EA017392B1 - Производные 2-гетероариламинопиримидина в качестве ингибиторов киназ - Google Patents

Abstract

В настоящем изобретении предлагаются соединения формулы (I)и их фармацевтические композиции, которые используют в качестве ингибиторов протеинкиназ, а также способы применения указанных соединений для лечения, снижения интенсивности симптомов или профилактики состояния связанного с аномальной или разрегулированной активностью киназы. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предлагаются способы применения указанных соединений для лечения, снижения интенсивности симптомов или профилактики заболеваний или нарушений, при которых наблюдается аномальная активность киназ c-kit, PDGFRα, PDGFRβ, CSF1R, Abl, BCR-Abl, CSK, JNK1, JNK2, p38, p70S6K, TGFβ, SRC, EGFR, trkB, FGFR3, Fes, Lck, Syk, RAF, MKK4, MKK6, SAPK2β, BRK, Fms, KDR, c-raf или b-raf.

Description

Перекрестные ссылки на родственные заявки

В настоящей заявке испрашивается приоритет в связи с предварительной заявкой 60/957240, поданной 22 августа 2007 г., которая в полном объеме включена в настоящее описание в качестве ссылки.

Область изобретения

В настоящем изобретении предлагаются ингибиторы протеинкиназ и способы применения указанных соединений. Более конкретно в настоящем изобретении предлагаются ингибиторы киназ с-кй и РЭСРК и их применение для лечения и профилактики заболеваний, опосредованных киназами с-к11 и ΡΌΟΡΒ.

Предпосылки создания настоящего изобретения

Протеинкиназы представляют собой большое семейство белков, играющих главную роль в регуляции множества различных клеточных процессов и обеспечении контроля функционирования клетки. Частичный список указанных киназ включает, но не ограничиваясь только ими, рецепторные тирозинкиназы, например рецепторную киназу фактора роста тромбоцитов (ΡΌΟΡΒ), рецепторную киназу фактора стволовых клеток, киназу с-кй. рецептор фактора роста нервов, киназу 1ткВ и рецепторную киназу роста фибробластов РОРК3, нерецепторную тирозинкиназу, такую как киназа ЛЫ и гибридная киназа ВСКЛЫ, Рек, Ьск и 8ук, а также серин/треонинкиназы, такие как киназы Ь-КАР, ΜΑΡ (например, МКК6) и 8ΑΡΚ2β. Аномальная активность киназы наблюдается при различных заболеваниях, включая доброкачественные и злокачественные пролиферативные заболевания, а также заболевания, которые развиваются из-за аномальной активации иммунной или нервной систем.

Описание вариантов осуществления настоящего изобретения

В настоящем изобретении предлагаются соединения и их фармацевтические композиции, которые можно использовать в качестве ингибиторов протеинкиназ.

В одном объекте настоящего изобретения предлагаются соединения формулы (1)

или их фармацевтически приемлемые соли, где 1-4 X¹, X², X³, X⁴, X⁵ и Х⁶ обозначают Ν, а остальные радикалы обозначают СК³, кольцо Е присоединено к ΝΚ, К² и К³ через атом углерода,

Аг обозначает необязательно замещенный 5-6-членный арил или гетероарил при условии, что Аг не обозначает имидазолил,

К¹ и К² независимо обозначают С1-С6алкил, С2-С6алкенил или С2-С6алкинил, каждый из которых необязательно замещен атомом галогена, аминогруппой или гидроксильной группой, галоген, цианогруппу, нитрогруппу, (СК2)кОК⁷, (С^ЖСЮ)^⁷, (СК;);5К , (СКЬЖ’К¹⁰, (СК2)кС(О)О0-1К⁷, ОС(О)К⁷, (СК2)кС(8)К⁷, (ОУкСЩЖ^.¹⁰, (СК+.С(О)\К(СК·) ..С(О)О · К , (СК+.\КС(О)О К , (СК2)к8(О)1-2№⁹К¹⁰, (СК2)_к8(О)_1-2К⁸, (СК2)кNК8(О)1-2К⁸ или (СК2)_кК⁶, или любые две соседние группы К² вместе с атомами, к которым они присоединены, образуют необязательно замещенное 5-8-членное карбоциклическое, гетероциклическое, арильное или гетероарильное кольцо,

К³ обозначает -Ь-МК⁴К⁵, -X-NК-С(О)К⁸ или -X-NК-С(О)NК⁴К⁵, где Ь обозначает -Х-С(О), -Х-ОС(О),

-8О_0-2(СК₂)|, (СК₂)_1-4, -О(СК₂)_1-4, или ^СКг . а X обозначает (СК₂) или [С(К)(СК₂ОК)],

К⁴, К⁵, К⁹ и К¹⁰ независимо обозначают Н, С1-С6алкил, С2-С6алкенил или С2-С6алкинил, каждый из которых необязательно замещен галогеном, аминогрупой, гидроксильной группой, алкоксигруппой, цианогруппой, карбоксильной группой или К⁶, (СК2)_кСИ, (СК₂)_1-&№⁷К⁷, (СК2)1-6ОК⁷, (СК2)_кС(О)О_0-1К⁷, (СК2)кС(О)1ЧК⁷К⁷ или (СК2)_к-К⁶,

К⁶ обозначает необязательно замещенный С3-С7циклоалкил, С6-С10арил или 5-10-членный гетероарил или 5-7-членное гетероциклическое кольцо,

К⁷ и К⁸ независимо обозначают (СК2)к-К⁶ или С1 -С₆алкил, С₂-С₆алкенил или С₂-С₆алкинил, каждый из которых необязательно замещен атомом галогена, аминогруппой, амидогруппой, гидроксильной группой, алкоксигруппой, цианогруппой, карбоксильной группой или группой К⁶, или К⁷ обозначает Н, в другом варианте К⁴ и К⁵ вместе с атомом N в каждой группе NК⁴К⁵, К⁷ и К⁷ вместе с атомом N в группе ΝΒ^⁷ или К⁹ и К¹⁰ вместе с атомом N в группе NК⁹К¹⁰ могут образовывать 4-7-членное гетероциклическое кольцо, необязательно замещенное 1-3 группами К¹¹ и необязательно содержащее ΝΒ¹², О, 8, =О или двойную связь,

К¹¹ обозначает К⁸, (СК2)к-ОК⁷, СО2К⁷, (СК2)к-С(О)-(СК2)к-К⁸, (СК2)_кС(О)1ЧК⁷К⁷, (СК2)кС(ОЖ(СК2)0-6С(О)О0-1К⁷,(СК2)к№С(О)О0₄К⁷, (С1С)· 8(О) \К К , (СК.к8(О) .|К или №^8(О)1-2К⁸,

К¹² обозначает Н, К⁸, -(СШ СО-К , (СК2)к-С(О)-(СК2)к-К⁸, (СК2)кС(О)1ЧК⁷К⁷, (СК2)кС(ОЖ(СК2)0-6С(О)О0₄К⁷, (С1С) \КС(О)О Ч , О2АО1.ЛО, (СК2)к8(О)1-2К⁸ или

- 1 017392 (СК₂)_кХК§(О)₁.₂К⁸, каждый К обозначает Н или С₁ -С₆алкил, каждый к равен 0-6,

_) и т независимо равны 0-4 при условии, что К⁸ в группе -Х-ИК-С(О)К⁸ не обозначает фенил, если Аг обозначает фенил, а X обозначает (СК₂)₀.

В некоторых примерах кольцо Е в указанной выше формуле (1) обозначает пиридинил. В других примерах Аг обозначает фенил. В еще одном варианте К², если он присутствует, обозначает галоген, С1 С6алкил, С1-С6алкоксигруппу, гидроксигруппу или СО2К⁷, а К⁷ обозначает Н или С1-С₆алкил. В других примерах К³ обозначает -Ь-ИК⁴К⁵, -Х-ИК-С(О)К⁸ или -Х-ИК-С(О)ИК⁴К⁵, Ь обозначает -Х-С(О), X обозначает (СКД, а .) равен 0.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения предлагаются соединения формулы (2А), (2В) или (2С)

где К¹ обозначает С₁-С₆алкоксигруппу или галогеналкил, содержащий 1-6 атомов фтора,

К², если он присутствует, обозначает С₁ -С₆алкил,

К³ обозначает -Ь-ИК⁴К⁵, -Х-ИК-С(О)К⁸ или -Х-МК-С(О)МК⁴К⁵,

Ь обозначает -Х-С(О),

Х обозначает (СКД,

К⁴ и К⁵ независимо обозначают Н, С1-С6алкил, С2-С6алкенил или С2-С6алкинил, каждый из которых необязательно замещен атомом галогена, аминогруппой, гидроксильной группой, алкоксигруппой, цианогруппой, карбоксильной группой или группой К⁶, или К⁴ и К⁵ вместе с атомом N образуют пиперазинил, пирролидинил или пиперидинил, каждый из которых необязательно замещен группой =0 или 1-2 группами К¹¹,

.) равен 0, к равен 0-4, т равен 0-1, а

К, К⁶, К⁸ и К¹¹ имеют значения, как определено для формулы (1).

В формулах (1), (2А), (2В) и (2С) К¹ может обозначать С1-С6алкоксигруппу или галогеналкил, содержащий 1-6 атомов фтора. Например, К¹ может обозначать ОСН3, ОСНЕ₂, ОСЕ₃, ОСН₂СЕ₃, ОСЕ₂СН₃ или ОСН₂СЕ₃.

В формулах (1), (2А), (2В) и (2С) К³ выбирают из следующих групп:

- 2 017392

- 3 017392

- 4 017392

- 5 017392

В других вариантах радикал В³ в указанных выше формулах (1), (2А), (2В) и (2С) выбирают из группы, включающей

где В_А выбран из -ΝΗ₂, -ΝΕΐ₂ и -ΝΗ(ΟΗ₂)_1-6ΟΗ.

В других примерах радикал В³ в соединениях указанных выше формул (1), (2А), (2В) и (2С) выбирают из группы, включающей

- 6 017392

В другом варианте настоящего изобретения предлагаются фармацевтические композиции, содержащие терапевтически эффективное количество соединения формул (1), (2А), (2В) или (2С) и фармацевтически приемлемый эксципиент.

В еще одном варианте настоящего изобретения предлагаются способы модуляции активности киназы, которые заключаются во введении в систему или субъекту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества соединения формул (1), (2А), (2В) или (2С) или их фармацевтически приемлемых солей или фармацевтически приемлемых композиций и таким образом в модуляции указанной активности киназ.

В одном варианте предлагаются способы модуляции киназ с-кй РОСЕВа, ΡΌΟΕΒβ, С8Е1В, АЫ, ВСР-АЫ. С8К, 1ΝΚ1, 1ΝΚ2, р38, р7086К, ΤΟΕβ, 8ВС, ЕСЕК., 1гкВ, ЕСЕВ3, Еез, Ьек, 8ук, ВАЕ, МКК4, МКК6, δΑΡ^β, ВВК, Етз, КЭВ, е-таЕ или Ь-гаЕ. В некоторых вариантах предлагаются способы модуляции киназ с-кП, РЭСЕРа или РОСЕР[к более конкретно в настоящем изобретении предлагаются способы, согласно которым соединения формул (1), (2А), (2В) или (2С), или их фармацевтически приемлемые соли, или фармацевтические композиции напрямую контактируют с киназами РЭСЕРа или Ρ^СЕВβ ίη νίΐτο или ίη νίνο.

В настоящем изобретении также предлагаются способы лечения заболевания или состояния, при котором модуляция активности киназы может предотвращать, подавлять или снижать интенсивность патологии и/или симптоматологии заболевания или состояния, и указанные способы заключаются во введении субъекту терапевтически эффективного количества соединения формул (1), (2А), (2В) или (2С), или их фармацевтически приемлемых солей, или их фармацевтических композиций, необязательно в комбинации со вторым терапевтическим агентом. Примеры терапевтических агентов, которые можно использовать в комбинации с соединением по настоящему изобретению, включают, но не ограничиваясь только ими, противофиброзный агент, пирфенидон, такролимус, противовоспалительный агент, кортикостероид, хромолин, антагонист лейкотриена, блокатор 1дЕ, бронхолитическое средство, агонист β₂, ксантины, антихолинергический или химиотерапевтический агент. При совместном введении с вторым терапевтическим агентом соединение формул (1), (2А), (2В) или (2С), или их фармацевтически приемлемые соли, или фармацевтические композиции можно вводить до введения второго терапевтического агента, одновременно с ним или после его введения.

В одном варианте предлагаются способы лечения заболевания или состояния, модулируемых киназами с-кй, РОСЕВа, Ρ^СЕВβ, С8Е1В, АЬ1, ВСВ-АЬ1, С8К, ΕΝΒ1, ΕΝΒ2, р38, р7086К, ΤСЕβ, 8ВС, ЕСЕВ, йкВ, ЕСЕВ3, Еез, Ьск, 8ук, ВАЕ, МКК4, МКК6, 8АР^, ВВК, Етз, КОВ, с-таЕ или Ь-гаЕ. В отдельных примерах предлагаются способы лечения заболевания или состояния, которые модулируются киназами РОСЕВа, Ρ^СЕВβ или с-кй. В некоторых примерах предлагаются способы лечения заболеваний или

- 7 017392 состояний, которые модулируются киназой с-кй.

Примеры заболевания или состояния, опосредованного киназами, которое можно лечить с использованием соединений и композиций по настоящему изобретению, включают, но не ограничиваясь только ими, заболевание, связанное с тучными клетками, аллергическое заболевание, синдром раздраженной кишки, фиброзные заболевания, неопластические нарушения, воспалительное нарушение, аутоиммунное нарушение, заболевание трансплантат против хозяина, метаболический синдром, нарушение, связанное с центральной нервной системой, нейродегенеративное нарушение, боль, алкогольную или наркотическую зависимость, рак, сердечно-сосудистое заболевание и заболевание, связанное с прионной инфекцией.

Примеры заболеваний, связанных с тучными клетками, которые можно лечить с использованием соединений и композиций по настоящему изобретению, включают, но не ограничиваясь только ими, аллергические нарушения (включая астму и атопический дерматит), крапивницу, угри и угри, вызванные пропионибактериями, прогрессирующую оссифицирующую фибродисплазию, воспаление и разрушение тканей, вызванное воздействием химического и биологического оружия (например, сибирская язва и сернистый иприт), муковисцидоз, заболевания почек, воспалительные заболевания мышц, ВИЧ, диабет типа II, церебральную ишемию, мастоцитоз, лекарственную зависимость и абстинентный синдром, заболевания центральной нервной системы, предотвращение или снижение выпадения волос, бактериальные инфекции, интерстициальный цистит, воспалительные заболевания кишечника (например, болезнь Крона, неспецифический язвенный колит, неопределенный колит и инфекционный колит), ангиогенез опухоли, аутоиммунные заболевания, воспалительные заболевания, рассеянный склероз и потерю костной массы.

Примеры аллергических заболеваний, которые можно лечить с использованием соединений и композиций по настоящему изобретению, включают, но не ограничиваясь только ими, астму, атопический дерматит, аллергический ринит, аллергичекий синусит, анафилактический синдром, крапивницу, отек Квинке, аллергический контактный дерматит, узловатую эритему, полиформную эритерму, кожный некрозирующий венулит, воспаление кожи вследствие укуса насекомых и инвазию кровососущих паразитов.

Синдром раздраженной кишки представляет собой функциональное нарушение желудочнокишечного тракта, характеризующееся болями в брюшной полости и изменением функционирования кишечника. Боли обычно ослабевают при дефекации и могут быть связаны с большей или меньшей частотой формирования стула, изменением консистенции стула, запором или недержанием стула, чувством неполного опорожнения, выделением слизи или вздутием живота.

Фиброзное заболевание в настоящем контексте включает все состояния, связанные с образованием и отложением компонентов внеклеточного матрикса, прежде всего во внутренних органах, включая почки, сердце, легкие, печень, кожу и суставы. Примеры фиброзных заболеваний, которые можно лечить с использованием соединений и композиций по настоящему изобретению, включают, но не ограничиваясь только ими, склеродермию, легочный фиброз, идиопатический легочный фиброз, первичную легочную гипертензию (например, артериальную легочную гипертензию), фиброз печени, фиброз почек, фиброз сердца, цирроз печени, фиброз костного мозга, гепатит С и стеатогепатит неалкогольного происхождения.

Примеры неопластических нарушений, которые можно лечить с использованием соединений и композиций по настоящему изобретению, включают, но не ограничиваясь только ими, мастоцитоз, стромальную опухоль желудочно-кишечного тракта, мелкоклеточный рак легких, немелкоклеточный рак легких, острый миелоидный лейкоз, острый лимфоцитарный лейкоз, миелодипластический синдром, хронический миелогенный лейкоз, колоректальную карциному, желудочную карциному, рак яичек, глиобластому и астроцитому.

Примеры воспалительных заболеваний, которые можно лечить с использованием соединений и композиций по настоящему изобретению, включают, но не ограничиваясь только ими, ревматоидный артрит, конъюктивит, ревматоидный спондилит, остеоартрит и подагрический артрит.

Примеры аутоиммунных заболеваний, которые можно лечить с использованием соединений и композиций по настоящему изобретению, включают, но не ограничиваясь только ими, рассеянный склероз, псориаз, воспалительное заболевание кишечника, синдром воспаленного кишечника, язвенный колит, болезнь Крона, ревматоидный артрит, полиартрит, очаговую или системную склеродермию, системную красную волчанку, дискоидную красную волчанку, кожную волчанку, дерматомиозит, полимиозит, синдром Шегрена, узелковый панартерит, аутоиммунную энтеропатию и пролиферативный гломерулонефрит.

Примеры заболеваний трансплантат против хозяина, которые можно лечить с использованием соединений и композиций по настоящему изобретению, включают, но не ограничиваясь только ими, отторжение трансплантатов органов, таких как почки, поджелудочная железа, печень, сердце, легкие и костной мозг.

Примеры метаболических синдромов, которые можно лечить с использованием соединений и композиций по настоящему изобретению, включают, но не ограничиваясь только ими, диабет типа I и II и ожирение.

- 8 017392

Примеры заболеваний, связанных с центральной нервной системой, которые можно лечить с использованием соединений и композиций по настоящему изобретению, включают, но не ограничиваясь только ими, депрессию, дистимическое расстройство, циклотимическое расстройство, анорексию, булимию, предменструальный синдром, синдром постменопаузы, задержку умственного развития, потерю внимания, пессимизм, возбуждение, самоосуждение и сниженное половое влечение, тревожное состояние, психиатрические заболевания и шизофрению.

Примеры депрессивных состояний, которые можно лечить с использованием соединений и композиций по настоящему изобретению, включают, но не ограничиваясь только ими, биполярную депрессию, тяжелую или меланхолическую депрессию, атипичную депрессию, резистентную депрессию и сезонную депрессию. Примеры тревожных состояний, которые можно лечить с использованием соединений и композиций по настоящему изобретению, включают, но не ограничиваясь только ими, тревогу, связанную с гипервентиляцией легких или сердечной аритмией, фобические расстройства, обессивно-компульсивное расстройство, расстройства, связанные с посттравматическим стрессом, острым стрессом и генерализованное тревожное расстройство. Примеры психиатрических заболеваний, которые можно лечить с использованием соединений и композиций по настоящему изобретению, включают, но не ограничиваясь только ими, приступы паники, включая психоз, бредовое расстройство, конверсионные расстройства, фобии, мании, делирий, диссоциативные эпизоды, включая диссоциативную амнезию, диссоциативную реакцию бегства и диссоциативное суицидальное поведение, самоотрицание, жестокое или агрессивное поведение, травму, пограничное расстройство личности и острый психоз, такой как шизофрения, включая параноидальную шизофрению, дезорганизованную шизофрению, кататоническую шизофрению и недифференцированную шизофрению.

Примеры нейродегенеративных заболеваний, которые можно лечить с использованием соединений и композиций по настоящему изобретению, включают, но не ограничиваясь только ими, остеоартрит, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Гентингтона, прионные заболевания, заболевание двигательных нейронов и боковой амиотрофический склероз.

Примеры болевых состояний, которые можно лечить с использованием соединений и композиций по настоящему изобретению, включают, но не ограничиваясь только ими, острую боль, послеоперационную боль, хроническую боль, ноцицептивную боль, боль при раке, невропатическую боль и психогенный болевой синдром.

Примеры расстройств, вызванных употреблением психоактивных веществ, которые можно лечить с использованием соединений и композиций по настоящему изобретению, включают, но не ограничиваясь только ими, наркотическую зависимость, привыкание к чрезмерному употреблению лекарственных средств, лекарственную зависимость, абстинентный синдром и передозировку лекарственных средств.

Примеры раковых заболеваний, которые можно лечить с использованием соединений и композиций по настоящему изобретению, включают, но не ограничиваясь только ими, глиому, меланому, желудочнокишечную стромальную опухоль, мелкоклеточный рак легкого, колоректальный рак и другие солидные опухоли.

Примеры сердечно-сосудистых заболеваний, которые можно лечить с использованием соединений и композиций по настоящему изобретению, включают, но не ограничиваясь только ими, стенокардию, инфаркт миокарда, застойную сердечную недостаточность, кардиомиопатию, гипертензию, артериальный и венозный стеноз.

Более конкретно соединения по настоящему изобретению можно использовать для лечения и профилактики астмы, атопического нейродермита, крапивницы, синдрома раздраженной кишки или фиброзных заболеваний, включая, но не ограничиваясь только ими, склеродермию, легочный фиброз, идиопатический легочный фиброз, первичную легочную гипертензию, первичную легочную артериальную гипертензию, идиопатическую артериальную гипертензию, фиброз печени, фиброз почек и фиброз сердца.

Кроме того, в настоящем изобретении предлагается применение соединений формул (1), (2А), (2В) или (2С) или их фармацевтических композиций, необязательно в комбинации с вторым терапевтическим агентом, для получения лекарственных средств, предназначенных для лечения заболеваний и состояний, модулируемых киназами с-кй, ΡΌΟΕΚα, ΡΌΟΕΚβ, С8Е1К, АЫ, ВСК-АЬ1, С8К, 1ΝΚ1, 1ΝΚ2, р38, р7086К, ΤΟΡβ, 8КС, ЕСЕК, 1ткВ, Е6ЕК3, Ее§, Ьск, 8ук, КАЕ, МКК4, МКК6, 8ΑΡΚ2β, ВКК, Еш§, КОК, с-гаГ или Ь-гаГ, и более конкретно для получения лекарственных средств, предназначенных для лечения заболеваний и состояний, модулируемых киназами ΡΌΟΕΚα, ΡΌΟΕΚβ или с-кй.

Согласно вышеупомянутым способам применения соединений по настоящему изобретению соединения формул (1), (2А), (2В) или (2С) можно вводить в систему, содержащую клетки или ткани. В другом варианте соединения формул (1), (2А), (2В) или (2С) можно вводить человеку или животному.

Определения

Термин алкил, использованный в данном контексте, обозначает остаток или структурный элемент каких-либо других групп, например галогензамещенный алкил и алкоксигруппу с прямой или разветвленной цепью. Необязательно замещенный алкил, алкенил или алкинил, использованные в данном контексте, необязательно содержат атом галогена (например, СЕ₃) или один или более атомов углерода, за

- 9 017392 мещенных или замененных на гетероатом, такой как ΝΚ, О или 8 (например, -ОСН₂СН₂О-, алкилтиол, тиоалкоксигруппа, алкиламины и т.п.).

Термин арил, использованный в данном контексте, обозначает моноциклическое или конденсированное бициклическое ароматическое кольцо, содержащее атомы углерода. Например, арил может обозначать фенил или нафтил. Термин арилен, использованный в данном контексте, обозначает двухвалентный радикал, образованный из арильной группы.

Термин гетероарил, использованный в данном контексте, обозначает арил, как описано выше, при этом один или более атомов в цикле обозначают гетероатом. Примеры гетероарильных групп включают (но не ограничиваются только ими) пиридил, индолил, индазолил, хиноксалинил, хинолинил, бензофуранил, бензопиранил, бензотиопиранил, бензо[1,3]диоксол, имидазолил, бензимидазолил, пиримидинил, фуранил, оксазолил, изоксазолил, триазолил, тетразолил, пиразолил, тиенил и т. п.

Термин карбоциклическое кольцо, использованный в данном контексте, обозначает насыщенное или частично ненасыщенное моноциклическое, конденсированное бициклическое или мостиковое полициклическое кольцо, содержащее атомы углерода, необязательно замещенные, например, группой =О.

Примеры карбоциклических колец включают, но не ограничиваясь только ими, циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклопропилен, циклогексанон и т. п.

Термин гетероциклическое кольцо, использованный в данном контексте, обозначает карбоциклическое кольцо, как описано выше, где один или более атомов углерода обозначают гетероатом. Например, гетероциклическое кольцо может содержать группы Ν, О, 8, -Ν=, -8-, -8(Ο), -8(Ο)₂- или -ΝΚ-, где В обозначает водород, С₁-С₄алкил или защитную группу. Примеры гетероциклических колец включают, но не ограничиваясь только ими, морфолино, пирролидинил, пирролидинил-2-он, пиперазинил, пиперидинил, пиперидинилон, 1,4-диокса-8-азаспиро[4,5]дец-8-ил и т.п.

Использованный в данном контексте термин атом Н обозначает в составе любой группы заместителя (например, в группе СЛ₂) все пригодные изотопы, например Н, ²Н и ³Н.

Если не указано иное, то термин необязательно замещенный заместитель обозначает, что заместитель обозначает группу, которая необязательно замещена одной или более группами, независимо выбранными, например, из следующих групп: необязательно замещенный атомом галогена алкил, алкенил, алкинил, алкоксигруппа, алкиламин, алкилтиогруппа, алкинил, амид, аминогруппа, включая моно- и дизамещенные аминогруппы, арил, арилоксигруппа, арилтиогруппа, карбонил, карбоциклил, цианогруппа, циклоалкил, галоген, гетероалкил, гетероалкенил, гетероалкинил, гетероарил, гетероциклил, гидроксигруппа, изоцианатогруппа, изотиоцианатогруппа, меркаптогруппа, нитрогруппа, О-карбамоил, Νкарбамил, О-тиокарбамил, Ν-тиокарбамил, С-амидогруппа, Ν-амидогруппа, 8-сульфонамидогруппа, Νсульфонамидогруппа, С-карбоксигруппа, О-карбоксигруппа, пергалогеналкил, перфторалкил, силил, сульфонил, тиокарбонил, тиоцианатогруппа, тригалогенметансульфонил и их защищенные соединения. Защитные группы, которые можно использовать для защиты указанных выше заместителей, известны и приведены в справочных изданиях, таких как Огеепе и ХУиК Рго!еейуе Огоирк ίη Огдапю 8уп111С5к. 3-е изд., ίοΐιη ХУПеу & 8опк, №\ν Уогк, ΝΥ (1999) и Кое1еп8к1, РгсИссНус Огоирк, ТЫете Уег1ад, №\ν Уогк, ΝΥ (1994), включенных в данных контекст в полном объеме качестве ссылок.

Термин совместное введение, использованный в данном контексте, обозначает введение выбранных терапевтических агентов одному пациенту и обозначает курс лечения, при котором агенты необязательно вводят одним и тем же способом или в одно и то же время.

Термин фармацевтическая комбинация, использованный в данном контексте, обозначает продукт, полученный при смешивании активных ингредиентов, и включающий фиксированные и нефиксированные комбинации активных ингредиентов. Термин фиксированная комбинация обозначает, что активные ингредиенты, т.е. соединение формулы (1) и совместный агент, вводят пациенту одновременно в форме единой дозы или лекарственной формы. Термин нефиксированная комбинация обозначает, что активные ингредиенты, например соединение формулы (1) и совместный агент, вводят пациенту в виде отдельных форм одновременно, или совместно, или последовательно, без определенных временных ограничений, причем указанное введение обеспечивает терапевтически эффективные уровни активных ингредиентов в организме пациента. Последнее также относится к комбинированной терапии, например введению трех или более активных ингредиентов.

Термин терапевтически эффективное количество обозначает количество соединения, которое вызывает биологическую или лечебную ответную реакцию в клетке, ткани, органе, системе, в организме животного или человека, по мнению исследователя, ветеринара, врача или другого специалиста.

Термин введение соединения обозначает доставку соединения по настоящему изобретению и его пролекарства субъекту, нуждающемуся в лечении.

Если в данном изобретении не указано иное, киназу выбирают из следующих киназ: е-кй, ΡΌΟΕΚα, ΡΌΟΕΒβ, С8Р1В, АЬ1, ВСВ-АЫ, С8К, ЖК1, ΡΝΚ2, р38, р7086К, ΤΟΕβ, 8ВС, ЕОЕВ, 1гкВ, ЕОЕВ3, Рек, Ьек, 8ук, ВАР, МКК4, МКК6, 8ΑΡΚ2β, ВВК, Ртк, КИВ, е-гаГ и Ь-гаГ, включая киназы дикого типа и мутантные формы (т.е. отличающиеся одной или несколькими аминокислотами по сравнению с последовательностью дикого типа).

- 10 017392

Способы осуществления настоящего изобретения

В настоящем изобретении предлагаются соединения и их фармацевтические композиции, которые можно применять в качестве ингибиторов протеинкиназ.

В одном объекте настоящего изобретения предлагаются соединения формулы (1)

или его фармацевтически приемлемая соль, где 1-4 X¹, X², X³, X⁴, X⁵ и Х⁶ обозначают Ν, а остальные группы обозначают СК³, кольцо Е присоединено к группам ΝΚ, К² и К³ через атом углерода,

Аг обозначает необязательно замещенный 5-6-членный арил или гетероарил при условии, что Аг не обозначает имидазолил,

К¹ и К² независимо обозначают С1-С6алкил, С2-С6алкенил или С2-С6алкинил, каждый из которых необязательно замещен галогеном, аминогруппой или гидроксильной группой, галоген, цианогруппу, нитрогруппу, (СК2)кОК⁷, (СадОДД⁷, (СК + 8К , (СК;)·..ΝΗΉ'. (СК2)кС(О)Оо-1К⁷, ОС(О)К⁷, №)кС(8)К⁷, (ОУкСЩЖ^.¹⁰, (СК2)кС(ОЖ(СК2)0-6С(О)О0-1К⁷, (С1<+ЛКС(О)О К . (СВ2)|.:8(О)|^к⁷К¹⁰. (СК2)_к8(О)_1-2К⁸, (СК2)кХК8(О)1-2К⁸ или (СК2)_кК⁶, или любые две соседние группы К² вместе с атомами, к которым они присоединены, могут образовывать необязательно замещенное 5-8членное карбоциклическое, гетероциклическое, арильное или гетероарильное кольцо,

К³ обозначает -Ь-МК⁴К⁵, ^-ΝΕ^Θ^⁸ или -X-NК-С(О)NК⁴К⁵, где Ь обозначает -Х-С(О), -Х-ОС(О), -8Оо-2(СК2),, (СК2)1-4, -О(СК2)1-4 или . X обозначает (СК₂), или [С(К)(СК2ОК)],

К⁴, К⁵, К⁹ и К¹⁰ независимо обозначают Н, С1-С6алкил, С2-С6алкенил или С2-С6алкинил, каждый из которых необязательно замещен галогеном, аминогруппой, гидроксильной группой, алкоксигруппой, цианогруппой, карбоксильной группой или группами К⁶; (СК2)_кСЫ, (СК₂)_1-6МК⁷К⁷, (СК₂)_1-6ОК⁷, (СК2)кС(О)О0-1К⁷, (СК2)кС(О)МК⁷К⁷ или (СК2)к-К⁶,

К⁶ обозначает необязательно замещенный С₃-С₇циклоалкил, С₆-С₁₀арил или 5-10-членный гетероарил или 5-7-членное гетероциклическое кольцо,

К⁷ и К⁸ независимо означают (СК2)к-К⁶ или С1-С₆алкил, С₂-С₆алкенил, С₂-С₆алкинил, каждый из которых необязательно замещен атомом галогена, аминогруппой, амидогруппой, гидроксигруппой, алкоксигруппой, цианогруппой, карбоксильной группой или К⁶, или К⁷ обозначает Н, в другом варианте К⁴ и К⁵ вместе с атомом N в каждой группе ХК'кА К⁷ и К⁷ вместе с атомом N в группе ΝΕ⁷^ или К⁹, К¹⁰ вместе с атомом N в группе ΝΒ^Η¹⁰ необязательно образуют 4-7-членное гетероциклическое кольцо, необязательно замещенное 1-3 группами К¹¹, необязательно содержащими группы ΝΒ¹², О, 8, -О или двойную связь,

К¹¹ обозначает К⁸, (СК2)к-ОК⁷, СО2К⁷, (СК2)кС(О)ХК(СК2)0-6С(О)О0-1К⁷, (С1С)·..\КС(О)О 41 , (СК2)кИН8(О)1-2К⁸,

К¹² обозначает Н, К⁸, -(СК2)1-4СО2К⁷, (СК2)к-С(О)-(СК2)к-К⁸, (СК+.С(О)\К К , (СК + С(О)\ЩС1Т) 6С(О)О0-1К⁷, (С1Т) \КС(О)О Я , (СК+.8(О) \К К , (СК2)к8(О)1-2К⁸ или (СК2)кХК8(О)1-2К⁸, каждый радикал К обозначает Н или С₁-С₆алкил, каждый к равен 0-6,

_) и т независимо равны 0-4, при условии, что К⁸ в группе не обозначает фенил, если Аг обозначает фенил, а X обозначает (СК2)0.

В одном варианте настоящего изобретения предлагаются соединения формул (2А), (2В) или (2С) (СВ₂)_к-С(О)-(СВ₂)_к-В⁸, (СК_;)-..С(О)\К К . (СВ₂)_к8(О)1-₂ИК⁷В⁷, (СК + 8(О)-1С или

где К¹ обозначает С1-Сбалкоксигруппу или галогеналкил, содержащий 1-6 атомов фтора,

- 11 017392

К², если присутствует, обозначает С₁-С₆алкил,

К³ обозначает -Ь-ИКК⁵, -Х-ИК-С(О)К⁸ или -Х-ИК-С(О)ИК⁴К⁵,

Ь обозначает -Х-С(О),

X обозначает (СК₂),,

К⁴ и К⁵ независимо обозначают Н, С₁ -С₆алкил, С₂-С₆алкенил или С₂-С₆алкинил, каждый из которых необязательно замещен атомом галогена, аминогруппой, гидроксигруппой, алкоксигруппой, цианогруппой, карбоксильной группой или К⁶, или К⁴ и К⁵ вместе с атомом N образуют пиперазинил, пирролидинил или пиперидинил, каждый из которых необязательно замещен группой =О или 1-2 группами К¹¹,

.) равен 0, к равен 0-4, т равен 0-1, а

К, К⁶, К⁸ и К¹¹ определены для формулы (1).

В каждой из вышеописанных формул любой асимметричный атом углерода может находиться в (К)-, (8)- или (К,8)-конфигурации. Соединения могут присутствовать в виде смеси изомеров или индивидуальных изомеров, например в виде индивидуальных энантиомеров или диастереомеров. Настоящее изобретение также включает возможные таутомеры соединений по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение также включает все пригодные изотопные формы соединений по настоящему изобретению или их фармацевтически приемлемых солей. Изотопные формы соединений по настоящему изобретению или их фармацевтически приемлемых солей обозначают соединения, в которых по крайней мере один атом заменен на атом с одинаковым атомным номером, но атомной массой, отличающейся от атомной массы существующего в природе атома. Примеры изотопов, которые могут содержаться в соединениях по настоящему изобретению и их фармацевтически приемлемых солях, включают, но не ограничиваясь только ими, изотопы водорода, углерода, азота и кислорода, такие как ²Н, ³Н, ¹¹С, 1 о 1/1 1С 1Ί 1 О ОС 1 О О< 1 02

С, С, Ν, О, О, 8, Е, С1 и I. Некоторые изотопные формы соединений по настоящему изобретению и их фармацевтически приемлемых солей, например, включающие радиоактивные изотопы ³Н или ¹⁴С, используют в исследованиях по распределению лекарственных агентов и/или субстратов в тканях.

В конкретных примерах изотопы ²Н, ³Н и ¹⁴С используют в связи с простым методом их получения и детектирования. В других примерах использование в качестве заместителей таких изотопов, как ²Н, обеспечивает определенные терапевтические преимущества в связи с лучшей метаболической стабильностью, например за счет увеличения периода полураспада ίη νίνο или снижения требуемой дозы. Изотопные формы соединения по настоящему изобретению или их фармацевтически приемлемых солей обычно получают и использованием стандартных методик и соответствующих реагентов. Изотопные формы соединения могут изменять метаболизм соединений и/или незначительно изменять физические свойства, такие как гидрофобность и т.п. Изотопные формы соединения могут увеличивать эффективность и безопасность, биодоступность и период полураспада, изменять степень связывания с белками, биораспределение, увеличивать содержание активных метаболитов и/или снижать образование реакционноспособных или токсичных метаболитов.

В каждой из описанных выше формул каждый необязательно замещенный остаток может содержать заместители, выбранные из группы, включающей С₁-С₆алкил, С₂-С₆алкенил или С₃-С₆алкинил, каждый из которых необязательно замещен галогеном или необязательно содержит атом углерода, который заменен на атомы Ν, 8, О, или их комбинацию (например, гидрокси(С₁-С₈)алкил, С₁-С₈алкокси(С₁С8)алкил), галоген, аминогруппу, амидиногруппу, С1-С6алкоксигруппу, гидроксил, метилендиоксигруппу, карбоксигруппу, С₁-С₃алкилкарбонил, С₁-С₈алкоксикарбонил, карбамоил, С₁-С₈алкилкарбамоил, сульфамоил, цианогруппу, оксогруппу, нитрогруппу или необязательно замещенное карбоциклическое кольцо, гетероциклическое кольцо, арил или гетероарил, как описано выше.

Соединения формул (1), (2А), (2В) или (2С) в свободной форме или в форме фармацевтически приемлемой соли характеризуются различными фармакологическими свойствами, например, как установлено по данным испытаний ίη νίίτο, как описано в данном контексте. Значение 1С₅₀ в описанных экспериментах обозначает концентрацию исследуемого соединения, при которой число клеток снижается на 50% по сравнению с контролем в отсутствие ингибитора. В общем случае соединения по настоящему изобретению характеризуются значениями 1С₅₀ от 1 нМ до 10 мкМ. В некоторых примерах соединения по настоящему изобретению характеризуются значениями 1С₅₀ от 0,01 до 5 мкМ. В других примерах соединения по настоящему изобретению характеризуются значением 1С₅₀ от 0,01 до 1 мкМ, более предпочтительно от 1 нМ до 1 мкМ. В других примерах соединения по настоящему изобретению характеризуются значениями 1С₅₀ менее 1 нМ или более 10 мкМ. Степень ингибирования соединений по настоящему изобретению в % составляет более 50% или в других вариантах более приблизительно 70% в отношении одной или более следующих киназ при концентрации 10 мкМ: с-к11, РИСЕКа, ΡΩΟΕΡβ. С8Е1К, АЫ, ВСК-АЬ1, С8К, ΕΝΚ1, ΕΝΚ2, р38, р7086К, ΤΟΕβ, 8КС, ЕСЕК, 1гкВ, ЕСЕК3, Ее§, Ьск, 8ук, КАЕ, МКК4, МКК6, 8АРК23, ВКК, Ет§, КОК, с-гаЕ или Ь-гаЕ.

Соединения по настоящему изобретению также можно применять для лечения опосредованного киназами состояния или заболевания, такого как заболевание, опосредованное киназами с-кй, РИСЕКа,

- 12 017392

ΡΌΟΕΚβ, С8Е1К, ЛЫ, ВСК-АЬ1, С8К, ΊΝΚ1, ΊΝΚ2, р38, р7086К, ΤΟΡβ, 8КС, ЕСЕК, 1гкВ, ЕСЕК3, Ее§, Ьск, 8ук, КАЕ, МКК4, МКК6, 8ΑΡΚ2β, ВКК, Еш§, КИВ, с-гаЕ или Ь-гаЕ

Более конкретно соединения по настоящему изобретению можно использовать для лечения и профилактики астмы, атопического дерматита, крапивницы, синдрома раздраженной кишки или фиброзных заболеваний, включая, но не ограничиваясь только ими, склеродермию, легочный фиброз, идиопатический легочный фиброз, первичную легочную гипертензию, первичную легочную артериальную гипертензию, идиопатическую артериальную гипертензию, фиброз печени, почек и сердца.

Фармакология и применение

Активность соединений по настоящему изобретению оценивали с использованием панели киназ (дикого типа и/или мутантных форм), и указанные соединения модулируют активность по крайней мере одной киназы в панели. Таким образом, соединения по настоящему изобретению можно использовать для лечения заболеваний или нарушений, в развитии которых принимают участие киназы (в развитии патологии или симптомологии указанных заболеваний). Примеры киназ, активность которых ингибируется соединениями и композициями, описанными в данном контексте, и в отношении которых можно использовать описанные в данном контексте способы, включают, не ограничиваясь только ими, киназы с-кй, ΡΌΟΕΒα, ΡΌΟΕΒβ, С8Е1К, АЬ1, ВСК-АЬ1, С8К, ЕМК1, ,ΙΝΌ. р38, р7086К, ΤΟΕβ, 8КС, ЕСЕК, йгкВ, ЕСЕК3, Ее§, Ьск, 8ук, КАЕ, МКК4, МКК6, δΑΡ^β, ВКК, Еш§, КИК, с-га£ или Ь-гаЕ.

с-Кй.

Тучные клетки представляют собой элементы ткани, образующиеся из определенной субпопуляции кроветворных стволовых клеток, экспрессирующих антигены СИ34, с-ΚίΙ и СИ13. Тучные клетки характеризуются гетерогенностью не только в отношении расположения и структуры ткани, но и на функциональном и гистохимическом уровнях. Незрелые тучные клетки-предшественники циркулируют в кровотоке и распределяются по различным тканям. Такие дифференциация и пролиферация контролируются цитокинами, одним из важнейших является фактор стволовых клеток, также известный как лиганд Кй, фактор Стила или фактор роста тучных клеток. Рецептор фактора стволовых клеток кодируется протоонкогеном, с-кй, который экспрессируется в кроветворных клетках-предшественниках, тучных клетках, половых клетках, интерстициальных клетках Кахаля и некоторых опухолях человека, а также экспрессируется некроветворными клетками.

Тирозинкиназы представляют собой белки рецепторного или нерецепторного типа, которые превращают концевой фосфат из АТФ в остатки тирозина в белке, таким образом активируя или инактивируя пути передачи сигнала. Рецептор фактора стволовых клеток, с-кй, представляет собой трансмембранную рецепторную протеинтирозинкиназу типа III, которая инициирует рост клеток и каскады пролиферационной передачи сигнала в ответ на связывание с фактором стволовых клеток. Лигирование рецептора с-кй в присутствии фактора стволовых клеток приводит к его димеризации с последующим трансфосфорилированием, что, в свою очередь, приводит к накоплению и активации различных внутрицитоплазматических субстратов. Указанные активированные субстраты приводят к активации множества внутриклеточных сигнальных путей, ответственных за пролиферацию и активацию клеток. Известно, что такие белки принимают участие в различных клеточных механизмах, которые в случае нарушения приводят к заболеваниям, таким как аномальная клеточная пролиферация и миграция, а также воспаление. Указанные соединения по настоящему изобретению подавляют клеточные процессы, включающие фактор стволовых клеток, например ингибируют автофосфорилирование рецептора фактора стволовых клеток и стимулируемую фактором стволовых клеток активацию киназы МΑΡΚ (митоген-активированной протеинкиназы).

Активность рецепторной протеинтирозинкиназы с-ΚίΙ регулируется в нормальных клетках, нормальная функциональная активность генного продукта с-кй имеет значение для поддержания нормального кроветворения, меланогенеза, гаметогенеза и роста и дифференциации тучных клеток. Кроме важной роли в нормальной физиологической активности клетки с-кй играет роль в биологических аспектах развития определенных видов рака у человека и разрегулированная активность киназы с-кй принимает участие в развитии патогенеза рака у человека и определенных видов опухолей. Пролиферация роста опухолевых клеток, опосредованная киназой с-кй, может происходить в результате специфической мутации полипептида с-кй. которая приводит к независимой активации лигандов или аутокринной стимуляции рецептора. В первом случае мутации, вызывающие конститутивную активацию активности киназы с-кй в отсутствие связывания с фактором стволовых клеток, приводят к развитию злокачественных опухолей у человека, включая опухоли половых клеток, тучных клеток, желудочно-кишечные стромальные опухоли, мелкоклеточный рак легких, меланому, рак молочной железы, острый миелогенный лейкоз, нейробластому и мастоцитоз.

Тучные клетки, содержащиеся в тканях пациента, принимают участие в развитии или вносят вклад в развитие заболеваний, таких как аутоиммунные заболевания (рассеянный склероз, ревматоидный артрит, воспалительные заболевания кишечника), аллергические заболевания, развитие кровеносных сосудов в опухоли, воспалительные заболевания и интерстициальный цистит. Аллергические заболевания включают, но не ограничиваясь только ими, аллергический ринит, аллергический синусит, анафилакти

- 13 017392 ческий синдром, крапивницу, отек Квинке, атопический дерматит, аллергический контактный дерматит, узловатую эритему, множественную эритему, кожный некротирующий венулит, воспаления кожи вследствие укуса насекомых и астму. Астма характеризуется обструкцией дыхательных путей, бронхиальной гиперчувствительностью, воспалением дыхательных путей и включает бронхиальную астму и аллергическую астму.

В случае указанных заболеваний тучные клетки принимают участие в разрушении тканей в результате высвобождения смеси различных протеаз и медиаторов, таких как гистамин, нейтральные протеазы, липидсодержащие медиаторы (простагландины, тромбоксаны и лейкотриены) и различные цитокины (ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-8, ΤΝΡ-Α, 6М-С8Р, ΜΙΡ-ЬА, М1Р-1Ь, ΜΙΡ-2 и ΙΡΝ-γ). Активация тучных клеток индуцирует различные эффекторные ответные реакции, такие как секреция аллергических медиаторов, протеаз, хемокинов, таких как МСР-1 и ΡΑΝΤΈ8, лейкотриенов, простагландинов, нейротрофинов, индукция транскрипции генов цитокинов (ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-13, ΤΝΡΑ и 6М-С8Р). Указанные медиаторы способствуют формированию астматического фенотипа при влиянии на эндотелиальные клетки, клетки гладкой мускулатуры и фибробласты, а также на клеточный матрикс и при накоплении других воспалительных клеток.

Тучные клетки могут участвовать в развитии астмы, как установлено при лечении моноклональными и гуманизированными антителами апО-ЦЕ. Принцип лечения антителами апО-ЦЕ заключается в специфическом воздействии на ЦЕ, что приводит к инактивации свободного апО-ЦЕ и остановке дальнейшего продуцирования ЦЕ. Кроме того, поскольку уровни ЦЕ являются основным регулятором уровня экспрессии рецептора ЦЕ, ΡίχΡΡ цель такого лечения заключается в снижении экспрессии ΡοοΡΙ на тучных клетках и базофилах и, следовательно, в снижении способности указанных клеток к активации. Снижение экспрессии ΡοοΡΙ на базофилах было установлено при лечении антителами апй-ЦЕ. Снижение экспрессии РееК! на базофилах связано со снижением способности базофилов секретировать медиаторы при активации.

Ингибиторы е-к11 также можно использовать для лечения инсулиннезависимого сахарного диабета, также известного как диабет типа ΙΙ, хронического заболевания, при котором инсулин не ускоряет захват глюкозы клетками, что приводит к увеличению уровня глюкозы в крови. Указанное заболевание поражает приблизительно 100 миллионов человек во всем мире, 75% из которых при установке диагноза страдали от ожирения. В течение многих лет неспособность регулировать захват глюкозы приводит к развитию диабета типа ΙΙ и к необходимости регулировать уровень глюкозы в крови с использованием лекарственных средств. В конечном итоге нерегулируемый уровень глюкозы в крови приводит к повреждению кровеносных сосудов, почек и глаз, а также к развитию сердечно-сосудистых заболеваний. Указанные повреждения ткани играют роль в повышении смертности у людей, страдающих от диабета.

Кроме того, активация тучных клеток различными стимуляторами, такими как стресс, травма, инфекция, а также нейромедиаторы, может приводить к обострению химического дисбаланса и к нарушениям ЦНС. Более конкретно дегрануляция тучных клеток стимулируется обычными нейромедиаторами, такими как нейротензин, соматостатин, вещество Р и ацетилхолин, факторами роста или выживания, прежде всего ΝΟΡ, ΤΟΡβΕ Тучными клетками, принимающими участие в ответной реакции на такие стимулы, являются тучные клетки мозга, а также другие тучные клетки, из которых их содержимое высвобождается в кровоток, который в конечном итоге доставляет их в сенсорные, моторные или мозговые нейроны. Тучные клетки мозга окрашиваются аналогично тучным клеткам соединительной ткани, но характеризуются секреторными свойствами тучных клеток слизистой оболочки, что свидетельствует об особой субпопуляции специфичных тучных клеток.

После активации тучных клеток высвобождающиеся гранулы высвобождают различные факторы, способные модулировать и изменять нейропередачу сигнала и выживаемость нейронов. Среди таких факторов важным является серотонин, так как повышение уровня свободного серотонина наблюдается у пациентов в состоянии депрессии. В другом варианте внезапное повышение уровня серотонина может наблюдаться после периода недостатка серотонина, что приводит к возникновению болей и мигрени. В связи с этим предполагается, что тучные клетки усиливают аутокринный или паракринный способ разрегулирования нейротрансмиссии. Например, вызванное состоянием тревоги или стрессом высвобождение нейромедиаторов, таких как серотонин, активирует тучные клетки, которые, в свою очередь, высвобождают содержимое их гранул, что в дальнейшем вызывает химический дисбаланс в мозге и заболевания ЦНС.

Другие медиаторы, высвобождаемые тучными клетками, подразделяются на вазоактивные, ноцицептивные, провоспалительные и другие нейромедиаторы. Вместе указанные факторы вызывают серьезные нарушения активности нейронов: сенсорных, моторных нейронов или нейронов ЦНС. Кроме того, у пациентов, страдающих мастоцитозом, наблюдается склонность к развитию заболеваний ЦНС по сравнению с нормальной популяцией. Указанный факт можно объяснить наличием активирующей мутации рецептора е-кй, при этом происходит индукция дегрануляции тучных клеток и выброс факторов, которые приводят к химическому дисбалансу и изменению нейропередачи.

В некоторых случаях активированные тучные клетки также могут принимать участие в разрушении

- 14 017392 нервных тканей при высвобождении смеси различных протеаз и медиаторов, которые подразделяются на три группы: предварительно ассоциированные с гранулами медиаторы (гистамин, протеогликаны и нейтральные протеазы), содержащие липиды протеазы (простагландины, тромбоксаны и лейкотриены) и различные цитокины (ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-8, ΤΝΕ-Ά, СМ-С8Е, М1Р-ЬА, М1Р-1Ь, ΜΙΡ-2 и ΙΡΝ-γ). Высвобождение медиаторов из активированных тучных клеток (ΤΝΡ-А, гистамина, лейкотриенов, простагландинов и т.п.), а также протеаз может вызывать: 1) воспаление и расширение кровеносных сосудов и 2) процесс разрушения нервной ткани. Ингибирование активности с-кй снижает пролиферацию клеток, снижая количество тучных клеток, ответственных за развитие заболеваний и/или состояний. Таким образом, можно ожидать, что ингибиторы с-кй играют важную роль при лечении с-кйзависимых заболеваний и/или состояний, таких как заболевания ЦНС.

Установлено также, что тучные клетки принимают участие или вносят вклад в развитие симптомов лекарственной зависимости или абстиненции. Лекарственная зависимость развивается в результате так называемой переносимости, которая заключается в необходимости увеличения дозы лекарственного средства для поддержания наиболее полного эффекта, и физической зависимости, которая проявляется в привыкании организма к лекарственному средству. Если прием лекарственного средства прекращают, субъект может ощущать неприятный синдром отмены лекарственного средства (абстинентный синдром).

Активация тучных клеток при введении различных лекарственных средств, включая, но не ограничиваясь только ими, производные салициловой кислоты, производные морфина, опиоиды, героин, амфетамины, алкоголь, никотин, анальгетики, анестетики и транквилизаторы, приводит к дегрануляции тучных клеток, при которой усиливается химический дисбаланс, что является причиной лекарственной зависимости и синдрома отмены лекарственного средства. После активации тучных клеток высвобождающиеся гранулы высвобождают различные факторы, модулирующие и изменяющие нейропередачу. К указанным факторам относится морфин, который связывается или хранится в гранулах тучных клеток. Табачный дым также вызывает выделение медиаторов из тучных клеток собаки и модулирует продуцирование простагландина, что приводит к развитию астмы. Кроме того, пациенты, страдающие от мастоцитоза, в большей степени предрасположены к развитию расстройств, вызванных употреблением психоактивных лекарственных средств, по сравнению с нормальной популяцией. Этот факт можно объяснить присутствием активирующих мутаций рецептора с-кй, что вызывает дегрануляцию тучных клеток и выброс факторов, способствующих усилению химического дисбаланса и изменению нейропередачи.

В настоящее время отсутствует способ лечения, обеспечивающий снижение интенсивности синдрома лекарственной зависимости и позволяющий устранить у индивидуалов нарушения, связанные со злоупотреблением лекарственными средствами. Ингибиторы с-кй можно использовать для лечения заболеваний, связанных со злоупотреблением лекарственными средствами, прежде всего, наркотической и лекарственной зависимости, привыкания к лекарственным средствам, зависимости от лекарственных средств, синдрома отмены и передозировки лекарственных средств, и способ лечения заключается во введении соединения, которое снижает число тучных клеток у субъекта, нуждающегося в таком лечении.

Киназа с-кй характеризуется гомологией с рецептором РИСЕ (тромбоцитарного фактора роста) и рецептором С8Е-1 (с-Ешк). Данные исследований различных эритроидных и миелоидных линий клеток свидетельствуют об экспрессии гена с-кй на ранних стадиях дифференциации (см. Аибге и др., Опсодепе 4, сс. 1047-1049 (1989)). Некоторые опухоли, например глиобластомные клетки, также характеризуются выраженной экспрессией с-кй.

Тромбоцитарный фактор роста (РИСЕ).

Тромбоцитарный фактор роста (РИСЕ) играет важную роль как на стадии нормального роста, так и на стадии патологической пролиферации клеток. Соединения по настоящему изобретению могут ингибировать активность рецептора РИСЕ (РИСЕК) и их можно использовать в качестве агентов для лечения незлокачественных пролиферативных заболеваний, таких как склеродермия и другие фиброзные заболевания, атеросклероз, тромбоз или псориаз. Соединения по настоящему изобретению также можно использовать в качестве подавляющих образование опухоли веществ, например, при мелкоклеточном раке легких, глиоме, саркоме, опухоли предстательной железы, и опухоли кишки, молочной железы, и яичников.

В одном варианте соединения по настоящему изобретению можно использовать для лечения и профилактики фиброзных нарушений или заболеваний, состояний, связанных с образованием и отложением компонентов межклеточного матрикса во внутренних органах, включая почки, сердце, легкие, печень, кожу и суставы. В различных исследованиях в качестве основного действующего соединения при развитии фиброзной ответной реакции на повреждение ткани используют РОСЕК. например:

1) наблюдается положительная регуляция в альвеолярных макрофагах у пациентов, страдающих идиопатическим легочным фиброзом;

2) рецептор РЭСЕ/ является одним из первых генов, которые положительно регулируются после активации печеночных звездчатых клеток с образованием миофибробластов, что является основной стадией при развитии фиброза печени;

3) при склеродермии наблюдается значительная положительная регуляция РОСЕ и его рецепторов,

- 15 017392 а также в процессе почечного фиброгенеза;

4) ΡΌΟΡ индуцируется при повреждении и/или провоспалительными цитокинами или по аутокринному механизму на миобластах, активируя их пролиферацию, дифференциацию и миграцию. Такие миобласты затем секретируют межклеточные матричные белки и коллаген, что приводит к образованию шрамов и прогрессирующему повреждению органов. Секреция ΤΟΤΡ также в значительной степени способствует продуцированию коллагена в процессе фиброгенеза;

5) трансген ΡΌΟΡ-С вызывает развитие фиброза печени у мышей, в то же время растворимый доминантно-негативный вариант ΡΌΟΡΒβ предотвращает фиброз печени у крыс;

6) введение ΡΌΟΡ-Β в почки ускоряет развитие признаков почечного фиброгенеза у крыс.

Фиброзные заболевания или состояния, которые можно лечить с использованием соединений по настоящему изобретению, включают фиброзные заболевания легких, такие как легочный фиброз (или интерстициальное заболевание легких или интерстициальный легочный фиброз), идиопатический легочный фиброз, первичную легочную гипертензию, идиопатическую легочную артериальную гипертензию, фиброзный элемент пневмокониоза (связанный с воздействием внешних вредных факторов, таких как курение, асбест, хлопковый очес, каменная пыль, рудничная пыль и другие частицы), легочный саркоидоз, фиброзирующий альвеолит, фиброзный или гипертрофический элемент муковисцидоза, хроническое обструктивное заболевание легких, респираторный дистресс-синдром у взрослых и эмфизему. Соединения по настоящему изобретению также можно применять для лечения и профилактики заболеваний, при которых наблюдается фиброзная гипертрофия почек (почечный фиброз), печени (печеночный фиброз), сердца (сердечный фиброз), предстательной железы (например, доброкачественная гипертрофия предстательной железы), плевры (плеврит, плевральный фиброз), поджелудочной железы и кожи и/или мышечных тканей, например склеродермия, эозинофильный фасциит, дисковые повреждения, связанные с волчанкой или дискоидной волчанкой, или хирургические спайки.

Другие фиброзные заболевания или нарушения, которые можно лечить с использованием соединений по настоящему изобретению, включают, но не ограничиваясь только ими, системный склероз, смешанное заболевание соединительной ткани, фибродисплазию, фиброзно-кистозную мастопатию, саркоидоз, миозит (например, полимиозит, первичный идиопатический полимиозит, детский полимиозит, дерматомиозит, детский дерматомиозит, первичный идиопатический дерматомиозит у взрослых, миозит с телами включения, полимиозит или дерматомиозит, связанный со злокачественными опухолями), заболевания, при которых наблюдается фиброзно-васкулярная интимальная гипертрофия, такие как васкулит (включая васкулит коронарных артерий), узелковый полиартриит или височный артериит, заболевания, при которых наблюдается фиброзная гипертрофия нервной ткани, такие как церебросклероз, кольцевидный склероз, диффузный склероз и лобарный склероз, и заболевания, при которых наблюдается фиброзная гипертрофия или фиброз стенок кишечника, такие как воспаление кишечника, включая болезнь Крона.

Кроме того, соединения по настоящему изобретению также можно использовать для защиты стволовых клеток, например, для предотвращения гемотоксического воздействия хемиотерапевтических агентов, таких как 5-фторурацил, а также для лечения астмы и гиперэозинофилии. Соединения по настоящему изобретению также можно применять для лечения заболеваний, чувствительных к ингибированию рецепторной киназы ΡΌΟΡ.

Соединения по настоящему изобретению также оказывают благоприятное действие при лечении заболеваний, развивающихся в результате трансплантации, например аллогенной трансплантации, прежде всего при отторжении ткани, например облитеративном бронхиолите, т. е. хроническом отторжении аллотрансплантата легкого. В отличие от пациентов, не страдающих облитеративным бронхиолитом, у пациентов, страдающих от указанного заболевания, наблюдается повышенный уровень ΡΌΟΡ в бронхоальвеолярной промывной жидкости.

Соединения по настоящему изобретению также можно эффективно использовать для лечения заболеваний, связанных с миграцией и пролиферацией клеток гладкой мускулатуры сосудов (ΡΌΟΡ и ΡΌΟΡΡ также часто принимают участие в развитии указанных процессов), таких как рестеноз и атеросклероз. Указанные эффекты и их последствия, действующие на пролиферацию или миграцию клеток гладкой мускулатуры сосудов ίη νίΐτο и ίη νίνο, можно оценивать при введении соединений по настоящему изобретению и при изучении их влияния на утолщение интимы сосудов при механическом повреждении ίη νίνο.

С8Р1В (ΡΜ8).

Белок, кодируемый указанным геном, является рецептором колониестимулирующего фактора 1, цитокина, который контролирует продуцирование, дифференциацию и функционирование макрофагов. С8РКТ опосредует большинство, если не все биологические действия данного цитокина. Кодируемый белок является трансмембранной рецепторной тирозинкиназой и принадлежит к семейству рецепторных тирозинпротеинкиназ ί.'8Ρ1/ΡΌΟΡ. Мутации указанного гена связывают с предрасположенностью к злокачественным миелоидным заболеваниям (см., например, Сакак и др., Ьеик. Ьутрйота 44, сс. 1935-1941 (2003)).

- 16 017392

АЬ1. Тгк, 8\к, Как, КаЕ, МАРК, ТСИД. Е6ЕК3, с-8гс, 8АРК, Ьск, Еек, Скк.

Тирозинкиназа Абельсона (т.е. АЫ, с-АЫ) принимает участие в регуляции клеточного цикла, в клеточной ответной реакции на генотоксический стресс и в передаче информации о клеточном окружении через интегриновый сигнал. Белок АЫ выполняет сложную функцию клеточного модуля, который интегрирует сигнал из различных вне- и внутриклеточных источников, и управляет клеточным циклом и апоптозом. Тирозинкиназа Абельсона включает различные подтипы, такие как гибридный белок (онкопротеин) ВСК-АЫ с разрегулированной активностью тирозинкиназы, или ν-АЫ.

Гибридный белок ВСК-АЫ образуется в результате реципрокной транслокации, при которой происходит гибридизация протоонкогена АЫ с геном Всг. ВСК-АЫ трансформирует В-клетки за счет увеличения митогенной активности. Такое увеличение приводит к снижению чувствительности к апоптозу, а также к изменению адгезии и хоминга клеток-предшественников хронического миелогенного лейкоза (ХМЛ).

ВСК-АЫ играет важную роль в патогенезе, в 95% случаев ХМЛ и в 10% случаев острого лимфоцитарного лейкоза (ОЛЛ). Гливек 8Т1-571 является ингибитором онкогенной тирозинкиназы ВСК-АЫ и используется для лечения ХМЛ. Однако у некоторых пациентов на стадии бластного криза ХМЛ развивается резистентность к 8Т1-571 из-за мутаций в последовательности киназы ВСК-АЫ. В настоящее время выявлено более 22 мутаций, таких как 6250Е, Е255У, Т3151, Е317Б и М351Т.

Соединения по настоящему изобретению ингибируют киназу аЫ, например киназу ν-аЫ. Соединения по настоящему изобретению также ингибируют киназу ВСК-АЫ дикого типа и мутантные формы киназы ВСК-АЫ, и, таким образом, их можно использовать для лечения Всг-аЫ-положительных форм рака и опухолей, таких как лейкозы (прежде всего ХМЛ и ОЛЛ, в развитии которых принимает участие прежде всего апоптозные механизмы). Соединения по настоящему изобретению также можно эффективно использовать для обработки лейкозных стволовых клеток, указанные соединения можно использовать для очистки указанных клеток ίη νίίτο после удаления таких клеток (например, при удалении костного мозга) и реимплантации клеток после их очистки от раковых клеток (например, реимплантация очищенных клеток костного мозга).

Семейство 1гк нейротрофиновых рецепторов (1ткА, 1ткВ, 1ткС) повышает выживаемость, ускоряет рост и дифференциацию нейрональных и ненейрональных тканей. Белок ТгкВ экспрессируется клетками нейроэндокринного типа в тонком кишечнике и ободочной кишке, в α-клетках поджелудочной железы, в моноцитах и макрофагах лимфатических узлов и селезенки и в гранулярных слоях эпидермиса (8ЫЬауата и Ко12цт1 (1996)). Экспрессия белка ТгкВ связана с нежелательным прогрессированием опухоли Вильмса и нейробластом. Кроме того, ТгкВ экспрессируется в раковых клетках предстательной железы, но не экспрессируется в нормальных клетках.

Сигнальный путь рецепторов 1тк включает каскад активации МАРК через 811с. активированных генов Как, ЕКК-1 и ЕКК-2, и путь передачи сигнала РЬС-γ 1 (8ιΐβίιηοΙο и др., (2001)).

8ук является тирозинкиназой, которая играет важную роль в дегрануляции тучных клеток и активации эозинофилов. Соответственно, киназа 8ук принимает участие в развитии различных аллергических заболеваний, прежде всего, астмы. Установлено, что киназа 8ук связывается с фосфорилированной γцепью рецептора ЕсеК1 через Ν-концевые домены 8Н2 и играет важную роль в следующих сигнальных путях.

Сигнальный путь Как-КаЕ-МЕК-ЕКК опосредует ответную реакцию клеток на сигналы роста. В результате мутации Как образуется его онкогенная форма в ~15% случаях рака человека. Семейство КаЕ принадлежит к серин/треонинпротеинкиназам и включает три белка: А-КаЕ, В-КаЕ и с-КаЕ (или КаЕ-1). ВКаЕ может играть важную роль при формировании некоторых опухолей и при этом нет необходимости в активации аллеля Как (ИаЫте 417, сс. 949-954 (2002)). Мутации киназы В-КаЕ выявлены во множестве злокачественных меланом.

Существующие способы лечения меланомы ограничены по своей эффективности, особенно на поздних стадиях меланомы. Соединения по настоящему изобретению, кроме того, подавляют клеточные процессы с участием киназы Ь-КаЕ и являются новыми перспективными агентами, предназначенными для лечения рака человека, прежде всего, лечения меланомы.

Митогенактивированные протеинкиназы (МАРК) являются членами консервативных путей передачи сигнала, которые активируют факторы транскрипции, факторы трансляции и другие молекулымишени в ответ на различные внеклеточные сигналы. МАРК активируются при фосфорилировании двойной фосфорилируемой последовательности Ткт-Х-Тут в присутствии митоген-активированной протеинкиназы (МКК). У высших эукариотов физиологическая роль сигнала киназы МАРК коррелирует с такими клеточными процессами, как пролиферация, онкогенез, рост и дифференциация. Соответственно, способность регулировать передачу сигнала через указанные пути (прежде всего через МКК4 и МКК6) можно использовать для разработки новых способов лечения и профилактики заболеваний человека, связанных с сигнальным путем МАРК, таких как воспалительные заболевания, аутоиммунные заболевания и рак.

Многочисленные формы р38 МАРК (α, β, γ, δ), каждая из которых кодируется отдельным геном,

- 17 017392 образуют часть каскада киназ, принимающих участие в ответной реакции клеток на различные стимулы, включая осмотический стресс, УФ-излучение и опосредованные цитокинами явления. Предполагается, что четыре указанные изоформы р38 регулируют различные аспекты внутриклеточной передачи сигнала. Их активация является частью каскада передачи сигналов, которые приводят к синтезу и продуцированию противовоспалительных цитокинов, например ΤΝΡα. р38 действует при фосфорилировании субстратов, расположенных в следующих путях, включая другие киназы и факторы транскрипции. Установлено, что агенты, ингибирующие р38 киназу, блокируют продуцирование цитокинов, включая, но не ограничиваясь только ими, ΤΝΡα, ИЛ-6, ИЛ-8 и ИЛ-Ιβ.

Установлено, что моноциты периферической крови (МЦПК) экспрессируют и секретируют противовоспалительные цитокины при стимуляции липополисахаридами ίη νίίτο. Ингибиторы р38 эффективно блокируют этот эффект, если МЦПК перед стимуляцией липополисахаридами предварительно обработать указанными соединениями. Ингибиторы р38 проявляют эффективность на моделях воспалительных заболеваний у животных. Деструктивное действие многих заболеваний и состояний на организм связано с избыточным продуцированием противовоспалительных цитокинов. Способность ингибитора р38 регулировать указанное сверхпродуцирование можно использовать при разработке модифицирующих заболевание агентов.

Установлено, что молекулы, блокирующие функцию р38, проявляют эффективность для подавления резорбции костной ткани, воспаления и других иммунных и воспалительных патологий. Таким образом, безопасный и эффективный ингибитор р38 представляет собой агент для лечения истощающих заболеваний, на которые можно воздействовать за счет модуляции сигнального пути р38. Следовательно, соединения по настоящему изобретению, ингибирующие активность р38, можно использовать для лечения воспаления, остеоартрита, ревматоидного артрита, рака, аутоиммунных заболеваний и для лечения других опосредованных цитокинами заболеваний.

Трансформирующий фактор роста β (ΤΟΡβ) относится к подсемейству белков, включающему, например, ΤΟΡβΙ, Τ0Ρβ2 и Τ0Ρβ3, которые являются плеотропными модуляторами роста и дифференциации клеток, эмбрионального развития и развития костной ткани, образования внеклеточного матрикса, кроветворения, иммунных и воспалительных ответных реакций. Члены семейства ΤΟΡβ инициируют внутриклеточные сигнальные пути, приводящие в конечном итоге к экспрессии генов, которые регулируют клеточный цикл, контролируют пролиферативные ответные реакции или связаны с белками внеклеточного матрикса, которые опосредуют сигнальный путь внешняя среда-клетка, адгезию, миграцию клеток и межклеточную коммуникацию.

Следовательно, соединения по настоящему изобретению, которые являются ингибиторами внутриклеточных сигнальных путей ΤΟΡβ, можно использовать в качестве терапевтических средств для лечения фибропролиферативных заболеваний, включая заболевания почек, связанные с разрегулированной активностью ΤΟΡβ, и повышенный фиброз, включая гломерулонефрит (ГН), например мезангиальный пролиферативный ГН, иммунный ГН и ГН мениска. Другие почечные состояния включают диабетическую нефропатию, почечный интерстициальный фиброз, почечный фиброз у пациентов после трансплантации, которым вводят циклоспорин, и нефропатию, связанную с ВИЧ. Коллагеновые сосудистые нарушения включают прогрессирующий системный склероз, полимиозит, склеродермию, дерматомиозит, эозинофильный фасциит, очаговую склеродермию или заболевания, связанные с синдромом Рейно. Фиброз легких, развивающийся в результате избыточной активности ΤΟΡβ, включает респираторный дистресс-синдром, хроническое обструктивное заболевание легких у взрослых, идиопатический легочный фиброз и интерстициальный легочный фиброз, часто связанный с аутоиммунными нарушениями, такими как системная красная волчанка и склеродермия, химический контакт или аллергии. Другим аутоиммунным нарушением, связанным с фибропролиферативными процессами, является ревматоидный артрит. Фибропролиферативные состояния могут быть связаны с глазными хирургическими операциями. Такие операции включают реплантацию сетчатки, сопровождающуюся пролиферативной витреоретинопатией, удаление катаракты с имплантацией искусственного хрусталика и дренирование после операции глаукомы.

Установлено, что рецептор 3 фактора роста фибропластов оказывает отрицательное регуляторное действие на рост костной ткани и подавляет пролиферацию хондроцитов. Различные мутации в рецепторе 3 фактора роста фибропластов вызывают летальную дисплазию. Одна мутация, ΤΌΙΙ ΡΟΡΚ.3, характеризуется конститутивной активностью тирозинкиназы, которая активирует фактор транскрипции 81311, вызывая экспрессию ингибитора клеточного цикла, остановку роста и аномальное развитие костной ткани (8и и др., ΝαΙυΓΟ, 386, сс. 288-292 (1997)). Кроме того, ΕΟΕΚ.3 экспрессируется в большинстве случаев рака типа множественной миеломы.

Киназа е-8ге передает онкогенные сигналы многих рецепторов. Например, сверхэкспрессия ΕΟΕΚ. или НЕК.2/пеи в опухолях приводит к конститутивной активации киназы е-8ге, что является характерным для злокачественной клетки, но не наблюдается в нормальной клетке. С другой стороны, мыши с дефицитом экспрессии киназы е-8ге представляют собой фенотип остеопетроза, что свидетельствует о важной роли е-8ге в функционировании остеокластов и возможном участии в развитии ассоциированных нару

- 18 017392 шений.

Семейство рибосомальных протеинкиназ 86 включает по крайней мере 8 членов (В8К1, В8К2, В8К3, В8К4, М8К1, М8К2, р7086К и р7086КЬ). Рибосомальные протеинкиназы 86 выполняют важные плеотропные функции, в том числе играют важную роль в регуляции трансляции мРНК при биосинтезе белков (Еиг. 1. Вюсйет., 267 (21), сс. 6321-6330 (2000, ноябрь), Ехр. Се11. Век., 253 (1), сс. 100-109 (1999, 25 ноября), Мо1. Се11. Епйосппок, 151 (1-2), сс. 65-77 (1999, 25 мая)). Кроме того, фосфорилирование рибосомального белка 86 киназой р7086 связано с регуляцией клеточной подвижности (1ттипо1. Се11. Вю1., 78 (4), сс. 447-451 (2000, август)) и клеточного роста (Ргод. Шс1ею Лс1й Век. Мо1. Вю1., 65, сс. 101127 (2000)) и, следовательно, является важным фактором при метастазировании опухолей, иммунной ответной реакции и регенерации тканей, а также при других патологических состояниях.

Стресс-активируемые протеинкиназы (8АРК, так называемые Ν-концевые киназы _)ип или киназы 1ΝΙ<) представляют собой семейство протеинкиназ, которые принимают участие на предпоследней стадии пути передачи сигнала, при этом происходит активация фактора транскрипции с-)ип и экспрессия генов, регулируемых с-щп. Прежде всего, с-)нп принимает участие в транскрипции генов, которые кодируют белки, связанные с репарацией ДНК, поврежденной вследствие генотоксических факторов. Агенты, которые ингибируют активность 8АРК в клетке, предотвращают репарацию ДНК и сенсибилизируют клетку к противораковым терапевтическим агентам, которые действуют за счет индукции повреждения ДНК.

Ьск принимает участие в передаче сигнала Т-клетками. У мышей с отсутствием гена Ьск наблюдается низкий уровень тимоцитов. Функция Ьск в качестве положительного активатора передачи сигнала Т-клетками свидетельствует о том, что ингибиторы Ьск можно использовать для лечения аутоиммунного заболевания, такого как ревматоидный артрит.

Еек интенсивно экспрессируется в миелоидных кроветворных клетках и принимает участие в путях передачи сигнала дифференциации и выживания миелоидных лейкоцитов. С8К принимает участие в развитии рака, прежде всего, колоректального рака и рака молочной железы.

В соответствии с указанным выше в настоящем изобретении предлагается также способ профилактики или лечения любого описанного выше заболевания или нарушения у субъекта, нуждающегося в указанном лечении, причем способ заключается в том, что указанному субъекту вводят терапевтически эффективное количество (см. раздел Способы введения и фармацевтические композиции ниже) соединения формулы (1), (2А), (2В) или (С) или его фармацевтически приемлемой соли. Для любого из указанных выше применений требуемые дозировки изменяются в зависимости от способа введения, конкретного состояния, подлежащего лечению, и требуемого действия.

Способы введения и фармацевтические композиции.

Использованный в данном контексте термин фармацевтическая композиция обозначает смесь соединения по настоящему изобретению с другими химическими компонентами, такими как носители, стабилизаторы, разбавители, диспергирующие агенты, суспендирующие агенты, загустители, и/или эксципиентами. Фармацевтическая композиция ускоряет введение соединения в организм. Фармацевтические композиции, содержащие соединение по настоящему изобретению, можно вводить в терапевтически эффективных количествах в виде фармацевтических композиций в любой стандартной форме и любым известным способом, включая, не ограничиваясь только ими: внутривенное, пероральное, ректальное, аэрозольное, парентеральное, офтальмологическое, легочное, чрескожное, вагинальное, ушное, назальное и местное введение.

Соединение предпочтительно вводят местным способом, а не системным, например инъекцией соединения напрямую в орган, в большинстве случаев в составе с замедленным всасыванием или с замедленным высвобождением. Кроме того, фармацевтическую композицию, содержащую соединение по настоящему изобретению, можно вводить в виде системы направленной доставки лекарственных средств, например в виде липосомы с покрытием из органоспецифических антител. Липосомы доставляются в мишень и селективно поглощаются органом. Кроме того, фармацевтические композиции, содержащие соединение по настоящему изобретению, можно вводить в форме состава с быстрым высвобождением, в форме состава с замедленным высвобождением или в форме состава с промежуточной скоростью высвобождения.

Для перорального введения соединение по настоящему изобретению можно перерабатывать, например, при простом смешивании активных соединений с известными фармацевтически приемлемыми носителями или эксципиентами. Указанные носители позволяют перерабатывать соединения, описанные в данном контексте, в таблетки, порошки, пилюли, драже, капсулы, жидкости, гели, сиропы, эликсиры, суспензии, эмульсии и т. п., которые пациент, нуждающийся в лечении, проглатывает.

Фармацевтические препараты для перорального введения получают при смешивании одного или более твердых эксципиентов с одним или более соединений, описанных в данном контексте, необязательно измельчении полученной смеси и при переработке смеси гранул с последующим добавлением при необходимости пригодных вспомогательных веществ, при этом получают таблетки или ядра драже. Пригодными эксципиентами являются, прежде всего, наполнители, такие как сахара, включая лактозу,

- 19 017392 сахарозу, маннит или сорбит, препараты целлюлозы, такие как, например, кукурузный крахмал, пшеничный крахмал, рисовый крахмал, картофельный крахмал, желатин, трагакантовая камедь, метилцеллюлоза, микрокристаллическая целлюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы, или другие соединения, такие как поливинилпирролидон (ПВП или повидон) или фосфат кальция. При необходимости можно добавлять дезинтегрирующие агенты, такие как сшитая натриевая соль кроскармеллозы, поливинилпирролидон, агар, или альгиновая кислота или ее соль, такая как альгинат натрия.

На ядра драже наносят также пригодные покрытия. Для этой цели используют концентрированные растворы сахара, которые необязательно содержат аравийскую камедь, тальк, поливинилпирролидон, гель карбопол, полиэтиленгликоль, и/или диоксид титана, растворы глазури и пригодные органические растворители или смеси растворителей. Для идентификации или характеризации различных комбинаций доз активного соединения в состав покрытия для таблетки или драже добавляют красители или пигменты.

Фармацевтические препараты, которые можно вводить перорально, включают твердые капсулы, состоящие из двух частей, изготовленные из желатина, а также мягкие закрытые капсулы, изготовленные из желатина и пластификатора, такого как глицерин или сорбит. Твердые капсулы из двух частей включают активные ингредиенты в смеси с наполнителем, таким как лактоза, связующими, такими как крахмалы, и/или замасливателями, такими как тальк или стеарат магния, и, необязательно, стабилизаторами. Мягкие капсулы заполнены раствором или суспензией активных соединений в пригодных жидкостях, таких как жирные масла, вазелин, или жидкие полиэтиленгликоли. Кроме того, добавляют стабилизаторы.

Для буккального или сублингвального введения композиции перерабатывают стандартным способом и получают таблетки, лепешки или гели. Парентеральные инъекции включают струйное вливание или непрерывное вливание. Фармацевтическую композицию соединения по настоящему изобретению перерабатывают и получают форму, пригодную для парентеральной инъекции, такую как стерильные суспензии, растворы или эмульсии в масляных или водных носителях, и указанная форма включает агенты для получения составов, такие как суспендирующие агенты, стабилизаторы и/или диспергирующие агенты. Фармацевтические составы для парентерального введения включают водные растворы активных соединений в водорастворимой форме. Кроме того, суспензии активных соединений получают в виде соответствующих масляных суспензий для инъекций. Пригодные липофильные растворители или носители включают жирные масла, такие как кунжутное масло, или сложные эфиры синтетических жирных кислот, такие как этилолеат, или триглицериды, или липосомы. Водные суспензии для инъекций содержат соединения, которые повышают вязкость суспензии, такие как натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы, сорбит или декстран. Суспензия необязательно также включает пригодные стабилизаторы или агенты, которые повышают растворимость соединений, что позволяет получать высококонцентрированные растворы. В другом варианте активный ингредиент представляет собой порошок, который перед введением смешивают с пригодным носителем, например стерильной апирогенной водой.

Соединения по настоящему изобретению вводят местным способом и получают в виде различных композиций, предназначенных для введения местным способом, таких как растворы, суспензии, лосьоны, гели, пасты, лечебные губные помады, бальзамы, кремы или мази. Указанные фармацевтические соединения содержат солюбилизаторы, стабилизаторы, агенты, повышающие тоничность, буферные вещества и консерванты.

В составах, пригодных для чрескожного введения, используются устройства и пластыри для чрескожной доставки, и указанные составы представляют собой липофильные эмульсии или буферные водные растворы, растворенные и/или диспергированные в полимере или адгезиве. Конструкция указанных пластырей обеспечивает непрерывную, периодическую доставку фармацевтических агентов или доставку в требуемый момент времени. Кроме того, чрескожную доставку соединений по настоящему изобретению осуществляют с использованием ионтофоретических пластырей и т.п. Кроме того, чрескожные пластыри обеспечивают контролируемую доставку соединений по настоящему изобретению. Скорость абсорбции уменьшают за счет использования мембран, контролирующих скорость высвобождения, или за счет удерживания соединения в полимерной матрице или геле. С другой стороны, можно использовать ускорители абсорбции для повышения скорости абсорбции. Агент или носитель, повышающий скорость абсорбции, включает абсорбируемые фармацевтически приемлемые растворители, которые повышают проницаемость активного агента через кожу. Например, устройства для чрескожной доставки представляют собой повязку, включающую основу, резервуар, содержащий соединения необязательно в смеси с носителями, необязательно барьер, контролирующий скорость доставки соединения на кожу пациента и обеспечивающий контролируемую предварительно определенную скорость в течение продолжительного периода времени, и средство для закрепления устройства на коже.

Для введения ингаляцией соединения по настоящему изобретению перерабатывают и получают аэрозоль, спрей или порошок. Фармацевтические композиции соединений по настоящему изобретению можно доставлять в форме аэрозоля из емкости или распылителя под давлением в смеси с пригодным пропеллентом, например дихлордифторметаном, трихлорфторметаном, дихлортетрафторэтаном, диоксидом углерода или другим пригодным газом. В случае аэрозоля под давлением доставку стандартной дозы

- 20 017392 осуществляют с использованием клапана, отмеряющего определенное количество аэрозоля. Капсулы и картриджи, например, из желатина, предназначенные для использования в ингаляторе или инсуффляторе, заполняют порошкообразной смесью соединения и пригодной порошкообразной основы, такой как лактоза или крахмал.

Соединения по настоящему изобретению также перерабатывают в форму ректальных композиций, такую как клизмы, ректальные гели, ректальные пены, ректальные аэрозоли, суппозитории, желеобразные суппозитории, или удерживающие клизмы, содержащие стандартные основы для суппозиториев, такие как кокосовое масло или другие глицериды, а также синтетические полимеры, такие как поливинилпирролидон, ПЭГ и т.п. В суппозиториях, содержащих композиции, сначала плавится низкоплавкий воск, такой как, не ограничиваясь только ими, смесь глицеридов жирных кислот, необязательно в комбинации с кокосовым маслом.

Фармацевтические композиции перерабатывают стандартным способом, используя один или более физиологически приемлемый носитель, включая эксципиенты и вспомогательные вещества, которые ускоряют переработку активных соединений в фармацевтические препараты. Соответствующий состав зависит от выбранного способа введения. Для получения составов можно использовать любые методики, носители и эксципиенты, известные в данной области техники. Фармацевтические композиции, включающие соединение по настоящему изобретению, можно получать стандартным способом, например при стандартном смешивании, растворении, грануляции, получении драже, растирании, эмульгировании, инкапсулировании, включении в матрицу или прессовании.

Фармацевтические композиции включают по крайней мере один фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или эксципиент и соединение формулы (1), (2А) или (2В), описанное в данном контексте, в качестве активного ингредиента в форме свободной кислоты, или в форме свободного основания, или в форме его фармацевтически приемлемой соли. Кроме того, способы и фармацевтические композиции, описанные в данном контексте, включают применение Ν-оксидов, кристаллических форм (известных как полиморфные формы), а также активных метаболитов указанных соединений, характеризующихся активностью аналогичного типа. В некоторых вариантах соединения могут существовать в виде таутомеров. Все таутомеры включены в качестве соединений в объем настоящего изобретения. Кроме того, соединения, описанные в данном контексте, могут существовать в несольватированной, а также в сольватированной формах, включающих фармацевтически приемлемые растворители, такие как вода, этанол и т. п. Сольватированные формы соединений, представленных в настоящем описании, также включены в объем настоящего изобретения. Кроме того, фармацевтические композиции включают другие лекарственные препараты или фармацевтические агенты, носители, адъюванты, такие как консерванты, стабилизаторы, смачивающие или эмульгирующие агенты, агенты, повышающие растворимость, соли для регуляции осмотического давления, и/или буферные вещества. Кроме того, фармацевтические композиции содержат другие терапевтически ценные соединения.

Способы получения композиций, включающих соединения, описанные в данном контексте, включают переработку соединений в смеси с одним или более инертных, фармацевтические приемлемых эксципиентов или носителей, при этом получают твердые, полутвердые или жидкие композиции. Твердые композиции включают, не ограничиваясь только ими, порошки, таблетки, диспергируемые гранулы, капсулы, пакетики и суппозитории. Жидкие композиции включают растворы, в которых растворено соединение, эмульсии, включающие соединение, или раствор, содержащий липосомы, мицеллы или наночастицы, включающие соединение, описанное в данном контексте. Полутвердые композиции включают, не ограничиваясь только ими, гели, суспензии и кремы. Композиции представляют собой жидкие растворы или суспензии, твердые формы, пригодные для растворения или суспендирования перед введением, или эмульсии. Указанные композиции включают также незначительные количества нетоксичных вспомогательных веществ, таких как смачивающие или эмульгирующие агенты, буферные вещества (стабилизирующие рН) и т.п.

Краткое описание фармацевтических композиций, описанных в данном контексте, приведено, например, в книге ВетшдФп, ТНе 8с1епсе апй Ргасйсе о£ Рйагтасу, 19 изд. (Еайоп, Ра., Маск РиЫгаЫпд Сотрапу (1995)), в книге Ноотег ТЕ., ВетшдФп'к Р11агтасеиНса1 8с1епсе§, Маск РиЬШЫпд Со., Еайоп, Пенсильвания (1975), в книге ЫЬегтап Н.А. и ЬасЬтап Ь.Е., Рйагтасеи11са1 Эокаде Еогтк, Магсе1 Эескег, Нью-Йорк, Ν.Υ. (1980), а также в книге Р11агтасеиНса1 Эокаде Еогтк апй Эгид Эейуегу 8уйет5, 7^ое изд. (Ырртсой ХУППапъ & ХУйкиъ (1999)), включенных в настоящее описание в полном объеме в качестве ссылок.

Способы введения и способы лечения.

Композиции, включающие соединение(я), описанное(ые) в данном контексте, можно вводить для профилактики и/или лечения. В терапевтических целях композиции вводят пациенту, который уже страдает от заболевания или состояния, в количестве, достаточном для лечения или, по крайней мере, частичной остановки развития симптомов заболевания или состояния. Специалист в данной области определяет указанные терапевтически эффективные количества стандартными методами (включая, не ограничиваясь только ими, клинические испытания с повышением дозы).

- 21 017392

Соединения по настоящему изобретению можно использовать в комбинации со вторым терапевтическим агентом. Например, если при введении одного из соединений, описанных в данном контексте, одним из побочных действий, испытываемых пациентом, является воспаление, соединения по настоящему изобретению можно вводить в комбинации с противовоспалительным агентом. Терапевтическую эффективность соединения, описанного в данном контексте, можно также повысить при введении адъюванта. При введении соединений по настоящему изобретению совместно с другими терапевтическими агентами дозировки совместно вводимых соединений изменяются в зависимости от типа совместного лекарственного средства, специфичности применяемого лекарственного средства, заболевания или состояния, подлежащего лечению, и т.п. Кроме того, при совместном введении с одним или более биологически активных агентов соединения по настоящему изобретению можно вводить одновременно с биологически активным агентом(ами) или последовательно. При введении соединения по настоящему изобретению в комбинации с вторым терапевтическим агентом можно наблюдать аддитивное или синергетическое действие.

В некоторых примерах соединения по настоящему изобретению можно использовать в комбинации с противофиброзным агентом, например с агентом, который препятствует развитию фиброзного заболевания (или модулирует его), такого как склеродермия, легочный фиброз, идиопатический легочный фиброз, первичная легочная гипертензия, первичная легочная артериальная гипертензия, идиопатическая артериальная гипертензия, фиброз печени, фиброз почек и фиброз сердца. Примеры противофиброзных агентов, которые можно использовать в комбинации с соединением по настоящему изобретению, включают, не ограничиваясь только ими, пирфенидон (ΝαΚαζοΙο и др., Еиг. 1. Рйаттасо1., 446, сс. 177-185 (2002)), такролимус (№щапо и др., Еиг. Векрш 1., 27, сс. 460-469 (2006)) или 5-хлор-2-{(1Е)-3-[2-(4метоксибензоил)-4-метил-1Н-пиррол-1 -ил]проп-1 -ен-1-ил}-№(метилсульфонил)бензамид (8МР-534,

8идати и др., Ат. 1. №рйто1о§у, 26, сс. 50-58 (2006)). Соединения по настоящему изобретению можно также использовать в комбинации с противовоспалительным агентом, включая, не ограничиваясь только ими, кортикостероиды и кромолины, антагонисты лейкотриена и блокаторы 1дЕ, такие как омализумаб. В других примерах соединения по настоящему изобретению можно использовать в комбинации с лекарственным средством, предназначенным для лечения астмы, например с бронхолитическими средствами, такими как 3₂-агонисты, с ксантинами (например, метилксантины) и антихолинергическими средствами, а также с противовоспалительным агентом, как описано выше.

Соединения по настоящему изобретению можно также использовать в комбинации с химиотерапевтическим агентом, предназначенным для лечения нарушения клеточной пролиферации, включая, не ограничиваясь только ими, лимфому, остеосаркому, меланому, или опухоль молочной железы, почек, предстательной железы, колоректальную опухоль, опухоль щитовидной железы, яичников, поджелудочной железы, нейрональную опухоль, опухоль легких, матки или опухоль желудочно-кишечного тракта. Примеры химиотерапевтических агентов, которые можно использовать в композициях и способах по настоящему изобретению, включают, не ограничиваясь только ими, антрациклины, алкилирующие агенты (например, митомицин С), алкилсульфонаты, азиридины, этиленимины, метилмеламины, азотистый иприт, нитрозомочевины, антибиотики, антиметаболиты, аналоги фолиевой кислоты (например, ингибиторы дигидрофолатредуктазы, такие как метотрексат), аналоги пурина, аналоги пиримидина, ферменты, подофиллотоксины, агенты, содержащие платину, интерфероны и интерлейкины. Конкретные примеры известных химиотерапевтических агентов, которые можно использовать в композициях и способах по настоящему изобретению, включают, не ограничиваясь только ими, бусульфан, ипросульфан, пипосульфан, бензодепу, карбохинон, метуридепу, уридепу, алтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид, триметилолмеламин, хлорамбуцил, хлорнафазин, циклофосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлоретамин, гидрохлорид оксида мехлоретамина, мелфалан, новембихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урамустин, кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин, ранимустин, дакарбазин, манномустин, митобронитол, митолактол, пипоброман, аклациномицины, актиномицин Е(1), антрамицин, азасерин, блеомицин, кактиномицин, карубицин, карзинофилин, хромомицин, дактиномицин, даунорубицин, дауномицин, 6-диазо-5-оксо-1-норлейцин, доксорубицин, эпирубицин, митомицин С, микофеноловая кислота, ногаламицин, оливомицин, пепломицин, пликамицин, порфиромицин, пуромицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберсидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин, деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат, флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин, анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин, фторурацил, тегафур, Ь-аспарагиназу, пульмозим, ацеглатон, альдофосфамидгликозид, аминолевулиновую кислоту, амзакрин, бестрабуцил, бисантрен, карбоплатин, цисплатин, дефофамид, демеколцин, диазихинон, элфорнитин, ацетат эллиптиния, этоглуцид, этопозид, флутамид, нитрат галлия, гидроксимочевину, а-интерферон, β-интерферон, γ-интерферон, интерлейкин 2, лентинан, лонидамин, митогуазон, митоксантрон, мопидамол, нитракрин, пентостатин, фенамет, пирарубицин, подофиллиновую кислоту, 2-этилгидразид, прокарбазин, разоксан, сизофиран, спирогерманий, паклитаксел, тамоксифен, тенипозид, тенуазоновую кислоту, триазихинон, 2,2',2-трихлортриэтиламин, уретан, винбластин, винкристин и виндезин.

- 22 017392

В основном, соединения по настоящему изобретению вводят в терапевтически эффективных количествах любым известным стандартным и приемлемым способом, в отдельности или в комбинации с одним или более терапевтических агентов. Терапевтически эффективное количество изменяется в широких пределах в зависимости от тяжести заболевания, возраста и относительного состояния здоровья субъекта, эффективности используемого соединения и других факторов. В основном установлено, что удовлетворительные результаты достигаются при системном введении в суточных дозах от приблизительно 0,03 до 2,5 мг/кг массы тела. Указанная суточная дозировка для крупного млекопитающего, например человека, находится в диапазоне от приблизительно 0,5 до приблизительно 100 мг, которую обычно вводят, например, в разделенных дозах вплоть до четырех раз в сутки или в форме с замедленным высвобождением. Пригодные стандартные лекарственные формы для перорального введения включают от приблизительно 1 до 50 мг активного ингредиента.

Токсичность и терапевтическую эффективность в ходе указанных курсов лечения определяют стандартными фармацевтическими методами с использованием культур клеток или экспериментальных животных, включая, не ограничиваясь только ими, определение ЬО₅₀ (летальную дозу для 50% популяции) и ΕΌ₅₀ (терапевтически эффективную дозу для 50% популяции). Терапевтический индекс определяют по соотношению дозы, оказывающей токсическое действие, к дозе, оказывающей терапевтическое действие, т.е. терапевтический индекс равен ΕΌ₅₀/ΕΌ₅₀. Данные, полученные при проведении анализов с использованием клеточных культур и испытаний на моделях животных, можно использовать для определения диапазона доз для введения человеку. Дозировка указанных соединений предпочтительно находится в диапазоне концентраций в кровотоке, который включает ΕΌ₅₀ с минимальной токсичностью. Дозировку изменяют в пределах указанного диапазона в зависимости от применяемой лекарственной формы и используемого способа введения.

Способы получения соединений по настоящему изобретению.

Общие методики получения соединений по настоящему изобретению приведены ниже в разделе Примеры. Если в составе конечного продукта присутствуют реакционноспособные функциональные группы, например гидроксигруппы, аминогруппы, иминогруппы, тиогруппы или карбоксигруппы, то при проведении указанных реакций указанные группы защищают для предотвращения их нежелательного участия в реакциях. Стандартные защитные группы используют в соответствии с общепринятой практикой, например, см. Огеепе Τ.^. и \Уи1з Ρ.Ο.Μ. в книге ΡιόΝ^λό Огоирз ίη Огдашс Сйет1зйу, ίοΐιη ^11еу апй 8опз (1991).

Соединение по настоящему изобретению получают в виде фармацевтически приемлемой кислотноаддитивной соли при взаимодействии соединения в форме свободного основания с фармацевтически приемлемой неорганической или органической кислотой. В другом варианте фармацевтически приемлемую основно-аддитивную соль соединения по настоящему изобретению получают при взаимодействии соединения в форме свободной кислоты с фармацевтически приемлемым неорганическим или органическим основанием. В другом варианте солевые формы соединений по настоящему изобретению получают с использованием солей исходных или промежуточных соединений.

Формы свободной кислоты или свободного основания соединений по настоящему изобретению можно получить из соответствующей основно-аддитивной соли или кислотно-аддитивной соли, соответственно. Например, соединение по настоящему изобретению в форме кислотно-аддитивной соли превращают в соответствующее свободное основание при обработке пригодным основанием (например, раствором гидроксида аммония, гидроксида натрия и т. п.). Соединение по настоящему изобретению в форме основно-аддитивной соли превращают в соответствующую свободную кислоту при обработке пригодной кислотой (например, соляной кислотой и т.д.).

Соединения по настоящему изобретению в неокисленной форме можно получить из Ν-оксидов соединений по настоящему изобретению при обработке восстанавливающим агентом (например, серой, диоксидом серы, трифенилфосфином, боргидридом лития, боргидридом натрия, трихлоридом фосфора, трибромидом фосфора или т. п.) в пригодном инертном органическом растворителе (например, ацетонитриле, этаноле, водном растворе диоксана или т.п.) при температуре от 0 до 80°С.

Пролекарства соединений по настоящему изобретению получают известными способами (например, более подробная информация приведена в статье 8аи1шег и др., Вюогдашс апй Мейюша1 Сйепиз1гу йейегз, т. 4, с. 1985 (1994)). Например, соответствующие пролекарства получают при взаимодействии немодифицированного соединения по настоящему изобретению с пригодным карбамилирующим агентом (например, 1,1-ацилоксиалкилкарбанохлоридатом, паранитрофенилкарбонатом или т.п.).

Защищенные производные соединений по настоящему изобретению получают известными способами. Подробное описание методик, используемых для введения защитных групп и их удаления, приведено в книге Огеепе Τ.^. ΡΐΌ^Ιίη§ Огоирз ίη Огдашс Сйет1зйу, 3^е изд., 1ойп \Уйеу апй 8опз, 1пс. (1999).

Соединения по настоящему изобретению получают стандартным способом по настоящему изобретению или способом по изобретению в виде сольватов (например, гидратов). Гидраты соединений по настоящему изобретению получают стандартным способом при перекристаллизации из водно- 23 017392 органических смесей растворителей с использованием органических растворителей, таких как диоксан, тетрагидрофуран или метанол.

Соединения по настоящему изобретению можно получить в виде их индивидуальных стереоизомеров при взаимодействии рацемической смеси соединения с оптически активным разделяющим агентом, при этом получают пару диастереоизомерных соединений, разделяют диастереомеры и выделяют оптически чистые энантиомеры. Разделение энантиомеров проводят с использованием ковалентных диастереомерных производных соединений по настоящему изобретению, или с использованием диссоциирующих комплексов (например, кристаллических диастереомерных солей). Диастереомеры характеризуются различными физическими свойствами (например, температурами плавления, температурами кипения, растворимостью, реакционной способностью и т.п.), и их разделяют на основе указанных различий. Диастереомеры разделяют с использованием хроматографии или методик разделения, основанных на различиях в растворимости. Затем из смеси выделяют оптически чистый энантиомер и разделяющий агент любыми известными способами, которые не приводят к рацемизации. Более подробное описание методик, используемых для разделения стереоизомеров соединений из их рацемической смеси, приведено в книге 1асс.|ие5 1., Со11е1 А., 8атие1 Η.ν. Епаиботега, Касета1ек апб КекоМопк, 1оНп \Убеу Апб 8оп§, 1пс. (1981).

В основном, соединения формулы (1), (2А), (2В) или (2С) получают способом, который включает следующие стадии:

(a) общие методики, как описано ниже в разделе Примеры;

(b) необязательное превращение соединения по настоящему изобретению в его фармацевтически приемлемую соль;

(c) необязательное превращение солевой формы соединения по настоящему изобретению в несолевую форму;

(б) необязательное превращение неокисленной формы соединения по настоящему изобретению в фармацевтически приемлемый Ν-оксид;

(е) необязательное превращение соединения по настоящему изобретению в форме Ν-оксида в его неокисленную форму;

(ί) необязательное выделение индивидуального изомера соединения по настоящему изобретению из смеси изомеров;

(д) необязательное превращение немодифицированного соединения по настоящему изобретению в фармацевтически приемлемое пролекарство и (11) необязательное превращение пролекарства соединения по настоящему изобретению в его немодифицированную форму.

Получение исходных соединений подробно не описано, поскольку соединения являются известными, или их можно получить по известным методикам, или как описано ниже в примерах. Специалисту в данной области представляется очевидным, что приведенные выше превращения представлены только в качестве типичных примеров способов получения соединений по настоящему изобретению и что можно использовать другие известные способы.

Следующие примеры представлены только для иллюстрации настоящего изобретения и не ограничивают его объем.

Получение промежуточных соединений

Получение 5-[5-(4-метоксифенил)пиримидин-2-иламино]пиридин-2-карбоновой кислоты 5.

5-Аминопиридин-2-карбоновую кислоту 1 (5,4 ммоль) растворяли в смеси бензол/МеОН (3:1, 40 мл) и охлаждали на ледяной бане до 0°С. В раствор медленно добавляли 2М раствор ΤΜ8ί.Ή₂Ν₂ в Εΐ₂Ο (6,5 ммоль). После завершения добавления реакционную смесь нагревали до КТ и перемешивали в течение 6 ч. После удаления растворителя в вакууме получали метиловый эфир 5-аминопиколиновой кислоты 2, который использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.

МС т/ζ: 153,1 (М+1)⁺.

В флакон помещали метиловый эфир 5-аминопиколиновой кислоты 2 (0,83 ммоль), 2-хлор-5-(4метоксифенил)пиримидин 3 (0,83 ммоль), Рб(ОАс)₂ (0,124 ммоль), реагент хаиШрйок (0,124 ммоль),

- 24 017392

Ск₂СО₃ (0,83 ммоль) и безводный 1,4-диоксан (5 мл). Флакон дважды вакуумировали и заполняли азотом, смесь нагревали в микроволновом реакторе при 130°С в течение 20 мин. Флакон охлаждали до КТ и реакционную смесь разбавляли ДХМ, промывали 10% раствором ΝΗ₄ί.Ί. солевым раствором и сушили над Ыа₂8О₄. Растворитель удаляли в вакууме и неочищенный остаток растирали в ЕЮАс, при этом получали метиловый эфир 5-[5-(4-метоксифенил)пиримидин-2-иламино]пиридин-2-карбоновой кислоты 4 в виде твердого вещества светло-коричневого цвета.

Ή ЯМР (400 МГц, й₆-ДМСО): δ 10,62 (к, 1Н), 8,93 (к, 2Н), 8,83 (ушир. к, 1Н), 8,46 (й, 1=8,0 Гц, 1Н, 8,27 (й, 1=8,0 Гц, 1Н), 7,72-7,70 (т, 2Н), 7,08-7,06 (т, 2Н), 3,86 (к, 3Н), 3,81 (к, 3Н).

МС т/ζ: 337,1 (М+1)⁺.

В суспензию метилового эфира 5-[5-(4-метоксифенил)пиримидин-2-иламино]пиридин-2карбоновой кислоты 4 (0,3 ммоль) в смеси ТГФ/МеОН/Н₂О (3:2:1, 5 мл) добавляли 6М ЫОН (1,8 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 12 ч. Затем растворитель удаляли в вакууме, остаток разбавляли Н₂О (6 мл) и рН доводили до нейтральных значений добавлением 6М НС1. Твердое вещество, которое выпадало в осадок, собирали, промывали водой и сушили в вакуум-сушильном шкафу в течение 12 ч, при этом получали 5-[5-(4-метоксифенил)пиримидин-2-иламино]пиридин-2-карбоновую кислоту 5 в виде твердого вещества желтого цвета, которую использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.

МС т/ζ: 323,2 (М+1)⁺.

5-[5-(4-Метоксифенил)пиримидин-2-иламино]-2-метилникотиновая кислота 10.

В раствор этилового эфира 2-метил-5-нитроникотиновой кислоты 7 (1,43 ммоль) в МеОН (15 мл) добавляли Ρй (5% на угле, влажность 50%, 10 мас.%). После продувки реакционную смесь перемешивали в атмосфере водорода в течение 3 ч. Растворитель фильтровали через целит и осадок на целите промывали МеОН. Растворитель удаляли в вакууме, при этом получали этиловый эфир 5-амино-2метилникотиновой кислоты 8 в виде твердого вещества желтого цвета, которое использовали без дополнительной очистки.

Ή ЯМР (400 МГц, й₆-ДМСО) δ 7,19 (й, 1=4,0 Гц, 1Н), 6,78 (й, 1=4,0 Гц, 2Н), 4,10 (к, 2Н), 3,56 (ф 1=8,0 Гц, 2Н), 1,80 (к, 3Н), 0,59 (ΐ, 1=8,0 Гц, 3Н).

МС т/ζ: 182,0 (М+1)⁺.

В флакон помещали этиловый эфир 5-амино-2-метилникотиновой кислоты 8 (1,25 ммоль), 2-хлор-5(4-метоксифенил)пиримидин 3 (1,25 ммоль), Ρй(ОΑс)₂ (0,187 ммоль), реагент хаШйрйок (0,187 ммоль), Ск₂СО₃ (1,25 ммоль) и безводный 1,4-диоксан (8 мл). Флакон вакуумировали и заполняли азотом (указанные процедуры повторяли два раза), реакционную смесь нагревали на масляной бане при 100°С в течение 2 ч. Флакон охлаждали до КТ и реакционную смесь разбавляли ДХМ, промывали 10% раствором ΝΠ₄Ο, солевым раствором и сушили над №₂8О₄. Растворитель удаляли в вакууме и неочищенный остаток очищали хроматографией на коротком слое силикагеля (элюент: ДХМ/МеС№МеОН, 8:2,5:0,5), при этом получали этиловый эфир 5-[5-(4-метоксифенил)пиримидин-2-иламино]-2-метилникотиновой кислоты 9 в виде твердого вещества светло-желтого цвета.

Ή ЯМР (400 МГц, йе-ДМСО): δ 10,13 (к, 1Н), 9,10 (й, 1=4,0 Гц, 1Н), 8,94 (к, 2Н), 8,78 (й, 1=4,0 Гц, 1Н), 7,79-7,77 (т, 2Н), 7,16-7,14 (т, 2Н), 4,45 (ф 1=8,0 Гц, 2Н), 3,90 (к, 3Н), 2,75 (к, 3Н), 1,45 (ΐ, 1=8,0 Гц, 3Н).

МС т/ζ: 365,1 (М+1)⁺.

В суспензию этилового эфира 5-[5-(4-метоксифенил)пиримидин-2-иламино]-2-метилникотиновой кислоты 9 (0,9 ммоль) в смеси ТГФ/МеОН/Н₂О, 3:2:1 (7 мл) добавляли 6М ЫОН (2,7 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 12 ч. Затем растворитель удаляли в вакууме, остаток разбавляли Н2О (6 мл) и рН доводили до нейтральных значений добавлением 6М НС1. Полученное твердое вещество отделяли фильтрованием, промывали водой и сушили в вакуум-сушильном шкафу в течение 12 ч, при этом получали 5-[5-(4-метоксифенил)пиримидин-2-иламино]-2-метилникотиновую кислоту 10 в виде твердого вещества грязно-белого цвета, которую использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.

МС т/ζ: 337,2 (М+1)⁺.

№5-[5-(4-Метоксифенил)пиримидин-2-ил]-2-метилпиридин-3,5-диамин 12.

- 25 017392

В суспензию 5-[5-(4-метоксифенил)пиримидин-2-иламино]-2-метилникотиновой кислоты 10 (0,59 ммоль) в безводном трет-ВиОН (15 мл) добавляли ТЭА (8,3 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 30 мин, затем по каплям добавляли ΌΡΡΑ (8,3 ммоль). Затем смесь в колбе кипятили с обратным холодильником в течение 4 ч. Растворитель удаляли при пониженном давлении и вязкий маслообразный остаток очищали препаративной ЖХВР (элюент: градиент ΜеСN 20-90%), при этом получали трет-бутиловый эфир {5-[5-(4-метоксифенил)пиримидин-2-иламино]-2-метилпиридин-3-ил}карбаминовой кислоты 11.

Ή ЯМР (400 МГц, а₆-ДМСО): δ 10,22 (ушир. 8, 1Н), 9,17 (ушир. 8, 1Н), 8,87 (8, 2Н), 8,50 (ушир. 8, 1Н), 7,70-7,68 (т, 2Н), 7,07-7,05 (т, 2Н), 3,81 (8, 3Н), 2,46 (8, 3Н), 1,58 (8, 9Н).

МС т/ζ: 408,1 (М+1)⁺.

Трет-бутиловый эфир {5-[5-(4-метоксифенил)пиримидин-2-иламино]-2-метилпиридин-3-ил}карбаминовой кислоты 11 (0,33 ммоль) растворяли в ДХМ (2 мл) и обрабатывали ТФУ (3 мл). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 2 ч. Растворитель удаляли, при этом получали твердый остаток грязно-белого цвета. Остаток переносили в воду, рН доводили до нейтральных значений добавлением

5% №ьСОз и экстрагировали смесью ДХМ/ΙΡΑ, 3:1 (3x40 мл). Органический слой промывали солевым раствором и сушили над №ьЗО₄. После упаривания органического растворителя при пониженном давлении получали №-[5-(4-метоксифенил)пиримидин-2-ил]-2-метилпиридин-3,5-диамин 12, который использовали без дополнительной очистки.

Ή ЯМР (400 МГц, а₆-ДМСО): δ 10,37 (8, 1Н), 8,90 (8, 2Н), 8,47 (ушир. 8, 1Н), 7,79 (ушир. 8, 1Н), 7,71-7,69 (т, 2Н), 7,08-7,06 (т, 2Н), 6,36 (ушир. 8, 2Н), 3,81 (8, 3Н), 2,43 (8, 3Н).

МС т/ζ: 308,2 (М+1)⁺.

2-Хлор-5-(4-(дифторметокси)фенил)пиримидин 17.

ОСНРз

Р0(РРМ₄

РЧ(РРИз)4 '3

1,4-диоксаи микроволн, реактор 150°С, мин

КОАс,

ОСНР₂ 1,4-диоксан микроволн, реактор ¹³ 150°С, мин

Бром-4-(дифторметокси)бензол 13 (10 ммоль), ацетат калия (30,0 ммоль), 4,4,5,5-тетраметил-2(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)-1,3,2-диоксаборолан 14 (11,0 ммоль) и Ρа(ΡΡЬ₃)₄ (0,5 ммоль) добавляли в колбу Шленка объемом 40 мл, снабженную перемешивающим стержнем. Колбу вакуумировали и заполняли азотом (указанные процедуры повторяли несколько раз). 1,4-Диоксан (10 мл) добавляли шприцом. Колбу Шленка закрывали и нагревали при 150°С в течение 20 мин в микроволновом реакторе. После завершения реакции растворитель удаляли в вакууме. Остаток растворяли в ДХМ (200 мл) и промывали водой. Органическую фазу сушили над безводным №ьЗО₊ фильтровали и концентрировали, при этом получали неочищенный продукт. После очистки колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: Ε1ОΑс, гексан, градиент от 0 до 20%) получали 2-(4-(дифторметокси)фенил)-4,4,5,5тетраметил-1,3,2-диоксаборолан 15.

Ή ЯМР (400 МГц, СИС1₃): δ 7,74 (а, 1=8,4 Гц, 2Н), 7,02 (а, 1=8,4 Гц, 2Н), 6,48 (1, 1=73,6 Гц, 1Н), 1,27 (8, 12Н).

МС т/ζ: 271,1 (М+1)⁺.

В раствор 5-бром-2-хлорпиримидина 16 (7,7 ммоль) в 1,4-диоксане (1,5 мл) добавляли 2-(4(дифторметокси)фенил)-4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан 15 (8,9 ммоль), 1,8М К₂СО₃ (16,2 ммоль) и ΡγΙ(ΡΡΙι₃)₄ (0,38 ммоль). Реакционную смесь вакуумировали и колбу заполняли азотом (процедуры повторяли два раза), затем нагревали при 150°С в течение 10 мин в микроволновом реакторе. Реакционную смесь разбавляли насыщенным раствором ΝΉ^1 и экстрагировали ДХМ (3x50 мл). Органический слой промывали солевым раствором, сушили над №ьЗО₄ и концентрировали. После очистки колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: гексан/Ε1ОΑс, 3:1) получали 2-хлор-5-(4-(дифторметокси)фенил) пиримидин 17.

Ή ЯМР (400 МГц, СИС1₃): δ 8,73 (8, 2Н), 7,47-7,52 (т, 2Н), 7,20-7,24 (т, 2Н), 6,52 (1, 1=72 Гц, 1Н). МС т/ζ: 257,0 (М+1)⁺.

- 26 017392

Получение конечных соединений

Соединения типа А.

н {5-[5-(4-Метоксифенил)пиримидин-2-иламино]пиридин-2-ил}пиперазин-1-илметанон А1.

В раствор 5-[5-(4-метоксифенил)пиримидин-2-иламино]пиридин-2-карбоновой кислоты 5 (0,12 ммоль) в ДМФА (0,5 мл) добавляли НАТО (0,13 ммоль) и ΌΙΕΑ (0,36 ммоль) при КТ. Полученную смесь перемешивали в течение 2 мин и затем добавляли раствор трет-бутилового эфира пиперазин-1карбоновой кислоты (0,12 ммоль) в ДМФА (1 мл). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 4 ч и напрямую очищали препаративной ЖХ-МС, при этом получали трет-бутиловый эфир 4-{5-[5-(4метоксифенил)пиримидин-2-иламино]пиридин-2-карбонил}пиперазин-1-карбоновой кислоты 6 в виде твердого вещества белого цвета.

Ή ЯМР (400 МГц, а₆-ДМСО): δ 10,32 (5, 1Н), 8,89 (в, 2Н), 8,39-8,37 (т, 2Н), 7,86 (άά, 1=4,0 и 8,0 Гц, 1Н), 7,71-7,69 (т, 2Н), 7,08-7,06 (т, 2Н), 3,81 (5, 3Н), 3,55-3,51 (ушир. т, 4Н), 3,96-3,94 (ушир. 5, 4Н), 1,42 (5, 9Н).

МС т/ζ: 491,1 (М+1)⁺.

Трет-бутиловый эфир 4-{5-[5-(4-метоксифенил)пиримидин-2-иламино]пиридин-2-карбонил}пиперазин-1-карбоновой кислоты 6 (0,03 ммоль) растворяли в ДХМ (2 мл) и обрабатывали ТФУ (2 мл). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 2 ч. Растворитель удаляли, при этом получали твердый остаток грязно-белого цвета, который промывали несколько раз ЕЮАс, при этом получали требуемый 5[5-(4-метоксифенил)пиримидин-2-иламино]пиридин-2-ил}пиперазин-1-илметанон А1 в виде твердого вещества белого цвета.

Ή ЯМР (400 МГц, а₆-ДМСО): δ 10,30 (5, 1Н), 9,13 (ушир. 5, 2Н), 8,98 (ά, 1=4,0 Гц, 2Н), 8,88 (в, 1Н), 8,43 (άά, 1=4,0 и 8,0 Гц, 1Н), 7,73 (ά, 1=8,0 Гц, 1Н), 7,71-7,69 (т, 2Н), 7,08-7,06 (т, 2Н), 3,81 (5, 3Н), 3,73 (ушир. 5, 4Н), 3,20 (ушир. 5, 4Н).

МС т/ζ: 391,1 (М+1)⁺.

4-{5-[5-(4-Метоксифенил)пиримидин-2-иламино]пиридин-2-карбонил)пиперазин-2-он А2.

В раствор 5-[5-(4-метоксифенил)пиримидин-2-иламино]пиридин-2-карбоновой кислоты 5 (0,05 ммоль) в ДМФА (1 мл) добавляли НАТО (0,06 ммоль) и ΌΙΕΑ (0,14 ммоль) при КТ. Полученную смесь перемешивали в течение 2 мин и затем добавляли пиперазин-2-он (0,05 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 12 ч и напрямую очищали препаративной ЖХ-МС, при этом получали 4{5-[5-(4-метоксифенил)пиримидин-2-иламино]пиридин-2-карбонил}пиперазин-2-он А2 в виде твердого вещества белого цвета.

Ή ЯМР (400 МГц, ά/ΐ-СНзОН): δ 8,98 (ά, 1=4,0 Гц, 1Н), 8,77 (5, 1Н), 8,53-8,52 (т, 2Н), 7,74-7,73 (т, 2Н), 7,58-7,56 (т, 2Н), 7,07-7,05 (т, 2Н), 3,94 (ушир. 5, 2Н), 3,81 (5, 3Н), 3,46 (ушир. 5, 2Н), 3,45 (ушир. 5, 2Н).

МС т/ζ: 405,2 (М+1)⁺.

(4-Метансульфонилпиперазин-1-ил){5-[5-(4-метоксифенил)пиримидин-2-иламино]пиридин-2- 27 017392 ил)метанон А4.

НАТи, ϋΙΕΑ, ДМФА, КТ, 12 ч

Указанное в заголовке соединение получали аналогично тому, как описано для соединения А2.

'|| ЯМР (400 МГц, а₄-СН₃ОН): δ 9,00 (ά, 1=4,0 Гц, 1Н), 8,77 (δ, 2Н), 8,52 (άά, 1=4,0 и 8,0 Гц, 1Н), 7,68 (ά, 1=8,0 Гц, 1Н), 7,59-7,57 (т, 2Н), 7,08-7,06 (т, 2Н), 3,90 (ушир. δ, 4Н), 3,83 (δ, 3Н), 7,79 (ушир. δ, 4Н), 2,89 (δ, 3Н).

МС т/ζ: 469,2 (М+1)⁺.

Соединения типа В.

(4-Метансульфонилпиперазин-1-ил){5-[5-(4-метоксифенил)пиримидин-2-иламино]-2-метилпиридин-3-ил}метанон В1.

Ю ДМФА, КТ, 4 ч В1

В раствор 5-[5-(4-метоксифенил)пиримидин-2-иламино]-2-метилникотиновой кислоты 10 (0,05 ммоль) в ДМФА (1 мл) добавляли НАТи (0,06 ммоль) и О[ЕЛ (0,14 ммоль) при КТ. Полученную смесь перемешивали в течение 2 мин, затем добавляли 1-метансульфонилпиперазин (0,05 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 4 ч и затем напрямую очищали препаративной ЖХ-МС, при этом получали (4-метансульфонилпиперазин-1 -ил) {5-[5 -(4-метоксифенил)пиримидин-2-иламино]-2метилпиридин-3-ил}метанон В1.

'|| ЯМР (400 МГц, ά^^ΟΠ): δ 9,30 (ά, 1=4,0 Гц, 1Н), 8,81 (δ, 2Н), 8,50 (ά, 1=4,0 Гц, 1Н), 7,60-7,58 (т, 2Н), 7,07-7,05 (т, 2Н), 3,96-3,94 (т, 2Н), 3,85 (δ, 3Н), 3,54-3,52 (т, 2Н), 3,42-3,39 (т, 2Н), 3,27 (ушир. δ, 2Н), 2,91 (δ, 3Н), 2,62 (δ, 3Н).

МС т/ζ: 483,1 (М+1)⁺.

(5-(5-(4-Метоксифенил)пиримидин-2-иламино)-2-метилпиридин-3-ил)(пирролидин-1-ил)метанон В2.

НАТи, ϋΙΕΑ, ДМФА, КТ, 4 ч

Указанное в заголовке соединение получали аналогично тому, как описано для соединения В1.

' Н ЯМР (400 МГц, ά/ΐ-СНзОН): δ 9,44 (ушир. δ, 1Н), 8,84 (δ, 2Н), 8,58 (ушир. δ, 1Н), 7,60-7,58 (т, 2Н), 7,08-7,05 (т, 2Н), 3,85 (δ, 3Н), 3,86 (ΐ, 1=4,0 Гц, 2Н), 3,38 (ΐ, 1=4,0 Гц, 2Н), 2,66 (δ, 3Н), 2,06-2,00 (т, 4Н).

МС т/ζ: 490,1 (М+1)⁺.

(5-(5-(4-(Дифторметокси)фенил)пиримидин-2-иламино)пиридин-3-ил)(пиперазин-1-ил)метанон В3.

- 28 017392

ΝΗ₂ Р<1(ОАс)_г, ХапЛрЬоз СзгСО,, 1,4-Диоксан

ЮО’С, 3 ч

ΗΑΤϋ, ϋΙΕΆ, ДМФА, КТ, 12 ч 2, ТФУ, КТ, I ч

вз

В флакон помещали 5-аминоникотиновую кислоту 18 (1,45 ммоль), 2-хлор-5-(4дифторметоксифенил)пиримидин 17 (1,45 ммоль), Рй(ОАс)₂ (0,22 ммоль), реагент хаййрйок (0,22 ммоль), Ск₂СО₃ (1,45 ммоль) и безводный 1,4-диоксан (5 мл). Флакон дважды вакуумировали и заполняли азотом, смесь нагревали на масляной бане при 100°С в течение 3 ч. Флакон охлаждали до КТ, реакционную смесь разбавляли водой (20 мл) и рН доводили до нейтральных значений добавлением 10% №-ьСО₃. Полученную суспензию экстрагировали смесью ДХМ/1РА (3:1, 3x50 мл). Органический слой промывали солевым раствором и сушили над №-ь8О₄. Растворитель удаляли в вакууме и неочищенный продукт оранжевого цвета очищали препаративной ЖХВР (элюент: градиент МеСN от 20 до 70%), при этом получали 5-(5-(4-(дифторметокси)фенил)пиримидин-2-иламино)никотиновую кислоту 19.

МС т/ζ: 359,1 (М+1)⁺.

В раствор 5-(5-(4-(дифторметокси)фенил)пиримидин-2-иламино)никотиновой кислоты 19 (0,028 ммоль) в ДМФА (1 мл) добавляли НАТИ (0,033 ммоль) и ΩΙΕΛ (0,084 ммоль) при КТ. Полученную смесь перемешивали в течение 2 мин, затем добавляли Ν-Ьос-пиперазин (0,03 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 12 ч и напрямую очищали препаративной ЖХ-МС, при этом получали трет-бутиловый эфир 4-(5-(5-(4-(дифторметокси)фенил)пиримидин-2-иламино)никотиноил)пиперазин-1карбоновой кислоты. Остаток обрабатывали ТФУ (1 мл) при КТ в течение 1 ч, концентрировали в вакууме и напрямую очищали препаративной ЖХ-МС, при этом получали (5-(5-(4-(дифторметокси)фенил) пиримидин-2-иламино)пиридин-3-ил)(пиперазин-1 -ил)метанон В 3.

Ή ЯМР (400 МГц, й₃-СН₃С№): δ 9,32 (ушир. к, 1Н), 8,86 (к, 2Н), 8,67 (ушир. к, 1Н), 8,41 (ушир. к, 1Н), 7,75 (й, 1=12,0 Гц, 2Н), 7,33 (й, 1=12,0 Гц, 2Н), 6,87 (ΐ, 1=73 Гц, 1Н), 4,20 (ушир. к, 4Н), 3,30 (ушир. к, 4Н).

МС т/ζ: 427,1 (М+1)⁺.

Соединения типа С.

пиперидин-2-карбоно{5-[5-(4-Метоксифенил)пиримидин-2-иламино]-2-метилпиридин-3-ил}амид вой кислоты С1.

В раствор 1-трет-бутилового эфира пиперидин-1,2-дикарбоновой кислоты (0,04 ммоль) в ДМФА (1 мл) добавляли НАТИ (0,05 ммоль) и Э1ЕА (20,12 ммоль). Полученную смесь перемешивали при КТ в течение 2 мин и затем добавляли №-[5-(4-метоксифенил)пиримидин-2-ил]-2-метилпиридин-3,5-диамин

- 29 017392 (0,032 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при 45^ОС в течение 12 ч. Смесь охлаждали и напрямую очищали препаративной ЖХ-МС, при этом получали трет-бутиловый эфир 2-{5-[5-(4метоксифенил)пиримидин-2-иламино]-2-метилпиридин-3-илкарбамоил}пиперидин-1-карбоновой кислоты 20.

МС т/ζ: 519,1 (М+1)⁺.

Трет-бутиловый эфир 2-{5-[5-(4-метоксифенил)пиримидин-2-иламино]-2-метилпиридин-3илкарбамоил}пиперидин-1-карбоновой кислоты 20 растворяли в ДХМ (1 мл) и добавляли ТФУ (2 мл). Раствор желтого цвета перемешивали при КТ в течение 2 ч. Растворитель и избыток ТФУ удаляли в вакууме и остаток очищали препаративной ЖХ-МС, при этом получали {5-[5-(4метоксифенил)пиримидин-2-иламино]-2-метилпиридин-3-ил}амид пиперидин-2-карбоновой кислоты С1.

¹Н ЯМР (400 МГц, б6-ДМСО) δ ¹Н ЯМР (400 МГц, б4-СН₃ОН): δ 9,27 (ά, >4,0 Гц, 1Н), 8,85 (ά, >4,0 Гц, 1Н), 8,80 (§, 2Н), 7,59-7,57 (т, 2Н), 7,06-7,06 (т, 2Н), 4,14 (άά, >4,0 и 12,0 Гц, 1Н), 3,86 (8, 3Н), 3,523,48 (т, 1Н), 3,15-3,12 (т, 1Н), 2,62 (8, 3Н), 2,45-2,44 (т, 1Н), 2,07-2,06 (т, 1Н), 1,98-1,95 (т, 1н), 1,891,85 (т, 1Н), 1,79-1,75 (т, 2Н).

МС т/ζ: 419,2 (М+1)⁺.

1-(5-(5-(4-Метоксифенил)пиримидин-2-иламино)-2-метилпиридин-3-ил)-3-(1-метил-1Н-пиразол-5ил)мочевина С2.

В раствор И-(5-(4-метоксифенил)пиримидин-2-ил)-6-метилпиридин-3,5-диамина 12 (0,06 ммоль) в ТГФ (2 мл) добавляли трифосген (0,02 ммоль) и Е)1ЕЛ (0,01 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 15 мин, затем добавляли 1-метил-1Н-пиразол-5-амин (0,1 ммоль) и продолжали перемешивание в течение 2 ч. Реакционную смесь упаривали досуха и очищали хроматографией на силикагеле (элюент: ДХМ/МеОН, 95:5), при этом получали 1-(5-(5-(4-метоксифенил)пиримидин-2-иламино)-2метилпиридин-3-ил)-3-(1-метил-1Н-пиразол-5-ил)мочевину С2 в виде твердого вещества белого цвета.

¹Н ЯМР (400 МГц, СВОД: δ 8,72 (ά, >2,0 Гц, 1Н), 8,70 (8, 2Н), 8,60 (ά, >2,0 Гц, 1Н), 7,54 (ά, ά=6,5 Гц, 2Н), 7,40 (ά, >2,0 Гц, 1Н), 7,03 (ά, ά=6,5 Гц, 2Н), 6,28 (ά, >2,0 Гц, 1Н), 3,84 (8, 3Н), 3,79 (8, 3Н), 2,49 (8, 3Н).

МС т/ζ: 431,2 (М+1)⁺.

В табл. 1 представлены типичные соединения по настоящему изобретению, полученные по описанным выше методикам. Соединения, представленные в табл. 1, по данным анализа с-к11 Мо7е и/или анализа РЕХ'тЕР ТС-НА-У8МС, характеризуются активностью <2,5 мкМ.

Таблица 1

- 30 017392

В табл. 2 представлены другие типичные соединения по настоящему изобретению, которые можно получить по общим методикам, описанным в примерах.

Методы анализа

Эффективность соединений по настоящему изобретению оценивали по их способности селективно

- 31 017392 ингибировать пролиферацию клеток Ва/Е3 дикого типа и клеток Ва/Е3, трансформированных киназой Те1 с-к11 и гибридными тирозинкиназами Те1 РОСЕК. Кроме того, соединения по настоящему изобретению могут селективно ингибировать опосредованную 8СЕ пролиферацию клеток Мо7е. Кроме того, эффективность соединений оценивали по их способности ингибировать киназы АЬ1, АКС, ВСК-АЬ1, ВКК, ЕрЬБ, Етк, Еуп, КОК, с-Кй, ЬСК, РОСЕ-К, Ь-КаЕ, с-КаЕ, 8АРК2, 8гс, Т1е2 и ТгкВ.

Анализ пролиферации: библиотека клеток ВаЕ3 - методика с использованием реагента ВпдЫ д1о.

Соединения оценивали по их способности ингибировать пролиферацию клеток Ва/Е3 дикого типа и клеток Ва/Е3, трансформированных гибридными тирозинкиназами Те1. Нетрансформированные клетки Ва/Е3 культивировали в среде, содержащей рекомбинантный ИЛ3. Клетки высевали в 384-луночные планшеты ТС с плотностью 5000 клеток в 50 мкл среды в лунке и добавляли исследуемое соединение при концентрации от 0,06 нМ до 10 мкМ. Затем клетки инкубировали при 37°С в течение 48 ч в атмосфере 5% СО₂. После инкубации клеток в каждую лунку добавляли 25 мкл реагента ВК1СНТ СЬО® (фирма Рготеда) согласно инструкциям фирмы-производителя и планшеты считывали в системе Апа1ук1 СТ в режиме люминесценции (50000 шагов интеграции во времени) в относительных световых единицах. Значения 1С₅₀ определяли по кривой зависимости ответной реакции от дозы.

Анализ клеток Мо7е.

Соединения по настоящему изобретению анализировали в 96-луночном планшете по их способности ингибировать опосредованную 8СЕ пролиферацию с использованием клеток Мо7е, которые эндогенно экспрессируют с-кй. Антипролиферативную активность в отношении клеток Мо7е, стимулированных рекомбинантным 8СЕ человека, определяли с использованием двухкратных серийных разведений исследуемых соединений (С_тах составляла 10 мкМ). После инкубации при 37°С в течение 48 ч жизнеспособность клеток определяли с использованием колориметрического анализа и реагента МТТ фирмы Рготеда.

Методика анализа НТКЕ с-кй.

В каждую лунку 384-луночного планшета Ргох1Р1а1е (фирма Раскагй) добавляли аликвотную часть (5 мкл) киназной смеси с-кй 2х, содержащей 25 нг с-кй (5 нг/мкл) и 2 мкМ раствор пептида биотинЕЕЕРОУЕЕ1Р1УЬЕЬЬР-ИН_; в киназном буферном растворе (20 мМ Трис, рН 7,5, 10 мМ МдС1₂, 0,01% БСА, 0,1% бридж 35, 1 мМ ДТТ, 5% глицерин, 0,05 мМ Иа₃УО₄). Для определения базовой линии в каждую лунку последнего ряда планшета Ргох1Р1а1е добавляли 5 мкл киназной смеси с-кй в отсутствие киназы с-кй. В каждую лунку добавляли соединения по настоящему изобретению и планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. В каждую лунку добавляли раствор АТФ 2х (40 мкМ) в киназном буферном растворе (5 мкл) и планшет инкубировали при комнатной температуре в течение 3 ч. В каждую лунку добавляли 10 мкл смеси для проявления (50% КЕ, 40% киназный буферный раствор, 10% ЭДТУ, МаЬ РТ66-К (кат. № 61Т66КЬВ), разбавленный 1:100, стрептавидин-ХЬ (кат. № 6118АХЬВ), разбавленный 1:100) и планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение еще 1-2 ч, затем регистрировали сигнал НТКЕ с использованием детектора.

Анализ пролиферации клеток ТС-НА-У8МС человека.

Клетки ТС-НА-У8МС человека (АТСС) выращивали в среде ОМЕМ, содержащей 10% ЭТС, до 8090% конфлюентности, затем ресуспендировали в среде ОМЕМ, содержащей 1% ЭТС и 30 нг/мл рекомбинантного РОСЕ-ВВ человека при концентрации 6х10 клеток/мл. Аликвотные части суспензии клеток добавляли в 384-луночные планшеты (50 мкл в лунке), инкубировали при 37°С в течение 20 ч, затем добавляли 0,5 мкл растворов соединений 100х и инкубировали при 37°С в течение 48 ч. После обработки в каждую лунку добавляли 25 мкл реагента Се11Тйег-С1о, выдерживали в течение 15 мин, затем планшеты считывали в системе СЬ1РК (фирма Мо1еси1аг ОеПсек).

Методика анализа РОСЕКа/β Ьапсе.

В каждую лунку 384-луночного планшета Ргох1Р1а1е (фирма Раскагй) добавляли аликвотную часть (2,5 мкл) раствора 2х пептида РОСЕК[1 и смеси АТФ (4 мкМ пептид биотин-[1А-[1А-[1ААЕЕЕЕУУЕ1ЕАККК, 20 мкМ АТФ в буферном растворе для анализа (20 мМ ЕЕерек, 54 мМ МдС1₂, 0,01% БСА, 0,05% Твин-20, 1 мМ ДТТ, 10% глицерин, 50 мкМ Иа₃УО₄)). Планшеты центрифугировали и в каждую лунку добавляли соединения по настоящему изобретению (50 нл) дозатором РйИоо1. В каждую лунку добавляли 2,5 мкл смеси ферментов 2х (РОСЕКа при концентрации 4,5 нг/мкл (кат. № РУ4117) или РОСЕК[1 при концентрации 1,5 нг/мкл (кат. № РУ3591) в буферном растворе для анализа) или только буферный раствор для анализа в отсутствие фермента РОСЕКа/β. Планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 1,5 ч. В каждую лунку добавляли 5 мкл смеси для проявления (50% 1М КЕ, 40% киназный буферный раствор, 10% ЭДТУ, МаЬ РТ66-К (кат. № 61Т66КЬВ), разбавленный 1:100, и стрептавидин-ХЬ (кат. № 6118АХЬВ), разбавленный 1:100), планшет Ргох1Р1а1е инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч, затем регистрировали сигнал НТКЕ с использованием детектора.

Анализ пролиферации клеток Ва/Е3 ЕЬ ЕЬТ3.

Для анализа использовали линию рго-В клеток мыши Ва/Е3, которые характеризуются сверхэкспрессией полноразмерного конструкта ЕЬТ3. Указанные клетки культивировали в среде КРМ1 1640/10% эмбриональная телячья сыворотка (КРМ1/ЭТС), содержащей пенициллин (50 мкг/мл), стрептомицин (50

- 32 017392 мкг/мл), Ь-глютамин (200 мМ) и рекомбинантный ИЛ3 мыши. Клетки Ва/Р3 (полноразмерный конструкт РЬТ3) культивировали на минимальной среде (в отсутствие ИЛ3) в течение 16 ч и затем высевали в 384луночные планшеты ТС с плотностью 5000 клеток в 25 мкл среды в лунке и добавляли исследуемое соединение при концентрации от 0,06 нМ до 10 мкМ. После добавления соединения для контроля цитотоксичности в 25 мкл среды в лунке добавляли лиганд РЬТ3 или ИЛ3 при соответствующих концентрациях. Затем клетки инкубировали при 37°С в течение 48 ч в атмосфере 5% СО₂. После инкубации клеток в каждую лунку добавляли 25 мкл реагента ΒΡΙΟΗΤ ОЬО® (фирма Рготеда) согласно инструкциям фирмыпроизводителя и планшеты считывали в системе Апа1ук! ОТ в режиме люминесценции (50000 шагов интеграции во времени) в относительных световых единицах.

Ингибирование ВСВ-АЬ1-зависимой клеточной пролиферации (экспресс-анализ).

Для анализа использовали линию клеток мыши (кроветворные клетки-предшественники линии 32Ό, трансформированные кДНК ВСВ-АЬ1 (32Ь-р210)). Указанные клетки культивировали в среде ВРМ1/10% эмбриональная телячья сыворотка (ВРМ1/ЭТС), содержащей пенициллин (50 мкг/мл), стрептомицин (50 мкг/мл) и Ь-глютамин (200 мМ). Нетрансформированные клетки 32Ό культивировали в аналогичных условиях при добавлении среды, содержащей 15% УЕШ в качестве источника ИЛ3.

Суспензию клеток 32Ό или 32Ь-р210 (50 мкл) высевали в 384-луночные микропланшеты Грейнера (черного цвета) с плотностью 5000 клеток в лунке. В каждую лунку добавляли 50 нл раствора исследуемого соединения (1 мМ исходный раствор в ДМСО, 8Т1571 использовали в качестве положительного контроля). Клетки инкубировали при 37°С в течение 72 ч в атмосфере 5% СО₂. В каждую лунку добавляли 10 мкл 60% раствора реагента А1атаг В1ие (фирма Тек ФадпокБек) и клетки инкубировали в течение еще 24 ч. Интенсивность флуоресценции (возбуждение при 530 нм, испускание при 580 нм) измеряли в системе Аес.|иек1 (фирма Мо1ееи1аг Остзеек).

Ингибирование ВСВ-АЬ1-зависимой клеточной пролиферации.

Клетки 32Ь-р210 высевали в 96-луночные планшеты ТС с плотностью 15000 клеток в лунке. В каждую лунку добавляли 50 мкл двухкратных серийных разведений исследуемого соединения (С_тах составляла 40 мкМ, 8Т1571 использовали в качестве положительного контроля). Клетки инкубировали при 37°С в течение 48 ч в атмосфере 5% СО₂, затем в каждую лунку добавляли 15 мкл раствора МТТ (фирма Рготеда) и клетки инкубировали в течение еще 5 ч. Оптическую плотность при 570 нм измеряли спектрофотометрически и рассчитывали значения 1С₅₀ по кривой зависимости ответной реакции от дозы.

Действие на клеточный цикл.

Клетки 32Ό и 32Ь-р210 высевали в 6-луночные планшеты ТС с плотностью 2,5x10 клеток в 5 мл среды в лунке и добавляли исследуемое соединение при концентрации 1 или 10 мкМ (8Т1571 использовали в качестве положительного контроля). Затем клетки инкубировали при 37°С в течение 24 или 48 ч в атмосфере 5% СО₂. Клеточную суспензию (2 мл) промывали ФСБ, фиксировали в 70% Е1ОИ в течение 1 ч и обрабатывали смесью ФСБ/ЭДТУ/РНКаза А в течение 30 мин, добавляли иодид пропидия (СГ составляла 10 мкг/мл) и измеряли интенсивность флуоресценции проточной цитометрией в системе РАС8еа11Ьиг (фирма ВО В1оке1епеек). Исследуемые соединения по настоящему изобретению оказывали апоптотическое действие на клетки 32О-р210, но не вызывали апоптоз в исходных клетках 32Ό.

Действие на автофосфорилирование ВСВ-АЬ1 в клетках.

Автофосфорилирование ВСВ-АЬ1 определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием иммобилизованных антител, специфичных к е-аЬ1, и антител к фосфотирозину. Клетки 32Ь-р210 высевали в 96-луночные планшеты ТС с плотностью 2х 10 клеток в 50 мкл среды в лунке. В каждую лунку добавляли 50 мкл двухкратных серийных разведений исследуемых соединений (С_тах составляла 10 мкМ, 8Т1571 использовали в качестве положительного контроля). Клетки инкубировали при 37°С в течение 90 мин в атмосфере 5% СО2. Затем клетки обрабатывали в течение 1 ч на ледяной бане буферным раствором для лизиса (150 мкл, 50 мМ Трис-ИСЬ рН 7,4, 150 мМ ЫаС1, 5 мМ ЭДТУ, 1 мМ ЕОТА и 1% ΝΡ-40), содержащим ингибиторы протеаз и фосфатаз. Клеточный лизат (50 мкл) добавляли в 96-луночные планшеты ОрБр1а!е, предварительно покрытые антителами, специфичными к аЬ1, и обработанные блокирующим раствором. Планшеты инкубировали при 4°С в течение 4 ч, промывали буферным раствором ТВ8-твин 20, добавляли 50 мкл раствора конъюгата щелочной фосфатазы и антител к фосфотирозину и затем планшет инкубировали при 4°С в течение ночи. Планшет промывали буферным раствором ТВ8-твин 20, затем добавляли 90 мкл люминесцентного субстрата и измеряли люминесценцию в системе Аес.|иек1 (фирма Мо1ееи1аг Оеу1еек). Исследуемые соединения по настоящему изобретению, которые ингибируют пролиферацию клеток, экспрессирующих ВСВ-АЬ1, ингибируют автофосфорилирование ВСВ-АЬ1 в клетках по дозозависимому механизму.

Действие на пролиферацию клеток, экспрессирующих мутантные формы Вег-аЬ1.

Эффективность соединений по настоящему изобретению оценивали по их антипролиферативному действию на клетки Ва/Р3, экспрессирующие ВСВ-АЬ1 дикого типа или мутантные формы ВСВ-АЬ1 (О250Е, Е255У, Т3151, Р317Ь, М351Т), которые характеризуются резистентностью или пониженной чувствительностью к 8Т1571. Антипролиферативное действие указанных соединений на клетки, экспрессирующие мутантный ВСВ-АЬ1, и на нетрансформированные клетки анализировали при концентрациях 10,

- 33 017392

3,3, 1,1 и 0,37 мкМ, как описано выше (в среде, не содержащей ИЛ3). Значения 1С₅₀ для соединений, не оказывающих токсического действия на нетрансформированные клетки, определяли по кривой зависимости ответной реакции от дозы, полученной, как описано выше.

Определение ферментативной активности ЕСЕК3.

Киназную активность очищенного ЕСЕК3 (фирма ИрЧайе) определяли в конечном объеме 10 мкл, содержащем 0,25 мкг/мл фермента в киназном буферном растворе (30 мМ Трис-НС1, рН 7,5, 15 мМ МдС1₂, 4,5 мМ МпС1₂, 15 мкМ №1₃УО₄ и 50 мкг/мл БСА), субстраты (5 мкг/мл биотин-поли-ΕΥ (С1и, Туг, фирма С18-И8, 1пс.) и 3 мкМ АТФ). Анализ проводили с использованием двух растворов: первый раствор (5 мкл), содержащий фермент ЕСЕК3 в киназном буферном растворе, сначала добавляли в 384луночный планшет ΡΐΌχίΡ1;·ι^® (фирма Ρе^к^η-Ε1те^), затем добавляли 50 нл раствора соединений в ДМСО. Затем в каждую лунку добавляли 5 мкл второго раствора, содержащего субстрат (поли-ΕΥ) и АТФ в киназном буферном растворе. Реакционную смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч, реакцию останавливали при добавлении 10 мкл смеси НТКЕ для проявления, содержащей 30 мМ Трис-НС1, рН 7,5, 0,5М КЕ, 50 мМ ЭДТУ, 0,2 мг/мл БСА, 15 мкг/мл стрептавидина-ХЬ665 (фирма С18-И8, 1пс.) и 150 нг/мл конъюгата криптата и антител к фосфотирозину (фирма С18-И8, 1пс.). Смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч (при этом образовывался комплекс стрептавидин-биотин), сигналы флуоресценции с разрешением во времени регистрировали в системе Апа1уЧ СТ (фирма Мо1еси1аг Иеуйсек Согр.). Величины 1С₅₀ рассчитывали методом линейной регрессии с учетом ингибирования в % каждым соединением при 12 концентрациях (исходный раствор разбавляли 1:3 от 50 мкМ до 0,28 нМ). По данным указанного анализа соединения по настоящему изобретению характеризуются значениями 1С₅₀ в диапазоне от 10 нМ до 2 мкМ.

Анализ ЕСЕК3 с использованием клеток.

Эффективность соединений по настоящему изобретению оценивали по их способности ингибировать пролиферацию трансформированных клеток Ва/Е3-ТЕЬ-ЕСЕК3, которая зависит от активности клеточной киназы ЕСЕК3. Клетки Ва/Е3-ТЕЬ-ЕСЕК3 культивировали в суспензии в культуральной среде К₽М1 1640, содержащей 10% ЭТС, до плотности 800000 клеток/мл. Клетки высевали в 384-луночный планшет с плотностью 5000 клеток в 50 мкл культуральной среды в лунке. Соединения по настоящему изобретению растворяли и разбавляли диметилсульфоксидом (ДМСО). Получали двенадцать серийных разведений 1:3 в ДМСО, при этом обычно получали растворы соединений при концентрации от 10 мМ до 0,05 мкМ. В лунки с клетками добавляли 50 нл разведений соединений и инкубировали в течение 48 ч в инкубаторе для клеточных культур. В лунки с клетками добавляли реагент А1атагВ1ие® (фирма ТРЕК Ийадпо^йс 8уЧет5). который используется для регистрации восстанавливающей способности пролифелирующих клеток (до конечной концентрации 10%). Смесь инкубировали при 37°С в течение еще 4 ч в инкубаторе для клеточных культур и затем регистрировали сигналы флуоресценции восстановленного реагента А1атагВ1ие® (возбуждение при 530 нм, испускание при 580 нм) в системе Апа1уЧ СТ (фирма Мо1еси1аг Иеуйсек Согр.). Значения 1С₅₀ рассчитывали методом линейной регрессии ингибирования (%) каждым соединением при 12 концентрациях.

Определение ферментативной активности Ь-КаЕ.

Эффективность соединений по настоящему изобретению оценивали по их способности ингибировать активность Ь-КаЕ. Анализ проводили в 384-луночных планшетах Махй8огр (фирма ΝϋΝΟ) со стенками черного цвета и прозрачным дном. Субстрат 1кВа разбавляли в ΩΡΕδ (1:750) и в каждую лунку добавляли 15 мкл указанного раствора. Планшеты инкубировали при 4°С в течение ночи и трижды промывали ТВ8Т (25 мМ Трис, рН 8,0, 150 мМ №1С1 и 0,05% твин-20) с использованием устройства для промывки планшетов ЕМВЬА. Планшеты блокировали реагентом 8ирегЬ1оск (15 мкл/лунка) при комнатной температуре в течение 3 ч, трижды промывали ТВ8Т и планшет сушили постукиванием по поверхности стола. В каждую лунку добавляли буферный раствор для анализа, содержащий 20 мкМ АТФ (10 мкл), затем добавляли 100 нл или 500 нл соединения. В-КаЕ разбавляли в буферном растворе для анализа (1 мкл в 25 мкл) и в каждую лунку добавляли 10 мкл разбавленного раствора Ь-КаЕ (0,4 мкг/лунка). Планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 2,5 ч. Киназную реакцию останавливали при шестикратной промывке планшетов раствором ТВ8Т. Антитела фосфо-1кВа (8ег 32/36) разбавляли в реагенте 8ирегЬ1оск (1:10000) и добавляли 15 мкл в каждую лунку. Планшеты инкубировали при 4°С в течение ночи и шестикратно промывали раствором ТВ8Т. Конъюгат щелочной фосфатазы и козьих антител к мышиному 1дС разбавляли в реагенте 8ирегЬ1оск (1:1500) и добавляли 15 мкл в каждую лунку. Планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч и шестикратно промывали раствором ТВ8Т. В каждую лунку добавляли 15 мкл флуоресцентного субстрата АйорЬок АР (фирма йготеда) и планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 15 мин. Планшеты считывали в системе АссщеЧ или Апа1уЧ СТ с использованием программы для анализа интенсивности флуоресценции (возбуждение при 455 нм, испускание при 580 нм).

Анализ Ь-КаЕ с использованием клеток.

Эффективность соединений по настоящему изобретению оценивали по их способности ингибировать фосфорилирование МЕК в клетках А375. Клетки линии А375 (АТСС) получали от пациента с диаг

- 34 017392 нозом меланома, и они характеризовались мутацией У599Е в гене В-КаГ. Уровни фосфорилированного МЕК повышались за счет мутации В-КаГ. Субконфлюентные и конфлюентные клетки А375 инкубировали в присутствии соединений при 37°С в течение 2 ч в бессывороточной среде. Затем клетки однократно промывали холодным ФСБ и лизировали в буферном растворе для лизиса, содержащем 1% тритона Х100. После центрифугирования супернатанты анализировали электрофорезом в ДДС-ПААГ и переносили на нитроцеллюлозные мембраны. Затем мембраны анализировали методом вестерн-блоттинг с использованием антител антифосфо-МЕК (8ег 217/221, фирма Се11 81дпа1шд). Количество фосфорилированного МЕК регистрировали по поглощению зон фосфо-МЕК на нитроцеллюлозных мембранах.

Радиоактивно-ферменативный анализ связывания на фильтре с использованием панели киназ Ир51а1е КтакеРгоГйег™.

Соединения по настоящему изобретению оценивали по их способности ингибировать активность отдельных ферментов панели киназ. Соединения анализировали в двух повторах при конечной концентрации 10 мкМ по следующей общей методике. Киназный буферный раствор (2,5 мкл, 10х, содержащий при необходимости МпС1₂), активную киназу (0,001-0,01 Ед., 2,5 мкл), специфический пептид или пептид поли(С1и4-Туг) (5-500 мкМ или 0,01 мг/мл) в киназном буферном растворе и киназный буферный раствор (50 мкМ, 5 мкл) смешивали в пробирке эппендорф на ледяной бане. Добавляли смесь Мд/АТФ (10 мкл, 67,5 (или 33,75) мМ МдС1₂, 450 мкМ (или 225 мкМ) АТФ и 1 мкКи/мл |';'-³²Р|-ЛТФ (3000 Ки/ммоль)) и реакционную смесь инкубировали при приблизительно 30°С в течение приблизительно 10 мин. Реакционную смесь (20 мкл) наносили на квадратные кусочки бумаги Р81 (2x2 см, фосфоцеллюлоза, для положительно заряженных пептидных субстратов) или ватман № 1 (для пептидного субстрата поли(С1и4-Туг)). Анализируемые квадратики четырехкратно промывали (каждый раз в течение 5 мин) 0,75% фосфорной кислотой и однократно промывали ацетоном в течение 5 мин. Анализируемые квадратики переносили в сцинтилляционный флакон, добавляли 5 мл сцинтилляционной жидкости и измеряли включение ³²Р (ими/мин) в пептидный субстрат на сцинтилляционном счетчике Весктап. Для каждой реакции рассчитывали ингибирование в %.

Следует понимать, что примеры и варианты, описанные в данном контексте, приведены исключительно для иллюстрации настоящего изобретения, и специалисту в данной области представляются очевидными различные модификации или изменения, которые включены в объем и сущность настоящего изобретения и прилагаемых пунктов формулы. Все публикации, патенты и заявки на выдачу патентов, цитированные в данном контексте, включены в виде ссылок в полном объеме в настоящее описание.

Claims (9)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Соединение формулы (1) или его фармацевтически приемлемая соль, где один из Х¹, Х², Х³, Х⁴, Х⁵ и Х ⁶ обозначает Ν, а другие обозначают СК³, и кольцо Е присоединено к ΝΒ, К² и К³ через атом углерода,

   Аг обозначает фенил,

   К¹ и К² независимо обозначают С1-С₆алкил или (СК₂)_кОК⁷,

   К³ обозначает -Ь-МК⁴К⁵, -Х-\К-С(О)К⁸ или -Х-ЛК-С(О)МК⁴К⁵, где Ь обозначает -Х-С(О) или (СК₂)_1-4 и

   X обозначает (СК₂), или [С(К)(СК₂ОК)];

   К⁴, К⁵ независимо обозначают Н, С1-С₆алкил, который необязательно замещен галогеном, гидроксильной группой или (СК2)к-К⁶,

   К⁶ обозначает незамещенное 5-10-членное гетероарильное кольцо, содержащее 1-2 гетероатома Ν, или 5-10-членное гетероарильное кольцо, содержащее 1-2 гетероатома Ν, замещенное метилом, или незамещенное 5-7-членное гетероциклическое кольцо, содержащее 1-2 гетероатома, независимо выбранных из Ν, О и 8, и необязательно содержащее 1 или 2 =О, или 5-7-членное гетероциклическое кольцо, содержащее 1-2 гетероатома, независимо выбранных из Ν, О и 8, которое замещено этилом или циклопропилом, и необязательно содержащее 1 или 2 =О,

   К⁷ и К⁸ независимо обозначают (СК2)к-К⁶ или С1-С6алкил, который необязательно замещен галогеном; или К⁷ обозначает Н, в другом варианте К⁴ и К⁵ вместе с атомом Ν в каждом ИК⁴К⁵ образуют незамещенное 4-7-членное гетероциклическое кольцо, содержащее 1-2 гетероатома Ν, необязательно содержащее =О, или 4-7членное гетероциклическое кольцо, содержащее 1-2 гетероатома Ν, замещенное 1-3 группами К¹¹, и необязательно содержащее =О,

   К¹¹ обозначает (СК2)к8(О)1-2К⁸, (СК2Х-ОК⁷ или СО2К⁷,

   - 35 017392 каждый К обозначает Н или С₁ -С₆алкил, каждый к равен 0-6 и

   _) и т независимо равны 0-4.
2. 2. Соединение по п.1, где К¹ обозначает С₂-С₆алкоксигруппу или галогеналкокси, содержащую 1-6 атомов фтора.
3. 3. Соединение по п.2, где К¹ обозначает ОСН₃, ОСНР₂, ОСЕ₃, ОСН₂СР₃, ОСР₂СН₃ или ОСН₂СР₃.
4. 4. Соединение по любому из пп.1-3, где К², если присутствует, обозначает С1-С₆алкил.
5. 5. Соединение по любому из пп.1-4, где

   К³ обозначает -Ι.-ΝΗΊΥ -\А'К-С(О)1К или -Х-МК-С(О)1МК⁴К⁵,

   Ь обозначает -Х-С(О),

   X обозначает (СК₂), и

   .) равен 0.
6. 6. Соединение по любому из пп.1-5, где К³ выбирают из группы, включающей
7. 7. Соединение по п.1, где указанное соединение выбирают из соединений формулы (2А), (2В) и (2С)

   - 36 017392 где К¹ обозначает С₁-С₆алкоксигруппу или галогеналкокси, содержащую 1-6 атомов фтора,

   К², если присутствует, обозначает С1-С6алкил,

   К³ обозначает -Ь-МК⁴К⁵, -X-NК-С(О)К⁸ или -X-NК-С(О)NК⁴К⁵,

   Ь обозначает -Х-С(О),

   X обозначает (СКД,

   К⁴ и К⁵ независимо обозначают Н, С1-С6алкил, который необязательно замещен галогеном, гидроксильной группой или К⁶; или К⁴ и К⁵ вместе с атомом N образуют пиперазинил, пирролидинил или пиперидинил, каждый из которых необязательно замещен =О или 1-2 группами К¹¹,

   К¹¹ обозначает (СК₂)_к§(О)_1-2К⁸,

   К⁸ обозначает (СК2)к-К⁶ или С1-С₆алкил, который необязательно замещен галогеном,

   К⁶ обозначает незамещенное 5-10-членное гетероарильное кольцо, или 5-10-членное гетероарильное кольцо, замещенное метилом, или незамещенное 5-7-членное гетероциклическое кольцо, необязательно содержащее 1 или 2 =О,

   К обозначает Н или С₁-С₆алкил,

   .) равен 0, к равен 0-4 и т равен 0-1.
8. 8. Соединение по п.1, где указанное соединение выбирают из группы, включающей

   - 37 017392
9. 9. Фармацевтическая композиция, включающая терапевтически эффективное количество соединения по любому из пп.1-8 и фармацевтически приемлемый носитель.

   Евразийская патентная организация, ЕАПВ

   Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2