CN104458675A - 一种筛选干细胞因子受体激酶抑制剂高通量筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明发现了一种筛选干细胞因子受体激酶抑制剂高通量筛选方法,包括以下步骤:(1)干细胞因子受体激酶抑制剂筛选模型的建立与优化:进行激酶浓度、温孵时间、底物浓度、ATP浓度实验;(2)阳性药验证模型可靠性:选用合适浓度的激酶,ATP Km,底物Km,激酶和底物每孔分别加入2μl,再按浓度梯度每孔加入4μl阳性药,加入2ul ATP开始反应,按优化时间室温孵育;每孔加入10μl终止液终止反应,室温孵育1小时后检测,分析数据得阳性药IC50;(3)高通量筛选模型验证:按照上述步骤操作,使用BiomekNXP自动化加样仪器和Multidrop自动分液器进行加样,计算Z因子。本发明的优点主要有:1)简便快捷;2)灵敏度高;3)结果稳定可靠,重现性好,可用于高通量筛选。
Description
技术领域
本发明属于药理学领域,利用均相时间分辨荧光检测技术,构建了干细胞因子受体酪氨酸激酶(Kit)抑制剂的高通量筛选模型,用于待测样品对Kit激酶抑制活性的高通量检测。
背景技术
Kit是一种原癌基因,是HZ4猫科肉瘤病毒的胞浆逆转录病毒同源物,位于4号染色体4q11-12,编码一种相对分子质量为145kD的跨膜糖蛋白,该蛋白属受体酪氨酸激酶家族成员。Kit受体分为膜外区、跨膜区和胞质区三部分。Kit/SCF***是蛋白激酶/磷酸酶信号转导过程中的一个重要环节。正常情况下Kit受体的活化需要SCF参与,当Kit受体与SCF的特异性结合后,触发Kit受体的同源二聚体化和细胞膜内酪氨酸残基的磷酸化,从而将细胞外的信号转导至细胞内。Kit基因突变导致了Kit不依赖配体的自发性受体二聚体化,引起Kit受体的持续激活,刺激细胞过度增殖和抗凋亡信号失控。己发现在许多恶性肿瘤中均有Kit的高表达,包括胃肠道间质瘤、***癌、生殖细胞瘤、乳腺癌及小细胞肺癌等。抑制Kit介导的信号转导途径以达到***的目的已成为近年来肿瘤治疗的热点。
时间分辨荧光技术(time-resolved fluorescence,TRF)是基于镧系元素如铕(Eu)、钐(Sm)、镝(Dy)等具有较长荧光寿命的特点发展而来的。当铕螯合物供体与受体之间距离小于10nm,且供体发射光谱与受体激发光谱有重叠时,则发生荧光共振能量转移,均相时间分辨荧光(homogeneous time-resolved fluorescence,HTRF)技术是法国Cisbio公司利用这一原理进行深入开发的产品。大多数荧光物质的荧光寿命非常短(一般为几毫秒),为了避免短暂的荧光干扰,Cisbio公司利用较长荧光寿命的镧系螯合物作为荧光能量供体,受体经过别藻蓝蛋白(allophycocyanin)或荧光素修饰,供体在能量转移时就可以使受体也具有较长的荧光寿命。因此,能量转移时受体发射光消失时间与供体发射光消失时间成正比,而与供受体间的距离成反比,这种方法延长了荧光检测时间,降低了短暂荧光引起的背景干扰。
目前,已有多种Kit激酶抑制剂的筛选方法,多利用ELISA法来筛选Kit激酶抑制剂,但是此方法费时费力,难以做到高通量筛选。因此,建立方便快捷准确的检测方法,特别是体外的功能性检测在药物筛选中越来越受到重视。
发明内容
本发明的目的在于建立一种基于均相时间分辨荧光的Kit激酶抑制剂高通量筛选模型,具有信噪比高,使用安全,样品消耗量小的特点。
本发明的技术方案:采用均相时间分辨荧光方法建立体外Kit激酶抑制剂高通量筛选模型,初筛,复筛发现一类具有抑制Kit激酶活性的候选化合物。具体步骤如下:
本发明利用均相时间分辨荧光的方法建立了一种Kit激酶抑制剂高通量筛选模型。
步骤一:Kit激酶抑制剂筛选模型的建立与优化。
步骤二:阳性药验证模型可靠性。
步骤三:高通量筛选模型验证。
附图说明:
图1:Kit激酶浓度梯度优化实验结果。(n=3,)
图2:Kit激酶温孵时间优化实验结果。(n=3,)
图3:Kit激酶底物浓度优化实验结果。(n=3,)
图4:Kit激酶ATP浓度优化实验结果。(n=3,)
图5:阳性药十字孢碱对Kit激酶的抑制曲线图。(n=3,)
图6:Kit激酶抑制剂高通量筛选模型信号检测窗口。
图7:高通量筛选Z′值分布。
具体实施方式
以下结合附图说明本发明的具体实施方式:
1.Kit激酶抑制剂筛选方法建立
(1)实验材料
Kit激酶检测试剂盒(Cisbio,法国)、Kit激酶(Invitrogen,美国)、ATP(生兴,中国)、十字孢碱(碧云天,中国)、384低体积白板(Coming,美国)、枪头(Axygen,美国)。
(2)实验步骤
1)进行Kit激酶浓度梯度、温孵时间、底物浓度、ATP浓度实验,见图1-4。
2)待测化合物精确称量,加入DMSO溶剂成母液,然后使用检测缓冲液配制待测化合物溶液至所需浓度,初筛浓度约为1×10-3mol/L。
3)在反应容器中每孔加入Kit激酶溶液2μl,底物溶液2μl,缓冲液或待筛化合物4μl,ATP2μl。室温反应1小时。
4)每孔加入Estradiol-XL6655μl,Anti-Estradiol-cryptate5μl,室温孵育1小时。
5)利用美国贝克曼库尔特(Beckman Coulter)公司检测平台HTRF模块分别检测665nm和610nm处的荧光强度。
6)绘制阳性药十字孢碱量效曲线并测定其IC50值,见图5。
7)采集检测信号并绘图,通过信号窗和Z’值确定高通量筛选模型的可靠性,见图6,7。
2.数据处理
(1)根据公式计算各孔665nm和610nm处荧光强度的比值(Ratio665/610);
(2)根据公式计算各孔的相对抑制率
(3)活性样品进行浓度稀释后检测的相对抑制率值,使用作Graphpad软件作图求算半数抑制率IC50。
实验结果
Kit激酶筛选模型优化结果:最佳反应所需的Kit激酶为0.1ng/μl(见图1),最佳温孵时间为60min(见图2),最佳底物浓度为0.38μM(见图3),最佳ATP浓度为21.31μM(见图4)。阳性药半数抑制率IC50为1.599nM(见图5),并通过信噪比和Z’值(见图6,7)验证表明采用本方法建立的Kit激酶抑制剂体外筛选模型达到了高通量筛选的要求,实验结果稳定可靠,可以用于进行Kit激酶抑制剂的高通量筛选。
Claims (6)
1.一种干细胞因子受体激酶抑制剂高通量筛选模型,其特征在于,包括步骤:
(1)激酶抑制剂筛选模型的建立与优化;
(2)阳性药验证模型可靠性;
(3)高通量筛选模型验证。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的激酶为干细胞因子受体激酶。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(1)中进行干细胞因子受体激酶浓度梯度、温孵时间、底物浓度、ATP浓度实验。
4.如权利要求3所述的方法,其特征在于,由步骤(1)可得到最佳反应所需的干细胞因子受体激酶浓度为0.1ng/μl,最佳温孵时间为60min,最佳底物浓度为0.38μM,最佳ATP浓度为21.31μM。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(2)选用步骤(1)所到的合适浓度的激酶,ATP Km,底物Km;将激酶和底物按1:2体积混合,每孔加入4μl,再按浓度梯度每孔加入4μl阳性药,最后每孔加入2μl ATP开始反应,按优化时间室温孵育;配制SA-XL665和TK-Ab,将SA-XL665和TK Ab按体积比1:1混合,每孔加入10μl终止反应,室温孵育1小时后检测,分析数据得阳性药半数抑制率IC50为1.599nM。
6.权利要求1-5中所述任一方法在筛选干细胞因子受体激酶抑制剂的应用。
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