EA017389B1 - Гетероциклические соединения и их применение - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к соединениям с приведенными ниже формулами или их фармацевтически приемлемым солям, а также фармацевтическим композициям, содержащим эти соединения и фармацевтически приемлемый разбавитель или носитель. Соединения настоящего изобретения полезны для лечения общего воспаления, артрита, ревматизма, остеоартрита, воспалительных заболеваний кишечника, воспалительных заболеваний глаз, воспалений или нестабильных заболеваний мочевого пузыря, псориаза, заболеваний кожи с воспалительными элементами, хронических воспалительных заболеваний, включающих, но не ограничивающихся этим, аутоиммунные заболевания, такие как системная красная волчанка (SLE), кинестезия, ревматоидный артрит, острый рассеянный энцефаломиелит, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, болезнь Шарко-Вюльпиана, синдром Шегрена и аутоиммунная гемолитическая анемия, аллергических состояний, включающих все формы гиперчувствительности, раковых заболеваний, опосредованных, зависящих или связанных с p110δ активностью, которые включают, но не ограничиваются этим, лейкемии, такие как острая лейкемия, миелоидную лейкемию (AML), миелодиспластический синдром (MDS), миелопролиферативные заболевания (MPD), хроническую миелоидную лейкемию (CML), Т-клеточный острый лимфобластный лейкоз (T-ALL), В-клеточную лимфобластную лейкемию (B-ALL), неходжкинскую лимфому (NHL), В-клеточную лимфому и твердые опухоли, такие как рак молочной железы.

Description

Настоящее изобретение в целом относится к ферменту фосфатидилинозитол-3-киназе (ΡΙ3Κ), в частности к селективным ингибиторам активности ΡΙ3Κ, и применению таких соединений.

Сведения о предшествующем уровне техники

Клеточная сигнализация через З'-фосфорилированные фосфоинозитиды вовлечена во множество клеточных процессов, например в малигнизацию, передачу сигналов факторов роста, воспаление и иммунитет (для обзора см. Катей е! а1., 1. Βίοί. Сйет., 274:8347-8350 (1999)). Фермент, ответственный за генерирование этих фосфорилированных сигнальных продуктов, фосфатидилинозитол-3-киназа (ΡΙ3киназа; ΡΙ3Κ), первоначально идентифицировался как активность, связанная с вирусными онкобелками и тирозинкиназным рецептором фактора роста, который фосфорилирует гидроксильную группу фосфатидилинозитола (ΡΙ) и его фосфорилированные производные в положении 3 кольца инозитола ^пауо^и е! а1., Ттепйк Се11. Βίοί. 2:358-60 (1992)).

Уровни фосфатидилинозитол-3,4,5-трифосфата (ΡΙΡ3), начального продукта активации ΡI3-киназы, возрастают при воздействии на клетки разных стимулов. Это включает сигнализацию через рецепторы для большинства факторов роста и много воспалительных стимулов, гормонов, нейротрансмиттеров и антигенов, и, таким образом, активация ΡΙ3Κ8 является одним, если не самым важным, элементом передачи сигнала, связанным с активацией рецептора на клеточной поверхности млекопитающего (Сап11еу, 8с1епсе, 296:1655-1657 (2002); УапйаекеЬтоеск е! а1. Аппи. Кеу. Вюсйет., 70:535-602 (2001)). Активация ΡI3-киназы, следовательно, является вовлеченной в широкий диапазон клеточных ответов, включающих рост клетки, миграцию, дифференциацию и апоптоз (Гагкег е! а1., Сиггеп!. Вю1оду, 5:577-99 (1995); Уао е! а1., 8с1епсе, 267:2003-05 (1995)). Хотя нижележащие мишени фосфорилированных липидов, генерирующих последующую активацию ΡI3-киназы, изучены не полностью, известно, что белки, содержащие плекстрин-гомологичный РН-домен и РУУЕ-Ппдег домен, активируются при связывании с различными фосфатидилинозитольными липидами (8!егптатк е! а1., 1. Се11. 8ск, 112:4175-83 (1999); Ьеттоп е! а1., Тгепйк Се11. Вю1., 7:237-42 (1997)). Две группы РН-домена, содержащие эффекторы ΡΙ3Κ, были изучены в отношении сигнализации иммунных клеток, членов Тес семейства тирозинкиназ и серин/треонин киназ АОС семейства. Члены Тес семейства, содержащие РН-домены с выраженной селективностью к ΡΐάΙπδ (3,4,5)Р₃, включают Тес, В!к, Йк и Е!к. Связывание ΡΗ с ΡΙΡ3 является критическим для тирозинкиназной активности членов Тес семейства (8сйае££ет апй 8сй\уаг1/Ьегд. Сшт. Орт. Iттипοί. 12:282-288 (2000)). Члены АОС семейства, которые регулируются ΡΙ3Κ, включают фосфоинозитид-зависимую киназу (ΡΌΚ1), АЛТ (также называемую как ΡΚΒ) и определенные изоформы протеин киназы С (ΡΚС) и 86 киназы. Существует три изоформы АНТ, и активирование АНТ тесно связано с ΡΚΚ-зависимой пролиферацией и сигналами для выживания. Активирование АНТ зависит от фосфорилирования ΡΌΚ1, которая также имеет 3-фосфоинозитид-селективный РН-домен для привлечения ее в мембрану, где она взаимодействует с АНТ. Другими важными ΡΌΚ1 субстратами являются ΡΚС и 86 киназа (Эеапе апй Ргитап, Аппи. Кеу. Iттипοί. 22, 563-598 (2004)). Ιπ уйто некоторые изоформы протеинкиназы С (ΡΚС) непосредственно активируются ΡΙΡ3 (Витдеппд е! а1., Па!иге, 376:599-602 (1995)).

В настоящее время семейство ΡΟ-киназ разделено на три класса на основе их субстратных специфичностей. Класс Ι ΡΙ3Κ8 может фосфорилировать фосфатидилинозитол (ΡΙ), фосфатидилинозитол-4фосфат и фосфатидилинозитол-4,5-бифосфат (ΡΙΡ2) для получения фосфатидилинозитол-3-фосфата (ΡΙΡ), фосфатидилинозитол-3,4-бифосфата и фосфатидилинозитол-3,4,5-трифосфата соответственно. Класс ΙΙ ΡΙ3Κ8 фосфорилирует ΡΙ и фосфатидилинозитол-4-фосфат, в то время как класс ΙΙΙ ΡΙ3Κ8 может фосфорилировать только ΡΙ.

Начальная очистка и молекулярное клонирование ГВ-киназы показали, что она является гетеродимером, состоящим из р85 и р110 субъединиц (О!§и е! а1., Се11, 65:91-104 (1991); Нйек е! а1., Се11, 70:419-29 (1992)). Позже были идентифицированы четыре отдельных ΡΙ3Κ8 класса Ι, обозначенные как ΡΙ3Κ α, β, δ и γ, при этом каждая из них состоит из отдельной 110 кЭа каталитической субъединицы и регуляторной субъединицы. В частности, каждая из трех каталитических субъединиц, а именно ρ110α, ρ110β и ρ110δ, взаимодействует с одной и той же регуляторной субъединицей, р85; тогда как р110γ взаимодействует с отдельной регуляторной субъединицей, р101. Как было описано выше, картины экспрессии каждой из этих ΡΙ3Κ8 в человеческих клетках и тканях также являются индивидуальными. Хотя в недавнем прошлом было накоплено много информации по клеточным функциям ΡI3-киназ в целом, роли, выполняемые индивидуальными изоформами, остаются до сих пор не полностью изученными.

Было описано клонирование бычьей р110а. Этот белок был идентифицирован как относящийся к белку дрожжей 8ассйаготусе§ сетеутае: Ур§34р, белку, вовлеченному в процессинг вакуолярного белка. Рекомбинантный р110а продукт также показал связывание с р85а для достижения активности ΡΙ3Κ в трансфицированных СО8-1 клетках. См. Нйек е! а1., Се11, 70, 419-29 (1992).

Клонирование второй человеческой р110 изоформы, обозначенной как р110β, описано в Ни е! а1., Мо1. Се11 Вю1., 13:7677-88 (1993). Считается, что эта изоформа связывается с р85 в клетках и является убиквитарно экспрессированной, поскольку ρ110β тКЫА был обнаружен в многочисленных тканях человека и мыши, а также в эндотелиальных клетках пупочной вены человека, лейкозных Т-клеточных

- 1 017389 линиях 1итка!, клетках эмбриональной почки человека линии 293, фибробласте мыши линии 3Т3, клетках НеЬа и клетках ΝΒΤ2 злокачественной опухоли мочевого пузыря крысы. Такая широкая экспрессия предполагает, что эта изоформа является очень важной в путях сигнализации.

Идентификация изоформы ρ110δ Р13-киназы описана в Сйаийу е! а1., 1. ΒίοΙ. Сйет., 272:19236-41 (1997). Наблюдалось, что человеческая изоформа ρ110δ экспрессирована ограничивающим ткани образом. Она экспрессирована на высоком уровне в лимфоцитах и лимфоидных тканях и играет ключевую роль в опосредованной киназой сигнализации в иммунной системе (ΑΙ-Λ1\ν;·ιη е! а1. Л 178:2328-2335 (2007); Оккепйаид е! а1. Л, 177:5122-5128 (2006); Ьее е! а1. ΡΝΑ8, 103:1289-1294 (2006)). Также было доказано, что ρ110δ экспрессируется на низких уровнях в клетках молочной железы, меланоцитах и эндотелиальных клетках (Уод! е! а1. Упо1оду, 344:131-138 (2006) и, следовательно, является вовлеченной в наделение раковых клеток молочной железы селективными миграционными свойствами (8а\\уег е! а1. Сапсег Кек. 63:1667-1675 (2003)). Подробности, касающиеся ρ110δ изоформы, также можно найти в Американском патенте № 568586753; 5822910 и 5985589. См. также УапйаекеЬгоеск е! а1., Ргос №11. Асай. 8с1. И8А, 94:4330-5 (1997) и международную публикацию \¥О 97/46688.

В каждой из ΡΙ3Κα, β и δ субъединиц р85 субъединица способствует локализации Р13-киназы к плазматической мембране путем взаимодействия ее 8Н2 домена с фосфорилированными тирозиновыми остатками (присутствующими в соответствующих аминокислотных последовательностях) в белкахмишенях (Катей е! а1., Се11, 83:821-30 (1995)). Было идентифицировано пять изоформ р85 (р85а, р85β, р55','. р55а и р50а), кодируемых тремя генами. Альтернативные транскрипты гена Р1к3г1 кодируют белки р85а, р55а и р50а (Эеапе апй Ртитап, Аппи. Неу. 1ттипо1. 22:563-598 (2004)). р85а является убиквитарно экспрессированным, в то время как р85β изначально был обнаружен в мозге и лимфоидных тканях (УоНша е! а1., Опсодепе, 7:789-93 (1992)). Связывание р85 субъединицы с каталитическими субъединицами Р13-киназы ρ110α, β или δ оказалось необходимым для каталитической активности и стабильности этих энзимов. К тому же, связывание Как белков также повышающе регулировало активность Р13киназы.

Клонирование ρ110γ выявило сложность внутри семейства Р13К энзимов (8!оуапоу е! а1., 8аепсе, 269:690-93 (1995)). Изоформа ρ110γ является близкородственной с р110а и ρ110β (45-48% идентичности в каталитическом домене), но, как отмечается, не использует р85 в качестве поставляющей субъединицы. Вместо этого, ρ110γ связывает р101 регуляторную субъединицу, которая также связывается с βγ субъединицами гетеротримерных О протеинов. р101 регуляторная субъединица для Р13К/ была изначально клонирована у свиней и человеческий ортолог был идентифицирован впоследствии (Кгидтапп е! а1., 1. Вю1. Сйет., 274:17152-8 (1999)). Известно, что взаимодействие между Ν-концевой областью ρ101 с Ν-концевой областью ρ101γ активирует Р13К/ через Οβγ. Недавно был идентифицирован ρ101-гомолог, р84 или ρ87^ΡIΚΑΡ (Р131К/ адаптерный белок 87 кИа), который связывает ρ110γ (Уо1д! е! а1. 1ВС, 281:99779986 (2006), 8ште е! а1. Сигг. Вю1. 15:566-570 (2005)). ρ87^ΡIΚΑΡ является гомологичным ρ101 в областях, которые связывают ρ110γ и Οβγ, и также опосредует активацию ρ110γ в направлении сопряженных с Обелком рецепторов. В отличие от р101, ρ87^ΡIΚΑΡ является высокоэкспрессированным в сердце и может быть решающим для Р13К/ сердечной функции.

Описание конститутивно активного полипептида Р13К представлено в международной публикации \УО 96/25488. Эта публикация раскрывает приготовление химерного белка, в котором 102-остататочный фрагмент р85, известный как интер-8Н2 (18Н2) область, является слитой через линкерную область с Ν-концом р110 мыши. 18Н2 домен р85 очевидно способен активировать Р13К активность, сравнимую с интактной р85 (Κ1^ρρе1 е! а1., Мо1. Се11 Вю1., 14:2675-85 (1994)).

Таким образом, Р13-киназы могут быть определены по их аминокислотной идентичности или по их активности. Дополнительные члены этого растущего семейства генов включают более дальние родственные липидные и протеиновые киназы, включающие νρκ34 ТОК1 и ТОК2 дрожжей 8ассйатотусек сетеу181ае (и их гомологи у млекопитающих, такие как РКАР и тТОК), ген атаксии-телеангиэктазии (АТМ) и каталитическую субъединицу ДНК-зависимой протеинкиназы (ΌΝΑ-РК). См. в общих чертах, Нип!ег, Се11, 83:1-4 (1995).

Р13-киназа также вовлечена в ряд аспектов активации лейкоцитов. р85-ассоциированная Р13киназная активность показала физическую связь с цитоплазменным доменом СО28, который является важной костимулирующей молекулой для активации Т-клеток в ответ на антиген (Радек е! а1., №!ите, 369:327-29 (1994); Кийй, 1ттипйу, 4:527-34 (1996)). Активация Т-клеток через СЭ28 понижает порог для активации антигеном и увеличивает интенсивность и продолжительность пролиферативного ответа. Эти эффекты связаны с увеличениями в считывании количества генов, включая интерлейкин-2 (1Ь-2), важный фактор роста Т-клетки (Ргакег е! а1., 8аепсе, 251:313-16 (1991)). Мутация СИ28, при которой он не может более взаимодействовать с Р13-киназой, приводит к неудаче в инициировании производства 1Ь-2, предполагая решающую роль Р13-киназы в активации Т-клеток.

- 2 017389

Специфические ингибиторы в отношении индивидуальных членов семейства энзимов обеспечивают действенные инструменты для расшифровки функций каждого энзима. Два соединения, БУ294002 и вортманнин, широко использовались в качестве ингибиторов Р13-киназы. Эти соединения, тем не менее, являются неспецифическими ингибиторами Р13К, поскольку они не различаются среди четырех членов класса I Р13-киназ. Например, величины 1С₅₀ для вортманнина в отношении каждой из разных Р13-киназ класса I находятся в диапазоне 1-10 нМ. Аналогично, значения 1С₅₀ для БУ294002 в отношении каждой из этих Р13-киназ составляют примерно 1 мкМ (Ргитап е! а1., Апп. Ксу. Вюсйет., 67:481-507 (1998)). Поэтому использование этих соединений в изучении роли индивидуальных Р13-киназ класса I является ограниченным.

На основании исследования с использованием вортманнина можно предположить, что функция Р13киназы также требуется для некоторых аспектов сигнализирования лейкоцитов через рецепторы, сопряженные с С-белком (Тйе1еп е! а1., Ргос. №111. Асай. 8с1. И8А, 91:4960-64 (1994)). Более того, было показано, что вортманнин и БУ294002 блокируют миграцию нейтрофилов и супероксидное высвобождение. Однако, поскольку все эти соединения не различаются среди разных изоформ Р13К, из этих исследований остается не ясно, какая конкретная изоформа Р13К или изоформы вовлечены в эти процессы и какие функции в целом выполняют разные энзимы класса I Р13К как в нормальных, так и пораженных тканях. До недавнего времени коэкспрессия нескольких изоформ РОК в большинстве тканей мешала усилиям по выделению активности каждого энзима.

Разделение активностей разных изоферментов РОК было недавно успешно проведено благодаря развитию генетически модифицированной мыши, что позволило изучить изоформ-специфичные нокаутные и кшаке-йеай (КО) трансгенные мыши, а также разработать более селективные ингибиторы для некоторых разных изоформ. р110а и ρ110β нокаутных мышей были генерированы и являются эмбрионально летальными, и из этих мышей может быть получено мало информации относительно экспрессии и функций р110а и β (В1 е! а1. Матт. Сепоте, 13:169-172 (2002); В1 е! а1. 1. Вю1. Сйет. 274:10963-10968 (1999)). Позднее, р110а кшаке-йеай (КО) трансгенных мышей были генерированы с помощью простой мутации в ОРС мотиве АТР связывающего кармана (р110аО^933А), который уменьшает киназную активность, но сохраняет экспрессию мутантной р110а киназы. В отличие от нокаутной мыши, принцип нокин сохраняет стехиометрию сигнальных комплексов, поддерживающие функции и имитирует приближение маленьких молекул более реалистично, чем нокаутные мыши. Аналогично, р110а нокаутной мыши, р110аО^933А гомозиготной мыши являются эмбрионально летальными. Однако гетерозиготные мыши являются жизнеспособными и детородными, но проявляют ослабленное сигнализирование через белки ΣΚ.8 (субстрат инсулинового рецептора), ключевые медиаторы инсулина, инсулин-подобный фактор роста-1 и действие лептина. Нарушенная отвечаемость на эти гормоны приводит к гиперинсулинемии, толерантности к глюкозе, булимии, увеличению ожирения и снижению общего роста у гетерозигот (Роикак, е! а1. Ма!иге, 441:366-370 (2006)). Эти исследования показали определенную, не избыточную роль р110а в качестве промежуточного продукта в ЮР-1, инсулиновой и лептиновой сигнализации, который не замещен другими изоформами. Надлежит рассмотреть описание р110[5 кшаке-йеай (КО) трансгенной мыши для дальнейшего понимания функции этой изоформы (мышь была приготовлена, но еще не опубликована; Уапйаекейтоеск).

р110у нокаутной и кшаке-йеай (КО) трансгенной мыши были генерированы и в целом показали аналогичные и мягкие фенотипы с начальными дефектами в миграции клеток врожденной иммунной системы и дефектом в развитии тимусных Т-клеток (Ь1 е! а1. 8с1епсе, 287:1046-1049 (2000), 8акак1 е! а1. 8с1епсе, 287:1040-1046 (2000), Райиссо е! а1. Се11, 118:375-387 (2004)).

Аналогично, р110у. РОК дельта нокаутные и кшаке-йеай (КО) трансгенные мыши были приготовлены и были жизнеспособными с мягкими и похожими фенотипами. р1105^С910А мутантной трансгенной мыши показала важную роль дельта в В-клеточном развитии и функционировании, с практически необнаруженными В-клетками маргинальной зоны и СО5⁺ В 1-клетками и сигнализированием через В- и Т-клеточные рецепторы для антигена (С1ау!оп е! а1. 1. Ехр. Мей. 196:753-763 (2002); Оккепйаид е! а1. 8аепсе, 297:1031-1034 (2002)). р1105^С910А мыши была тщательно изучена и выявила иную роль дельты в иммунной системе. Т-клеточно-зависимый и Т-клеточно-независимый иммунные отклики являются значительно ослабленными в р1105^С910А и секреция ТН1 (ΓΝΕ-γ) и ТН2 цитокина (№-4, !к-5) являются нарушенными (Оккепйаид е! а1. 1. ^типок 177:5122-5128 (2006)). Недавно было представлено описание пациента с мутацией р1105. Тайваньский мальчик с первичным В-клеточным иммунодефицитом и гаммагипоглобулинемией ранее неизвестной этиологии, представленной заменой одной пары нуклеотидов, т.3256С на А в 1021 кодоне 24 экзона р1105. Эта мутация вызывала миссенс аминокислотное замещение (от Е к К) в кодоне 1021, который расположен в высококонсервативном каталитическом домене белка р1105. Пациент не имеет других выявленных мутаций, и, насколько было изучено, его фенотип согласуется с дефицитом р1105 у мыши (1ои е! а1. Ш!. 1. !ттиподепе1. 33:361-369 (2006)).

- 3 017389

Изоформ-селективные низкомолекулярные соединения были разработаны с переменным успехом для всех изоформ киназ класса I ΡΙ3 (Йо е! а1. 1. РНагш. Ехр. ТНегареи!., 321:1-8 (2007)). Ингибиторы альфа являются предпочтительными, потому что мутации р110а были идентифицированы в нескольких твердых опухолях; например, амплификационная система для выявления мутации альфы связана с 50% овариальным, цервикальным, легочным раком и раком молочной железы, и активированная мутация была описана в более чем 50% колоректального рака и 25% рака молочной железы (Неппекку е! а1. Ыа1иге Ие\зе\\ъ. 4:988-1004 (2005)). УатапоиеЫ было разработано соединение ΥΜ-024, которое равносильно ингибирует альфа и дельта и является 8- и 28-кратно селективным по отношению к бета и гамма соответственно (Ио е! а1. 1. РНагш. Ехр. ТНегареи!, 321:1-8 (2007)).

ρ110β является вовлеченной в образование тромбоцитов (1асккоп е! а1. Ыа1иге Мей. 11:507-514 (2005)), и специфичные для этой изоформы низкомолекулярные ингибиторы могут использоваться впоследствии для показателя, включающего нарушения свертывания крови (ТЭХ-221:0.007 иМ на бета; в 14 раз селективнее дельта и более чем в 500 раз селективнее гамма и альфа) (1!о е! а1. 1. РНагш. Ехр. ТНегареи!., 321:1-8 (2007)).

Селективные соединения для р 110γ разработаны в виде нескольких групп иммуннодепрессивных препаратов для аутоиммунных заболеваний (Киеск1е е! а1. Ха!иге Кеу1ете, 5:903-918 (2006)). Следует отметить, что Ά8 605240 проявил эффективность при моделировании на мышах ревматоидного артрита (Сатрк е! а1. Ыа!иге Мейкше, 11:936-943 (2005)) и задержал начало заболевания при моделировании системной красной волчанки (БагЬег е! а1. Ыа!иге Мейюше, 11:933-935 (205)).

Дельта-селективные ингибиторы также были недавно описаны. Самые селективные соединения включают хиназолиноновые пуриновые ингибиторы (ΡΙΚ39 и 1С 87114). 1С 87114 ингибирует р1105 в высоком наномолекулярном диапазоне (трехзначный) и имеет более чем 100-кратную селективность относительно р110а, 52-кратную селективность относительно р 110β, но имеет недостаточную селективность относительно р110у (примерно 8-кратную). Это свидетельствует об отсутствии активности относительно любых тестированных протеинкиназ (ΚπφΗΐ е! а1. Се11, 125:733-747 (2006)).

С помощью дельта-селективных соединений или генетически модифицированной мыши (р1105^С910А) было доказано, что дополнительно к ключевой роли в В- и Т-клеточной активации дельта является также частично вовлеченной в миграцию нейтрофилов и в начальный нейтрофильный окислительный всплеск и приводит к частичной блокировке антигенДдЕ-опосредованной дегрануляции тучных клеток (СопйШРе е! а1. В1оой, 106:1432-1440 (2005); Ай е! а1. Ыа!иге, 431:1007-1011 (2002)). Поэтому р1105 выступает как важный медиатор многих ключевых воспалительных ответов, которые также участвуют в аберрантных воспалительных состояниях, включающих, но не ограничивающихся этим, аутоиммунные заболевания и аллергию. В поддержку этой идеи существует большое количество данных целевой проверки р1105, полученных в результате исследования с использованием как генетических инструментов, так и фармакологических агентов. Таким образом, использование дельта-селективного соединения 1С 87114 и р1105^С910А мыши, Ай е! а1. (ЫаШге, 431:1007-1011 (2002)) показало, что дельта играет критическую роль в мышиной модели аллергических заболеваний. В отсутствие функциональной дельты пассивная кожная анафилаксия (РСА) является значительно сниженной и может быть приписана снижению аллергена-1дЕ, индуцирующего активацию тучных клеток и дегрануляцию. К тому же, ингибирование дельты с помощью 1С 87114 показало значительное подавление воспаления и заболевания в мышиной модели астмы, использующей овальбумин-индуцированное воспаление дыхательных путей (Ьее е! а1. ЕА8ЕВ, 20:455-465 (2006)). Эти данные, в которых используется соединение, были подтверждены у р1105^С910А мутантной мыши с помощью той же модели аллергического воспаления дыхательных путей разными группами (ЫакНей е! а1. Еиг. 1. 1ттипо1. 37:416-424 (2007)).

Существует потребность в дальнейшем исследовании функции ΡΙ3Κ5 в воспалительных и аутоиммунных ситуациях. Более того, для понимания ΡΙ3Κδ требуется дальнейшее исследование структурных взаимодействий р110δ как с его регуляторной субъединицей, так и с другими белками в клетке. Также остается потребность в более активных и селективных или специфических ингибиторах ΡΙ3Κδ для того, чтобы избежать возможной токсикации, связанной с активностью на изомерах р110а (инсулиновая сигнализация) и β (активация тромбоцитов). В частности, селективные или специфические ингибиторы ΡΙ3Κδ являются желательными для выполнения роли этого изофермента в дальнейшем и для развития отличных фармацевтических препаратов для моделирования активности изофермента.

- 4 017389

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к соединениям, представленным приведенными ниже формулами, или их фармацевтически приемлемым солям, которые являются эффективными для ингибирования биологической активности человеческой ΡΙ3Κ5:

Другим аспектом изобретения является обеспечение соединений, которые ингибируют ΡΙ3Κδ селективно, несмотря на то, что имеют относительно низкий ингибирующий потенциал по сравнению с другими изоформами ΡΙ3Κ. Другим аспектом изобретения являются фармацевтические композиции, содержащие указанные выше соединения. Другие аспекты и преимущества изобретения будут очевидны для среднего специалиста данной области.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Один аспект изобретения относится к соединению, имеющему структуру

или его любой фармацевтически приемлемой соли.

Другой аспект изобретения относится к соединению, имеющему следующую структуру:

или его любой фармацевтически приемлемой соли.

Другой аспект изобретения относится к соединению, имеющему следующую структуру:

или его фармацевтически приемлемой соли.

Другой аспект изобретения относится к фармацевтической композиции, включающей соединение согласно любому из приведенных выше вариантов и фармацевтически приемлемый разбавитель или носитель.

Изобретение относится к лечению Р13К-опосредованных состояний и нарушений. В определенных вариантах Р13К-опосредованные состояния или нарушения являются выбранными из ревматоидного артрита, анкилозирующего спондилита, остеоартрита, псориатического артрита, псориаза, воспалительных заболеваний и аутоиммунных заболеваний. В других вариантах Р13К-опосредованное состояние или нарушение выбрано из сердечно-сосудистых заболеваний, атеросклероза, гипертонии, глубокого венозного тромбоза, инсульта, инфаркта миокарда, нестабильной стенокардии, тромбоэмболизма, эмболии легких, тромболитических заболеваний, острой артериальной непроходимости, тромботической окклюзии и болезни коронарных артерий. В еще других вариантах Р13К-опосредованное состояние или нарушение является выбранным из рака, рака толстой кишки, глиобластомы, эндометриального рака, печеночно-клеточного рака, рака легких, меланомы, рака почки, рака щитовидной железы, клеточной лим

- 5 017389 фомы, лимфопролиферативных заболеваний, мелкоклеточного рака легкого, плоскоклеточного рака легкого, глиомы, рака молочной железы, рака предстательной железы, рака яичников, рака шейки матки и лейкемии. В еще других вариантах Р13К-опосредованные состояния или нарушения являются выбранными из диабета II типа. В еще других вариантах Р13К-опосредованные состояния или нарушения являются выбранными из респираторных заболеваний, бронхита, астмы и хронического обструктивного заболевания легких. В определенных вариантах объектом является человек.

Изобретение также относится к лечению ревматоидного артрита, анкилозирующего спондилоартрита, остеоартрита, псориатического артрита, псориаза, воспалительных заболеваний или аутоиммунных заболеваний, включающему этап введения компонента согласно любому вышеприведенному варианту.

Изобретение также относится к лечению ревматоидного артрита, анкилозирующего спондилоартрита, остеоартрита, псориатического артрита, псориаза, воспалительных заболеваний и аутоиммунных заболеваний, воспалительных заболеваний кишечника, воспалительных заболеваний глаз, воспалительных или нестабильных мочеиспусканий, заболеваний кожи с воспалительными составляющими, хронических воспалительных состояний, аутоиммунных заболеваний, системной красной волчанки (8ЬЕ), миастении, ревматоидного артрита, острого рассеянного энцефаломиелита, идиопатической тромбоцитопенической пурпуры, болезни Шарко-Вюльпиана, синдрома Шегрена и аутоиммунной гемолитической анемии, аллергических состояний и гиперчувствительности, включающему этап введения соединения согласно любому из приведенных выше или ниже вариантов.

Изобретение также относится к лечению раковых заболеваний, которые являются опосредованными, зависимыми или связанными с ρ110δ активностью, включающему этап введения соединения согласно любому из приведенных выше или ниже вариантов.

Изобретение также относится к лечению раковых заболеваний, выбранных из острого миелолейкоза, миелодиспластического синдрома, миелопролиферативных заболеваний, хронического миелолейкоза, Т-клеточного острого лимфобластного лейкоза, В-клеточного острого лимфобластного лейкоза, неходжкинской лимфомы, В-клеточной лимфомы, твердых опухолей и рака молочной железы, включающему этап введения соединения согласно любому из приведенных выше или ниже вариантов.

Соединения настоящего изобретения могут иметь в целом несколько асимметричных центров и обычно изображаются в виде рацемических смесей. Настоящее изобретение охватывает рацемические смеси, частично рацемические смеси и отдельные энантиомеры и диастереомеры.

Фармацевтически приемлемая соль означает соль, приготовленную обычными и хорошо известными опытным в данной области специалистам способами. Фармакологически приемлемые соли включают основные соли неорганических и органических кислот, включающих, но не ограничивающихся этим, соляную, серную, фосфорную, метансульфоновую, этансульфоновую, оксиянтарную, уксусную, щавелевую, винную, лимонную, молочную, фумаровую, янтарную, малеиновую, салициловую, бензойную, фенилуксусную, миндальную кислоты и подобные. Когда соединения изобретения включают кислотную функцию, такую как карбоксильная группа, в этом случае пригодные фармацевтически приемлемые пары катионов для карбоксильной группы являются хорошо известными опытным в данной области специалистам и включают щелочные, щелочно-земельные, аммониевые, четвертичные аммониевые катионы и подобные. Дополнительные примеры фармакологически приемлемых солей см. ниже и Ветде е! а1., I. Рйатт. 8с1. 66:1 (1977).

Следует отметить, что соединения изобретения могут содержать группы, которые могут существовать в таутометрических формах, таких как циклические или ациклические амидиновые и гуанидиновые группы, замещенные гетероатомами гетероарильные группы (Υ'=Θ, 8, ΝΚ), и подобные, которые проиллюстрированы в следующих примерах:

и хотя в качестве примера приведена, описана, изображена и/или заявлена здесь одна форма, все таутометрические формы могут быть включены в такое название, описание, изображение и/или формулу.

- 6 017389

Экспериментальная часть

Используются следующие сокращения: водн. - водный;

ΒΙΝΑΡ - 2,2'-бис-(дифенилфосфино)-1,1'-бинафтил;

конц. - концентрированный;

ИСМ - ИСМ;

ΌΜΡ - ΌΜΡ;

ЕьО - диэтиловый эфир;

ЕЮАс - этиловый эфир уксусной кислоты;

ЕЮН - этиловый спирт;

ч - час(ы);

мин - минуты;

МеОН - метиловый спирт;

к.т. (КТ) - комнатная температура;

насыщ. - насыщенный;

ТНЕ - тетрагидрофуран.

Общая информация.

Реагенты и растворители, использующиеся ниже, могут быть получены коммерческим путем. Спектры ¹Н-ЯМР регистрировали на спектрометре ЯМР фирмы Вгикег частотой 400 и 500 МГц. Значительные пики группировали в следующем порядке: мультиплетность (5, синглет; б, дуплет; 1, триплет; с.|, квартет; т, мультиплет; Ьг 5. широкий синглет), константа(ы) взаимодействия в герцах (Гц) и число протонов. Результаты масс-спектрометрии представлены в виде соотношения массы к заряду с относительно большим содержанием каждого йона (в скобках Е81 масс-спектрометрический анализ с ионизацией электрораспылением выполнялся на масс-спектрометре Адйеи! 1100 8епе§ ЬС/ΜδΌ). Все соединения могут быть проанализированы в режиме Е81 положительных ионов с использованием мобильной фазы ацетонитрил:вода, содержащая 0,1% муравьиной кислоты. Аналитическую обращенно-фазовую ВЭЖХ выполняли на жидкостном хроматографе Адйеи! 1200 серии на колонке Адбеи! Есйрке ХОВ-С18 5 мкм (4,6x150 мм) в качестве неподвижной фазы и элюировали смесью ацетонитрил:Н₂О с 0,1% ТЕА. Обращенно-фазовая полупрепаративная ВЭЖХ проводилась на Адйеи! 1100 8епе§ на колонке С18 РИепотепех Оет1ш™ 10 мкм (250x21,20 мм) в качестве неподвижной фазы и элюировали смесью ацетонитрил:Н2О с 0,1% ТЕА.

Способ А.

Смесь 2-хлорхинолин-3-карбальдегида (1 экв.), арилбориновой кислоты (1,1 экв.), тетракис(трифенилфосфин)палладия (5 мол.%) и карбоната натрия (2 М водн. р-р, 5,0 экв.) в СН₃С№вода (3:1, 0,1 М) нагревали при 100°С в атмосфере Ν₂ в течение нескольких часов. Смесь разделяли между ЕЮАс и Н₂О, органический слой отделяли и водный слой экстрагировали ЕЮАс. Объединенные органические слои высушивали над Νη₂8Ο₄, фильтровали, концентрировали при пониженном давлении и очищали колоночной хроматографией на силикагеле, используя градиент от 0 до 25% ЕЮАс в гексане для получения 2-арилхинолин-3-карбальдегидов.

Способ В.

Твердый борогидрид натрия (1,5 экв.) добавляли к раствору 2-арилхинолин-3-карбальдегида (1 экв.) в тетрагидрофуране ТНЕ (0,5 М) при 0°С и смесь перемешивали при 0°С в течение 2 ч. Реакционную смесь охлаждали добавлением воды. Водный слой экстрагировали ЕЮАс (3 раза). Объединенные органические слои высушивали над №₂8О₄, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Осадок очищали колоночной хроматографией на силикагеле, используя 50% ЕЮАс в гексане для получения (2-арилхинолин-3 -ил)метанолов.

- 7 017389

Способ С.

(2-Арилхинолин-3-ил)метанол (1 экв.) в СНС1₃ (0,25 М) обрабатывали 8ОС1₂ (5 экв.) при комнатной температуре в течение 2 ч. Растворители удаляли при пониженном давлении и остаток разделяли между ЕЮАс и насыщенным водным раствором ЫаНСО₃. Органический слой отделяли, отмывали водой и солевым раствором, высушивали над №₂8О.-|. фильтровали и концентрировали при пониженном давлении.

Сырой продукт очищали колоночной хроматографией на колонке Кеб1-8ер™, используя градиент от 0 до 100% ЕЮАс в гексане для получения 3-(хлорметил)-2-арилхинолинов.

Способ Ό.

С1	0 ΝβΝ3 (3 эка)	мн2
		ОМ5О(0.25М)
Ν	О(Й4)П	КТ, 4 ч
й) РсБС (10%, 5 масс.%)		чг^
нз	МеОН (0.25 М) КТ. 8 ч	КЗ

К раствору 3-(хлорметил)-2-арилхинолина (1 экв.) в ΌΜ8Ο (0,25 М) добавляли ΝαΝ₃ (3 экв.) при комнатной температуре и смесь перемешивали в течение | ч при комнатной температуре. Смесь разбавляли водой, экстрагировали ЕЮАс (2 раза) и объединенные органические слои отмывали водой (2 раза), высушивали над Ν;·ι₂8Ο₊ фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Осадок растворяли в МЕОН и обрабатывали 10% Рб-С (5 мас.%) и смесь затем перемешивали в атмосфере Н₂ из баллона в течение ночи. Смесь фильтровали через слой СеШе™ с последующим удалением растворителей для получения (2-арилхинолин-3-ил)метанаминов.

Способ Е.

К перемешивающемуся раствору 3-(хлорметил)-2-арилхинолина (1 экв.) в 16 мл ΌΜΕ добавляли ΝαΝ₃ (2 экв.) при комнатной температуре. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. Смесь разделяли между ЕЮАс и Н₂О. Органический слой высушивали над Мд8О₄, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении для получения 3-(азидометил)-2-арилхинолинов. Сырой продукт использовали без очистки на следующей стадии. К перемешивающемуся раствору 3(азидометил)-2-арилхинолина в ТНЕ-Н₂О (4:1, 0,21 М) добавляли по каплям РМе₃ (1,0 М раствор в ТНЕ, 1,2 экв.) при комнатной температуре и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. К смеси добавляли ЕЮАс и смесь экстрагировали 1н. НС1 (2 раза). Объединенные экстракты нейтрализовали твердым бикарбонатом натрия и экстрагировали ЕЮАс (2 раза). Объединенные органические экстракты высушивали над Мд8О₄, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении для получения темного сиропа. Сырой продукт очищали колоночной хроматографией на колонках Яеб1-8ер™, используя в качестве элюента градиент от 0 до 100% СН₂С1₂:МЕОН:ХН₄ОН (89:9:1) в СН₂С1₂ для получения (2-арилхинолин-3 -ил)метанаминов. Способ Е.

ϊ) ΡΜΒΝΗ₂ (1.5 эта.) ОСЕ (0.2 М)

КТ, 1ч___________ ίί) ЦавН(ОАс)₃ (3 экв.) “С,2 ч

ΝΗΡΜΒ

Смесь 2-арилхинолин-3-карбальдегида (1 экв.), дихлорэтана ОСЕ (0,2 М), и п-метоксибензиламина ΡΜΒΝΉ₂ (1,5 экв.) перемешивали при комнатной температуре. Через 1 ч к смеси добавили триацетоксиборогидрид натрия ЫаВН(ОАс)₃ (3 экв.) и смесь перемешивали при 50°С в течение 2 ч. К смеси добавили насыщенный водный раствор №1НСО₃ и смесь перемешивали в течение 15 мин. Органический слой отделяли и водный слой экстрагировали СН2С12 (2 раза). Объединенные органические слои отмывали солевым раствором, высушивали над Мд8О₄, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали колоночной хроматографией на колонке К.еб1-8ер™, используя градиент от 0 до 100% ЕЮАс в гексане для получения Ы-(4-метоксибензил)(2-арилхинолин-3-ил)метанаминов.

- 8 017389

Способ С.

Смесь Ы-(4-метоксибензил)(2-арилхинолин-3-ил)метанамина (1 экв.) и аммоний-церий(ГУ) нитрата (3,5 экв.) в СН₃СЫ-Н₂О (2:1, 0,22 М) перемешивали при комнатной температуре в течение 24 ч. К смеси добавляли 0,5 М НС1 (12 экв.) и смесь отмывали СН₂С1₂ (3 раза) для удаления полученного 4-метоксибензальдегида. Органическую фракцию экстрагировали 0,5 М НС1 (2 раза). Объединенные кислые водные слои подщелачивали 2н. ЫаОН до рН 9,0. Полученный осадок собирали фильтрацией. Сырой продукт очищали колоночной хроматографией на колонке Яей1-8ер™, используя в качестве элюента градиент от 0 до 100% СН₂С1₂:МЕОН:НН₄ОН (89:9:1) в СН₂С1₂ для получения (2-арилхинолин-3ил)метанаминов.

Способ Н.

Смесь (2-арилхинолин-3-ил)метанамина (1 экв.) в этаноле ЕЮН (0,16 М) обрабатывали ιΡγ₂ΝΕϊ (1,2 экв.) и затем 6-хлоруридином (1 экв.) при 80°С в течение 8 ч. Реакционную смесь концентрировали и очищали колоночной хроматографией на колонке Яей1-8ер™, используя в качестве элюента градиент от 0 до 100% СН₂С1₂:МЕОН:NН₄ОН (89:9:1) в СН₂С1₂ для получения №((2-арилхинолин-3-ил)метил)-9Нпурин-6-аминов.

Способ К.

К смеси 2-фенилхинолин-3-карбальдегида (1,0 экв.) в тетрагидрофуране ΊΠΕ (0,28 М) при 0°С добавляли по каплям раствор реагента Спдпагй (3 М, 2 экв.) и реакционную смесь перемешивали в течение ночи перед резким охлаждением насыщенным раствором N^01. Смесь экстрагировали ЕЮАс (2x10 мл) и объединенные органические слои высушивали (№₂8О₄) и концентрировали при пониженном давлении. Осадок очищали колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: ЕЮАс/гексан, 1/1) для получения 1-(2-фенилхинолин-3-ил)спиртов.

Способ Ь.

Смесь 4-хлор-7Н-пирроло[2,3-й]пиримидина (2,0 экв.) и 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана (4,0 экв.) в безводном ЭМ8О (0,69 М) перемешивали при комнатной температуре в течение 5 ч и затем добавляли посредством канюли в смесь 1-(2-фенилхинолин-3-ил)спирта (1 экв.) и гидрида натрия в виде 60% дисперсии в минеральном масле (3 экв.) в ЭМЕО (0,5 М), который перемешивали в течение 30 мин при комнатной температуре и в течение 30 мин при 50°С перед добавлением. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 6 ч перед добавлением воды и экстрагировали ЕЮАс (4 раза). Объединенные органические слои отмывали водой, солевым раствором, высушивали (Мд8О₄) и концентрировали при пониженном давлении. Осадок очищали колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: СН₂С1₂/МЕОН, 50/1) для получения требуемого продукта.

- 9 017389

Пример 1. 3-((8)-1(9Н-Пурин-6-иламино)этил)-2-(пиридин-2-ил)хинолин-8-карбонитрил

Смесь Ы-((8)-1-(8-хлор-2-(пиридин-2-ил)хинолин-3-ил)этил-9Н-пурин-6-амина (80 мг, 0,2 ммоль), Рб(РРй₃)₄ (23 мг, 0,1 экв.) и Ζη(ί.’Ν)₂ (117 мг, 5,0 экв.) в ΌΜΕ (5 мл) продували Ν₂ в течение 5 мин перед нагреванием до 130°С. Через 3 ч ЙСМ8 показала образование следового количества 2. Реакционную смесь затем нагревали до 165°С в течение ночи. После охлаждения до комнатной температуры реакционную смесь фильтровали через Се111е™ и очищали обращенно-фазовой ВЭЖХ (Μοί'.’Ν/Η₂Θ. 0,1% ТРА) для получения твердого белого вещества.

Ή-ЯМР (400 Гц, ΌΜ8Θ-ά₆): δ 8,83 (δ, 1Н), 8,72 (δ, 1Н), 8,52 (δ, 1Н), 8,42-8,37 (т, 2Н), 8,14 (б, 1=8,0 Гц, 1Н), 8,08 (1, 1=8,0 Гц, 1Н), 7,79 (1, 1=8,0 Гц, 1Н), 7,55 (1, 1=8,0 Гц, 1Н), 6,24 (δ, 1Н), 1,72 (б, 1=8,0 Гц, 3Н).

Масс-спектр (Ε8Ι) т/е=393 (Μ+1).

Общие методики для аналогов 8-фторхинолина.

Методика Б8Ь-1.

В колбу с круглым дном добавили (8)-3-(1-азидоэтил)-2-хлор-8-фторхинолин (1 экв.), тетракистрифенилфосфин палладия(0) (0,04 экв.), карбонат натрия (5 экв.) и арилбороновую кислоту (1,5 экв.). Колбу продували азотом и добавляли смесь МеС№Н₂О в соотношении 3:1 для обеспечения концентрации 0,1 М по отношению к исходному азиду. Реакционную смесь нагревали до 80°С до завершения реакции. Растворитель удаляли и остаток заново растворяли в этилацетате и воде. Слои разделяли и органический слой отмывали солевым раствором, высушивали над Мд8О₄, фильтровали и концентрировали. Сырую реакционную смесь очищали колоночной хроматографией (этилацетат в гексане, градиент) для получения (8)-3-(1-азидоэтил)-8-фтор-2-арилхинолина.

Методика В8Й-2.

ν, νη₂

(8)-3-(1-Азидоэтил)-8-фтор-2-арилхинолин растворяли в ТНР (для получения 0,1 М раствора) и добавляли трифенилфосфин (1,1 экв.) и воду (2 экв.). Реакционную смесь нагревали до 60°С в течение ночи. После охлаждения до комнатной температуры растворитель удаляли под вакуумом и остаток заново растворяли в этиловом эфире. Слой эфира экстрагировали 3 раза с помощью 1н. НС1. Водный слой доводили до рН 10-12 путем добавления 15% №ОН и щелочной водный слой экстрагировали дважды этиловым эфиром. Слои эфира отмывали солевым раствором, высушивали над Мд8О₄, фильтровали и концентрировали для получения (8)-1-(8-фтор-2-арилхинолин-3-ил)этанамина.

Методика В8Й-3.

В колбу с круглым дном добавляли (8)-1-(8-фтор-2-арилхинолин-3-ил)этанамин (1 экв.), 6-бромпурин (1,2 экв.) и диизопропилэтиламин (3 экв.). Достаточное количество н-бутанола добавляли для приготовления 0,1 М раствора по отношению к (8)-1-(8-фтор-2-арилхинолин-3-ил)этанамину. Смесь нагревали до 100-115°С в течение 24 ч, охлаждали до комнатной температуры и растворитель удаляли под вакуумом. Очистка обращенно-фазовой ВЭЖХ позволила получить (8)-№1-(8-фтор-2-арилхинолин3-ил)этил)-9Н-пурин-6-амин. Продукты растворяли в ЭСМ/№НСО₃ и органический слой разделяли, высушивали над Мд8О₄, фильтровали и концентрировали для получения (8)-№(1-(8-фтор-2-фенилхинолин3-ил)этил)-9Н-пурин-6-амина в виде свободных оснований.

- 10 017389

Пример 2. (8)-Н-(1-(2-(3,5-Дифторфенил)-8-фторхинолин-3-ил)этил)-9Н-пурин-6-амин

Р

Показатели для (8)-Ν-(1 -(2-(3,5-дифторфенил)-8-фторхинолин-3-ил)этил)-9Н-пурин-6-амина:

¹Н-ЯМР (400 МГц, СИС1₃): δ ррт 8,35 (8, 2Н), 8,00 (δ, 1Н), 7,56 (й, 1=8,6 Гц, 1Н), 7,46 (т, 3Н), 7,38 (ййй, 1=10,6, 7,8, 1,6 Гц, 1Н), 6,90 (й, 1=9,0, 2,4 Гц, 1Н), 6,50 (Ьг 8, 1Н), 1,53 (й, 1=6,4 Гц, 3Н).

Масс-спектр (Ε8Ι) т/е =420,9 (М+1).

Определение биологической активности.

Рекомбинантная экспрессия ΡΙ3Κ8.

Субъединицы р110 полной длины ΡΙ3Κ α, β и δ, маркированные на Ν-конце меткой ро1у-Н18, были коэкспрессированы с р85 экспрессирующими векторами на основе вируса Васи1о в клетках 819 насекомого. Гетеродимеры р110/р85 были очищены последовательно Νί-ΝΤΆ, О-НР. 8ирегйех-100 хроматографией. Очищенные α, β и δ изомеры хранились при -20°С в 20 мМ Трис, рН 8, 0,2 М №С1, 50% глицерина, 5 мМ ΌΤΤ, 2 мМ холата натрия. Процессированная ΡΙ3Κγ, остатки 114-1102, маркированные на Ν-конце меткой ро1у-Н18, была экспрессирована вирусом Васи1о в Н15 клетки насекомого, γ-изозим был очищен последовательно Νί-ΝΤΆ, О-НР, 8ирегйех-100 хроматографией, γ-изозим хранился замороженным при 80°С в ΝαΠ₂ΡΟ₄, рН 8, 0,2 М №С1, 1% этиленгликоле, 2 мМ β-меркаптоэтаноле.

	Альфа	Бета	Дельта	Гамма
50мМ Трис	рН 8	рН7.5	рН7.5	рН8
МёСк	15 мМ	10 мМ	10 мМ	15 мМ
Холат Νθ	2 мМ	1 мМ	0.5 мМ	2 мМ
ОТТ	2 мМ	1 мМ	1 мМ	2 мМ
АТР	1 μΜ	0.5 μΜ	0.5 μΜ	1 μΜ
ΡΙΡ2	нет	2.5 μΜ	2.5 μΜ	нет
Время	1 ч	2ч	2ч	1 ч
[Энзим]	15 нМ	40 нМ	15 нМ	50 нМ

Ферментный анализ ίη уйго.

Анализы проводились в 25 мкл с вышеуказанными конечными концентрациями компонентов в белых полипропиленовых планшетах (Со81аг 3355). Фосфоакцептор фосфатидилинозитол, ΡΜΙη8(4,5)Ρ2 Ρ4508 был получен от Есйе1оп Вю8С1епсе8. Активность АТФазы альфа и гамма изоферментов не была сильно стимулирована Ρΐ^η8(4,5)Ρ2 в этих условиях и была, следовательно, исключена из анализа этих изоферментов. Тестируемые соединения были растворены в диметилсульфоксиде и разбавлены трехкратным серийным разведением. Соединение в Ό8ΜΟ (1 мкл) было добавлено в каждую тест-ячейку и было определено ингибирование по отношению к реакциям, не содержащим соединение, с энзимом и без него. После выдерживания проб при комнатной температуре реакция была остановлена, и остаточный АТР определялся путем добавления равного объема коммерческого АТР биолюминесцентного набора (Гегкт Е1тег Еа8уЬйе) согласно инстукциям производителя и регистрировался с помощью Αηαβ+ΐΟΤ люминометра.

Пролиферация человеческих В-клеток? стимулированная анти-ЮМ.

Изоляция человеческих В-клеток.

Изолирование ΡВΜС8 от Ьеикорас или от человеческой свежей крови. Изолирование человеческих В-клеток с помощью М111епу1 протокола и изолирующего В-клетки комплекта ΙΙ. Человеческие В-клетки были очищены с помощью колонок аи!оМАС8™ Со1итп8.

Активация человеческих В-клеток.

Использование 96-луночного планшета с плоским дном, планшет из расчета 50000/лунка очищенных В-клеток в среде пролиферации В-клеток (ИМЕМ+5% РС8, 10 мМ Нере8, 50 мкмоль 2-меркаптоэтанола); 150 мкл среды, содержащей 250 нг/мл СП40Т-Ь2 рекомбинантного белка (Атдеп) и 2 мкг/мл античеловеческого ЦМ антитела (1аск8оп [ттипоРе8еас11 ЬаЬ.#109-006-129), смешивали с 50мкл В-клеточной средой, содержащей ингибиторы ΡΙ3Κ, и инкубировали в течение 72 ч при 37°С инкубатора. Через 72 ч В-клетки были импульсно мечены 0,5-1 иС1/лунка ³Н-тимидином в течение ночи ~18 ч и собирали клетки с помощью ТОМ Нагуе81ег.

- 11 017389

Соединение 1С₅₀ И-((18)-1-(7-фтор-2-(2-пиридинил)-3-хинолинил)этил)-9Н-пурин-6-амин 0.009416. Пролиферация человеческих В-клеток стимулированная 1Ь-4.

Изолирование человеческих В-клеток.

Изолирование человеческих РВМСк от Ьеикорае или от человеческой свежей крови. Изолирование человеческих В-клеток с помощью МШепу| протокола - изолирующего В-клетки комплекта II. Человеческие В-клетки были очищены с помощью колонок анЮМАСБ™ СоЬпппк.

Активация человеческих В-клеток.

Использование 96-луночного планшета с плоским дном, планшет из расчета 50000/лунка очищенных В-клеток в среде пролиферации В-клеток (ИМЕМ+5% ЕС8, 10 мМ Нерек, 50 мкмоль 2-меркаптоэтанола). Среду (150 мкл), содержащую 250 нг/мл СИ40Е-Ь2 рекомбинантного белка (Ашдеп) и 10 нг/мл 1Ь-4 (К.&И кук1еш # 204-1Ь-025), смешивали с 50 мкл В-клеточной среды, содержащей соединения, и инкубировали в течение 72 ч при 37°С инкубатора. Через 72 ч В-клетки были импульсно мечены 0,5-1 иСа/лунка ³Н-тимидином в течение ночи ~18 ч и собирали клетки с помощью ТОМ НагуеЧег.

Анализ индуцированной специфическим Т-антигеном (столбнячный токсин) пролиферации человеческих РВМС.

Человеческие РВМС приготовили из замороженных запасов или их выделили из свежей человеческой крови с помощью градиента Нео11. Используют 96-луночный планшет с круглым дном и высевают 2х10⁵ РВМС/лунка с культурной средой (КРМИ640+10% ЕС8, 50иМ 2-меркаптоэтанол, 10 мМ Нерек). Для определения 1С₅₀ ингибиторы Р13К тестировали в концентрации от 10 до 0,001 мкМ, с инкементом в половину логарифма и в тройной повторности. Столбнячный токсин, Т-клеточный специфичный антиген (Ишуегкйу о£ МаккасЬикейк ЬаЬ) добавляли в количестве 1 мкг/мл и инкубировали в течение 6 дней при 37°С инкубирования. Надосадочную жидкость собрали через 6 дней для проведения анализа 1Ь-2 ЕЫ8А, затем импульсно метили ³Н-тимидином в течение ~18 ч для определения пролиферации.

СЕР анализ для определения ингибирования класса 1а и класса III Р13К.

АКТ1 (РКВа) регулируется классом I;·! РИК, активированной митогенными факторами (ЮЕ-1, РИСЕ, инсулин, тромбин, ИСЕ и т.п.). В ответ на митогенный стимул АКТ1 перемещается из гиалоплазмы в клеточную мембрану.

Еогкйеай (ЕКНКЕ1) является субстратом для АКТ1. Он является цитоплазматическим при фосфорилировании АКТ (выживаемость/рост). Ингибирование АКТ (задержка роста/апоптоз)-транслокация Еогкйеай в ядро.

ЕУУЕ домены связываются с РО(3)Р. Большинство генерируется конститутивным действием РИК класса III.

Анализ активных перемещений АКТ в мембрану клетки (СНО-ГК.-АК’П-ЕСЕР клетки/СЕ НеаЙЬсаге).

Отмывали клетки буфером анализа. Обрабатывали соединениями в буфере анализа в течение 1 ч. Добавляли 10 нг/мл инсулина. Закрепляли через 10 мин при комнатной температуре и делали снимок.

Анализ транслокации Еогкйеай (МИА МВ468 Еогкйеай-И|уегкаСЕР се11к).

Клетки обрабатывали соединением в среде для выращивания в течение 1 ч. Фиксировали и делали снимок.

Анализ класса III И(3)Р (И2О8 ЕСЕР-2ХЕУУЕ се11к/СЕ НеаИйсаге).

Отмывали клетки буфером анализа. Обрабатывали соединениями в буфере анализа в течение 1 ч. Фиксировали и делали снимок.

Контролем для всех 3 анализов является 10 иМ ХУоПтаппш.

АКТ является цитоплазматическим; ЕогкЬеай является ядерным; РД3)Р не содержат эндосом Биомаркерный анализ.

Стимулирование экспрессии СИ69 или В7.2(СИ86) В-клеточных рецепторов.

Гепаринизированную человеческую цельную кровь стимулировали 10 мг/мл анти-ЦИ (8ои1йегп Вю1ес11. #9030-01). Затем 90 мкл стимулированной крови аликвотировали в каждую лунку 96луночного планшета и обрабатывали 10 мкл разных концентраций блокирующего соединения (от 10 до 0,0003 мкМ), разбавленных в ^ИМ+Ю'Й, ЕВ8 (СФсо). Образцы инкубировали вместе в течение от 4 ч (для СИ69 экспрессии) до 6 ч (для В7.2 экспрессии) при 37°С. Обработанную кровь (50 мкл) переносили на 96-луночный глубокий планшет (Иипс) для окрашивания антителами с помощью 10 мкл каждого из СИ45-РегСР (ВИ Вюкшепсек, #347464), СИ19-ЕГТС (ВИ Вюкаепсек, #340719) и СИ69-РЕ (ВИ Вюкшепсек, #341652). Следующие 50 мкл обработанной крови переносили на второй 96-луночный глубокий планшет для окрашивания антителами с помощью 10 мкл каждым из СИ19-ИТС (ВИ Вюкаепсек, #340719) и СИ86-РеСу5 (ВИ Вюкаепсек, #555666). Все окрашивание выполнялось в течение 15-30 мин в темноте при комнатной температуре. Кровь затем лизировали и закрепляли с помощью 450 мкл ЕАС8 лизирующего раствора (ВИ Вюкаепсек, #349202) в течение 15 мин при комнатной температуре. Образцы затем отмывали 2Х РВ8+2% ЕВ8 перед проведением ЕАСБ-анализа. Образцы гейтировали либо по СИ45/СИ19 двойным положительным клеткам для СИ69 окрашивания или СИ19 положительными клетками для СИ86 окрашивания.

- 12 017389

Гамма-радиометрия: стимулирование человеческих моноцитов для экспрессии фосфопротеинкиназы.

Человеческая клеточная линия моноцитов, ТНР-1, сохранялась в ΚΡΜΙ + 10% РВ8 (01Ьсо). За один день перед стимулированием клетки подсчитывали с помощью исключения трипанового синего на гемоцитометре и суспендировали при концентрации 1х10⁶ клеток на 1 мл среды. 100 мкл клеток плюс среда (1х10⁵ клеток) аликвотировали в каждую лунку 4-96-луночного глубокого планшета (Кипе) для тестирования восьми разных соединений. Клетки выдерживали в течение ночи перед обработкой разными концентрациями (от 10 до 0,0003 мкМ) блокирующего соединения. Соединение, разбавленное в среде (12 мкл), добавляли в клетки в течение 10 мин при 37°С. Человеческий МСР-1 (12 мкл, Β&Ό О1адпо8Йс8, #279-МС) разбавляли в среде и добавляли в каждую лунку при конечной концентрации 50 нг/мл. Стимулирование продолжали в течение 2 мин при комнатной температуре. Предварительно нагретый РЛС§ ΡΙιοδΠολν Ьуве/Нх буфер (1 мл при 37°С) (ВО Вю5с1спсс5. #558049) добавляли в каждую лунку. Планшеты затем инкубировали при 37°С дополнительно в течение 10-15 мин. Планшеты центрифугировали при 1500 об/мин в течение 10 мин, супернатант аспирировали и добавляли 1 мл ледяного 90% МеОН в каждую лунку при интенсивном встряхивании. Планшеты затем инкубировали в течение ночи при 70°С или на льду в течение 30 мин перед окрашиванием антителами. Планшеты центрифугировали и отмывали 2Х в РВ8+2% РВ8 (О1Ьсо). Раствор для промывания аспирировали и клетки суспендировали в оставшемся буфере. Кроличью рАКТ (50 мкл, Се11 81дпа11пд, #4058Ь) в соотношении 1:100 добавляли в каждый образец в течение 1 ч при комнатной температуре при встряхивании. Клетки отмывали и центрифугировали при 1500 об/мин в течение 10 мин. Супернатант аспирировали и клетки суспендировали в оставшемся буфере. Вторичное антитело, козий антикроличий А1еха 647 (50 мкл, Шуйгодеп, #А21245) в соотношении 1:500 добавляли в течение 30 мин при комнатной температуре при встряхивании. Клетки затем отмывали 1Х в буфере и суспендировали в 150 мкл буфера для проведения РАС8-анализа. Клетки следует тщательно диспергировать пипетированием перед проведением анализа на проточном цитометре. Клетки анализировали на Ь8В II (Вес1оп Оккшкоп) и гейтировали на рассеяние вперед и боковое рассеивание для определения уровней экспрессии рАКТ в популяции моноцитов.

Гамма-радиометрия: Стимулирование моноцитов для экспрессии фосфо-АКТ в костном мозге мыши.

Бедренные кости мышей препарировали у пяти женских особей мышей ВАЬВ/с (СЬат1е8 Ктует ЬаЬк.) и собрали в ΒΡΜΙ + 10% РВ8 среде (01Ьсо). Костный мозг мыши удаляли путем разрезания концов бедренной кости и промыванием 1 мл среды с помощью иглообразного датчика (25 даиде пееб1е). Костный мозг затем диспергировали в среде с помощью иглообразного датчика (21 даиде пееб1е). Объем среды увеличивали до 20 мл и клетки подсчитывали методом исключения трипанового синего на гемоцитометре. Концентрацию клеток в суспензии затем увеличивали до 7,5х10⁶ клеток на 1 мл среды и 100 мкл (7,5х10⁵ клеток) аликвотировали в каждую лунку 4-96-луночного глубокого планшета Щипс) для тестирования восьми разных соединений. Клетки выдерживали при 37°С в течение 2 ч перед обработкой разными концентрациями (от 10 до 0,0003 мкМ) блокирующего соединения. Соединение, разбавленное в среде (12 мкл), добавляли в клетки костного мозга в течение 10 мин при 37°С. Мышиный МСР-1 (12 мкл, Κ.&Ό О1адпо8Йс8, #479-1Е) разбавляли в среде и добавляли в каждую лунку при конечной концентрации 50 нг/мл. Стимулирование продолжали в течение 2 мин при комнатной температуре. 1 мл предварительно нагретого до 37°С РАС8 Р1ю5По\\' Ьуве/Их буфера (ВО Вюкаепсек, #558049) добавляли в каждую лунку. Планшеты затем инкубировали при 37 С в течение дополнительных 10-15 мин. Планшеты центрифугировали при 1500 об/мин в течение 10 мин.

Супернатант аспирировали и 1 мл ледяного 90% раствора МеОН добавляли в каждую лунку при интенсивном встряхивании. Планшеты инкубировали в течение ночи при -70°С или на льду в течение 30 мин перед окрашиванием антителами. Планшеты центрифугировали и отмывали 2Х в РВ8+2% РВ8 (01Ьсо). Промывающую жидкость аспирировали и клетки суспендировали в оставшемся буфере. Рс блокатор (2 мкл, ВО Ркагшшдеп, #553140) затем добавляли в каждую лунку в течение 10 мин при комнатной температуре. После блокировки 50 мкл исходных антител разбавляли в буфере; СО 11Ь-А1еха488 (ВО Вюкшепсек, #557672) в соотношении 1:50, СО64-РЕ (ВО Вюкшепсек, #558455) в соотношении 1:50 и кроличью рАКТ (Се11 81дпа1шд, #4058Ь) в соотношении 1:100 добавляли в каждый образец в течение 1 ч при комнатной температуре при встряхивании. Промывающий буфер добавили к клеткам и центрифугировали при 1500 об/мин в течение 10 мин. Супернатант аспирировали и клетки суспендировали в оставшемся буфере. Вторичное антитело; козий антикроличий А1еха 647 (50 мкл, 1пуйтодеп, #А21245) в соотношении 1:500 добавляли в течение 30 мин при комнатной температуре при встряхивании. Клетки затем отмывали 1Х в буфере и суспендировали в 100 мкл буфера для проведения РАС8-анализа. Клетки анализировали на Ь8В II (Вес1оп Оюкшкоп) и гейтировали по СО11Ь/СО64 двойным положительным клеткам для определения уровней экспрессии рАКТ в популяции моноцитов.

- 13 017389 рАКТ анализ ίη νίνο.

Носитель и соединения вводили р.о. (0,2 мл) иглой (Ога1 Сауаде №ей1ек Роррег & 8опк, №\ν Нуйе Рагк, ΝΥ) в мышь (Ттапкдешс Ьше 3751, женскую особь, 10-12 ν1<δ Атдеп 1пс, Тйоикапй Оакк, СА) за 15 мин до внутривенного введения (0,2 мл) анти-1дМ Р1ТС (50 ид/мышь) (1асккоп 1ттипо Кекеатсй, \Уек1 Сгоуе, РА). Через 45 мин мышь умерщвляли в камере с СО₂. Кровь забирали путем пункции сердца (0,3 мл) (1 сс 25 г 8утшдек, Зйепсоой. 8ΐ. Ьоик, МО) и переносили в 15 мл коническую пробирку (№-11де/М.1пс 1п1етпа1юпа1, Эептагк). Кровь немедленно фиксировали с помощью 6,0 мл ΒΌ Р1юкПо\у Ьуке/Р1х ВиГГег (ΒΌ В1о8с1епсе, 8ап .Токе, СА), инвертировали 3Х' и помещали в водяную ванну при температуре 37°С. Половину селезенки удаляли и переносили в трубку ЕррепйогГ, содержащую 0,5 мл РВ8 (1пуйтодеп Согр, Сгапй 1к1апй, ΝΥ). Селезенку разрушали с помощью гомогенизатора ткани (Ре11е1 РекЙе, К1тЫе/Коп1е8, Уше1апй, N1) и немедленно фиксировали с помощью 6,0 мл ΒΌ Р1юкПо\у Ьуке/Е1х буфера, инвертировали 3Х' и помещали в водяную ванну при температуре 37°С. Как только ткани были собраны, мышь декапитировали и тушку уничтожали. Через 15 мин 15 мл конические пробирки удаляли с водяной ванны с температурой 37°С и помещали на лед до тех пор, пока ткани продолжали разлагаться. Разрушенные селезенки фильтровали через 70 мкм клеточный фильтр (ΒΌ В1о8с1епсе, ВейГогй, МА) в другую 15 мл коническую пробирку и отмывали 9 мл РР8. Спленоциты и кровь центрифугировали при 2,000 об/мин в течение 10 мин (холод) и буфер аспирировали. Клетки ресуспендировали в 2,0 мл холодного (-20°С) 90% метилового спирта (МаШпскгой! Сйетюак, РЫШркЬитд, N1). Метанол медленно добавляли во время быстрого вращения конической пробирки. Ткани затем хранили при -20°С до тех пор, пока клетки не могли быть фильтрованы для проведения ЕАС8- анализа.

Иммунизация мультидозой тринитрофенола (Т№).

Кровь собирали путем ретроорбитальных глазных кровопусканий из мышей женских особей в возрасте 7-8 недель ΒΛΕΒ/с (Сйат1ек Ктует ЬаЬк.) в день 0 перед иммунизацией. Свертывание крови происходило в течение 30 мин и производили центрифугирование при 10,000 об/мин в пробирках МФЮатег™ для исследования сыворотки ЩесФп Оюкшкоп) в течение 10 мин. Сыворотку собирали, аликвотировали в пробирки Майтх (МаБтх Тес1 Согр.) и хранили при -70°С до проведения анализа ЕЫ8А. Мышам орально вводили соединение перед иммунизацией и через последовательные интервалы времени, основанные на времени жизни молекулы. Мышей затем иммунизировали либо 50 мкг Т№-ЬР8 (РОкЛенсе Тес1., #Т-5065), 50 мкг Т№-Е1со11 (Рюкаепсе Тес1., #Е-1300), либо 100 мкг Т№-КЕН (Рюкс1епсе Тес1., #Т-5060) плюс 1% раствор квасцов ^геп^ад, #3501) в РΒ8. Т№-КЕН плюс раствор квасцов готовили осторожным переворачиванием 3-5 раз смеси каждые 10 мин в течение 1 ч перед иммунизацией. На 5 день после обработки мышей умерщвляли СО2 и делали пункцию сердца. Кровь свертывалась в течение 30 мин и производили центрифугирование при 10,000 об/мин в пробирках Мю1о1ашег™ для исследования сыворотки в течение 10 мин. Сыворотку собирали, аликвотировали в пробирки МаБтх (Майтх Тес1 Согр.) и хранили при -70°С до проведения анализа ЕЬ18А. Т№-специфичные уровни иммуноглобулинов 1дС1, 1дС2а, 1дС3 и 1дМ в сыворотке затем измеряли методом твердофазного иммуноферментного анализа (ЕЫ8А). Т№Ш8А (РюкеагсН Тес1., #Т-5050) использовали для захвата Т№-специфичных антител. Т№Ш8А (10 мкг/мл) использовали для покрытия 384-ячеечных плат ЕЬ18А (Сотшпд Сок1аг) в течение ночи. Платы затем промывали и блокировали в течение 1 ч с помощью 10% Β8А ЕЬ18А блокирующего раствора (КРЬ). После блокирования платы ЕЫ8А отмывали и образцы сыворотки/стандарты серийно разбавляли и оставляли для связывания с платами на 1 ч. Планшеты отмывали и вторичные антитела, меченные 1д-НВР (козьи антимышиные 1дС1, 8ои111егп Рю1ес11 #1070-05, козьи антимышиные 1дС2а, 8ои111егп Рю1ес11 #1080-05, козьи антимышиные 1дМ, 8ои111егп Рю1ес11 #1020-05, козьи антимышиные 1дС3, 8ои111егп Рю1ес11 #1100-05) разбавляли в соотношении 1:5000 и инкубировали на платах в течение 1 ч. Раствор ТМВ пероксидазы (8игеР1ие Рекегуе™ ТМВ от КРЬ) использовали для обнаруживания антител. Планшеты отмывали и образцы оставляли в ТМВ растворе примерно на 5-20 мин в зависимости от анализируемого 1д. Реакцию останавливали с помощью 2 М раствора серной кислоты и на ридере считывали ΟΌ (оптическую плотность) при длине волны 450 нм.

Для лечения заболеваний опосредованных Р13К5, таких как ревматоидный артрит, болезнь Бехтерева, остеоартрит, псориатический артрит, псориаз, воспалительные заболевания и аутоиммунные заболевания, соединения настоящего изобретения могут вводиться орально, парентерально, ингаляционным распылением, ректально или местно в стандарных лекарственных формах, содержащих обычно используемые фармацевтически приемлемые носители, адъюванты или наполнители. Использующийся здесь термин парентеральный включает подкожные, внутривенные, внутримышечные, надчревные техники введения или интраперитонеально.

Лечение заболеваний и нарушений также предполагает включение профилактического введения соединений изобретения, их фармацевтических солей или их фармацевтических композиций пациенту (а именно животному, предпочтительно млекопитающему, более предпочтительно человеку), которому необходимо провести превентативное лечение, например, ревматоидного артрита, болезни Бехтерева, остеоартрита, псориатического артрита, псориаза, воспалительных заболеваний и аутоиммунных заболеваний и подобных.

- 14 017389

Режим дозирования для лечения опосредованных Р13К5 заболеваний рака и/или гипергликемии соединениями изобретения и/или композиции этого изобретения основан на множестве факторов, включающих тип заболевания, возраст, вес, пол, медицинские показания пациента, серьезность состояния, режим введения и в особенности использующееся соединение. Таким образом, режим дозирования может колебаться в широких пределах, но может быть определен обычным способом с помощью стандартных методов. Уровни доз примерно порядка от 0,01 до 30 мг на 1 кг веса тела в день, предпочтительно от 0,1 до 10 мг/кг, более предпочтительно от 0,25 до 1 мг/кг являются пригодными для всех раскрытых здесь способов применения.

Фармацевтически активные соединения настоящего изобретения могут подвергаться обработке в соответствии с традиционными фармацевтическими методами производства медицинских препаратов для введения пациентам, включая людей и других млекопитающих.

Для орального введения фармацевтическая композиция может быть в форме, например, капсулы, таблетки, суспензии или жидкости. Фармацевтическая композиция предпочтительно является изготовленной в форме стандартной лекарственной формы, содержащей заданное количество активного ингредиента. Например, такие формы могут содержать количество активного ингредиента примерно от 1 до 2000 мг, предпочтительно от 1 до 500 мг и более предпочтительно от 5 до 150 мг. Пригодная ежедневная доза для человека или другого млекопитающего может широко различаться в зависимости от состояния пациента и других факторов, но может быть определена с помощью обычных способов.

Активный компонент может быть также введен инъекцией в виде композиции с пригодными носителями, включающими раствор хлорида натрия, декстрозу или воду. Ежедневный парентеральный дозированный режим будет составлять примерно от 0,1 до 30 мг/кг общего веса тела, предпочтительно примерно от 0,1 до 10 мг/кг и более предпочтительно от 0,25 до 1 мг/кг.

Препараты для инъекций, такие как стерильные впрыскиваемые водные или масляные суспензии могут быть приготовлены в соответствии с известными использующимися пригодными диспергирующими или смачивающими агентами и суспендирующими агентами. Стерильные препараты для впрыскивания могут также быть стерильным раствором для инъекций или суспензией в нетоксичном, приемлемом для парентерального введения разбавителе или растворителе, например растворе 1,3-бутандиола. Приемлемые носители и растворители, которые могут использоваться, включают воду, раствор Рингера и изотонический раствор хлорида натрия. К тому же, определенные масла обычно применяются в виде растворителя или суспендирующей среды. Для этой цели может использоваться любое нелетучее масло, включая синтетические моно- или диглицериды. К тому же, жирные кислоты, такие как олеиновая кислота, находят применение в приготовлении препаратов для инъекций.

Суппозитории для ректального введения лекарства могут быть приготовлены путем смешивания лекарства с подходящим нераздражающим наполнителем, таким как масло какао или полиэтиленгликоли, которые являются твердыми при обычных температурах, но при ректальных температурах будут жидкими и, следовательно, будут растворяться в прямой кишке и высвобождать лекарство.

Пригодная местная доза активного компонента соединения изобретения составляет от 0,1 до 150 мг и вводится от одного до четырех, предпочтительно от одного до двух раз в день. Для местного введения активный компонент может включать от 0,001 до 10% отношения масс, например от 1 до 2 мас.% лекарственной формы, хотя оно может включать до 10% отношения масс, но предпочтительно не более 5% отношения масс и более предпочтительно от 0,1 до 1% лекарственной формы.

Лекарственный состав для местного введения включает жидкие или полужидкие препараты, пригодные для проникновения через кожу (например, линименты, лосьоны, мази, кремы или пасты) и пригодные для введения капли в глаза, уши или нос.

Для введения соединения настоящего изобретения обычно соединяют с одним или более адъювантом, пригодным для показанного курса введения. Соединения могут быть смешаны с лактозой, сахарозой, крахмальным порошком, эфирами целлюлозы алкановых кислот, стеариновой кислотой, тальком, стеаратом магния, оксидом магния, натриевыми и кальциевыми солями фосфорной и серной кислот, камедью, желатином, альгинатом натрия, поливинилпирролидином и/или поливиниловым спиртом и таблетированы или капсулированы для удобного введения. Или же соединения настоящего изобретения могут быть растворены в салине, воде, полиэтиленгликоле, пропиленгликоле, этаноле, кукурузном масле, арахисовом масле, кунжутном масле, смоле трагаканта и/или разных буферах. Другие адъюванты и способы введения хорошо известны в области фармацевтики. Носитель или наполнитель может включать замедляющий материал, такой как глицерил моностеарат или глицерил дистеарат по отдельности или с пластичным материалом, или другие материалы, хорошо известные в данной области.

Фармацевтические композиции могут быть изготовлены в твердой форме (включая гранулы, порошки или свечи) или в жидкой форме (например, растворы, суспензии или эмульсии). Фармацевтические композиции могут подвергаться обычным фармацевтическим операциям, таким как стерилизация, и/или могут содержать обычно используемые адъюванты, такие как консерванты, стабилизаторы, смачивающие агенты, эмульгаторы, буферы и т. д.

- 15 017389

Твердые стандартные лекарственные формы для орального введения могут включать капсулы, таблетки, пилюли, порошки и гранулы. В таких твердых лекарственных формах активное соединение может быть смешано по меньшей мере с одним инертным наполнителем, таким как сахароза, лактоза или крахмал. Такие лекарственные формы могут также включать, как в обычной практике, дополнительные субстанции, отличающиеся от инертных наполнителей, например лубриканты, такие как стеарат магния. В случае капсул, таблеток и пилюль лекарственная форма может также включать буферные вещества. Таблетки и пилюли могут быть дополнительно приготовлены с энтеросолюбильными покрытиями.

Жидкие лекарственные формы для орального введения могут включать фармацевтически приемлемые эмульсии, растворы, суспензии, сиропы и эликсиры, содержащие инертные наполнители, широко использующиеся в данной области техники, такие как вода. Такие композиции могут также включать адъюванты, такие как смачивающие, подслащивающие, вкусовые и ароматизирующие добавки.

Соединения настоящего изобретения могут обладать одним или более асимметричными атомами углерода и таким образом быть способными существовать в форме оптических изомеров, а также в форме их рацемических или нерацемических смесей. Оптические изомеры могут быть получены с помощью расщепления рацемических смесей в соответствии с обычными способами, например путем образования диастереоизомерических солей, путем обработки оптически активными кислотами или основаниями. Примерами соответствующих кислот являются винная кислота, диацетилвинная, дибензоилвинная, дитолуолвинная и камфорсульфокислота и затем разделение смеси диастереоизомеров путем кристаллизации с последующим освобождением оптически активных оснований из этих солей. Различные способы разделения оптических изомеров включают использование хиральной хроматографической колонки, оптимально выбранной для максимального увеличения разделения энантиомеров. Еще другой доступный способ включает синтез ковалентных диастереоизомерических молекул путем взаимодействия соединений изобретения с оптически чистой кислотой в активированной форме или оптически чистым изоцианатом. Синтезированные диастереоизомеры могут быть разделены обычными средствами, такими как хроматография, дистилляция, кристаллизация или сублимация, и затем гидролизированы для получения энантиметрически чистого соединения. Оптически активные соединения изобретения могут быть также получены путем использования активных исходных материалов. Эти изомеры могут быть в форме свободной кислоты, свободного основания, эфира или соли.

Также соединения этого изобретения могут существовать как изомеры, которые являются соединениями такой же молекулярной формулы, но в которой атомы относительно друг друга располагаются поразному. В частности, алкиленовые заместители соединений настоящего изобретения обычно и предпочтительно расположены и включены в молекулы, как указано в определениях для каждой из этих групп, читаемых слева направо. Однако в определенных случаях опытному специалисту в данной области следует учесть, что возможно приготовление соединений настоящего изобретения, в которых эти заместители являются обращенными по ориентации относительно к другим атомам в молекуле. То есть внедренный заместитель может быть таким же, как отмечено выше, за исключением того, что он внедрен в молекулу в обратной ориентации. Опытному специалисту в данной области следует учесть, что эти изомерические формы соединений настоящего изобретения должны истолковываться как включенные в рамки настоящего изобретения.

Соединения настоящего изобретения могут использоваться в форме солей, извлеченных из неорганических или органических кислот. Соли включают, но не ограничиваются этим, следующие: ацетат, адипинат, цитрат, аспартат, бензоат, бензолсульфонат, бисульфат, бутират, камфорат, камфорсульфонат, диглюконат, циклопентанпропионат, додецилсульфат, этансульфонат, глюкогептаноат, глицерофосфат, гемисульфат, гептаноат, гаксаноат, фумарат, гидрохлорид, гидробромид, гидроиодид, 2-гидроксиэтансульфонат, лактат, малеат, метансульфонат, никотинат, 2-нафталенсульфонат, оксалат, пальмоат, пектинат, персульфат, 2-фенилпропионат, пикрат, пивалат, пропионат, сакцинат, тартрат, тиоцианат, тосилат, месилат и андеканоат. Также основные азотосодержащие группы могут быть кватернизированными такими агентами, как низшие галоидные алкилы, такие как метил, этил, пропил и хлористый бутил, бромиды и йодиды; диалкилсульфаты, такие как диметил, диэтил, дибутил и диамилсульфаты, длинноцепные алкилгалогениды, такие как децил, лаурил, миристил и стеарилхлорид, бромиды и йодиды, аралкилгалогениды, такие как бензилбромиды и фенетилбромиды и др. Следовательно, могут быть получены растворимые или диспергируемые в воде или в масле продукты.

Примеры кислот, которые могут использоваться для образования фармацевтически приемлемых солей, включают такие неорганические кислоты, как соляная, серная и фосфорная кислоты, и такие органические кислоты, как оксалиновая, малеиновая, янтарная и лимонная кислоты. Другие примеры включают соли щелочных металлов или щелочно-земельных металлов, таких как натрий, калий, кальций или магний или органические основания.

Также рамками настоящего изобретения предусмотрены фармацевтически приемлемые эфиры карбоновой кислоты или содержащие гидроксил группы, включающие метаболически меченый эфир или пролекарственную форму соединения настоящего изобретения. Метаболически меченый эфир является таким, уровень которого в крови, например, увеличивается и пролонгирует эффективность соответствующей неэфирной формы соединения. Пролекарственная форма является формой, которая не является

- 16 017389 активной формой молекулы при введении, но которая становится терапевтически активной после некоторой ίη νίνο активности или биотрансформации, такой как метаболизм, например ферментативное или гидролитическое расщепление. Для общего обсуждения пролекарств, включающих эфиры, см. 8уеп55оп апб Типек Эгид Ме1аЬо1кт Ееу1е5 165 (1988) и Випбдаагб Эебдп о£ Ргобгидк, Е15е\аег (1985). Примеры замаскированного карбоксилатного аниона включают разные эфиры, такие как алкил (например, метил, этил), циклоалкил (например, циклогексил), аралкил (например, бензил, р-метоксибензил) и алкилкарбонилоксиалкил (например, пивалоилоксиметил). Амины были замаскированы как арилкарбонилоксиметил замещенные производные, которые расщепляются эстеразами ш νίνο, высвобождая свободное лекарство и формальдегид (Випдаагб ί. Меб. СНет. 2503 (1989)). Также лекарства, содержащие кислую ΝΉ группу, такие как имидазол, имид, индол и подобные, были замаскированы Ν-ацилоксиметильными группами (Випбдаагб Эебдп о£ Ргобгидк, Е15еу1ег (1985)). Гидроксильные группы были замаскированы как сложные эфиры и простые эфиры. ЕР 039051 (81оап апб ЬбЙе, 4/11/81) раскрывает пролекарства на основе гидроксамовой кислоты основания Манниха, их приготовление и использование. Сложные эфиры соединения настоящего изобретения могут включать, например, метил, этил, пропил и эфиры бутила, а также другие пригодные сложные эфиры, образованные между кислой группой и группой, содержащей гидроксил. Метаболически меченые сложные эфиры могут включать, например, метоксиметил, этоксиметил, изопропоксиметил, альфа-метоксиэтил, группы, такие как а-((С1-С₄)алкилокси)этил, например метоксиэтил, этоксиэтил, пропоксиэтил, изопропоксиэтил и т.п.; 2-оксо-1,3-диоксолен-4-илметильные группы, такие как 5-метил-2-оксо-1,3, диоксолен-4-илметил и т.п.; С1-Сз-алкилтиометильные группы, например метилтиометил, этилтиометил, изопропилтиометил и т.п.; ацилоксиметильные группы, например пивалоилоксиметил, альфа-ацетоксиметил и т.п.; этоксикарбонил-1-метил или альфа-ацилокси-альфа-замещенные метильные группы, например альфа-ацетоксиэтил.

Кроме того, соединения изобретения могут существовать в виде кристаллических твердых веществ, которые могут быть кристаллизованы из обычно применяемых растворителей, таких как этанол, Ν,Ν-диметилформамид, вода и подобных. Таким образом, кристаллические формы соединений изобретения могут существовать в виде полиморфов, сольватов и/или гидратов родительских соединений или их фармацевтически приемлемых солей. Все такие формы также рассматриваются как включенные в рамки изобретения.

Несмотря на то что соединения изобретения могут вводиться как единственный активный фармацевтический агент, они также могут использоваться в комбинации с одним или более соединений изобретения или другими агентами. При введении в виде комбинации терапевтические агенты могут быть приготовлены как отдельные композиции, которые вводятся одновременно или в разное время, или терапевтические агенты могут вводиться как одна композиция.

Перечисленное выше является иллюстрацией изобретения и не предполагает ограничивать изобретение раскрытыми соединениями. Вариации и изменения, которые являются очевидными опытным в данной области специалистам, находятся в рамках изобретения, которые определены в его формуле.

Claims (6)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Соединение, имеющее структуру или его фармацевтически приемлемая соль.
2. 2. Фармацевтическая композиция, содержащая соединение по п.1 и фармацевтически приемлемый разбавитель или носитель.
3. 3. Соединение, имеющее структуру или его фармацевтически приемлемая соль.
4. 4. Фармацевтическая композиция, содержащая соединение по п.3 и фармацевтически приемлемый разбавитель или носитель.
5. 5. Соединение, имеющее структуру

   - 17 017389
6. 6. Фармацевтическая композиция, содержащая соединение по п.5 и фармацевтически приемлемый разбавитель или носитель.

   Евразийская патентная организация, ЕАПВ

   Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2