EA011882B1 - Pyy-агонисты и их применение - Google Patents

Abstract

В данном изобретении предложены варианты PYYи их ПЭГилированные производные, а также композиции и способы, полезные в лечении состояний, модулируемых агонистом NPY Y2-рецептора.

Description

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к ΡΥΥ-агонистам, более конкретно к вариантам ΡΥΥ₃_₃₆ и к пэгилированным производным ΡΥΥ_3-36 и вариантов ΡΥΥ_3-36, к композициям, содержащим такие агонисты, выделенным нуклеиновым кислотам, кодирующим такие ΡΥΥ-агонисты, и к применению таких агонистов или композиций в лечении ожирения и сопутствующих заболеваний или для снижения аппетита, потребления пищи или потребления калорий у млекопитающего.

Предшествующий уровень техники

Ожирение вызывает большую озабоченность здравоохранения из-за его широкой распространенности и связанным с ним риском для здоровья. Более того, ожирение может влиять на качество жизни субъекта ввиду ограничения подвижности и снижения физической выносливости, а также в результате общественной, академической и связанной с работой дискриминации.

Как правило, ожирение и избыточный вес определяют по индексу массы тела (ΒΜΙ), который коррелирует с общей тучностью организма и служит в качестве меры риска возникновения некоторых заболеваний. ΒΜΙ рассчитывают как массу в килограммах, деленную на рост в метрах в квадрате (кг/м²). Избыточный вес обычно определяют, когда ΒΜΙ составляет 25-29,9 кг/м², а ожирение обычно определяют, когда ΒΜΙ составляет 30 кг/м² или выше. См., например, Νηΐίοηηΐ Неай, Ьиид, апй В1оой ΙηδΙίΙυΙο. Сйшса1 СшйеБиек ои 1Не Иеиййсайои, Еуа1иайои, апй ТгеаНпеШ о£ ОсепсеЦЫ апй ОЬекйу ίη Айи11к (Национальный институт сердца, легких и крови, Клиническое руководство по идентификации, оценке и лечению избыточного веса и ожирения у взрослых), Тйе Еу1йеисе Керой, ^акЫидои, ОС: и.8. ОераПтеЩ о£ Неа1111 аий Нитаи Бегуюек, ΝΙΗ риЬБсайои ио. 98-4083 (1998).

Недавними исследованиями обнаружено, что ожирение и связанный с ним риск для здоровья не ограничивается взрослыми, но также в пугающей степени оказывает воздействие на детей и подростков. Согласно данным Центра по контролю заболеваемости (США) (СеШег £ог Э^еаке Сои!го1) процент детей и подростков, которым поставлен диагноз избыточный вес, увеличился более чем в два раза с начала 1970-х гг. и приблизительно 15% детей и подростков в настоящее время имеют избыточный вес. Возрастает частота факторов риска для болезни сердца, таких как высокий уровень холестерина и высокое кровяное давление, у детей и подростков с избыточным весом по сравнению с субъектами подобного возраста, имеющими нормальный вес. Кроме того, у детей и подростков драматически возросло число случаев диабета 2 типа, ранее считавшегося болезнью взрослых. Состояния избыточного веса и ожирение тесно связаны с диабетом 2 типа. Недавно было установлено, что для подростков с избыточным весом шанс стать взрослыми людьми с избыточным весом или тучными людьми составляет 70%. Такая вероятность увеличивается приблизительно до 80%, если по меньшей мере один из родителей имеет избыточный вес или является тучным. Самым прямым последствием избыточного веса, которое ощущается самими детьми, является дискриминация в обществе.

Люди с избыточным весом или тучные люди имеют повышенный риск таких болезненных состояний, как гипертензия, дислипидемия, диабет 2 типа (инсулинонезависимый), резистентность к инсулину, нетолерантность к глюкозе, гиперинсулинемия, ишемическая болезнь сердца, стенокардия, застойная сердечная недостаточность, инсульт, желчные конкременты, холецистит, желчнокаменная болезнь, подагра, остеоартрит, обструктивные приступы апноэ во сне и проблемы с дыханием, заболевание желчного пузыря, некоторые формы рака (например рака эндометрия, молочной железы, предстательной железы и толстой кишки) и психологические расстройства (такие как депрессия, расстройства приема пищи, деформированное представление о фигуре и низкая самооценка). Негативные в отношении здоровья последствия ожирения делают его второй лидирующей причиной предотвратимой смерти в Соединенных Штатах и оказывают значительное экономическое и психосоциальное воздействие на общество. См. ΜсС^ии^8 Μ, Еоеде ^Н., Ас1иа1 Саикек о£ Эеа111 ш111е Иийей 8Ше8, ΙΑΜΑ, 270, 2207-12, 1993.

В настоящее время ожирение признано хроническим заболеванием, которое требует лечения с целью снижения связанного с ним риска для здоровья. Несмотря на то, что уменьшение массы представляет собой важный результат лечения, одна из главных задач лечения ожирения заключается в улучшении сердечно-сосудистых и метаболических показателей с целью снижения связанных с ожирением заболеваемости и смертности. Было показано, что уменьшение массы тела на 5-10% может значительно улучшить метаболические показатели, такие как содержание глюкозы в крови, кровяное давление и концентрация липидов. Поэтому считается, что уменьшение массы тела на 5-10% может понизить заболеваемость и смертность.

Доступные в настоящее время отпускаемые по рецепту лекарственные средства для лечения ожирения, как правило, снижают массу путем уменьшения всасывания пищевых жиров, как при применении орлистата, или путем создания дефицита энергии в результате уменьшения потребления пищи и/или в результате увеличения расхода энергии, что наблюдается в случае с сибутрамином. Поиск альтернатив доступным в настоящее время средствам против ожирения проведен несколькими путями, один из которых сфокусирован на некоторых пептидах кишечника, которые вовлечены в модулирование насыщения, как например пептид ΥΥ (ΡΥΥ).

ΡΥΥ является членом семейства панкреатических полипептидных (РР) гормонов (вместе с РР и нейропептидом Υ (ΝΡΥ)). Как и другие члены этого семейства, ΡΥΥ представляет собой амидированный

- 1 011882 по С-концу, состоящий из 36 аминокислот пептид. Он является эндокринным пептидом кишечника, первоначально выделенным из кишечника свиньи (Та!ето!о апб Мий, Ыа!ите 285: 417-418, 1980), и впоследствии было показано, что он уменьшает потребление пищи с повышенным содержанием жира после периферического введения у крыс (Окаба е! а1., Епбосгшо1оду 8ирр1етеп! 180, 1993) и вызывает уменьшение массы у мышей после периферического введения (Мог1еу апб Е1ооб, ЬИе 8с1епсе§ 41:2157-2165, 1987). Известно о существовании множественных депонированных и циркулирующих в крови молекулярных форм ΡΥΥ (Сйеп е! а1., Оа81тоеп!его1оду 87: 1332-1338, 1984; и Коббу, е! а1., Кеди1. Рер!. 18: 201212, 1987). Одна из таких форм, ΡΥΥ_3-36, была выделена из экстрактов слизистой оболочки ободочной кишки человека (ЕЬейеш е! а1., Рерйбек 10: 797-803, 1989), и было обнаружено, что она является преобладающей формой ΡΥΥ в плазме крови человека после приема пищи (Отапб! е! а1., Кеди1. Рер!. 51: 151159, 1994). Сообщалось, что ΡΥΥ_3-36 является высоко аффинным селективным агонистом Υ2-рецептора (Υ2Κ) ΝΡΥ (Кейе е! а1., Ат. 1. ЕйНоЕ Оактошкк!. Ыуег Ρ^^ώΕ 279: 0126-0131, 2000). Сообщалось, что периферическое введение ΡΥΥ_3-36 значительно уменьшало потребление пищи и прирост массы у крыс, снижало аппетит и потребление пищи у людей и уменьшало потребление пищи у мышей, но не у лишенных Υ2Κ мышей, что являлось подтверждением того, что для воздействия на потребление пищи требуется Υ2Κ. В исследованиях на людях обнаружено, что инфузия ΡΥΥ_3-36 значительно снижает аппетит и уменьшает потребление пищи на 33% в течение 24 ч. Иифузия ΡΥΥ_3-36 для достижения нормальных, возникающих после приема пищи, концентраций пептида в циркулирующей крови приводила к достижению максимальных уровней ΡΥΥ3-36 в сыворотке крови через 15 мин с последующим быстрым падением до базальных уровней в течение 30 мин. Сообщалось о существенном ингибировании потребления пищи в течение 12-часового периода после инфузии ΡΥΥ3-36, но не было по существу никакого влияния на потребление пищи в течение периода времени от 12 до 24 ч. В исследовании на крысах повторное внутрибрюшинное (ΙΡ) введение ΡΥΥ_3-36 (инъекции дважды в сутки в течение 7 суток) уменьшало кумулятивное потребление пищи (Вайетйат, е! а1., №!ите 418: 650-654, 2002).

Лекарственные средства на основе полипептидов зачастую ковалентно присоединяют к таким полимерам, как полиэтиленгликоли (ПЭГ), для пролонгирования периода их полувыведения ίη у1уо. Однако это зачастую приводит к значительной потере биологической или фармакологической активности (8йесй!ет е! а1., ЕЕВ8 Ьейетк 579: 2439-2444, 2005; Еиейедек апб АЬисйотек1, 1. Сопйо1 Ке1еа§е 11: 139148, 1990; Кайе, Абу. Эгид Эе1 8у§. 10: 91-114, 1993; Вайоп апб Вег11ю1б. Ρΐιηηη. 8с1. Тес1то1. Тобау 1: 352-356, 1996; Шса е! а1., Абу. Эгид ИеНуету Кеу. 6, 1991; Ие1дабо е! а1., Спйса1 Кеу. Тйет. Эгид Сатег 8у§!. 9: 249-304, 1992; Еипд е! а1., Ρо1ут. Егориий 38: 565-566, 1997; Кеббу, Апп. Ρйа^тасоίйе^. 34: 915923, 2000; Уегопеке, ВютаЕепай 22: 405-417, 2001). Например, 8йесй!ег и др., выше, сообщали, что присоединение полиэтиленгликоля 40 кДа к ΡΥΥ_3-36 методами обычной химии через образование стабильной связи (40 кДа ПЭГ-ΡΥΥ_3-36) приводило к его полной инактивации в исследованиях по потреблению пищи на мышах (подкожная (8С) инъекция). Тем не менее, они также сообщали, что обратимое присоединение полиэтиленгликоля к ΡΥΥ_3-36 (40 кДа ПЭГ-ΕМ8-ΡΥΥ_3-36) приводило к восьмикратному увеличению в значении функционального периода полувыведения (24 ч против 3 ч). См. также заявки на патент РСТ №№ АО 2004/089279 и АО 03/026591.

Краткое изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение относится к ΡΥΥ-агонистам, представляющим собой варианты ΡΥΥ_3-36.

В одном аспекте настоящего изобретения ΡΥΥ-агонист представляет собой вариант ΡΥΥ_3-36 млекопитающих, в котором остаток 10 (глутаминовая кислота) или остаток 11 (аспарагиновая кислота) заменен аминокислотой «X», выбранной из группы, состоящей из цистеина, лизина, серина, треонина, тирозина и неприродных аминокислот, имеющих функциональную группу, способную к образованию конъюгатов с гидрофильным полимером, таким как полиэтиленгликоль (ПЭГ), например функциональную группу кето, тиол, гидроксил, карбоксил или свободную аминогруппу, при этом такой вариант обозначают как (Ε10Χ)ΡΥΥ_3-36 или (Ό11Χ)ΡΥΥ_3-36, соответственно.

Остатком «X» предпочтительно является цистеин, а соответствующими вариантами, следовательно, (Ε10Ο)ΡΥΥ_3-36 и (Ι)11ΟΡΥΥ_;;...

В предпочтительном воплощении настоящего изобретения ΡΥΥ-агонист представляет собой вариант ΡΥΥ_3-36 человека (ΕΡΥΥ_3-36), ΡΥΥ_3-36 собаки, ΡΥΥ_3-36 кошки или ΡΥΥ_3-36 лошади, более предпочтительно 1ιΡΥΥ_3-36.

В предпочтительном воплощении изобретения ΡΥΥ-агонист представляет собой полипептид (Ε10Ο)1ιΡΥΥ.ι_-.ι₆· имеющий аминокислотную последовательность

ΙΚΡΕΑΡΟΟΟΑ8ΡΕΕΕΝΚΥΥΑ8ΕΚΗΥΕΝΕνΤΚΟΚΥ-ΝΗ₂ [8ЕО ГО N0:3], или его фармацевтически приемлемую соль.

В следующем предпочтительном воплощении ΡΥΥ-агонист представляет собой полипептид (Ό11Ο)1ιΡΥΥ.ι_-.ι₆· который имеет аминокислотную последовательность

ΙΚΡΕΑΡΟΕΟΑδΡΕΕΕΝΚΥΥΑδΕΚΗΥΕΝΕνΤΚςΚΥ-ΝΗζ [8Е<2 ГО N0:4], или его фармацевтически приемлемую соль.

Наиболее предпочтительно, когда агонист представляет собой (Ε10Ο)1ιΡΥΥ.ι_-.ι₆. ΡΥΥ-агонисты по

- 2 011882 изобретению предпочтительно конъюгируют с гидрофильным полимером, предпочтительно ПЭГ. Агонист предпочтительно является монопэгилированным, то есть, отношение агониста к ПЭГ составляет приблизительно 1:1, и он присоединен по способной к образованию конъюгатов функциональной группе, такой как функциональная группа кето, тиол, гидроксил, карбоксил или свободная аминогруппа, в остатке «X» в (Ε10Χ)ΡΥΥ_3-3₆ и (Ό11Χ)ΡΥΥ_3-36 ПЭГ может быть линейным, разветвленным или имеющим боковые цепи; более предпочтительно, линейным или разветвленным; наиболее предпочтительно, линей ным.

В линейных ПЭГ один конец ПЭГ блокирован группой, являющейся инертной в условиях сочетания ПЭГ с агонистом, например, группой простого эфира, предпочтительно группой метокси. ПЭГ, терминированные таким образом (с использованием группы метокси), обычно обозначают как мПЭГ. Другой конец активирован для сочетания с ΡΥΥ-агонистом. Аналогично, в случае с разветвленными ПЭГ, полезными в настоящем изобретении, все концы, кроме одного, блокированы группой простого эфира, а конец, не блокированный группой простого эфира, активируют для сочетания. В одном воплощении не блокированный группой простого эфира конец ПЭГ блокирован линкерной группировкой («Ь»), связывающей ПЭГ с функциональной группой, которая является реакционноспособной в отношении способной к образованию конъюгатов функциональной группы аминокислоты X в (Ε10Χ)ΡΥΥ_3-36 или (Ό11Χ)ΡΥΥ_3-36, с получением конъюгата, представляющего собой ПЭГ, ковалентно присоединенный к способной к образованию конъюгатов функциональной группе в X. В дополнительном воплощении ПЭГ присоединен непосредственно к реакционноспособной группе без включения линкерной группировки. Такие ПЭГ часто называют «безлинкерными» ПЭГ.

Для полипептидов (Ε10ϋ)ΡΥΥ_3-36 и (Ό11Ο)ΡΥΥ_3-36, не блокированный группой простого эфира конец ПЭГ предпочтительно присоединен к линкеру, связывающему ПЭГ с малеимидом или другой группой, которая будет взаимодействовать с тиолом остатка цистеина с получением конъюгата, представляющего собой ПЭГ, ковалентно присоединенный к тиоловой группе цистеина.

Подходящие реакционноспособные ПЭГ для использования с (Ε10Ο)ΗΡΥΥ_3-36 или (Ό11Ο)ΡΥΥ_3-36 включают ПЭГ формул

Предпочтительно, чтобы ПЭГ представлял собой мПЭГ-малеимид, изображенный выше, включающий линкерную группировку -Ь-. Безлинкерные ПЭГ-малеимиды также подходят для применения в настоящем изобретении, в особенности с (Ε10Γ)ΗΡΥΥ_3-36 или (Ό11Ο)ΡΥΥ_3-36 Такие безлинкерные ПЭГмалеимиды можно получить, как описано в Соойхоп апй Ка1ге, Вю/Тсе11по1сщу 8: 343-346, 1990.

Конъюгаты, полученные в результате сочетания полипептидов (Ε10Γ)ΗΡΥΥ_3-36 или (Ό11Ο)ΡΥΥ_3-36 с мПЭГ, показанными выше, изображены на следующих далее формулах, где -8К. представляет собой полипептид (Ε10Γ’)1ιΡΥΥ_3-36 или (Ό11Ο)ΡΥΥ_3-36, в котором 8 представляет собой атом серы тиоловой группы цистеина:

мПЭГ---5О,СН₂СН₂8Я мПЭГ— ΗΝ— СОСН₂5К и _мПЭГ—5~—5К

Линкер -Ь- служит просто для связывания ПЭГ с реакционноспособной функциональной группой и поэтому не ограничен конкретной группировкой, а предпочтительно включает алкиленовую группу, содержащую сложноэфирую связь, уретановую связь, амидную связь, простую эфирную связь, карбонатную связь или группу вторичного амина.

В предпочтительном воплощении, в частности для линейных ПЭГ, линкер представляет собой группу формулы

- 3 011882

-О(СН₂)_РМНС(О)(СН₂)_Г-, где р равен целому числу от 1 до 6, предпочтительно от 1 до 3, более предпочтительно 2 или 3, наиболее предпочтительно 3, и г равен целому числу от 1 до 6, предпочтительно от 1 до 3, более предпочтительно 2 или 3, наиболее предпочтительно 2. Предпочтительный линкер представляет собой группу

СН₂СН₂СН^НСОСН₂СН₂-.

В другом предпочтительном воплощении, в частности для разветвленных ПЭГ, линкер представляет собой группу формулы

-ШС(О)(СН₂)₅-, где 8 равен целому числу от 1 до 6, предпочтительно от 1 до 3, более предпочтительно 2 или 3, наиболее предпочтительно 2. Предпочтительный линкер представляет собой группу -ЛНС(О)СН₂СН₂-.

ПЭГ может быть линейным или нелинейным, например, разветвленным или имеющим боковые цепи. Предпочтительно, чтобы ПЭГ являлся линейным или разветвленным, предпочтительно, линейным или разветвленным мПЭГ-малеимидом. Глицерин-разветвленный мПЭГ-малеимид является предпочтительным разветвленным ПЭГ. Предпочтительно, чтобы ПЭГ являлся линейным мПЭГ-малеимидом. Средняя молекулярная масса ПЭГ должна находиться в диапазоне от приблизительно 1 кДа до приблизительно 50 кДа. Предпочтительно, чтобы средняя молекулярная масса находилась в диапазоне от приблизительно 5 кДа до приблизительно 45 кДа; более предпочтительно, от приблизительно 10-12 кДа до приблизительно 40-45 кДа или от приблизительно 20 кДа до приблизительно 40-45 кДа. Особый интерес представляет линейный мПЭГ, такой как показано в формуле 1, со средней молекулярной массой, равной приблизительно 20 или приблизительно 30 кДа. Также представляет интерес глицерин-разветвленный мПЭГ формулы 2, предпочтительно со средней молекулярной массой, равной приблизительно 20 кДа или приблизительно 43 кДа.

Предпочтительные ПЭГ, соответственно активированные для конъюгирования с тиоловой группой цистеина в (Ε10ί.’)1ιΡΥΥ_3-36 или (О11С)РУУ_3-36. представляют собой соединения формул 1 и 2. В линейном мПЭГ формулы 1 η равен целому числу в диапазоне приблизительно 175-800; предпочтительно, приблизительно 375-525 или приблизительно 600-750, или приблизительно 425-475 или приблизительно 650-700, или приблизительно 437-463 или 675-700. В глицерин-разветвленных мПЭГ формулы 2 каждый т является предпочтительно одинаковым и равен целому числу в диапазоне приблизительно 150-500; предпочтительно, приблизительно 160-285 или приблизительно 400-525, или приблизительно 200-250 или 450-500.

Разнообразные ПЭГ, соответственно активированью для конъюгирования с целевыми функциональными группами в боковой цепи аминокислот пептидов, например, группами кето, тиол, гидроксил, карбоксил или свободными аминогруппами, могут быть приобретены у ряда поставщиков, например у ΝΟΡ Согрогайоп (Токуо, 1арап) или №к!аг Тйегареи11С8 Согрогайоп (Нип18уШе, ЛЬ).

Другой аспект настоящего изобретения относится к конъюгатам представленных вариантов ΡΥΥ_3-36 и полиэтиленгликоля.

В одном воплощении конъюгат представляет собой соединение формулы 3

- 4 011882

где группировка мПЭГ является линейной или разветвленной и имеет среднюю молекулярную массу в диапазоне от приблизительно 1 до 50 кДа, предпочтительно от 5 до приблизительно 45 кДа, более предпочтительно от приблизительно 10 или 12 кДа до приблизительно 40 или 45 кДа, или от приблизительно 20 кДа до приблизительно 40 кДа или 45 кДа,

Ь представляет собой группу формулы

-О(СН₂)_РМНС(О)(СН₂)_Г-, в которой р равен целому числу от 1 до 6; предпочтительно от 1 до 3; более предпочтительно 2 или 3; наиболее предпочтительно 3; (как представлено ниже в формуле 4); и г равен целому числу от 1 до 6; предпочтительно от 1 до 3; более предпочтительно 2 или 3, наиболее предпочтительно 2;

или Ь представляет собой группу формулы

-?ШС(О)(СН₂)₅-, в которой 8 равен целому числу от 1 до 6; предпочтительно от 1 до 3; более предпочтительно 2 или 3; наиболее предпочтительно 2; и

-8К представляет собой полипептид (Е10С)НР¥¥з_-36 или (Ό11Ο)ΗΡΥΥ_3-36, в котором 8 представляет собой атом серы тиоловой группы цистеина.

Предпочтительным воплощением по изобретению является конъюгат линейного мПЭГ и варианта ΡΥΥ_3-36 формулы 4

где η равен целому числу в диапазоне приблизительно 175-800; предпочтительно приблизительно 375-525 или приблизительно 600-750, или приблизительно 437-463 или приблизительно 675-700; и -8К. представляет собой полипептид (Ε10ί.’)1ιΡΥΥ_3-36 или (Ό11Ο)ΕΡΥΥ_3-36, в котором 8 представляет собой атом серы тиоловой группы цистеина; или его фармацевтически приемлемая соль. Предпочтительно, чтобы средняя молекулярная масса группировки (СН₂СН₂О)_П составляла приблизительно 20 кДа или 30 кДа. Особенный интерес представляет конъюгат, в котором -8К. представляет собой полипептид (Ε10ΟΗΡΥΥ3-36.

Дополнительный аспект изобретения относится к конъюгатам, в которых группировка ПЭГ является разветвленной. Предпочтительные конъюгаты этой категории содержат глицерин-разветвленную группировку ПЭГ. Особый интерес представляет конъюгат формулы 5

где каждый т приблизительно одинаковый и равен целому числу в диапазоне приблизительно 150550; предпочтительно приблизительно 160-285 или приблизительно 400-525, или приблизительно 200250 или приблизительно 450-500, и -8К представляет собой полипептид (Е10С)НРУУ_3-36 или (□11С)11РУУ_3-36· в котором 8 представляет собой атом серы тиоловой группы цистеина; или его фармацевтически приемлемая соль. Предпочтительно, чтобы каждая группировка (СН2СН2О)т, имела среднюю

- 5 011882 молекулярную массу в диапазоне приблизительно 9-11 кДа или приблизительно 20-22 кДа. Предпочтительно, чтобы объединенная средняя молекулярная масса группировок (СН₂СН₂О)_т составляла приблизительно 20 кДа или приблизительно 43 кДа. Конъюгат, в котором -§К является полипептидом (Е10С)11РУУ_3-36. представляет особенный интерес.

В настоящем изобретении также предложено моноклональное антитело. специфически связывающееся с полипептидом. имеющим аминокислотную последовательность. которая показана в ЗЕО ΙΌ N0:3 или 8Е0 ΙΌ N0:4. В одном воплощении этого аспекта изобретения полипептид пэгилирован по остатку цистеина.

В дополнение. в настоящем изобретении предложены полинуклеотидные последовательности. кодирующие полипептидные последовательности по изобретению. предпочтительно они кодируют 8Е0 ΙΌ N0:3 и 8ЕО ΙΌ N0:4.

В другом воплощении изобретения предложена фармацевтическая композиция. содержащая ΡΥΥагонист по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. В дополнительном воплощении композиция также содержит по меньшей мере один дополнительный фармацевтический агент. который может представлять собой агент. полезный в лечении основного для этой композиции показания или заболеваний. сопутствующих основному показанию. Дополнительный фармацевтический агент предпочтительно является средством против ожирения. Композиция предпочтительно содержит терапевтически эффективное количество ΡΥΥ-агониста по изобретению или терапевтически эффективное количество комбинации ΡΥΥ-агониста по изобретению и дополнительного фармацевтического агента.

Кроме того. предложен способ лечения заболевания. состояния или расстройства. модулируемого У2В-агонистом у млекопитающих. включающий периферическое введение млекопитающему. нуждающемуся в таком лечении. терапевтически эффективного количества ΡΥΥ-агониста по изобретению. ΡΥΥагонист по изобретению может быть использован сам по себе или в комбинации по меньшей мере с одним дополнительным фармацевтическим агентом. полезным в лечении заболевания. состояния или расстройства либо заболеваний. сопутствующих этому заболеванию. состоянию или расстройству. Заболевания. состояния или расстройства. модулируемые Υ2Β-агонистом у млекопитающих. включают ожирение и избыточный вес. Лечение таких заболеваний. состояний или расстройств вероятно будет приводить к улучшению заболеваний. сопутствующих таким заболеваниям. состояниям или расстройствам. Дополнительно предложен способ лечения ожирения у млекопитающего. нуждающегося в таком лечении. включающий периферическое введение млекопитающему терапевтически эффективного количества ΡΥΥ-агониста по настоящему изобретению.

Кроме того. предложен способ снижения массы или стимулирования уменьшения массы (включая предупреждение или замедление прироста массы) у млекопитающего. включающий периферическое введение млекопитающему регулирующего массу или уменьшающего массу количества ΡΥΥ-агониста по настоящему изобретению.

Кроме того. предложен способ уменьшения потребления пищи у млекопитающего. включающий периферическое введение млекопитающему уменьшающего потребление пищи количества ΡΥΥагониста по настоящему изобретению.

Кроме того. предложен способ стимулирования насыщения у млекопитающего. включающий периферическое введение млекопитающему стимулирующего насыщение количества ΡΥΥ-агониста по изобретению.

Кроме того. предложен способ уменьшения потребления калорий у млекопитающего. включающий периферическое введение млекопитающему уменьшающего потребление калорий количества ΡΥΥагониста по изобретению. ΡΥΥ-агонист может быть введен сам по себе или в комбинации по меньшей мере с одним дополнительным фармацевтическим агентом. предпочтительно средством против ожирения.

В каждом из способов. изложенных в данном описании и в прилагаемой формуле изобретения. ΡУУ-агонист может быть введен сам по себе или в комбинации по меньшей мере с одним дополнительным фармацевтическим агентом. предпочтительно средством против ожирения.

Представленные ΡΥΥ-агонисты и композиции. содержащие их. также полезны в изготовлении лекарственного средства для терапевтических применений. упомянутых в данном описании.

Определения и сокращения

Фраза «фармацевтически приемлемый» означает. что данные вещество или композиция должны быть совместимы с точки зрения химии и/или токсикологии с другими ингредиентами. входящими в состав препарата. и/или млекопитающим. которого лечат им.

Термин «ΡΥΥ-агонист» означает любое соединение. вызывающее один или более эффектов. вызываемых действием ΡΥΥ. предпочтительно ΡΥΥ_3-36. ίη νίνο или ίη νίίτο.

Фраза «терапевтически эффективное количество» означает количество ΡУУ-агониста по настоящему изобретению. которое уменьшает потребление калорий. уменьшает массу тела и/или уменьшает тучность организма по сравнению с соответствующими контрольными величинами. определяемыми до лечения или в обработанной растворителем группе.

Термин «млекопитающее» означает людей. а также всех других теплокровных членов царства жи

- 6 011882 вотных, обладающих механизмом гомеостаза в классе «Млекопитающие», например, домашних млекопитающих, млекопитающих зоопарков и млекопитающих-источников пищи. Некоторыми из примеров домашних млекопитающих являются представители семейств псовых (например, собаки), кошачих (например, кошки) и лошадей; некоторыми из примеров млекопитающих-источников пищи являются свиньи, крупный рогатый скот, овцы и тому подобное. Предпочтительным млекопитающим является человек или домашнее млекопитающее. Наиболее предпочтительным млекопитающим является человек мужского или женского пола.

Термины «лечащий», «лечить» или «лечение» включают как превентивное, то есть профилактическое, так и паллиативное лечение.

Термин «периферическое введение» означает введение за пределами центральной нервной системы. Периферическое введение не включает непосредственного введения в головной мозг. Периферическое введение включает внутрисосудистое, внутримышечное, подкожное, ингаляционное, пероральное, сублингвальное, энтеральное, ректальное, трансдермальное или интраназальное введение, но этим не ограничивается.

Неприродной аминокислотой, подходящей для использования в настоящем изобретении, обычно является любая аминокислота приведенной ниже формулы, отличающаяся от 20 природных аминокислот (СаиФг аиб 8Ытте1, ВюрйуДса1 Сйет181гу, Рай 1, \УН Ргеетаи & 8ои§, 8аи ЕгаиДксо, 42-43, 1980), где В¹ представляет собой любой заместитель, включающий функциональную группу кето, тиол, карбоксил, гидроксил или свободную аминогруппу, как например описанные в публикации заявки на патент США № 2005/0208536, включенной в данное описание во всей своей полноте посредством ссылки.

К¹

Такие неприродные аминокислоты, например, включают тиотирозин, орнитин, 3меркаптофенилаланин, 3- или 4-аминофенилаланин, 3- или 4-ацетилфенилаланин, 2-или 3гидроксифенилаланин (орто- или метатирозин), гидроксиметилглицин, аминоэтилглицин, 1-метил-1меркаптоэтилглицин, аминоэтилтиоэтилглицин и меркаптоэтилглицин. Большинство неприродных аминокислот, полезных в настоящем изобретении, имеется в продаже. Другие могут быть получены способами, известными в данной области техники. Например, тиотирозин можно получить способом, описанным в работе Ьи е! а1., 1. Ат. Сйет. 8ос. 119: 7173-7180, 1997, включенной в данное описание посредством ссылки.

Термин «ΡΥΥ человека» или «11РУУ» означает амидированный по С-концу, состоящий из 36 аминокислот полипептид, имеющий следующую аминокислотную последовательность:

ΥΡΙΚΡΕΑΡΟΕΟΑ8ΡΕΕΕΝΚΎΥΑ8ΕΙ<ΙΙΥΕΝΕνΤΚ.ζ)ΚΥ-ΝΗ₂ [8Ε(3 ГО N0:1].

Термин «йРУУ_3-з₆» означает С-концевой 34-мерный йРУУ, имеющий следующую аминокислотную последовательность:

ΙΚΡΕΑΡΟΕϋΑ8ΡΕΕΕΝΚΥΥΑ8ΕΚΗΥΕΝΕνΤΚςΚΥ-ΝΗ₂ [8Е9 Ю N0:2].

Термин «(Е10С)йРУУ_3-36» означает С-концевой 34-мерный йРУУ, в котором остаток глутаминовой кислоты 10 в 1РУУ заменен на остаток цистеина и который имеет следующую аминокислотную последовательность:

ΙΚΡΕΑΡΟ€ΟΑ8ΡΕΕΕΝΚΥΥΑ8ΕΒΗΥΕΝΕνΤΚ9ΒΥ-ΝΗ2 [8Е<2 ГО N0:3].

Термин «(О11С)йРУУ_3-36» означает С-концевой 34-мерный йРУУ, в котором остаток аспарагиновой кислоты 11 в 1РУУ заменен на остаток цистеина и который имеет следующую аминокислотную последовательность:

ΙΚΡΕΑΡΟΕΟΑ8ΡΕΕΕΝΚΥΥΑ8ΕΚΗΥΕΝΕνΤΚ9ΚΥ-ΝΗ₂ [8ЕС2 ГО N0:4].

Краткое описание графических материалов

Фиг. 1 представляет собой запись обращенно-фазовой ВЭЖХ очищенного пептида (Е10С)11РУУ_3-36 на колонке 2огЬах Есйрке ХЭВ-С8.

Фиг. 2 представляет собой запись эксклюзионной ВЭЖХ (8ЕС-ВЭЖХ) реакционной смеси линейного 30К мПЭГ-малеимида плюс (Е10С)йРУУ_3-36 на 8ЕС-колонке 81юбех 804.

Фиг. 3 представляет собой фотографию 8Ό8 РАСЕ (электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия) фракций, полученных после очистки на 8Р Нйгар конъюгата линейный 30К мПЭГ-малеимид-(Е10С)1РУУ_3-36. Μν представляет собой стандарты молекулярной массы; Б представляет собой наносимую в колонку пробу; ЕТ представляет собой проходящий поток; 4-23 представляют собой элюированные фракции.

Фиг. 4 представляет собой запись обращенно-фазовой ВЭЖХ очищенного пептида (О11С)11РУУ_3-36 на колонке 2огЬах Есйрке ХЭВ-С8.

Фиг. 5 представляет собой запись эксклюзионной ВЭЖХ реакционной смеси линейного 30К мПЭГмалеимида плюс (Э11С)НРУУ_3-36 на 8ЕС-колонке 81юбех 804.

Фиг. 6 представляет собой запись эксклюзионной ВЭЖХ, показывающую профиль элюции очи

- 7 011882 щенного продукта конъюгата линейный 30К мПЭГ-малеимид-(Е10С)ЬР¥Уз.з₆ на §ЕС-колонке 8йобех 804.

Фиг. 7 представляет собой запись эксклюзионной ВЭЖХ, показывающую профиль элюции очищенного продукта конъюгата линейный 30К мПЭГ-малеимид-(П11С)ЬР¥У_3-36, на 8ЕС-колонке 81ю0ех 804.

Фиг. 8 представляет собой запись эксклюзионной ВЭЖХ реакционной смеси глицеринразветвленного 43К мПЭГ-малеимида плюс (Е10С)НРУУ_3-36 на 8ЕС-колонке 8НоОех 804.

Фиг. 9 представляет собой запись эксклюзионной ВЭЖХ, показывающую профиль элюции очищенного продукта конъюгата глицерин-разветвленный 43К мПЭГ-малеимид-(Е10С)1РУУ_3-36 на 8ЕСколонке 8йобех 804.

Фиг. 10 представляет собой график ингибирования кумулятивного потребления пищи после периода голодания у мышей после внутрибрюшинной (1Р) инъекции. На фиг. 10 А показана кривая доза-эффект для нативного РУУ_3-36 по сравнению с группой, получавшей растворитель. На фиг. 10В показана кривая доза-эффект для конъюгата линейный 30К мПЭГ-малеимид-(Е10С)ЬРУУ_3-36.

На фиг. 11 показано влияние на потребление пищи после периода голодания 1Р инъекции мышам конъюгата глицерин-разветвленный 43К мПЭГ-малеимид-(Е10С)РУУ_3-36 по сравнению с растворителем и конъюгатом линейный 30К мПЭГ-малеимид-(Е10С)РУУ_3-36. Фиг. 11А является графическим представлением, показывающим ответ в течение 6 ч после инъекции. Фиг. 11В представляет собой диаграмму сравнения эффектов в течение 24 ч после инъекции.

На фиг. 12 показано влияние 1Р инъекций растворителя, РУУ_3-36 и конъюгата линейный 30К мПЭГмалеимид-(Е10С)РУУ_3-36 на спонтанно кормящихся мышей. На фиг. 12А показано влияние на потребление пищи, а на фиг. 12В показано влияние на массу тела.

На фиг. 13 показано влияние подкожной (8С) инъекции растворителя, РУУ_3-36 и конъюгата линейный 30К мПЭГ-малеимид-(Е10С)ЬРУУ_3-36 на спонтанно кормящихся мышей. На фиг. 13А показано влияние на потребление пищи, а на фиг. 13В показано влияние на массу тела.

На фиг. 14 показана экспозиция РУУ в плазме у мышей после 1Р инъекции в дозе 0,1 мг/кг. На фиг. 14А продемонстрированы уровни РУУ в плазме после инъекции 11РУУ_3-36. а на фиг. 14В продемонстрированы уровни РУУ в плазме после инъекции конъюгата линейный 30К мПЭГ -малеимид-(Е10С)НРУУ_3-36.

Фиг. 15 представляет собой график кривых «концентрация-ответ» для РУУ_3-36 или конъюгата линейный 30К мПЭГ-малеимид-(Е10С)РУ¥_3-36, полученных с использованием анализа с использованием аналит-связывающих сцинтилляционных гранул (ксшйПайои ргох1шйу аккау; 8РА), в котором лиганды конкурируют с ¹²⁵1-РУ¥1_-36 за связывание с У2К. экспрессируемым ΚΑΝ-Τδ-клетками.

Фиг. 16 представляет собой график кривых «концентрация-ответ» для РУУ_3-36 или конъюгата линейный 30К мПЭГ-малеимид-(Е10С)РУ¥_3-36, полученных с использованием анализа по связыванию ГТФ(гуанозинтрифосфат)гамма[³⁵8] с Υ2Κ, экспрессируемым на мембранах ΚΑΝ-Τδ-клеток.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к РΥΥ-агонистам, представляющим собой варианты РΥΥ_3-36 и их пэгилированные конъюгаты, которые могут обладать по меньшей мере одним улучшенным химическим или физиологическим свойством, выбранным из пониженной скорости клиренса, повышенной продолжительности нахождения в плазме, пролонгированной активности ίη угуо, повышенной эффективности, повышенной стабильности, улучшенной растворимости и пониженной антигенности, но этим не ограничиваются.

Предпочтительным вариантом РΥΥ_3-36 по изобретению является ^^Ο^ΥΥ^^. Другим предпочтительным вариантом является (^11С)йРΥΥ_3-36. Эти и другие варианты по изобретению могут быть получены путем синтеза, с помощью технологии рекомбинантной ДНК и другими способами, как описано ниже и в примерах в данном описании, или аналогичными способами.

В дополнение к перечисленным выше заменам (например, Е10С и О11С), РΥΥ-агонисты по изобретению также могут включать одну или более чем одну консервативную аминокислотную замену в других аминокислотных положениях. Консервативные замены могут быть произведены, например, в соответствии с приведенной ниже таблицей. Алифатическая неполярная, полярная-незаряженная и полярнаязаряженная аминокислоты могут быть заменены другой алифатической аминокислотой, которая является неполярной, полярной-незаряженной или полярной-заряженной аминокислотой, соответственно. Предпочтительно, чтобы такие замены осуществлялись между аминокислотами одной и той же линии третьей колонки приведенной ниже таблицы. Консервативные аминокислотные замены также могут быть осуществлены между ароматическими аминокислотами, которые показаны в приведенной ниже таблице.

- 8 011882

АЛИФАТИЧЕСКАЯ	Неполярная	ОАР
1Ь V
Полярная-незаряженная	С8ТМ
N0
Полярная-заряженная	ОЕ
КН
АРОМАТИЧЕСКАЯ		Η Е XV Υ

Получение путем синтеза

Варианты ΡΥΥ₃_3₆ по этому изобретению, например (Ε10Ο)ΗΡΥΥ₃.₃₆ и (Ό11Ο)ΗΡΥΥ_3-36, могут быть получены с использованием стандартных методик пептидного синтеза, известных в данной области техники, например посредством твердофазного пептидного синтеза, проводимого с использованием автоматического пептидного синтезатора (например, модели 433А; Аррйеб ВюкукЕетк, Еок1ег Сйу, СА) с использованием (Вое- (трет-бутоксикарбонил) или Ртое-химии (9-флуоренилметиленоксикарбонил). Обзор многих доступных методик пептидного синтеза можно найти в работе 8о11б Рйаке Рерйбе 8уп111е818 2'¹ еб. (81е\уагЕ ΙΜ. апб Уоипд, Ю., Р1егее Скет1са1 Сотрапу, РоскГогб, 1Ь, 1984). См. также книгу 8ο1ί6ркаке Огдашс 8уп111е818 (Вигдекк, К., 1ойп \УПеу & 8опк, №\у Υο^к, ΝΥ, 2000) и статью Епде1к е( а1., Апдеу. Скет. 1пб. Еб. 28:716- 34, 1989. Все перечисленные выше работы включены в данное описание посредством ссылки.

Варианты ΡΥΥ_3-36 по изобретению предпочтительно конъюгируют с ПЭГ. Реакции конъюгирования, называемые реакциями пэгилирования, исторически проводили в растворе с молярным избытком полимера и без учета места присоединения полимера к белку. Однако обычно получали подтверждение тому, что такие общие методики не являются адекватными для сохранения достаточной биологической активности при конъюгировании биологически активных белков с неантигенными полимерами. Одним из путей сохранения биологической активности варианта агониста ΡΥΥ3-36 после пэгилирования является по существу возможность избежать, в процессе сочетания, конъюгации любых реакционноспособных групп этого варианта, которые участвуют в связывании агониста с рецептором-мишенью. С целью сохранения высоких уровней активности, в одном аспекте настоящего изобретения предложен способ конъюгирования полиэтиленгликоля с вариантом агониста ΡΥΥ3-36 по изобретению по специфическим реакционноспособным сайтам, которые по существу не перекрываются с сайтом(ами) связывания рецептора. Другой аспект этого изобретения представляет собой введение реакционноспособных остатков в ΡΥΥ3-36 с целью получения вариантов этого агониста для конъюгирования с полиэтиленгликолем с минимальным изменением активности.

Химическая модификация посредством образования ковалентной связи может быть осуществлена в любых подходящих условиях, в общем случае адаптированных для реакции конъюгирования биологически активного вещества с активированным ПЭГ. Реакцию конъюгирования осуществляют в относительно мягких условиях для того, чтобы избежать инактивации варианта агониста ΡΥΥ_3-36. Мягкие условия включают поддержание рН реакционного раствора в диапазоне приблизительно 3-10 и температуры реакции в диапазоне приблизительно 0-40°С. Нецелевые функциональные группы в вариантах ΡΥΥ_3-36, которые являются реакционноспособными по отношению к активированному ПЭГ в условиях пэгилирования, предпочтительно защищают соответствующей защитной группой, которую можно удалить после пэгилирования по целевой функциональной группе. При пэгилировании свободных аминогрупп такими реагентами, как ПЭГ-альдегиды или ПЭГ-сукцинимиды, рН обычно поддерживают в диапазоне приблизительно 3-10, предпочтительно приблизительно 4-7,5. Реакцию сочетания предпочтительно проводят в подходящем буфере (рН 3-10), например фосфате, ΜΕ8 (2-(№морфолино)этансульфоновая кислота), цитрате, ацетате, сукцинате или ΗΕΡΕ8 (№2-гидроксиэтил-пиперазин-Ж2-этансульфоновая кислота), в течение приблизительно 1-48 ч при температуре в диапазоне приблизительно 4-40°С. При пэгилировании тиоловых групп с использованием таких реагентов, как ПЭГ-малеимиды, ПЭГ-винилсульфоны или ПЭГортопиридилдисульфиды, рН предпочтительно поддерживают в диапазоне приблизительно 4-8. ПЭГамины полезны при пэгилировании кетогрупп, например, в параацетилфенилаланине, и их можно получить, как описано в Ρ^^ί е( а1., 1. Огд. Скет. 45:5364-5370, 1980.

При осуществлении реакций конъюгирования по настоящему изобретению обычно получают реакционную смесь или пул, содержащую(ий) желаемый монопэгилированный вариант ΡΥΥ3-36, а также непрореагировавший вариант пептида ΡΥΥ3-36, непрореагировавший ПЭГ и обычно менее чем приблизительно 20% высокомолекулярных структур, которые могут включать конъюгаты, содержащие более одной цепи ПЭГ и/или агрегированные структуры. После удаления непрореагировавших структур и высокомолекулярных структур производят извлечение композиций, содержащих преимущественно монопэгилированные варианты ΡΥΥ3-36. Принимая во внимание, что такие конъюгаты часто включают одну полимерную цепь, они являются по существу гомогенными.

Желаемый конъюгат ПЭГ и варианта ΡΥΥ_3-36 может быть очищен из реакционной смеси традици

- 9 011882 онными способами, обычно используемыми для очистки белков, такими как диализ, высаливание, ультрафильтрация, ионообменная хроматография, хроматография гидрофобного взаимодействия (Н1С), гельхроматография и электрофорез. Для удаления любого непрореагировавшего ПЭГ или непрореагировавшего варианта ΡΥΥ_3-36 особенно эффективна ионообменная хроматография. Отделение желаемого конъюгата ПЭГ-вариант можно осуществить посредством помещения реакционной смеси, содержащей смешанные структуры, в буферный раствор, имеющий рН от приблизительно 4 до приблизительно 10, предпочтительно ниже 8, чтобы избежать деамидирования. Буферный раствор предпочтительно содержит одну или более буферных солей, выбранных из КС1, ЫаС1, К₂НРО₄, КН₂РО₄, Иа₂НРО₄, ИаН₂РО₄, ИаНСО₃, ЫаВО₄ и СН₃СО₂Иа, но этим не ограничивается.

Если буферная система, используемая в реакции пэгилирования, отличается от таковой в процессе разделения, реакционную смесь для пэгилирования подвергают буферному обмену/диафильтрации или разбавляют достаточным количеством изначального буфера для разделения.

Фракционирование конъюгатов в пуле, содержащем желаемые структуры, предпочтительно осуществляют с использованием среды для ионообменной хроматографии. Такая среда способна к селективному связыванию конъюгатов ПЭГ и вариантов ΡΥΥ_3-36 за счет различий в заряде, который варьирует до некоторой степени предсказуемым образом. Например, поверхностный заряд варианта ΡΥΥ3-36 определяется количеством доступных заряженных групп на поверхности пептида, которые доступны для взаимодействия с носителем колонки, устойчивым в присутствии ПЭГ. Эти заряженные группы обычно служат в качестве точки возможного присоединения полимеров ПЭГ. Следовательно, конъюгаты ПЭГ и вариантов ΡΥΥ3-36 будут иметь заряд, отличный от заряда других присутствующих структур, что дает возможность избирательного выделения.

Для очистки представленных конъюгатов ПЭГ и вариантов ΡΥΥ3-36 особенно предпочтительны ионообменные смолы. В способе очистки по настоящему изобретению используют катионообменные смолы, такие как сульфопропил-смолы. Неограничивающий перечень катионообменных смол, подходящих для использования по настоящему изобретению, включает 8Р-Ы1тар®, 8Р 8ерйатоке НР® и 8Р 8ер11агоке® Гак! Πο\ν. Также можно использовать другие подходящие катионообменные смолы, например 8- и СМ(карбоксиметил)содержащие смолы.

Катионообменную смолу предпочтительно упаковывают в колонку и уравновешивают традиционным образом. Используют буфер, имеющий те же значения рН и осмоляльности, что и раствор ПЭГконъюгированного варианта ΡΥΥ_3-36. Элюирующий буфер предпочтительно содержит одну или более солей, выбранных из СН₃СО₂Ыа, НЕРЕ8, КС1, ЫаС1, К₂НРО₄, КН₂РО₄, Ыа₂НРО₄, ЫаН₂РО₄, ЫаНСО₃, ИаВО_4; и (ИН₄)₂СО₃, но этим не ограничивается. Раствор, содержащий конъюгат, затем адсорбируют на колонке, при этом непрореагировавший ПЭГ и некоторые высокомолекулярные структуры не удерживаются. По окончании загрузки для элюирования желаемой фракции ПЭГ-конъюгированного варианта ΡΥΥ_3-36 к колонке прикладывают градиентный поток элюирующего буфера с увеличивающейся концентрацией соли. Объединенные элюированные фракции после стадии катионообменного разделения предпочтительно ограничиваются однородными полимерными конъюгатами. Любые структуры неконъюгированных вариантов ΡΥΥ_3-36 затем можно вымывать из колонки с использованием традиционных методик. При желании, моно- и мультипэгилированные структуры вариантов ΡΥΥ_3-36 и высокомолекулярные структуры можно потом отделить друг от друга путем проведения дополнительной ионообменной хроматографии или эксклюзионной хроматографии.

Вместо линейного градиента можно применять методики, в которых используются множественные стадии изократического элюирования с повышающейся концентрацией. Множественные стадии изократического элюирования с повышающейся концентрацией будут приводить к последовательному элюированию сначала конъюгатов мультипэгилированных/агрегированных и затем монопэгилированных вариантов ΡΥΥ_3-36. Также можно использовать методики элюирования, основанные на градиентах рН. В общем случае температурный диапазон для элюирования составляет от приблизительно 4°С до приблизительно 25°С. Элюирование конъюгата ПЭГ и варианта ΡΥΥ_3-36 регистрируют по УФ-поглощению при 280 нм. Сбор фракций можно осуществлять, исходя непосредственно из профилей элюирования во времени.

Рекомбинантная экспрессия Молекулы нуклеиновых кислот

Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие полипептид (Е10С)йΡΥΥ_3-36, могут содержать одну из следующих последовательностей нуклеиновых кислот (мутация в кодоне для замены Е10С подчеркнута): а!сааасссЁаейс!сссйЁС[я1Ёас£сс!с£ссйЁа!аеаЕс!еаассес1ас!ас£сс!ссс1есессас1:асс1саа сс1дд!сасссддсадс§§1а! (8Еф ГО ΝΟ: 5); или а!сааассс£ас£с!сссЁ£с!£С£ас£сс1сассейаЁ£айс1£аассЁС!ас1асесс!ссс!йСйссас1асс!саа сс1дд!сассс8§са§сдд1а! (8Еф Ю N0: 6).

Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие полипептид (^11С)йΡΥΥ_3-36, могут содержать одну из следующих последовательностей нуклеиновых кислот (мутация в кодоне для замены Ό11С подчеркнута):

- 10 011882 а(сааасссйадйс(сссйдсйаа(й(йсс(с£сс£йадйайс(йаассйс(ас(асдсс(ссс(йсйссас(асс(саа сс^дЕсасссддсадсддХаЕ (8Е<3 ГО N0: 7); или а(сааассс гааясХссс аас ааахес дсс(с йссййаккайсщаасс ι> с (ас(ас йсс(ссс(йс£ссасХасс(саа сс(дд(сассс§£са§с§д(а( (8Е0 ГО N0: 8).

Эти последовательности также могут включать стоп-кодон (например (да, (аа, (ад) на С-конце, и их легко получить рядом способов, включая химический синтез, генетическую мутацию полинуклеотидных последовательностей 11ΡΥΥ дикого типа, полученных из кДНК или скринингом геномной библиотеки, скринингом библиотеки по экспрессии и/или амплификацией кДНК с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР), но этим не ограничиваясь. Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие варианты (Ε10ί.')1ιΡΥΥ_3-36 и (Ό110)ΗΡΥΥ_3-36, можно создавать с использованием сайт-специфического мутагенеза, ПЦР-амплификации или других подходящих способов, в случае, если праймер(ы) имеет(ют) желаемые точечные мутации. Способы рекомбинантной ДНК и способы мутагенеза, рассмотренные в данном описании, в целом приведены в 8атЬгоок е( а1., Мо1еси1аг С1ошпд: ЬаЬога(огу Мапиа1 (Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога(огу Рге88, 1989) и Сштеп( Рго(осо18 ш Мо1еси1аг Вю1оду (Ли8иЬе1 е( а1., еб8., Сгееп РиЬ118Йег8 1пс. апб ^беу апб 8оп8 1994). Если желательно, чтобы ЕЮ или Ό11 была заменена другой, не существующей в природе аминокислотой, такой пептид может быть рекомбинантно экспрессирован с использованием способов, которые описаны, например, в публикации заявки на патент США № 2005/0208536, включенной в данное описание посредством ссылки.

Полинуклеотиды нуклеиновых кислот, кодирующие аминокислотную последовательность ΗΡΥΥ, могут быть идентифицированы посредством экспрессирующего клонирования, в котором применяется детектирование позитивных клонов на основании свойства экспрессируемого белка. Обычно библиотеки нуклеиновых кислот подвергают скринингу в отношении связывания антитела или другого партнера по связыванию (например, рецептора или лиганда) с клонированными белками, которые экспрессируются и располагаются на поверхности клеток-хозяев. Антитело или партнер по связыванию модифицируют детектируемой меткой с целью идентификации таких клеток, экспрессирующих желаемый клон.

Методики рекомбинантной экспрессии, осуществляемые в соответствии с приведенными ниже описаниями, могут быть использованы для получения кодирующих (Е10С.')11РУУ_3-36 и (Ό11ί.')1ιΡΥΥ_3-36 полинуклеотидов и для экспрессии кодируемых полипептидов. Например, вставкой последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность варианта (Ε1(Χ.')1ιΡΥΥ_3-36 или (Ό11ΟΗΡΥΥ3-36, в соответствующий вектор, специалист в данной области может без труда получить большие количества желаемой нуклеотидной последовательности. Данные последовательности могут быть затем использованы для получения детектирующих зондов или амплификационных праймеров. Альтернативно, полинуклеотид, кодирующий аминокислотную последовательность полипептида (Ε1(Χ.’)1ιΡΥΥ_3-36 или (Ό11Ο)ΗΡΥΥ_3-36, можно легко вставить в экспрессирующий вектор. Введением экспрессирующего вектора в соответствующего хозяина можно получить кодируемый вариант (Ε10Ο)ΗΡΥΥ_3-36 или (Ό11Ο)ΗΡΥΥ_3-36 в больших количествах.

Другим способом получения подходящей последовательности нуклеиновой кислоты является полимеразная цепная реакция (ПЦР). В этом способе кДНК получают из поли(А)+РНК или суммарной РНК, используя фермент обратную транскриптазу. Два праймера, обычно комплементарные двум отдельным участкам кДНК, кодирующим аминокислотную последовательность варианта (Е10С)йΡΥΥ_3-36 или (Ό11Ο)ΗΡΥΥ_3-36, затем добавляют к кДНК вместе с полимеразой, такой как Тад-полимераза, и полимераза амплифицирует участок кДНК между этими двумя праймерами.

Другим способом получения молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность варианта (Ε100)ΗΡΥΥ_3-36 или (Ό11Ο)ΗΡΥΥ_3-36, является химический синтез с использованием способов, хорошо известных специалисту в данной области техники, как например описанные в Епде18 е( а1., Лпдете. Сйет. 1п(1. Еб. 28: 716-34, 1989. Эти способы включают способы синтеза нуклеиновых кислот с использованием фосфотриэфиров, фосфорамидитов и Н-фосфонатов. Предпочтительным способом такого химического синтеза является синтез на полимерной подложке с использованием стандартной химии фосфорамидитов. Обычно длина ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность (Ε100)ΗΡΥΥ_3-36, будет составлять приблизительно одну сотню нуклеотидов. Нуклеиновые кислоты, превышающие приблизительно 100 нуклеотидов, можно синтезировать в виде нескольких фрагментов с использованием этих способов. Фрагменты затем можно лигировать вместе с образованием полноразмерной нуклеотидной последовательности гена (Е10С)йΡΥΥ_3-36.

Фрагмент ДНК, кодирующий амино-конец полипептида, может иметь АТС, который кодирует остаток метионина. Этот метионин может быть представлен или не представлен в зрелой форме (Ε1(Χ.')1ιΡΥΥ_3-36 или (Ό11Ο)ΗΡΥΥ_3-36, в зависимости от того, предназначен ли полипептид, продуцируемый в клетке-хозяине, для секретирования из клетки. В качестве стартового сайта также можно использовать кодон, кодирующий изолейцин. Кроме этого можно использовать другие способы, известные специалисту в данной области техники. В некоторых воплощениях варианты нуклеиновых кислот содержат кодоны, которые были изменены для оптимальной экспрессии (Е10С)йΡΥΥ_3-36 или (Ό11Ο)ΗΡΥΥ_3-36 в

- 11 011882 данной клетке-хозяине. Конкретные изменения кодонов будут зависеть от (Е10С)йР¥Уз_з₆ или (Ό11Ο)ΗΡΥΥ₃.3₆ и клетки-хозяина, выбранной для экспрессии. Такую «оптимизацию кодонов» можно осуществить рядом способов, например, путем выбора кодонов, предпочтительных для использования в высоко экспрессируемых генах в данной клетке-хозяине. Можно использовать компьютерные алгоритмы, которые включают таблицы частот кодонов, такие как Есо_Ыдй.Сой для частот кодонов высоко экспрессируемых бактериальных генов, и они представлены в пакете (программ), версия 9.0 Университета в Висконсине (Ишуегайу о£ \У1ксопкш Раскаде Уегкюп 9.0; Сеийск Сотри!ег Сгоир, Майкоп, \νίκ.). Другие полезные таблицы частот кодонов включают Се1едаик_Ыдй.сой, Се1едаик_1о^.сой, Иго8орЫ1а_Ыдй.соб, Нитаи_Ыдй.сой, Ма1/е_1пд11.сой и 'Теак!_Ыдй.сой.

Векторы и клетки-хозяева

Молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислотную последовательность (Ε10Ο)1ιΡΥΥ_3-36 или (Ό11Ο)1ΡΥΥ_3-36, вставляют в соответствующий экспрессирующий вектор, используя стандартные методики лигирования. Обычно вектор выбирают таким образом, чтобы он был функциональным в конкретной применяемой клетке-хозяине (то есть, вектор является совместимым с системой клетки-хозяина с тем, чтобы могла идти амплификация гена и/или экспрессия гена). Молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислотную последовательность (Ε10Ο)1ιΡΥΥ_3-36 или (Ό11Ο)1ΡΥΥ_3-36, можно амплифицировать/экспрессировать в клетке-хозяине прокариот, дрожжей, насекомых (бакуловирусные системы) и/или эукариот. Для обзора по экспрессирующим векторам, смотри Ме111. Εηζ., уо1. 185 (Ό. У. Соеййе1, ей., Асайетю Ргекк, 1990).

Обычно экспрессирующие векторы, используемые в любой из клеток-хозяев, будут содержать последовательности для поддержания плазмид и для клонирования и экспрессии экзогенных нуклеотидных последовательностей. Такие последовательности, вместе называемые как «фланкирующие последовательности», в некоторых воплощениях обычно будут включать одну или более чем одну из следующих нуклеотидных последовательностей: промоторную, одну или более энхансерных последовательностей, ориджин репликации, последовательность терминации транскрипции, полную интронную последовательность, содержащую донорный и акцепторный сайт сплайсинга, последовательность, кодирующую лидерную последовательность для секреции полипептида, сайт связывания с рибосомой, последовательность полиаденилирования, полилинкерный участок для вставки нуклеиновой кислоты, кодирующей экспрессируемый полипептид, и селектируемый маркерный элемент. Каждая из этих последовательностей обсуждается ниже.

Возможно, вектор может содержать «метка»-кодирующую последовательность, то есть, олигонуклеотидную молекулу, расположенную на 5'- или З'-конце последовательности, кодирующей (Ε10Ο)1ιΡΥΥ_3-36 или (Ό11Ο)1ιΡΥΥ_3-36; при этом данная олигонуклеотидная последовательность кодирует полиН1к (такой как гексаНщ), или другую «метку», такую как ЕЬЛС, НА (гемаглютинин вируса гриппа) или тус, для которой существуют антитела, имеющиеся в продаже. Эту метку обычно подвергают слиянию с полипептидом по мере его экспрессии, и она может служить в качестве средства для аффинной очистки (Ε10Ο)1ιΡΥΥ_3-36 или (Ό11Ο)1ιΡΥΥ_3-36 из клетки-хозяина. Аффинную очистку можно осуществить, например, с помощью колоночной хроматографии с использованием антител против метки в качестве аффинной матрицы. Возможно, затем метку можно удалить из очищенных (Ε10С)йΡΥΥ_3-36 или (Ό11Ο)1ιΡΥΥ_3-36 различными способами, такими как использование конкретных пептидаз для расщепления, например, энтерокиназного расщепления по 3'-концу последовательности метки ЕЬАС, расположенной слева от одной из аминокислотных последовательностей, которые показаны на 8ЕО Ш N0: 3-4.

Фланкирующие последовательности могут быть гомологичными (то есть, из того же вида и/или штамма, что и клетка-хозяин), гетерологичными (то есть, из вида, отличного от вида или штамма клеткихозяина), гибридными (то есть, представлять собой комбинацию фланкирующих последовательностей более чем из одного источника) или синтетическими, либо фланкирующие последовательности могут представлять собой нативные последовательности, которые обычно участвуют в регуляции экспрессии 1ιΡΥΥ_3-36. Источником фланкирующей последовательности может быть любой прокариотический или эукариотический организм, любой организм позвоночного или беспозвоночного или любое растение, при условии, что фланкирующая последовательность функциональна в клетке-хозяине и может быть активирована системой клетки-хозяина.

Полезные фланкирующие последовательности можно получить любым из нескольких способов, хорошо известных в данной области техники. Обычно, фланкирующие последовательности, полезные в данном изобретении, отличные от последовательностей, фланкирующих ген ΡΥΥ, должны быть предварительно идентифицированы посредством картирования и/или анализа с помощью рестрикционных эндонуклеаз и могут, таким образом, быть выделены из ткани подходящего источника с использованием соответствующих рестрикционных эндонуклеаз. В некоторых случаях может быть известна полная нуклеотидная последовательность фланкирующей последовательности. В этих случаях фланкирующая последовательность может быть синтезирована с использованием способов синтеза или клонирования нуклеиновых кислот, изложенных в данном описании.

Когда вся или только часть фланкирующей последовательности известна, она может быть получена с использованием ПЦР и/или скрининга геномной библиотеки с использованием подходящего олигонук

- 12 011882 леотида и/или фрагмента фланкирующей последовательности из того же самого или другого вида. Когда фланкирующая последовательность не известна, фрагмент ДНК, содержащий фланкирующую последовательность, может быть выделен из большего по размерам участка ДНК, который может содержать, например, кодирующую последовательность или даже другой ген или гены. Выделение может быть осущестлено посредством обработки рестрикционной эндонуклеазой с получением подходящего фрагмента ДНК с последующим выделением с использованием очистки в агарозном геле, хроматографии на колонке 01адсп® (Сйа!зетог!й, СА) или других способов, известных специалисту в данной области. Выбор подходящих для этой цели ферментов будет очевиден специалисту в данной области техники.

Ориджин репликации обычно представляет собой часть тех прокариотических экспрессирующих векторов, которые имеются в продаже, и ориджин способствует амплификации вектора в клетке-хозяине. Амплификация вектора до определенного числа копий может, в некоторых случаях, быть важна для оптимальной экспрессии (Е10С)йР¥Уз_-з₆ или (□11С)йРУУ_3-з₆. Если выбранный вектор не содержит сайт ориджина репликации, его можно химически синтезировать на основе известной последовательности и лигировать в вектор. Например, ориджин репликации из плазмиды рВР322 (№\ν Епд1апб Вю1аЬ§, Веуег1у, МА) подходит для большинства грам-отрицательных бактерий, а для клонирования векторов в клетках млекопитающих полезны многие ориджины (например, вируса 40 (8У40) обезьяны, вируса полиомы, аденовируса, вируса везикулярного стоматита (У8У) или вирусов папилломы, таких как НРУ (вирус папилломы человека) или ВРУ (папилломавирус крупного рогатого скота)). В общем случае ориджин репликации не является необходимым компонентом для экспрессирующих векторов млекопитающих (например, ориджин 8У40 часто используется только потому, что он содержит ранний промотор).

Последовательность терминации транскрипции обычно локализована на З'-конце кодирующего полипептид участка и служит для терминации транскрипции.

Обычно последовательность терминации транскрипции в прокариотических клетках представляет собой богатый С-С фрагмент, за которым следует поли-Т-последовательность. Хотя данную последовательность легко клонировать из библиотеки либо даже приобрести как часть вектора, ее также легко можно синтезировать с использованием способов синтеза нуклеиновых кислот, таких как представленные в данном описании.

Селектируемый маркерный генный элемент кодирует белок, необходимый для выживания и роста клетки-хозяина на селективной культуральной среде. Обычно селектируемые маркерные гены кодируют белки, которые (а) придают прокариотическим клеткам-хозяевам устойчивость к антибиотикам или другим токсинам, например, ампициллину, тетрациклину или канамицину; (б) дополняют ауксотрофную недостаточность клетки; или (в) поставляют крайне необходимые питательные вещества, которые невозможно получить из комплексных сред. Предпочтительными селектируемыми маркерами являются ген устойчивости к канамицину, ген устойчивости к ампициллину и ген устойчивости к тетрациклину. Для селекции в прокариотических и эукариотических клетках-хозяевах также можно использовать ген устойчивости к неомицину.

Для амплификации гена, который будет экспрессирован, можно использовать другие гены селекции. Амплификация представляет собой процесс, когда гены, в которых существует наибольшая потребность для продуцирования критического для роста белка, повторяются в тандеме внутри хромосом при последовательных генерациях рекомбинантных клеток. Примеры подходящих селектируемых маркеров для клеток млекопитающих включают дигидрофолат-редуктазу (ΌΗΕΒ) и тимидинкиназу. Трансформантов клеток млекопитающих помещают в условия селекционного давления, в которых только трансформанты уникально адаптируются для выживания благодаря наличию в векторе гена селекции. Селекционное давление создают посредством культивирования трансформированных клеток в условиях, при которых концентрация селекционного агента в среде последовательно изменяется, приводя в результате этого к амплификации как гена селекции, так и ДНК, кодирующей (Е10С)11РУУ_3-36 или (Ό1Κ’)1ιΡΥΥ_3-36. В результате с амплифицированной ДНК синтезируются повышенные количества (Е10С)йРΥΥ_3-36 или (Ό11ΟΗΡΥΥ3-36.

Сайт связывания с рибосомой обычно необходим для инициации трансляции мРНК и характеризуется последовательностью Шайна-Далгарно (прокариоты) или последовательностью Козака (эукариоты). Этот элемент обычно локализован в положении 3' по отношению к промотору и 5' по отношению к кодирующей последовательности (Ε10ί’)1ιΡΥΥ_3-36 или (Ό11Ο)№ΥΥ_3-36, которая должна быть экспрессирована. Последовательность Шайна-Далгарно варьирует, но обычно представляет собой полипурин (то есть, имеет высокое содержание А-С). Идентифицировано много последовательностей Шайна-Далгарно, каждую из которых можно легко синтезировать способами, приведенными в данном описании, и использовать в прокариотическом векторе.

Для того чтобы направить (Ε10Ο)№ΥΥ_3-36 или (Ό11Ο)№ΥΥ_3-36 из клетки-хозяина, можно использовать лидерную или сигнальную последовательность. Обычно нуклеотидная последовательность, кодирующая эту сигнальную последовательность, расположена в кодирующем участке молекулы нуклеиновой кислоты (Е10С)йΡΥУ_3-36 или (Ό11Ο)№ΥΥ_3-36 или непосредственно у 5'-конца кодирующего участка (Ε10С)йΡΥУ_3-36 или (Ό11Ο)№ΥΥ_3-36. Идентифицированы многие сигнальные последовательности и лю

- 13 011882 бые из них, которые функциональны в выбранной клетке-хозяине, можно использовать вместе с молекулой нуклеиновой кислоты (Е10С)йР¥Уз_-з₆ или (Ό11С)11РУУ_3-36. Следовательно, сигнальная последовательность может быть гомологичной (естественного происхождения) или гетерологичной по отношению к молекуле нуклеиновой кислоты (Е10С)ЬРУУ_3-36 или (О11С)11РУУ_3-36. К тому же сигнальную последовательность можно синтезировать химически с использованием способов, изложенных в данном описании. В большинстве случаев секретирование (Е10С)ЬРУУ_3-36 или (О11С)11РУУ_3-36 из клетки-хозяина благодаря наличию сигнального пептида будет приводить к удалению сигнального пептида из секретируемых (Е10С)ЬРУУ_3-36 или (О11С)11РУУ_3-36. Сигнальная последовательность может быть компонентом вектора, или она может быть частью вставленной в вектор молекулы нуклеиновой кислоты (Е10С)ЬРУУ_3-36 или (П11С)№¥¥3-36.

Нуклеотидная последовательность, кодирующая нативную сигнальную последовательность ЬРУУ_3-36, может быть присоединена к кодирующему участку (Е10С)ЬРУУ_3-36 или (О11С)йРУУ_3-36, либо нуклеотидная последовательность, кодирующая гетерологичную сигнальную последовательность, может быть присоединена к кодирующему участку (Е10С)ЬРУУ_3-36 или (Ό 11С)11РУ Υ _3-36. Выбранная гетерологичная сигнальная последовательность должна распознаваться и процессироваться, то есть отщепляться сигнальной пептидазой клетки-хозяина. Для прокариотических клеток-хозяев, которые не распознают и не процессируют нативную сигнальную последовательность №ΥΥ, сигнальную последовательность заменяют на прокариотическую сигнальную последовательность, выбранную, например, из группы лидерных последовательностей щелочной фосфатазы, пенициллиназы или термостабильного энтеротоксина II. Для секретирования в дрожжах нативная сигнальная последовательность 11РУУ может быть заменена на лидерную последовательность дрожжевой инвертазы, альфа-фактора или кислой фосфатазы. Для экспрессии в клетках млекопитающих нативная сигнальная последовательность является достаточной, хотя могут подходить другие сигнальные последовательности млекопитающих.

Во многих случаях транскрипция молекулы нуклеиновой кислоты усиливается благодаря присутствию в векторе одного или более интронов; это особенно справедливо, когда полипептид продуцируется в эукариотических клетках-хозяевах, в особенности в клетках-хозяевах млекопитающих. Используемые интроны могут естественным образом присутствовать внутри гена №ΥΥ, в особенности, когда используемый ген является полноразмерной геномной последовательностью или ее фрагментом. Когда интрон не присутствует естественным образом внутри гена (как для большинства кДНК), его можно получить из другого источника. Расположение интрона по отношению к фланкирующим последовательностям и гену 11РУУ обычно является важным, поскольку чтобы быть эффективным, интрон должен транскрибироваться. Таким образом, когда транскрибируется молекула кДНК, кодирующая (Е10С)№УТ_3-36 или (Ό11Ο)№ΥΥ_3-36., предпочтительным положением для интрона является положение 3' по отношению к сайту начала транскрипции и 5' по отношению к поли-А последовательности терминации транскрипции. Предпочтительно, чтобы интрон или интроны были локализованы либо с одной стороны кДНК, либо с другой (то есть, 5' или 3'), так чтобы это не прерывало кодирующую последовательность. Можно использовать любой интрон из любого источника, включая вирусы, прокариотические и эукариотические (растение или животное) организмы, при условии совместимости с клеткой-хозяином, в которую его вводят. Кроме того, в данное описание включены синтетические интроны. Возможно, в векторе можно использовать более одного интрона.

Экспрессирующие и клонирующие векторы обычно будут содержать промотор, который распознается организмом хозяина и оперативно связывается с молекулой, кодирующей (Е10С)№УТ_3-36 или (Ό11Ο)№ΥΥ_3-36. Промоторы представляют собой нетранскрибируемые последовательности, локализованные выше (то есть, 5') по отношению к стартовому кодону структурного гена (в общем случае в пределах приблизительно 100-1000 пар оснований (п.о.)), которые регулируют транскрипцию данного структурного гена. Промоторы традиционно группируют в один из двух классов: индуцибельные промоторы и конститутивные промоторы. Индуцибельные промоторы инициируют повышенные уровни транскрипции ДНК, находящейся под их контролем, в ответ на некоторое изменение в условиях культивирования, как например присутствие или отсутствие питательного вещества, или изменение в температуре. Конститутивные промоторы, с другой стороны, инициируют постоянное продуцирование продукта гена; то есть имеется незначительная регуляция или не имеется никакой регуляции генной экспрессии. Хорошо известно большое количество промоторов, распознаваемых разнообразными потенциальными клетками-хозяевами. Подходящий промотор функциональным образом связан с ДНК, кодирующей (Е10С)йРУТ_3-36 или (Ό11Ο)№ΥΥ_3-36, путем удаления промотора из источника ДНК с использованием обработки рестрикционными ферментами и вставки желаемой промоторной последовательности в вектор. Чтобы направить амплификацию и/или экспрессию молекулы нуклеиновой кислоты (Е10С)11РУУ_3-36 или (П11С)№УТ_3-36, можно использовать нативную промоторную последовательность №ΥΥ_3-36. Тем не менее, предпочтителен гетерологичный промотор, если он позволяет осуществлять более сильную транскрипцию и давать более высокие выходы экспрессируемого белка по сравнению с нативным промотором, и если он совместим с системой клетки-хозяина, которая выбрана для использования.

Промоторы, подходящие для использования с прокариотическими хозяевами, включают беталактамазные и лактозные промоторные системы; промотор индуцибельной РНК-полимеразы Е.сой Т7;

- 14 011882 промотор щелочной фосфатазы; триптофановую (Хгр) промоторную систему; и гибридные промоторы, такие как Хас-промотор. Также подходят другие известные бактериальные промоторы. Их последовательности опубликованы, что позволяет специалисту в данной области лигировать их с желаемой последовательностью ДНК, используя при необходимости линкеры или адаптеры для создания любых полезных сайтов рестрикции.

Промоторы, подходящие для использования с дрожжевыми клетками-хозяевами, также хорошо известны в данной области техники. С дрожжевыми промоторами преимущественно используют дрожжевые энхансеры. Промоторы, подходящие для использования с клетками-хозяевами млекопитающих, хорошо известны и включают промоторы, полученные из геномов вирусов, таких как вирус полиомы, вирус птичьей оспы, аденовирус (такой как Аденовирус 2), папилломавирус крупного рогатого скота, вирус птичьей саркомы, цитомегаловирус (СМУ), ретровирусы, вирус гепатита В и, наиболее предпочтительно, вирус 40 (8У40) обезьяны, но этим не ограничиваются. Другие подходящие промоторы млекопитающих включают гетерологичные промоторы млекопитающих, например, промоторы белков теплового шока и актиновый промотор.

Дополнительные промоторы, которые могут представлять интерес в отношении регуляции экспрессии (Ε10С)бΡΥΥ_3-36 или (Ό11ί.’)1ιΡΥΥ_3-36. включают: участок раннего промотора 8У40 (Веток! апб СбатЬоп, ИаХиге 290: 304-10, 1981); СМУ-промотор; промотор, содержащийся в длинных 3'терминальных повторах вируса саркомы Рауса (ΎαιηαιηοΙο е! а1, Се11 22: 787-97, 1980); промотор тимидинкиназы вируса герпеса (^адпег е! а1., Ριό^ №111. Асаб. 8с1. И.8.А. 78: 1444-45, 1981); регуляторные последовательности гена металлотионина (ВппкХег е! а1., ИаХиге 296: 39-42, 1982); прокариотические экспрессирующие векторы, такие как промотор бета-лактамазы (УШа-КатагоГГ е! а1., Ριό^ №И1. Асаб. 8с1. И.8.А. 75: 3727-31, 1978); или Хас-промотор (ИеВоег еХ а1., Ργόο. Νπ11. Асаб. 8с1. И.8.А. 80: 21-25, 1983), но этим не ограничиваются.

Для усиления транскрипции в высших эукариотах ДНК, кодирующей (Ε10ί.')1ιΡΥΥ_3-36 или (Ό11Ο6ΡΥΥ3-36, в вектор можно вставить энхансерную последовательность. Энхансеры представляют собой цис-действующие элементы ДНК, обычно приблизительно 10-300 п.о. по длине, которые действуют на промотор, усиливая транскрипцию. Энхансеры относительно независимы от ориентации и расположения. Они были обнаружены в положениях 5' и 3' по отношению к транскрибируемой единице. Известно несколько энхансерных последовательностей, доступных из генов млекопитающих (например, генов глобина, эластазы, альбумина, альфа-фетопротеина и инсулина). Однако обычно будет использован энхансер из вируса. Энхансер 8У40, энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер вируса полиомы и энхансеры аденовирусов являются типичными энхансерными элементами для активации эукариотических промоторов. Несмотря на то, что энхансер может быть встроен в вектор в положении 5' или 3' по отношению к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей (Ε10ί.')1ιΡΥΥ_3-36 или (Ό11Ο)6ΡΥΎ_3-36, обычно он расположен в положении 5' по отношению к промотору.

Экспрессирующие векторы можно конструировать из исходного вектора, как например вектора, имеющегося в продаже. Такие векторы могут содержать или могут не содержать все желаемые фланкирующие последовательности. Когда одна или более фланкирующих последовательностей, приведенных в данном описании, не присутствуют изначально в векторе, их можно получить в индивидуальном порядке и лигировать в вектор. Способы, используемые для получения каждой из фланкирующих последовательностей, хорошо известны специалисту в данной области техники.

Предпочтительными векторами являются такие, которые совместимы с клеткой-хозяином бактерий, насекомых и млекопитающих. Такие векторы включают, среди прочего, рСКЛ, рСКЗ и рсПИА3.1 (ΙηνίХгодеп, СагИЬаб, СА), рВ811 (8ХгаХадепе, Ьа боИа, СА), рЕТ15 (Nονадеη, Мабкоп, VI), рСЕХ ^Наташа ВюХесб, Ρксаιа\νау. ΝΣ), рΕСΡΡ-N2 (С1опХес1, Ρη^ А1Хо, СА), рЕТЬ (В1иеВас11, 1№1бодеп), рО8К-альфа (публикация заявки РСТ № νθ 90/14363) и рРа8ХВасИиа1 (С1Ьсо-ВРТ, Сгапб Ыапб, ΝΥ).

Дополнительные подходящие векторы включают космиды, плазмиды или модифицированные вирусы, но этим не ограничиваются, однако очевидно, что векторная система должна быть совместима с выбранной клеткой-хозяином. Такие векторы включают плазмиды, такие как плазмидные производные В1ие8сбрХ® (высококопийная фагмида на основе Со1Е1, 8ХгаХадепе), ПЦР-клонированные плазмиды, разработанные для клонирования Тач-амплифицированных ПЦР-продуктов (например, ТОРО® ТА С1ошпд® К1Х, Ρ0Κ2.1® плазмидные производные, 1№1бодеп), и векторы млекопитающих, дрожжей или вирусов, такие как бакуловирусная экспрессирующая система (рВасРАК плазмидные производные, С1опХес1), но этим не ограничиваются.

После того как вектор сконструирован и молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид (Ε10С)бΡΥΥ_3-36 или (Ό11Ο)1ΡΥΥ_3-36, встроена в подходящий сайт этого вектора, скомплектованный вектор можно ввести в подходящую клетку-хозяин для амплификации и/или экспрессии полипептида. Трансформация выбранных клеток-хозяев экспрессирующим вектором для полипептида (Ε10С)бΡΥΥ_3-36 или (Ό11ί.')1ιΡΥΥ_3-36 может быть осуществлена хорошо известными способами, включая такие способы как трансфекция, инфекция, электропорация, микроинъекция, липофекция, диэтиламиноэтил(ИЕАЕ)декстрановый способ или другие известные методики. Выбранный способ отчасти должен соответство

- 15 011882 вать функции того типа клетки-хозяина, который будет использован. Эти способы и другие подходящие способы хорошо известны специалисту в данной области и изложены, например, в 8атЬгоок с1 а1., выше.

Клетки-хозяева могут быть прокариотическими клетками-хозяевами (такими как Е. сой) или эукариотическими клетками-хозяевами (такими как дрожжевые клетки, клетки насекомых или позвоночных). Клетка-хозяин, когда ее культивируют в соответствующих условиях, синтезирует полипептид (Е10С)11РУУ_3-36 или (О11С)11РУУ;,_-36. который потом может быть собран из культуральной среды (если клетка-хозяин секретирует его в среду) или непосредственно из клетки-хозяина, продуцирующей его (если он не секретируется). Выбор соответствующей клетки-хозяина будет зависеть от различных факторов, таких как желаемые уровни экспрессии, полипептидные модификации, которые желательны или необходимы для активности (как например гликозилирование или фосфорилирование), и легкость сворачивания в биологически активную молекулу.

В данной области техники известен ряд подходящих клеток-хозяев, и многие из них могут быть получены из Американской коллекции типовых культур (АТСС), Мапаззаз, Уа. Примеры включают клетки млекопитающих, такие как клетки яичников китайского хомячка (СНО), СНО ЭНЕР(-)-клетки (иг1аиЬ с1 а1., Ргос. №11. Асаб. 8с1. И.8.А. 97: 4216-20, 1980), клетки почки эмбриона человека (НЕК) 293 или 293Тклетки, или 3Т3-клетки, но этим не ограничиваются. Выбор подходящих клеток-хозяев млекопитающего и способов трансформации, культивирования, амплификации, скрининга, получения и очистки продукта известны в данной области техники. Другими подходящими клеточными линиями млекопитающих являются клеточные линии СО8-1 и СО8-7 обезьяны и клеточная линия СУ-1. Дополнительные типичные примеры клеток-хозяев млекопитающих включают клеточные линии приматов и клеточные линии грызунов, включая трансформированные клеточные линии. Также подходят обычные диплоидные клетки, клеточные штаммы, происходящие из ίη νίΙΐΌ культуры первичной ткани, а также первичных эксплантатов. Клетки-кандидаты могут быть генотипически дефицитными по селектируемому гену или могут содержать доминантно действующий селектируемый ген. Другие подходящие клеточные линии млекопитающих включают Ν2Α клетки нейробластомы мыши, НеЬа, Ь-929 клетки мыши, линии 3Т3, происходящие из мышей 8\\тзз, Ва1Ь-с или ΝΙΗ, клеточных линий хомячка ВНК или НаК, но этим не ограничиваются. Каждая из этих клеточных линий известна и доступна специалисту в области экспрессии белков.

Аналогично, в качестве подходящих клеток-хозяев полезны бактериальные клетки. Например, в области биотехнологии в качестве клеток-хозяев хорошо известны различные штаммы Е. сой (например, НВ101, ΌΗ5α, ΌΗ10 и МС1061). Различные штаммы В. зиЬййз, Рзепботопаз, другие виды ВасШиз и виды 81гер1отусез также могут быть использованы в этом способе.

Многие штаммы дрожжевых клеток, известные специалистам в данной области, также доступны в качестве клеток-хозяев для экспрессии полипептидов (Е10С)йРУУ_3-36 и (О11С)11РУУ_3-36. Предпочтительные дрожжевые клетки включают, например, 8ассйаготусез сегМзае и РкЫа раз1опз.

В дополнение, где это желательно, для экспрессии (Е10С)11РУУ_3-36 и (Э11С)кРУУ_3-36 можно использовать клеточные системы насекомых. Такие системы описаны, например, в КШз е1 а1., 1993, Вю1есйшс.|иез 14: 810-17; ЬисНо^, Сип. Орш. Вю1есЬпо1. 4: 564-72, 1993; и Ьиск1оте е1 а1., 1. Уйо1., 67: 4566-79, 1993. Предпочтительными клетками насекомых являются δί-9 и Н15 (Шуйгодеп).

Получение полипептида (Е'10С)КРУУ_3-36 и (О'1'1С)КРУУ_3-36

Линию клеток-хозяев, содержащую вектор, экспрессирующий (Е10С)11РУУ_3-36 или (Ό11Ο№¥¥₃-₃6, можно культивировать, используя стандартную среду, хорошо известную специалисту в данной области. Обычно среда будет содержать все питательные вещества, необходимые для роста и выживания этих клеток. Подходящие среды для культивирования клеток Е. сой включают, например, бульон Луриа (ЙВ) и/или ТегпПс ВгоШ (ТВ). Подходящие среды для культивирования эукариотических клеток включают среду 1640 от Возней Рагк Метопа1 1пзй1и1е (ВРМ1 1640), минимальную незаменимую среду (МЕМ) и/или модифицированную Дульбекко среду Игла (ЭМЕМ), каждая из которых может быть дополнена сывороткой и/или ростовыми факторами, если это необходимо для конкретной культивируемой клеточной линии. Подходящей средой для культур клеток насекомых является среда Грейса (Огасе), дополненная при необходимости дрожжевым экстрактом (уеаз1о1а1е), гидролизатом лактальбумина и/или фетальной телячьей сывороткой.

Обычно в качестве дополнения к среде добавляют антибиотик или другое соединение, полезное для селективного роста трансфицированных или трансформированных клеток. Предназначенное для использования соединение будет определяться селектируемым маркерным элементом, присутствующим в плазмиде, которой трансформировали клетку-хозяина. Например, когда селектируемый маркерный элемент определяет устойчивость к канамицину, соединением, добавляемым в культуральную среду, будет канамицин. Другие соединения для селективного роста включают ампициллин, тетрациклин и неомицин.

Количество продуцируемого клеткой-хозяином полипептида (Е10С)йРУ¥_3-36 или (Э11С)НРУУ_3-36 можно оценить, используя стандартные способы, известные в данной области техники. Такие способы включают вестерн-блоттинг, δΌδ-полиакриламидный гель-электрофорез, гель-электрофорез в неденатурирующих условиях, разделение с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), иммунопреципитацию и/или такие анализы активности, как анализы по связыванию ДНК со смещением в геле, но этим не ограничиваются.

- 16 011882

Если (Ε10ί’)1ιΡΥΥ_3-36 или (Ό1 Κ’)1ιΡΥΥ_3-36 разработаны для их секретирования из линии клетокхозяев. большая часть полипептида может быть обнаружена в культуральной клеточной среде. Если. однако. полипептид не секретируется из клеток-хозяев. он будет присутствовать в цитоплазме и/или в ядре (для эукариотических клеток-хозяев) или в цитозоле (для грам-отрицательных бактериальных клетокхозяев).

Что касается (Ε10Τ')1ιΡΥΥ_3-36 или (Ό11Ο)ΗΡΥΥ_3-36. находящихся в цитоплазме и/или ядре клеткихозяина (для эукариотической клетки-хозяина) или в цитозоле (для бактериальной клетки-хозяина). то внутриклеточный материал (включая тельца включения для грам-отрицательных бактерий) можно экстрагировать из клетки-хозяина с использованием любой стандартной методики. известной специалисту в данной области. Например. клетки-хозяева можно лизировать для высвобождения содержимого периплазмы/цитоплазмы с использованием пресса Френча. гомогенизации и/или обработки ультразвуком с последующим центрифугированием.

Если (Ε10ί’)1ιΡΥΥ_3-36 или (Ό1Κ’)1ιΡΥΥ_3-36 образует тельца включения в цитозоле. то эти тела зачастую могут связываться с внутренней и/или внешней клеточной мебранами. и ввиду этого будут преимущественно обнаружены в материале осадка после центрифугирования. Затем материал осадка можно обработать при экстремальных значениях рН или с использованием хаотропного агента. такого как детергент. гуанидин. производные гуанидина. мочевина или производные мочевины. в присутствии восстанавливающего агента. такого как дитиотрейтол при щелочных значениях рН или трискарбоксиэтилфосфин при кислых значениях рН. чтобы произвести высвобождение. разрушение на части и солюбилизацию телец включения. Солюбилизированные (Ε10ί’)1ιΡΥΥ_3-36 или (Ό1Κ’)1ιΡΥΥ_3-36 далее можно анализировать. используя гель-электрофорез. иммунопреципитацию или тому подобное. Если желательно выделить данный полипептид. то выделение может быть осуществлено с использованием стандартных способов. как например изложенные в данном описании и в МаШоп βί а1.. Мс111. Ет. 182: 264-75. 1990.

Если тельца включения не образуются в значительной степени по мере экспрессии (Ε10Τ')1ιΡΥΥ_3-36 или (Ό11ί.')1ιΡΥΥ_3-36. то данный полипептид будет находиться преимущественно в супернатанте после центрифугирования клеточного гомогената. Затем полипептид можно выделить из супернатанта с использованием таких способов. как способы. изложенные в данном описании.

Очистку (Ε10ί’)1ιΡΥΥ_3-36 или (Ό1 Κ’)1ιΡΥΥ_3-36 из раствора можно осуществить с использованием разнообразных методик. Если полипептид синтезирован таким образом. что он содержит метку. такую как гексагистидин 9 или другой небольшой пептид. такой как ЕБЛС (ЕаНтап Койак Со.. Наусп. СТ) или тус (ΙηνίίΓο^βη). либо на его карбоксильном. либо аминоконце. его можно очистить в одностадийном процессе путем пропускания раствора через аффинную колонку. где матрица колонки обладает высокой аффинностью к данной метке.

Например. полигистидин связывается с высокой аффинностью и специфичностью с никелем. Таким образом. для очистки можно использовать аффинную колонку с никелем (такую как никелевые колонки Οίηβοη®). См.. например. СиггсгИ ЕгоЮсоЕ ίη Мо1еси1аг В1о1оду § 10.11.8 (Ли8иЬе1 βί а1.. сй5.. Сгссп ΡιιΕ1Ы1СГ5 Шс. апй ХУйеу апй 8оп§. 1993).

В дополнение. полипептид (Ε10Τ')1ιΡΥΥ_3-36 или (Ό11ί.')1ιΡΥΥ_3-36 можно очистить посредством применения моноклонального антитела. способного к специфическому распознаванию полипептида (Ε10ί’)1ιΡΥΥ_3-36 или (Ό1Κ’)1ιΡΥΥ_3-36 и связыванию с ним.

В ситуациях. когда предпочтительна частичная или полная очистка полипептида (Ε10Τ')1ιΡΥΥ_3-36 или (Ό 11ί.')1ιΡΥΥ _3-36. то есть чтобы он был частично или по существу полностью очищен от примесей. можно использовать стандартные способы. известные специалистам в данной области техники. Такие способы включают разделение с использованием электрофореза с последующим электроэлюированием. различные типы хроматографии (аффинную. иммуноаффинную. гель-фильтрацию и ионообменную). ВЭЖХ и препаративное изоэлектрическое фокусирование (прибор/методика Борите. НоеЕег 8с1СпРПс. 81п ЕгамсБсо. СА). но этим не ограничиваются. В некоторых случаях для достижения повышенной степени чистоты можно объединять две или более методик очистки.

В данной области техники известен ряд дополнительных способов получения полипептидов. и эти способы можно использовать для получения полипептидов (Ε10С)йΡУУ_3-36 и (Ό11ί.')1ιΡΥΥ_3-36. См.. например. работу РоЬегй еί а1.. Ργόο. №111. Асай. 8ск И.8.А. 94: 12297-303. 1997. в которой описано получение белков слияния между мРНК и кодируемым ею пептидом. См. также РоЬегй. Сигг. 0ρίη. СНет. Вю1. 3: 268-73. 1999.

Способы получения пептидов или полипептидов также описаны в патентах США №№ 5763192. 5814476. 5723323 и 5817483. Способ включает получение случайных генов или их фрагментов и затем введение этих генов в клетки-хозяева. которые продуцируют один или более белков. кодируемых этими случайными генами. Клетки-хозяева далее подвергают скринингу с целью идентификации тех клонов. которые продуцируют пептиды или полипептиды. обладающие желаемой активностью. Другие способы экспрессии рекомбинантных пептидов изложены в патентах США №№ 6103495. 6210925. 6627438 и 6737250. В способе используют Е. со11 и общий секреторный путь Е. со11. Пептид подвергают слиянию с сигнальной последовательностью; таким образом. пептид помечен для секретирования.

Другой способ получения пептидов или полипептидов описан в РСТ публикации заявки на патент

- 17 011882 \νϋ 99/15650. Опубликованный способ, названный случайной активацией генной экспрессии для открытия гена, включает активацию эндогенной генной экспрессии или сверхэкспрессии гена посредством способов рекомбинации ίη кйи. Например, экспрессия эндогенного гена активируется или усиливается в результате интегрирования регуляторной последовательности в клетку-мишень, которая способна к активации экспрессии гена посредством негомологичной или неправильной рекомбинации. ДНК-мишень сначала подвергают облучению и в нее вставляют генетический промотор. В конечном счете, промотор располагается в разрыве перед геном, что инициирует транскрипцию этого гена. Это приводит к экспрессии желаемого пептида или полипептида.

Амидирование

Амидирование пептида, полученного либо синтетически, либо рекомбинантно, осуществляют под действием фермента, называемого пептидил-глицин-альфа-амидирующая монооксигеназа (РАМ). При рекомбинантном получении пептидов (Ε10Ο)ΗΡΥΥ_3-36 или (Ό11Ο)ΗΡΥΥ_3-36 с использованием бактериальной экспрессирующей системы пептиды могут быть амидированы по С-концу в результате реакции ίη νίΐΐΌ с использованием рекомбинантного фермента РАМ. Источник фермента РАМ, способы его продуцирования и очистки и способы, которые можно использовать для амидирования пептидов (Ε10Ο)ΗΡΥΥ_3-36 или (Ό11Ο)ΗΡΥΥ_3-36, описаны, например, в патентах США №№ 4708934, 5789234 и 6319685.

Селективные по отношению к (Е'10С)ЬРУУ_3-3(, и (ОЫС)ЬРУУ_3-3(, антитела

Антитела и фрагменты антител, которые специфически связывают полипептиды (Ε10ί.')1ιΡΥΥ_3-36 или (О11С)№УУ_3-36, с пэгилированием или без него по сайту цистеинового замещения (как изложено в данном описании), но селективно не связывают нативный ΗΡΥΥ_3-36, входят в объем настоящего изобретения. Антитела могут быть поликлональными, в том числе моноспецифическими поликлональными; моноклональными; рекомбинантными; химерными; гуманизированными, такими как СЭЯ-привитыми (сотр1етеп1ап1у-йе1епшптд ге§юп; гипервариабельный участок); человеческими; состоящими из одной цепи; и/или биспецифическими; а также их фрагментами; вариантами или производными. Фрагменты антител включают те части антитела, которые связываются с эпитопом на полипептиде (Ε10ί.')1ιΡΥΥ_3-36 или (□1Κ.’)1ιΡΥΥ_3-36. Примеры таких фрагментов включают РаЬ- и Р(аЬ')-фрагменты, образованные в результате ферментативного расщепления полноразмерных антител. Другие связывающие фрагменты включают фрагменты, полученные с использованием методик рекомбинантной ДНК, таких как экспрессия рекомбинантных плазмид, содержащих последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие вариабельные участки антител.

Поликлональные антитела к полипептиду (Ε10С)йΡΥ_3-36 или (Э11С)№У¥_3-36 в общем случае получают с использованием животных (например, кроликов или мышей) посредством многократных 8С или ΙΡ инъекций полипептида (Ε10С)йΡΥ¥_3-36 или (ΌΠΟίΗΡΥΥ^^ и адъюванта. Полезным может быть конъюгирование полипептида (Ε10С)йΡΥ¥_3-36 или (^11С)йΡΥ¥_3-36 с белковым носителем, который является иммуногенным в иммунизируемых видах, таким как гемоцианин морского моллюска, сывороточный альбумин, бычий тироглобулин или ингибитор трипсина из сои. Кроме этого для усиления иммунного ответа используют вызывающие агрегацию агенты, такие как квасцы. После иммунизации у животных отбирают кровь и сыворотку анализируют на титр анти-(Ε10С)йΡΥ¥_3-36 или анти-(^11С)йΡΥ¥_3-36 антител.

Моноклональные антитела к полипептидам (Ε10С)йΡΥ¥_3-36 или (^11С)йΡΥ¥_3-36 получают, используя любой способ, обеспечивающий продуцирование молекул антител непрерывными клеточными линиями в культуре. Примеры подходящих способов получения моноклональных антител включают гибридомные способы Кохлера и др. (КоЫег е! а1., №11иге 256: 495-97, 1975) и способ с использованием Вклеточных гибридом человека (Ко/Ьог ί. 1ттипо1. 133: 3001, 1984; Вгойеиг е! а1., Мопос1опа1 АпйЬойу Ρι^ικίΟι-ι Тес11пк|иек апй АррЬсайопк, 51-63 (Магсе1 Иеккег, 1пс., 1987)). Кроме того, согласно изобретению предложены гибридомные клеточные линии, продуцирующие моноклональные антитела, реакционноспособные по отношению к полипептидам (Ε^Ο^ΕΥΥ^ или (ΌΠΟΗΡΥΥ^.

Предпочтительные способы определения специфичности и аффинности моноклональных антител посредством конкурентного ингибирования могут быть найдены в Наг1оте апй Ьапе, Ап!1Ьой1ек: ЬаЬога!огу Мапиа1 (Со1й 8рппд НагЬог ЬаЬога!опек, 1989); Сштеп! ΡιόΦ^Κ ίη 1ттипо1оду (СоШдап е! а1., ейк., Огеепе ΡιιΝίκΙιίηβ Аккос. апй \νίΚ\· 1п!егкс1епсе, 1993); и Ми11ег, Ме111. Εηζуто1. 92: 589-601, 1988.

Химерные антитела по настоящему изобретению могут содержать индивидуальные Н- и/или Ь-цепи иммуноглобулинов. Предпочтительная химерная Н-цепь содержит антиген-связывающий участок, происходящий из Н-цепи антитела, не являющегося человеческим, специфичного к полипептиду (Ε10С’)11Ρ¥¥_3-36 или (ΌΠΟίΗΡΥΥ^, который соединен по меньшей мере с частью С-участка человеческой Н-цепи (Сн), такой как СН1 или СН₂. Предпочтительная химерная Ь-цепь содержит антигенсвязывающий участок, происходящий из Ь-цепи антитела, не являющегося человеческим, специфичного к полипептиду (Ε10С)йΡΥ¥_3-36 или (ΌΠΟίΗΡΥΥ^^, который соединен по меньшей мере с частью С-участка человеческой Ь-цепи (С_ь). Химерные антитела и способы их получения известны в данной области техники. См. СаЬ111у е! а1., Ριό^ ИаИ. Асай. 8сЕ И.8.А. 81: 3273-77, 1984; Моткоп е! а1., Ριό^ №111. Асай. 8с1. И.8.А. 81: 6851-55, 1984; ВоиЬаппе е! а1., №11иге 312: 643-46, 1984; №иЬегдег е! а1., №11иге 314: 268-70, 1985; Ь1и е! а1., Ριό^ №111. Асай. 8сЕ И.8.А. 84: 3439-43, 1987; и Наг1оте апй Ьапе, выше.

- 18 011882

Селективно связывающие агенты, имеющие химерные Н-цепи и Ь-цепи с одинаковой или различной специфичностью по связыванию вариабельных участков, также можно получить, объединяя соответствующим образом индивидуальные полипептидные цепи способами, известными в данной области техники. См., например, Сиггеи! Гго1осо18 ш Μο1еси1а^ Βώ^^ (АикиЬе1 е! а1., ейк., Сгееи ГцЫЦкегк Шс. аий \УПеу и 8оик, 1994) и Наг1ос аий Ьаие, выше. Используя этот подход, клетки-хозяева, экспрессирующие химерные Н-цепи (или их производные), культивируют отдельно от клеток-хозяев, экспрессирующих химерные Ь-цепи (или их производные), и иммуноглобулиновые цепи извлекают по отдельности, а затем объединяют. Альтернативно, клетки-хозяева можно культивировать совместно и предоставлять цепям возможность для спонтанной ассоциации в культуральной среде с последующим извлечением собранного иммуноглобулина.

В другом воплощении моноклональное антитело по изобретению является «гуманизированным» антителом. Способы гуманизации антител, не являющихся человеческими, хорошо известны в данной области техники. См. патенты США №№ 5585089 и 5693762. В общем случае гуманизированное антитело содержит один или более аминокислотных остатков, введенных в него из источника, не являющегося человеком. Гуманизацию можно осуществить, например, используя способы, описанные в данной области техники (1оиек е! а1., 1986, №1иге 321: 522-25; Кзесктаии е! а1., 1998, №11иге 332: 323-27; УеШоеуеи е! а1., 1988, 8с1еисе 239: 1534-36), посредством замещения соответствующих участков антитела человека по меньшей мере частью гипервариабельного участка (СОК) антитела грызунов.

Методики создания рекомбинантных ДНК-версий антиген-связывающих участков молекул антител (то есть, РаЬ-фрагментов или фрагментов вариабельных участков), которые заменяют генерацию моноклональных антител, находятся в пределах объема настоящего изобретения. Согласно этой методике молекулы информационной РНК, кодирующие антитело, экстрагируют из клеток иммунной системы, взятых у иммунизированного животного, и транскрибируют в кДНК. Эту кДНК затем клонируют в бактериальную экспрессирующую систему. В одном из примеров такой методики, подходящей для практического применения по этому изобретению, используют векторную систему бактериофага лямбда, имеющую лидерную последовательность, которая заставляет экспрессируемый РаЬ-белок мигрировать в периплазматическое пространство (между бактериальной клеточной мембраной и клеточной стенкой) или секретироваться. Можно быстро производить и подвергать скринингу большое количество функциональных РаЬ-фрагментов из тех, которые связывают антиген. Такие (Ε10ί’)1ιΡΥΥ_3-36- или (Ό1Κ’)1ιΡΥΥ_3-36связывающие молекулы (РаЬ-фрагменты со специфичностью к полипептидам (Ε10С)кΡΥΥ_3-36 или (Ό11ί.')1ιΡΥΥ_3-36) конкретно охватываются термином «антитело», как он использован в данном описании.

Кроме того, в объем изобретения включены методики, разработанные для получения химерных антител посредством сплайсинга генов молекулы мышиных антител соответствующей антигенной специфичности с генами молекулы человеческих антител соответствующей биологической активности (такой как способность активировать систему комплемента человека и опосредовать антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (АЭСС)). Μο^^^κοи е! а1., Ьгос. Асай. 8сР И.8.А. 81: 6851-55, 1984; №иЬегдег е! а1., №11иге 312: 604-08, 1984. Селективно связывающие агенты, такие как антитела, получаемые в соответствии с этой методикой, входят в объем данного изобретения.

Очевидно, что данное изобретение не ограничено мышиными или крысиными моноклональными антителами; в действительности можно использовать человеческие антитела. Такие антитела можно получить с использованием человеческих гибридом.

Таким образом, полностью человеческие антитела, которые связывают полипептиды (Ε100)ΗΡΥΥ₃₃₆ или (Ό11Ο)ΗΡΥΥ_3-36, включены в данное изобретение. Такие антитела получают посредством иммунизации (Ε10ί.')1ιΡΥΥ_3-36- или (^11С)кΡΥΥ_3-36-антигеном (возможно конъюгированным с носителем) трансгенных животных (например мышей), способных продуцировать репертуар человеческих антител в отсутствие продуцирования эндогенных иммуноглобулинов. См., например, 1акоЬоу1!к е! а1., Ггос. Ν!1. Асай. 8с1. И.8.А. 90: 2551-55, 1993; 1акоЬоуйк е! а1., ΝοΙιιιό 362: 255-58, 1993; Β^иддетаиη е! а1., Υеа^ ш Штиио. 7: 33-40, 1993.

Кроме того, в данное изобретение включены человеческие антитела, которые связывают полипептиды (Ε10ί.')1ιΡΥΥ_3-36 или (Ό11ί.')1ιΡΥΥ_3-36. Используя трансгенных животных (например мышей), способных продуцировать репертуар человеческих антител в отсутствие продуцирования эндогенных иммуноглобулинов, такие антитела получают посредством иммунизации антигеном полипептида (Ε10ί.')1ιΡΥΥ_3-36 или (Ό11ί.')1ιΡΥΥ_3-36 (то есть, антигеном, имеющим по меньшей мере 6 соседних аминокислот), возможно конъюгированным с носителем. См., например, 1акоЬоу1!к е! а1., 1993 выше; 1акоЬоу1!к е! а1., №1иге 362: 255-58, 1993; Β^идде^таиη е! а1., 1993, выше. В одном из способов таких трансгенных животных получают, выводя в них из строя эндогенные локусы, кодирующие тяжелую и легкую иммуноглобулиновые цепи, и вводя в их геном локусы, кодирующие белки тяжелой и легкой цепи человека. Частично модифицированных животных, то есть, имеющих не полный комплект модификаций, далее скрещивают для получения животного, имеющего все желаемые модификации иммунной системы. При введении иммуногена эти трансгенные животные продуцируют антитела с аминокислотными последовательностями человека (в большей мере, чем например мыши), включая вариабельные участки, которые являются иммуноспецифичными для этих антигенов. См. публикации заявок на патент РСТ №№ \¥О

- 19 011882

96/33735 и АО 94/02602. Дополнительные способы описаны в патенте США № 5545807, публикациях заявок на патент РСТ №№ АО 91/10741 и АО 90/04036, в патенте ЕР № 0546073 В1 и публикации заявки на патент РСТ № АО 92/03918. Человеческие антитела также можно получить путем экспрессии рекомбинантной ДНК в клетках-хозяевах или путем экспрессии в гибридомных клетках, как изложено в данном описании.

В альтернативном воплощении человеческие антитела также могут быть получены из библиотек фагового дисплея (НоодепЬоот е! а1., I. Мо1. Вю1. 227: 381, 1991; Магкк е! а1., I. Мо1. Вю1. 222: 581, 1991). Эти процессы имитируют иммунную селекцию посредством проявления репертуаров антител на поверхности нитчатого бактериофага с последующей селекцией фага на основе их связывания с выбранным антигеном. Одна из таких методик описана в публикации заявки на патент РСТ № АО 99/10494, в которой описано выделение высокоаффинных и функциональных агонистических антител к МБЬ- и тккрецепторам с использованием такого подхода.

Химерные, СОК-привитые и гуманизированные антитела обычно получают рекомбинантными способами. Нуклеиновые кислоты, кодирующие эти антитела, вводят в клетки-хозяева и экспрессируют, используя материалы и методики, изложенные в данном описании и известные в данной области техники. В предпочтительном воплощении антитела получают в клетках-хозяевах млекопитающего, таких как СНО-клетки. Моноклональные (например, человеческие) антитела можно получить путем экспрессии рекомбинантной ДНК в клетках-хозяевах или путем экспрессии в гибридомных клетках, как изложено в данном описании.

АнтиДЕШС^УУз^ и анти-(П11С)№¥¥з_-з₆ антитела по изобретению можно использовать в любом известном способе анализа, таком как анализы на конкурентное связывание, прямой и непрямой сэндвич-анализы и иммунопреципитационные анализы (8о1а, Мопос1опа1 апйЬоб1е8: Мапиа1 о£ Тес11пк|ие8. 147-158 (СКС Гге55. 1пс., 1987)), для детектирования и количественного определения полипептидов (Ε10Ο)1ιΡΥΥ_3-36 и (ΌΠΠ^ΥΥ^^, а также для очистки полипептидов. Антитела будут связывать полипептиды или (Ό11ί.')1ιΡΥΥ_3-36 с аффинностью, соответствующей используемому способу анализа.

ΡΥΥ-агонисты по изобретению могут быть представлены в форме фармацевтически приемлемых солей присоединения кислоты для применения в относящемся к способу аспекте изобретения. Репрезентативные фармацевтически приемлемые соли присоединения кислоты настоящих соединений включают соли: гидрохлорид, гидробромид, гидроиодид, нитрат, сульфат, бисульфат, фосфат, кислый фосфат, изоникотинат, ацетат, лактат, салицилат, цитрат, кислый цитрат, тартрат, пантотенат, битартрат, аскорбат, сукцинат, малеат, гентизинат, фумарат, глюконат, глюкуронат, сахарат, формиат, бензоат, глутамат, метансульфонат, этансульфонат, бензолсульфонат, паратолуолсульфонат, памоат, пальмитат, малонат, стеарат, лаурат, малат, борат, гексафторфосфат, нафтилат, глюкогептаноат, лактобионат и лаурилсульфонат и тому подобное. Соли не-пэгилированных вариантов не обязательно должны быть фармацевтически приемлемыми, если данный вариант предполагают использовать в качестве промежуточного соединения при получении конъюгата ПЭГ и варианта ΡΥΥ_3-36.

ΡΥΥ-агонисты по настоящему изобретению в общем случае будут вводить в форме фармацевтической композиции. Фармацевтическая композиция может, например, быть в форме, подходящей для перорального введения (например, в форме таблетки, капсулы, пилюли, порошка, раствора, суспензии), для парентеральной инъекции (например, в форме стерильного раствора, суспензии или эмульсии), для интраназального введения (например, в форме аэрозольных капель и так далее), для ректального введения (например, в форме суппозитория) или для трансдермального введения (например, в форме пластыря). Фармацевтическая композиция может быть в стандартных лекарственных формах, подходящих для разового введения точных дозировок. Фармацевтическая композиция будет включать в себя традиционный фармацевтический носитель и ΡΥΥ-агонист по изобретению в качестве активного ингредиента. В дополнение, она может включать другие фармацевтические агенты, адъюванты и так далее.

Способы приготовления различных фармацевтических композиций биологически активных пептидов хорошо известны в фармацевтических областях науки. Например, см. публикацию заявки на патент США № 2005/0009748 (для перорального введения) и 2004/0157777, 2005/0002927 и 2005/0215475 (для введения через слизистые оболочки, например, интраназального или трансбуккального введения). См. также Кетшд1оп: Тке Ρ^ас!^се о£ Ρйа^тасу, Ырртсо!! А1Шат§ апб А11кт§, ВаШтоге, МО, 20^4Ь еб. 2000.

ΡΥΥ-агонисты по данному изобретению можно применять вместе с другими фармацевтическими агентами для лечения болезненных статусов или состояний, рассмотренных в данном описании. Следовательно, способы лечения, включающие введение соединений по настоящему изобретению в комбинации с другими фармацевтическими агентами, также предложены согласно настоящему изобретению.

Подходящие фармацевтические агенты, которые можно применять в комбинации с ΡΥΥагонистами по настоящему изобретению, включают другие средства против ожирения, такие как антагонисты каннабиноидных рецепторов-1 (СВ-1) (такие как римонабант), ингибиторы 11 β-гидроксистероиддегидрогеназы-1 (11β-Η8Ό, тип 1), агонисты МСК-4 (рецептор-4 меланокортина), агонисты холецистокинина-А (ССК-А), ингибиторы обратного захвата моноаминов (такие как сибутрамин), симпатомимети

- 20 011882 ческие агенты, агонисты в₃-адренергических рецепторов, агонисты дофаминовых рецепторов (такие как бромкриптин), аналоги рецепторов меланоцит-стимулирующего гормона, агонисты 5НТ2с-рецептора, антагонисты меланин-концентрирующего гормона, лептин, аналоги лептина, агонисты лептинового рецептора, антагонисты галанина, ингибиторы липазы (такие как тетрагидролипстатин, то есть орлистат), аноректические агенты (такие как агонист бомбезина), антагонисты рецептора нейропептида-Υ (например, антагонисты рецептора Ν₽Υ Υ5), тиреомиметические агенты, дегидроэпиандростерон или его аналог, агонисты или антагонисты глюкокортикоидного рецептора, антагонисты орексинового рецептора, агонисты рецепторов глюкагоноподобного пептида-1, цилиарные нейротрофические факторы (такие как Ахокте™, поставляемый Кедепегоп Рйагтасеийса1к, 1пс., ТапуЮ^п, ΝΥ и Ргос1ег & СатЬ1е Сотрапу, Стаппай, ОН), ингибиторы агути(адоий)-связанного белка (АСКР) человека, антагонисты грелинового рецептора, антагонисты или обратные агонисты рецепторов гистамина 3, агонисты рецепторов нейромедина и, ингибиторы МТР/АроВ (микросомальный белок-переносчик триглицеридов /аполипопротеин В) (например, интестинально действующие ингибиторы МТР, такие как дирлотапид) и тому подобное.

Предпочтительные средства против ожирения для применения в комбинации с РΥΥ-агонистами по настоящему изобретению включают антагонисты СВ-1-рецептора, интестинально действующие ингибиторы МТР, агонисты ССК-А, агонисты 5НТ2с-рецептора, антагонисты рецептора ΝΓΥ Υ5, орлистат и сибутрамин. Предпочтительные антагонисты СВ-1-рецептора для применения в способах по настоящему изобретению включают: римонабант (δΚ141716Α, также известный под торговой маркой Асотрйа™), его можно приобрести у δаηоίϊ-δуηΐйе1аЬо или можно получить, как описано в патенте США № 5624941; №(пиперидин-1-ил)-1-(2,4-дихлорфенил)-5-(4-иодфенил)-4-метил-1Н-пиразол-3-карбоксамид (АМ251), поставляемый Тоспк™, ЕШкуШе, МО; [5-(4-бромфенил)-1-(2,4-дихлор-фенил)-4-этил-Ы-(1пиперидинил)-1Н-пиразол-3-карбоксамид] (δΚ147778), который можно получить, как описано в патенте США № 6645985; №(пиперидин-1-ил)-4,5-дифенил-1-метилимидазол-2-карбоксамид, №(пиперидин-1ил)-4-(2,4-дихлорфенил)-5-(4-хлорфенил)-1-метилимидазол-2-карбоксамид, №(пиперидин-1-ил)-4,5-ди(4-метилфенил)-1-метилимидазол-2-карбоксамид, №циклогексил-4,5-ди-(4-метилфенил)-1-метилимидазол-2-карбоксамид, №(циклогексил)-4-(2,4-дихлорфенил)-5-(4-хлорфенил)-1 -метилимидазол-2-карбоксамид и №(фенил)-4-(2,4-дихлорфенил)-5-(4-хлорфенил)-1-метилимидазол-2-карбоксамид, который можно получить, как описано в публикации заявки на патент РСТ № АО 03/075660; соль гидрохлорид, мезилат и безилат амида 1-[9-(4-хлорфенил)-8-(2-хлор-фенил)-9Н-пурин-6-ил]-4-этиламинопиперидин-4карбоновой кислоты, которую можно получить, как описано в публикации заявки на патент США № 2004/0092520; амид 1-[7-(2-хлорфенил)-8-(4-хлор-фенил)-2-метилпиразоло[1,5-а][1,3,5]триазин-4-ил]3-этиламино-азетидин-3-карбоновой кислоты и амид 1-[7-(2-хлорфенил)-8-(4-хлорфенил)-2метилпиразоло[1,5-а][1,3,5]триазин-4-ил]-3-метиламиноазетидин-3-карбоновой кислоты, которые можно получить, как описано в публикации заявки на патент США № 2004/0157839; 3-(4-хлорфенил)-2-(2хлорфенил)-6-(2,2-дифторпропил)-2,4,5,6-тетрагидропиразоло[3,4-с]пиридин-7-он, который можно получить, как описано в публикации заявки на патент США № 2004/0214855; 3-(4-хлорфенил)-2-(2хлорфенил)-7-(2,2-дифторпропил)-6,7-дигидро-2Н,5Н-4-окса-1,2,7-триазаазулен-8-он, который можно получить, как описано в публикации заявки на патент США № 2005/0101592; 2-(2-хлорфенил)-6-(2,2,2трифторэтил)-3-(4-трифторметилфенил)-2,6-дигидропиразоло[4,3-й]пиримидин-7-он, который можно получить, как описано в публикации заявки на патент США № 2004/0214838; ^)-4-хлор-И-{[3-(4хлорфенил)-4-фенил-4,5-дигидро-пиразол-1-ил]метиламино-метилен}-бензолсульфонамид (δΕν-319) и ^)-И-{[3-(4-хлорфенил)-4-фенил-4,5-дигидропиразол-1-ил]-метиламинометилен}-4-трифторметилбензолсульфонамид (δΕν-326), которые можно получить, как описано в публикации заявки на патент РСТ № АО 02/076949; №пиперидино-5-(4-бромфенил)-1-(2,4-дихлорфенил)-4-этилпиразол-3карбоксамид, который можно получить, как описано в патенте США № 6432984; 1-[бис-(4хлорфенил)метил]-3-[(3,5-дифторфенил)метансульфонилметилен]азетидин, который можно получить, как описано в патенте США № 6518264; 2-(5-(трифторметил)пиридин-2-илокси)-Ы[-(4-(4-хлорфенил)-3(3-цианофенил)бутан-2-ил)-2-метилпропанамид, который можно получить, как описано в публикации заявки на патент РСТ № АО 04/048317; 4-{[6-метокси-2-(4-метоксифенил)-1-бензофуран-3ил]карбонил}бензнитрил (ΕΥ-320135), который можно получить, как описано в патенте США № 5747524; 1-[2-(2,4-дихлорфенил)-2-(4-фторфенил)бензо[1,3]диоксол-5-сульфонил]пиперидин, который можно получить, как описано в АО 04/013120; и [3-амино-5-(4-хлорфенил)-6-(2,4-дихлорфенил)фуро[2,3-Ь]пиридин-2-ил]фенилметанон, который можно получить, как описано в публикации заявки на патент РСТ № АО 04/012671.

Предпочтительные интестинально действующие ингибиторы МТР для применения в комбинациях, фармацевтических композициях и способах по изобретению включают дирлотапид ((δ)-Ν-{2[бензил(метил)амино]-2-оксо-1-фенилэтил}-1-метил-5-[4'-(трифторметил)[1,1-бифенил]-2-карбоксамидо]1Н-индол-2-карбоксамид) и (карбамоилфенилметил)амид 1-метил-5-[(4'-трифторметил-бифенил-2карбонил)амино]-1Н-индол-2-карбоновой кислоты, оба они могут быть получены с использованием способов, описанных в патенте США № 6720351; (пентилкарбамоилфенилметил)амид (δ)-2-[(4'трифторметилбифенил-2-карбонил)амино]хинолин-6-карбоновой кислоты, {[(4-фторбензил)метил- 21 011882 карбамоил] фенилметил}амид (§)-2-[(4'-трет-бутил-бифенил-2-карбонил)амино]хинолин-6-карбоновой кислоты и [(4-фторбензилкарбамоил)фенилметил]амид (§)-2-[(4'-трет-бутил-бифенип-2-карбонил)амино]хинолин-6-карбоновой кислоты, все они могут быть получены, как описано в публикации заявки на патент США № 2005/0234099А1, (-)-4-[4-[4-[4-[[(2§,4К)-2-(4-хлорфенил)-2-[[(4-метил-4Н-1,2,4триазол-3 -ил)сульфанил]метил-1,3-диоксолан-4-ил] метокси] фенил] пиперазин-1 -ил] фенил]-2-(1К)-1метилпропил]-2,4-дигидро-3Н-1,2,4-триазол-3-он (также известный как Мйта!ар1бе или К103757), который можно получить, как описано в патентах США №№ 5521186 и 5929075; и имплитапид (ΒΑΥ 139952), который можно получить, как описано в патенте США № 6265431. Наиболее предпочтительным является дирлотапид, митратапид, (пентилкарбамоил-фенилметил)амид (§)-2-[(4'-трифторметилбифенил-2-карбонил)амино]хинолин-6-карбоновой кислоты, {[(4-фторбензил)метилкарбамоил]фенилметил}амид (§)-2-[(4'-трет-бутилбифенил-2-карбонил)амино]хинолин-6-карбоновой кислоты или [(4фторбензилкарбамоил)фенилметил]амид (§)-2-[(4'-трет-бутилбифенил-2-карбонил)амино]хинолин-6карбоновой кислоты.

Предпочтительные антагонисты ΝΡΥ Υ5-рецептора включают 2-оксо-Ы-(5фенилпиразинил)спиро[изобензофуран-1(3Н),4'-пиперидин]-1'-карбоксамид, который можно получить, как описано в публикации заявки на патент США № 2002/0151456; и 3-оксо-Ы-(5-фенил-2-пиразинил)спиро [изобензофуран-1 (3Н),4'-пиперидин]-1'-карбоксамид; 3 -оксо-Ы-(7-трифторметилпиридо [3,2Ь]пиридин-2-ил)спиро-[изобензофуран-1 (3Н),4'-пиперидин]-1 '-карбоксамид; Ν-[5-(3 -фторфенил)-2пиримидинил]-3-оксоспиро-[изобензофуран-1(3Н),[4'-пиперидин]-1'-карбоксамид; транс-3'-оксо-Ы-(5фенил-2-пиримидинил)]спиро[циклогексан-1,1'(3'Н)-изобензофуран]-4-карбоксамид; транс-3'-оксо-Ы-[1(3-хинолил)-4-имидазолил]спиро [циклогексан-1,1'(3'Н)-изобензофуран]-4-карбоксамид; транс-3 -оксо-Ν(5-фенил-2-пиразинил)спиро[4-азаизо-бензофуран-1(3Н), 1'-циклогексан]-4'-карбоксамид; транс-Ν-[5-(3фторфенил)-2-пиримидинил]-3-оксоспиро[5-азаизобензофуран-1(3Н), 1'-циклогексан]-4'-карбоксамид; транс-Ы[-[5-(2-фторфенил)-2-пиримидинил]-3 -оксоспиро [5-азаизобензофуран-1(3Н), 1 '-циклогексан]-4'карбоксамид; транс-Ы-[1-(3,5-дифторфенил)-4-имидазолил]-3-оксоспиро[7-азаизобензофуран-1(3Н), 1'циклогексан]-4'-карбоксамид; транс-3 -оксо-Ы-(1-фенил-4-пиразолил)спиро [4-азаизобензофуран-1 (3Н), 1 'циклогексан]-4'-карбоксамид; транс-Ы-[1-(2-фторфенил)-3-пиразолил]-3-оксоспиро[6-азаизобензофуран1(3 Н), 1'-циклогексан]-4'-карбоксамид; транс-3 -оксо-Ы-( 1-фенил-3-пиразолил)спиро [6-азаизобензофуран1(3Н), 1'-циклогексан]-4'-карбоксамид и транс-3-оксо-Ы-(2-фенил-1,2,3-триазол-4-ил)спиро[6азаизобензофуран-1(3Н), 1'-циклогексан]-4'-карбоксамид, все они могут быть получены, как описано в публикации заявки на патент РСТ № У О 03/082190; а также их фармацевтически приемлемые соли и сложные эфиры. Все перечисленные выше патенты США и публикации включены в данное описание посредством ссылки.

В аспекте изобретения, относящемся к способам, ΡΥΥ-агонист по изобретению, сам по себе или в комбинации с одним или более чем одним другим фармацевтическим агентом, периферически вводят субъекту по отдельности или вместе с любым из традиционных способов периферического введения, известных в данной области техники. Соответственно, ΡΥΥ-агонист или комбинацию можно вводить субъекту парентерально (например, внутривенно, внутрибрюшинно, внутримышечно или подкожно), интраназально, перорально, сублингвально, трансбуккально, посредством ингаляции (например, в виде аэрозоля), ректально (например, в виде суппозитория) или трансдермально. Парентеральное введение является предпочтительным способом введения, а подкожное введение является предпочтительным способом парентерального введения.

Композиции, подходящие для парентеральной инъекции, в общем случае включают фармацевтически приемлемые стерильные водные или неводные растворы, дисперсии, суспензии или эмульсии и стерильные порошки для восстановления в стерильных инъекционных растворах или дисперсиях. Примеры подходящих водных и неводных носителей или разбавителей (включая растворители и наполнители) включают воду, этанол, полиолы (пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, глицерин и тому подобное), их подходящие смеси, триглицериды, включая растительные масла, такие как оливковое масло, и сложные органические эфиры для инъекций, такие как этилолеат.

Эти композиции для парентеральной инъекции также могут содержать такие эксципиенты, как консерванты, увлажняющие, солюбилизирующие, эмульгирующие и диспергирующие агенты. Предотвращение композиций от микробного заражения может быть достигнуто с использованием различных антибактериальных и противогрибковых агентов, например, парабенов, хлорбутанола, фенола, сорбиновой кислоты и тому подобного. Также бывает желательно включать агенты, придающие изотоничность, например, сахара, хлорид натрия и тому подобное. Пролонгированное всасывание фармацевтических композиций для инъекции может быть вызвано посредством применения агентов, обладающих способностью к замедлению всасывания, например, моностеарата алюминия и желатина.

ΡΥΥ-агонисты по настоящему изобретению будут введены субъекту в дозировке, изменяющейся в зависимости от ряда факторов, включая способ введения, возраст и массу субъекта, тяжесть подвергаемого лечению заболевания, состояния или расстройства и фармакологическую активность вводимого ΡΥΥ-агониста. Определение диапазона дозировок и оптимальных дозировок для конкретного пациента определяется специалистом обычной квалификации в данной области техники.

- 22 011882

РУУ-агонисты по настоящему изобретению для парентерального введения можно вводить субъекту-человеку с уровнями дозировок в диапазоне от приблизительно 0,01 мкг/кг до приблизительно 10 мг/кг/доза в режиме дозирования из расчета на не-пэгилированный вариант. Например, для 30К мПЭГмалеимид-(Е10С)1РУУ3-36 парентеральный уровень дозирования будет находиться в диапазоне от приблизительно 0,01 мкг/кг до приблизительно 10 мг/кг/доза в режиме дозирования из расчета на (Е10С)1РУУ3-36, предпочтительно в диапазоне от приблизительно 0,05 мг/кг до приблизительно 1,0 мг/кг/доза, или приблизительно от 0,05 или 0,1 мг/кг до приблизительно 1,0 мг/кг/доза, или приблизительно от 0,05 или 0,1 мг/кг до приблизительно 0,3 или 0,5 мг/кг/доза. Например, доза 85 мг 30К мПЭГмалеимид-(Е10С)йРУУ_3-36, который имеет молекулярную массу приблизительно 34024 Да (30 кДа ПЭГ плюс 4024, молекулярная масса не-пэгилированного пептида), эквивалентна 10 мг из расчета на непэгилированный (Е10С)йРУУ _3-36. Режим дозирования может составлять одну или более доз в сутки, предпочтительно перед приемом пищи, или, в особенности для 30К мПЭГ-малеимид-(Е10С)йРУУ_3-36 или 20К мПЭГ-малеимид-(Е10С)1РУУ_3-36, предпочтительным режимом дозирования будет 2 или 3 раза в неделю, или один раз в неделю, или один раз каждые 10-14 суток.

Воплощения настоящего изобретения проиллюстрированы следующими далее примерами. Следует понимать, однако, что воплощения по изобретению не ограничиваются конкретными подробностями этих примеров, поскольку специалисту в данной области техники будут известны или очевидны в свете настоящего описания и прилагаемой формулы изобретения и другие их варианты. Все цитируемые в данном описании ссылки включены таким образом посредством ссылки.

Примеры

Пример 1. Линейный 30К и 20К мПЭГ-малеимид-(Е10С)йрРУУ_3-36

В этом примере представлено получение, по существу, гомогенного монопэгилированного (Е10С)йРУУ_3-36 с использованием мПЭГ (30К или 20К), присоединенного к остатку 10.

(а) Получение (Е10С)1РУУ3-36 (Е10С)РУУ_3-36 синтезировали твердофазным способом, используя Етос-стратегию с активацией гексафторфосфатом 2-(1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония (НВТИ) (Еак1тос; циклы по 0,15 ммоль), используя автоматический пептидный синтезатор (модель 433А; Аррйеб Вюкук1етк, Еок1ег Сйу, СА). В качестве защитных групп боковых цепей использовали Тг1 (тритил, или триметилфенил) для Аки, С1п, Сук и Н1к; 1Ви (трет-бутил) для 8ег, Тйг и Туг; Вос для Ьук; О1Ви (трет-бутокси) для Акр и С1и; и РЬЕ для Агд. Отщепление пептида от смолы завершали с использованием смеси 9 мл трифторуксусной кислоты (ТЕА), 0,5 г фенола, 0,5 мл Н₂О, 0,5 мл тиоанизола и 0,25 мл 1,2-этандитиола при комнатной температуре в течение 4 ч. Пептид осаждали в охлажденном во льду этиловом эфире и промывали этиловым эфиром, растворяли в ΌΜ8Ο и очищали обращенно-фазовой ВЭЖХ на колонке Vа1е^к ЭеЙарак С18, 15 мкм, 100А, 50x300 мм (внутренний диаметр (ГО)) (№ по каталогу VАТ011801, ’№а!егк, МИГогб, МА), используя линейный градиент от смеси 100% растворителя А: 0% растворителя В до смеси 70% растворителя А:30% растворителя В в течение 30 мин при скорости потока 80 мл/мин. Растворитель А представляет собой водный 0,1%-ный раствор ТЕА (трифторуксусная кислота). Растворитель В представляет собой 0,1%-ный раствор ТЕА в ацетонитриле. Молекулярную массу очищенного пептида подтверждали с использованием Е81-М8 (М_Ауд=4024), а чистоту оценивали по обращенно-фазовой ВЭЖХ (фиг. 1).

(б) Получение конюъгата линейный 30К мПЭГ-малеимид-(Е10С)йРУУ_3-36

Линейный мПЭГ-малеимидный реагент с молекулярной массой (ΜΨ) приблизительно 30000 (8ипЬпдй1 МЕ-300МА, ΝΟΡ Согрогайоп, Токуо, 1арап) подвергали избирательному сочетанию с (Е10С)1РУУ3-36 по сульфгидрильной группе цистеина в остатке 10. Линейный 30К мПЭГ-малеимид, растворенный в 20 мМ НЕРЕ8 (81дта Сйет1са1, 81. Ьошк, МО) рН 7,0 или, альтернативно, в 20 мМ ацетате натрия (81дта Сйет1са1, 81. Ьошк, МО) рН 4,5, немедленно приводили во взаимодействие с пептидом (Е 10С)йРУУ_3-36 путем непосредственного добавления пептида с получением концентрации пептида 1 мг/мл и относительного молярного соотношения мПЭГ:(Е10С)йРУУ_3-36 приблизительно 1:1. Реакции проводили в темноте при комнатной температуре в течение 0,5-24 ч. Реакции в НЕРЕ8 рН 7,0 останавливали разбавлением в 20 мМ ацетате натрия, рН 4,5, для последующей очистки катионообменной хроматографией. Реакционные смеси в 20 мМ ацетате натрия, рН 4,5, наносили непосредственно на колонку для катионообменной хроматографии. Продукты реакции оценивали по 8ЕС-ВЭЖХ (фиг. 2).

(в) Очистка конъюгата линейный 30К мПЭГ-малеимид-(Е10С)йРУУ_3-36

Пэгилированные структуры (Е10С)йРУУ_3-36 очищали из реакционной смеси до чистоты >95%, используя одну стадию ионообменной хроматографии. Монопэгилированный (Е10С)1 РУУ3-36 очищали от немодифицированного (Е10С)1РУУ3-36 и структур большей молекулярной массы, используя катионообменную хроматографию. Типичную реакционную смесь линейного 30К мПЭГ-малеимида и (Е10С)йРУУ_3-36 (10 мг белка), которая описана выше, фракционировали на колонке 8Р-8ерйагоке Нйгар (5 мл) (Атегкйат Рйагтааа Вю1есй, СЕ Неаййсаге, Р1кса1а^ау, N1), уравновешенной 20 мМ ацетатом натрия, рН 4,5 (буфер А). Реакционную смесь разбавляли (7Х) буфером А и наносили на колонку при скорости потока 2,5 мл/мин. Колонку промывали буфером А в объеме, равном 5-10 объемам колонки. После этого из колонки элюировали различные структуры (Е10С)1РУУ3-36 в объеме, равном 20 объемам

- 23 011882 колонки, с использованием линейного 0-100 мМ градиента №С1. Элюат регистрировали по поглощению на 280 нм (А₂₈₀) и собирали фракции соответствующего размера. Фракции объединяли по степени пэгилирования, как оценивали по ©8Ό8-ΡΑΟΕ (фиг. 3). Очищенный пул затем концентрировали до 0,5-5 мг/мл в концентраторе СепЕпргер 3 (Ат1соп Тес1то1оду Согрогайоп, ЖйЬЬогоидЬ, ΜΑ) или, альтернативно, используя концентратор У1уакрш 10К (У1уакс1епсе 8аг(опик Сгоир, Наппоуег, Сегтапу). Концентрацию белка в очищенном пуле определяли путем сравнения площади пика обращенно-фазовой (ОФ) ВЭЖХ со стандартной кривой для ΡΥΥ3-36 (не показано) или, альтернативно, концентрацию в очищенном пуле определяли по поглощению на 280 нм, используя экспериментально полученный коэффициент экстинкции. С использованием 8ЕС-ВЭЖХ получали профиль очищенного пула пэгилированного (Ε10С)кΡУУз_-з₆, который показан на фиг. 6.

(г) Получение конъюгата линейный 20К мПЭГ-малеимид-(Ε10С)ЬΡУУз_-з₆

Линейный мПЭГ-малеимидный реагент с Μν приблизительно 20000 ФипЬгфЫ МЕ-200МА, ΝΟΡ Согрогайоп) подвергали избирательному сочетанию с (Ε10Ο1ιΡΥΥ_3-36 по сульфгидрильной группе цистеина в остатке 10. Линейный 20К мПЭГ-малеимид, растворенный в 20 мМ ацетате натрия (81дта СЬетка1, 8ΐ. Ьошк, МО) рН 4,5, непосредственно приводили во взаимодействие с пептидом (Ε10С)ЬΡУУз_-з₆ путем прямого добавления пептида с получением концентрации пептида 1 мг/мл и относительного молярного соотношения мПЭГ:(Ε10С)ЬΡУУз_-з₆ приблизительно 1,3:1. Реакции проводили в темноте при комнатной температуре в течение 60 мин, затем 16 ч при 4°С. Реакционные смеси в 20 мМ ацетате натрия, рН 4,5, наносили непосредственно на колонку для катионообменной хроматографии. Продукты реакции оценивали по 8ЕС-ВЭЖХ.

(д) Очистка конъюгата линейный 20К мПЭГ-малеимид-(Ε10С)ЬΡУУз_-з₆

Пэгилированные структуры (Ε10С)ЬΡУУз_-з₆ очищали из реакционной смеси до чистоты >95%, используя одну стадию ионообменной хроматографии. Монопэгилированный (Ε10С)ЬΡУУз_-з₆ отделяли от свободного ПЭГ, немодифицированного (Ε10С)ЬΡУУз_-з₆ и структур большей молекулярной массы, используя катионообменную хроматографию. Типичную реакционную смесь линейного 20К мПЭГмалеимида и (Ε10С)ЬΡУУз_-з₆ (20 мг белка), которая описана выше, фракционировали на колонке 8Ρ8ерЬагоке Нйгар (5 мл) (АтегкЬаш ΡЬа^шас^а ВшЕесЬ, СЕ Неа1ЕЬсаге), уравновешенной 20 мМ ацетатом натрия, рН 4,5 (буфер А). Реакционную смесь наносили на колонку при скорости потока 1,0 мл/мин. Колонку промывали буфером А в объеме, равном 4 объемам колонки, при скорости потока 2,5 мл/мин. После этого из колонки элюировали различные структуры (Ε10С)ЬΡУУз_-з₆ в объеме, равном 25 объемам колонки, с использованием линейного 0-200 мМ градиента №1С1 при скорости потока 2,5 мл/мин. Элюат регистрировали по поглощению на 280 нм (А280) и собирали фракции соответствующего размера. Фракции объединяли по степени пэгилирования, как оценивали по 8ЕС-ВЭЖХ. Очищенный пул затем концентрировали до 0,5-5 мг/мл, используя концентратор У1уакрш 10К (У1уакс1епсе 8агЕогшк Сгоир). Концентрацию белка в очищенном пуле определяли по поглощению на 280 нм, используя экспериментально полученный коэффициент экстинкции. Суммарный выход очищенного конъюгата моно-20К мПЭГмалеимид-(Ε10С)ЬΡΥΥз_-з₆ составил 38%. Чистоту конъюгата моно-20К мПЭГ-малеимид-(Ε10С)ЬΡΥΥз_-з₆ в очищенном пуле определили как 96%, используя 8ЕС-ВЭЖХ.

Пример 2. Линейный 30К мПЭГ-малеимид-(^11С)ЬΡУУз_-з₆

Этот пример демонстрирует получение, по существу, гомогенного монопэгилированного (Ό1Κ.')1ιΡΥΥ_3-36 с использованием мПЭГ, присоединенного к остатку 11.

(а.) Получение (Ό1Κ’)1ιΡΥΥ_3-36 (Ο11φ1ΡΥΥ3_3₆ синтезировали твердофазным способом, применяя Ртос-стратегию с активацией гексафторфосфатом 2-(1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония (НВТИ) (РакЕтос; циклы по 0,15 ммоль), используя автоматический пептидный синтезатор (модель 433А; АррЬеб ВюкукЕетк, РокЕег Сйу, СА). В качестве защитных групп боковых цепей использовали Тг( для Акп, С1п, Сук и Ηίκ; (Ви для 8ег, ТЬг и Туг; Вос для Ьук; ОЕВи для Акр и С1и; и ΡΜ для Агд. Отщепление пептида от смолы завершали с использованием смеси 9 мл трифторуксусной кислоты (ТРА), 0,5 г фенола, 0,5 мл Н₂О, 0,5 мл тиоанизола и 0,25 мл 1,2-этандитиола при комнатной температуре в течение 4 ч. Пептид осаждали в охлажденном во льду этиловом эфире и промывали этиловым эфиром, растворяли в ΌΜ8Ο и очищали обращеннофазовой ВЭЖХ на колонке ЬеИарак С18, 15 мкм, 100А, 50x300 мм (внутренний диаметр) (№ по каталогу VΑТ011801, ’№аЕегк, ΜΠ^ιύ, ΜΑ), используя линейный градиент от смеси 100% растворителя А:0% растворителя В до смеси 70% растворителя А:30% растворителя В в течение 30 минут при скорости потока 80 мл/мин. Растворитель А представляет собой водный 0,1%-ный раствор ТРА (трифторуксусная кислота). Растворитель В представляет собой 0,1%-ный раствор ТРА в ацетонитриле. Молекулярную массу очищенного пептида подтверждали с использованием Ε8Ι-Μ8 ^^=4038), а чистоту оценивали по обращенно-фазовой ВЭЖХ (фиг. 4).

(б) Получение конъюгата линейный 30К мПЭГ-малеимид-(^11С)ЬΡУУз_-з₆

Линейный мПЭГ-малеимидный реагент с ΜΨ приблизительно 30000 (ЗипЬпдЬЕ МЕ-300МА, ΝΟΡ СогрогаЕюп, Токуо, .Гараи) подвергали избирательному сочетанию с (Ό1Κ’)1ιΡΥΥ_3-3₆ по сульфгидрильной группе цистеина в остатке 11. Линейный 30К мПЭГ-малеимид, растворенный в 20 мМ ΗΕΡΕ8 (81дта

- 24 011882

С.'11ет1еа1. 3ΐ. Ьош8, МО) рН 7,0, непосредственно приводили во взаимодействие с пептидом (Ό1^)№ΥΥ_3-36 путем прямого добавления пептида с получением концентрации пептида 1 мг/мл и относительного молярного соотношения мПЭГ:(^11С)йΡΥУ_3-36 приблизительно 1:1. Реакции проводили в темноте при комнатной температуре в течение 0,5-24 ч. Реакции останавливали разбавлением в 20 мМ ацетате натрия, рН 4,5, для непосредственной очистки катионообменной хроматографией. Продукты реакции оценивали по ЗЕС-ВЭЖХ (фиг. 5).

Альтернативно, вместо растворения линейного 30К мПЭГ-малеимида в НЕРЕЗ, как описано выше, его растворяют в 20 мМ ацетате натрия (З1дта Сйетюа1, 8ΐ. Ьошк, МО), рН 4,5, и непосредственно приводят во взаимодействие с пептидом (Ό110)№ΥΥ_3-36 путем прямого добавления пептида с получением концентрации пептида 1 мг/мл и относительного молярного соотношения мПЭГ:((^11С)йΡΥУ_3-36 приблизительно 1:1. Реакции проводят в темноте при комнатной температуре в течение 0,5-24 ч. Реакционные смеси наносят непосредственно на колонку для катионообменной хроматографии. Продукты реакции оценивают по 8ЕС-ВЭЖХ.

(в) Очистка конъюгата линейный 30К мПЭГ-малеимид-(^11С)йΡΥУ_3-36

Пэгилированные структуры (Ό110)№ΥΥ_3-36 очищали из реакционной смеси до чистоты >95%, используя одну стадию ионообменной хроматографии. Монопэгилированный (Ό1^)№ΥΥ_3-36 очищали от немодифицированного (Ό1^)№ΥΥ_3-36 и структур большей молекулярной массы, используя катионообменную хроматографию. Типичную реакционную смесь линейного 30К мПЭГ-малеимида и (Ό11Ο№ΥΥ_3-36 (10 мг белка), которая описана выше, фракционировали на колонке ЗР-Зерйагоке Нйгар (5 мл) (Атегкйат Рйагтааа Вю!есй, СЕ НеаИйсаге, Р18са!а^ау, N1), уравновешенной 20 мМ ацетатом натрия, рН 4,5 (буфер А). Реакционные смеси при рН 7,0 разбавляли (7Х) буфером А и наносили на колонку при скорости потока 2,5 мл/мин. Колонку промывали буфером А в объеме, равном 5-10 объемам колонки. После этого из колонки элюировали различные структуры (Ό1^)№ΥΥ_3-36 в объеме, равном 20 объемам колонки, с использованием линейного 0-100 мМ градиента №С1. Элюат регистрировали по поглощению на 280 нм (А₂₈₀) и собирали фракции соответствующего размера. Фракции объединяли по степени пэгилирования, что оценивали по 8ЕС-ВЭЖХ. Очищенный пул затем концентрировали до 0,5-5 мг/мл в концентраторе Укакрт 10К (Укакшепсе ЗагЮпик Сгоир). Концентрацию белка в очищенном пуле определяли путем сравнения площади пика ОФ-ВЭЖХ со стандартной кривой для ΡΥУ_3-36 (не показано). С использованием ЗЕС-ВЭЖХ получали профиль очищенного пула пэгилированного (Ό11Ο№ΥΥ_3-36, который показан на фиг. 7.

Альтернативно, реакционные смеси при рН 4,5 из вышеприведенной стадии (б), наносят непосредственно на колонку при скорости потока 2,5 мл/мин и концентрацию в очищенном пуле определяют по поглощению на 280 нм, используя экспериментально полученный коэффициент экстинкции.

Пример 3. Разветвленный 43К мПЭГ-малеимид-(Ε10С)йΡУУ_3-36

Этот пример демонстрирует получение по существу гомогенного монопэгилированного (Ε10С)йΡΥУ_3-36 с использованием мПЭГ, присоединенного к остатку 10.

(а) Получение конъюгата разветвленный 43К мПЭГ-малеимид-(Ε10С)йΡΥУ_3-36

Разветвленный мПЭГ-малеимидный реагент с М\У приблизительно 43000 (ЗипЬпдЫ СЬ2-400МА, ΝΘΡ Согрогайоп, Токуо, 1арап) подвергали избирательному сочетанию с ^^Ο^ΥΥ^^, полученным, как описано в примере 1(а), по сульфгидрильной группе цистеина в остатке 10.

Разветвленный 43К мПЭГ-малеимид, растворенный в 20 мМ НЕРЕЗ (З1дта Скетка1, 8ΐ. Ьош8, МО), рН 7,0, непосредственно приводили во взаимодействие с пептидом (Ε10С)йΡУУ_3-36 путем прямого добавления пептида с получением концентрации пептида 1 мг/мл и относительного молярного соотношения мПЭГ приблизительно 1:1. Реакции проводили в темноте при комнатной температуре в течение 0,5-24 часов. Реакции в НЕРЕЗ, рН 7,0, останавливали разбавлением в 20 мМ ацетате натрия, рН 4,5, для немедленной очистки катионообменной хроматографией. Продукты реакции оценивали по ЗЕС-ВЭЖХ (фиг. 8).

Альтернативно, разветвленный 43К мПЭГ-малеимид, растворяют в 20 мМ ацетате натрия (ЗЦта Сйетка1, 3ΐ. Ьошк, МО), рН 4,5, и немедленно приводят во взаимодействие с пептидом (Ε10С)йΡУУ_3-36 путем прямого добавления пептида с получением концентрации пептида 1 мг/мл и относительного молярного соотношения мПЭГ:(Ε10С)йΡУУ_3-36 приблизительно 1:1. Реакционные смеси наносят непосредственно на колонку для катионообменной хроматографии.

(б) Очистка монопэгилированного конъюгата разветвленный 43К мПЭГ -малеимид-(Е10С)ЬР ΥΥ_3-36

Монопэгилированные структуры разветвленный 43К мПЭГ-малеимид-(Ε10С)йΡУУ_3-36 отделяли от немодифицированного (Ε10С)йΡУУ_3-36 и структур большей молекулярной массы, используя одну стадию катионообменной хроматографии. Типичную реакционную смесь разветвленного 43К мПЭГ-малеимида и (Ε10С)йΡУУ_3-36 (10 мг белка), которая описана выше, фракционировали на колонке ЗР-Зерйагоке Нйгар (5 мл) (АтепФаш Рйагтааа Вю!есй, СЕ НеаИйсаге), уравновешенной 20 мМ ацетатом натрия, рН 4.5 (буфер А). Реакционные смеси при рН 7,0 разбавляли (10Х) буфером А и наносили на колонку при скорости потока 2,5 мл/мин. Колонку промывали буфером А в объеме, равном 5-10 объемам колонки. После этого из колонки элюировали различные структуры (Ε10С)йΡУУ_3-36 в объеме, равном 20 объемам колонки, с использованием линейного 0-100 мМ градиента №С1. Элюат регистрировали по поглощению на

- 25 011882

280 нм (А₂₈₀) и собирали фракции соответствующего размера. Фракции объединяли по степени пэгилирования, как оценивали по 8ЕС-ВЭЖХ. Очищенный пул затем концентрировали до 0,5-5 мг/мл в концентраторе Сепбтртер 3 (Аткоп Тесбпо1о§у Сотротабоп) или, альтернативно, используя концентратор νίνηκρίη 10К (Укакскпсе 8абопик Сгоир). Концентрацию белка в очищенном пуле рассчитывали количественно по результатам аминокислотного анализа. С использованием 8ЕС-ВЭЖХ получали профиль очищенного пула монопэгилированного конъюгата разветвленный 43К мПЭГ-малеимид-(Е10С)бΡУУ_3-36, который показан на фиг. 9.

Альтернативно, концентрацию белка определяют путем сравнения площади пика ОФ-ВЭЖХ со стандартной кривой для ΡΥΥ_3-36 (не показано) или по поглощению на 280 нм, используя экспериментально полученный коэффициент экстинкции.

Пример 4.

В этом примере рассматривается получение по существу гомогенного монопэгилированного (Е10С)бΡУУ_3-36 с использованием линейного мПЭГ (12 кДа) или разветвленного мПЭГ (20 кДа), присоединенного к остатку 10, и получение по существу гомогенного монопэгилированного (Ό1^)№ΥΥ_3-36 с использованием линейного мПЭГ (20 кДа), линейного мПЭГ (12 кДа) или разветвленного мПЭГ (20 кДа), присоединенного к остатку 11.

(а) Получение конъюгата линейный 12К мПЭГ-малеимид-(Е10С)бΡУУ_3-36

Линейный мПЭГ-малеимидный реагент с Μν приблизительно 12000 (8ипЬбдб! МЕ-120МА, ЫОЕ Сотротабоп) подвергают избирательному сочетанию с (Е10С)бΡУУ_3-36 по сульфгидрильной группе цистеина в остатке 10. Линейный 12К мПЭГ-малеимид, растворенный в 20 мМ ацетате натрия (81дта Сбетка1) рН 4,5, непосредственно приводят во взаимодействие с пептидом (Е10С)бΡУΥ_3-36 путем прямого добавления пептида с получением концентрации пептида 1 мг/мл и относительного молярного соотношения мПЭГ:(Е10С)бΡУУ_3-36 приблизительно 1:1. Реакции проводят в темноте при комнатной температуре в течение 0,5-24 ч. Реакционные смеси в 20 мМ ацетате натрия, рН 4,5, наносят непосредственно на колонку для катионообменной хроматографии. Продукты реакции оценивают по 8ЕС-ВЭЖХ или 8О8-РАСЕ.

(б) Очистка конъюгата линейный 12К мПЭГ-малеимид-(Е10С)бΡУУ_3-36

Пэгилированные структуры ^^Ο^ΥΥ^^ очищают из реакционной смеси до чистоты >95%, используя одну стадию ионообменной хроматографии. Монопэгилированный (Е10С)11РУУ_3-36 отделяют от свободного ПЭГ, немодифицированного (Е10С)бΡУУ_3-36 и структур большей молекулярной массы, используя катионообменную хроматографию. Типичную реакционную смесь линейного 12К мПЭГмалеимида и ^^Ο^ΥΥ^^ (10 мг белка), которая описана выше, фракционируют на колонке 8Р8ербагоке Нбтар (5 мл) (Атегкбат Рбагтааа Вюксб, СЕ Неаббсаге), уравновешенной 20 мМ ацетатом натрия, рН 4,5 (буфер А). Реакционную смесь наносят на колонку при скорости потока 1,0 мл/мин. Колонку промывают буфером А в объеме, равном 4 объемам колонки, при скорости потока 2,5 мл/мин. После этого из колонки элюируют различные структуры в объеме, равном 25 объемам колонки, с использованием линейного 0-200 мМ градиента №1С1 при скорости потока 2,5 мл/мин. Элюат регистрируют по поглощению на 280 нм (А₂₈₀) и собирают фракции соответствующего размера. Фракции объединяют по степени пэгилирования, что оценивают по 8ЕС-ВЭЖХ. Очищенный пул затем концентрируют до 0,5-5 мг/мл, используя концентратор ^уакрш 10К (^уакскпсе 8абопик Сгоир). Концентрацию белка в очищенном пуле определяют по поглощению на 280 нм, используя экспериментально полученный коэффициент экстинкции. С использованием 8ЕС-ВЭЖХ или 8Б8-РАСЕ получают профиль очищенного пула 12К мПЭГ-малеимид-(Е10С)бΡУУ_3-36.

(в) Получение конъюгата разветвленный 20К мПЭГ-малеимид-(Е10С)бΡУУ_3-36

Разветвленный мПЭГ-малеимидный реагент с ΜΨ приблизительно 20000 (8ипЬбдб! СБ2-200МА, ЫОЕ Сотротабоп) подвергают избирательному сочетанию с (Е10С)бΡΥΥ_3-36 по сульфгидрильной группе цистеина в остатке 10. Разветвленный 20К мПЭГ-малеимид, растворенный в 20 мМ ацетате натрия (81дта Сбетка1, 8ΐ. Бонк МО) рН 4,5, непосредственно приводят во взаимодействие с пептидом (Е10С)11ΡУУ_3-36 путем прямого добавления пептида с получением концентрации пептида 1 мг/мл и относительного молярного соотношения мПЭГ:(Е10С)бΡУУ_3-36 приблизительно 1:1. Реакции проводят в темноте при комнатной температуре в течение 0,5-24 ч. Реакционные смеси в 20 мМ ацетате натрия, рН 4,5, наносят непосредственно на колонку для катионообменной хроматографии. Продукты реакции оценивают по 8ЕС-ВЭЖХ или 8Б8-РАСЕ.

(г) Очистка конъюгата разветвленный 20К мПЭГ-малеимид-(Е10С)бΡУУ_3-36

Пэгилированные структуры (Е10С)бΡУУ3-36 очищают из реакционной смеси до чистоты >95%, используя одну стадию ионообменной хроматографии. Монопэгилированный отделяют от свободного ПЭГ, немодифицированного и структур большей молекулярной массы, используя катионообменную хроматографию. Типичную реакционную смесь разветвленного 20К мПЭГмалеимида и (Е10С)бΡУУ_3-36 (10 мг белка), которая описана выше, фракционируют на колонке 8Р8ербагоке Нбтар (5 мл) (Атегкбат Рбагтааа Вюксб, СЕ Неаббсаге), уравновешенной 20 мМ ацетатом натрия, рН 4,5 (буфер А). Реакционную смесь наносят на колонку при скорости потока 1,0 мл/мин. Ко

- 26 011882 лонку промывают буфером А в объеме, равном 4 объемам колонки, при скорости потока 2,5 мл/мин. После этого из колонки элюируют различные структуры (Е10С)11РУУ_3-36 в объеме, равном 25 объемам колонки, с использованием линейного 0-200 мМ градиента №1С1 при скорости потока 2,5 мл/мин. Элюат регистрируют по поглощению на 280 нм (А₂₈₀) и собирают фракции соответствующего размера. Фракции объединяют по степени пэгилирования, что оценивают по БЕС-ВЭЖХ. Очищенный пул затем концентрируют до 0,5-5 мг/мл, используя концентратор νίναφίη 10К (Угуакаеисе Байопик Огоир). Концентрацию белка в очищенном пуле определяют по поглощению на 280 нм, используя экспериментально полученный коэффициент экстинкции. С использованием БЕС-ВЭЖХ или БЭБ-РАСЕ получают профиль очищенного пула конъюгата разветвленный 20К мПЭГ-малеимид-(Е10С)йРΥУ_3-36.

(д) Получение конъюгата линейный 20К мПЭГ-малеимид-(^11С)йРΥУ_3-36

Линейный мПЭГ-малеимидный реагент с ΜΜ приблизительно 20000 (БииЬпдй! МЕ-200МА, ΝΟΡ Согрогайои) подвергают избирательному сочетанию с (Ό11Ο№ΥΥ_3-36 по сульфгидрильной группе цистеина в остатке 11. Линейный 20К мПЭГ-малеимид, растворенный в 20 мМ ацетате натрия (Б1дта С11ет1са1) рН 4,5, непосредственно приводят во взаимодействие с пептидом (Ό1^)№ΥΥ_3-36 путем прямого добавления пептида с получением концентрации пептида 1 мг/мл и относительного молярного соотношения мПЭГ:(^11С)йРΥУ_3-36 приблизительно 1:1. Реакции проводят в темноте при комнатной температуре в течение 0,5-24 ч. Реакционные смеси в 20 мМ ацетате натрия, рН 4,5, наносят непосредственно на колонку для катионообменной хроматографии. Продукты реакции оценивали по БЕС-ВЭЖХ или БЭБ-РАСЕ.

(е) Очистка конъюгата линейный 20К мПЭГ-малеимид-(^11С)йРΥУ_3-36

Пэгилированные структуры (Ό1^)№ΥΥ_3-36 очищают из реакционной смеси до чистоты >95%, используя одну стадию ионообменной хроматографии. Монопэгилированный (Ό1^)№ΥΥ_3-36 отделяют от свободного ПЭГ, немодифицированного (^11С)йРΥУ_3-36 и структур большей молекулярной массы, используя катионообменную хроматографию. Типичную реакционную смесь линейного 20К мПЭГмалеимида и (Ό11Ο)№ΥΥ_3-36 (10 мг белка), которая описана выше, фракционируют на колонке БРБерйагоке Нйгар (5 мл) (Атегкйат РЕагтааа Вю1ес11. СЕ Неаййсаге), уравновешенной 20 мМ ацетатом натрия, рН 4,5 (буфер А). Реакционную смесь наносят на колонку при скорости потока 1,0 мл/мин. Колонку промывают буфером А в объеме, равном 4 объемам колонки, при скорости потока 2,5 мл/мин. После этого из колонки элюируют различные структуры (Ό1^)№ΥΥ_3-36 в объеме, равном 25 объемам колонки, с использованием линейного 0-200 мМ градиента №1С1 при скорости потока 2,5 мл/мин. Элюат регистрируют по поглощению на 280 нм (А280) и собирают фракции соответствующего размера. Фракции объединяют по степени пэгилирования, что оценивают по БЕС-ВЭЖХ. Очищенный пул затем концентрируют до 0,5-5 мг/мл, используя концентратор ^уакрт 10К (^уакаеисе Байопик Огоир). Концентрацию белка в очищенном пуле определяют по поглощению на 280 нм, используя экспериментально полученный коэффициент экстинкции. С использованием БЕС-ВЭЖХ или БЭБ-РАСЕ получают профиль очищенного пула 20К мПЭГ-малеимид-(^11С)йРΥУ_3-36.

(ж) Получение конъюгата линейный 12К мПЭГ -малеимид-(^11С)йРΥУ_3-36

Линейный мПЭГ-малеимидный реагент с ΜΨ приблизительно 12000 (БииЬпдй! МЕ-120МА, ΝΟΡ Согрогайои) подвергают избирательному сочетанию с (Ό11Ο№ΥΥ_3-36 по сульфгидрильной группе цистеина в остатке 10. Линейный 12К мПЭГ-малеимид, растворенный в 20 мМ ацетате натрия (Б1дта СЬет1са1, Б!. Ьошк, МО) рН 4,5, непосредственно приводят во взаимодействие с пептидом (Ό11Ο)№ΥΥ_3-36 путем прямого добавления пептида с получением концентрации пептида 1 мг/мл и относительного молярного соотношения мПЭГ:(^11С)йРΥУ_3-36 приблизительно 1:1. Реакции проводят в темноте при комнатной температуре в течение 0,5-24 ч. Реакционные смеси в 20 мМ ацетате натрия, рН 4,5, наносят непосредственно на колонку для катионообменной хроматографии. Продукты реакции оценивают по БЕСВЭЖХ или БЭБ-РАСЕ.

(з) Очистка конъюгата линейный 12К мПЭГ-малеимид-(^11С)йРΥУ_3-36

Пэгилированные структуры (Ρ11Ο)№ΥΥ₃.₃₆ очищают из реакционной смеси до чистоты >95%, используя одну стадию ионообменной хроматографии. Монопэгилированный (Ρ11Ο)№ΥΥ₃.₃₆ отделяют от свободного ПЭГ, немодифицированного (Ρ11Ο)№ΥΥ₃.₃₆ и структур большей молекулярной массы, используя катионообменную хроматографию. Типичную реакционную смесь линейного 12К мПЭГ-малеимида и (Ό11Ο)№ΥΥ_3-36 (10 мг белка), которая описана выше, фракционируют на колонке БР-БерЕагоке Нйгар (5 мл) (АтегкЕат РЕагтааа Вю1ес1г СЕ НеаЕйсаге), уравновешенной 20 мМ ацетатом натрия, рН 4,5 (буфер А). Реакционную смесь наносят на колонку при скорости потока 1,0 мл/мин. Колонку промывают буфером А в объеме, равном 4 объемам колонки, при скорости потока 2,5 мл/мин. После этого из колонки элюируют различные структуры (ΌΠΟ^ΥΥ^ в объеме, равном 25 объемам колонки, с использованием линейного 0-200 мМ градиента №1С1 при скорости потока 2,5 мл/мин. Элюат регистрируют по поглощению на 280 нм (А280) и собирают фракции соответствующего размера. Фракции объединяют по степени пэгилирования, что оценивают по БЕС-ВЭЖХ. Очищенный пул затем концентрируют до 0,5-5 мг/мл, используя концентратор νίνηφΕι 10К (^уакаеисе Байопик Огоир). Концентрацию белка в очищенном пуле определяют по поглощению на 280 нм, используя экспериментально полученный коэффициент экстинкции. С использованием БЕС-ВЭЖХ или БЭБ-РАСЕ получают профиль очищенного пула 12К мПЭГ -малеимид-(^11С)йРΥУ_3-36.

- 27 011882 (и) Получение конъюгата разветвленный 20К мПЭГ-малеимид-(О11 С)ЬΡΥΥ _3-36

Разветвленный мПЭГ-малеимидный реагент с М\У приблизительно 20000 (ЪииЬпдЫ СБ2-200МА, Ν0Ε Согрогабои) подвергают избирательному сочетанию с (Ό11Ο)№ΥΥ_3-36 по сульфгидрильной группе цистеина в остатке 10. Разветвленный 20К мПЭГ-малеимид, растворенный в 20 мМ ацетате натрия (81дта СЬет1са1, δΐ. Ьошк, МО) рН 4,5, непосредственно приводят во взаимодействие с пептидом (Ό11Ο)1ιΡΥΥ_3-36 путем прямого добавления пептида с получением концентрации пептида 1 мг/мл и относительного молярного соотношения мПЭГ:(О11С)НРХХ_3-36 приблизительно 1:1. Реакции проводят в темноте при комнатной температуре в течение 0,5-24 ч. Реакционные смеси в 20 мМ ацетате натрия, рН 4,5, наносят непосредственно на колонку для катионообменной хроматографии. Продукты реакции оценивают по 8ЕС-ВЭЖХ или δΌδ-РАСЕ.

(к) Очистка конъюгата разветвленный 20К мПЭГ-малеимид-(011Ο)№ΥΥ _3-36

Пэгилированные структуры (Ό11Ο)№ΥΥ_3-36 очищают из реакционной смеси до чистоты >95%, используя одну стадию ионообменной хроматографии. Монопэгилированный (Ό11Ο)№ΥΥ_3-36 отделяют от свободного ПЭГ, немодифицированного (Ό11Ο)№ΥΥ_3-36 и структур большей молекулярной массы, используя катионообменную хроматографию. Типичную реакционную смесь разветвленного 20К мПЭГмалеимида и (Ό11Ο)№ΥΥ_3-36 (10 мг белка), которая описана выше, фракционируют на колонке 8Р8ерЬагоке Нйгар (5 мл) (АтегкЬат РЬагтааа Вю1ес11. СЕ НеаЛЬсаге), уравновешенной 20 мМ ацетатом натрия, рН 4,5 (буфер А). Реакционную смесь наносят на колонку при скорости потока 1,0 мл/мин. Колонку промывают буфером А в объеме, равном 4 объемам колонки, при скорости потока 2,5 мл/мин. После этого из колонки элюируют различные структуры (Ό11Ο)№ΥΥ_3-36 в объеме, равном 25 объемам колонки, с использованием линейного 0-200 мМ градиента №1С1 при скорости потока 2,5 мл/мин. Элюат регистрируют по поглощению на 280 нм (А280) и собирают фракции соответствующего размера. Фракции объединяют по степени пэгилирования, как оценивают по 8ЕС-ВЭЖХ. Очищенный пул затем концентрируют до 0,5-5 мг/мл, используя концентратор У1уакрш 10К (У1уакс1еисе 8агЮпик Сгоир). Концентрацию белка в очищенном пуле определяют по поглощению на 280 нм, используя экспериментально полученный коэффициент экстинкции. С использованием 8ЕС-ВЭЖХ или δΌδ-РАСЕ получают профиль очищенного пула конъюгата разветвленный 20К мПЭГ-малеимид-(О11С)НРХХ_3-36.

Пример 5. Определение биохимических характеристик (Е10С)№^_3-36, (Ό11Ο)№ΥΥ_3-36 и пэгилированные формы (Е10С)№^_3-36 и (Ό11Ο)№ΥΥ_3-36 охарактеризовывали различными биохимическими методами, включая масс-спектрометрию с ионизацией электрораспылением ^δΙ-Μδ), δΌδ-РАСЕ и δΕС-ВЭЖХ и ОФ-ВЭЖХ, соответственно.

(A) Масс-спектрометрию с ионизацией электрораспылением ^δΙ-Μδ) осуществляли на ЬС/ΜδΌ электрораспылительном масс-спектрометре серии 1100 (Ад11еи! ТесЬио1од1ек, Ра1о А1!о, СА) в режиме положительно заряженных ионов (пример 1(а), 2(а)).

(Б) Для анализа пептида (Е10С)№^_3-36 (фиг. 1 и 4) проводили обращенно-фазовую хроматографию на колонке ΖΟΒΒΆΧ Ес11рке ХОВ-С8, 4,6 х 150 мм, 5 мм (№ по каталогу 993967-906, Ад11еи! ТесЬио1од1ек, Ра1о А1!о, СА), используя линейный градиент от смеси 100% растворителя А и 0% растворителя В до смеси 95% растворителя А и 5% растворителя В в течение 3 мин, затем от смеси 95% растворителя А и 5% растворителя В до смеси 50% растворителя А и 50% растворителя В в течение 12 мин при скорости 1,5 мл/мин (пример 1(а)). Растворителем А является водный 0,1%-ный раствор ТЕА. Растворителем В является 0,1%-ный раствор ТЕА в ацетонитриле.

Обращенно-фазовую хроматографию для количественного определения пэгилированных (Е10С)№^_3-36 и (Ό11Ε)ΕΥΥ_3-36 (не показано) проводили на колонке Ууйас С18 (2,1x250 мм) (№ по каталогу 218Μδ552, Ууйас, Некрепа, СА), используя линейный градиент от смеси 80% растворителя А и 20% растворителя В до смеси 40% растворителя А и 60% растворителя В в течение 48 мин при скорости потока 0,2 мл/мин (пример 1(в), 2(в)). Растворителем А является водный 0,1%-ный раствор ТЕА. Растворителем В является 0,085%-ный раствор ТЕА в ацетонитриле.

(B) Эксклюзионная высокоэффективная жидкостная хроматография (ЪЕС-ВЭЖХ)

Реакционные смеси линейного 30К или разветвленного 43К мПЭГ либо с (Е10С)№ГХ_3-36; либо с (Ό11Ο)№ΥΥ_3-36, пулы после их катионообменной очистки и конечные очищенные продукты оценивали, используя δΕС-ВЭЖХ в неденатурирующих условиях (пример 1(6) и (в), 2(6) и (в)). Аналитическую δΕС-ВЭЖХ в неденатурирующих условиях выполняли, используя δЬойеx К\У804 или ТδК С4000Р^ХЬ (ТокоЬаак) в 20 мМ фосфате рН 7,4, 150 мМ №С1, при скорости потока 1,0 мл/мин (возможно δире^йеx 200, 7,8 ммх30 см, АтегкЬат Вюкаеисе, Р1кса!а^ау, Νί). Пэгилирование значительно увеличивает гидродинамический объем белка, приводя к сдвигу в сторону более раннего времени удерживания. В реакционных смесях 30К мПЭГ-малеимид плюс (Ε10С)ЬΡΥΥ_3-36 наблюдали небольшой пик, соответствующий оставшемуся немодифицированным (Ε10С)ЬΡΥΥ_3-36, а также новые пики, соответствующие пэгилированным структурам пептида (фиг. 2). Новые структуры наблюдали в реакционных смесях 30К мПЭГ и (Ό11Ο)№ΥΥ_3-36 и разветвленный 43К мПЭГ и (Е10С)№ГХ_3-36 с очень небольшим количеством оставшегося немодифицированым (Ό11Ε)ΗΕΥΥ_3-36 или (Е10С)№ГХ_3-36 (фиг. 5 и 8). Эти пэгилированные и непэгилированные структуры фракционировали хроматографией на δΡ-δерЬа^оке, и после этого было пока

- 28 011882 зано, что полученные очищенные структуры моно-мПЭГ-(Е10С)ΗΡΥΥ_3-36 и моно-мПЭГ-(^11С)ΗΡΥΥ_3-36 элюировались в виде одного пика с чистотой >95% при проведении 8ЕС в неденатурирующих условиях (фиг. 6, 7 и 9). Стадией хроматографии на 8Е-8ерЬаго8е эффективно отделяли свободные мПЭГ, (Ε1(Χ.')1ιΡΥΥ_3-36 или (Ό11Ο)ΗΡΥΥ_3-36 и структуры большей молекулярной массы от монопэгилированных конъюгатов линейный 30К и разветвленный 43К мПЭГ-(Е10С)ΗΡУΥ_3-36 или мПЭГ-(^11С)ΗΡУΥ_3-36.

(Г) 8Ό8-ΡΑ6Ε

8Ό8-ΡΑΟΕ (пример 1(в)) также использовали для оценки реакции фракций после катионообменной очистки (фиг. 3) и конечных очищенных продуктов. 8Ό8-ΡΑΟΕ проводили на гелях 10-Νι.ιΡΑΟΕ толщиной 1 мм (1пу1(годеп, Саг18Ьаб, СА) в восстанавливающих и не восстанавливающих условиях и окрашивали, используя окрашивающий набор №мех Со11о1ба1 Соота881е™ С-250 (1пуйгодеп, Саг18Ьаб, СА).

Биологические анализы

Полезность ΡΥΥ-агонистов по настоящему изобретению в качестве фармацевтически активных агентов в уменьшении прироста массы и лечении ожирения у млекопитающих (в особенности, людей) можно продемонстрировать по активности агонистов в традиционных анализах и в анализах ш уйго и ш У1уо, описанных ниже. Кроме того, в таких анализах предложены средства, с помощью которых активности настоящих ΡΥΥ-агонистов можно сравнивать с активностями известных соединений.

Исследования потребления пищи (И)

Анализ в условиях возобновления питания после голодания: самцов мышей С57ВЬ/61 (ТНе 1аск8оп ЬаЬога(огу, Ваг НагЬог, МЕ) размещали по 2 на клетку. Их содержали в условиях 12:12-часового цикла чередования света и темноты (включение освещения в 5:00 утра, выключение освещения в 5:00 вечера), кормили гранулированным кормом для грызунов КМН3000 Ριιππ;·ι (Ке8еагсй П1е(8, 1пс., №\ν Вгипотюк, ΝΣ), а воду предоставляли без ограничений. Мышей получали в возрасте 7-8 недель и давали возможность акклиматизироваться как минимум в течение 10 суток до проведения исследования. На день проведения исследования возраст мышей составлял 9-12 недель. За сутки до начала исследования мышей помещали в клетки со свежей подстилкой, не давая никакой пищи, но с предоставлением свободного доступа к воде. Их не кормили в течение вечера и ночи (20-24 ч). В день исследования мышам посредством ΙΡ инъекции вводили дозу (объем дозы составляет 5 мл/кг), возвращали в свою клетку и в клетку незамедлительно помещали предварительно взвешенный корм. В качестве растворителя для дозирования использовали 20 мМ №-ацетат, рН 4,5, 50 мМ №С1, и дозу брали из расчета на активную ΡΥΥсоставляющую без учета пэгилирования. Растворитель в качестве контроля, нативный ΡΥΥ, 30К мПЭГмалеимид-(Е10С)йΡУΥ_3-36 и 43К мПЭГ-малеимид-(Е10С)йΡУΥ_3-36 тестировали в трех дозах (0,1 мг/кг; 0,3 мг/кг и 1,0 мг/кг). Корм повторно взвешивали через 2, 4, 6 и 24 ч после дозирования. Подстилку проверяли на проливание, ее взвешивали и включали в расчеты. Кумулятивное потребление пищи рассчитывали, вычитая вес корма для каждого момента времени из исходного веса корма. Процент (%) ингибирования рассчитывали как (Иобраб-Р1раств)/Р1раств*100.

На фиг. 10 показано 6-часовое кумулятивное потребление после ΙΡ инъекции трех доз нативного ΡΥΥ_3-36 (фиг. 10А) и 30К мПЭГ-малеимид-(Е10С)йΡУΥ_3-36 (фиг. 10В). Как нативный ΡΥΥ_3-36, так и 30К мПЭГ-малеимид-(Е10С)йΡУΥ_3-36 демонстрировали дозозависимое уменьшение кумулятивного потребления пищи в течение 6-часового курса.

43К мПЭГ-малеимид-(Е10С)йΡУΥ_3-36 также вызывал дозозависимое уменьшение кумулятивного потребления пищи в течение 6 часов (фиг. 11А) и 24 ч (фиг. 11В). Однако влияние 43К мПЭГ-малеимид(Ε1(Χ.')1ιΡΥΥ_3-36 на снижение кумулятивного потребления пищи не было столь велико, как было продемонстрировано с использованием 30К мПЭГ-малеимид-(Е10С)йΡУΥ_3-36 в той же дозе (0,1 мг/кг) как после 6 ч, так и после 24 ч.

Кроме того, сравнивали эффекты 30К мПЭГ-малеимид-(Е10С)йΡУΥ_3-36 на возобновление кормления после голодания вслед за инъекцией 0,1 мг/кг (8С) с эффектами 30К мПЭГ-малеимид-(^11С)йΡУΥ_3-36. Несмотря на то, что конъюгат 30К мПЭГ-малеимида с полипептидом (Ό11Ο)ΗΡΥΥ_3-36 вызывал снижение кумулятивного потребления пищи (И) в течение периода времени 24 ч, как показано ниже в таблице, этот эффект не был столь значительным по сравнению с наблюдаемым для 30К мПЭГ-малеимид-(Е10С)11ΡУΥ_3-36.

Обработка	2ч Ы	% измен.	4 ч ΡΙ	% измен.	6ч Е1	% измен.	24 ч ΓΙ	% измен.
Растворитель	Среднее	2,03	0,00	2,93	0,00	4,06	0,00	10,79	0,00
	8ЕМ*	0,16	8,06	0,22	7,46	0,46	11.30	0,67	6,23
Е10С	Среднее	1,89	-6,99	2,16	-26,21	2,45	-39,62	8,04	-25,48
	8ЕМ	0,27	13,45	0,27	9,09	0,26	6,33	0,88	8,14
Й11С	Среднее	2,14	5,22	2,56	-12,56	3,09	-24,02	9,08	-15,88
	ЗЕМ	0,15	7,30	0,23	7,72	0,27	6,68	0,42	3,88

*8ЕМ средняя квадратичная ошибка

- 29 011882

Эффекты конъюгата линейный 20К мПЭГ-малеимид-(Е10С)кΡ¥¥_3-36 сравнивали с эффектами 30К мПЭГ-малеимид-(Ε10С)кΡ¥¥_3-36 (оба из примера 1). Результаты одного исследования, в котором самцов мышей инъецировали дозой 0,1 мг/кг (ΙΡ), показаны ниже в таблице.

% изменения в кумулятивном потреблении пищи по сравнению с обработкой растворителем

Обработка	2чР1	4чР1	6чр1	24 ч ΡΙ	48 ч ΡΙ
30КЕ10С	-56	-65	-78	-47	-20
20К Е10С	-65	-73	-79	-36	-17

Аналогично, результаты второго исследования, в котором сравниваются эффекты на прием пищи конъюгатов линейный 20К мПЭГ-малеимид-(Е10С)кΡ¥¥_3-36 и 30К мПЭГ-малеимид-(Ε10С)кΡ¥¥_3-36 после дозы 0,1 мг/кг (8С), показаны ниже в таблице.

% изменения в кумулятивном потреблении пищи по сравнению с обработкой растворителем

Обработка	2чР1	4 ч ΡΙ	6 ч ΡΙ	24 ч Р1	48 ч Р1	72чР1
30КЕ10С	-13	-24	-29	-20	-12	-2
20КЕ10С	-45	-55	-58	-28	-14	-5

Концентрации ΡΥΥ в плазме после 8С инъекции были следующими:

Обработка	2 ч	4ч	6 ч	24 ч	30 ч	48 ч
30КЕ10С	151±58	204±48	308±29	139±27	79±14	40±6
20КЕ10С	110±21	186±37	204±14	62±16	45±12	13±3

Анализ на спонтанное потребление пищи: самцов мышей С57ВБ/61 (Тке 1аск§оп ЬаЬога!огу) размещали индивидуально и оставляли в течение 2 недель для акклиматизации перед проведением исследования. Их содержали в условиях 12:12-часового цикла чередования света и темноты, кормили порошкообразным кормом для грызунов без ограничений и предоставляли свободный доступ к воде. За день до дозирования мышей помещали в камеры для (тестирования) потребления пищи и оставляли в течение 1 суток для акклиматизации. На следующие сутки мышам вводили дозу ΙΡ или подкожной (8С) инъекцией непосредственно перед выключением света (4:00 вечера). Потребление пищи непрерывно регистрировали с 10-минутными интервалами в течение всего периода времени и ежедневно осуществляли измерение массы тела. Показаны результаты для ΙΡ инъекции нативного ΡΥΥ_3-36 и конъюгата 30К мПЭГ-малеимид(Ε10С)кΡ¥¥_3-36 (фиг. 12) и для 8С инъекции нативного ΡΥΥ_3-36 и конъюгата 30К ПЭГ-малеимид(Ε10С)кΡ¥¥_3-36 (фиг. 13). Несмотря на то, что как нативный ΡΥΥ_3-36, так и конъюгат 30К мПЭГмалеимид-(Е10С)кΡ¥¥_3-36 сразу же давали уменьшение в кумулятивном потреблении пищи по сравнению с обработанными растворителем мышами, эффект уменьшения потребления пищи, вызванный конъюгатом 30К мПЭГ-малеимид-(Ε10С)кΡ¥¥_3-36, был намного более продолжительным, чем эффект, вызванный нативным ΡΥΥ3-36. В сочетании с более продолжительным эффектом на потребление пищи конъюгат 30К мПЭГ-малеимид-(Ε10С)кΡΥΥ_3-36 также демонстрировал пролонгированную экспозицию в плазме после разовой инъекции (0,1 мг/кг, ΙΡ) (фиг. 14). В то время как для нативного ΡΥΥ_3-36 скорость клиренса составляла 16 мл/мин/кг и С_тах 38 нМ, для конъюгата 30К мПЭГ-малеимид-(Ε10С)кΡ¥¥_3-36 скорость клиренса составляла 0,2 мл/мин/кг и С_тах 267 нМ. Величины ΡΥΥ в плазме мышей измеряли с использованием набора для радиоиммуноанализа 11ΡΥΥ (Ьтсо Кекеагск, 1пс., 8!. Ьошк, МО).

Анализ с использованием мини-насосов на мышах оЬ/оЬ (линия с генетическим ожирением): самцов мышей оЬ/оЬ (Тке 1аск§оп ЬаЬога!огу) возрастом 8-9 недель (п=26) кормили нормальным кормом для грызунов и им имплантировали на срок 14 суток осмотические мини-насосы (А1ха Согр., Моип!аш У|е\\\ СА), с помощью которых вводили либо растворитель (физиологический раствор), либо ΡΥΥ_3-36 (0,1 мг/кг/сутки), либо конъюгат 30К мПЭГ-малеимид-(Ε10С)кΡ¥¥_3-36 (0,03 мг/кг/сутки). Взвешивание корма и определение массы тела проводили каждые сутки. Состав жировой массы тела определяли на сутки 0 и сутки 13. В конце исследования отбирали образцы крови. Не было обнаружено никаких значительных различий в потреблении пищи, массе тела или составе жировой массы тела для этих групп. По окончании исследования определяли ΡΥΥ в плазме с использованием радиоиммуноанализа, как описано ранее. В группе, обработанной нативным ΡΥΥ_3-36, уровни ΡΥΥ в плазме составляли 15±2 нг/мл; в группе, обработанной конъюгатом 30К мПЭГ-малеимид-(Ε10С)йΡ¥¥_3-36, уровни ΡΥΥ в плазме составляли 132±22 нг/мл.

Исследования по связыванию ΐη υϊΙιό 8РА для связывания лигандов

В 8ΡА для связывания лигандов измеряют конкурентное вытеснение меченого радиоактивной меткой ΡΥΥ из Υ2-рецепторов и используют микросферы, содержащие сцинтилляционное вещество (8ΡАгранулы), покрытое лектиновым агглютинином пшеничного зародыша (АСА), полученным от Атегккат Вюкшепсек (№ по каталогу ΡΡΝΟ 0085). Суспензии клеток нейробластомы человека КА№Т8, экспрессирующих Υ2-рецепторы на своей поверхности (РиЫепбогГ е! а1., Егос. №!1. Асаб. 8сг И8А, 87: 182186, 1990), готовили, используя буфер для сбора клеток, составленный из 50 мМ ΗΕΡΕ8-буфера (рН 7,4), 145 мМ №С1, 2,5 мМ СаС1₂, 1 мМ МдС1₂, 10 мМ глюкозы, 0,1% В8А, 5% ЭМ8О и протеазных ингиби

- 30 011882 торов Воске. 8РА-анализы проводили в 96-луночном формате в трех повторах, используя 50000 клеток/лунка, ¹²⁵1-РУУ (40000 имп/мин/лунка) и 8РА-гранулы (0,5 мг/лунка) в буфере для анализа, составленном из 50 мМ НЕРЕ8-буфера (рН 7,4), 1 мМ МдС1₂, 2,5 мМ СаС1₂, 0,1% (масс/об.) В8А, 0,025% (масс/об.) бацитрацина и 0,025% азида натрия. Добавляли тестируемые лиганды в различных концентрациях (от 0,032 до 500 нМ) в анализируемую смесь, которую затем инкубировали в течение 16-24 ч при комнатной температуре при постоянном встряхивании. Планшеты оставляли стоять в течение одного часа и затем просчитывали, используя детектор М1сгоВе!а® Тгбих (Регкт Е1тег, Воз!оп, МА). Результаты для 11РУУ._3-,₃₆ и 30К мПЭГ-малеимид-(Е10С)11РУУ_3-36 из примера 1 показаны на фиг. 15.

Анализы по связыванию ГТФу[³⁵8] с ΝΡΥ У2К-рецепторами

Функциональный анализ представляет собой анализ по связыванию ГТФу[³⁵8], проводимый на ΝΕΝ флэш-планшетах (96-луночный формат). Мембраны готовили из КА№Т8-клеток, как описано в Вазз е1 а1., Мо1. РНагт. 50: 709-715, 1990. Анализ по связыванию ГТФ γ[³⁵δ] проводили в 96-луночном формате Е1аз11Р1а1е™ в двух повторах с использованием 100 пМ ГТФγ[³⁵δ] и 10 мкг мембран на лунку в буфере для анализа, составленном из 50 мМ Тпз-НС1, рН 7,4; 3 мМ МдС12, рН 7,4; 10 мМ МдС12, 20 мМ ЕСТА, 100 мМ №С1, 5 мкМ ГДФ, 0,1% бычьего сывороточного альбумина и следующих ингибиторов протеаз: 100 мкг/мл бацитрацина, 100 мкг/мл бензамидина, 5 мкг/мл апротинина, 5 мкг/мл лейпептина. Затем анализируемую смесь инкубировали с тестируемым соединением в возрастающих концентрациях (кривая по 6 точкам для концентрации; логарифмические разведения в диапазоне от 10^-12 М до 10^-5 М) в течение 60 мин при 30°С. Затем Е1азНР1а1ез™ центрифугировали при 2000х д в течение 10 мин. Стимулирование связывания ГТФγ[³⁵δ] далее количественно подсчитывали, используя детектор МюгоЬе(а™. Расчеты ЕС50 и внутренней активности выполняли, используя Рпзт посредством СгарНраб. Результаты для 11РУУ_3-36 и 30К мПЭГ-малеимид-(Е10С)йР¥У_3-з₆ из примера 1 показаны на фиг. 16. Величины ЕС₅₀ для конъюгатов 30К мПЭГ-малеимид-(Е10С)11РУУ_3-36 и 20К мПЭГ-малеимид-(Е10С)НРУУ_3-36 из примера 1 были сопоставимы (например, 4,3 нМ и 4,6 нМ при измерении в одном и том же анализе).

Claims (28)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Полипептид (Е10С)йРУУ_3-36, имеющий аминокислотную последовательность

   ΙΒΤΕΑΡΟΟΟΑδΡΕΕΕΝΚΥΥΑδΕΚΗΥΕΝΕνΤΙ^ΒΎ-ΝΗ;; [8Е(} ГО N0:3], или его фармацевтически приемлемая соль.
2. 2. Полипептид (Ό11Ο)№ΥΥ_3-36, имеющий аминокислотную последовательность

   ΙΚΡΕΑΡΟΕΟΑδΡΕΕΕΝΒΥΥΑ8ΕΒΗΥΕΝΕνΤΒρΒΥ-ΝΗ₂ [8Ер ГО N0:4], или его фармацевтически приемлемая соль.
3. 3. Конъюгат, содержащий полиэтиленгликоль (ПЭГ) и полипептид (Е10€)НРΥΥ_3-36 или (ϋ11€)№ΥΥ3_36.
4. 4. Конъюгат по п.3, имеющий формулу 3 где ПЭГ представляет собой метокси-ПЭГ (мПЭГ) и является линейным или разветвленным и имеет среднюю молекулярную массу в диапазоне от приблизительно 1 до 50 кДа,

   Б представляет собой группу формулы

   -О(СН_г^НС(О)(СН2)г, в которой каждый р и г независимо равен целому числу от 1 до 6, или Б представляет собой группу формулы

   -ШС(О)(СН₂)г, в которой з равен целому числу от 1 до 6 и

   -8В представляет собой полипептид (Е10С)НРΥΥ_3-36 или (^11€)НРΥΥ_3-36. в котором δ представляет собой атом серы тиоловой группы цистеина.
5. 5. Конъюгат по п.4, где мПЭГ является линейным.
6. 6. Конъюгат по п.5, имеющий формулу 4

   - 31 011882 где и равен целому числу в диапазоне от приблизительно 600 до 750 и -8К представляет собой полипептид (Е10С)№У¥_3-з₆, в котором 8 представляет собой атом серы тиоловой группы цистеина.
7. 7. Конъюгат по п.6, где группировка (ОСН₂СН₂)_и имеет среднюю молекулярную массу приблизительно 30 кДа.
8. 8. Конъюгат по п.5, имеющий формулу 4 где и равен целому числу в диапазоне от приблизительно 375 до 525 и -8К представляет собой полипептид (Ε^Π^ΥΥ^^, в котором 8 представляет собой атом серы тиоловой группы цистеина.
9. 9. Конъюгат по п.8, где группировка (ОСН₂СН₂)_и имеет среднюю молекулярную массу приблизительно 20 кДа.
10. 10. Конъюгат по п.5, имеющий формулу 4 где и равен целому числу в диапазоне от приблизительно 600 до 750 и -8К представляет собой полипептид (^11С)йΡΥ¥_3-36, в котором 8 представляет собой атом серы тиоловой группы цистеина.
11. 11. Конъюгат по п.10, где группировка (ОСН2СН2)и имеет среднюю молекулярную массу приблизительно 30 кДа.
12. 12. Конъюгат по п.4, где мПЭГ является разветвленным.
13. 13. Конъюгат по п.12, где мПЭГ является глицерин-разветвленным.
14. 14. Конъюгат по п.13, имеющий формулу 5 где каждый т является приблизительно одинаковым и равен целому числу в диапазоне от приблизительно 450 до 500 и -8К представляет собой полипептид (Ε10С)йΡΥ¥_3-36, в котором 8 представляет собой атом серы тиоловой группы цистеина.
15. 15. Конъюгат по п.14, где каждая группировка (ОСН₂СН₂)_т имеет среднюю молекулярную массу в диапазоне от приблизительно 20 до 22 кДа.
16. 16. Конъюгат по п.13, имеющий формулу 5

    - 32 011882 где каждый т является одинаковым и равен целому числу в диапазоне от приблизительно 450 до 500 и -8К представляет собой полипептид (Ό11Ο)1ΡΥΥ_3-36, в котором 8 представляет собой атом серы тиоловой группы цистеина.
17. 17. Конъюгат по п.16, где каждая группировка (ОСН₂СН₂)_т имеет среднюю молекулярную массу в диапазоне от приблизительно 20 до 22 кДа.
18. 18. Глицерин-разветвленный конъюгат 43К мПЭГ-малеимид-(Ε10С)ЬΡΥΥ_3-36, имеющий формулу 5 где каждый т является приблизительно одинаковым и -8Я представляет собой полипептид (Ε10С)ЬΡΥΥ_3-36, в котором 8 представляет собой атом серы тиоловой группы цистеина, или его фармацевтически приемлемая соль.
19. 19. Глицерин-разветвленный конъюгат 43К мПЭГ-малеимид-(^11С)ЬΡΥΥ_3-36 формулы 5 где каждый т является приблизительно одинаковым и -8Я представляет собой полипептид (Ό11Ο)1ΡΥΥ_3-36, в котором 8 представляет собой атом серы тиоловой группы цистеина, или его фармацевтически приемлемая соль.
20. 20. Фармацевтическая композиция, содержащая полипептид по п.1 или 2 или конъюгат по любому из пп.3-19 либо их фармацевтически приемлемую соль и фармацевтически приемлемый носитель.
21. 21. Фармацевтическая композиция по п.20, дополнительно содержащая второй агент, представляющий собой средство против ожирения.
22. 22. Способ лечения ожирения или состояния избыточного веса у млекопитающего, нуждающегося в таком лечении, включающий периферическое введение млекопитающему терапевтически эффективного количества полипептида по п.1 или 2 или конъюгата по любому из пп.3-19 либо их фармацевтически приемлемой соли.
23. 23. Способ замедления прироста массы, уменьшения потребления пищи или уменьшения потребления калорий у млекопитающего, включающий периферическое введение млекопитающему терапевтически эффективного количества полипептида по п.1 или 2 или конъюгата по любому из пп.3-19 либо их

    - 33 011882 фармацевтически приемлемой соли.
24. 24. Способ по п.22 или 23, при котором полипептид, конъюгат или соль вводят в комбинации со вторым агентом, представляющим собой средство против ожирения.
25. 25. Применение полипептида по п.1 или 2 или конъюгата по любому из пп.3-19 либо их фармацевтически приемлемой соли в изготовлении лекарственного средства для лечения ожирения или состояния избыточного веса у млекопитающих или для замедления прироста массы, уменьшения потребления пищи или уменьшения потребления калорий у млекопитающего.
26. 26. Полинуклеотид, кодирующий полипептид по п.1 или 2.
27. 27. Моноклональное антитело, специфически связывающееся с полипептидом, содержащим аминокислотную последовательность, как она показана на 8Ε^ ΙΌ ΝΟ: 3 или 8Ε^ ΙΌ ΝΟ: 4.
28. 28. Моноклональное антитело по п.27, где указанный полипептид пэгилирован по остатку цистеина.