NL1032266C2

NL1032266C2 - PYY-agonisten en toepassingen daarvan.

Info

Publication number: NL1032266C2
Application number: NL1032266A
Authority: NL
Inventors: Rory Francis Finn; Ned Roger Siegel; Nancy Ann Nardone
Original assignee: Pfizer Prod Inc
Priority date: 2006-01-27
Filing date: 2006-08-02
Publication date: 2007-10-09
Also published as: PE20070997A1; UY29711A1; SV2006002635A; HN2006027890A; NL1032266A1; AR054602A1; WO2007085887A1

Description

j ^ !cO

PYY-AGONISTEN EN TOEPASSINGEN DAARVAN Terrein van de uitvinding

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op PYY-agonisten, meer in het bijzonder PYY3-36-varianten en ge-pegyleerde derivaten van PYY3-36 en PYY3_36-varianten, prepa-5 raten die dergelijke agonisten bevatten, geïsoleerde nu-cleïnezuren die coderen voor dergelijke PYY-agonisten en het gebruik van dergelijke agonisten of preparaten bij de behandeling van obesitas en co-morbiditeiten daarvan, of het verminderen van de eetlust, de voedselopname of de ca-10 lorie opname door een zoogdier.

Achtergrond van de uitvinding

Obesitas is een belangrijk probleem voor de volksgezondheid doordat dit steeds meer voorkomt en de daarmee 15 geassocieerde gezondheidsrisico's. Bovendien kan obesitas de levenskwaliteit van een persoon beïnvloeden door de beperkte mobiliteit en een verminderd fysiek uithoudingsvermogen alsmede discriminatie op sociaal en academisch terrein, en op het werk.

20 Obesitas en overgewicht worden in het algemeen gede finieerd door middel van de lichaamsmassa-index (body mass index: BMI), die een correlatie heeft met de totale hoeveelheid lichaamsvet en dient als een maat voor het risico op bepaalde ziekten. BMI wordt berekend door het gewicht 25 in kilogrammen te delen de lengte in meters in het kwadraat (kg/m2) . Overgewicht wordt meestal gedefinieerd als 1032266

V

2 een BMI van 25-29,9 kg/m2, en obesitas wordt meestal gedefinieerd als een BMI van 30 kg/m2 of meer. Zie bijv. National Heart, Lung, and Blood Institute, Clinical Guidelines on the Identification, Evaluation, and Treatment of Over-5 weight and Obesity in Adults, The Evidence Report, Washington, DC: VS, Department of Health and Human Services, NIH publication no. 98-4083 (1998).

Bij recente studies is ontdekt dat obesitas en de daarmee geassocieerde gezondheidsrisico's niet beperkt 10 blijven tot volwassenen, maar eveneens kinderen en adolescenten treffen in een mate die verontrustend mag worden genoemd. Volgens het Center for Disease Control is het percentage kinderen en adolescenten waarvoor de definitie van overgewicht geldt meer dan verdubbeld sinds de vroege 15 jaren zeventig, en lijdt ongeveer 15% van de kinderen en adolescenten lijdt nu aan overgewicht. Risicofactoren voor hartziekte, zoals een hoog cholesterolgehalte en een hoge bloeddruk, komen vaker voor bij kinderen en adolescenten met overgewicht vergeleken met personen met een normaal 20 gewicht van dezelfde leeftijd. Ook is type 2 diabetes, eerder als een ziekte van volwassenen beschouwd, dramatisch toegenomen bij kinderen en adolescenten. Overgewicht en obesitas kennen een nauw verband met type 2 diabetes. Een recente schatting stelt dat adolescenten met overge-25 wicht een kans van 70% hebben om volwassenen met overgewicht of obesitas te worden. De kans stijgt tot ongeveer 80% indien ten minste één ouder overgewicht heeft of obees is. Het meest rechtstreekse gevolg van van overgewicht is in de beleving van de kinderen zelf de sociale uitslui-30 ting.

Personen met overgewicht of obesitas lopen een groter risico op kwalen als hypertensie, dyslipidemie, type 2 (niet van insuline afhankelijke) diabetes, insulineresis-tentie, intolerantie voor glucose, hyperinsulinemie, coro-35 naire hartziekte, angina pectoris, congestieve hartinsuf-ficiëntie, beroerte, galstenen, cholescystitis, cholelithiasis, jicht, osteoartritis, obstructieve slaapapnoe en 3 ft ademhalingsproblemen, ziekte van de galblaas, bepaalde vormen van kanker (bijv. van endometrium, borst, prostaat en colon) en psychologische stoornissen (zoals depressie, eetstoornissen, verstoord beeld van eigen lichaam en ge-5 ring gevoel van eigenwaarde). De negatieve gevolgen voor de gezondheid van obesitas maken dat in de Verenigde Staten tot de tweede hoofdoorzaak van te voorkomen overlijden en hebben een aanzienlijk economisch en psychosociaal effect op de maatschappij. Zie McGinnis M, Foege WH., "Actu-10 al Causes of Death in the United States", JAMA, 270:2207-12, 1993.

Obesitas wordt nu herkend als een chronische ziekte die behandeling behoeft om de daarmee geassocieerde gezondheidsrisico's te verminderen. Hoewel gewichtsverlies 15 een belangrijk resultaat van de behandeling is, is één van de voornaamste doelen van de beheersing van obesitas toch het verbeteren van de cardiovasculaire en metabolische waarden om de obesitas-gerelateerde morbiditeit te verminderen. Men heeft aangetoond dat 5-10% verlies van li-20 chaamsgewicht de metabolische waarden, zoals bloedglucose, bloeddruk en de lipideconcentraties, aanzienlijk kan verbeteren. Derhalve wordt aangenomen dat een vermindering van 5-10% in lichaamsgewicht de morbiditeit en mortaliteit kan verminderen.

25 De tegenwoordig beschikbare geneesmiddelen die op re cept verkrijgbaar zijn voor het beheersen van obesitas verminderen in het algemeen het gewicht door absorptie van vetten uit de voeding te verlagen, zoals bij orlistat, of door het creëren van een energietekort door voedselopname 30 te verminderen en/of van het energieverbruik te verhogen, zoals wordt gezien met sibutramine. De zoektocht naar alternatieven voor de tegenwoordig beschikbare middelen tegen obesitas verloopt langs diverse routes, waarvan één zich heeft geconcentreerd op bepaalde darmpeptiden die in 35 verband zijn gebracht met het moduleren van verzadiging, zoals peptide YY (PYY).

4 PYY is een lid van een pancreatische polypeptide (PP) familie van hormonen (tezamen met PP en neuropeptide Y (NPY)) . Zoals bij de andere leden van de familie is PYY een aan het C-uiteinde geamideerd peptide van 36 aminozu-5 ren. Het is een endocrien peptide uit de darmen dat aanvankelijk werd geïsoleerd uit varkensdarm (Tatemoto and Mutt, Nature 285:417-418, 1980) en later werd ervan gerapporteerd dat het de opname van voedsel met een hoog vetgehalte bij ratten na perifere toediening verminderde (Okada 10 et al., Endocrinology Supplement 180, 1993) en dat het bij muizen na perifere toediening gewichtverlies veroorzaakte (Morley en Flood, Life Sciences 41:2157-2165, 1987). Be kend is dat verscheidene opgeslagen en in circulatie zijn de moleculaire vormen van PYY bestaan (Chen et al., 15 Gastroenterology 87:1332-1338, 1984; en Roddy, et al., Re-gul. Pept., 18:201-212, 1987). Eén dergelijke vorm, PYY3-36, werd geïsoleerd uit slijmvliesextracten uit de menselijke colon (Eberlein et al., Peptides, 10:797-803, 1989) en dit bleek de overheersende vorm van PYY in humaan 20 postprandiaal plasma te zijn (Grandt et al., Regul. Pept., 51:151-159, 1994). Van PYY3_36 is gerapporteerd dat het een selectieve agonist met grote affiniteit voor de NPY Y2-receptor (Y2R) is (Keire et al., Am. J. Physiol., Gasroin-test. Liver Physiol. 279:G126-G131, 2000). Er is beschre-25 ven dat de perifere toediening van PYY3_36 de hoeveelheid opgenomen voedsel en de gewichtvermeerdering in ratten aanzienlijk verminderde, de eetlust en de hoeveelheid opgenomen voedsel bij mensen aanzienlijk deed afnemen en ook de hoeveelheid opgenomen voedsel bij muizen verlaagde, 30 maar niet bij zgn. Y2R null-muizen, hetgeen deed vermoeden dat voor het effect op de opgenomen hoeveelheid voedsel het Y2R nodig is. Bij studies op mensen werd van een infuus van PYY3_36 gevonden dat het de eetlust duidelijk deed afnemen en de hoeveelheid opgenomen voedsel in 24 uur met 35 33% verminderde. Een infuus van PYY3_36 om de normale post- prandiale concentraties in de bloedsomloop van het peptide te bereiken had binnen 15 minuten piekgehalten van PYY3_36 i 5 in het serum tot gevolg, gevolgd door een snelle daling tot basale waarden binnen 30 minuten. Bovendien werd genoemd er een duidelijke remming van de hoeveelheid opgenomen voedsel was in de periode van 12 uur na het infuus met 5 PYY3-36, maar dat er in wezen geen effect was met betrek king tot de hoeveelheid opgenomen voedsel in de periode tussen 12 uur en 24 uur daarna. Bij een studie op ratten verminderde een herhaalde toediening van PYY3_36 (i.p. injecties tweemaal daags gedurende 7 dagen) de cumulatieve 10 hoeveelheid opgenomen voedsel (Batterham, et al., Nature, 418:650-654, 2002).

Geneesmiddelen op basis van polypeptiden zijn vaak covalent gebonden aan polymeren zoals polyethyleenglycolen om hun halfwaardetijd in vivo te verlengen. Dit leidt ech-15 ter vaak ook tot een drastisch verlies van biologische of farmacologische activiteit (Shechter et al., FEBS Letters, 579:2439-2444, 2005/ Fuerteges en Abuchowski, J. Control

Release, 11:139-148, 1990; Katre, Adv. Drug Del. Sys., 10:91-114, 1993/ Bailon en Berthold, Pharm. Sci. Technol. 20 Today, 1:352-356, 1996? Nucci et al., Adv. Drug Delivery

Rev., 6, 1991; Delgado et al., Critical Rev. Ther. Drug

Carrier Syst., 9:249-304, 1992; Fung et al., Polym. Preprintsf 38:565-566, 1997; Reddy, Ann. Pharmacother., 34:915-923, 2000; Veronese, Biomaterials, 22:405-417, 25 2001). Schechter et al., hierboven, rapporteerden bijvoor beeld dat de pegylering met 40 kD van PYY3_36 met stan-daardchemie via de vorming van een stabiele binding (40 kD PEG-PYY3-36) leidde tot de volledige inactivering in voed-selopnamestudies met muizen (s.c. injectie). Ook maakten 30 ze melding van het feit dat de reversibele pegylering van PYY3-36 (40 kD PEG-FMS-PYY3-36) een achtvoudige stijging van de functionele halfwaardetijd tot gevolg had (24 uur vs. 3 uur) . Zie eveneens PCT octrooiaanvragen WO 2004/089279 en WO 03/026591.

35 1 » 6

Samenvatting van da uitvinding

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op PYY-agonisten die varianten van PYY3-36 zijn.

Volgens een aspect van de onderhavige uitvinding is 5 de PYY-agonist een variant van PYY3_36 van zoogdieren, waarin rest 10 (glutaminezuur) of rest 11 (asparaginezuur) is vervangen door een aminozuur "X" dat wordt gekozen uit de groep bestaande uit cysteine, lysine, serine, threonine, tyrosine en niet-natuurlijke voorkomende aminozuren, 10 met een functie die kan worden geconjugeerd met een hydrofiel polymeer zoals polyethyleenglycol (PEG), bijvoorbeeld een keto-, thiol-, hydroxyl-, carboxyl- of vrije amino-functie, waarbij de variant wordt aangeduid als respectievelijk (E10X)PYY3-36 of (DllX)PYY3-36.

15 De rest "X" is bij voorkeur cysteine en de overeen komstige varianten zijn derhalve (E10C) PYY3-36 en (DllC) PYY3_36.

In een voorkeursuitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding is de PYY-agonist een variant van humane PYY3-36 20 (hPYY3-3e) f honden-PYY3-36/ katten-PYY3.36 of paarden-PYY3-36, en liever hPYY3_36.

In een voorkeursuitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding is de PYY-agonist het polypeptide (E10C) hPYY3_36, met de aminozuursequentie 25 IKPEAPGC DAS PEELNRYYAS LRHYLNLVTRQRY-NH2 [SEQ ID NO: 3], of een farmaceutisch aanvaardbaar zout daarvan.

In een andere voorkeursuitvoeringsvorm is de PYY-agonist het polypeptide (DllC) hPYY3-36 dat de aminozuursequentie IKPEAPGECASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRY-NH2 [SEQ ID NO: 4] 30 heeft, of een farmaceutisch aanvaardbaar zout daarvan.

Liefst is de agonist (E10C) hPYY3.36·

De PYY-agonist van de onderhavige uitvinding is bij voorkeur geconjugeerd met een hydrofiel polymeer, bij voorkeur een PEG. De agonist is bij voorkeur mono-gepegy-35 leerd, dat wil zeggen de verhouding van agonist tot PEG is ongeveer 1:1, die is gebonden aan de conjugeerbare functionaliteit, zoals een keto-, thiol-, hydroxyl-, carboxyl- 7 of een vrije aminofunctionaliteit van "X" in (E10X) PYY3-36 en (D11X) PYY3-36- De PEG kan lineair, vertakt of hangend zijn, liever is deze lineair of vertakt, en liefst is deze lineair.

5 In lineaire PEG'S is één uiteinde van de PEG voorzien van een stopgroep die inert is onder de omstandigheden van het koppelen van de PEG aan de agonist, bijv. een ether-groep en bij voorkeur een methoxygroep. PEG'S die op deze wijze zijn getermineerd (met een methoxygroep), worden ge-10 woonlijk aangeduid als mPEG's. Het andere uiteinde is geactiveerd voor koppeling met de PYY-agonist. Evenzo zijn bij vertakte PEG'S die bruikbaar zijn in de onderhavige uitvinding alle uiteinden op één na, voorzien van een etherstopgroep en is het niet van een etherstopgroep voor-15 ziene uiteinde geactiveerd voor koppeling. In een uitvoeringsvorm is het niet van een etherstopgroep voorziene uiteinde van de PEG voorzien van een linkerrest ("L") die de PEG verbindt met een functionele groep die kan reageren met de conjugeerbare functionaliteit van het aminozuur X 20 in (E10X) PYY3-36 of (DUX) PYY3-36 om een conjugaat met de PEG covalent gebonden aan de conjugeerbare functionaliteit van X te produceren. In een andere uitvoeringsvorm is de PEG rechtstreeks gebonden aan de reactieve groep, zonder dat een linkerrest is opgenomen. Dergelijke PEG's worden vaak 25 PEG's "zonder linker" genoemd.

Voor de (E10C) PYY3-36- en (D11C) PYY3_36-polypeptiden is het niet van een ethergroep als stopgroep voorzien uiteinde van de PEG bij voorkeur gebonden aan een linker die de PEG verbindt met een maleimide of een andere groep die zal 30 reageren met de thiol van de cysteïnerest, hetgeen een conjugaat produceert waarin de PEG covalent gebonden is aan de thiolgroep van cysteine.

Geschikte reactieve PEG's voor gebruik met E10CPYY3-36 of (D11C) PYY3-36 omvatten PEG's met de formules 35 8

O

;S

mPEG— L—Ν mPEG —S02CH-CH2 r ' o mPEG—HIM-COChy en mPEG-S-S— / \ N=/

Bij voorkeur is de PEG het hierboven afgebeelde mPEG-raaleïmide dat een linkerrest -L- bevat. PEG-maleïmiden zonder linkergroep zijn ook geschikt voor gebruik in de 5 onderhavige uitvinding, in het bijzonder met (E10C) hPYY3_36 of (D11C) PYY3_36. Dergelijke PEG-maleïmiden zonder linkergroep kunnen worden bereid als beschreven door Goodson en Katre, Bio/Technology 8:343-346, 1990.

De conjugaten geproduceerd uit de koppeling van de 10 (E10C) hPYY3_36- of (D11C) PYY3_36-polypeptiden met de hierbo ven getoonde mPEG's worden afgebeeld in de volgende formules, waarin -SR het (E10C) hPYY3-36~ of (D11C) PYY3-36~poly-peptide is, waarin S het zwavelatoom van de thiolgroep van cysteine is: o

mPEG-HN-COCH2SR en mPEG—S-SR

De linker -L- dient louter voor het verbinden van de PEG met de reactieve functionele groep en is derhalve niet bijzonder beperkt, maar omvat bij voorkeur een alkyleen- 9 groep die een esterbinding, een urethaanbinding, een amidebinding, een etherbinding, een carbonaatbinding of een secundaire aminogroep bevat.

In een voorkeursuitvoeringsvorm voor met name lineai-5 re PEG'S is de linker een groep die voldoet aan de formule -0 (CH2)PNHC (0) (CH2)r- waarin p een geheel getal van 1 tot 6, bij voorkeur 1 tot 10 3, liever 2 of 3 en liefst 3 is, en r een geheel getal van 1 tot 6, bij voorkeur 1 tot 3, liever 2 of 3 en liefst 2 is. Een linker die de voorkeur heeft, is de groep -CH2CH2CH2NHCOCH2CH2-.

In een andere voorkeursuitvoeringsvorm voor met name 15 vertakte PEG's is de linker een groep met de formule -NHC(O) (CH2)s- waarin s een geheel getal van 1 tot 6, bij voorkeur 1 tot 20 3, liever 2 of 3 en liefst van 2 is. Een linker die de voorkeur heeft, is de groep -NHC(0)CH2CH2-.

De PEG kan al of niet lineair zijn, bijvoorbeeld vertakt of hangend. Bij voorkeur is de PEG lineair of vertakt, bij voorkeur een lineair of vertakt mPEG-maleïmide. 25 Een glycerol-vertakt mPEG-maleïmide is een vertakte PEG die de voorkeur heeft. Bij voorkeur is de PEG een lineair mPEG-maleïmide. De PEG dient een gewichtsgemiddeld mole-cuulgewicht in het traject van ongeveer 1 kD tot ongeveer 50 kD te hebben. Bij voorkeur ligt het gemiddelde mole-30 cuulgewicht in het traject van ongeveer 5 kD tot 45 kD, liever ongeveer 10-12 kD tot ongeveer 40-45 kD, of ongeveer 20 kD tot ongeveer 40-45 kD. Van bijzonder belang is een lineaire mPEG, zoals die getoond in formule 1, met een gewichtsgemiddeld molecuulgewicht van ongeveer 12 kD of 35 ongeveer 20 kD. De glycerol-vertakte mPEG met formule 2 is eveneens van belang en heeft bij voorkeur een gewichtsge- 10 · I* middeld molecuulgewicht van ongeveer 20 kD of ongeveer 43 kD.

PEG'S die de voorkeur hebben en geschikt geactiveerd zijn voor conjugatie met de thiolgroep van cysteine van 5 (E10C) hPYY3_36 of (D11C) PYY3-36 zijn de verbindingen met de formules 1 en 2. In de lineaire mPEG met formule _1 is n een geheel getal in het traject van ongeveer 75 tot 800, bij voorkeur ongeveer 90-135, of ongeveer 250-295 of ongeveer 375 tot 525 of ongeveer 600 tot 750, of ongeveer 425 10 tot 475 of ongeveer 650 tot 700, of ongeveer 437 tot 463 of 675 tot 600. In de glycerol-vertakte mPEG met formule 2 is elke m ongeveer dezelfde en is deze een geheel getal in het traject ongeveer 150 tot 500, bij voorkeur ongeveer 160 tot 285 of ongeveer 400 tot 525, of ongeveer 200 tot 15 250 of 450 tot 500.

O

CH3(OCH2CH2)nOCH2CH2CH2NHCOCH2CH2N^^jj

O

CH2-(OCH2CH2)mOCH3 CH-(OCH2CH2)mOCH3 1 'h

CH2 -NHC(0)CH2CH2N

r 20 2 11

Een grote verscheidenheid van PEG'S die geschikt geactiveerd zijn voor conjugatie met doelfunctionaliteiten in de zij keten van aminozuren in peptiden, bijv. keto-, thiol-, hydroxyl-, carboxyl- of vrije aminounctionalitei-5 ten, is commercieel verkrijgbaar bij een aantal leveranciers, bijvoorbeeld van NOF Corporation, Tokio, Japan of Nektar Therapeutics Corporation, Huntsville, AL, VS.

Een ander aspect van de onderhavige uitvinding heeft betrekking op conjugaten van de onderhavige PYY3_36-varian-10 ten en polyethyleenglycol.

In één uitvoeringsvorm is het conjugaat een verbinding met formule 3 >-r" mPEG— L—N \

O

15 3 waarin de mPEG-rest lineair of vertakt is en een gewichts-gemiddeld molecuulgewicht heeft in het traject van ongeveer 1 kD tot 50 kD, en bij voorkeur 5 kD tot ongeveer 45 20 kD, en liever ongeveer 10 kD of 12 kD tot ongeveer 40 of 45 kD, of ongeveer 20 kD tot ongeveer 40 kD of 45 kD en nog liever ongeveer 10 of 12 kD tot ongeveer 20 kD of 25 kD, en nog liever zelfs ongeveer 12 kD of ongeveer 20 kD.

L een groep is met de formule 25 -0(CH2)pNHC(0) (CH2)r- waarin p een geheel getal van 1 tot 6, bij voorkeur 1 tot 3, liever 2 of 3, liefst 3 is (zoals afgebeeld in de on-30 derstaande formule 4^) en r een geheel getal van 1 tot 6, bij voorkeur 1 tot 3, liever 2 of 3 en liefst 2 is, of L een groep is met de formule * 12 -NHC(O) (CH2)s- waarin s een geheel getal van 1 tot 6, bij voorkeur 1 tot 3, liever 2 of 3 en liefst 2 is en 5 -SR het polypeptide (E10C) hPYY3_36 of (D11C) hPYY3-36 is, waarin S het zwavelatoom van de thiolgroep van cysteine is.

Een voorkeursuitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding is het lineaire mPEG-PYY3-36~variantconjugaat met 10 formule 4 V,

CH3(0CH2CH2)n0CH2CH2CH2NHC(0)CH2CH2N

o 4 15 waarin n een geheel getal in het traject van ongeveer 750 tot 800, en bij voorkeur ongeveer 90-135, of ongeveer 250-295, of ongeveer 375 tot 525 of ongeveer 600 tot 750, of ongeveer 437 tot 463 of ongeveer 675 tot 700 is, en -SR het polypeptide (E10C) hPYY3_36 of (D11C) hPYY3_36 is, waarin S 20 het zwavelatoom van de thiolgroep van cysteine is, of een farmaceutisch aanvaardbaar zout daarvan. Bij voorkeur heeft de (CH2CH2O)n-rest een gewichtsgemiddeld molecuulge-wicht van ongeveer 12 kD of ongeveer 20 kD. Het conjugaat waarin -SR het polypeptide (E10C) hPYY3_36 is, is van bij-25 zonder belang.

Een ander aspect van de onderhavige uitvinding heeft betrekking op conjugaten waarin de PEG-rest vertakt is. Voorkeursconjugaten in deze categorie omvatten een glyce-rol-vertakte PEG-rest. Van bijzonder belang is het conju-30 gaat met de formule 5 * 13 CH2-(OCH2CH2)inOCH3 CH—(OCH2CH2)mOCH3 1 V, o 5 waarin elke m ongeveer dezelfde is en een geheel getal in het traject van ongeveer 150 tot 550, bij voorkeur onge-5 veer 160 tot 285 of ongeveer 400 tot 525, of ongeveer 200 tot 250 of ongeveer 450 tot 500 is, en -SR het (E10C) hPYY3-36- of (DllC) hPYY3-36~polypeptide is, waarin S het zwavelatoom van de thiolgroep van cysteine is, of een farmaceutisch aanvaardbaar zout daarvan. Bij voorkeur 10 heeft elke (CH2CH20)m-rest een gewichtsgemiddeld molecuul-gewicht in het traject van ongeveer 9-11 kD of ongeveer 20-22 kD. Bij voorkeur is het gecombineerde gewichtsgemid-delde molecuulgewicht van de (CH2CH20),n-resten ongeveer 20 kD of ongeveer 43 kD. Het conjugaat waarin -SR het poly-15 peptide (E10C)hPYY3_36 is, is van bijzonder belang.

De onderhavige uitvinding voorziet ook in een mono-klonaal antilichaam dat specifiek bindt aan een polypeptide dat de aminozuursequentie zoals getoond in SEQ ID NO: 3 of SEQ ID NO: 4 omvat. In één uitvoeringsvorm van dit as-20 peet van de onderhavige uitvinding is het polypeptide ge-pegyleerd op de cystelnerest.

Bovendien voorziet de onderhavige uitvinding in po-lynucleotidesequenties die coderen voor de polypeptidese-quenties van de onderhavige uitvinding; bij voorkeur code-25 ren deze voor SEQ ID NO: 3 en SEQ ID NO: 4.

In een andere uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding wordt voorzien in een farmaceutisch preparaat dat een PYY-agonist van de onderhavige uitvinding en een far-

1 * I

14 maceutisch aanvaardbare drager omvat. In een andere uitvoeringsvorm omvat het preparaat eveneens ten minste een extra farmaceutisch middel, dat een middel kan zijn dat bruikbaar is bij de behandeling van de primaire indicatie 5 voor het preparaat of een co-morbiditeit van de primaire indicatie. Het extra farmaceutische middel is bij voorkeur een middel tegen obesitas. Het preparaat bevat bij voorkeur een therapeutisch effectieve hoeveelheid van een PYY-agonist van de onderhavige uitvinding of een therapeutisch 10 effectieve hoeveelheid van een combinatie van een PYY-ago-nist van de onderhavige uitvinding en een extra farmaceutisch middel.

Ook wordt voorzien in een werkwijze voor het behandelen van een ziekte, aandoening of stoornis gemoduleerd 15 door een Y2R-agonist bij zoogdieren, die omvat het perifeer toedienen aan een zoogdier dat aan een dergelijke behandeling behoefte heeft van een therapeutisch effectieve hoeveelheid van een PYY-agonist van de onderhavige uitvinding. De PYY-agonist van de onderhavige uitvinding kan al-20 leen of in combinatie worden gebruikt met ten minste een extra farmaceutisch middel dat bruikbaar is bij de behandeling van de ziekte, aandoening of stoornis of een co-morbiditeit van de ziekte, aandoening of stoornis. De ziekten, aandoeningen of stoornissen gemoduleerd door een 25 Y2R-agonist in zoogdieren omvatten obesitas en het hebben van overgewicht. Co-morbiditeiten van dergelijke ziekten, aandoeningen of stoornissen zouden overigens waarschijnlijk worden verbeterd door behandeling van dergelijke ziekten, aandoeningen of stoornissen. Bovendien wordt 30 voorzien in een werkwijze voor het behandelen van obesitas bij een zoogdier dat aan een dergelijke behandeling behoefte heeft, die omvat het perifeer toedienen aan het zoogdier van een therapeutisch effectieve hoeveelheid van een PYY-agonist van de onderhavige uitvinding.

35 Ook wordt voorzien in een werkwijze voor het vermin deren van het gewicht of het bevorderen van gewichtverlies (met inbegrip van het voorkomen of het tegengaan van ge- 15 wichtsvermeerdering) bij een zoogdier, die omvat het perifeer toedienen aan het zoogdier van een hoeveelheid van een PYY-agonist van de onderhavige uitvinding die het gewicht beheerst of het gewicht vermindert.

5 Ook wordt voorzien in een werkwijze voor het vermin deren van de hoeveelheid opgenomen voedsel bij een zoogdier, die omvat het perifeer toedienen aan het zoogdier van een hoeveelheid van een PYY-agonist van de onderhavige uitvinding die de hoeveelheid opgenomen voedsel vermin-10 dert.

Ook wordt voorzien in een werkwijze voor het induceren van verzadiging bij een zoogdier, die omvat het perifeer toedienen aan het zoogdier van een verzadiging-inducerende hoeveelheid van een PYY-agonist van de onder-15 havige uitvinding.

Ook wordt voorzien in een werkwijze voor het verminderen van de hoeveelheid opgenomen calorieën bij een zoogdier, die omvat het perifeer toedienen aan het zoogdier van een hoeveelheid van een PYY-agonist van de onderhavige 20 uitvinding die de hoeveelhied opgenomen calorieën vermindert. De PYY-agonist kan alleen of in combinatie worden toegediend met ten minste één extra farmaceutisch middel, bij voorkeur een middel tegen obesitas.

Bij elk van de hierin beschreven werkwijzen en in de 25 aangehechte conclusies kan de PYY-agonist alleen of in combinatie worden toegediend met ten minste één extra farmaceutisch middel, bij voorkeur een middel tegen obesitas.

De onderhavige PYY-agonisten en preparaten die deze bevatten zijn ook bruikbaar bij de vervaardiging van een 30 geneesmiddel voor de hierin genoemde therapeutische toepassingen.

Definities en afkortingen

De frase "farmaceutisch aanvaardbaar" betekent dat de 35 stof of het preparaat in chemische en/of toxicologische zin verenigbaar dient te zijn met de andere bestanddelen 16 die deel uitmaken van een preparaat en/of het zoogdier dat daarmee wordt behandeld.

De term "PYY-agonist" betekent elke verbinding die één of meer van de effecten veroorzaakt die worden uitge-5 lokt door PYY, bij voorkeur PYY3-36, in vivo of in vitro.

De frase "therapeutisch effectieve hoeveelheid" betekent een hoeveelheid van een PYY-agonist van de onderhavige uitvinding die de hoeveelheid opgenomen calorieën vermindert, het lichaamsgewicht verlaagt en/of de hoeveelheid 10 lichaamsvet verlaagt, ten opzichte van geschikte controle-waarden die voorafgaand aan de behandeling of in een met vehiculum behandelde groep werden vastgesteld.

De term "zoogdier" betekent mensen alsmede alle andere warmbloedige leden van het dierenrijk die in het bezit 15 zijn van een homeostatisch mechanisme in de klasse zoogdieren, bijv. gezelschapsdieren, dieren in de dierentuin en zoogdieren die tot voedsel dienen. Enkele voorbeelden van gezelschapsdieren zijn hondachtigen (bijv. honden), katachtigen (bijv. katten) en paarden; enkele voorbeelden 20 van zoogdieren die tot voedsel dienen zijn varkens, rundvee, schapen en dergelijke. Bij voorkeur is het zoogdier een mens of een gezelschapsdier. Liefst is het zoogdier een mens, zowel een man als een vrouw.

De termen "behandelen" of "behandeling" omvatten zo-25 wel de preventieve, dat wil zeggen de profylactische, als palliatieve behandeling.

De term "perifere toediening" betekent toediening buiten het centrale zenuwstelsel. Perifere toediening omvat niet de rechtstreekse toediening aan de hersenen. Pe-30 rifere toediening omvat, maar is niet beperkt tot, intra-vasculaire, intramusculaire, subcutane, orale, sublingua-le, enterale, rectale, transdermale of intra-nasale toediening, of toediening door middel van inhalatie.

Een niet in de natuur voorkomend aminozuur dat ge-35 schikt is voor gebruik in de onderhavige uitvinding is meestal een aminozuur met de volgende formule, die afwijkt van de 20 in de natuur voorkomende aminozuren (Cantor en 17

Shimmel, Biophysical Chemistry, deel 1, WH Freeman & Sons, San Francisco, VS, 42-43, 1980), waarin R1 een substituent omvattende een keto-, thiol-, carboxyl-, hydroxyl- of een vrije aminofunctionaliteit is, zoals die beschreven in 5 Amerikaanse octrooiaanvrage 2005/0208536, die hierin in zijn geheel is opgenomen door verwijzing.

R1

H2N ^SVSS'C°2H

10 Dergelijke niet in de natuur voorkomende aminozuren omvatten bijvoorbeeld thiotyrosine, ornithine, 3-mercapto-fenylalanine, 3- of 4-aminofenylalanine, 3- of 4-acetylfe-nylalanine, 2- of 3-hydroxyfenylalanine (o- of m-tyrosi-ne), hydroxymethylglycine, aminoethylglycine, 1-methyl-l- 15 mercaptoethylglycine, aminoethylthioethylglycine en mer-captoethylglycine. Vele van de niet in de natuur voorkomende aminozuren die bruikbaar zijn in de onderhavige uitvinding zijn commercieel verkrijgbaar. Andere kunnen worden bereid met werkwijzen die stand der techniek zijn.

20 Thiotyrosine kan bijvoorbeeld worden bereid met de werkwijze beschreven door Lu et al., J. Am. Chem. Soc 119:7173-7180, 1997, die hierin is opgenomen door verwijzing.

De term "humane PYY" of "hPYY" betekent een polypep- 25 tide met 36 aminozuren waarvan het C-uiteinde geamideerd is en mett de volgende aminozuursequentie: YPIKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRY-NH2 [SEQ ID NO:1] 30 De term "hPYY3-36" betekent het C-terminale 3 4-meer hPYY met de volgende aminozuursequentie: IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRY-NH2 [SEQ ID NO:2] 18

De term " (E10C) hPYY3_36" betekent het C-terminale 34-meer hPYY waarin de glutaminezuurrest 10 van hPYY is vervangen door een cysteïnerest, en dat volgende aminozuurse-quentie heeft: 5 IKPEAPGCDASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRY-NH2 [SEQ ID NO:33.

De tem " (D11C) hPYY3.36” betekent het C-terminale 34-meer hPYY waarin de asparaginezuurrest 11 van hPYY is ver-10 vangen door een cysteïnerest, en dat de volgende amino-zuursequentie heeft: IKPEAPGECASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRY-NH2 [SEQ ID NO:4].

15 Korte beschrijving van de afbeeldingen

Figuur 1 is een diagram van omgekeerde fase-HPLC, waarbij het gezuiverde (E10C) hPYY3-36~peptide wordt gevolgd over een Zorbax Eclipse ED8C8-kolom.

Figuur 2 is een grootte-uitsluitings-HPLC, waarbij 20 het reactiemengsel van het lineaire 30 kD mPEG-maleïmide plus (E10C) hPYY3-36 wordt gevolgd over een Shodex 804 SEC-kolom.

Figuur 3 is een foto van SDS PAGE van fracties uit de SP Hitrap-zuivering van lineair 30 kD mPEG-maleïmide 25 (E10C) hPYY3_36· MW = molecuulgewichten van standaarden, L = kolombelading; FT = doorstroming; 4-23 = elutiefracties.

Figuur 4 is een omgekeerde fase-HPLC, waarbij het gezuiverde (D11C) hPYY3-36~peptide wordt gevolgd over een Zorbax Eclipse XDB-C8-kolom.

30 Figuur 5 is een grootte-uitsluitings-HPLC, waarbij het reactiemengsel van het lineaire 30 kD mPEG-maleïmide plus (D11C) hPYY3-36 wordt gezuiverd op een Shodex 804 SEC-kolom.

Figuur 6 is een grootte-uitsluitings-HPLC die het 35 elutieprofiel toont van het op een Shodex 804 SEC-kolom gezuiverde lineaire 30 kD mPEG-maleïmide (E10C) hPYY3-36-product.

• » 19

Figuur 7 is een grootte-uitsluitings-HPLC die het elutieprofiel toont van het op een Shodex 804 SEC-kolom gezuiverde lineaire 30 kD mPEG-maleïmide (D11C) hPYY3_36-product.

5 Figuur 8 is een grootte-uitsluitings-HPLC van het re- actiemengsel van het glycerol-vertakte 43 kD mPEG-maleïmi-de plus (E10C) hPYY3-36 op een Shodex 804 SEC-kolom.

Figuur 9 is een grootte-uitsluitings-HPLC het elutie-profiel toont van het op een Shodex 804 SEC-kolom gezui-10 verde glycerol-vertakte 43 kD mPEG-maleïmide (E10C) hPYY3-36-product.

Figuur 10 is een grafiek van de remming van de cumulatieve hoeveelheid opgenomen voedsel bij muizen die voedsel is onthouden na intraperitoneale (i.p.) injectie. Fi-15 guur 10A toont het effect van de dosis van natief PYY3-36 in vergelijking met de groep die vehiculum kreeg toegediend. Figuur 10B toont het effect van de dosis het lineaire 30 kD mPEG-maleïmide (E10C) hPYY3_36.

Figuur 11 toont het effect op de hoeveelheid opgeno-20 men voedsel bij i.p. injectie in muizen die voedsel werd onthouden van glycerol-vertakte 43 kD mPEG-maleïmide (E10C) PYY3-36 in vergelijking met vehiculum en het lineaire 30 kD mPEG-maleïmide (E10C) PYY3.3$. Figuur 11A is een lijngrafiek die de respons gedurende een 6 uur na injectie 25 laat zien. Figuur 11B is een staafdiagram dat de effecten vergelijkt gedurende 24 uur na injectie.

Figuur 12 toont de effecten van i.p. injectie van vehiculum, PYY3.36 en lineaire 30 kD mPEG-maleïmide (E10C) PYY3-36 op spontaan gevoede muizen. Figuur 12A toont 30 het effect op de hoeveelheid opgenomen voedsel en figuur 12B toont het effect op het lichaamsgewicht.

Figuur 13 toont de effecten van subcutane (S.C.) injectie van vehiculum, PYY3-3S en lineaire 30 kD mPEG-maleïmide (E10C) hPYY3-36 op spontaan gevoede muizen. Figuur 35 13A toont het effect op de hoeveelheid opgenomen voedsel en figuur 13B toont het effect op het lichaamsgewicht.

20

Figuur 14 toont het in contact komen van plasma met PYY in muizen na i.p. injectie van 0,1 mg/kg. Figuur 14A demonstreert de niveaus van PYY in het plasma na injectie van hPYY3-36 en figuur 14B toont de niveaus van PYY in het 5 plasma na injectie van het lineaire 30 kD mPEG-maleïmide (E10C)hPYY3-36.

Figuur 15 is een grafiek van de respons tegen de concentratie voor PYY3-36 of lineaire 30 kD mPEG-maleïmide (E10C) PYY3-36 uit de Scintillation Proximity Assay (SPA), 10 waarbij de liganden concurreren met 125I-PYY1_36 voor binding aan de Y2R die tot expressie wordt gebracht in KAN-TS-cellen.

Figuur 16 is een grafiek van de respons tegen de concentratie voor PYY3-36 of lineiare 30 kD mPEG-maleïmide 15 (E10C) PYY3-36 uit de GTPy[35S]-bindingsassay met Y2R die tot expressie wordt gebracht op KAN-TS-membranen.

Gedetailleerde beschrijving van de uitvinding

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op PYY-20 agonisten die varianten zijn van PYY3_36 en gepegyleerde conjugaten daarvan, die ten minste één verbeterde chemische of fysiologische eigenschap kunnen hebben gekozen uit, maar niet beperkt tot, lagere klaringssnelheid, langere verblijfduur in het plasma, langere in vivo activi-25 teit, hogere potentie, grotere stabiliteit, betere oplosbaarheid en lagere antigeniciteit.

Een PYY3_36-variant van de onderhavige uitvinding die de voorkeur heeft, is (E10C) hPYY3_36· Een andere voorkeursvariant is (D11C) hPYY3-36- Deze en andere varianten van de 30 onderhavige uitvinding kunnen synthetisch worden geproduceerd met recombinatie of op andere manieren, zoals hierna en wordt beschreven in de voorbeelden hierin, of met analoge werkwijzen.

Behalve de hierboven genoemde substituties (bijv. 35 E10C en DllC) kunnen de PYY-agonisten van de onderhavige uitvinding ook één of meer conservatieve aminozuursubsti-tuties op andere aminozuurposities omvatten. Conservatieve 21 fr substituties kunnen bijvoorbeeld worden uitgevoerd volgens de onderstaande tabel. Alifatische niet-polaire, polaire-ongeladen en polaire-geladen aminozuren kunnen de vervanger voor een ander alifatisch aminozuur zijn dat respec-5 tievelijk een niet-polair, polair-ongeladen of polair-geladen aminozuur is. Bij voorkeur treden dergelijke substituties op tussen aminozuren in dezelfde regel van de derde kolom van de onderstaande tabel. Conservatieve substituties van aminozuren kunnen ook worden uitgevoerd tus-10 sen aromatische aminozuren die in de onderstaande tabel zijn vermeld.

I ..... - . II I I '-I η·ΙΙ 1 imili.ai lil I n I II I I ' ALIFATISCH Niet-polair GAP_ __I L V_

Polair - ongeladen C S T M_ __N_Q_

Polair - geladen D E_ ___K_R_ AROMATISCH H F W Y |

Synthetische productie 15 De PYY3-36-varianten van de onderhavige uitvinding, bijv. (E10C) hPYY3_36 en (D11C)hPYY3_36, kunnen worden bereid met gebruik van standaardtechnieken voor peptidesynthese uit de stand der techniek, bijv. door middel van peptidesynthese met een vaste fase die wordt uitgevoerd met een 20 automatische peptidesynthesizer (bijv. model 433 A, Applied Biosystems, Foster City, CA, VS) , waarbij chemie met t-Boc- of Fmoc-groepen wordt gebruikt. Een samenvatting van de vele technieken voor peptidesynthese die beschikbaar zijn, kan worden gevonden in Solid Phase Peptide Syn-25 thesis, 2e editie (Stewart, J.M. en Young, J.D., Pierce

Chemical Company, Rockford, IL, VS 1984). Zie ook het boek Solid-phase Organic Synthesis (Burgess, K., John Wiley & Sons, New York, NY, VS, 2000) en het artikel van Engels et al., Angew. Chem. Jntl. Ed., 28:716-34, 1989. Alle boven- » 22 staande literatuurplaatsen worden hierin opgenomen door verwijzing.

De PYY3-36~varianten van de onderhavige uitvinding worden bij voorkeur geconjugeerd met een PEG. Conjugatiereac-5 ties, die pegyleringsreacties worden genoemd, werden in het verleden in oplossing uitgevoerd met een molaire overmaat van polymeer en zonder rekening te houden met het feit waar het polymeer aan het eiwit zou kunnen binden. Dergelijke algemene technieken zijn echter meestal ontoe-10 reikend gebleken voor het conjugeren van biologisch actieve eiwitten aan niet-antigene polymeren terwijl daarbij voldoende biologische activiteit behouden bleef. Een manier om na pegylering de biologische activiteit van de PYY3-36~agonistvariant te behouden is het bij de koppe-15 lingswerkwijze in aanzienlijke mate vermijden van de conjugatie van reactieve groepen van de variant geassocieerd met binding van de agonist aan de doelreceptor. Een aspect van de onderhavige uitvinding is het voorzien in een werkwijze voor het conjugeren van een polyethyleenglycol aan 20 een PYY3_36-variant-agonist van de onderhavige uitvinding op specifieke reactieve plaatsen die nagenoeg niet storend werken op één of meer bindingsplaatsen van de receptor, zodat daarbij hoog activiteitsniveau de activiteit in grotere mate behouden blijft. Een ander aspect van de onder-25 havige uitvinding is de insertie van reactieve resten in PYY3_36 de agonistvarianten daarvan voor conjugatie te voorzien van een polyethyleenglycol met een beperkte verandering van activiteit.

De chemische modificatie via een covalente binding 30 kan worden uitgevoerd onder geschikte omstandigheden die in het algemeen worden toegepast bij een conjugatiereactie van een biologisch actieve stof met een geactiveerde PEG. De conjugatiereactie wordt onder relatief milde omstandigheden uitgevoerd, zodat inactivering van de PYY3-36_va-35 riant-agonist wordt vermeden. Milde omstandigheden omvatten het houden van de pH van de reactieoplossing in het traject van ongeveer 3 tot 10 en de reactietemperaturen in 23 het traject van ongeveer 0 tot 40°C. Functionaliteiten die geen doel zijn in de PYY3_36-varianten en onder de omstandigheden voor pegylering reactief zijn voor de geactiveerde PEG worden bij voorkeur beschermd met een geschikte be-5 schermende groep die na pegylering van de doelfunctie kan worden verwijderd. Bij het pegyleren van vrije aminogroe-pen met reagentia zoals PEG-aldehyden of PEG-succinimiden wordt meestal een pH in het traject van ongeveer 3 tot 10 en bij voorkeur van ongeveer 4 tot 7,5 gehandhaafd. De 10 koppelingsreactie wordt bij voorkeur uitgevoerd in een geschikte buffer (pH = 3 tot 10), bijv. fosfaat, MES, ci-traat, acetaat, succinaat of HEPES, gedurende ongeveer 1 tot 48 uur bij een temperatuur in het traject van ongeveer 4 tot 40°C. Bij het pegyleren van thiolgroepen met reagen-15 tia zoals PEG-maleïmiden, PEG-vinylsulfonen of PEG-ortho-pyridyldisulfiden wordt bij voorkeur een pH in het traject van ongeveer 4 tot 8 gehandhaafd. PEG-aminen zijn bruikbaar bij de pegylering van ketogroepen, bijv. in p-acetyl-fenylalanine, en kunnen worden bereid als beschreven door 20 Pillai et al., J. Org. Chem., 45:5364-5370, 1980.

De conjugatiereacties van de onderhavige uitvinding voorzien meestal in een reactiemengsel of iets dergelijks dat de gewenste mono-gepegyleerde PYY3-36-variant, alsmede niet gereageerd hebbend PYY3_36-variantpeptide, niet gerea-25 geerd hebbende PEG en doorgaans minder dan ongeveer 20% moleculen met een hoog molecuulgewicht die conjugaten die meer dan één PEG-streng bevatten en/of geaggregeerde moleculen kunnen omvatten, bevat. Nadat de niet gereageerd hebbende moleculen en moleculen met een hoog molecuulge-30 wicht zijn verwijderd, worden preparaten verkregen die voornamelijk mono-gepegyleerde PYY3_36-varianten bevatten. Gegeven dat de conjugaten vaak een enkele polymeerstreng bevatten zijn de conjugaten nagenoeg homogeen.

Het gewenste conjugaat van de PEG-PYY3-36_variant kan 35 uit het reactiemengsel worden geïsoleerd met gebruikelijke werkwijzen die meestal worden gebruikt voor de zuivering van eiwitten, zoals dialyse, uitzouten, ultrafiltratie, 24 ionenwisselingschromatografie, hydrofobe interactie/chro-matografie (HIC), gelchromatografie en elektroforese.

Ionenwisselingschromatografie is bijzonder effectief bij het verwijderen van niet gereageerd hebbende PEG of niet 5 gereageerd hebbende PYY3-3e-variant. De scheiding van het gewenste conjugaat van de PEG-variant kan worden bewerkstelligd door het reactiemengsel dat de gemengde moleculen bevat in een bufferoplossing met een pH van ongeveer 4 tot ongeveer 10, en bij voorkeur van minder dan 8 te brengen, 10 zodat deamidering wordt vermeden. De bufferoplossing bevat bij voorkeur één of meer buff er zouten gekozen uit, maar niet beperkt tot, KC1, NaCl, K2HP04, KH2P04, Na2HP04,

NaH2P04, NaHC03, NaB04 en CH3C02Na.

Als het in de pegyleringsreactie te gebruiken buffer-15 systeem verschilt van het bij de scheidingswerkwij ze gebruikte, wordt het reactiemengsel van de pegylering onderworpen aan bufferuitwisseling/diafiltratie of verdund met een voldoende hoeveelheid van de aanvankelijke scheidings-buffer.

20 De fractionering van de conjugaten in een mengel dat de gewenste moleculen bevat, wordt bij voorkeur uitgevoerd met gebruik van een medium voor ionenwisselingschromatograf ie. Dergelijke media zijn in staat tot de selectieve binding van conjugaten van PEG-PYY3-36-variant door ver-25 schillen in lading die enigszins voorspelbaar zijn. De op-pervlaktelading van een PYY3-36~variant wordt bijvoorbeeld bepaald door het aantal beschikbare geladen groepen op het oppervlak van het peptide die beschikbaar zijn voor interactie met de kolomdrager die niet in contact zijn geweest 30 met PEG. Deze geladen groepen dienen meestal als mogelijke bindingspunt van PEG-polymeren. Derhalve zullen de PEG-PYY3_36-variant-conjugaten een lading hebben die verschilt van andere aanwezige moleculen, hetgeen een seletieve isolering mogelijk maakt.

35 Voor zuivering van de onderhavige PEG-PYY3_36~variant- conjugaten hebben ionenwisselaarharsen in het bijzonder de voorkeur. Kationenwisselaarharsen zoals sulfopropylharsen 25 worden bij de zuiveringswerkwijze van de onderhavige uitvinding gebruikt. Een niet-beperkende opsomming van katio-nenwisselaarhars die geschikt zijn voor gebruik bij de onderhavige uitvinding omvatten SP-hitrap®, SP Sepharose HP® 5 en SP Sepharose® fast flow. Andere geschikte kationenwis-selaarharsen, bijv. S- en CM-harsen, kunnen ook worden gebruikt .

Bij voorkeur wordt de kationenwisselaarhars op gebruikelijke wijze in een kolom gepakt en geëquilibreerd. 10 Een buffer met dezelfde pH en osmolaliteit als de oplossing van de met PEG geconjugeerde PYY3-36-variant wordt gebruikt. De elutiebuffer bevat bij voorkeur één of meer zouten gekozen uit, maar niet beperkt tot: CH3C02Na, HEPES, KC1, NaCl, K2HPO4, KH2PO4, Na2HP04, NaH2P04, NaHC03, NaB04, en 15 (NH4)2C03. De oplossing die het conjugaat bevat, wordt ver volgens op de kolom geabsorbeerd, waarbij niet gereageerd hebbende PEG en enkele moleculen met hoog molecuulgewicht niet worden vastgehouden. Na afloop van het opbrengen wordt een gradiëntstroom van een elutiebuffer met oplopen-20 de zoutconcentraties op de kolom aangebracht, waarbij de gewenste fractie van met PEG geconjugeerde PYY3_36-variant wordt geëlueerd. De geëlueerde en samengevoegde fracties worden bij voorkeur na de scheidingsstap met de kationen-wisseling beperkt tot uniforme polymeerconjugaten. Een 25 niet-geconjugeerde PYY3_36-variant kan vervolgens met gebruikelijke technieken uit de kolom worden gewassen. Desgewenst kunnen bovendien mono- en meervoudig gepegyleerde PEG-PYY3_36-variantmoleculen en moleculen met een hoger molecuulgewicht van elkaar worden gescheiden via extra 30 ionenwisselingschromatografie over een ionenwisselaar of grootte-uitsluitingschromatografie.

In plaats van een lineaire gradiënt kunnen technieken worden gebruikt waarbij meervoudige isocratische stappen van toenemende concentratie worden gebruikt. Meervoudige 35 isocratische elutiestappen van toenemende concentratie zullen leiden tot de opeenvolgende elutie van meervoudig gepegyleerde/geaggregeerde en vervolgens mono-gepegyleerde / 26 PYY3-36~variant conjugaten. Ook kunnen elutietechnieken op basis van pH-gradiënten worden gebruikt. Het temperatuur-traject voor elutie ligt in het algemeen tussen ongeveer 4°C en ongeveer 25°C. De elutie van de PEG-PYY3-36-variant 5 wordt gevolgd door UV-absorptie bij 280 nm. Verzameling van de fracties kan worden bereikt met eenvoudige elutie-profielen in de tijd.

Recombinant-expressie 10 Nucleïnezuurmoleculen

De nucleïnezuurmoleculen die coderen voor een (E10C) hPYY3_36-polypeptide kunnen één van de volgende nu-cleïnezuursequenties omvatten (de codonmutatie voor E10C-substitutie is onderstreept): 15 atcaaacccgaggctcccggctgtgacgcctcgccggaggagctgaaccgctactacg cctccctgcgccactacctcaacctggtcacccggcagcggtat (SEQ ID NO: 5) of 20 atcaaacccgaggctcccggctgcgacgcctcgccggaggagctgaaccgctactacg cctccctgcgccactacctcaacctggtcacccggcagcggtat (SEQ ID NO: 6) .

De nucleïnezuurmoleculen die coderen voor een 25 (D11C)hPYY3_36-polypeptide kunnen één van de volgende nu- cleïnezuursequenties omvatten (de codonmutatie voor D11C-substitutie is onderstreept): atcaaacccgaggctcccggcgaatgtgcctcgccggaggagctgaaccgctactacg 30 cctccctgcgccactacctcaacctggtcacccggcagcggtat (SEQ ID NO: 7) of atcaaacccgaggctcccggcgaatqcgcctcgccggaggagctgaaccgctactacg cctccctgcgccactacctcaacctggtcacccggcagcggtat (SEQ ID NO: 35 8) .

27

Deze sequenties kunnen ook een stopcodon bevatten (bijv. tga, taa, tag) op het C-uiteinde bevatten en op diverse wijzen gemakkelijk worden verkregen, waaronder, zonder beperking: chemische synthese, genetische mutatie van 5 wild type hPYY-polynucleotidesequenties die verkregen zijn uit cDNA of onderzoek van de genoombibliotheek, onderzoek van de expressiebibliotheek en/of amplificatie met de po-lymerasekettingreactie (polymerase chain reaction; PCR) van cDNA. Nucleïnezuurmoleculen die coderen voor de 10 (E10C) hPYY3_36“ en (D11C) hPYY3_36~varianten kunnen worden ge produceerd met gebruik van plaats-gerichte mutagenese, PCR-amplificatie en andere geschikte werkwijzen, waarbij een of meer primers de gewenste puntmutaties hebben. De hierin beschreven recombinant DNA-werkwijzen en mutagene-15 sewerkwijzen zijn in het algemeen die genoemd door Sam-brook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) en Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., redacteuren, Green Publishers Inc. en Wiley and Sons 1994). Indien het wense-20 lijk zou zijn dat een ander niet in de natuur voorkomend aminozuur in plaats van E10 of Dll wordt gebruikt, dan kan een dergelijk peptide recombinant tot expressie worden gebracht met werkwijzen die bijvoorbeeld zijn beschreven in Amerikaanse octrooiaanvrage 2005-0208536, die hierin is 25 opgenomen door verwijzing.

Nucleïnezuurpolynucleotiden die coderen voor de ami-nozuursequentie van hPYY's kunnen worden geïdentificeerd door expressiekloneren, waarbij wordt gebruik gemaakt van de detectie van positieve klonen op grond van een eigen-30 schap van het tot expressie gebrachte eiwit. Meestal worden nucleïnezuurbibliotheken onderzocht door de binding van een antilichaam of een andere bindingspartner (bijv. een receptor of ligand) aan gekloneerde eiwitten die tot expressie worden gebracht en verschijnen op een celopper-35 vlak van een gastheer. Het antilichaam of de bindingspartner wordt gemodificeerd met een detecteerbare label, waar- * * 28 door cellen worden geïdentificeerd die de gewenste kloon tot expressie brengen.

Recombinante expressietechnieken uitgevoerd volgens de beschrijvingen die hierna worden gegeven kunnen worden 5 gevolgd voor het produceren van polynucleotiden die coderen voor (E10C) hPYY3-36 en (D110C) hPYY3_36 en voor het tot expressie brengen van de polypeptiden waarvoor wordt gecodeerd. Door inserteren van een nucleïnezuursequentie die codeert voor de arainozuursequentie van een (E10C) hPYY3-36-10 of een (D11C) hPYY3_36~variant in een geschikte vector kan een deskundige bijvoorbeeld gemakkelijk grote hoeveelheden van de gewenste nucleotidesequentie produceren. De sequenties kunnen vervolgens worden gebruikt voor de vorming van detectieprobes of primers voor amplificatie. Als alterna-15 tief kan een polynucleotide dat codeert voor de aminozuur-sequentie van een (E10C) hPYY3_36- of een (D11C) hPYY3_36-polypeptide worden uitgevoerd in een expressievector. Door inbrengen van de expressievector in een geschikte gastheer kan de (E10C) hPYY3_36- of (D11C) hPYY3_36-variant waarvoor 20 wordt gecodeerd in grote hoeveelheden worden geproduceerd.

Een andere werkwijze voor het verkrijgen van een geschikte nucleïnezuursequentie is de polymerasekettingreac-tie (PCR). Bij deze werkwijze wordt cDNA bereid uit poly (A)+RNA of totaal RNA met gebruik van het enzym reverse-25 transcriptase. Twee primers, die meestal complementair zijn aan twee aparte gebieden van cDNA die coderen voor de aminozuursequentie van een (E10C) hPYY3.36- of een (D11C) hPYY3.36-variant worden vervolgens tezamen met een polymerase zoals een Taq-polymeriase toegevoegd aan het 30 cDNA, en het polymerase amplificeert het cDNA-gebied tussen de twee primers.

Een andere wijze van bereiding van een nucleïnezuur-molecuul dat codeert voor de aminozuursequentie van een (E10C) hPYY3-36_ of een (D11C) hPYY3-36-variant is de chemische 35 synthese met gebruik van werkwijzen die voor de deskundige bekend zijn, zoals die beschreven door Engels et al. in Angew. Chem. Intl. Ed., 28:716- 34, 1989. Deze werkwijzen 29 omvatten de fosfotriester-, fosforamidiet- en H-fosfonaat-werkwijzen voor de nucleïnezuursynthese. Een voorkeurswerkwijze voor een dergelijke chemische synthese is de synthese op een polymeer als drager, waarbij standaardfos-5 foramidietchemie wordt gebruikt. Meestal zal het DNA dat codeert voor de aminozuursequentie van een (E10C) hPYY3-36 een lengte van ongeveer honderd nucleotiden hebben. Nucle-inezuren die langer zijn dan ongeveer 100 nucleotiden kunnen met gebruik van deze werkwijzen als verscheidene frag-10 menten worden gesynthetiseerd. De fragmenten kunnen vervolgens aan elkaar worden geligeerd, hetgeen een volledige nucleotidesequentie van een (E10C) hPYY3-36~gen van volledige lengte vormt.

Het DNA-fragment dat codeert voor het amino-uiteinde 15 van het polypeptide, kan een ATG hebben, dat codeert voor een methioninerest. Deze methionine kan al of niet aanwezig zijn in de rijpe vorm van (E10C) hPYY3_36 of (D11C)LP443-36, afhankelijk van het feit of het in de gastheercel geproduceerde polypeptide bestemd is om te worden 20 afgescheiden uit die cel. Het codon dat codeert voor isol-eucine kan ook als startlokatie worden gebruikt. Andere werkwijzen die voor de deskundige bekend zijn, kunnen ook worden gebruikt. In bepaalde uitvoeringsvormen bevatten nucleïnezuurvarianten codons die zijn gewijzigd voor een 25 optimale expressie van een (E10C) hPYY3-36 of een (D11C) hPYY3-36 in een bepaalde gastheercel. De desbetreffende wijzigingen van het codon zullen afhankelijk zijn van (E10C) hPYY3_36 of (D11C)hPYY3_36 en de gastheercel die voor expressie wordt gekozen. Dergelijke "codonoptimalisa-30 tie” kan worden uitgevoerd met diverse werkwijzen, bijvoorbeeld door kiezen van codons die de voorkeur hebben voor gebruik bij sterk tot expressie gebrachte genen in een bepaalde gastheercel. Computeralgoritmen die codonfre-quentietabellen, zoals "Eco_high.Cod" voor codonpreferen-35 tie van sterk tot expressie gebrachte bacteriële genen om-vattenkunne worden gebruikt en worden verschaft door de University of Wisconsin Package Version 9.0 (Genetics Com- ψ 30 puter Group, Madison, Wis., VS). Andere bruikbare codon-frequentietabellen omvatten "Celegans_high.cod," "Cele-gans_low.cod," "Drosophila_high.cod," "Human_high.cod," "Maize_high.cod," en "Yeast_high.cod." 5

Vectoren en gastheercellen

Een nucleïnezuurmolecuul dat codeert voor de amino-zuursequentie van een (E10C) hPYY3_36 of een (D11C) hPYY3_36 wordt ingevoerd in een geschikte expressievector, waarbij 10 standaardligatietechnieken worden gebruikt. De vector wordt meestal zodanig gekozen dat deze functioneel is in de desbetreffende gebruikte gastheercel (de vector is dus verenigbaar met het inwendige van de gastheercel, zodat amplificatie van het gen en/of de expressie van het gen 15 kan optreden). Een nucleïnezuurmolecuul dat codeert voor de aminozuursequentie van een (E10C) -hPYY3_36 of een (D11C) hPYY3-36 kan worden geamplificeerd/tot expressie worden gebracht in prokaryotische cellen, gistcellen, insectencellen (baculovirussystemen) en/of eukaryotische gast-20 heercellen. Zie voor een overzicht van expressievectoren: Meth. Enz., vol. 185 (D. V. Goeddel, red., Academie Press, 1990).

Meestal zullen expressievectoren die in één van de gastheercellen worden gebruikt, sequenties bevatten voor 25 het onderhoud van plasmiden en voor het kloneren en de expressie van exogene nucleotidesequenties. Dergelijke sequenties die in bepaalde uitvoeringsvormen, gezamenlijk wordt aangeduid als "flankeringssequenties", zullen in bepaalde uitvoeringsvormen typisch één of meer van de vol-30 gende nucleotidesequenties omvatten: een promotor, één of meer versterkersequenties, een oorsprong van replicatie, een sequentie voor beëindiging van de transcriptie, een complete intronsequentie die een donor- en acceptor-splice-plaats bevat, een sequentie die codeert voor een 35 leadersequentie voor polypeptidesecretie, een ribosoombin-dingsplaats, een polyadenyleringssequentie, een polylin-kergebied voor invoegen van het nucleïnezuur dat codeert « 31 voor het polypeptide dat tot expressie moet worden gebracht en een selecteerbaar markerelement. Elk van deze sequenties zal hierna worden beschreven.

Eventueel kan de vector een coderende "tag"-sequentie 5 bevatten, dat wil zeggen een oligonucleotidemolecuul dat zich bevindt aan het 5'- of 3'-uiteinde van de coderende sequentie voor (E10C) I1PYY3-.36 of (D11C) hPYY3_36; de oligonu-cleotidesequentie codeert voor polyHis (zoals hexaHis), of een andere "tag" zoals FLAG, HA (hemaglutinine influenza-10 virus) of myc waarvoor commercieel verkrijgbare antilicha-men bestaan. Deze tag wordt bij expressie van het polypeptide meestal gekoppeld met het polypeptide en kan dienen als een middel voor affiniteitszuivering van de (E10C) hPYY3-36 of (D11C) hPYY3-36 uit de gastheercel. Affini-15 teitszuivering kan bijvoorbeeld worden bewerkstelligd met kolomchromatografie waarbij antilichamen tegen de tag als een affiniteitmatrix worden gebruikt. Eventueel kan de tag vervolgens op diverse manieren worden verwijderd uit de gezuiverde (E10C) hPYY3_36 of (D11C) hPYY3_36, zoals het ge-20 bruik van bepaalde peptidasen voor splitsing, bijv. en-terokinasedigestie 3' of een FLAGtag-sequentie die zich dichter bij het begin in de aminosequenties bevindt, zoals wordt getoond in SEQ ID NO's: 3-4.

Flankeringssequenties kunnen homoloog (dus uit de-25 zelfde diersoort en/of stam als de gastheercel), hetero-loog (dus uit een andere diersoort dan de soort of stam van de gastheercel), hybride (dus een combinatie van flankeringssequenties uit meer dan één bron) of synthetisch zijn, of de flankeringssequenties kunnen natieve sequen-30 ties zijn die doorgaans fungeren voor regulatie van de expressie van hPYY3-36. De bron van een flankeringssequentie kan een prokaryotisch of eukaryotisch organisme, een gewerveld of ongewerveld organisme of een plant zijn, mits de flankeringssequentie functioneel is in en kan worden 35 geactiveerd door het inwendige van de gastheercel.

Bruikbare flankeringssequenties kunnen worden verkregen met verscheidene werkwijzen uit de stand der techniek.

32

Andere hierin bruikbare flankeringssequenties dan die van het PYY-gen zullen tevoren zijn geïdentificeerd door in kaart brengen en/of digestie met restrictie-endonuclease. Deze kunnen dus uit het geschikte weefsel worden geïso-5 leerd met gebruik van de geschikte restrictie-endonuclea-sen. In sommige gevallen kan de volledige nucleotidese-quentie van een flankeringssequentie bekend zijn. Hier kan de flankeringssequentie worden gesynthetiseerd met de hierin beschreven werkwijze voor nucleïnezuursynthese of 10 -kloneren.

Wanneer de gehele of slechts een gedeelte van de flankeringssequentie, kan deze worden verkregen met gebruik van PCR en/of door onderzoek van een genoombiblio-theek met een geschikt oligonucleotide en/of een fragment 15 van een flankeringssequentie uit dezelfde of een andere soort. Wanneer de flankeringssequentie niet bekend is, kan een fragment van het DNA dat de flankeringssequentie bevat, worden geïsoleerd uit een groter stuk DNA dat bijvoorbeeld een codeersequentie of zelfs een ander gen of 20 andere genen bevat. De isolatie kan worden bewerkstelligd door digestie met endonuclease om het juiste DNA-fragment te produceren, gevolgd door isolatie met zuivering met agarosegel, Qiagen®-kolomchromatografie (Chatsworth, CA, VS) of andere voor de deskundige bekende werkwijzen. De 25 keuze van geschikte enzymen om dit doel te bereiken zal voor een deskundige voor de hand liggen.

Een bron van de replicatie is meestal een gedeelte van prokaryotische expressievectoren die commercieel kunnen worden verkregen, en de bron is behulpzaam bij de am-30 plificatie van de vector in een gastheercel. Amplificatie van de vector tot een bepaald aantal kopieën kan in bepaalde gevallen van belang zijn voor de optimale expressie van een (E10C) hPYY3_36 of een (D11C) hPYY3_36. Indien de gekozen vector geen bron van een replicatieplaats bevat, kan 35 er één chemisch worden gesynthetiseerd op grond van een bekende sequentie, en in de vector worden opgenomen. De bron van replicatie uit het plasmide pBR322 (New England 33

Biolabs, Beverly, MA, VS) is bijvoorbeeld geschikt voor de meeste gram-negatieve bacteriën, en diverse bronnen (bijv. SV40, polyoom, adenovirus, vesiculair stomatitisvirus (VSV) of papillomavirussen zoals HPV of BPV) zijn geschikt 5 voor kloneringsvectoren in zoogdiercellen. In het algemeen is voor expressievectoren bij zoogdieren geen bron van replicatie nodig (de SV40-bron wordt bijvoorbeeld vaak slechts gebruikt omdat deze de vroege promotor bevat).

Een sequentie voor beëindiging van de transcriptie 10 bevindt zich meestal op de 3'-positie van het uiteinde van een codeergebied voor polypeptiden en dient om de transcriptie te beëindigen. Doorgaans is een sequentie voor beëindiging van de transcriptie in prokaryotische cellen een fragment dat rijk is aan G-C gevolgd door een poly-T-15 sequentie. Terwijl de sequentie gemakkelijk wordt gekloneerd uit een bibliotheek of zelfs commercieel kan worden aangeschaft als onderdeel van een vector, kan deze ook gemakkelijk worden gesynthetiseerd met werkwijzen voor nu-clelnezuursynthese, zoals die welke hierin worden beschre-20 ven.

Een selecteerbaar markergenelement codeert voor een eiwit dat nodig is voor de overleving en groei van een gastheercel die in een selectief kweekmedium groeit. Typische gekozen markergenen coderen voor eiwitten die (a) re-25 sistentie verlenen tegen antibiotica of andere toxinen, bijv. ampicilline, tetracycline of kanamycine, voor prokaryotische gastheercellen, (b) auzotrofe deficiënties van de cel aanvullen of (c) vitale stoffen leveren die niet beschikbaar zijn uit complexe media. Selecteerbare markers 30 die de voorkeur hebben, zijn kanamycineresistentiegen, het ampicillineresistentiegen en het tetracyclineresistentie-gen. Een neomycineresistentiegen kan ook worden gebruikt voor selectie in prokaryotische en eukaryotische gastheercellen.

35 Andere selectiegenen kunnen worden gebruikt voor am plificatie van het gen dat tot expressie zal worden gebracht. Amplificatie is het proces waarbij genen waaraan 34 een grotere behoefte bestaat voor de productie van een eiwit dat van vitaal belang is voor de groei in tandem in de chromosomen van de opeenvolgende generaties van recombi-nantcellen worden herhaald. Voorbeelden van geschikte se-5 lecteerbare markers voor zoogdiercellen omvatten dihydro-folaatreductase (DHFR) en thymidinekinase. De zoogdiercel-transformanten worden onder selectiedruk geplaatst, waarbij alleen de transformanten uniek zijn aangepast voor overleving krachtens het selectiegen dat in de vector aan-10 wezig is. De selectiedruk wordt opgelegd door kweken van de getransformeerde cellen onder omstandigheden waarbij de concentratie van het selectiemiddel in het medium successievelijk wordt gewijzigd, hetgeen leidt tot amplificatie van zowel het selectiegen als het DNA dat codeert voor een 15 (E10C) hPYY3-36 of (DllC) hPYY3-36. Dientengevolge worden gro tere hoeveelheden (E10C) hPYY3_36 of (DllC) hPYY3_36 uit het geamplificeerde DNA gesynthetiseerd.

Een ribosoombindingsplaats is doorgaans nodig voor het begin van translatie van mRNA en wordt geïdentificeerd 20 door een Shine-Dalgarno-sequentie (prokaryoten) of een Ko-zak-sequentie (eukaryoten). Het element bevindt zich meestal op de 3'-positie van de promotor en de 5'-positie van de codeersequentie van een (E10C) hPYY3_36 of een (DllC)hPYY3_36 die tot expressie zal worden gebracht. De 25 Shine-Dalgarno-sequentie is gevarieerd, maar is meestal een polypurine (en heeft dus een hoog A-G-gehalte) . Er zijn vele Shine-Dalgarno-sequenties geïdentificeerd, die alle gemakkelijk kunnen worden gesynthetiseerd met de hierin gegeven werkwijzen en in een prokaryotische vector 30 kunnen worden gebruikt.

Een leader- of signaalsequentie kan worden gebruikt om een (E10C) hPYY3-36 of (DllC) hPYY3-36 uit de gastheercel te leiden. Een nucleotidesequentie die codeert voor de signaalsequentie bevindt zich meestal in het codeergebied van 35 het (E10C) hPYY3_36- of (DllC) hPYY3-36-nucleïnezuurmolecuul, of direct op het 5'-uiteinde van een codeergebied voor (E10C)hPYY3-36 of (DllC)hPYY3-36. Er zijn vele signaalsequen- % 35 ties geïdentificeerd en elk hiervan die functioneel in de gekozen gastheercel is, kan worden gebruikt met een (E10C) hPYY3-36 - of (D11C) hPYY3_36-nucleïnezuurmolecuul. Derhalve kan een signaalsequentie homoloog (voorkomend in de 5 natuur) of heteroloog zijn aan het nucleïnezuurmolecuul van (E10C)hPYY3-36~ of (D11C)hPYY3_36 zijn. Bovendien kan een signaalsequentie met de hierin beschreven werkwijzen chemisch worden gesynthetiseerd. In de meeste gevallen zal de secretie van een (E10C) hPYY3_36 of een (D11C) hPYY3_36 uit de 10 gastheercel door de aanwezigheid van een signaalpeptide de verwijdering van het signaalpeptide uit de afgescheiden (E10C) hPYY3-36 of (D11C) hPYY3-36 tot gevolg hebben. De signaalsequentie kan een bestanddeel van de vector, maar ook onderdeel van een nucleïnezuurmolecuul van (E10C) hPYY3_36-15 of (DllC)hPYY3-36 zijn dat in de vector wordt ingevoegd.

Een nucleotidesequentie die codeert voor een natieve hPYY3_36-signaalsequentie kan worden gekoppeld aan een co-deergebied voor (E10C) hPYY3-36 of (D11C) hPYY3-36 of een nucleotidesequentie die codeert voor een heterologe signaal-20 sequentie kan worden gekoppeld aan een codeergebied voor . (E10C)hPYY3-36 of (D11C)hPYY3-36. De gekozen heterologe signaalsequentie dient er een te zijn die wordt herkend en bewerkt, dat wil zeggen wordt afgesplitst door een sig-naalpeptidase, door de gastheercel. Voor prokaryotische 25 gastheercellen die de natieve hPYY-signaalsequentie niet herkennen en bewerken wordt de signaalsequentie vervangen door een prokaryotische signaalsequentie die bijvoorbeeld wordt gekozen uit de groep van de basische fosfatase-, pe-nicillase- of onder invloed van warmte stabiele entero-30 toxine II-leaders. Voor de afscheiding uit gist kan de natieve hPYY-signaalsequentie worden vervangen door gistin-vertase-, α-factor- of zure fosfatase-leaders. Bij de expressie in zoogdiercellen voldoet de natieve signaalsequentie, hoewel ook andere signaalsequenties van zoogdie-35 ren geschikt kunnen zijn.

In vele gevallen wordt de transcriptie van een nucleïnezuurmolecuul verhoogd door de aanwezigheid van één 36 of meer introns in de vector; dit geldt met name wanneer een polypeptide in eukaryotische gastheercellen wordt geproduceerd, in het bijzonder gastheercellen van zoogdieren. De gebruikte introns kunnen in de natuur in het hPYY-5 gen voorkomen, met name wanneer het gebruikte gen een ge-noomsequentie van volledige lengte of een fragment daarvan is. Wanneer het intron in de natuur niet in het gen voorkomt (zoals bij de meeste cDNA's), kan het intron uit een andere bron worden verkregen. De positie van het intron 10 ten opzichte van de flankeringssequenties en het hPYY-gen is in het algemeen belangrijk, aangezien het intron dient te worden getranscribeerd om effectief te zijn. Wanneer een cDNA-molecuul dat codeert voor (E10C) hPYY3-3$ of (DllC)hPYYa-36 wordt getranscribeerd is de voorkeurspositie 15 voor het intron de 3' -positie ten opzichte van de beginplaats van de transcriptie en de 5'-positie ten opzichte van de poly-A-transcirptieplaats voor beëindiging van de sequentie. Bij voorkeur zullen het intron of de introns zich op een van beide andere zijden (dus op de 5'- of 3'-20 positie) van het cDNA bevinden, zodat het de codeersequen-tie niet onderbreekt. Een intron uit een bepaalde bron, met inbegrip van virale, prokaryotische en eukaryotische (plantaardige of dierlijke) organismen kan worden gebruikt, mits het verenigbaar is met de gastheercel waarin 25 het wordt ingevoegd. Ook zijn hierin synthetische intronen begrepen. Eventueel kan meer dan één intron in de vector worden gebruikt.

Expressie- en kloneringsvectoren zullen meestal een promotor bevatten die wordt herkend door het organisme van 30 de gastheer en operabel gebonden is aan het molecuul dat codeert voor (E10C)hPYY3-36 of (D11C)hPYY3_36. Promotors zijn niet-getranscribeerde sequenties die zich boven (dus de 5'-positie) het startcodon van een structureel gen (in het algemeen binnen ongeveer 100 tot 1000 bp) bevinden en die 35 de transcriptie van het structurele gen regelen. Promotors kennen een gebruikelijke onderverdeling in één van twee klassen: induceerbare promotors en constitutieve promo- 37 tors. Induceerbare promotors initiëren hogere niveaus van transcriptie uit het DNA dat onder hun controle staat in reactie op bepaalde wijzigingen in de kweekomstandigheden, zoals de aanwezigheid of afwezigheid van een voedingsstof 5 of een verandering van de temperatuur. Constitutieve promotors initiëren daarentegen continue productie van genproduct; dat betekent dat er weinig of geen regeling van de genexpressie is. Er is een groot aantal promotors bekend dat door een verscheidenheid van mogelijke gastheer-10 cellen wordt herkend. Een geschikte promotor is operabel gekoppeld aan het DNA dat codeert voor (E10C) hPYY3_36 of (Dl 1C)hPYY3-36 door verwijderen van de promotor uit de DNA-bron door digestie met restrictie-enzym en inserteren van de gewenste promotorsequentie in de vector. De natieve 15 promotorsequentie van hPYY3-36 kan worden gebruikt om de amplificatie en/of expressie van een nucleinezuurnmolecuul van (E10C)hPYY3-36~ of (D11C)hPYY3_36 te sturen. Een hetero-loge promotor heeft echter de voorkeur indien deze in vergelijking met de natieve promotor een grotere transcriptie 20 en grotere opbrengsten van het tot expressie gebrachte eiwit toelaat en indien deze verenigbaar is met het gast-heercelsysteem dat voor gebruik wordt gekozen.

Promotors geschikt voor gebruik in prokaryotische gastheercellen omvatten de bèta-lactamase- en lactosepro-25 motorsystemen; E. coli T7 induceerbaar RNA-polymerase; basisch fosfatase; een tryptofaan (trp)-promotorsysteem, en hybride promotors zoals de tac-promotor. Ook andere bekende bacteriële promotors zijn geschikt. Hun sequenties zijn gepubliceerd, hetgeen het voor een deskundige mogelijk 30 maakt om deze te ligeren aan de gewenste DNA-sequentie, waarbij naar behoefte linkers of adapters worden gebruikt om bruikbare restrictieplaatsen te verkrijgen.

Geschikte promotors voor gebruik in gisten zijn eveneens stand der techniek. Gistversterkers worden voordelig 35 gebruikt met gistpromotors. Geschikte promotors voor gebruik bij gastheercellen van zoogdieren zijn bekend en omvatten, maar zijn niet beperkt tot, die verkregen uit de / 38 genomen van virussen zoals polyomavirus, pluimveepokkenvi-rus, adenovirus (zoals adenovirus 2), runderpapillomavi-rus, vogelsarcoomvirus, cytomegalovirus, retrovirussen, hepatitis B-virus en liefst apenvirus 40 (SV40). Andere 5 geschikte promotors voor zoogdiercellen omvatten heterolo-ge promotors voor zoogdiercellen, bijvoorbeeld warmte-schok-promotors en de actinepromotor.

Extra promotors die van belang kunnen zijn oor het regelen van de expressie van (E10C) hPYY3-36 of (D11C) hPYY3-36 10 omvatten, maar zijn niet beperkt tot: het vroege promotor-gebied van SV40 (Bemoist en Chambon, Nature, 290:304-10, 1981) , de CMV-promotor; de promotor die zich bevindt in de 3'-positie van de lange eindstandige herhaling van Rous-sarcoomvirus (Yamamoto et al, Cell, 22:787- 97, 1980); de 15 herpesthymidinekinasepromoter (Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 78:1444-45, 1981); de regulerende se quenties van het metallothioninegen (Brinster et al.. Nature, 296:39-42, 1982); prokaryotische expressievectoren zals de bèta-lactamasepromoter (Villa-Kamaroff et al., 20 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.f 75:3727-31, 1978) of de tac-promoter (DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80:21-25, 1983).

Een versterkersequentie kan in de vector worden ingevoegd, zodat de transcriptie van een DNA dat codeert voor 25 (E10C)hPYY3_36 of (D11C)hPYY3-36 in hogere eukaryoten wordt verhoogd. Versterkers zijn op de cis-positie werkende elementen van DNA, doorgaans met een lengte van ongeveer 10-300 bp, die op de promotor inwerken zodat de transcriptie wordt verhoogd. De versterkers zijn relatief onafhankelijk 30 van oriëntatie en positie. Zij zijn gevonden in de 5'- en 3’-positie van de transcriptie-eenheid. Er zijn verscheidene uit zoogdiergenen verkrijgbare versterkersequenties bekend (bijv. globine, elastase, albumine, α-feto-eiwit en insuline). Meestal zal echter een versterker uit een virus 35 worden gebruikt. De SV40-versterker, de vroege promotor-versterker van het cytomegalovirus, de polyoma-versterker en adenovirus-versterkers zijn voorbeelden van versterken- 39 de elementen voor de activering van eukaryotische promotors. Hoewel een versterker in de vector kan worden ge-spliced op een 5'- of 3'-positie van een nucleïnezuurmole-cuul dat codeert voor (E10C)hPYY3-36 of (D11C) I1PYY3-.36, be-5 vindt deze zich typisch op de plaats 5'-positie ten opzichte van de promotor.

Expressievectoren kunnen worden opgebouwd uit een uitgangsvector zoals een commercieel verkrijgbare vector. Dergelijke vectoren kunnen al of niet alle gewenste flan-10 keringssequenties bevatten. Wanneer één of meer van de hierin beschreven flankeringssequenties niet reeds in de vector aanwezig zijn, kunnen deze afzonderlijk worden verkregen en in de vector worden ingevoerd. Werkwijzen die worden gebruikt voor het verkrijgen van elk van de flanke-15 ringssequenties zijn voor een deskundige bekend.

Voorkeursvectoren zijn die welke verenigbaar zijn met de bacteriën, insecten- en zoogdiercellen die gastheer zijn. Dergelijke vectoren omvatten onder andere pCRII, pCR3 en pcDNA3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA, VS), pBSII 20 (Stratagene, La Jolla, CA, VS) , pET15 (Novagen, Madison, WI, VS), pGEX (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, VS), pEGFP-N2 (Clontech, Palo Alto, CA, VS), pETL (BlueBacII, Invitrogen), pDSR-alpha (PCT octrooiaanvrage WO 90/14363) en pFastBacDual (Gibco-BRL, Grand Island, NY, VS).

25 Verdere geschikte vectoren omvatten, maar zijn niet beperkt tot, cosmiden, plasmiden of gemodificeerde virus sen, maar het zal duidelijk zijn dat het vectorsysteem verenigbaar dient te zijn met de gekozen gastheercel. Dergelijke vectoren omvatten, maar zijn niet beperkt tot, 30 plasmiden zoals Bluescript®-plasmidederivativen (een groot aantal kopieën van ColEl-fagimide, Stratagene), PCR-klo-neerplasmiden ontworpen voor kloneren van met Taq geampli-ficeerde PCR-producten (bijv. TOPO® TA Cloning® Kit, PCR2.l®-plasmidederivativen, Invitrogen) en vectoren uit 35 zoogdieren, gisten of virussen, zoals een baculovirusex- pressiesysteem (pBacPAK-plasmidederivativen, Clontech).

40

Nadat de vector is opgebouwd en een nucleïnezuurmole-cuul dat codeert voor een (E10C) hPYY3-36~ of (D11C) hPYYa-36-polypeptide is ingevoerd in de juiste plaats van de vector, kan de voltooide vector in een geschikte gastheercel 5 worden ingevoerd voor amplificatie en/of expressie van polypeptide. De transformatie van een expressievector voor een (E10C) hPYY3-36- of (D11C) hPYY3_36-polypeptide in een gekozen gastheercel kan met bekende werkwijzen worden bewerkstelligd, waaronder werkwijzen als transfectie, infec-10 tie, elektroporatie, micro-injectie, lipofectie, een werkwijze met DEAE-dextran of andere bekende technieken. De gekozen werkwijze zal ten dele een functie zijn van het type van te gebruiken de gastheercel. Deze werkwijzen en andere geschikte werkwijzen zijn voor de deskundige bekend 15 en worden bijvoorbeeld uiteengezet in Sambrook et al., hierboven.

Gastheercellen kunnen prokaryotische gastheercellen (zoals E. coli) of eukaryotische gastheercellen (zoals een cel van gist, insecten of gewervelden) zijn. De gastheer-20 cel synthetiseert, wanneer deze onder geschikte omstandigheden wordt gekweekt, een (E10C) hPYY3-36~ of (D11C) -hPYY3-36-polypeptide dat vervolgens uit het kweekmedium (indien de gastheercel dit in het medium afscheidt) of rechtstreeks uit de dit producerende gastheercel (indien dit niet wordt 25 afgescheiden) kan worden verzameld. De keuze van een geschikte gastheercel zal afhankelijk zijn van diverse factoren, zoals de gewenste expressieniveaus, modificaties van het polypeptide die voor de activiteit noodzakelijk of gewenst zijn (zoals glycosylering of fosforylering) en of 30 het gemakkelijk tot een biologisch actief molecuul kan worden gevouwen.

In de stand der techniek is een aantal geschikte gastheercellen bekend, en vele zijn verkrijgbaar bij American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, VS. 35 Voorbeelden omvatten, maar zijn niet beperkt tot: zoog-diercellen, zoals ovariumcellen van de Chinese hamster (CHO), CHO DHFR(-)-cellen (Urlaub et al., Proc. Natl.

41

Acad. Sci. U.S.A., 97:4216-20, 1980), niercellen van een menselijke embryo (HEK) 293- of 293T-cellen of 3T3-cellen. De keuze van geschikte gastheercellen van zoogdieren en werkwijzen voor de transformatie, kweek, amplificatie, on-5 derzoek, productie en zuivering zijn stand der techniek. Andere geschikte cellijnen van zoogdieren zijn apen COS-1-en COS-7-cellijnen en de CV-l-cellijn. Andere voorbeelden van gastheercellen van zoogdieren omvatten cellijnen van primaten en cellijnen uit knaagdieren, met inbegrip van 10 getransformeerde cellijnen. Normale diploïde cellen, cel-stammen die afkomstig zijn van in vitro kweek van primair weefsel, alsmede primaire explantaten, zijn eveneens geschikt. De kandidaatcellen kunnen genotypisch deficiënt zijn in het selectiegen, of kunnen een dominant werkend 15 selectiegen bevatten. Andere geschikte cellijnen van zoogdieren omvatten, maar zijn niet beperkt tot, muizenneuro-blastoom N2A-cellen, HeLa, muizen-L-929-cellen, 3T3-lijnen die afkomstig zijn uit Swiss, Balb-c- of HIH-muizen, BHK-of HaK-hamstercellijnen. Elk van deze cellijnen is bekend 20 bij en verkrijgbaar voor deskundigen op het gebied van de eiwitexpressie.

Als gastheercellen zijn bacteriecellen eveneens bruikbaar. De diverse stammen van E. coli (bijv. HB101, DH5a, DH10 en MC1061) zijn bekend als gastheercellen op 25 het gebied van de biotechnologie. Diverse stammen van B. subtilis, Pseudomonas spp., andere Bacillus spp. en Strep-tomyces spp. kunnen eveneens bij deze werkwijze ook worden gebruikt.

Als gastheercellen voor de expressie van 30 (E10C)hPYY3_36- of (DllC) hPYY3-36-polypeptiden zijn voor de deskundigen vele stammen van gistcellen bekend. Gistcellen die de voorkeur hebben, omvatten bijvoorbeeld Saccharomy-ces cerivisae en Pichia pastoris.

Bovendien kunnen waar gewenst systemen van insecten-35 cellen worden gebruikt voor de expressie van (E10C) hPYY3-36 of (DllC)hPYY3_36. Dergelijke systemen worden bijvoorbeeld beschreven door Kitts et al., 1993, Biotechniques, 14:810- 42 17; Lucklow, Curr. Opin. Biotechnol., 4:564-72, 1993; en

Lucklow et al., J. Virol., 67:4566-79, 1993. Insectencel len die de voorkeur hebben, zijn Sf-9 en Hi5 (Invitrogen).

5 Productie van (E10C) hPYY3-36~ en (D11C) hPYY3.36-polypeptiden

Een gastheercellijn omvattende een expressievector voor {E10C) hPYY3-36 of (D11C) hPYY3_36 kan worden gekweekt met gebruik van standaardmedia die voor de deskundigen bekend zijn. De media zullen doorgaans alle voedingsstoffen be-10 vatten die noodzakelijk zijn voor de groei en overleving van de cellen. Geschikte media voor het kweken van E. co-li-cellen omvatten bijvoorbeeld Luria Broth (LB) en/of Terrific Broth (TB). Geschikte media voor het kweken van eukaryotische cellen omvatten Roswell Park Memorial Insti-15 tute/medium 1640 (RPMI 1640), Minimal Essential Medium (MEM) en/of Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), die alle kunnen worden aangevuld met een serum en/of groeifactoren zoals noodzakelijk zijn voor de desbetreffende cell-lijn die wordt gekweekt. Een geschikt medium voor insec-20 tenkweken is Grace-medium dat indien noodzakelijk wordt aangevuld met gistolate, lactalbuminehydrolysaat en/of foetaal kalfserum.

Typisch wordt een antibioticum of een andere verbinding die bruikbaar is voor de selectieve groei van ge-25 transfecteerde of getransformeerde cellen toegevoegd als een supplement op de media. De verbinding die zal worden gebruikt wordt voorgeschreven door het selecteerbare mar-kerelement dat aanwezig is op het plasmide waarmee de gastheercel werd getransformeerd. Wanneer het selecteerba-30 re markerelement bijvoorbeeld kanamycineresistentie is, zal de verbinding die aan het kweekmedium wordt toegevoegd kanamcyine zijn. Andere verbindingen voor selectieve groei omvatten ampicilline, tetracycline en neomycine.

De hoeveelheid van een (E10C) hPYY3_36- of 35 (D11C) hPYY3-36-polypeptide die door een gastheercel wordt geproduceerd, kan worden beoordeeld met gebruik van werkwijzen uit de stand der techniek. Dergelijke werkwijzen •» 43 omvatten, zonder beperking, Western blot-analyse, SDS-po-lyacrylamidegelelektroforese, niet-denaturerende gelelek-troforese, scheiding met vloeistofchromatografie met hoog scheidend vermogen (HPLC, High Performance Liquid Chroma-5 tography), immunoprecipitatie en/of activiteitsassays zoals DNA-binding-gel-shift-assays.

Indien een (E10C)hPYY3_36 of (Dl 1C)I1PYY3-36 ontworpen is om te worden afgescheiden door de gastheercellijn, kan het grootste gedeelte van het polypeptide in het celkweekme-10 dium worden gevonden. Indien het polypeptide echter niet wordt afgescheiden door de gastheercellen, zal het aanwezig zijn in het cytoplasma en/of de kern (voor eukaryoti-sche gastheercellen) of in het cytoplasma (voor gastheercellen van gram-negatieve bacteriën).

15 Voor een (E10C) hPYY3-36 of (DllC) hPYY3_36 dat zich in het cytoplasma van de gastheercel en/of de kern (voor eu-karyotische gastheercellen) of in het cytoplasma (voor bacteriële gastheercellen) bevindt, kan het intracellulaire materiaal (met inbegrip van inclusielichamen voor gram-20 negatieve bacteriën) uit de gastheercel worden geëxtra heerd met gebruik van een standaardtechniek die voor de deskundigen bekend is. De gastheercellen kunnen bijvoorbeeld worden gelyseerd om de inhoud van het periplasma/cy-toplasma af te geven met een French-pers, homogenisatie 25 en/of behandeling in een ultrasoonbad, gevolgd door cen-trifugatie.

Indien een (E10C) hPYY3_3e of (DllC) hPYY3-3e in het cytoplasma inclusielichamen heeft gevormd, kunnen de inclusielichamen zich vaak binden aan de binnenste en/of buitenste 30 celmembranen en zullen deze dus na centrifugatie voornamelijk worden gevonden in het materiaal van de pellet. Het materiaal in de pellet kan vervolgens worden behandeld bij pH-uitersten of met een chaotropisch middel zoals een detergens, guanidine, guanidinederivaten, ureum of ureumde-35 rivaten in aanwezigheid van een reductiemiddel zoals dithiothreïtol bij een basische pH, of triscarboxyethyl-fosfine bij een zure pH, om de inclusielichamen vrij te B# 44 maken, in stukken te breken en te solubiliseren. De geso-lubiliseerde (E10C) hPYY3-36 of (D11C) hPYY3-36 kan vervolgens worden geanalyseerd met gelelektroforese, immunoprecipita-tie en dergelijke. Als het gewenst is om het polypeptide 5 te isoleren, kan de isolering worden uitgevoerd met gebruik van standaardwerkwijzen zoals die hierin beschreven, en in Marston et al., Meth. Enz., 182:264-75, 1990.

Indien bij expressie van een (E10C) hPYY3-36 of een (D11C) hPYY3_3$ niet in aanzienlijke mate inclusielichamen 10 wordt gevormd, dan zal het polypeptide na centrifugatie van het celhomogenaat voornamelijk wordt gevonden in de supernatant. Het polypeptide kan verder uit de supernatant worden geïsoleerd met gebruik van werkwijzen zoals die hierin beschreven.

15 De zuivering van een (E10C) hPYY3_36 of (D11C) hPYY3_36 uit een oplossing kan worden bewerkstelligd met een verscheidenheid van technieken. Indien het polypeptide op een zodanige wijze is gesynthetiseerd dat het een tag zoals Hexahystidine-9 of een ander klein peptide zoals FLAG 20 {(Eastman Kodak Co., New Haven, CT, VS) of myc (Invitro-gen) op zijn carboxyl- of amino-terminus bevat, kan het met een éénstapswerkwijze worden gezuiverd door de oplossing een affiniteitskolom te laten passeren, waarbij de kolommatrix een grote affiniteit voor de tag heeft.

25 Polyhistidine bindt bijvoorbeeld met grote affiniteit en specificiteit aan nikkel. Een affiniteitskolom van nikkel (zoals de Qiagen®-nikkelkolommen) kan dus voor zuivering worden gebruikt. Zie bijv. Current Protocols in Molecular Biology § 10.11.8 (Ausubel et al., redacteuren, 30 Green Publishers Inc. en Wiley and Sons, 1993).

Bovendien kan een (E10C) hPYY3-36- of (D11C) hPYY3-36-polypeptide worden gezuiverd door het gebruik van een mo-noklonaal antilichaam dat in staat is om specifiek een (E10C) hPYY3-36- of (D11C) hPYY3.36-polypeptide te herkennen en 35 daaraan te binden.

In situaties waarin het de voorkeur heeft om een (E10C)hPYY3-36- of (D11C)hPYY3-36-polypeptide gedeeltelijk of 45 volledig te zuiveren, zodat het gedeeltelijk of nagenoeg volledig vrij is van verontreinigingen, kunnen voor de deskundige bekende standaardwerkwijzen worden gebruikt. Dergelijke werkwijzen omvatten, zonder beperking, schei-5 ding met elektroforese gevolgd door elektro-elutie, diverse typen chromatografie (affiniteits-, immunoaffiniteits-, molzeven- en ionenwisselingschromatografie), HPLC en pre-paratieve iso-elektrische focussing ("Isoprime" machi-ne/techniek, Hoefer Scientific, San Francisco, CA, VS) . In 10 sommige gevallen kunnen twee of meer zuiveringstechnieken worden gecombineerd om een grotere zuiverheid te verkrijgen .

Een aantal aandere werkwijzen voor het produceren van polypeptiden is stand der techniek, en de werkwijzen kun-15 nen worden gebruikt voor het produceren van (E10C)-hPYY3-36- en (D11C) hPYY3-36-polypeptiden; zie bijv. Roberts et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 94:12297-303, 1997, die de productie beschrijft van fusie-eiwitten tussen een mRNA en het peptide waarvoor dit codeert. Zie ook Roberts, 20 Curr. Opin. Chem. Biol., 3:268-73, 1999.

Werkwijzen voor het produceren van peptiden of polypeptiden worden eveneens beschreven in Amerikaanse oc-trooischriften: 5.763.192; 5.814.476; 5.723.323 en 5.817.483. De werkwijze behelst het produceren van sto-25 chastische genen of fragmenten daarvan en het vervolgens inbrengen van deze genen in gastheercellen die één of meer eiwitten produceren waarvoor wordt gecodeerd door de stochastische genen. De gastheercellen worden vervolgens onderzocht, waarbij de klonen worden geïdentificeerd die 30 peptiden of polypeptiden met de gewenste activiteit produceren. Andere werkwijzen voor expressie van recombinant peptide worden beschreven in Amerikaanse octrooischriften: 6.103.495; 6.210.925; 6.627.438 en 6.737.250. De werkwijze maakt gebruik van E. coli en de algemene secretieroute van 35 E. coli. Het peptide wordt gefuseerd met een signaalse-quentie; het peptide is dus bedoeld voor secretie.

46

Een andere werkwijze voor het produceren van peptiden of polypeptiden wordt beschreven in PCT octrooiaanvrage WO 99/15650. De gepubliceerde werkwijze, die wordt aangeduid als random-activering van de genexpressie voor de ontdek-5 king van genen, behelst de activering van endogene genexpressie of over-expressie van een gen door in situ recom-binantwerkwijzen. De expressie van een endogeen gen wordt bijvoorbeeld geactiveerd of verhoogd door integreren van een regulerende sequentie in de doelcel die de expressie 10 van het gen kan activeren door niet-homologe of ongeoorloofde recombinatie. Het doel-DNA wordt eerst onderworpen aan straling, en een genetische promotor wordt ingevoerd. De promotor lokaliseert uiteindelijk een breuk aan het front van een gen, en begint met de transcriptie van het 15 gen. Dit leidt tot de expressie van het gewenste peptide of polypeptide.

Amidering

Amidering van een peptide, dat synthetisch of recom-20 binant wordt geproduceerd, wordt bewerkstelligd met een enzym dat peptidyl-glycine-alfa-amiderend monooxygenase (PAM) wordt genoemd. Wanneer (E10C) hPYY3_36- of (D11C) hPYY3_36“peptiden recombinant worden geproduceerd met gebruik van een bacterieel expressiesysteem, kunnen de 25 peptiden C-terminaal worden geamideerd door een in vitro reactie met recombinant PAM-enzym. De bron van het PAM-enzym, werkwijzen voor de productie en zuivering ervan en werkwijzen die kunnen worden gebruikt voor het amideren van (E10C) hPYY3_36~ of (D11C) hPYY3_36-peptiden worden bij-30 voorbeeld beschreven in Amerikaanse octrooischriften: 4.708.934; 5.789.234 en 6.319.685.

Selectieve (E10C) hPYY3-36~ en (D11C) hPYY3.36-antilichamen

Antilichamen en antilichaamfragmenten die specifiek 35 binden aan (E10C) hPYY3_36- of (D11C) hPYY3_36-polypeptiden, met of zonder pegylering op de plaats van de cysteïnesub-stitutie (zoals hierin beschreven), maar die niet selec- te 47 tief binden aan natieve hPYY3_36 vallen onder de bescher-mingsomvang van de onderhavige uitvinding. De antilichamen kunnen polyklonaal, met inbegrip van monospecifek polyklo-naal, monoklonaal, recombinant, chimeer, gehumaniseerd, 5 zoals CDR-grated, humaan, met enkele keten en/of bispeci-fiek zijn, alsmede fragmenten, varianten of derivaten daarvan. Antilichaamfragmenten omvatten die gedeelten van het antilichaam die binden aan een epitoop van het (E10C) hPYY3_36- of (DllC)hPYY3-36-polypeptide. Voorbeelden 10 van dergelijke fragmenten omvatten Fab- en F(ab')-fragmenten die worden gevormd door enzymatische splitsing van antilichamen van volledige lengte. Andere bindingsfragmen-ten omvatten die welke worden gevormd door recombinant-DNA-technieken, zoals de expressie van recombinante plas-15 miden die nucleïnezuursequenties bevatten die coderen voor variabele gebieden van een antilichaam.

Polyklonale antilichamen gericht op een (E10C) hPYY3-3e-of (D11C) hPYY3_36-polypeptide worden in het algemeen in dieren {bijv. konijnen of muizen) geproduceerd door middel 20 van meervoudige s.c. of i.p. injecties van (ElOC) hPYY3_36-of (D11C) hPYY3_36-polypeptide en een adjuvans. Het kan bruikbaar zijn om (E10C) hPYY3_36- of (D11C) hPYY3-36-polypeptide te conjugeren met een dragereiwit dat immuno-geen is in de te immuniseren diersoort, zoals keyhole-25 limpet-hemocyanine, serumalbumine, runderthyroglobuline of remmer van sojatrypsineremmer. Ook worden aggregatiemidde-len zoals aluin gebruikt voor het versterken van de im-muunrespons. Na immunisatie wordt van de dieren bloed afgenomen en wordt het serum getest op de anti- 30 (E10C) hPYY3-36- of anti-(D11C) hPYY3_36-antilichaamtiter.

Monoklonale antilichamen gericht op (E10C) hPYY3_36- of (D11C) hPYY3_36-polypeptiden worden geproduceerd met gebruik van een werkwijze die voorziet in de productie van antili-chaammoleculen door continue cellijnen in kweek. Voorbeel-35 den van geschikte werkwijzen voor het bereiden van monoklonale antilichamen omvatten de hybridoma-werkwijzen van Kohier et al., Nature, 256:495-97, 1975, en de werkwijze 48 met humane B-celhybridoma (Kozbor, J. Immunol., 133:3001, 1984; Brodeur et al.f Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 51-63 (Marcel Dekker, Inc., 1987). Ook wordt door de onderhavige uitvinding voorzien 5 in hybridoma-cellijnen die monoklonale antilichamen produceren die reactief zijn met (E10C) hPYY3-36- of (D11C) hPYY3-36~polypeptiden.

Voorkeurswerkwijzen voor het bepalen van de specificiteit en affiniteit van monoklonale antilichamen door 10 concurrerende remming kunnen worden gevonden bij Harlow en Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratories, 1989); Current Protocols in Immunology (Col-ligan et al., redacteuren, Greene Publishing Assoc, en Wiley Interscience, 1993), en Muller, Meth. Enzymol., 15 92:589-601, 1988.

Chimere antilichamen van de onderhavige uitvinding kunnen afzonderlijke H- en/of L-immunoglobulineketens omvatten. Een chimere H-keten die de voorkeur heeft, omvat een bindingsgebied voor antigeen dat afkomstig is van de 20 H-keten van een niet-humaan antilichaam dat specifiek is voor een (E10C) hPYY3.36- of (D11C) hPYY3_36-polypeptide, en gebonden is aan ten minste een gedeelte van een C-gebied van een humane H-keten (CH) , zoals CHi of CH2. Een chimere L-keten die de voorkeur heeft, omvat een bindingsgebied 25 voor antigeen dat afkomstig is van de L-keten van een niet-humaan antilichaam dat specifiek is voor een (E10C) hPYY3_36- of (D11C) hPYY3_36-polypeptide, en gebonden is aan ten minste een gedeelte van een C-gebied van een humane L-keten (Cl) . Chimere antilichamen en werkwijzen voor 30 hun productie zijn stand der techniek; zie Cabilly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81:3273-77, 1984; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Ü.S.A., 81:6851-55, 1984; Boulianne et al., Nature, 312:643-46, 1984; Neuberger et al., Nature, 314:268-70, 1985; Liu et al., Proc. Natl.

35 Acad. Sci. U.S.A., 84:3439-43, 1987; en Harlow en Lane, hierboven.

49

Selectieve bindingsmiddelen met chimere H-ketens en L-ketens met dezelfde of een verschillende bindingspecifi-citeit voor een variabel gebied kunnen ook worden bereid door de juiste samenvoeging van de afzonderlijke polypep-5 tideketens volgens werkwijzen die stand der techniek zijn; zie bijv. Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., redacteuren, Green Publishers Inc. en Wiley and Sons, 1994), en Harlow en Lane, hierboven. Met gebruik van deze aanpak worden gastheercellen die chimere H-ketens (of 10 hun derivaten) tot expressie brengen apart gekweekt uit gastheercellen die chimere L-ketens (of hun derivaten) tot expressie brengen en worden de immunoglobulineketens afzonderlijk verkregen en vervolgens samengevoegd. Als alternatief kunnen de gastheercellen tezamen worden gekweekt 15 en kan men de ketens spontaan in het kweekmedium laten samenvoegen, waarna het geassembleerde immunoglobuline wordt geïsoleerd.

In een andere uitvoeringsvorm is een monoklonaal an-tilichaam van de onderhavige uitvinding een "gehumani-20 seerd" antilichaam. Werkwijzen voor het humaniseren van niet-humane antilichamen zijn stand der techniek. Zie de Amerikaans octrooischriften: 5.585.089 en 5.693.762. In het algemeen heeft een gehumaniseerd antilichaam één of meer aminozuurresten die zijn ingebracht uit een bron die 25 niet-humaan is. Humanisering kan bijvoorbeeld worden uitgevoerd met gebruik van werkwijzen die in het vakgebied zijn beschreven (Jones et al., 1986, Nature, 321:522-25,

Riechmann et al., 1998, Nature, 332:323- 27; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534-36). Dit geschiedt door min-30 ste een gedeelte van het complementairiteit gebied van een knaagdier (complementarity-determining region, CDR) te vervangen door de overeenkomstige gebieden van een humaan antilichaam.

Technieken voor het creëren van recombinante DNA-ver-35 sies voor de bindingsgebieden van antigeen van antili-chaammoleculen (dat wil zeggen Fab of fragmenten uit een variabel gebied) die vorming van monoklonale antilichamen 50 overslaan, worden omsloten door de beschermingsomvang van de onderhavige uitvinding. Bij deze techniek worden voor een antilichaam specifieke boodschapper-RNA-moleculen geëxtraheerd uit cellen van het immuunsysteem die afkomstig 5 zijn van een geïmmuniseerd dier en getranscribeerd in cDNA. Het cDNA wordt vervolgens gekloneerd in een bacteri-eel expressiesysteem. Een voorbeeld van een dergelijke techniek die geschikt is voor de praktijk van de onderhavige uitvinding gebruikt een lambda-vectorsysteem van een 10 bacteriofaag met een leader-sequentie die ervoor zorgt het tot expressie gebrachte Fab-eiwit migreert naar de peri-plasmische ruimte (tussen het bacteriële celmembraan en de celwand) of wordt uitgescheiden. Men kan snel grote aantallen functionele Fab-fragmenten genereren en onderzoeken 15 op welke hiervan zich aan het antigeen binden. Dergelijke bindingsmoleculen voor (E10C) hPYY3-36 of (D11C) hPYY3-36 binden (Fab-fragmenten met specificiteit voor (E10C)ΙΊΡΥΥ3-36-of (DllC) hPYY3_36-polypeptiden) worden specifiek omsloten door de term "antilichaam" zoals deze hierin wordt ge-20 bruikt.

Eveneens binnen de beschermingsomvang van de onderhavige uitvinding vallen technieken die zijn ontwikkeld voor de productie van chimere antilichamen door splicing van de genen uit een muizenantilichaammolecuul met de juiste an-25 tigeenspecificiteit en genen uit een humaan antilichaammo-lecuul met de geschikte biologische activiteit (zoals het vermogen tot het activeren van het humane complement en het bevorderen van de van antilichaam afhankelijke cellulaire cytotoxiciteit (antibody-dependent cellular cyto-30 toxicity; ADCC)); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81:6851-55, 1984; Neuberger et al., Nature, 312:604-08, 1984. Selectieve bindingsmiddelen zoals anti lichamen die door middel van deze techniek worden geproduceerd, vallen binnen de beschermingsomvang van de onderha-35 vige uitvinding.

Het zal duidelijk zijn dat de onderhavige uitvinding niet beperkt is tot monoklonale antilichamen van muizen of 51 ratten; in feite kunnen humane antilichamen worden gebruikt. Dergelijke antilichamen kunnen worden verkregen door humane hybridomas te gebruiken. Volledig humane antilichamen die zich binden aan (E10C) I1PYY3-36- of 5 (D11C)hPYY3_36-polypeptiden worden dus omsloten door de on derhavige uitvinding. Dergelijke antilichamen worden geproduceerd door immuniseren met een (E10C) hPYY3_36- of (D11C) hPYY3_36~antigeen (eventueel geconjugeerd met een drager) van transgene dieren (bijv. muizen) die een reper-10 toire van humane antilichamen kunnen produceren zonder dat er een endogene immunoglobulineproductie plaatsvindt; zie bijv. Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90:2551-55, 1993; Jakobovits et al., Nature, 362:255-58, 1993; Bruggemann et al., Year in Immuno., 7:33-40, 1993.

15 Eveneens omsloten door de onderhavige uitvinding zijn humane antilichamen die binden aan (E10C) hPYY.3_3e- of (D11C) hPYY3-36-polypeptiden. Met transgene dieren (bijv. muizen) die een repertoire van humane antilichamen kunnen produceren zonder dat er een endogene immunoglobulinepro-20 duetie plaatsvindt, worden dergelijke antilichamen geproduceerd door immunisatie met een antigeen van (E10C) hPYY3_36- of (D11C) hPYY3-36~polypeptide (dus met ten minste 6 continue aminozuren) dat eventueel geconjugeerd is met een drager; zie Jakobovits et al., 1993, hierboven; 25 Jakobovits et al., Nature, 362:255-58, 1993; Bruggermann et al., 1993, hierboven. Bij een werkwijze worden dergelijke transgene dieren geproduceerd door uitschakelen van de endogene loci die coderen voor de zware en lichte immu-noglobulineketens daarin en invoegen van loci die coderen 30 voor humane zware en lichte keteneiwitten in het genoom daarvan. Gedeeltelijk gemodificeerde dieren, dat wil zeggen die dieren met minder dan het volledige complement van modificaties worden vervolgens gekruist, waarbij een dier wordt verkregen met alle gewenste modificaties van het im-35 muunsysteem. Wanneer een immunogeen wordt toegediend, produceren deze transgene dieren antilichamen met humane (in plaats van bijvoorbeeld muizen) aminozuursequenties, waar- 52 onder de variabele gebieden die immunospecifiek voor deze antigenen zijn. Zie PCT octrooiaanvragen: WO 96/33735 en WO 94/02602. Andere werkwijzen worden beschreven in Amerikaans octrooischrift 5.545.807, PCT octrooi aanvragen: WO 5 91/10741 en WO 90/04036, en in Europees octrooischrift 0 546 073 Bl en PCT octrooiaanvrage WO 92/03918. Humane an-tilichamen kunnen ook worden geproduceerd door de expressie van recombinant DNA in gastheercellen of door expressie in hybridomacellen zoals hierin wordt beschreven.

10 In een alternatieve uitvoeringsvorm kunnen humane an- tilichamen ook worden geproduceerd uit faag-displaybiblio-theken (Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227:381, 1991;

Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581, 1991). Deze werkwijzen bootsen immuunselectie na door display van antili-15 chaamrepertoires op het oppervlak van een filamentachtige bacteriofaag en de daarop volgende selectie van de faag door hun binding aan een antigeen naar keuze. Een dergelijke techniek wordt beschreven in PCT octrooiaanvrage WO 99/10494, die de isolering beschrijft van functionele ago-20 nistische antilichamen voor MPL- en mks-receptoren met grote affiniteit, waarvoor een dergelijke aanpak wordt gebruikt .

Chimere, CDR-geënte en gehumaniseerde antilichamen worden typisch geproduceerd door recombinantwerkwijzen. 25 Nucleïnezuren die coderen voor de antilichamen worden in de gastheercellen gebracht en tot expressie gebracht met gebruik van materialen en procedures die hierin worden beschreven en stand der techniek zijn. In een voorkeursuitvoeringsvorm worden de antilichamen geproduceerd in gast-30 heercellen van zoogdieren, zoals CHO-cellen. Monoklonale (bijv. humane) antilichamen kunnen worden geproduceerd door de expressie van recombinant DNA in gastheercellen of door expressie in hybridomacellen zoals hierin wordt beschreven.

35 De anti-(E10C)hPYY3-36- en anti-(D11C) hPYY3-36-anti- lichamen van de onderhavige uitvinding kunnen in een bekende assaywerkwijze worden gebruikt, zoals concurrerende 53

bindingassays, directe en indirecte sandwich-assays en im-munoprecipitatie-assays (Sola, Monoclonal Antibodies: A

Manual van Techniques, 147-158 (CRC Press, Inc., 1987)) voor de detectie en bepaling van (E10C) hPYY3_36- of 5 (D11C) hPYY3_36-polypeptiden, alsmede zuivering van polypep- tiden. De antilichamen zullen zich binden aan (E10C)hPYY3_36- of (D11C)-hPYY3_36-polypeptiden met een affiniteit die geschikt is voor de assay-werkwij ze die wordt gebruikt.

10 De PYY-agonisten van de onderhavige uitvinding kan worden verschaft in de vorm van farmaceutisch aanvaardbare zuuradditiezouten voor gebruik in het werkwijzeaspect van de onderhavige uitvinding. Representatieve farmaceutisch aanvaardbare zuuradditiezouten van de onderhavige uitvin-15 ding omvatten hydrochloride-, hydrobromide-, hydrojodide-, nitraat-, sulfaat-, bisulfaat-, fosfaat-, zure fosfaat-, isonicotinaat-, acetaat-, lactaat-, salicylaat-, citraat-, zure citraat-, tartraat-, pantothenaat-, bitartraat-, as-corbaat-, succinaat-, maleaat-, gentisinaat-, fumaraat-, 20 gluconaat-, glucuronaat-, sacharaat-, formiaat-, ben-zoaat-, glutamaat-, methaansulfonaat-, ethaansulfonaat-, benzeensulfonaat-, p-tolueensulfonaat-, pamoaat-, palmi-taat-, malonaat-, stearaat-, lauraat-, malaat-, boraat-, hexafluorfosfaat-, naftylaat-, glucoheptonaat-, lactobio-25 naat- en laurylsulfonaatzouten en dergelijke. Zouten van de niet-gepegyleerde varianten behoeven niet farmaceutisch aanvaardbaar te zijn wanneer de variant zal worden gebruikt als een tussenproduct bij de bereiding van het con-jugaat van de PEG-PYY3_36-variant.

30 De PYY-agonisten van de onderhavige uitvinding zullen in het algemeen worden toegediend in de vorm van een farmaceutisch preparaat. Het farmaceutische preparaat kan bijvoorbeeld in een vorm zijn die geschikt is voor orale toediening (bijv. een tablet, capsule, pil, poeder, oplos-35 sing, suspensie), voor parenterale injectie (bijv. een steriele oplossing, suspensie of emulsie) , voor intranasa-le toediening (bijv. een aërosol, druppels, enz.), voor 54 rectale toediening (bijv. een suppositorium) of voor transdermale toediening (bijv. een pleister). Het farmaceutische preparaat kan in eenheidsdoseringsvormen zijn die geschikt zijn voor enkelvoudige toediening van nauw-5 keurige doseringen. Het farmaceutische preparaat zal een gebruikelijke farmaceutische drager en een PYY-agonist van de onderhavige uitvinding als een actief bestanddeel bevatten. Bovendien kan het andere farmaceutische middelen, adjuvantia, enz. omvatten.

10 Werkwijzen voor het bereiden van diverse farmaceuti sche preparaten van biologisch actieve peptiden zijn stand der farmaceutische techniek; zie bijvoorbeeld Amerikaanse octrooiaanvragen 2005/0009748 (voor orale toediening) en 2004/0157777, 2005/0002927 en 2005/0215475 (voor transmu- 15 cosale toediening, bijv. intranasale of buccale toediening) . Zie eveneens Remington: The Practice van Pharmacy, Lippincott Williams en Wilkins, Baltimore, MD, VS, 20* ed. 2000.

De PYY-agonisten van de onderhavige uitvinding kunnen 20 worden gebruikt met andere farmaceutische middelen voor de behandeling van de ziektetoestanden of aandoeningen die hierin worden beschreven. Derhalve voorziet de onderhavige uitvinding ook in werkwijzen voor behandeling die toediening van verbindingen van de onderhavige uitvinding in 25 combinatie met andere farmaceutische middelen omvatten.

Geschikte farmaceutische middelen die kunnen worden gebruikt in combinatie met de PYY-agonisten van de onderhavige uitvinding omvatten andere middelen tegen obesitas, zoals cannabinoïd-1 (CB-1)-antagonisten (zoals rimona-30 bant), Ιΐβ-hydroxysteroïddehydrogenase-l (Ιΐβ-HSD type 1)-remmers, MCR-4-agonisten, cholecystokinine-A (CCK-A)-ago-nisten, monoamineheropnameremmers (zoals sibutramine), sympathomimetische middelen, β3-adrenerge receptoragonis-ten, dopaminereceptoragonisten (zoals bromocriptine), me-35 lanocytstimulerend-hormoonreceptoranaloga, 5HT2c-receptor-agonisten, melanineconcentrerend-hormoonantagonisten, lep-tine, leptineanaloga, leptinereceptoragonisten, galanine- !» 55 antagonisten, lipaseremmers (zoals tetrahydrolipstatine, dat wil zeggen orlistat), anorectische middelen (zoals een bombesineagonist), neuropeptide-Y-receptorantagonisten (bijv. antagonisten van de NPY Y5-receptor), thyromimeti-5 sche middelen, dehydroepiandrosteron of een analogon daarvan, agonisten of antagonisten van de glucocorticoïdere-ceptor, orexinereceptorantagonisten, glucagonachtige pep-tide-l-receptoragonisten, ciliaire neurotrofe factoren (zoals Axokine”· dat verkrijgbaar is bij Regeneron Pharma-10 ceuticals, Inc., Tarrytown, NY, VS, en Procter & Gamble Company, Cincinnati, OH, VS), humaan agouti-gerelateerd eiwit (AGRP)-remmers, ghrelinereceptorantagonisten, antagonisten of omgekeerde agonisten van de histamine-3-receptor, neuromedine ü-receptoragonisten, MTP/ApoB-rem-15 mers (bijv. darmselectieve MTP-remmers, zoals dirlotapide) en dergelijke.

Middelen tegen obesitas die de voorkeur hebben voor gebruik in combinatie met de PYY-agonisten van de onderhavige uitvinding omvatten CB-l-receptorantagonisten, darm-20 selectieve MTP-remmers, CCKa-agonisten, 5HT2c-receptor-agonisten, NPY Y5-receptorantagonisten, orlistat en sibru-tamine. CB-l-receptorantagonisten die de voorkeur hebben voor gebruik in de werkwijzen van de onderhavige uitvinding omvatten: rimonabant (SR141716A, ook bekend onder de 25 handelsnaam Acomplia™) is verkrijgbaar bij Sanofi-Synthe-labo of kan worden bereid als beschreven in Amerikaans oc-trooischrift 5.624.941; N- (piperidine-l-yl)-1-(2,4-di-chloorfenyl)-5-(4-joodfenyl)-4-methyl-lH-pyrazool-3-car-boxamide (AM251) is verkrijgbaar bij Tocris™, Ellisville, 30 MO, VS; [5-(4-broomfenyl)-1-(2,4-dichloorfenyl)-4-ethyl-N-(1-piperidinyl) -l/i-pyrazool-3-carboxamide] (SR147778) dat kan worden bereid als beschreven in Amerikaans octrooi-schrift 6.645.985; N- (piperidine-l-yl)-4,5-difenyl-l-me-thylimidazool-2-carboxamide, A7- (piperidine-l-yl) -4- (2,4-35 dichloorfenyl)-5-(4-chloorfenyl)-l-methylimidazool-2-car-boxamide, N- (piperidine-l-yl)-4,5-di(4-methylfenyl)-1-me-thylimidazool-2-carboxamide, W-cyclohexyl-4,5-di(4-methyl- 56 fenyl)-l-methylimida200l-2-carboxamide, N-(cyclohexyl)-4-(2,4-dichloorfenyl)-5-(4-chloorfenyl)-l-methylimidazool-2-carboxamide en N- (fenyl)-4-(2,4-dichloorfenyl)-5-(4-chloorfenyl)-l-methylimidazool-2-carboxamide, die kunnen 5 worden bereid als beschreven in PCT octrooiaanvrage WO 03/075660; het hydrochloride-/ mesylaat- en besylaatzout van 1-[9- (4-chloorfenyl)-8-(2-chloorfenyl)-9H-purine-6-yl]-4-ethylaminopiperidine-4-carbonzuuramide, dat kan worden bereid als beschreven in Amerikaans octrooiaanvrage 10 2004/0092520; 1-[7-(2-chloorfenyl)-8-(4-chloorfenyl)-2- methylpyrazolo[1,5-a][1,3,5]triazine-4-yl]-3-ethylamino-azetidine-3-carbonzuuramide en 1-[7-(2-chloorfenyl)-8-(4-chloorfenyl)-2-methylpyrazolo[1, 5-a] [1,3,5]triazine-4-yl]- 3- methylaminoazetidine-3-carbonzuuramide, die kunnen wor-15 den bereid als beschreven in Amerikaans octrooiaanvrage 2004/0157839; 3-(4-chloorfenyl)-2-(2-chloorfenyl)-6-(2,2- difluorpropyl)-2,4,5,6-tetrahydropyrazolo[3, 4-c]pyridine- 7-on, dat kan worden bereid als beschreven in Amerikaanse octrooiaanvrage 2004/0214855; 3-(4-chloorfenyl)-2-(2- 20 chloorfenyl)-7-(2,2-difluorpropyl)-6,7-dihydro-2H,5H-4- oxa-1,2,7-triaza-azuleen-8-on, dat kan worden bereid als beschreven in Amerikaanse octrooiaanvrage 2005/0101592; 2-(2-chloorfenyl)-6-(2,2,2-trifluorethyl)-3-(4-trifluorme-thylfenyl)-2,6-dihydropyrazolo[4,3-d]pyrimidine-7-on, dat 25 kan worden bereid als beschreven in Amerikaanse octrooiaanvrage 2004/0214838; (S)-4-chloor-N-{[3-(4-chloorfenyl)- 4- fenyl-4,5-dihydropyrazool-l-yl]methylaminomethyleen}ben-zeensulfonamide (SLV-319) en (S)-N-{[3-(4-chloorfenyl)-4-fenyl-4,5-dihydropyrazool-l-yl]methylaminomethyleen}-4- 30 trifluormethylbenzeensulfonamide (SLV-326), die kunnen worden bereid als beschreven in PCT octrooiaanvrage WO 02/076949; N-piperidino-5-(4-broomfenyl)-1-(2,4-dichloorfenyl) -4-ethylpyrazool-3-carboxaiiu.de, dat kan worden bereid als beschreven in Amerikaanse octrooischrift 35 6.432.984; 1-[bis(4-chloorfenyl)methyl]-3-[(3,5-difluorfe- nyl)methaansulfonylmethyleen]azetidine, dat kan worden bereid als beschreven in Amerikaanse octrooischrift 57 6.518.264; 2-(5-(trifluormethyl)pyridine-2-yloxy)-N-(4-(4- chloorfenyl)-3-(3-cyaanfenyl)butaan-2-yl)-2-methylpropana-mide, dat kan worden bereid als beschreven in PCT octrooiaanvrage WO 04/048317; 4-{[6-methoxy-2-(4-methoxyfenyl)-1-5 benzofuran-3-yl]carbonyl}benzonitril (LY-320135), dat kan worden bereid als beschreven in Amerikaanse octrooischrift 5.747.524; l-[2-(2,4-dichloorfenyl)-2-(4-fluorofenyl)ben zo [1, 3] dioxool-5-sulfonyl] piperidine, dat kan worden bereid als beschreven in WO 04/013120 en [3-amino-5-(4-10 chloorfenyl)-6-(2,4-dichloorfenyl)furo[2, 3-b]pyridine-2- yl]fenylmethanon, dat kan worden bereid als beschreven in PCT octrooiaanvrage WO 04/012671.

Intestinaal werkende MTP-remmers die de voorkeur hebben voor gebruik in de combinaties, farmaceutische prepa-15 raten en werkwijzen van de onderhavige uitvinding omvatten dirlotapide ( (S)-W-{2-[benzyl(methyl)amino]-2-oxo-l-fenyl-ethyl}-l-methyl-5-[4’-(trifluormethyl)[1,1'-bifenyl]-2-carboxamido]-liï-indool-2-carboxamide) en l-methyl-5-[(4'-trifluormethylbifenyl-2-carbonyl)amino]-lH-indool-2-car-20 bonzuur(carbamoylfenylmethyl)amide, die beide kunnen worden bereid met gebruik van werkwijzen die worden beschreven in Amerikaans octrooischrift 6.720.351; (S)—2— [ (4 * — trifluormethylbifenyl-2-carbonyl)amino]chinoline-6-carbon-zuur(pentylcarbamoylfenylmethyl)amide, (S) -2-[(4'-tert-bu-25 tylbifenyl-2-carbonyl)amino]chinoline-6-carbonzuur{[(4- fluorbenzyl)methylcarbamoyl]fenylmethyl}amide en (S)-2-[(4'-tert-butylbifenyl-2-carbonyl)amino]chinoline-6-car-bonzuur [(4-fluorbenzylcarbamoyl)fenylmethyl]amide, die alle kunnen worden bereid als beschreven in Amerikaanse 30 octrooiaanvrage 2005/0234099A1, (-)-4-[4-[4-[4-[[(2S, 4R) - 2-(4-chloorfenyl)-2-[[(4-methyl-4H-l,2,4-triazool-3-yl)-sulfanyl]methyl-1,3-dioxolaan-4-yl]methoxy]fenyl]piperazi-ne-l-yl]fenyl]-2-(IR)-1-methylpropyl]-2,4-dihydro-3H- 1,2,4-triazool-3-on (ook bekend als Mitratapide of 35 R103757), dat kan worden bereid als beschreven in Ameri kaanse octrooischriften 5.521.186 en 5.929.075, en impli-tapide (BAY 13-9952), dat kan worden bereid als beschreven 58 in Amerikaans octrooischrift 6.265.431. De meeste voorkeur hebben dirlotapide, mitratapide, (S)-2-[(4'-trifluorme-thylbifenyl-2-carbonyl)amino]chinoline-6-carbonzuur(pen-tylcarbamoylfenylmethyl)amide, (S)—2 —[(4'-tert-butylbife- 5 nyl-2-carbonyl)amino]chinoline-6-carbonzuur{[(4-fluorben-zyl)methylcarbamoyl]fenylmethyl}amide of (S)-2-[(4'-tert-butylbifenyl-2-carbonyl)amino]chinoline-6-carbonzuur[(4-fluorbenzylcarbamoyl)fenylmethyl]amide. NPY Y5-receptoran-tagonisten die de voorkeur hebben, omvatten: 2-oxo-N-(5- 10 fenylpyrazinyl)spiro[isobenzofuran-1(3H), 4'-piperidine]- 11-carboxamide, dat kan worden bereid als beschreven in Amerikaanse octrooiaanvrage 2002/0151456 en 3-oxo-N-{5-fenyl-2-pyrazinyl)spiro[isobenzofuran-1(3H),4'-piperidine] -1'-carboxamide; 3-oxo-N-(7-trifluormethylpyrido- 15 [3,2-b]pyridine-2-yl)spiro[isobenzofuran-1(3H),4'-piperi dine] -1'-carboxamide; N-[5-(3—fluorfenyl)-2-pyrimidinyl]- 3-oxospiro[isobenzofuran-1(3H), 4'-piperidine]-1'-carboxamide; trans-3'-oxo-N-(5-fenyl-2-pyrimidinyl)]spiro[cyclo-hexaan-1,1’(3Ή)-isobenzofuran]-4-carboxamide; trans-3'-20 oxo-N-[1-(3-chinolyl)-4-imidazolyl]spiro[cyclohexaan- 1,1'(3Ή)-isobenzofuran]-4-carboxamide; trans-3-oxo-N-(5-fenyl-2-pyrazinyl)spiro[4-azaisobenzofuran-l(3H),1'-cy-clohexaan]-4'-carboxamide; trans-N-[5-(3-fluorfenyl)-2-pyrimidinyl] -3-oxospiro [5-azaisobenzofuran-l (3H) , l'-cyclo-25 hexaan]-4'-carboxamide; trans-N-[5-(2-fluorfenyl)-2-pyrimidinyl] -3-oxospiro[5-azaisobenzofuran-l (3H) , l'-cyclohexaan]-4'-carboxamide; trans-N-[1-(3,5-difluorfenyl)-4-imidazo-lyl] -3-oxospiro [7-azaisobenzofuran-l (3H), l'-cyclohexaan] -4’-carboxamide; trans-3-oxo-N-(l-fenyl-4-pyrazolyl)spiro-30 [4-azaisobenzofuran-l (3H), l'-cyclohexaan] -4'-carboxamide; trans-N-[1-(2-fluorfenyl)-3-pyrazolyl]-3-oxospiro[6-aza-isobenzofuran-1 (3H), l'-cyclohexaan]-4'-carboxamide; trans- 3-oxo-N-(l-fenyl-3-pyrazolyl)spiro[6-azaisobenzofuran-1 (3H), l'-cyclohexaan]-4'-carboxamide en trans-3-oxo-N-(2-35 fenyl-1,2,3-triazool-4-yl)spiro[6-azaisobenzofuran-

1 (3H), l'-cyclohexaan] -4'-carboxamide, die alle kunnen worden bereid als beschreven in PCT octrooiaanvrage WO

·· 59 03/082190, en de farmaceutisch aanvaardbare zouten en esters daarvan. Alle hierboven aangehaalde Amerikaanse oc-trooischriften en publicaties zijn hierin opgenomen door verwij zing.

5 Volgens het werkwijzeaspect van de onderhavige uit vinding wordt een PYY-agonist van de onderhavige uitvinding alleen of in combinatie met één of meer andere farmaceutische middelen perifeer toegediend aan een patiënt, apart of tezamen, volgens één van de gebruikelijke werk-10 wijzen voor perifere toediening uit de stand der techniek. Dienoverenkomstig kan de PYY-agonist of een combinatie daarvan aan een patiënt parenteraal (bijv. intraveneus, intraperitoneaal, intramusculair of subcutaan), intrana-saal, oraal, sublinguaal, buccaal, door middel van inhala-15 tie (bijv. door middel van een aërosol), rectaal (bijv. door middel van suppositoria) of transdermaal worden toegediend. Parenterale toediening is een voorkeurswerkwijze voor toediening en subcutane toediening is een voorkeurswerkwijze voor parenterale toediening.

20 Preparaten die geschikt zijn voor parenterale injec tie omvatten in het algemeen farmaceutisch aanvaardbare steriele waterige of niet-waterige oplossingen, dispersies, suspensies of emulsies en steriele poeders voor re-constitutie in steriele injecteerbare oplossingen of dis-25 persies. Voorbeelden van geschikte waterige en niet-wate-rige dragers of verdunningsmiddelen (met inbegrip van oplosmiddelen en vehicula) omvatten water, ethanol, polyolen (propyleenglycol, polyethyleenglycol, glycerol en dergelijke), geschikte mengsels daarvan, triglyceriden, waaron-30 der plantaardige oliën zoals olijfolie, en injecteerbare organische esters zoals ethyloleaat.

Deze preparaten voor parenterale injectie kunnen ook excipiënten bevatten zoals conserveer-, bevochtigings-, solubilisatie- en dispergeermiddelen, alsmede emulgatoren. 35 Voorkomin van verontreiniging door micro-organismen van de preparaten kan worden uitgevoerd met diverse antibacterië-le en antifungale middelen, bijvoorbeeld parabenen, *· 60 chloorbutanol, fenol, sorbinezuur en dergelijke. Het kan ook gewenst zijn om isotone middelen op te nemen, bijvoorbeeld suikers, natriumchloride en dergelijke. Langdurige absorptie van injecteerbare farmaceutische preparaten kan 5 worden teweeggebracht door het gebruik van middelen die de absorptie kunnen uitstellen, bijvoorbeeld aluminiummono-stearaat en gelatine.

De PYY-agonisten van de onderhavige uitvinding zullen aan een patiënt worden toegediend in een dosering die va-10 rieert naar gelang van een aantal factoren, waaronder de wijze van toediening, de leeftijd en het gewicht van de patiënt, de ernst van de ziekte, aandoening of stoornis die wordt behandeld en de farmacologische activiteit van de PYY-agonist die wordt toegediend. De bepaling van dose-15 ringstrajecten en de optimale doseringen voor een bepaalde patiënt valt binnen de gewone vakkennis.

Voor parenterale toediening kunnen de PYY-agonisten van de onderhavige uitvinding aan een menselijke patiënt worden toegediend in doseringsniveaus in het traject van 20 ongeveer 0,01 pg/kg tot ongeveer 10 mg/kg in een dose-ringsregime op basis van een niet-gepegyleerde variant. Een dosis van 85 mg van 30 kD mPEG-maleïmide (E10C) hPYY3-3$, dat een molecuulgewicht van ongeveer 34024 Da (30 kD PEG plus 4024, het molecuulgewicht van het niet-gepegyleerde 25 peptide) , heeft, is equivalent met 10 mg op basis van niet-gepegyleerde (E10C) hPYY3_36· Voor het 20 kD of 12 kD mPEG-maleïmide (E10C) hPYY3-36 zou het parenterale doserings-niveau in het traject van ongeveer 0,01 pg/kg tot ongeveer 10 mg/kg liggen in een doseringsregime op basis van een 30 (E10C)hPYY3-36, en bij voorkeur in het traject van ongeveer 0,01 mg/kg tot ongeveer 1,0 mg/kg, of ongeveer 0,01 mg/kg tot ongeveer 0,05 mg/kg, of ongeveer 0,05 mg/kg tot ongeveer 0,1 mg/kg, of ongeveer 0,05 of 0,1 mg/g tot ongeveer 1,0 mg/kg, of ongeveer 0,05 of 0,1 mg/kg tot ongeveer 0,3 35 of 0,5 mg/kg. Het doseringsregime kan één of meer doses daags, bij voorkeur voorafgaand aan een maaltijd zijn, of, in het bijzonder bij het 30 kD mPEG-maleïmide ·» 61 (E10C) hPYY3_36 of het 20 kD mPEG-maleïmide (E10C) hPYY3-36/ heeft een doseringsregime van twee- of driemaal per week of eenmaal per week, of eenmaal per 10-14 dagen de voorkeur. Op een dagelijkse basis is een doseringstraject dat 5 de voorkeur heeft voor het 20 kD mPEG-maleïmide (E10C) hPYY3_3g ongeveer 0,01 tot ongeveer 0,05 mg/kg en liever ongeveer 0,02 tot ongeveer 0,03 mg/kg. Eveneens op een dagelijkse basis is een doseringstraject dat de voorkeur heeft voor het 12 kD mPEG-maleïmide-(E10C) hPYY3-36 on-10 geveer 0,02 tot ongeveer 0,08 mg/kg en liever ongeveer 0,05 tot ongeveer 0,06 mg/kg, of ongeveer 0,06 tot ongeveer 0,07 mg/kg.

Uitvoeringsvormen van de onderhavige uitvinding worden toegelicht door de volgende voorbeelden. Het zal ech-15 ter duidelijk zijn dat de uitvoeringsvormen van de onderhavige uitvinding niet beperkt zijn tot de specifieke bijzonderheden van deze voorbeelden, aangezien andere variaties daarvan bekend zullen zijn of in het licht van de onderhavige beschrijving en de aangehechte conclusies voor 20 een deskundige voor de hand zullen liggen. Alle hierin aangehaalde literatuurplaatsen zijn hierdoor opgenomen door verwijzing.

VOORBEELDEN

2 5 Voorbeeld 1

Biochemische karakterisering {E10C) hPYY3_36, (D11C) hPYY3-36 en de gepegyleerde vormen van (E10C)hPYY3-36 en (D11C)hPYY3_36 werden gekarakteriseerd door, of kunnen worden gekarakteriseerd, met diverse bio-30 chemische werkwijzen waaronder massaspectrometrie met elektrospray-ionisatie (ESI-MS), SDS-polyacrylamidegel-elektroforese (SDS-PAGE), grootte-uitsluitingschromato-grafie-vloeistofchromatografie met hoog scheidend vermogen (SEC-HPLC, Size Exclusion Chromatography - High Performan-35 ce Liquid Chromatography), en omgekeerde fase vloeistof-chromatografie met hoog scheidend vermogen (RP-HPLC, reversed fase-high performance liquid chromatography).

62 (a) ESI-MS werd uitgevoerd met een LC/MSD electro-spray-massaspectrometer (1100 reeks; Agilent Technologies, Palo Alto, CA, VS) (positieve mode).

(b) RP-HPLC werd uitgevoerd voor analyse van 5 (E10C) hPYY3-36-peptide met een Zorbax Eclipse XDB-C8-kolom, 4,6 x 150 mm, 5 mm (Cat # 993967-906, Agilent Technologies, Palo Alto, CA, VS) met gebruik van een lineaire gradiënt van 100% oplosmiddel A, 0% oplosmoiddel B tot 95% oplosmiddel A, 5% oplosmiddel B in 3 minuten, en vervol-10 gens van 95% oplosmiddel A, 5% oplosmiddel B tot 50% oplosmiddel A, 50% oplosmiddel B in 12 minuten bij een stroomsnelheid van 1,5 ml/minuut. Oplosmiddel A is een 0,1% oplossing van TFA in water. Oplosmiddel B is een 0,1% oplossing van TFA in acetonitril.

15 RP-HPLC voor de bepaling van gepegyleerde (E10C) hPYY3_36 en (D11C)hPYY3-36 werd uitgevoerd met een Vy-dac Cl8-kolom (2,1 x 250 mm) (Cat # 218MS552, Vydac, Hesperia, CA, VS) met een lineaire gradiënt van 80% oplosmiddel A, 20% oplosmiddel B tot 40% oplosmiddel A, 60% oplos-20 middel B in 48 minuten bij een stroomsnelheid van 0,2 ml/minuut. (Voorbeeld 1C, 2C) Oplosmiddel A is een 0,1% oplossing van TFA in water. Oplosmiddel B is een 0,085% oplossing van TFA in acetonitril.

(c) Grootte-uitsluitingschromatografie-vloeistofchro-25 matografie met hoog scheidend vermogen (SEC-HPLC)

De reactiemengsels van lineair 30 kD of vertakt 43 kD mPEG met (E10C) hPYY3_36 of (D11C) hPYY3-36, de samengevoegde mengsels die zijn gezuiverd met een kationenwisselaar en de uiteindelijk gezuiverde producten werden beoordeeld met 30 gebruik van niet-denaturerende SEC-HPLC. De analytische niet-denaturerende SEC-HPLC werd uitgevoerd met een Shodex KW804 of TSK G4000PWXL (Tosohaas) in 20 mM fosfaatbuffer met pH = 7,4, 150 mM NaCl bij een stroomsnelheid van 1,0 ml/minuut (eventueel Superdex 200; 7,8 mm x 30 cm, Amers-35 ham Bioscience, Piscataway, NJ, VS). Pegylering zorgt voor een sterke toename van het hydrodynamische volume van het eiwit, hetgeen leidt tot een verschuiving naar een kortere *· 63 retentietijd. In de reactiemengsels van 30 kD mPEG (D11C) hPYY3-36 en vertakte 43 kD mPEG (E10C) hPYY3_36 werden nieuwe moleculen waargenomen, alsmede zeer weinig niet-ge-modificeerde (D11C) hPYY3_36 of (E10C)hPYY3_36. Deze gepegy-5 leerde en niet-gepegyleerde moleculen werden gefractio- neerd met SP-Sepharose-chromatografie, en de ontstane gezuiverde mono-mPEG (E10C) hPYY3-36 en mPEG (D11C) hPYY3-36-moleculen bleken vervolgens bij niet-denaturerende SEC te elueren als een enkele piek met een zuiverheid > 95%. De 10 stap van SP-Sepharose-chromatografie verwijderde vrije mPEG, (E10C) hPYY3-36 of (D11C) hPYY3_36 en de verbindingen met hogere molecuulgewicht en effectief uit het mono-gepegy-leerde mPEG (E10C) hPYY3_36 of mPEG (D11C) hPYY3.36.

(d) SDS-PAGE

15 SDS-PAGE werd eveneens gebruikt van de reactie, de fracties van zuivering op een kationenwisselaar en de uiteindelijk gezuiverde producten te beoordelen. SDS-PAGE werd uitgevoerd over 1 mm dikke 10 NuPAGE-gelen (Invitro-gen, Carlsbad, CA, VS) onder zowel reducerende als niet-20 reducerende omstandigheden en er werd gekleurd met gebruik van een zgn. Novex Colloidal Coomassie™ G-250 staining kit {Invitrogen, Carlsbad, CA, VS).

Voorbeeld 2 25 Lineaire 30 kD, lineaire 20 kD, lineaire 12 kD en 5 kD mPEG-maleïmi de (E10C) hPYYa-ag

Dit voorbeeld voorziet in de bereiding van nagenoeg homogeen mono-gepegyleerde (E10C) hPYY3_36, waarbij mPEG (30 kD, 20kD, 12kD of 5kD) gebonden is aan rest 10.

30 (a) Bereiding van (E10C) hPYY3-36 (E10C) hPYY3_36 werd gesynthetiseerd met een vaste-fase-werkwijze, waarbij de Fmoc-strategie met activering door 2-(lH-benzotriazool-l-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexa-35 fluorfosfaat (HBTU) (Fastmoc, cycli van 0,15 mmol) in een automatische peptidesynthesizer (model 433A; Applied Bio-systems, Foster City, CA, VS) werd gebruikt. De gebruikte 64 beschermende groepen voor de zij keten waren Trt voor Asn, Gin, Cys en His; tBu voor Ser, Thr en Tyr; Boe voor Lys; OtBu voor Asp en Glu, en Pbf voor Arg. De afsplitsing van het peptide-hars werd voltooid met een mengsel van 9 ml 5 trifluorazijnzuur (TFA), 0,5 g fenol, 0,5 ml H20, 0,5 ml thioanisool en 0,25 ml 1,2 ethaandithiol, gedurende 4 uur bij kamertemperatuur. Het peptide werd neergeslagen in ijskoude ethylether, gewassen met ethylether, opgelost in DMSO en gezuiverd met omgekeerde fase-HPLC over een Delta-10 pak C18-ID-kolom (Waters, 15 pm, 100 A, 50 x 300 mm; Cat # WAT011801, Waters, Milford, MA, VS), waarbij een lineaire gradiënt van 100% oplosmiddel A; 0% oplosmiddel B tot 70% oplosmiddel A: 30% oplosmiddel B in 30 minuten bij een stroomsnelheid van 80 ml/min werd gebruikt. Oplosmiddel A 15 is een 0,1% oplossing van TFA (trifluorazijnzuur) in water. Oplosmiddel B is een 0,1% oplossing van TFA in aceto-nitril. De molecuulmassa van het gezuiverde peptide werd bevestigd door ESI-MS (Mgem - 4024) en de zuiverheid werd vastgesteld met omgekeerde fase-HPLC (figuur 1).

20 (b) Bereiding van lineair 30 kD mPEG-malelmide (E10C) hPYY3-36

Lineair mPEG-maleïmidereagens met een MW van ongeveer 30.000 (Sunbright ME-300MA, NOF Corporation, Tokio, Japan) 25 werd selectief gekoppeld aan (E10C) hPYY3-36 op de sulfhy-drylgroep van de cysteine bij rest 10. Lineair 30 kD mPEG-maleïmide, opgelost in 20 mM HEPES (Sigma Chemical, St. Louis, MO, VS) met pH = 7,0, of, als alternatief, 20 mM natriumacetaat (Sigma Chemical, St. Louis, MO, VS) met pH 30 - 4,5, werd onmiddellijk in reactie gebracht met (E10C) hPYY3_36-peptide door rechtstreekse toevoeging van peptide, hetgeen een peptideconcentratie van 1 mg/ml en een relatieve molverhouding van mPEG: (E10C) hPYY3_36 van ongeveer 1:1 opleverde. De reacties werden gedurende 0,5-24 35 uur in het donker bij kamertemperatuur uitgevoerd. De reacties in HEPES met pH = 7,0 werden gestopt door verdunning in 20 mM natriumacetaat met pH = 4,5, een onmiddel- ·* 65 lijke zuivering op kationenwisselingschromatografie. De reacties in 20 mM natriumacetaat met pH = 4,5 werden direct geladen op kationenwisselingschromatografie. De reac-tieproducten werden beoordeeld met SEC-HPLC (figuur 2).

5 (c) Zuivering van lineair 30 kD mPEG-maleimide (E10C) hPYY3-36

Het gepegyleerde (E10C) hPYY3_36 uit het reactiemengsel werd gezuiverd tot > 95% met gebruik van een enkele ionen-10 wisselingschromatografiestap. Mono-gepegyleerd (E10C) hPYY3-36 werd gescheiden van een niet-gemodif iceerd (E10C)hPYY3-36 en de verbindingen met hogere molecuulge-wichten met gebruik van kationenwisselingschromatografie. Een typisch reactiemengsel van lineair 30 kD mPEG-maleïmi-15 de (E10C)hPYY3-36 (10 mg eiwit), zoals hierboven beschre ven, werd gescheiden op een SP-Sepharose Hitrap-kolom (5 ml) (Amersham Pharmacia Biotech, GE Healthcare, Piscata-way, NJ, VS), geëquilibreerd in 20 mM natriumacetaat met pH = 4,5 (buffer A) . Het reactiemengsel werd 7x verdund 20 met buffer A en op de kolom geladen bij een stroomsnelheid van 2,5 ml/min. De kolom werd gewassen met 5-10 kolomvolu-mina van buffer A. Vervolgens werden de diverse (E10C) hPYY3_36-moleculen van de kolom geëlueerd in 20 kolomvolumina van een lineaire NaCl-gradiënt van 0-100 mM. 25 Het eluens werd gevolgd met absorptie bij 280 nm (A280) en fracties van de juiste grootte werden verzameld. De fracties werden vervolgens samengevoegd naar gelang van de mate van pegylering, zoals bepaald met SDS-PAGE® (figuur 3) . Het gezuiverde samengevoegde mengsel werd vervolgens ge-30 concentreerd tot 0,5-5 mg/ml in een Centriprep 3- concentrator (Amicon Technology Corporation, Northborough, MA, VS) of als alternatief met gebruik van een Vivaspin 10K-concentrator (Vivascience Sartorius Group, Hannover, Duitsland). De eiwitconcentratie van het gezuiverde samen-35 gevoegde mengsel werd bepaald door vergelijken van het van een RP-HPLC-piekoppervlak met een PYY3-36-standaardkromme (niet afgebeeld). Als alternatief werd de concentratie van 66 het gezuiverde samengevoegde mengsel bepaald met de absorptie bij 280 nm met gebruik van een experimenteel bepaalde extinctiecoëfficiënt. Van het gezuiverde samengevoegde mengsel van gepegyleerd (E10C) hPYY3_36 werd met ge-5 bruik van SEC-HPLC een profiel gemaakt zoals getoond in figuur 6.

(d) Bereiding van lineair 20 kD mPEG-malelmide (E10C) hPYY3-3e 10 Lineair mPEG-maleïmidereagens met een MW van ongeveer 20.000 (Sunbright ME-200MA, NOF Corporation) werd selectief gekoppeld aan (E10C) hPYY3.36 op de sulfhydrylgroep van de cysteine bij rest 10. Lineair 20 kD mPEG-maleïmide, opgelost in 20 mM natriumacetaat (Sigma Chemical, St. Louis, 15 MO, VS) met pH = 4,5, werd onmiddellijk in reactie ge bracht met (E10C) hPYY3.36-peptide door rechtstreekse toevoeging van peptide, zodat een peptideconcentratie van 1 mg/ml en een relatieve molverhouding van mPEG: (E10C)hPYY3-36 van ongeveer 1:3:1 werd verkregen. De 20 reacties werden in het donker gedurende 60 minuten bij ka mertemperatuur en vervolgens gedurende waarna nog 16 uur bij 4°C uitgevoerd. De reactiemengsels in 20 mM natriumacetaat met pH = 4,5 werden direct geladen op kationen-wisselingschromatografie. De reactieproducten werden be-25 oordeeld met SEC-HPLC.

(e) Zuivering van lineair 20 kD mPEG-maleïmide (E10C) hPYY3_36

Het gepegyleerde (E10C) hPYY3-36 uit het reactiemengsel 30 werd gezuiverd tot > 95% met gebruik van een enkele ionen-wisselingschromatografiestap. Mono-gepegyleerd (E10C) hPYY3_36 werd gescheiden van vrije PEG, niet- gemodif iceerde (E10C) hPYY3-36 en de verbindingen met een hoger molecuulgewicht met gebruik van kationenwisselings-35 chromatografie. Een typisch reactiemengsel van lineair 20 kD mPEG-maleïmide (E10C)hPYY3_36 ( 20 mg) eiwit, zoals hierboven beschreven, werd gescheiden over een SP-Sepharose ·* 67

Hitrap-kolom {5 ml) (Amersham Pharmacia Biotech, GE Healthcare) , geëquilibreerd in 20 mM natriumacetaat met pH = 4,5 (buffer A) . Het reactiemengsel werd op de kolom geladen bij een stroomsnelheid van 0,2 ml/min. De kolom werd 5 gewassen met 4 kolomvolumina van buffer A bij een stroomsnelheid van 2,5 ml/min. Vervolgens werden de diverse (E10C) hPYY3_36-moleculen van de kolom geëlueerd in 25 kolomvolumina van een lineaire NaCl-gradiënt van 0-200 mM bij een stroomsnelheid van 2,5 ml/min. Het eluens werd ge-10 volgd met absorptie bij 280 nm (A2eo) en fracties van de juiste grootte werden verzameld. De fracties werden samengevoegd naar gelang van de mate van pegylering, zoals vastgesteld met SEC-HPLC. Het gezuiverde samengevoegde mengsel werd vervolgens geconcentreerd tot 0,5-5 mg/ml met 15 gebruik van een Vivaspin 10K-concentrator (Vivascience

Sartorius Group). De eiwitconcentratie van het gezuiverde samengevoegde mengsel werd vastgesteld door absorptie bij 280 nm met gebruik van een experimenteel bepaalde extinc-tiecoëfficiënt. De totale opbrengst van de werkwijze van 20 gezuiverd mono-20 kD mPEG-maleimide (E10C) hPYY3_36 was 38%. De gezuiverde fractie van mono-20 kD mPEG-maleïmide (E10C) hPYY3_36 werd vastgesteld op een zuiverheid van 96% met gebruik van SEC-HPLC.

25 (f) Bereiding van lineair 20 kD mPEG-maleïmide (E10C) hPYY3-36

Lineair mPEG-maleïmidereagens met een MW van ongeveer 12.000 (Sunbright ME-120MA, NOF Corporation) werd selectief gekoppeld aan (E10C) hPYY3-36 op de sulfhydrylgroep van 30 de cysteine bij rest 10. Lineair 12 kD mPEG-maleïmide opgelost in 20 mM natriumacetaat (Sigma Chemical) met pH = 4,5, werd onmiddellijk in reactie gebracht met (E10C) hPYY3_36-peptide door rechtstreekse toevoeging van peptide, zodat een peptideconcentratie van 1 mg/ml en een 35 relatieve mol verhouding van mPEG: (E10C) hPYY3-36 van ongeveer 1:1 werd verkregen. De reacties werden in het donker gedurende 0,5 tot 24 uur bij kamertemperatuur uitgevoerd.

/ 68

De reactiemengsels in 20 mM natriumacetaat met pH = 4,5 werden direct geladen op kationenwisselingschromatografie. De reactieproducten werden beoordeeld met SEC-HPLC.

5 (g) Zuivering van lineair 12 kD mPEG-maleïmide (E10C)hPYY3-36

Het gepegyleerde (E10C) hPYY3_36 uit het reactiemengsel werd gezuiverd tot > 95% met gebruik van een enkele ionen-wisselingschromatografiestap. Mono-gepegyleerd 10 (E10C) hPYY3_36 werd gescheiden van vrije PEG, niet- gemodificeerde (E10C) hPYY3-36 en de verbindingen met een hoger molecuulgewicht met gebruik van kationenwisseling-schromatografie. Een typisch reactiemengsel van lineair 12 kD mPEG-maleimide (E10C) hPYY3-36 (25 mg eiwit), zoals hier-15 boven beschreven, werd gescheiden over een SP-Sepharose Hitrap-kolom (5 ml) (Amersham Pharmacia Biotech, GE Healthcare), geëquilibreerd in 20 mM natriumacetaat met pH = 4,5 (buffer A) . Het reactiemengsel werd op de kolom gebracht bij een stroomsnelheid van 0,2 ml/min. De kolom 20 werd gewassen met 4 kolomvolumina van buffer A bij een stroomsnelheid van 2,5 ml/min. Vervolgens werden de diverse (E10C) hPYYs-ae-moleculen van de kolom geëlueerd in 4 kolomvolumina van een lineaire NaCl-gradiënt van 0-400 mM bij een stroomsnelheid van 2,5 ml/min. Het eluens werd ge-25 volgd met absorptie bij 280 nm (A280) en fracties van de juiste grootte werden verzameld. De fracties werden samengevoegd naar gelang van de mate van pegylering, zoals vastgesteld met SEC-HPLC. Het gezuiverde samengevoegde mengsel werd vervolgens geconcentreerd tot 0,5-5 mg/ml met 30 gebruikt van een Vivaspin 10K-concentrator (Vivascience Sartorius Group). De eiwitconcentratie van het gezuiverde samengevoegde mengsel werd bepaald met de absorptie bij 280 nm met gebruik van een experimenteel bepaalde extinc-tiecoëfficiënt. Van een gezuiverd samengevoegd mengsel van 35 12 kD mPEG-maleïmide (E10C) hPYY3-36 werd met gebruik van SEC-HPLC een profiel gemaakt, en hij elueerde als een enkele piek.

* 69 (h) Bereiding van lineair 5 kD mPEG-maleïmide (E10C) hPYY3-3e

Lineair raPEG-maleïmidereagens met een MW van ongeveer 5000 (Sunbright ME-050MA, NOF Corporation) werd selectief 5 koppeld aan (E10C) hPYY3-36 op de sulfhydrylgroep van de cysteine bij rest 10. Lineair 12 kD mPEG-maleïmide, opgelost in 20 mM natriumacetaat (Sigma Chemical) met pH = 4,5, werd onmiddellijk in reactie gebracht met (E10C) hPYY3-36-peptide door rechtstreekse toevoeging van 10 peptide, zodat een peptideconcentratie van 1 mg/ml en een relatieve molverhouding van mPEG: (E10C)hPYY3-36 van ongeveer 1:1 werd verkregen. De reacties werden in het donker gedurende 0,5 tot 24 uur bij kamertemperatuur uitgevoerd. De reactiemengsels in 20 mM natriumacetaat met pH = 4,5 15 werden direct geladen op kationenwisselingschromatografie. De reactieproducten werden beoordeeld met SEC-HPLC.

(i) Zuivering van lineair 5 kD mPEG-maleïmide (El0C) hPYY3-36

Het gepegyleerde (E10C) hPYY3_36 uit het reactiemengsel 20 werd gezuiverd tot > 95% met gebruik van een enkele ionenwis selingschromatografiestap. Mono-gepegyleerd (E10C) hPYY3_36 werd gescheiden van vrije PEG, niet-ge-modificeerd (E10C) hPYY3-36 en de verbindingen met een hoger molecuulgewicht met gebruik van kationenwisselingschroma-25 tografie. Een typisch reactiemengsel van lineair 5 kD mPEG-maleïmide (E10C) hPYY3-36 (25 mg eiwit), zoals hierboven beschreven, werd gescheiden over een SP-Sepharose Hitrap-kolom (5 ml) (Amersham Pharmacia Biotech, GE Healthcare), geëquilibreerd in 20 mM natriumacetaat met pH = 4,5 (buf-30 fer A) . Het reactiemengsel werd op de kolom gebracht bij een stroomsnelheid van 0,2 ml/min. De kolom werd gewassen met 4 kolomvolumina van buffer A bij een stroomsnelheid van 2,5 ml/min. Vervolgens werden de diverse (E10C) hPYY3_36-moleculen van de kolom geëlueerd in 5 kolom-35 volumina van een lineaire NaCl-gradiënt van 0-500 mM bij een stroomsnelheid van 2,5 ml/min. Het eluens werd gevolgd met absorptie bij 280 nm (A280) en fracties van de juiste / 70 grootte werden verzameld. De fracties werden samengevoegd naar gelang van de mate van pegylering, zoals vastgesteld met SEC-HPLC. De eiwitconcentratie van het gezuiverde samengevoegde mengsel werd vastgesteld als 0,5-5 mg/ml door 5 de absorptie bij 280 nm met gebruik van een experimenteel bepaald extinctiecoëfficiënt. Van een gezuiverd samengevoegd mengsel van 5 kD mPEG-maleïmide (E10C) hPYY3_36 werd met gebruik van SEC-HPLC een profiel gemaakt, en hij elu-eerde als een enkele piek.

10

Voorbeeld 3

Lineair 30 kD mPEG-maleïmide(DllQhPYYs-ae

Dit voorbeeld laat de bereiding van nagenoeg homogeen mono-gepegyleerd (D11C) hPYY3_36 zien, waarbij mPEG gebonden 15 is aan rest 11.

(a) Bereiding van (Dl 1C)hPYY3-36 (DllC) hPYY3_36 werd gesynthetiseerd met een vaste-fase-werkwijze, waarbij de Fmoc-strategie met activering door 20 2-(lH-benzotriazool-l-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexa- fluorfosfaat (HBTU) (Fastmoc, cycli van 0,15 mmol) in een automatische peptidesynthesizer (model 433A; Applied Bio-systems, Foster City, CA, VS) werd gebruikt. De gebruikte beschermende groepen voor de zij keten waren Trt voor Asn, 25 Gin, Cys en His; tBu voor Ser, Thr en Tyr; Boe voor Lys; OtBu voor Asp en Glu, en Pbf voor Arg. De afsplitsing van peptidehars werd voltooid met een mengsel van 9 ml tri-fluorazijnzuur (TFA), 0,5 g fenol, 0,5 ml H20, 0,5 ml thioanisool en 0,25 ml 1,2;ethaandithiol, gedurende 4 uur 30 bij kamertemperatuur. Het peptide werd neergeslagen in ijskoude ethylether, en gewassen met ethylether, opgelost in DMSO en gezuiverd met omgekeerde fase-HPLC over een Waters Deltapak C18-ID-kolom (Waters, 15 μιτι, 100 A, 50 x 300 mm; Cat # WAT011801, Milford, MA, VS), waarbij een li-

35 neaire gradiënt van 100% oplosmiddel A: 0% oplosmiddel B

tot 70% oplosmiddel A: 30% oplosmiddel B in 30 minuten bij een stroomsnelheid van 80 ml/min werd gebruikt. Oplosmid- / 71 del A is een 0,1% oplossing van TFA in water. Oplosmiddel B is een 0,1% oplossing van TFA in acetonitril. De mole-cuulmassa van het gezuiverde peptide werd bevestigd met ESI-MS (Mgem = 4038) en de zuiverheid werd vastgesteld met 5 omgekeerde fase-HPLC (figuur 4).

(b) Bereiding van lineair 30 kD mPEG malelmide-(PllC)hPYY3-36

Lineair mPEG-maleïmidereagens met een MW van ongeveer 10 30.000 (Sunbright ME-300MA, NOF Corporation, Tokio, Japan) werd selectief gekoppeld aan (D11C) I1PYY3-36 op de sulfhy-drylgroep van de cysteine bij rest 11. Lineair 30 kD mPEG-maleïmide, opgelost in 20 mM HEPES (Sigma Chemical, St. Louis, MO, VS) met pH = 7,0, werd onmiddellijk in reactie 15 gebracht met (D11C)hPYY3_36-peptide door rechtstreekse toevoeging van peptide, hetgeen een peptideconcentratie van 1 mg/ml en een relatieve molverhouding van mPEG: (D11C)hPYY3_36 van ongeveer 1:1 opleverde. De reacties werden gedurende 0,5-24 uur in het donker bij kamertempe-20 ratuur uitgevoerd. De reacties werden gestopt door verdunning in 20 mM natriumacetaat met pH = 4,5, voor onmidde-lijke zuivering door kationenwisselingschromatografie. De reactieproducten werden beoordeeld met SEC-HPLC (figuur 5) .

25 Als alternatief kan in plaats van oplossen van li neair 30 kD mPEG-maleïmide in HEPES als hierboven wordt beschreven, worden opgelost in 20 mM natriumacetaat (Sigma Chemical, St. Louis, MO, VS) met pH = 4,5 en onmiddellijk in reactie gebracht met (D11C) hPYY3_36-peptide door recht-30 streekse toevoeging van peptide, hetgeen een peptideconcentratie van 1 mg/ml en een relatieve molverhouding van mPEG: (DllC)hPYY3-36 van ongeveer 1:1 opleverde. De reacties werden gedurende 0,5-24 uur in het donker bij kamertemperatuur uitgevoerd. De reactiemengsels werden direct gela-35 den op kationenwisselingschromatografie. De reactieproduc-ten worden beoordeeld met SEC-HPLC.

* 72 (c) Zuivering van lineair 30 kD mPEG-maleïmide-(Dl 1C) hPYY3-36

Het gepegyleerde (DllC) hPYY3_36 uit het reactiemengsel werd gezuiverd tot > 95% met gebruikvan een enkele ionen-5 wisselingschromatografiestap. Mono-gepegyleerd (D11C) hPYY3_36 werd gescheiden van niet-gemodif iceerd (D11C) hPYY3-36 en de verbindingen met hogere molecuulge-wicht en met gebruik van kationenwisselingschromatografie. Een typisch reactiemengsel van lineair 30 kD mPEG-maleïmi-10 de (D11C)hPYY3_36 (10 mg eiwit), zoals hierboven beschreven, werd gescheiden over een SP-Sepharose Hitrap-kolom (5 ml) (Amersham Pharmacia Biotech, GE Healthcare, Piscata-way, NJ, VS), geëquilibreerd in 20 mM natriumacetaat met pH = 4,5 (buffer A) . Het reactiemengsel werd bij pH = 7,0 15 7x verdund met buffer A en op de kolom geladen bij een stroomsnelheid van 0,2 ml/min. De kolom werd gewassen met 5-10 kolomvolumina van buffer A bij een stroomsnelheid van 2,5 ml/min. Vervolgens werden de diverse (DllC) hPYY3-.36-moleculen van de kolom geëlueerd in 20 kolomvolumina van 20 een lineaire NaCl-gradiënt van 0-100 mM. Het eluens werd gevolgd met absorptie bij 280 nm (A2eo) en fracties van de juiste grootte werden verzameld. De fracties werden vervolgens samengevoegd naar gelang van de mate van pegyle-ring, zoals werd vastgesteld door middel van SEC-HPLC. Het 25 gezuiverde samengevoegde mengsel werd vervolgens geconcentreerd tot 0,5-5 mg/ml in een Vivaspin 10K-concentrator (Vivascience Sartorius Group). De eiwitconcentratie van het gezuiverde samengevoegde mengsel werd bepaald door vergelijken van het RP-HPLC-piekoppervlak met een PYY3_36-30 standaardkromme (niet afgebeeld). Van een gezuiverd samengevoegd mengsel van gepegyleerd (DllC) hPYY3_36 werd met gebruik van SEC-HPLC een profiel gemaakt zoals getoond in figuur 7.

Als alternatief worden de reactiemengsels met pH = 35 4,5, uit (b) hierboven, rechtstreeks op de kolom gebracht bij een stroomsnelheid van 2,5 ml/min en wordt de concentratie van het gezuiverde samengevoegde mengsel bepaald 73 door de absorptie bij 280 run met gebruik van een experimenteel bepaalde extinctiecoëfficiënt.

Voorbeeld 4 5 Vertakt 43 kP en vertakt 20 kD mPEG-maleïmide (E10CC)hPYY3-36

Dit voorbeeld laat de bereiding van nagenoeg homogeen mono-gepegyleerd (E10CC) hPYY3_36 zien, waarbij vertakt 4 3 kD of 20 kD mPEG gebonden is aan rest 10.

10 (a) Bereiding van vertakt 43 kD mPEG-maleïmide (E10CC) hPYY3-36

Vertakt mPEG-maleïmidereagens met een MW van ongeveer 43.000 (Sunbright GL2-400MA, NOF Corporation, Tokio, Ja-15 pan) werd selectief gekoppeld aan (E10C) hPYY3-36, dat was bereid zoals beschreven in voorbeeld 1(a), op de sulfhy-drylgroep van de cysteïne bij rest 10.

Vertakt 43 kD mPEG-maleïmide, opgelost in 20 mM HEPES (Sigma Chemical, St. Louis, MO, VS) met pH = 7,0, werd on-20 middellijk in reactie gebracht met (E10C) hPYY3-36-peptide door rechtstreekse toevoeging van peptide, zodat een pep-tideconcentratie van 1 mg/ml en een relatieve molverhou-ding van mPEG: (E10C) hPYY3_36 van ongeveer 1:1 werd verkregen. De reacties werden gedurende 0,5-24 uur in het donker 25 bij kamertemperatuur uitgevoerd. De reacties in HEPES met pH = 7,0 werden gestopt door verdunning in 20 mM na- triumacetaat met pH = 4,5, voor onmiddellijke zuivering op kationenwisselingschromatografie. De reactieproducten werden beoordeeld met SEC-HPLC (figuur 8).

30 Als alternatief werd vertakt 43 kD mPEG-maleïmide op gelost in 20 mM natriumacetaat (Sigma Chemical, St. Louis, MO, VS) met pH = 4,5 en onmiddellijk in reactie gebracht met (E10C) hPYY3_36-peptide door rechtstreekse toevoeging van peptide, zodat een peptideconcentratie van 1 mg/ml en 35 een relatieve mol verhouding van mPEG: (E10C) hPYY3-36 van ongeveer 1:1 werd verkregen. De reactiemengsels werden direct op kationenwisselingschromatografie geladen.

/ 74 (b) Zuivering van mono-qepeqyleerd vertakt 43 kD mPEG-malelmide (E10CC) hPYY3-36

Het mono-gepegyleerde vertakte 43 kD mPEG-maleimi-5 de (E10CC) hPYY3_36-molecuul werd gescheiden van niet-gemodi-ficeerd {E10C) hPYY3_36 en moleculen met hogere molecuulge-wichten met gebruik van een enkele chromatografiestap over een kationenwisselaar. Een typisch reactiemengsel van vertakte 43 kD mPEG-maleïmide (E10C)hPYY3-36 (10 mg eiwit), 10 zoals hierboven beschreven, werd gescheiden over een SP-Sepharose Hitrap-kolom (5 ml) (Amersham Pharmacia Biotech, GE Healthcare, Piscataway), geëquilibreerd in 20 mM natri-umacetaat met pH = 4,5 (buffer A) . De reactiemengsels met pH = 7,0 werden lOx verdund met buffer A en op de kolom 15 geladen bij een stroomsnelheid van 2,5 ml/min. De kolom werd gewassen met 5-10 kolomvolumina van buffer A. Vervolgens werden de diverse (E10C) hPYY3_36-moleculen van de kolom geëlueerd in 20 kolomvolumina van een lineaire NaCl-gradiënt van 0-100 mM. Het eluens werd gevolgd met absorp-20 tie bij 280 nm (A2eo) en fracties van de juiste grootte werden verzameld. De fracties werden samengevoegd naar gelang van de mate van pegylering, zoals vastgesteld met SEC-HPLC. Het gezuiverde samengevoegde mengsel werd vervolgens geconcentreerd tot 0,5-5 mg/ml in een Centriprep 25 3-concentrator (Amicon Technology Corporation) of als alternatief in een Vivaspin 10K-concentrator (Vivascience Sartorius Group). De eiwitconcentratie van het gezuiverde samengevoegde mengsel werd gekwantificeerd door aminozuur-analyse. Van het gezuiverde samengevoegde mengsel van mo-30 no-gepegyleerd vertakt 43 kD mPEG-maleimide (E10CC) hPYY3_36 werd met gebruik van SEC-HPLC een profiel gemaakt zoals getoond in figuur 9.

Als alternatief werd de eiwitconcentratie bepaald door vergelijken van het RP-HPLC-piekoppervlak met een 35 PYY3-36~standaardkromme (niet afgebeeld) of door de absorptie bij 280 nm met gebruik van een experimenteel bepaalde extinctiecoëfficiënt.

75 (c) Bereiding van vertakt 20 kD mPEG-maleïmide (E10CC)hPYY3-36

Vertakt mPEG-maleïmidereagens met een MW van ongeveer 5 20.000 (Sunbright GL2-200MA, NOF Corporation) werd selec tief gekoppeld aan (E10C) hPYY3_36 op de sulfhydrylgroep van de cysteine bij rest 10. Vertakt 20 kD mPEG-maleïmide, opgelost in 20 mM natriumacetaat (Sigma Chemical, St. Louis, MO, VS) met pH = 4,5, werd onmiddellijk in reactie ge-10 bracht met (E10C) hPYY3_36-peptide door rechtstreekse toe voeging van peptide, zodat een peptideconcentratie van 1 mg/ml en een relatieve molverhouding van mPEG: (E10C)hPYY3-36 van ongeveer 1,25:1 werd verkregen opleverde. De reacties werden gedurende 0,5-24 uur in het 15 donker bij kamertemperatuur uitgevoerd. De reactiemengsels in 20 mM natriumacetaat met pH = 4,5 werden direct geladen op kationenwisselingschromatografie. De reactieproducten werden beoordeeld met SEC-HPLC.

20 (d) Zuivering van vertakt 20 kD mPEG-maleïmide (El OCC) hPYY3_36

Het gepegyleerde (E10C) hPYY3_36 uit het reactiemengsel werd gezuiverd tot > 95% met gebruik van een enkele ionen-wisselingschromatografiestap. Mono-gepegyleerd 25 (E10C)hPYY3_36 werd gescheiden van vrije PEG, niet-gemodi- ficeerd (E10C) hPYY3-36 en de verbindingen met hogere mole-cuulgewichten met gebruik van kationenwisselingschromato-grafie. Een typisch reactiemengsel van vertakt 20 kD mPEG-maleïmide (E10C)hPYY3_36 (10 mg eiwit), zoals hierboven be-30 schreven, werd gescheiden over een SP-Sepharose Hitrap-kolom (5 ml) (Amersham Pharmacia Biotech, GE Healthcare), geëquilibreerd in 20 mM natriumacetaat met pH = 4,5 (buffer A) . Het reactiemengsel werd op de kolom geladen bij een stroomsnelheid van 0,2 ml/min. De kolom werd gewassen 35 met 4 kolomvolumina van buffer A bij een stroomsnelheid van 2,5 ml/min. Vervolgens werden de diverse (E10C)hPYY3-36-moleculen van de kolom geëlueerd in 25 76 kolomvolumina van een lineaire NaCl-gradiënt van 0-200 mM bij een stroomsnelheid van 2,5 ml/min. Het eluens werd gevolgd met absorptie bij 280 nm (A280) en fracties van de juiste grootte werden verzameld. De fracties werden ver-5 volgens samengevoegd naar gelang van de mate van pegyle-ring, zoals vastgesteld met SEC-HPLC. Het gezuiverde samengevoegde mengsel werd vervolgens geconcentreerd tot 0,5-5 mg/ml in een Vivaspin 10K-concentrator (Vivascience Sartorius Group). De eiwitconcentratie van het gezuiverde 10 samengevoegde mengsel werd bepaald door de absorptie bij 280 nm met gebruik van een experimenteel bepaalde extinc-tiecoëfficiënt. Van het gezuiverde samengevoegde mengsel van vertakt 20 kD mPEG-maleïmide (E10C) hPYY3_36 werd met gebruik van SEC-HPLC of SDS-PAGE een profiel gemaakt en hij 15 elueerde als een enkele piek.

Voorbeeld 5 *

Dit voorbeeld beschouwt de bereiding van nagenoeg homogeen mono-gepegyleerd (D11C) hPYY3-36 met lineaire 20 kD 20 mPEG, lineaire 12 kD mPEG of vertakte 20 kD mPEG, die gebonden is aan rest 11.

(a) Bereiding van lineair 20 kD mPEG-maleïmide (D11C) hPYY3_36 25 Lineair mPEG-maleïmidereagens met een MW van ongeveer 20.000 (Sunbright ME-200MA, NOF Corporation) werd selectief gekoppeld aan (D11C)hPYY3_36 op de sulfhydrylgroep van de cysteine bij rest 11. Lineair 20 kD mPEG-maleïmide, opgelost in 20 mM natriumacetaat (Sigma Chemical) met pH = 30 4,5, werd onmiddellijk in reactie gebracht met (DllC)hPYY3-36-peptide door rechtstreekse toevoeging van peptide, zodat een peptideconcentratie van 1 mg/ml en een relatieve molverhouding van mPEG: (D11C) hPYY3_36 van ongeveer 1:1 werd verkregen. De reacties werden gedurende 0,5-35 24 uur in het donker bij kamertemperatuur uitgevoerd. De reactiemengsels in 20 mM natriumacetaat met pH = 4,5 werden direct op kationenwisselingschromatografie geladen. De 77 reactieproducten werden beoordeeld met SEC-HPLC of SDS-PAGE.

(b) Zuivering van lineair 20 kD mPEG-maleïmide 5 (D11C) hPYY3_36

Het gepegyleerde (D11C)hPYY3_36 uit het reactiemengsel werd gezuiverd tot > 95% met gebruik van een enkele ionen-wisselingschromatografiestap. Mono-gepegyleerd (Dl 1C)hPYY3_36 werd gescheiden van vrije PEG, niet-gemodi-10 ficeerde (D11C) hPYY3_3e en de verbindingen met hogere mole-cuulgewichten met gebruik van kationenwisselingschromato-grafie. Een typisch reactiemengsel van lineair 20 kD mPEG-maleimide (D11C) hPYY3_36 (10 mg eiwit), zoals hierboven beschreven, werd gescheiden over een SP-Sepharose Hitrap-15 kolom (5 ml) (Amersham Pharmacia Biotech, GE Healthcare), geëquilibreerd in 20 mM natriumacetaat met pH = 4,5 (buffer A) . Het reactiemengsel werd op de kolom geladen bij een stroomsnelheid van 1,0 ml/min. De kolom werd gewassen met 4 kolomvolumina van buffer A bij een stroomsnelheid 20 van 2,5 ml/min. Vervolgens werden de diverse (D11C) hPYY3_36-moleculen van de kolom geëlueerd in 25 kolomvolumina van een lineaire NaCl-gradiënt van 0-200 mM bij een stroomsnelheid van 2,5 ml/min. Het eluens werd gevolgd met absorptie bij 280 nm (A2eo) en fracties van de 25 juiste grootte werden verzameld. De fracties werden samengevoegd naar gelang van de mate van pegylering, zoals vastgesteld met SEC-HPLC. Het gezuiverde samengevoegde mengsel wordt vervolgens geconcentreerd tot 0,5-5 mg/ml met gebruik van een Vivaspin 10K-concentrator (Vivascience 30 Sartorius Group). De eiwitconcentratie van het gezuiverde samengevoegde mengsel wordt bepaald door de absorptie bij 280 mM met gebruik van een experimenteel bepaalde extinc-tiecoëfficiënt. Van het gezuiverde samengevoegde mengsel van 20 kD mPEG-maleïmide (Dl 1C) ΙΊΡΥΥ3-36 werd met gebruik van 35 SEC-HPLC of SDS-PAGE een profiel gemaakt.

/ 78 (c) Bereiding van lineair 12 kD mPEG-malelmide (PllC)hPYY3-36

Lineair mPEG-maleïmidereagens met een MW van ongeveer 12.000 (Sunbright ME-200MA, NOF Corporation) werd selec-5 tief gekoppeld aan (D11C) hPYY3_36 op de sulfhydrylgroep van de cysteine bij rest 10. Lineair 12 kD mPEG-maleimide, op-gelost in 20 mM natriumacetaat (Sigma Chemical, St. Louis, MO, VS) met pH = 4,5, werd onmiddellijk in reactie ge bracht met {D11C) hPYY3_36-peptide door rechtstreekse toe-10 voeging van peptide, zodat een peptideconcentratie van 1 mg/ml en een relatieve molverhouding van mPEG: (D11C) hPYY3_36 van ongeveer 1:1 werd verkregen. De reacties werden gedurende 0,5-24 uur in het donker bij kamertemperatuur uitgevoerd. De reactiemengsels in 20 mM na-15 triumacetaat met pH = 4,5 werden direct op kationenwisse-lingschromatografie geladen. De reactieproducten werden beoordeeld met SEC-HPLC of SDS-PAGE.

(d) Zuivering van lineair 12 kD mPEG-maleimide-20 (PllC)hPYY3-3fi

Het gepegyleerde (D11C) hPYY3_36 uit het reactiemengsel werd gezuiverd tot > 95% met gebruik van een enkele ionen-wisselingschromatografiestap. Mono-gepegyleerd

(Dl 1C)hPYY3_36 werd gescheiden van vrije mPEG, niet-gemodi-25 ficeerde (D11C) hPYY3-36 en de verbindingen met hogere mole-cuulgewichten met gebruik van kationenwisselingschromato-grafie. Een typisch reactiemengsel van lineaire 20 kD mPEG-maleïmide (D11C)hPYY3_36 (10 mg eiwit), zoals hierboven beschreven, werd gescheiden over een SP-Sepharose Hi-30 trap-kolom (5 ml) (Amersham Pharmacia Biotech, GE Healthcare), geëquilibreerd in 20 mM natriumacetaat met pH = 4,5 (buffer A) . Het reactiemengsel werd vervolgens op de kolom gebracht bij een stroomsnelheid van 1,0 ml /min. De kolom werd gewassen met 4 kolomvolumina van buffer A bij een 35 stroomsnelheid van 2,5 ml/min. Vervolgens werden de diverse (Dl 1C) hPYY3-36-moleculen van de kolom geëlueerd in 25 kolomvolumina van een lineaire NaCl-gradiënt van 0-200 mM

79 bij een stroomsnelheid van 2,5 ml/min. Het eluens werd gevolgd met absorptie bij 280 nm (Α2βο) en fracties van de juiste grootte werden verzameld. De fracties werden samengevoegd naar gelang van de mate van pegylering, zoals 5 vastgesteld met SEC-HPLC. Het gezuiverde samengevoegde mengsel werd vervolgens geconcentreerd tot 0,5-5 mg/ml met gebruik van een Vivaspin 10K-concentrator (Vivascience Sartorius Group). De eiwitconcentratie van het gezuiverde samengevoegde mengsel werd bepaald door de absorptie bij 10 280 mM met een experimenteel bepaalde extinctiecoëffi- ciënt. Van het gezuiverde samengevoegde mengsel van 12 kD mPEG-maleïmide (D11C) hPYY3-36 werd met gebruik van SEC-HPLC of SDS-PAGE een profiel gemaakt.

15 (e) Bereiding van vertakt 20 kD mPEG-malelmide- (D11C) hPYY3-36

Vertakt mPEG-maleïmide reagens met een MW van ongeveer 20.000 (Sunbright GL2-200MA, NOF Corporation) werd selectief gekoppeld aan (D11C) I1PYY3-36 op de sulfhydryl-20 groep van de cysteine bij rest 10. Vertakt 20 kD mPEG-maleïmide, wordt opgelost in 20 mM natriumacetaat (Sigma Chemical, St. Louis, MO, VS) met pH = 4,5, wordt onmiddellijk in reactie gebracht met (D11C) hPYY3_36~peptide door rechtstreekse toevoeging van peptide, zodat een peptide-25 concentratie van 1 mg/ml en een relatieve molverhouding van mPEG: (D11C) hPYY3_36 van ongeveer 1:1 werd verkregen. De reacties werden gedurende 0,5-24 uur in het donker bij kamertemperatuur uitgevoerd. De reactiemengsels in 20 mM natriumacetaat met pH = 4,5 worden direct op kationenwisse-30 lingschromatografie geladen. De reactieproducten werden beoordeeld met SEC-HPLC.

(f) Zuivering van vertakt 20 kD mPEG-maleïmide (DllC) hPYYa-36 35 Het gepegyleerde {DllC)hPYY3_36 uit het reactiemengsel werd gezuiverd tot > 95% met gebruik van een enkele ionen-wisselingschromatografiestap. Mono-gepegyleerde » 80 (D11C) hPYY3_36 werd gescheiden van vrije PEG, niet-gemodi-ficeerd (D11C) hPYY3-36 en de verbindingen met hogere mole-cuulgewicht met gebruik van een chromatografiekolom met kationenwisselaar. Een typisch reactiemengsel van vertakt 5 20 kD mPEG-maleïmide (D11C) hPYÏ3-36 (10 mg eiwit), zoals hierboven beschreven, werd gescheiden over een SP-Sepharose Hitrap-kolom (5 ml) (Amersham Pharmacia Biotech, GE Healthcare), geëquilibreerd in 20 mM natriumacetaat met pH = 4,5 (buffer A) . Het reactiemengsel werd op de kolom 10 geladen bij een stroomsnelheid van 1,0 ml/min. De kolom werd gewassen met 4 kolomvolumina van buffer A bij een stroomsnelheid van 2,5 ml/min. Vervolgens werden de diverse (D11C) hPYY3_36-moleculen van de kolom geëlueerd in 25 kolomvolumina van een lineaire NaCl-gradiënt van 0-200 mM 15 bij een stroomsnelheid van 2,5 ml/min. Het eluens werd gevolgd met absorptie bij 280 nm (A2eo) en fracties van de juiste grootte werden verzameld. De fracties worden samengevoegd naar gelang van de mate van pegylering, zoals wordt vastgesteld met SEC-HPLC. Het gezuiverde samenge-20 voegde mengsel werd vervolgens geconcentreerd tot 0,5-5 mg/ml met gebruik van een Vivaspin 10K-concentrator (Vi-vascience Sartorius Group). De eiwitconcentratie van het gezuiverde samengevoegde mengsel werd bepaald door de absorptie bij 280 mM met een experimenteel bepaalde extinc-25 tiecoëfficiënt. Van het gezuiverde samengevoegde mengsel van 20 kD mPEG-maleïmide (D11C) hPYY3_3s werd met gebruik van SEC-HPLC of SDS-PAGE een profiel gemaakt.

Voorbeeld € 30 Biologische assays

De bruikbaarheid van de PYY-agonisten van de onderhavige uitvinding als farmaceutisch actieve middelen bij de vermindering van de gewichtstoename en de behandeling van obesitas bij zoogdieren (en in het bijzonder mensen) kan 35 worden aangetoond door de activiteit van de agonisten in gebruikelijke assays en in de in vitro en in vivo assays die hierna worden beschreven. Dergelijke assays voorzien eveneens in middelen waardoor de activiteiten van de on derhavige PYY-agonisten kunnen worden vergeleken met de activiteiten van bekende verbindingen.

81 5 Studies naar de hoeveelheid opgenomen voedsel

Assay van door vasten geïnduceerde hervoeding: Mannelijke C57BL/6J-muizen (the Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, VS) werden met zijn tweeën in een kooi gehuisvest. Ze werden onderworpen aan een cyclus van licht:donker van 12:12 10 (lichten aan om 05.00 uur; lichten uit om 17.00 uur) en kregen knaagdierenvoer in de vorm van pellets (RMH3000+ Purina; Research Diets, Ine., New Brunswick, NJ, VS) en water ad libitum. De muizen arriveerden op een leeftijd van 7-8 weken en men liet ze gedurende een minimale perio-15 de van 10 dagen acclimatiseren voordat de studie plaatsvond. Op de dag van de studie waren de muizen 9-12 weken oud. De dag voor het begin van de studie werden de muizen ondergebracht in kooien met een nieuwe onderlaag en zonder voedsel, maar ze kregen de vrije beschikking over water. 20 De nacht over (20-24 uur) werd voedsel onthouden. Op de dag van de studie kregen de muizen een i.p. injectie (volume, van de dosis = 5 ml/kg) toegediend, werden teruggebracht naar hun kooi en werd tevoren afgewogen voedsel onmiddellijk in de kooi geplaatst. Het gebruikte doserings-25 vehiculum was 20 mM Na-acetaat met pH = 4,5, 50 mM NaCl. De dosis werd berekend op de actieve PYY-entiteit zonder pegylering. De controle met vehiculum, het natieve PYY, 30 kD mPEG-maleïmide (E10C) hPYY3-36 en 43 kD mPEG-maleimide (E10C) hPYY3_36 werden getest in drie doses (0,1 mg/kg, 0,3 30 mg/kg en 1,0 mg/kg). Het voedsel werd 2, 4; 6 en 24 uur na het doseren opnieuw gewogen. De onderlaag werd gecontroleerd op gemorst voedsel, dat werd gewogen en in de berekeningen opgenomen. De cumulatieve hoeveelheid opgenomen voedsel werd berekend door aftrekken van het gewicht van 35 het voedsel op elk tijdstip van het begingewicht van het voedsel. Het percentage (%) remming werd berekend met (FI behandeling — flvehiculum)/flvehiculum X 100.

« 82

Figuur 10 toont de cumulatieve opanme van voedsel gedurende 6 uur na de i.p. injectie van de drie doses van het natieve PYY3-36 (figuur 10A) en het 30 kD mPEG-maleïmi-de (E10C) hPYY3_36 (figuur 10B) . Zowel het natieve PYY3-36 als 5 het 30 kD mPEG-maleïmide (E10C) hPYY3-36 lieten een dosisaf-hankelijke daling zien van de cumulatieve hoeveelheid opgenomen voedsel in de loop van 6 uur.

Het 43 kD mPEG-maleïmide(E10C)hPYY3_36 produceerde in 6 uur eveneens een dosisafhankelijke daling (figuur 11A) en 10 ook van de cumulatieve hoeveelheid opgenomen voedsel gedurende 24 uur (figuur 11B) . Het effect van het 43 kD mPEG-maleïmide (E10C) hPYY3-36 op het verminderen van een verlaging van de cumulatieve hoeveelheid opgenomen voedsel was echter niet zo groot als werd aangetoond voor het 30 kD 15 mPEG-maleïmide (E10C) hPYY3.36 bij dezelfde dosis (0,1 mg/kg) na zowel 6 uur als 24 uur.

De effecten van 30 kD mPEG-maleïmide (E10C) hPYY3_36 op de door vasten geïnduceerde hervoeding na injectie van 0,1 mg/kg s.c. werden ook vergeleken met de effecten van 30 kD 20 maleïmide (D11C) hPYY3-36. Hoewel het 30 kD mPEG-maleïmide-(DllC)hPYY3-36-polypeptide een vermindering van de cumulatieve hoeveelheid opgenomen voedsel (food intake; FI) in de loop van 24 uur veroorzaakte, zoals wordt getoond in de onderstaande tabel, was het effect niet zo groot als werd 25 waargenomen voor het 30 kD maleïmide (E10C)hPYY3.36.

Behan- 2 uur t Ver- 4 uur % Ver- 6 uur % Ver- 24 uur 4 Verdeling FI ande- FI ande- FI ande- Fi ande- rinq ring ring ring

Vehi- Gemid- 2,03 0,00 2,93 0,00 4,06 0,00 10,79 0,00 culum deld SEM 0,16 β, 06 0,22 7,46 0,46 11,30 0, 67 6,23 E10C Gemid- 1,09 -6,99 2,16 -26,21 2,45 -39,62 8,04 -25,48 deld SEM 0,27 13,45 0,27 9,09 0,26 6,33 0,88 8,14

Dl1C Gemid- 2,14 5,22 2,56 -12,56 3,09 -24,02 9,08 -15,88 deld SEM 0,15 7,30 0,23 7,72 0,27 6,68 0,42 3,88 * 83

De effecten van lineair 20 kD mPEG-maleïmide (E10C) hPYY3-36 werden vergeleken met 30 kD mPEG-maleïmide (ElOC)hPYY (beide van voorbeeld 1). In een studie waarin een dosis van 0,1 mg/kg (i.p.) werd geïnjecteerd in manne-5 lijke muizen, zijn de resultaten als volgt in de onderstaande tabel.

% verandering in cumulatieve hoeveelheid opgenomen voedsel _vs behandeling met vehiculum_

Behandeling 2 uur FI 4 uur FI 6 uur FI 24 uur FI 48 uur FI

30kD E10C__-56__-65__^TQ__-47__-20 20kD E10C__-65__-73__-79__-36__-17 10

Evenzo zijn in een tweede studie waarin de voedings-effecten van lineiar 20 kD mPEG-maleïmide (E10C)hPYY3_3$ en 30 kD mPEG-maleïmide (E10C) hPYY3_36 na een dosis van 0,1 mg/kg (s.c.) worden verkregen de resultaten als volgt in 15 de onderstaande tabel.

% verandering in cumulatieve hoeveelheid opgenomenvoedsel _vs behandeling met vehiculum_

Behandeling 2 uur FI 4 uur FI 6 uur FI 24 uur FI 48 uur FI 72 uur FI

30kD E10C__-13__-24__-29__-20__-12__-2 20kD E10C__-45__-55__-58__-28__-14__-5 20 De concentraties van PYY in het plasma na s.c. injectie _waren als volgt_

Behandeling 2 uur 4 uur 6 uur 24 uur 30 uur 48 uur 30kD E10C 151158 204148 308+29 139±27 79+14__40±6 20kD E10C 110+21 186137 204±14 62±16 45±12__13+3

Assay van de hoeveelheid spontaan opgenomen voedsel:

Mannelijke C57 BL/6J-muizen (the Jackson Laboratory) wer-25 den afzonderlijk gehuisvest en men stond voor de studie een acclimatisatie van ten minste twee weken toe. Ze werden onderworpenaan een cyclus van licht:donker van 2:12, kregen gepoederde kost ad libitum gevoerd en hadden boven- Λ 84 dien de vrije beschikkingtot water. Op de dag voor de toediening werden de muizen voedelopnamekamers geplaatst en hoeveelheid voedsel geplaatst en stond men acclimatisatie van een dag toe. De volgende dag werden de muizen gedo-5 seerd met i.p. of subcutane (s.c.) injectie juist voor de lichten uitgingen (16.00 uur). De hoeveelheid opgenomen voedsel werd automatisch gevolgd met tussenpozen van 10 minuten gedurende het gehele tijdsverloop en de lichaamsgewichten werden dagelijks gemeten. De resultaten worden 10 getoond voor i.p. injectie van natief PYY3-36 en het 30 kD mPEG-maleïmide (E10C) hPYY3_36 (figuur 12) en voor s.c. injectie van natief PYY3.36 en het 30 kD mPEG-maleimide (E10C) hPYY3-36 (figuur 13). Hoewel zowel het natieve PYY3-36 als het 30 kD mPEG-maleïmide (E10C) hPYY3_36 een onmiddel-15 lijke vermindering van in de cumulatieve hoeveelheid opgenomen voedsel teweegbrachten in vergelijking met muizen die met vehiculum waren behandeld, was het effect van de verminderde hoeveelheid opgenomen voedsel dat door het 30 kD mPEG-maleïmide (E10C) hPYY3-36 was veroorzaakt van veel 20 langere duur dan het effect dat door het natieve PYY3_3e werd veroorzaakt. Gekoppeld aan een langduriger effect op de hoeveelheid opgenomen voedsel liet het 30 kD mPEG-maleïmide (E10C) hPYY3_36 ook een langdurige plasmablootstel-ling zien na de enkele injectie (0,1 mg/kg i.p.) (figuur 25 14) . Terwijl het natieve PYY3_36 een klaringssnelheid van 16 ml/min/kg en een C^v van 38 nM had, had het 30 kD mPEG-maleïmide (E10C) hPYY3_36 een klaringssnelheid van 0,2 ml/min/kg en een Cmax van 267 nM. De PYY-waarden in plasma werden in muizen gemeten met gebruik van een hPYY-radio-30 immunoassay kit (Linco Research, Ine., St. Louis, MO, VS).

In een aparte studie met 12 kD mPEG-maleïmide (E10C)hPYY3-36, waarin de muizen dagelijks gedurende 4 dagen deze PYY-agonist werd toegediend (s.c.), vertoonden de muizen een dosisafhankelijke afname van de cumulatieve 35 hoeveelheid opgenomen voedsel die gedurende het verloop van de vierdaagse studie gehandhaafd bleef, alsook een daling van het lichaamsgewicht ten opzichte van de basis- 85 «· lijn. Alle waarden werden 24 uur na dosering en juist voorafgaand aan de volgende dosering geregistreerd.

% Verandering in cumulatieve hoeveelheid opgenomen voedsel 5 ten opzichte van met vehiculum behandelde groep (gemiddeld __ ± SEM) __

Behandeling__Dosis 1__Dosis 2__Dosis 3__Dosis 4 12kD mPEG-PYY3- -3,5 ± 2,3 3,1 + 5,0 2,4 ± 3,8 -1,2 ± 2,2 36 bij 0,1 mg/kg_____ 12kD mPEG-PYY3- -29,5 ±4,6 -14,4 +4,6 -10,1 ±5,1 -14,6 ±3,9 36 bij 0,3 mg/kg_____ % Verandering in lichaamsgewicht ten opzichte van li- ___chaamsgewicht van basislijn (gemiddeld ± SEM)_

Behandeling Dosis 1__Dosis 2__Dosis 3__Dosis 4

Vehiculum__2,3 ± 0,5 0,7 ± 0,7 -1,0 ± 0,6 -0,4 ± 0,3 12kD mPEG-PYY3- 0,0 ± 0,7 -0,9 ± 0,8 -2,6 ±1,7 -2,1 ± 1,3 36 bij 0,1 mg/kg_____ 12kD mPEG-PYY3- -1,6 ±1,0 -0,9 ± 1,2 -1,2 ±1,5 -3,0 ± 1,3 36 bij 0,3 mg/kg______ 10

Concentraties in het plasma (ng/ml) van PEG-peptide 16-18 _uur na dosering (gemiddeld ± SEM)_

Behandeling__Dosis 1__Dosis 2__Dosis 3__Dosis 4 12kD mPEG-PYY3- 9,3 ± 0,8 9,1 ± 1,1 10,4± 0,6 9,9 ± 1,0 36 bij 0,1 mg/kg _____ 12kD mPEG-PYY3- 12,2 ± 1,3 14,0 ± 1,3 12,8 ± 0,5 14,0 ± 0,7 36 bij 0,3 mg/kg______

In een model voor muizen met door een dieet geïndu-15 ceerde obesitas (diet-induced obesity; DIO) kregen de muizen in plaats van de standaardlaboratoriumkost nu een vetrijk dieet (TestDiet®, Richmond, IN, VS; "van Heek series"; DIO gezuiverd knaagdierdieet met 45% energie uit vetten; Cat. No. # 58V8) gedurende 15 weken voorafgaand 20 aan het begin van de voedingsstudie. De muizen werden dagelijks gedoseerd (s.c.), 30-60 minuten voordat de lichten uit gingen, van 12 kD mPEG-male'imide (E10C)hPYY3_36. De lichaamsgewichten en de gewichten van het voedsel werden 24 i 86 uur na toediening en juist voorafgaand aan de volgende toediening geregistreerd.

% verandering in cumulatieve hoeveelheid opgenomen voedsel 5 ten opzichte van behandeling met vehiculum (gemiddeld: al- _le waarden p < 0,01)_

Behandeling__Dosis 1__Dosis 2__Dosis 3__Dosis 4 12kD mPEG-PYY3-36 -22,7 ± 6,7 -22,7 ± 6,3 -22,7 ± 5,7 -20,2 ± 5,2 bij 0,1 mg/kg_____ 12kD mPEG-PYY3-36 -44,7 ± 3,2 -41,1 ± 2,8 -36,4 ± 2,5 -30,1 ± 3,0 bij 0, 3 mg/kg____ % Verandering in lichaamsgewicht ten opzichte van basislijn (gemiddeld: alle werden van 12kD mPEG p<0,01) io ___i___

Behandeling__Dosis 1__Dosis 2__Dosis 3__Dosis 4 12kD mPEG-PYY3-36 -1,0 ± 0,4 -2,0 ± 0,7 -2,9 ± 0,8 -3,3 ± 0,7 bij 0,1 mg/kg____ 12kD mPEG-PYY3-36 -3,0 ± 0,4 -4, ± 0,53 -5,1 ± 0,5 -5,1 ± 0,6 bij 0,3 mg/kg_____ vehiculum__0,6 ± 0,4 -0,3 i 0,4 -0,4 ± 0,6 -0,7 i 0,5

Mini-pomp-assay met ob/ob-muizen: Mannelijke ob/ob- muizen (The Jackson Laboratory) met een leeftijd van 8-9 weken (n = 26) kregen normaal voer en er werden 14-daagse 15 osmotische mini-pompen (Alza Corp., Mountain Vieuw, CA, VS) geïmplanteerd die vehiculum (zoutoplossing), PYY3-36 (0,1 mg/kg/dag) of 30 kD mPEG-maleïmide (E10C) hPYY3_36 (0,03 mg/kg/dag) toedienden. De gewichten van het voedsel en de lichaamsgewichten werden dagelijks gemeten. De samenstel-20 ling van het lichaamsvet werd bepaald op dag 0 en dag 13. Aan het eind van de studie werden bloedmonsters genomen. Er waren voor deze groepen geen verschillen van betekenis voor wat betreft in de hoeveelheid opgenomen voedsel, het lichaamsgewicht of de samenstelling van het lichaamsvet. 25 Plasma-PYY werd bepaald na beëindiging van de studie; hiervoor werd de eerder beschreven radio-immunoassay gebruikt. In de met natieve PYY3.36 behandelde groep waren de plasma-PYY-spiegels na meting 15 ± 2 mg/ml; bij de met 30 t 87 kD mPEG-maleïmide (E10C) hPYY3_36 behandelde groep waren de plasma-PYY-spiegels 132 ± 22 ng/ml.

Ia vitro bindingsstudies 5 SPA voor ligandbinding:

De SPA voor ligandbinding meet de concurrerende verdringing van van een radiolabel voorzien PYY van Y2R-re-ceptoren en maakt gebruik van microbollen die een scintil-latieverbinding (SPA-parels) bevatten en bekleed zijn met 10 lectine-tarwekiemagglutinine (WGA). Deze werden verkregen bij Amersham Biosciences (Cat. No. RPNQ 0085). Suspensies van menselijke neuroblastoom KAN-TS-cellen die Y2-recepto-ren op hun oppervlak tot expressie brengen (Fuhlendorf et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 182-186, 1990) werden 15 bereid met gebruik van een buffer voor het oogsten van cellen bestaande uit 50 mM Hepes-buffer (pH = 7,4), 145 mM NaCl, 2,5 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM glucose, 0,1% BSA, 5% DMSO en Roche-proteaseremmers. De SPA-assays werden in drievoud uitgevoerd in platen met 96 putjes met gebruik 20 van 50.000 cellen/putje, 125I-PYY (40.000 cpm/putje) en SPA-parels (0,5 mg/putje) in assaybuffer bestaande uit 50 mM Hepes-buffer met pH = 7,4, 1 mM MgCl2, 2,5 mM CaCl2, 0,1% (gew./vol.) BSA, 0,025% (gew./vol.) bacitracine en 0,025% natriumazide. De testliganden werden in diverse 25 concentraties (0,032 tot 500 nM) aan het assaymengsel toegevoegd, dat vervolgens gedurende 16-24 uur bij kamertemperatuur werd geïncubeerd onder schudden. Men liet de platen gedurende 1 uur staan en de platen werden vervolgens geteld met gebruik van een MicroBeta® Trilux-detector 30 (Perkin Elmer, Boston, MA, VS) . De resultaten voor hPYY3-36 en 30 kD mPEG-maleïmide (El0C) hPYY3_36 van voorbeeld 1 worden getoond in figuur 15.

6TPy[35S] -bindingsassay aan NPY Y2R-receptoren 35 De functionele assay is een GTPy[35S] -bindingsassay die wordt uitgevoerd in NEN Flashplates (plaat met 96 putjes) . De membranen werden bereid uit KAN-TS-celllen als 88 beschreven door Bass et al., Mol. Pharm., 50: 709-715, 1990. De GTPy [35S]-bindingassays werden in tweevoud uitgevoerd in een FlashPlate”* met 96 putjes met gebruik van 100 pM GTPy [35S] en 10 pg membraan per putje in assaybuffer 5 bestaande uit 50 mM Tris-HCl met pH = 7,4, 3 mM MgCl2 met pH = 7,4, 10 mM MgCl2, 20 mM EGTA, 100 mM NaCl, 5 pM GDP, 0,1% runderserumalbumine en de volgende proteaseremmers: 100 pg/ml bacitracine, 100 pg/ml benzamidine, 5 pg/ml aprotinine, 5 pg/ml leupeptine. Het assaymengsel werd ver-10 volgens gedurende 60 minuten bij 30°C geïncubeerd met toenemende concentraties van de testverbinding (concentratie-kromme met 6 punten; logaritmische verdunningen in het traject van 10"12 M tot 10“5 M) . De FlashPlates™ werden vervolgens gedurende 10 minuten gecentrifugeerd bij 2000x g. 15 Stimulering van GTPy[35S]-binding werd vervolgens gemeten met gebruik van een Microbeta™-detector. De EC50-waarden en de intrinsieke activiteit werden berekend met gebruik van Prism van Graphpad. De resultaten voor hPYY3_36 en 30 kD mPEG-maleïmide (E10C) hPYY3_36 van voorbeeld 1 worden ge-20 toond in figuur 16. De ECso-waarden voor het 30 kD mPEG-maleïmide (ElOC) hPYY3_36 en het 20 kD mPEG-maleïmide (E10C)hPYY3_36 van voorbeeld 1 waren vergelijkbaar (bijv.

4,3 nM en 4,6 nM wanneer in dezelfde assay werd gemeten).

%

SEQUENCE LISTING

<110> PFIZER PRODUCTS INC

Nardone, Nancy A.

Finn, Rory F.

Siegel, Ned R.

<120> PYY AGONISTS AND USES THEREOF

<130> PC32768C

<150> PCT/IB2006/000270 <151> 2006-01-30 <150> Taiwan 95103474 <151> 2006-01-27 <160> 8 <170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211> 36

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 1

Tyr Pro He Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu 15 10 15

Leu Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr 20 25 30

Arg Gin Arg Tyr 35 <210> 2 <211> 34

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 2 lie Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 15 10 15

Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gin 20 25 30

Arg Tyr <210> 3

V

2 <211> 34

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 3 lie Lys Pro Glu Ala Pro Gly Cys Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 15 10 15

Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gin 20 25 30

Arg Tyr <210> 4 <211> 34

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 4 lie Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Cys Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 15 10 15

Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gin 20 25 30

Arg Tyr <210> 5 <211> 102 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 atcaaacccg aggctcccgg otgtgacgcc tcgccggagg agctgaaccg ctactacgcc 60 tccctgcgcc actacctcaa cctggtcacc cggcagcggt at 102 <210> 6 <211> 102 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 atcaaacccg aggctcccgg ctgcgaogcc tcgccggagg agctgaaccg ctactacgcc 60 tccctgcgcc actacctcaa cctggtcacc cggcagcggt at 102 <210> 7 3 <211> 102 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 atcaaacccg aggctcccgg cgaatgtgcc tcgccggagg agctgaaccg ctactacgcc 60 tccctgcgcc actacctcaa cctggtcacc cggcagcggt at 102 <210> 8 <211> 102 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 atcaaacccg aggctcccgg cgaatgcgcc tcgccggagg agctgaaccg ctactacgcc 60 tccctgcgcc actacctcaa cctggtcacc cggcagcggt at 102 1032266 t V, ch3(och2ch2)iicx:h2ch2CH2nhc(0)ch2CH2n o 4 1032266

Claims

1. Conjugaat omvattende een methoxypolyethyleenglycol (mPEG) en het polypeptide (E10C)I1PYY3-36 met de aminozuur-sequentie IKPEAPGCDASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRY-NH2 [SEQ ID

2. Conjugaat volgens conclusie 1, waarin de {OCH2CH2) n-rest een gewichtsgemiddeld molecuulgewicht van ongeveer 12 kD heeft.

3. Farmaceutisch preparaat omvattende het conjugaat volgens conclusie 1 of 2 of een farmaceutisch aanvaardbaar zout daarvan en een farmaceutisch aanvaardbar drager.

4. Farmaceutisch preparaat volgens conclusie 3, dat 25 bovendien een tweede middel omvat dat een middel tegen obesitas is. 1032268 t 90

5. Werkwijze voor het behandelen van obesitas of een aandoening van het hebben van overgewicht bij een zoogdier dat daaraan behoefte heeft, welke werkwijze het perifeer toedienen aan het zoogdier van een therapeutisch effectie- 5 ve hoeveelheid van het conjugaat volgens conclusie 1 of 2 of een farmaceutisch aanvaardbaar zout daarvan omvat.

5 NO: 3], waarbij het conjugaat de formule 4 CH3(0CH2CH2)n0CH2CH2CH2NHC(0)CH2CH2N o 4 10 heeft, waarin de mPEG lineair is, n een geheel getal in het traject van ongeveer 250-295 is en -SR het polypeptide (E10C)hPYY3-36 is, waarin S het zwavelatoom van de thiol-groep van cysteine is. 15

6. Werkwijze voor het remmen van gewichtstoename, het verminderen van de hoeveelheid opgenomen voedsel of het 10 verminderen van de ca lor ie-opname in een zoogdier dat daaraan behoefte heeft, welke werkwijze het perifeer toedienen aan het zoogdier van een therapeutisch effectieve hoeveelheid van het conjugaat volgens conclusie 1 of 2 of een farmaceutisch aanvaardbaar zout daarvan omvat. 15

7. Werkwijze volgens conclusie 5 of 6, waarbij het conjugaat of het zout wordt toegediend in combinatie met een tweede middel dat een middel tegen obesitas is.

8. Gebruik van het conjugaat volgens conclusie 1 of 2 of een farmaceutisch aanvaardbaar zout daarvan bij de vervaardiging van een geneesmiddel voor het behandelen van obesitas of een aandoening van het hebben van overgewicht in een zoogdier dat daaraan behoefte heeft of voor het 25 verminderen van gewichtstoename, het verminderen van de hoeveelheid opgenomen voedsel of het verminderen van calo-rie-opname in een zoogdier dat daaraan behoefte heeft.

9. Conjugaat omvattende een mPEG en het polypeptide 30 (E10C) hPYY3_36 met de aminozuursequentie IKPEAPGCDASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRY-NH2 [SEQ ID NO: 3], waarbij het conjugaat de formule 4 * 91 >s CH}(0CH2CH2)n0CH2CH2CH2NHC(0)CH2CH2 N o 4 heeft, 5 waarin de mPEG lineair is, n een geheel getal in het traject van ongeveer 90-135 is en -SR het polypeptide (E10C)hPYY3_36 is, waarin S het zwavelatoom van de thiol-groep van cysteine is.

10. Conjugaat volgens conclusie 9, waarin de (OCH2CH2)n-rest een gewichtsgemiddeld molecuulgewicht van ongeveer 5 kD heeft.

11. Farmaceutisch preparaat omvattende het conjugaat 15 volgens conclusie 9 of 10 of een farmaceutisch aanvaardbaar zout daarvan en een farmaceutisch aanvaardbare drager.

12. Farmaceutisch preparaat volgens conclusie 12 dat 20 bovendien een tweede middel omvat dat een middel tegen obesitas is.

13. Werkwijze voor het behandelen van obesitas of een aandoening van het hebben van overgewicht in een zoogdier 25 dat daaraan behoefte heeft, welke werkwijze het perifeer toedienen aan het zoogdier van een therapeutisch effectieve hoeveelheid van het conjugaat volgens conclusie 9 of 10 of een farmaceutisch aanvaardbaar zout daarvan omvat.

14. Werkwijze voor het remmen van gewichtstoename, het verminderen van de hoeveelheid opgenomen voedsel of verminderen van de calorie-opname in een zoogdier dat t 92 daaraan behoefte heeft, welke werkwijze het perifeer toedienen aan het zoogdier van een therapeutisch effectieve hoeveelheid van het conjugaat volgens conclusie 9 of 10 of een farmaceutisch aanvaardbaar zout daarvan omvat. 5

15. Werkwijze volgens conclusie 13 of 14, waarbij het conjugaat of het zout wordt toegediend in combinatie met een tweede middel dat een middel tegen obesitas is.

16. Gebruik van het conjugaat volgens conclusie 9 of 10 of een farmaceutisch aanvaardbaar zout daarvan bij de vervaardiging van een geneesmiddel voor het behandelen van obesitas of een aandoening van het hebben van overgewicht in een zoogdier dat daaraan behoefte heeft of verminderen 15 van gewichtstoename, het verminderen van de hoeveelheid opgenomen voedsel of het verminderen van de hoeveelheid calorie-opname in een zoogdier dat daaraan behoefte heeft. 1032266