EA004791B1

EA004791B1 - Композиции на основе слитого белка ob и способы их применения

Info

Publication number: EA004791B1
Application number: EA200100216A
Authority: EA
Inventors: Майкл Бенджамин Мэнн; Рэнди Айра Хект
Original assignee: Амген Инк.
Priority date: 1996-12-20
Filing date: 1997-12-11
Publication date: 2004-08-26
Also published as: NZ514145A; AR059907A2; NO992779L; NO324506B1; DE69737266D1; YU27999A; JP2001512417A; JP4659068B2; IL130396A0; BG64288B1; CZ9902036A3; NO992779D0; DK0954588T3; ES2280083T3; EP0954588B1; EA004790B1; CN1195858C; PT954588E; SK77499A3; ATE351910T1

Abstract

Настоящее изобретение относится к композициям слитого белка Fc-OB, способам получения таких композиций и их применению. В частности, настоящее изобретение относится к генетически или химически слитому белку, состоящему из Fc района иммуноглобулина, его производного или аналога, слитого с N-терминальной областью белка ОВ, его производного или аналога.

Description

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к композициям слитого белка Ес-ОВ, способам получения таких композиций и их применения.

Уровень техники

При том, что молекулярные основы ожирения в значительной мере остаются неизвестными, идентификация гена ОВ и кодируемого им белка (белок ОВ или лептин) пролила свет на механизм, регулирующий отложение жира в организме. См. публикацию РСТ XVО 96/05309 (12/22/96), Епебтап е! а1.; Ζ1ιαη§ е! а1., На1иге 372: 425-432 (1994); см. также ТНе Согтес!юп а! Ма1ите 374: 479 (1995). Белок ОВ активен ίη νίνο как у мутантных мышей оЬ/оЬ (мыши, ожиревшие в силу дефекта образования продукта гена ОВ), так и у нормальных мышей дикого типа. Биологическая активность проявляется, помимо прочего, в снижении веса. См. Ватпада, ОЬеое Рто!еш 811т М1се. 8с1епсе 269: 275-456 (1995). Белок ОВ, его производные и применение их в качестве модуляторов для контроля веса и ожирения у животных, включая млекопитающих и человека, были описаны более подробно в публикации РСТ νθ 96/05309 (12/22/96).

Другие биологические эффекты белка ОВ охарактеризованы слабо. Известно, например, что у мутантных мышей оЬ/оЬ введение белка ОВ приводит к снижению уровней инсулина и глюкозы в сыворотке. Известно также, что введение белка ОВ приводит к снижению количества жира в организме. Это наблюдалось как на мутантных мышах оЬ/оЬ, так и на неожиревших нормальных мышах. Ре11еушоип!ег е! а1., 8с1епсе 269: 540-543 (1995); На11ао е! а1., 8с1епсе 269: 543-546 (1995). См. также Сашрйе1б е! а1., 8аепсе 269: 546-549 (1995) (Периферическое и центральное введение микрограммовых доз белка ОВ снижало потребление пищи и веса тела у мышей оЬ/оЬ и мышей, ожиревших от специальной диеты, но не у ожиревших мышей бЬ/бЬ.). Ни в одной из этих работ не отмечено токсичности, даже при наивысших дозах.

Несмотря на перспективы клинического применения белка ОВ, способ действия белка ОВ ίη νί\Ό не выяснен до конца. Что касается рецептора ОВ, то высокая аффинность связывания белка ОВ, характерная для гипоталамуса крыс, указывает на локализацию рецептора ОВ. 8!ерйепо е! а1., №11иге 377: 530-532. Для мышей 6Ь/6Ь характерен тот же фенотип, что и для мышей оЬ/оЬ, т.е. крайнее ожирение и диабет типа II; считается, что данный фенотип обусловлен дефектным рецептором ОВ, особенно потому, что мыши 6Ь/6Ь не отвечают на введение белка ОВ. См. 8!ерйепо е! а1., оирта.

С прогрессом технологий рекомбинантных ДНК доступность для терапевтического применения рекомбинантных белков обусловила успехи в химической модификации белков и в создании новых фармацевтических форм бел ков. Одной из целей таких модификаций является защита белка и снижение деградации. Слитые белки и химические присоединения могут эффективно предотвращать физический контакт протеолитических ферментов с собственно белковым скелетом, предотвращая тем самым деградацию белка. К дополнительным преимуществам при определенных условиях относятся повышение стабильности, времени циркулирования и биологической активности терапевтического белка. Обзорная статья, посвященная слитым белкам и модификациям белков: Етапо15, Еосио Оп Ого\\Й1 Еас!ого 3: 4-10 (Мау 1992) (опубликовано Меб15сйр!, МоипМете Соий, Епегп Вагпе! Йапе, Ьопбоп N20, ОБЭ, ИК).

Одной из таких модификаций предусматривается использование Ес-района иммуноглобулинов. Антитела состоят из двух функционально независимых частей: вариабельного домена, известного как ЕаЬ, который связывает антиген, и константного домена, известного как Рс, который обеспечивает связь с такими эффекторами, как комплемент или фагоциты. Есрайон иммуноглобулинов имеет продолжительный срок полужизни в плазме, а ЕаЬ - короткоживущ. Сароп, е! а1., №11иге 337: 525-531 (1989).

Были сконструированы продукты терапевтических белков с использованием Ес-домена с тем, чтобы обеспечить более продолжительный срок полужизни или ввести такие функции, как связывание с Ес-рецептором, связывание с Абелком, фиксация комплемента и перенос через плаценту, которые обусловлены Ес-доменом иммуноглобулинов. Например, Ес-район антитела 1дС1 был слит с Ν-терминальным фрагментом СЭ30-Й. молекулы, которая связывает рецепторы С.'Э30. экспрессирующиеся на клетках лимфомы Ходжкина, анапластических лимфомных клетках, Т-клеточных лейкозных клетках и злокачественных опухолевых клетках других типов. См. патент США № 5,480,981. Интерлейкин 10 (1Й-10), агент, подавляющий отторжение пересаженных органов и антивоспалительный агент, был слит с мышиным Есу2а для увеличения исходно непродолжительного времени циркуляции цитокина. Ζΐκπβ, X. е! а1., Тйе 1оитпа1 о£ 1шшипо1оду, 154: 5590-5600 (1995). Проведены также исследования, направленные на оценку применения рецептора фактора некроза опухолей, соединенного с Ес белком 1дС1 человека, для лечения больных с септическим шоком. Е15йет, С. е! а1., Ν. Епд1. I. Меб., 324: 1697-1702 (1996); Уап Ζее, К. е! а1., Тйе 1оитпа1 о£ 1шшипо1оду, 156: 2221-2230 (1996). Ес был также слит с рецептором СЭ4 для получения терапевтического белка для лечения СПИДа. См. Сароп, е! а1., №11иге 337: 525-531 (1989). Кроме того, Ν-терминальный фрагмент интерлейкина 2 также был слит с Ес фрагментом 1дС1 или 1дС3 для того, чтобы преодолеть короткий срок полужизни интерлейкина 2 и его общую токсич3 ность. См. НагуШ с1 а1., 1ттипо1сс11по1оду. 1: 95-105 (1995).

Поскольку белок ОВ был идентифицирован как многообещающий терапевтический белок, имеется потребность в разработке композиций аналогов ОВ для клинического применения в сочетании с введением белка ОВ или же в качестве альтернативы такому введению. Результатом таких разработок должны быть такие композиции аналогов ОВ, в которых благодаря химическим модификациям и соответствующим фармацевтическим формам достигается снижение деградации белка, повышены стабильность и время циркуляции. В настоящем изобретении заявлены такие композиции.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение относится к композициям слитого белка Рс-ОВ, способам получения таких композиций и их применения. В частности, настоящее изобретение относится к генетически слитому белку, состоящему из Рсрайона (или аналогов) иммуноглобулинов, слитого с Ν-терминальной областью белка ОВ или его аналогов. Слитый белок Рс-ОВ способен к димеризации посредством цистеиновых остатков Рс-района. Неожиданно модификации по генетическому слиянию Рс-района с Ν-концом белка ОВ обладали преимуществами в отношении стабильности, скорости выведения (клиренса) и пониженной деградации, которые не наблюдаются у белка ОВ или у слитого белка Рсрайона с С-концом белка ОВ. Удивительно и важно, что Ν-терминальная модификация обеспечивает неожиданную защиту белка от деградации, повышает время циркулирования и стабильность по сравнению с белком ОВ или Рсмодификацией С-конца белка ОВ. Такие неожиданные преимущества Рс-модификаций белка ОВ будут важны для потребителей белка ОВ, поскольку подобные изменения обусловливают потребность в более низких дозах или более редких введениях. Таким образом, как описано далее более подробно, настоящее изобретение отличается рядом аспектов, относящихся к генетической модификации белков посредством слияния Рс-района с белком ОВ (или его аналогом), а также к специфическим модификациям, препаратам и способам их применения.

Соответственно, в качестве одного из аспектов настоящего изобретения заявлен слитый белок Рс-ОВ, отличающийся тем, что Рс генетически слит с Ν-концом белка ОВ (или его аналога). Кроме того, фрагмент Рс может быть соединен с Ν-концом белка ОВ (или его аналога) посредством пептида или химических линкеров, известных из уровня техники. Как отмечалось выше и будет более подробно описано далее, слитый белок Рс-ОВ неожиданно оказался более защищенным от деградации, что привело к повышению времени циркулирования и стабильности по сравнению с белком ОВ или Рсмодификацией С-конца белка ОВ. Таким обра зом, дополнительным аспектом настоящего изобретения являются не только композиции на основе слитого белка Рс-ОВ, но и последовательности ДНК, кодирующие такие белки, соответствующие векторы и клетки-хозяева, содержащие такие векторы, применяемые для получения слитых белков согласно настоящему изобретению.

В качестве другого аспекта в настоящем изобретении заявлены способы получения слитого белка Рс-ОВ. К этим способам относятся технологии рекомбинантных ДНК, использумые для получения рекомбинантных белков. Кроме того, данный аспект также включает способы ферментации и очистки.

В качестве другого аспекта в настоящем изобретении заявлены способы устранения избыточного веса у больного или животных, включая модуляцию жировых отложений введением слитых белков Рс-ОВ. С учетом характеристик слитого белка Рс-ОВ, рассматриваются способы снижения количества и/или частоты введения белка ОВ путем введения слитых белков Рс-ОВ.

В качестве другого аспекта в настоящем изобретении заявлены терапевтические способы для лечения заболеваний, сопутствующих избыточному накоплению жира, таких как диабет, дис- и гиперлипидемии, атеросклероз, артериальные бляшки, а также для предотвращения образования или снижения вероятности образования желчных камней, повышения чувствительности к инсулину и/или увеличения мышечной массы.

В качестве другого аспекта в настоящем изобретении заявлены соответствующие фармацевтические композиции белков Рс-ОВ, их аналогов и производных, применяемые для такой терапии.

Краткое описание фигур

Фиг. 1 - Рекомбинантная мышиная (двухцепочечная) ДНК теЮВ (8ΕΟ.ΙΩ. Νοκ.1 и 2) и аминокислотная последовательность (8ΕΟ.ΙΩ. Νο.3).

Фиг. 2 - Рекомбинантная человеческая (двухцепочечная) ДНК аналога те!ОВ (8ΕΟ.ΙΩ. Νοκ.4 и 5) и аминокислотная последовательность (δΕρ.ΙΌ. Νο.6).

Фиг. 3 (А-С) - Рекомбинантная человеческая (двухцепочечная) ДНК те1Ес-ОВ (8ΕΟ.ΙΩ. Νοκ.7 и 8) и аминокислотная последовательность (δΕρ.ΙΌ. Νο.9).

Фиг. 4 (А-С) - Рекомбинантная человеческая (двухцепочечная) ДНК варианта те!Рс-ОВ (δΕρ.ΙΏ. Νοκ.10 и 11) и аминокислотная последовательность (8ΕΟ.ΙΩ. Νο.12).

Фиг. 5 (А-С) - Рекомбинантная человеческая (двухцепочечная) ДНК варианта те!Рс-ОВ (δΕρ.ΙΏ. Νοκ.13 и 14) и аминокислотная последовательность (8ΕΟ.ΙΩ. Νο.15).

Фиг. 6 (А-С) - Рекомбинантная человеческая (двухцепочечная) ДНК варианта те!Рс-ОВ (δΕρ.ΙΌ. N08.16 и 17) и аминокислотная последовательность (δΕρ.ΙΌ. Νο.18).

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к композициям слитого белка Рс-ОВ, способам получения таких композиций и их применения. В частности, настоящее изобретение относится к генетически или химически слитому белку, состоящему из Рс-района иммуноглобулинов и Νтерминальной области белка ОВ. Неожиданно слияние Рс-района с Ν-концом белка ОВ привело к таким преимуществам, которых лишены белок ОВ или слитые белки Рс-района с Сконцом белка ОВ. Удивительно, но Νтерминальная модификация белка Рс-ОВ обеспечивает неожиданную защиту белка от деградации, повышает время циркулирования и стабильность. Соответственно, слитой белок РсОВ, его аналоги и производные, а также способы их получения и применения описаны далее более подробно.

Композиции

Рс-последовательность в последовательности рекомбинантного белка Рс-ОВ человека, приведенная в 8Ε0.ΙΩ. Νο.9 (см фиг. 3), может быть выбрана из тяжелой цепи иммуноглобулина ΙβΟ-1 человека, см. Ε11ΐ8οη, ЕМ. с1 а1., №.1с1ею Лс1б8 К.е8. 10: 4071-4079 (1982), или любой другой последовательности Рс, известной из уровня техники (например, других классов 1дО, к которым относятся (без ограничения перечисленными), ΙβΟ-2. ΙβΟ-3 и ΙβΟ-4. или других иммуноглобулинов). Могут быть сконструированы варианты, аналоги или производные Рс-компонента, например, производством различных замен остатков или последовательностей.

Остатки цистеина можно делетировать или заменить другими аминокислотами для предотвращения образования дисульфидных связей Рс-последовательностей. В частности, аминокислота в положении 5 8Ε0.ΙΩ. Νο.9 является цистеиновым остатком. Последовательность рекомбинантного Рс-ОВ, 8Ε0.ΙΩ. Νο.9, состоит из 378 аминокислот (не считая остатка метионина). Первая аминокислота в последовательности рекомбинантного белка Рс-ОВ на фиг. 3 обозначается как +1 с метионином в положении -1.

Можно удалить остаток цистеина в положении 5 или заменить одной или несколькими аминокислотами. Остаток аланина можно заменить остатком цистеина в положении 6 с получением вариантной аминокислотной последовательности, приведенной на фиг. 4 (8Ε0.ΙΩ. Νο.12). Рекомбинантный белок Рс-ОВ, приведенный на фиг. 4, состоит из 378 аминокислот (не считая остатка метионина). Первая аминокислота в последовательности рекомбинантного белка Рс-ОВ на фиг. 4 обозначается как +1 с метионином в положении -1.

Аналогично, цистеин в положении 5 последовательности 8Ε0.ΙΩ. Νο.9 может быть заменен серином или другим аминокислотным остатком или же делетирован. Можно получить вариант или аналог путем делеции аминокислот в положениях 1, 2, 3, 4 и 5, как в варианте 8Ер.Ш. Νο.15 (см фиг. 5). Замены, произведенные по этим положениям, также входят в объем настоящего изобретения. Рекомбинантный белок Рс-ОВ, приведенный на фиг. 5, состоит из 373 аминокислот (не считая остатка метионина). Первая аминокислота в последовательности рекомбинантного белка Рс-ОВ на фиг. 5 обозначается как +1 с метионином в положении -1.

Могут быть произведены модификации путем замены четырех аминокислот для удаления сайта связывания комплемента (С1с|). В этой вариантной модификации последовательности 8Ер.Ш. Νο.15 лейцин в положении 15 будет заменен глутаматом, глутамат в положении 98 будет заменен аланином, и лизин в положениях 100 и 102 будет заменен аланином (см. фиг. 6 и 8Ε0.ΙΩ. Νο.18). Рекомбинантный белок Рс-ОВ, приведенный на фиг. 6, состоит из 373 аминокислот (не считая остатка метионина). Первая аминокислота в последовательности рекомбинантного белка Рс-ОВ на фиг. 6 обозначается как +1 с метионином в положении -1.

Аналогично, один или несколько остатков тирозина можно заменить остатками фенилаланина. Дополнительно рассматриваются также другие вариантные аминокислотные вставки, делеции и/или замены, которые включены в объем настоящего изобретения. Кроме того, изменения могут быть осуществлены в виде введения измененных аминокислот, таких как пептидомиметики или Ό-аминокислоты. Белок Рс может быть также соединен с белками ОВ в белке Рс-ОВ посредством химических или аминокислотных линкерных единиц различной длины. Такие химические линкеры хорошо известны из уровня техники. Последовательности аминокислотных линкеров могут включать, без ограничений перечисленными (а) а1а, а1а, а1а;

(б) а1а, а1а, а1а, а1а;

(в) а1а, а1а, а1а, а1а, а1а;

(г) д1у, д1у;

(д) §1у, §1у, §1у;

(ж) §1у, §1у, §1у, §1у, д1у;

(з) §1у, §1у, §1у, §1у, §1у, §1у, §1у;

(и) §1у-рго-§1у;

(к) д1у, д1у, рю, д1у, д1у; и (л) любые комбинации компонентов с (а) до (к).

ОВ-часть слитого белка Рс-ОВ может быть выбрана из набора рекомбинантных белков мыши, приведенного в 8Ε0.ΙΩ. Νο.3 (см. фиг. 1), или рекомбинантного белка человека, описанного Ζΐιηηβ е1 а1., №1иге, 8ирга (работа, упоминаемая в качестве ссылки), или же такого белка с отсутствующим остатком глутаминила в положении 28 (См. Ζΐιηηβ е1 а1., №1иге, 8ирга, на стр. 428). Может быть также использован аналог рекомбинантного белка ОВ человека, пред7 ставленный последовательностью 8ΕΟ.ΙΩ. Νο.6 (см. фиг. 2), который содержит (1) аргинин вместо лизина в положении 35; и (2) лейцин вместо изолейцина в положении 74 (кратким обозначением этого аналога служит рекомбинантный человеческий К^-Ь³⁵, 1^Ь⁷⁴). Аминокислотные последовательности рекомбинантного человеческого и рекомбинантного мышиного белков или их аналогов, имеющих или не имеющих слитый фрагмент Ес на Ν-конце белка ОВ, приведены ниже с метионильным остатком в положении -1; однако, в случае любого из представленных белков ОВ или их аналогов, метионильный остаток может отсутствовать.

Мышиный белок существенно гомологичен человеческому белку, что в особенности справедливо в отношении зрелого белка, и особенно по Ν-концу. Можно получить аналог рекомбинантного человеческого белка путем изменений (таких как замена аминокислотных остатков) в рекомбинантной человеческой последовательности. Поскольку рекомбинантный человеческий белок обладает биологической активностью на мышах, такой аналог, скорее всего, будет активен и в отношении человека. Например, при использовании человеческого белка, имеющего лизин в качестве остатка 35 и изолейцин в качестве остатка 74 согласно нумерации 8ΕΟ.ΙΩ. Νο.6, при том, что первая аминокислота является валином, а аминокислота в положении 146 - цистеин, можно заменить другой аминокислотой одну или несколько аминокислот в положениях 32, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 89, 97, 100, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138 и 145. Можно выбрать аминокислоту в соответствующем положении мышиного белка (8ΕΟ.ΙΩ. Νο.3) или другую аминокислоту.

Можно также получить консенсусные молекулы на основе последовательности белка ОВ крысы. См. Мигакаш1 с1 а1., Вюсйет. Βίοрйуз. КеБ.СЬтт. 209: 944-952 (1995), работа, цитируемая в качестве ссылки. Крысиный белок ОВ отличается от белка ОВ человека по следующим положениям (с использованием нумерации 8ΕΟ.ΙΌ. Νο.6): 4, 32, 33, 35, 50, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 101, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138 и 145. Можно заменить другой аминокислотой одну или несколько аминокислот в этих различающихся положениях. Положения, обозначенные подчеркнутыми цифрами, это те положения, по которым белок ОВ мыши и белок ОВ крысы отличаются от белка ОВ человека, и потому они особенно пригодны для замен. По одному или нескольким положениям аминокислоту соответствующего белка ОВ крысы можно заменить другой аминокислотой.

Положения, которые в крысином и мышином белках ОВ отличаются от таковых в зрелом белке ОВ человека, следующие: 4, 32, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 89, 97, 100, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138 и 145. Согласно 8ΕΟ.ΙΌ. Νο.6 бе лок ОВ, в котором одна или несколько аминокислот заменены другими аминокислотами, такими, например, которые обнаруживаются в соответствующих крысиной и мышиной последовательности, также может быть эффективным.

Аминокислоты, обнаруживаемые в белке ОВ макаки резус и отличающиеся от таковых в зрелом белке ОВ человека, таковы: 8(8), 35(К), 48(У), 53(0), 60(Ι), 66(Ι), 67(Ν), 68(Ь), 100(Ь), 108(Ε), 112(Ό) и 118(Ь) (совпадения указаны в скобках с использованием однобуквенного кода аминокислот). Поскольку рекомбинантный белок ОВ человека активен в отношении обезьян циномолгус, может быть эффективен и белок ОВ человека с последовательностью 8Ε0.ΙΌ. Νο.6 (с лизином в положении 35 и изолейцином в положении 74), у которого одна или несколько дивергентных аминокислот заменены другой аминокислотой, такой как аминокислоты в скобках. Необходимо отметить, что отдельные дивергентные аминокислоты такие же, как и обнаруживаемые в мышином белке (положения 35, 68, 89, 100 и 112). Так, можно получить консенсусную молекулу мышь/макака/человек, имеющую (с использованием нумерации 8Ε0.ΙΌ. Νο.6, в которой имеются лизин в положении 35 и изолейцин в положении 74) одну или несколько аминокислот, замещенных другой аминокислотой: 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142 и 145.

Могут быть получены и другие аналоги путем делеции части аминокислотной последовательности белка. Например, зрелый белок утрачивает лидерную последовательность (от -22 до -1). Можно получить следующие усеченные формы молекул белка ОВ человека (с использованием нумерации 8Ε0.ΙΌ. Νο.6):

(а) аминокислоты 98-146 (б) аминокислоты 1-32 (в) аминокислоты 40-116 (г) аминокислоты 1-99 и (соединенные с) 112-146 (д) аминокислоты 1-99 и (соединенные с) 112-146, имеющие одну или несколько аминокислот 100-111, вставленные между аминокислотами 99 и 112.

Усеченные формы могут быть изменены по одной или нескольким аминокислотам, по которым белки ОВ крысы, мыши или макаки резус отличаются от белка ОВ человека. Более того, изменения могут быть произведены в виде вставки измененных аминокислот, таких как пептидомиметики или Ό-аминокислоты.

Таким образом, в объем настоящего изобретения входит такой слитый белок Ес-ОВ, в котором белок ОВ выбран из следующего:

(а) аминокислотная последовательность 1146, приведенная в 8Ε0. ΙΌ. Νο.3 (ниже) или

8Ε0. ΙΌ. Νο.6;

(б) аминокислотная последовательность 1146, приведенная в 8ЕЦ. ГО. Νο.6, имеющая остаток лизина в положении 35 и остаток изолейцина в положении 74;

(в) аминокислотная последовательность компонента (б), в которой различные аминокислоты заменены в одном или нескольких из следующих положений (с использованием нумерации 8ЕО. ГО. Νο.6): 4, 32, 33, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 и 145;

(г) аминокислотная последовательность компонентов (а), (б) или (в), в которой дополнительно отсутствует глутаминиловый остаток в положении 28;

(д) аминокислотная последовательность компонентов (а), (б), (в) или (г), имеющая на Νконце метионильный остаток;

(е) усеченный аналог белка ОВ, выбранный из следующего (с использованием нумерации 8ЕЦ. ГО. Νο.6):

(ΐ) аминокислоты 98-146 (ίί) аминокислоты 1-32 (ίίί) аминокислоты 40-116 (ίν) аминокислоты 1-99 и 112-146 (ν) аминокислоты 1-99 и 112-146, имеющие одну или несколько аминокислот 100-111, вставленные между аминокислотами 99 и 112;

(νί) усеченный ОВ аналог компонента (ί), в котором одна или несколько из следующих аминокислот 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 и 145 заменена другой аминокислотой;

(νίί) усеченный аналог компонента (ίί), в котором одна или несколько из следующих аминокислот 4, 8 и 32 заменена другой аминокислотой;

(νίίί) усеченный аналог компонента (ίίί), в котором одна или несколько из следующих аминокислот 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111 и 122 заменена другой аминокислотой;

(ίχ) усеченный аналог компонента (ίν), в котором одна или несколько из следующих аминокислот 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 112, 118, 136, 138, 142 и 145 заменена другой аминокислотой;

(х) усеченный аналог компонента (ν), в котором одна или несколько из следующих аминокислот 4, 32, 33, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 и 145 заменена другой аминокислотой;

(χί) усеченный аналог любого из компонентов (1)-(х), имеющий Ν-терминальный метионильный остаток; и (ж) белок ОВ, аналог или производное в виде любого из компонентов от (а) до (е), содержащий химическую субстанцию, присоединенную к белку;

(з) производное компонента (ж), при том, что данная химическая субстанция представляет собой водорастворимый полимер;

(и) производное компонента (з), при том, что данный водорастворимый полимер представляет собой полиэтиленгликоль;

(к) производное компонента (з), при том, что данный водорастворимый полимер представляет собой полиаминокислотную субстанцию;

(л) производное любого из компонентов от (з) до (к), при том, что данная субстанция присоединена исключительно к Ν-концу данного белка;

(м) белок ОВ, аналог или производное в виде любого из компонентов от (а) до (л) в фармацевтически приемлемом носителе.

Производные

Заявленные слитые белки Ес-ΟΒ (термин белок включает понятия пептид, Ес, ΟΒ или аналоги, описываемые в настоящей заявке, если не указано обратное) были дериватизированы присоединением одной или нескольких химических сущностей к слитому белку Ес-ΟΒ. Эти химически модифицированные производные могут впоследствии вводиться в состав фармацевтических форм, предназначенных для внутриартериального, внутрибрюшинного, внутримышечного, подкожного, внутривенного, орального, назального, пульмонарного, местного и других способов введения, которые обсуждаются далее. Показано, что при определенных условиях химические модификации биологически активных белков обеспечивают дополнительные преимущества, такие как повышенная стабильность и время циркулирования терапевтического белка и пониженная иммуногенность. См. патент США № 4,179,337, Όανίκ е! а1., опубликованный 18 декабря 1979. См. обзор: АЬис1ю\ткк| е! а1., ίη Еихушек ак Эгидк. (1.8. Но1сегЬегд аиб 1. КоЬейк, ебк. рр.367-383 (1981)); Егаис1к е! а1., кирга.

Химические сущности, пригодные для подобной дериватизации, могут быть выбраны из различных водорастворимых полимеров. Выбранный полимер должен быть водорастворимым, с тем чтобы присоединенный к нему белок не преципитировал в водной среде, такой как физиологическое окружение. Для терапевтического применения конечного препарата предпочтительно, чтобы полимер был фармацевтически приемлемым. Квалифицированный специалист способен выбрать нужный полимер с учетом изложенных соображений в зависимости о того, будет ли конъюгат полимер/белок применяться терапевтически, и если будет, то с учетом нужной дозировки, времени циркулирования, устойчивости к протеолизу и других условий. В отношении заявленных в настоящем изобретении белков и полипептидов эффективность дериватизации можно подтвердить введением производного в желаемой форме (например, при помощи осмотического насоса, или, что более предпочтительно, инъекцией или вливанием, или же в виде формы, предназначенной для орального, легочного или назального применения) и отслеживанием биологических эффектов, как описано.

Водорастворимый полимер может быть выбран из группы, включающей, например, полиэтиленгликоль, сополимеры этиленгликоля/пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлозу, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, поли-1,3-диоксолан, поли-1,3,6триоксан, сополимер этилена/малеинового ангидрида, полиаминокислоты (как гомополимеры, так и случайные сополимеры), декстран или поли(п-винилпирролидон)полиэтиленгликоль, гомополимеры пропиленгликоля, сополимеры пропиленоксида/этиленоксида, полиоксиэтилированные полиолы и поливиниловый спирт. Пропиональдегид-полиэтиленгликоль может иметь преимущества для производства из-за его стабильности в воде. Могут использоваться также сукцинат и стирен.

Белки ОВ или Ес, используемые для получения слитого белка Ес-ОВ, можно модифицировать присоединением полиаминокислот или единичных боковых аминокислот к белку ОВ или Ес (или аналогу). Например, полиаминокислота может служить дополнительным белком-носителем, который подобно белку Ес слит с белком ОВ или его аналогом, и служить для увеличения срока циркулирования белка в дополнение к аналогичному эффекту, достигаемому за счет слияния Ес-ОВ. С учетом терапевтических и косметических целей настоящего изобретения, такие полиаминокислоты не должны обладать или не должны индуцировать антигенный ответ или другие нежелательные реакции. Такие полиаминокислоты могут быть выбраны из группы, включающей сывороточный альбумин (такой как альбумин сыворотки человека), дополнительное антитело или его фрагмент (например, Ес-район) или другие полиаминокислоты, например лизины. Как указывается далее, местом присоединения полиаминокислоты может быть Ν-конец белка Ес-ОВ, или С-конец, или другие места между ними; она может быть также присоединена к белку Ес-ОВ посредством химического линкера.

Полимер может иметь любой молекулярный вес и быть разветвленным или неразветвленным. Для полиэтиленгликоля, с учетом удобства в работе и целей производства, предпочтителен средний молекулярный вес от, примерно, 2 кЭа до, примерно, 100 кЭа (термин примерно указывает, что в препаратах полиэтиленгликоля некоторые молекулы имеют больший молекулярный вес, чем указано, а некоторые - меньший). В зависимости от желаемого терапевтического профиля (например, продолжительности поддерживаемого высвобождения, возможных эффектов на биологическую активность, простоты обращения, степени или отсутствия антигенности и других известных воздействий полиэтиленгликоля на тера певтический белок или его аналог), можно применять полиэтиленгликоль другого молекулярного веса.

Количество присоединенных молекул полимера может варьировать, и квалифицированный специалист способен контролировать эффект данного фактора на функцию белка. Может быть осуществлена монодериватизация, или ди-, три-, тетра- или какая-либо комбинации дериватизаций с одной и той же или другой химической сущностью (например, такими полимерами, как полиэтиленгликоли различных молекулярных весов). Соотношение молекул полимера и молекул белка (или пептида) будет варьировать, так же, как и их концентрация в реакционной смеси. Вообще, оптимальное соотношение (с точки зрения эффективности реакции, в которой нет избытка непрореагировавшего белка или полимера) может определяться такими факторами, как заданная степень дериватизации (например, моно-, ди-, три- и т.д.), молекулярный вес выбранного полимера, является ли полимер разветвленным или линейным, и применяемыми условиями реакции.

Химические субстанции должны присоединяться к белку с учетом воздействия на функциональные или антигенные домены белка. Имеется ряд способов присоединения, доступных квалифицированному специалисту, например ЕР 0 401 384, упоминаемый в качестве ссылки (присоединение ПЭГа к С-С8Е), см. также Майк е! а1., Ехр. Нета!о1. 20:1028-1035 (1992) (описано пэгирование СМ-С8Е при помощи трезилхлорида). Например, полиэтиленгликоль может быть ковалентно связан с белком через реакционноспособную группу, такую как свободная амино- или карбоксильная группа. Реакционноспособными группами являются такие, с которыми может быть связана активированная молекула ПЭГ. Аминокислотные остатки, содержащие свободную аминогруппу, могут включать остатки лизина и Ν-концевой остаток аминокислоты. Таковые, содержащие свободную карбоксильную группу, могут включать остатки аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты и С-концевой остаток аминокислоты. В качестве реакционноспособной группы для связывания с молекулой(-ами) ПЭГ могут быть использованы сульфгидрильные группы. Для терапевтических целей обычно предпочтительно присоединение по аминогруппе, например присоединение по Ν-концу или группе лизина. Присоединения по остаткам, важным для рецепторного связывания, надо избегать, если требуется рецепторное связывание.

Может возникнуть потребность в получении слитого белка Ес-ОВ, специфически модифицированного по Ν-концу. Используя полиэтиленгликоль для иллюстрации заявленных композиций, исследователь может сделать выбор из разнообразия молекул полиэтиленгликоля (по молекулярному весу, разветвленности и

т.д.), определить соотношение молекул полиэтиленгликоля и молекул белка (или пептида) в реакционной смеси, тип проводимой реакции пэгирования и способ получения конкретного Ν-терминально пэгированного белка. Способ получения Ν-терминально пэгированного препарата может включать очистку Ν-терминально пэгированного материала из популяции всех пэгированных молекул. Селективная Νтерминальная химическая модификация может быть достигнута путем восстановительного алкилирования, при котором используется дифференциальная реактивность различных типов первичных аминогрупп (лизиновых против Νтерминальных), доступных для дериватизации в конкретном белке. При соответствующих условиях реакции достигается преимущественно селективная дериватизация белка по Ν-концу полимером, присоединенным через карбонильную группу. Например, можно селективно пэгировать белок по Ν-концу, проводя реакцию при таких значениях рН, которые позволяют использовать различия между рК_а еаминогруппой остатков лизина и таковым αаминогруппы Ν-концевого остатка белка. Такой селективной дериватизацией контролируется присоединение водорастворимого полимера к белку: конъюгация с полимером происходит преимущественно по Ν-концу белка и никакой существенной модификации других реакционноспособных групп, таких как аминогруппы боковой цепи, не происходит. При применении восстановительного алкилирования водорастворимый полимер имеет единственную реакционноспособную альдегидную группу для соединения с белком. Можно использовать полиэтиленгликоль пропиональдегид, содержащий одну реакционноспособную альдегидную группу.

Ν-терминально монопэгированное производное является предпочтительным в силу легкости получения терапевтического препарата. Ν-терминальное пэгирование обеспечивает получения гомогенного продукта, поскольку характеристика продукта облегчена по сравнению с ди-, три - или другими мультипэгированными продуктами. Применение описанного выше процесса восстановительного алкилирования для получения пэгированного по Ν-концу продукта является предпочтительным из-за простоты коммерческого производства.

Комплексы

Слитой белок Те-ОВ, его аналог или производное можно назначать в виде комплекса со связывающей композицией. Такие связывающие композиции могут оказывать воздействие на пролонгирование времени циркулирования за те пределы, которые достижимы для слитого белка Ре-ОВ, его аналога или производного. Такой композицией может быть белок (или, синонимично, пептид). Примером связывающего белка служит рецептор белка ОВ или его фрагмент, такой как его растворимый фрагмент. Другие связывающие белки могут быть определены исследованием белка ОВ или белка Рс-ОВ в сыворотке или эмпирическим скринингом на наличие связывания. Используемые связывающие белки обычно не должны интерферировать со способностью белка ОВ, слитых белков РсОВ, их аналогов или производных связываться с эндогенным рецептором белка ОВ и/или влиять на передачу сигнала.

Фармацевтические композиции

В настоящем изобретении также заявлены способы применения фармацевтических композиций слитых белков Рс-ОВ и их производных. Такие фармацевтические композиции могут назначаться для инъекций, оральной, пульмонарной, назальной, трансдермальной и других форм введения. В целом, изобретением охватываются фармацевтические композиции, содержащие эффективные количества белка и его производных, полученные согласно настоящему изобретению, вместе с фармацевтически приемлемыми разбавителями, консервантами, солюбилизаторами, эмульгаторами, адъювантами и/или носителями. Такие композиции содержат растворители с различными буферами (например, ТП5-НС1. ацетат, фосфат), различного рН и ионной силы; такие добавки, как детергенты и солюбилизирующие агенты (например, Твин 80, Полисорбат 80), антиоксиданты (например, аскорбиновая кислота, метабисульфит натрия), консерванты (например, тимерзол, бензиловый спирт и наполнители (например, лактоза, маннитол). Терапевтический материал может быть введен в конкретные препараты полимерных соединений, таких как полимолочная кислота, полигликолевая кислота и т.д., или в липосомы. Может применяться гиалуроновая кислота, которая способствует поддержанию препарата в циркуляции. Такие композиции могут влиять на физическое состояние, стабильность скорость высвобождения ίη νίνο и скорость выведения ίη νίνο заявленных белков и их производных. См. например, Ветшдоп'к Рйаттасеибса1 Заепсек, 18111 Еб. (1990, Маск РиЫщЫпд Со., Еа^оп, РА 18042), стр. 1435-1712, упоминаемую в настоящем описании в качестве ссылки. Композиции могут быть приготовлены в жидком виде или в виде сухого порошка, такого как лиофилизированная форма. Рассматриваются также имплантируемые формы для поддерживаемого высвобождения, так же, как и трансдермальные формы.

Рассматриваются также оральные твердые дозировочные формы, которые описаны в целом в Рет1пд1оп'5 Рйагтасеибса1 Заепсек, 18111 Еб. 1990 (Маск РиЬШЫпд Со., Еайоп, РА 18042) в Главе 89, работа, упоминаемая в настоящем описании в качестве ссылки. К твердым дозировочным формам относятся таблетки, капсулы, пилюли, пастилки или лепешки. Для создания фармацевтических форм заявленных композиций можно использовать липосомальную или протеиноидную инкапсуляцию (как, например, протеиноидные микросферы, описанные в патенте США № 4,925673). Можно использовать липосомпую инкапсуляцию, а липосомы дериватизировать различными полимерами (например, патент США № 5,013,556). Описание возможных твердых дозировочных форм терапевтических средств дано МагзЬа11, К. Ιη: М обеги РЬаттасеийсз Ебйеб Ьу С.8. Вапкег апб С.Т. ВЬобез, Глава 10, 1979, работа, упоминаемая в настоящем описании в качестве ссылки. В целом, фармацевтическая форма будет включать слитой белок Гс-ОВ, (его аналог или производное) и инертные ингредиенты, создающие защиту от желудочного окружения и высвобождающие биологически активный материал в кишечнике.

Также специально рассматриваются оральные дозировочные формы дериватизированных белков. Слитой белок Гс-ОВ можно так химически модифицировать, что оральное применение производного окажется эффективным. Вообще, под химической модификацией подразумевают присоединение к молекуле белка (или пептида) по меньшей мере одной химической сущности, при том, что данная сущность делает возможным (а) подавление протеолиза и (б) поступление в кровоток из желудка или кишечника. Также желательно повысить общую стабильность белка и повысить время его циркулирования в организме. Примерами таких сущностей служат полиэтиленгликоль, сополимеры этиленгликоля и пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлоза, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон и полипролин. АЬис1то\\'зк| апб Оау13. 8о1иЬ1е Ро1утег-Епхуте Аббис!з. Ιη: Епхутез аз Огидз, НосепЬегд апб ВоЬейз, ебз., ^беу-1п1етзс1епсе, Ыете Уотк, ΝΥ, (1981), стр.367-383; №^татк, е! а1., 1. Арр1. ВюсЬет. 4: 185-189 (1982). К другим используемым полимерам относятся поли-1,3-диоксолан и поли1,3,6-тиоксокан. Как указывалось выше, для фармацевтического применения предпочтительным является полиэтиленгликоль.

В случае слитого белка Гс-ОВ, его аналога или производного местом высвобождения может быть тонкий кишечник (например, двенадцатиперстная кишка, тощая кишка, подвздошная кишка) или толстый кишечник. Квалифицированный специалист может выбрать такую конечную лекарственную форму, которая не будет растворяться в желудке, а будет высвобождать действующее начало в двенадцатиперстной кишке или еще где-либо в кишечнике. Предпочтительно при высвобождении избежать неблагоприятного воздействия среды желудка или защитой слитого белка Гс-ОВ, его аналога или производного, или же путем высвобождения биологически активного материала за пределами желудка, например в кишечнике.

Для того чтобы противостоять агрессивному окружению в желудке, покрытие должно быть непроницаемо по меньшей мере при рН

5,0. Примерами наиболее обычных инертных ингредиентов, используемых для создания покрытий, устойчивых к желудочному соку, служат тримеллитат ацетатцеллюлозы (САТ), фталат гидроксипропилметилцеллюлозы (НРМСР), НРМСР 50, НРМСР 55, Адиа!ег1с, фталат поливинилацетата (РУАР), Еибтадй Ε30Ό, Еибтадй Ь, Еибтадй 8 и шеллак. Эти покрытия могут применяться в виде смешанных пленок.

Покрытие или смесь покрытий может наноситься на таблетки не только для целей защиты от желудочного сока. К таким покрытиям относятся сахарное, а также покрытия, способствующие проглатыванию таблеток. Капсулы могут состоять из твердой оболочки (например, желатиновой) для доставки сухого терапевтического агента, например порошка; для жидких форм можно использовать мягкую желатиновую оболочку. В качестве материала капсул можно использовать крахмал или другой съедобный углевод. Для приготовления пилюль, лепешек, сплавленных таблеток и порошковых таблеток можно использовать способ влажной формовки.

Терапевтический агент может содержаться в конечной лекарственной форме в виде микрочастиц, гранул или чешуек размером около 1 мм. Материал, используемый для заполнения капсул, может иметь вид порошка, слегка спрессованных пробок или даже таблеток. Конечную лекарственную форму можно получить под давлением.

Могут вводиться оцветители и ароматизирующие агенты. Например, белок (или производное) можно ввести в состав конечной формы (например, в липосомы или микросферы), а затем смешать со съедобным продуктом, таким как охлажденный напиток, содержащий оцветители и ароматизаторы.

При необходимости разбавить терапевтический препарат или увеличить его объем, это достигается добавлением инертного материала. К таким наполнителям относятся углеводороды, особенно маннитол, α-лактоза, безводная лактоза, целлюлоза, сахароза, модифицированные декстраны и крахмал. В качестве наполнителей могут применяться некоторые неорганические соли, такие как трифосфат кальция, карбонат магния и хлорид калия. Среди коммерчески доступных наполнителей можно назвать Газ!Г1о, Етбех, 8ТА-Вх 1500, Етсотргезз и АукеИ.

В твердую дозировочную форму терапевтического препарата могут входить разрыхлители. К материалам, используемым в качестве разрыхлителей, относятся, без ограничения перечисленными, крахмал и коммерческий разрыхлитель на основе крахмала, Ехр1о!аЬ. Можно применять натриевый гликолат крахмала, амберлит, натриевую карбоксиметилцеллюлозу, ультрамилопектин, альгинат натрия, желатин, апельсиновую кожуру, кислую карбоксиметилцеллюлозу, натуральные губки и бентонит. Другим видом разрыхлителей являются нераство римые катионобменные смолы. Как разрыхлители и связующие применяют такие порошковые смолы, как агар, карайя или трагакант. Альгиновая кислота и ее натриевая соль также используются в качестве разрыхлителей.

Для поддержания препарата в виде твердой таблетки применяются связующие вещества, среди которых такие природные продукты, как гуммиарабик, трагакант, крахмал и желатин. Среди других связующих можно назвать метилцеллюлозу (МС), этилцеллюлозу (ЕС) и карбоксиметилцеллюлозу (СМС). Поливинилпирролидон (РУР) и гидроксипропилметилцеллюлоза (НРМС) могут применяться для гранулирования терапевтического препарата в спиртовых растворах.

Для предотвращения слипания в процессе приготовления конечной лекарственной формы в фармацевтический состав можно включать антифрикционные агенты. Любриканты можно использовать как прослойку между терапевтическим агентом и формовочной ячейкой. К ним относятся, без ограничения перечисленными, стеариновая кислота, включая ее магниевую и кальциевую соли, политетрафторэтилен (РТЕЕ), жидкий парафин, растительные масла и воски. Могут применяться такие жидкие любриканты, как лаурилсульфат натрия, лаурилсульфат магния, полиэтиленгликоль различного молекулярного веса, СагЬо^ах 4000 и 6000.

Для повышения текучести препарата в процессе приготовления конечной лекарственной формы и для облегчения формовки под давлением могут применяться глиданты. К ним относятся крахмал, тальк, пирогенный кремний и гидратированный кремний алюминат.

Для облегчения растворения терапевтического агента в водной среде в качестве увлажняющего агента может быть добавлено поверхностно-активное вещество. К таким поверхностно-активные веществам относятся такие катионные детергенты, как лаурилсульфат, диоктилнатрийсульфосукцинат и диоктилнатрийсульфонат. К используемым катионным детергентам относятся бензалкониумхлорид или бензетониумхлорид. В список возможных неионных детергентов, которые могут включаться в состав конечных форм в качестве поверхностноактивных веществ, входят также лауромакроголь 400, полиоксил 40 стеарат, полиоксиэтилен гидрогенированное касторовое масло 10, 50 и 60, глицерин моностеарат, полисорбат 40, 60, 65 и 80, жирнокислый эфир сахарозы, метилцеллюлоза и карбоксиметилцеллюлоза. Эти поверхностно-активные вещества могут присутствовать в конечной форме белка или производного сами по себе или в смеси в различных пропорциях.

К добавкам, которые значительно усиливают проникновение белка (или производного), относятся, например, такие жирные кислоты, как олеиновая кислота, линолевая кислота и леноленовая кислота.

Могут потребоваться конечные формы для контролируемого высвобождения. Препарат можно заключить в инертный матрикс, который делает возможным высвобождение диффузией или выщелачиванием, например, в смолы или губки.

В конечную форму могут быть также введены медленно дегенерирующие матриксы, например альгинаты, полисахариды. Другой формой контролируемого высвобождения является способ, основанный на терапевтической системе Огок (А1ха Согр.), согласно которой препарат заключен в полупроницаемую мембрану, через которую проникает вода и в силу осмотического эффекта вымывает препарат через небольшое отверстие.

При получении конечных форм можно использовать и другие покрытия. К ним относятся различные сахара, применяемые для карамелизации. Терапевтический агент может также назначаться в виде покрытых пленкой таблеток, и используемые в этом случае материалы делятся на две группы. В первую входят такие неперевариваемые материалы, как метилцеллюлоза, этилцеллюлоза, гидроксиэтилцеллюлоза, метилгидроксиэтилцеллюлоза, гидроксипропилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, натрийкарбоксиметилцеллюлоза, провидон и полиэтиленгликоли. Во вторую группу входят перевариваемые материалы, среди которых эфиры и фталевая кислота.

Для получения оптимального пленочного покрытия можно использовать смесь материалов. Пленочное покрытие можно наносить карамелизацией, жидким способом или под давлением.

Рассматривается также легочный (пульмонарный) способ доставки заявленного белка (или производного). Белок (или производное) попадает в легкие млекопитающего при вдыхании и через эпителиальную выстилку легких проникает в кровоток. (К другим работам на эту тему относятся: Аб)е1 е! а!., Рйагтасеийса1 Кекеагсй 7: 565-569 (1990); Аб)е1 е! а1., 1п!ета!юпа1 1оита1 о£ Рйагтасеийск 63: 135-144 (1990) (лепролид ацетат); Вгасще! е! а1., 1оигпа1 о£ С’агбюуакси1аг Рйагтасо1оду 13 (кирр1.5): 143-146 (1989) (эндотелин-1); НиЬЬагб е! а1., Аппа1к о£ 1п!егпа1 Мебкте 3: 206-212 (1989) (α1антитрипсин); 8тИй е! а1., б. С1ш. 1пуек!. 84: 1145-1146 (1989) (а1-протеиназа); Октет е! а1., АегокоК/аЦоп о£ Рго!етк, Ргосеебтдк о£ 8утрокшт оп гекр1га!огу Эгид Оейуегу II, Кеук!опе, Со1огабо, Магсй, 1990 (рекомбинантный гормон роста человека); ЭеЬк е! а1., Тйе 1оигпа1 о£ 1ттипо1оду 140: 3482-3488 (1988) (интерферон-γ и фактор некроза опухолей α) и Р1а1х е! а1., патент США № 5,284,656 (гранулоцитарный колониестимулирующий фактор).)

Для осуществления настоящего изобретения возможно применение широкого спектра механических устройств, разработанных для пульмонарного способа доставки терапевтических продуктов, включая, без ограничения перечисленными, распылители, дозирующие ингаляторы, порошковые ингаляторы, которые известны квалифицированным специалистам.

К конкретным примерам коммерчески доступных устройств, приемлемых для осуществления настоящего изобретения, относятся распылитель и11гауеп1. производимый Ма1йпкггоб!, Шс., 81. №1.115, Μί55οιιπ; распылитель Лотт ΙΙ, производимый Магс.|ие51 Меб1са1 Ргабис15, Επ^1\νοο6, Ο’οίοηάο; распылитель УепФйп, производимый 61;·ιχο Шс., Кевеагсй ТпапДе Рагк, ΝοΠ1ι Сагойпа; распылитель 8ρίηйа1ег, производимый Ρί5οιΐ5 Οοιρ., Веско гб, Ма55ас1ш5е15.

Все подобные устройства предусматривают применение таких конечных лекарственных форм, которые приемлемы для дозировки белка (его аналога или производного). Обычно в состав таких конечных лекарственных форм, специфичных для типа используемого устройства, в дополнение к растворителям, адъювантам и/или носителям, необходимым для достижения терапевтического эффекта, входит веществопропеллант.

Белок (или производное) предпочтительно приготавливать в виде диспергированной формы со средним размером частиц менее 10 мкм (или микрон), наиболее предпочтительно от 0,5 до 5 мкм для наиболее эффективной доставки в отдаленные альвеолы легких.

К носителям относятся такие углеводороды, как трегалоза, маннитол, ксилитол, сахароза, лактоза и сорбитол. К другим ингредиентам, используемым в конечных формах, относятся ИРРС, ИОРЕ, И8РС и ИОРС. Можно применять природные или синтетические поверхностноактивные вещества. Используется полиэтиленгликоль (независимо от его применения для дериватизации белка или аналога). Можно применять декстраны, такие как циклодекстран. Можно применять желчные соли и другие подобные усилители. Можно применять целлюлозу и производные целлюлозы. Применимы аминокислоты, подобно тому, как они входят в состав буферов.

Рассматривается также применение липосом, микрокапсул или микросфер, комплексов включений и других типов носителей.

Конечная лекарственная форма, предназначенная для применения с помощью реактивного или ультразвукового распылителя, будет, как правило, содержать белок Ес-ОВ, его аналоги или производные, растворенные в воде в концентрации от около 0,1 до 25 мг биологически активного белка на мл раствора. Конечная форма может также содержать буфер и простой сахар (например, для стабилизации белка и под держания осмотического давления). Конечная форма, предназначенная для доставки с помощью распылителя, может содержать поверхностно-активное вещество для предотвращения или снижения поверхностно-индуцированной агрегации белка, вызванной атомизацией раствора при образовании аэрозоля.

Конечные формы, предназначенные для доставки с помощью дозирующего ингалятора, обычно будут включать мелкодисперсный порошок, содержащий белок (или производное), суспендированный в пропелланте при помощи поверхностно-активного вещества. Пропеллантом может быть любой удобный материал, используемый для этой цели, такой как хлорфторкарбон, гидрохлорфторкарбон, гидрофторкарбон или гидрокарбон, включая трихлорфторметан, дихлордифторметан, дихлортетрафторэтанол, и 1,1,1,2-тетрафторэтан или их сочетания. К приемлемым поверхностно-активным веществам относятся сорбитан триолеат и соевый лецитин. В качестве поверхностно-активного вещества может использоваться олеиновая кислота.

Конечные формы, предназначенные для доставки в виде порошка с помощью порошкового ингалятора, будут включать мелкодисперсный сухой порошок, содержащий белок (или производное), а также могут включать наполнитель, такой как лактоза, сорбитол, сахароза, маннитол, трегалоза или ксилитол, в таких количествах, которые способствуют диспергированию порошка из дозатора, например, от 50 до 90% по весу.

Рассматривается также назальный способ доставки белка (его аналога или производного). Назальное введение обеспечивает попадание белка в кровоток непосредственно после введения терапевтического препарата в нос, без необходимости депонирования продукта в легких. Формы для назального введения содержат декстран или циклодекстран. Рассматриваются также возможности транспорта через другие слизистые оболочки.

Дозировка

Квалифицированный специалист сможет убедиться в эффективности назначенной дозировки после ее назначения и отслеживания желаемого терапевтического эффекта. В силу Νтерминальной модификации белка ОВ настоящее изобретение обеспечивает неожиданную защиту белка от деградации, повышенное время циркулирования и стабильность по сравнению с белком ОВ или С-терминальной модификацией белка ОВ. Квалифицированный специалист сможет убедиться в том, что вследствие таких изменений эффективные дозировки могут предусматривать меньшие дозы или более редкие введения препарата.

Предпочтительна такая конечная форма препарата, чтобы ее дозировка от около 0,10 мкг/кг/день до около 10 мг/кг/день обеспечива21 ла желаемый терапевтический эффект. Эффективные дозировки можно определить при постоянном использовании диагностических тестов. Например, диагностический тест для определения белка ОВ или слитого белка Рс-ОВ в крови (или в плазме, или сыворотке) может быть применен исходно для определения эндогенного уровня белка. Такие диагностические инструменты могут иметь вид антительного теста, такого как сэндвич-тест на основе антител. Исходно оценивается эндогенный уровень белка и определяется его базальный уровень. Терапевтические дозировки назначаются с учетом количественных определений эндогенного и экзогенного белка ОВ или слитого белка РсОВ (т.е. белка, аналога или производного, обнаруживаемого в организме, как уже имеющегося, так и введенного) в ходе лечения. По ходу лечения дозировки могут меняться от относительно высоких в начале курса до достижения положительного эффекта к более низким, поддерживающим дозировкам для сохранения терапевтического эффекта.

Идеально, чтобы в тех ситуациях, когда требуется только снижение количества липидов в крови, поддержание низкого уровня липидов в крови или повышение мышечной массы тела, дозировки были бы недостаточны для потери веса. Так, в начальном курсе терапии ожиревшего больного могут назначаться такие дозировки, которые обеспечивают снижение веса и сопутствующее снижение уровня липидов крови или сопутствующее уменьшение жировой ткани/медленное нарастание массы.

Когда достигается потеря веса, можно назначать дозу, достаточную для предупреждения обратного нарастания веса, достаточную для поддержания желаемых уровней липидов крови, медленного нарастания массы (или предупреждения медленного истощения).

Эти дозировки могут быть определены эмпирически, поскольку эффекты белка ОВ и белка Рс-ОВ обратимы (напр., СатрйеИ с1 а1., 8с1епсе 269: 546-549 (1995) на стр. 547). Так, если назначенная дозировка приводит к потере веса в тех случаях, когда она нежелательна, должны назначаться меньшие дозы для достижения нужного уровня липидов в крови или увеличения мышечной массы без потери веса.

Для повышения индивидуальной чувствительности к инсулину должны приниматься во внимание аналогичные соображения. Увеличение мышечной массы без потери веса может быть достаточным для снижения доз инсулина (или, возможно, амилина, тиазолидинедионов или других сильных препаратов для лечения диабета), назначаемых больному для лечения диабета.

Для повышения общей силы могут применяться аналогичные дозировки. Увеличение мышечной массы с сопутствующим повышением общей силы может быть достигнуто при применении доз, недостаточных для потери веса. К другим положительным эффектам, достигаемым также без потери веса, относятся увеличение количества красных клеток крови (и, соответственно, оксигенации крови) и снижение резорбции костей или остеопороза.

Сочетания

Заявленные в настоящем изобретении способы могут быть использованы в сочетании с другими препаратами, такими как применяемые для лечения диабета (например, инсулин, возможно - тиазолидинедионы, амилин или их антагонисты), холестерин и медикаменты, снижающие кровяное давление (подобные тем, что снижают количество липидов в крови), или другие сердечно-сосудистые препараты, а также препараты, повышающие активность (напр. амфетамины). Могут также применяться препараты, подавляющие аппетит (такие, которые влияют на уровни серотонина или нейропептида Υ). Подобные назначения могут осуществляться одновременно или последовательно.

Кроме того, заявленные способы могут применяться в сочетании с хирургическими методами, такими как косметическая хирургия с целью изменения общего вида тела (например, липосакция или лазерная хирургия для снижения массы тела). Положительные эффекты сердечной хирургии, например аорто-коронарного шунтирования и других операций, направленных на ослабление болезненных состояний, которые вызваны закупоркой кровеносных сосудов жировыми отложениями, такими как артериальные бляшки, могут быть повышены сопутствующим применением заявленных композиций и способов. Такие методы удаления желчных камней, как ультразвуковой или лазерный, могут применяться до, во время или после использования заявленных терапевтических подходов. Более того, заявленные способы можно применять как дополнительные при хирургических и терапевтических способах заживления сломанных костей, поврежденных мускулов или в других случаях, когда повышение мышечной массы способствует выздоровлению.

Следующие примеры приведены с целью более полного иллюстрирования изобретения и не ограничивают его объем.

Пример 1. Применение мышиного белка Рс-ОВ для подкожных инъекций.

Данный пример показывает, что подкожные инъекции мышиного белка Рс-ОВ приводят к потере веса у нормальных мышей. Нормальным (неожиревшим) мышам С57 проводили подкожные инъекции мышиного белка Рс-ОВ в течение 22 дней. Дозировка в 10 мг белка/кг веса тела/день приводила к 14%-ной (+/-1,1%) потере веса от исходного значения к 22-му дню инъекций. Введение РВ8 приводило к 3,9%-ной (+/-3,3%) потере веса от исходного значения к 22-му дню инъекций. Потеря веса при дозировке 10 мг белка/кг веса тела/день у ожиревших мышей СЭ1 составляла 10% (+/-4,3%) от исходного значения, а введение ΡΒ8 приводило к 8,7%-ной (+/-1,3%) потере, в обоих случаях - к 22-му дню инъекций.

Ниже приведены проценты (%) разницы от исходного значения в весе мышей СЭ1 (в возрасте 8 недель).

Таблица 1

Снижение веса при подкожном введении

Время, дни	Носитель (ΡΒ8)	Худые/Рекомбинантный слитой белок Ес-ΟΒ	Ожиревшие/Рекомбинантный слитой белок Ес-ΟΒ
1-2	-0,44+/-1,1	-3,6+/-0,41	-1,03+/-1,36
3-4	-1,07+/-0,33	-6,8+/-1,5	-2,7+/-1,1
5-6	-0,13+/-1,1	-9,5+/-1,2	-4,9+/-0,95
7-8	-0,92+/-0,29	-12,5+/-1,6	-7,7+/-2,9
9-10	1,6+/-1,3	-12,6+/-1,9	-8,2+/-2,0
11-12	-1,98+/-1	-13,6+/-1,96	-8,6+/-2,9
13-14	-5,2+/-1,3	-14,6+/-1,7	-10,1+/-3,6
15-16	-8,6+/-0,1	-14,5+/-2	-9,4+/-2,2
17-18	-8,5+/-0,64	-16,1+/-1,8	-9,6+/-2,99
19-20	-4,1+/-0,99	-16+/-1,5	-10,4+/-3,3
21-22	-3,9+/-3,3	-14,1+/-1,1	-10+/-4,3

Можно видеть, что к концу 22-дневного срока подкожных введений животные, получавшие белок Ес-ΟΒ, потеряли более 14,1% веса (худые) и 10% веса (ожиревшие) по сравнению с животными, получавшими только носитель (ΡΒ8), и по сравнению с исходными значениями.

Удивительно, что животные, получавшие Ес-ΟΒ 22 дня, продолжали терять в весе до 28 дня, т.е. 4 дня спустя после последней инъекции. Нормальные (неожиревшие) мыши СЭЕ которым подкожно вводили мышиный белок Ес-ΟΒ в течение 22-х дней, потеряли 21% веса к 28-му дню по сравнению с исходными значениями, к 22-му дню эта потеря составляла 14%. Аналогично, ожиревшие мыши СЭЕ которым вводили мышиный белок Ес-ΟΒ в течение 22-х дней, потеряли 13% веса к 28-му дню по сравнению с исходными значениями, к 22-му дню эта потеря составляла 10%. На 34-й день потеря веса сохранялась на уровне 10% у ожиревших мышей и 5% у худых мышей. В контролях для каждой системы на сроках с 22-го по 34-й день отмечена средняя прибавка в весе, равная 4% для ожиревших мышей и 7% для худых.

Пример 2. Использование белка Ес-ΟΕ человека для подкожных инъекций мышам С57.

Данный пример показывает, что подкожные инъекции белка Ес-ΟΒ человека приводят к потере веса у нормальных мышей. Нормальным (неожиревшим) мышам С57 проводили подкожные инъекции белка Ес-ΟΒ человека в течение 7 дней. Дозировка в 10 мг белка/кг веса тела/день приводила к 12%-ной (+/-1,3%) потере веса от исходного значения к 7-му дню инъекций. Дозировка в 1мг белка/кг веса тела/день приводила к 8,9%-ной (+/-1,5%) потере веса от исходного значения к 7-му дню инъекций. Потеря веса при дозировке 10 мг белка/кг веса тела/день у ожиревших мышей С57 составляла 1,1% (+/-0,99%) от исходного значения, а при дозировке 1 мг белка/кг веса тела/день - 2,5% (+/-1,1%), в обоих случаях - к 7-му дню инъекций.

Результаты

Ниже приведены проценты (%) разницы от исходного значения в весе мышей С57 (в возрасте 8 недель).

Таблица 2

Снижение веса при подкожном введении

Время, дни	Носитель (ΡΒ8)	Рекомбинантный слитый белок Ес-ΟΒ	Рекомбинантный белок ОВ
1-2	0,258+/-1,3	-6,4+/-1,6	-2,1+/-0,91
3-4	2,2+/-1,1	-12,1+/-1,5	-0,78+/-0,36
5-6	4,5+/-2	-11,5+/-1,5	-1,7+/-0,6
7-8	7,0+/-2,1	-11,9+/-1,6	0,1+/-1,2
9-10	9,0+/-1,9	-11,5+/-1,3	7,2+/-2,7
11-12	10+/-3,8	-9+/-1,4	10,9+/-2,9
13-14	12,5+/-4,4	-9,5+/-1,6	12,3+/-6,4
15-16	11,1+/-1,0	-3,0+/-1,5	10,3+/-3,3
17-18	17,2+/-3,6	8,0+/-1,3	13,3+/-3,4

Можно видеть, что к 17-му дню после 7 дней инъекций в дозе 10 мг/кг/день животные, получавшие белок Ес-ΟΒ, восстановили 8% веса тела. Животные, получавшие дозировку 1 мг/кг/день в течение 7 дней, восстановили 6,4% веса тела через 12 дней.

Эксперимент показал, что в течение восстановительного периода с 7-го по 22-й день, после последней инъекции на 7-й день, восстановление веса происходит медленнее у мышей, получавших Ес-ΟΒ, нежели у мышей, получавших ΟВ. Следовательно, белок Ес-ΟΒ выводится не столь быстро, как белок ΟВ, обусловливая тем самым более продолжительный эффект снижения веса.

Пример 3. Дозозависимый ответ мышей СЕ7 на введение слитого белка Ес-ОВ.

Дополнительное исследование показывает, что существует дозозависимый ответ на постоянное введение белка Ес-ΟΒ. В данном эксперименте ожиревшим мышам СЕ7 весом 35-40 г вводили рекомбинантный белок Ес-ΟΒ человека с использованием метода, описанного в предыдущем примере. Результаты приведены в табл. 3 ниже (% снижения веса тела сравнен с исходным значением, определенным, как описано выше).

Таблица 3

Дозозависимый ответ при постоянном введении

Доза	Время	% снижения веса тела
0,25 мг/кг/день	День 5	4
0,5 мг/кг/день	День 5	12
1 мг/кг/день	День 5	16

Можно видеть, что повышение дозы с 0,25 до 1 мг/кг/день повышало потерю веса с 4 до 16%. Примечательно также, что на 5-й день дозировка 1 мг/кг/день приводила к снижению веса на 16%. В данном исследовании отмечена низкая скорость восстановления веса до 0%, что свидетельствует о медленном выведении белка

Рс-ОВ, которое обусловливает продолжительный эффект снижения веса.

Пример 4. Фармакокинетика рекомбинантного Рс-ОВ человека у мышей СЭ1 и собак.

Целью настоящего эксперимента было исследование фармакокинетитических свойств рекомбинантного те!-Рс-ОВ белка человека на мышах СО 1 и собаках. После внутривенных или подкожных введений в дозе 1 мг/кг/день в сыворотках с помощью фермент-связанного иммуносорбентного теста (ЕЫ8Л) определяли концентрации рекомбинантного те!-Рс-ОВ человека.

Для обоих видов отмечено более длительное воздействие по сравнению с рекомбинантным белком те!-Рс-ОВ человека, которое количественно оценивали по более высоким пикам концентраций в сыворотке и большим площадям под кривыми концентраций (ЛИС). Рс-ОВ обладал более низким системным клиренсом, чем рекомбинантный те!-ОВ белок человека. Это видно из низкого клиренса и более продолжительной полужизни по сравнению с белком ОВ. Это увеличение обусловлено не только увеличением стабильности белка, но также и снижением эффективности почечного клиренса. В результате, Рс-ОВ выводился из системной циркуляции медленнее. Повышенные пиковое время, пиковые концентрации в сыворотке и ЛИС для белка Рс-ОВ согласуются с низким клиренсом. Белок Рс-ОВ будет обеспечивать значительно более высокое системное воздействие, нежели белок ОВ. Результаты приведены ниже в табл. 4.

Таблица 4

Фармакокинетические свойства

Вид	Мыши СЭ-1	Мыши СЭ-1	Собаки (бигль)
Способ введения	Внутривенно	Подкожно	Подкожно
	Белок ОВ	Белок Рс-ОВ	Белок ОВ	Белок Рс-ОВ	Белок ОВ	Белок Рс-ОВ
Доза, мг/кг	1	1	1	1	1	1
Время достижения пика, ч			0,14	6	2,8	8
Пиковая концентрация в сыворотке, нг/мл			1520	7550	300	1120
АиС, нг/ч/мл	1470	366000	1230	132000	2200	52500
Полужизнь, ч	0,491	21,4	0,388		2,13	22,9
Клиренс, млчкг	681	2,73

Пример 5.

Данный пример показывает, что введение рекомбинантного белка Рс-ОВ человека нормальным, неожиревшим мышам с нормальным уровнем липидов в крови приводит к снижению уровней холестерина, глюкозы и триглицеридов. Кроме того, из данного примера следует, что эти уровни остаются низкими в течение трехдневного восстановительного периода.

Нормальным мышам СЭ1 подкожно вводили рекомбинантный Рс-ОВ белок человека. Образцы крови брали через 24 ч после 23-го дня, последнего для инъекций. Как обсуждалось выше, при используемых дозировках животные теряли в весе. Как видно из табл. 5, у мышей наблюдалось существенное дозозависимое снижение холестерина в сыворотке, глюкозы и триглицеридов по сравнению с контролем.

Таблица 5

Доза	Глюкоза	Холестерин	Триглицериды
РВ8	232,6+/-15,1	67,8+/-3,6	52,6+/-3,7
1 мг/кг/день	225,8+/-	+/-	+/-
10 мг/кг/день	+/-	+/-	+/-
1 мг/кг каждые 2 дня	+/-	+/-	+/-
10 мг/кг каждые 2 дня	+/-	+/-	+/-
1 мг/кг каждые 3 дня	+/-	+/-	+/-
10 мг/кг каждые 3 дня	+/-	+/-	+/-

Эти данные показывают, что белок Рс-ОВ или его аналоги и производные являются эффективными агентами, снижающими уровень липидов в крови.

Пример 6.

Пациенту, страдающему ожирением, вводили человеческий белок Рс-ОВ, его аналог или производное с целью снижения веса. У данного пациента также отмечено повышенное содержание липидов в крови, включая холестерин, до 200 мг/100 мл. В ходе терапии Рс-ОВ у пациента достигнуто удовлетворительное снижение веса. Похудевшему пациенту вводили поддерживающие дозы белка Рс-ОВ, его аналога или производного для поддержания низких уровней липидов в крови, включая сниженные (менее 200 мг/100 мл) уровни холестерина. Вводимые дозы были недостаточны для дальнейшего снижения веса. Введение препарата было постоянным. Количество циркулирующего белка РсОВ, его аналога или производного можно контролировать с помощью диагностического набора, такого как тест на основе антител к белку ОВ (или другого источника антигена, если это было применимо).

Пример 7.

Не страдающий ожирением пациент подвергся операции аорто-коронарного шунтирования или другому инвазивному лечению по поводу продвинутой стадии образования артериальных бляшек. После операции больному вводили поддерживающие дозы белка Рс-ОВ, его аналога или производного для предотвращения повторного образования артериальных бляшек. Вводимые дозы были недостаточны для снижения веса. Введение препарата было постоянным. Количество циркулирующего белка белка РсОВ, его аналога или производного можно контролировать с помощью диагностического набора, такого как тест на основе антител к белку ОВ (или другого источника антигена, если это было применимо).

Пример 8.

Не страдающий ожирением пациент страдал от гипертонии, обусловленной сниженным кровотоком по закупоренным артериям. Больному вводили дозу белка Рс-ОВ, его аналога или производного, достаточную для снижения количества артериальных бляшек, обусловливающих закупорку артерий. Затем состояние больного контролировали в отношении гипертонии и последующего образования артериальных бляшек. Если гипертония возобновлялась, больному опять вводили эффективноое количество белка Рс-ОВ, его аналога или производного, достаточное для восстановления кровотока, но недостаточное для снижения веса. Количество циркулирующего белка белка Рс-ОВ, его аналога или производного можно контролировать с помощью диагностического набора, такого как тест на основе антител к белку ОВ (или другого источника антигена, если это было применимо).

Пример 9.

Больной страдал желчекаменной боезнью. Желчные камни или не удаляли, и при этом считалось, что удастся избежать образования новых камней, или камни удаляли, но оставляли желчный пузырь (например, при использовании лазерной или ультразвуковой хирургии) и также предполагали, что удастся избежать образования новых камней. Пациенту вводили эффективное количество белка Рс-ОВ, его аналога или производного, что предотвращало накопление желчных камней и образование новых камней, мышечной массы. Количество циркулирующего белка белка Рс-ОВ, его аналога или производного можно контролировать с помощью диагностического набора, такого как тест на основе антител к белку ОВ (или другого источника антигена, если это было применимо).

Пример 10.

Больному диабетом требовалось снижение доз инсулина, применяемых для лечения диабета. Пациенту вводили эффективное количество белка Рс-ОВ, его аналога или производного, что приводило к увеличению мышечной массы. Чувствительность больного к инсулину возрастала, и дозировки инсулина, необходимые для снятия симптомов диабета, можно было снизить как в отношении необходимого количества единиц инсулина, так и в отношении количества инъекций инсулина в день. Количество циркулирующего белка белка Рс-ОВ, его аналога или производного можно контролировать с помощью диагностического набора, такого как тест на основе антител к белку ОВ (или другого источника антигена, если это было применимо).

Пример 11.

Не страдающему ожирением пациенту требовалось увеличение мышечной массы в терапевтических целях, в частности в ходе выздоровления от заболевания, приводящего к потере мышечной массы. Пациенту вводили эффективное количество белка Рс-ОВ, его аналога или производного, что приводило к желаемому увеличению мышечной массы. За увеличением мышечной массы следили при помощи ΌΕΧΑсканирования. Количество циркулирующего белка Рс-ОВ, его аналога или производного можно контролировать с помощью диагностического набора, такого как тест на основе антител к белку ОВ (или другого источника антигена, если это было применимо).

Материалы и методы

Животные

В приведенных выше примерах использованы мыши ЭС1 дикого типа и мыши (+/+)С57В16. Возраст мышей в начале эксперимента составлял 8 недель, а их вес был стабилизирован.

Кормление и взвешивание

Мыши получали измельченный корм для грызунов (ΡΜΙ Реебк, Шс.) в кормушках для сухого корма (А11епЮ\уп Сащпд апб Ецшртеп!). Использование такого рациона давало возможность более точных и чувствительных замеров по сравнению с использованием обычного брикетированного корма. Взвешивание проводили в одно и то же время (2 часа дня) ежедневно в течение всего эксперимента. Вес тела за день до инъекции принимали за отправную точку. Вес использованных в экспериментах мышей составлял 18-22 г.

Содержание

Мышей рассаживали по одной в клетки, и их содержание соответствовало гуманитарным нормам.

Введение белка или растворителя

Белок (как описано ниже) или носитель (фосфатный буферный раствор, рН 7,4) вводили подкожными или внутривенными инъекциями. Контроли

Контрольным животным вводили только носитель без слитого белка Рс-ОВ или белка ОВ.

Белок

Последовательности 8ΕΟ.ΙΩ. Νοκ.1, 2 и 3 кодируют рекомбинантные ДНК и белок ОВ мыши (фиг. 1), а последовательности 8ΕΟ.ΙΩ. Νοκ.4, 5 и 6 кодируют аналогичные рекомбинантные ДНК и белок ОВ человека (фиг. 2). Как упоминалось выше, рекомбинантный белок ОВ человека, кодируемый последовательностью 8ΕΟ.ΙΩ. Νο.6, имеет остаток лизина в положении 35 и остаток изолейцина в положении 74. Кроме того, рекомбинантный белок человека описан Ζ1ι;·ιη§ е! а1., №!иге, кирга, и в публикации РСТ \УО 96/05309, (обе работы включены в качестве ссылок, включая рисунки), а мышиный и человеческий аналоги рекомбинантных белков на фиг. 1 и 2 являются примерами белка ОВ, который можно использовать для получения слитого белка Рс-ОВ описанными способами, применяемыми для получения лекарства и для лечения. Для получения слитого белка Рс-ОВ могут быть использованы другие ОВ или Рс белки, их аналоги или производные.

Соответственно, первая аминокислота в аминокислотной последовательности рекомбинантного белка ОВ обозначается как +1 и является валином, а аминокислота в положении -1 метионин. С-терминальная аминокислота имеет номер 146 (цистеин) (см. фиг. 1 и 2). Первая аминокислота в последовательности рекомбинантного белка Ес-ОВ человека на фиг. 3 обозначается как +1 и является глутаматом, а аминокислота в положении -1 является метионином. С-терминальная аминокислота с номером 378 - цистеин. Первая аминокислота в последовательности вариантного рекомбинантного белка Ес-ОВ человека на фиг. 4 обозначается как +1 и является глутаматом, а аминокислота в положении -1 является метионином. С-терминальная аминокислота имеет номер 378 (цистеин). Первая аминокислота в последовательности вариантного рекомбинантного белка Ес-ОВ человека на фиг. 5 обозначается как +1 и является аспарагиновой кислотой, а аминокислота в положении -1 является метионином. С-терминальная аминокислота имеет номер 373 (цистеин). Первая аминокислота в последовательности вариантного рекомбинантного белка Ес-ОВ человека на фиг. 6 обозначается как +1 и является аспарагиновой кислотой, а аминокислота в положении -1 является метионином. С-терминальная аминокислота имеет номер 373 (цистеин).

Вектор экспрессии и штамм-хозяин

Использовали плазмидный вектор экспрессии рЛМС21 (номер доступа в АТСС 98113), который является производным рСЕМ1656 (номер доступа в АТСС 69576) и содержит соответствующие сайты рестрикции для вставки генов ниже промотора 1их РВ (см. патент США № 5,169,318, в котором описана система экспрессии 1их). Была получена ДНК Ес-ОВ, описываемая ниже и показанная на фиг. 3-6, которую лигировали в вектор экспрессии рЛМС21, линеаризованный эндонуклеазами рестрикции №е1 и ВатН1, и полученным лигатом трансформировали клетки-хозяева Е. сой, штамма ЕМ5. Клетки Е.сой ЕМ5 получены в Атдеп 1пс., Тйоикапб Оакк, СА, из штамма Е. сой К-12 (Васйтап, е! а1., Вас1епа1. Веу. 40: 116167 (1976)) и содержат интегрированный ген репрессора фага лямбда с1₈₅₇ (8икктап е! а1., С.В. Асаб. 8οΐ. 254:1517-1579 (1962)). Получение вектора, трансформацию клеток и отбор колоний осуществляли стандартными методами (например, 8атйгоок, е! а1., Мо1еси1аг С1опшд: А БаЬогаЮгу Мапиа1, 2пб Ебйюп, Со1б 8ртшд НагЬог ЬаЬога1огу Ргекк, Со1б 8ртшд НагЬог, Ν.Υ.). Клетки-хозяева выращивали на среде ЕВ.

Конструкция ДНК Ес-ОВ

Плазмида рЕс-А3 (описана ниже) служила источником последовательности тяжелой цепи иммуноглобулина человека 1дС-1 от аминокислоты номер 99 (С1и) до природного карбоксиконца. Последовательность 1дС-1 человека можно получить из СепеЬапк (Р01857).

Последовательность ОВ человека описана выше, а также Ζΐκιοβ е! а1., №Лте, кирга, и в публикации РСТ XVО 96/05309, упоминаемых в качестве ссылок, включая рисунки. ДНК ОВ лигировали в вектор экспрессии рСЕМ1656, линеаризованный эндонуклеазами рестрикции ХЬа1 и ВатН1 с использованием стандартных процедур клонирования, например, 8атЬтоок, е! а1., Мо1еси1аг С1опшд: А ЕаЬогаЮгу Мапиа1, 2пб Ебйюп, Со1б 8рпп§ НагЬог БаЬота1огу Ргекк, Со1б 8ртшд НагЬог, Ν.Υ. Плазмида рСЕМ1656, несущая последовательность ДНК ОВ, служила источником последовательности для рекомбинантного гена ОВ человека.

Генетическое слияние двух данных последовательностей осуществляли методом перекрывающейся полимеразной цепной реакции (ПЦР) (Но, 8.Ν. е! а1., 8йе Э|гес1еб Ми1адеиек1к Ву Оует1ар Еxΐеик^ои Иктд Тйе Ро1утегаке Сйаш Веасйоп, Сепе 77:51-59 (1989)). Продукт ПЦР разрезали эндонуклеазой рестрикции №е1 с получением липкого 5'-конца и эндонуклеазой рестрикции ВатН1 с получением липкого 3'конца. Вектор рАМС21 рестрицировали аналогично. Лигирование проводили со слитым фрагментом и линеаризованным вектором. Лигированной ДНК трансформировали посредством электропорации хозяйский штамм Е. сой. Клоны, выросшие на чашках с агаром (50 мкг/мл), проверяли на экспрессию белка, имеющего размер Ес-ОВ. Выделяли плазмиды из индивидуальных клонов и секвенировали для установления кодирующей области гена.

Когда требовались дополнительные модификации гена Ес-ОВ, для создания таких изменений опять же использовали метод ПЦР. Два набора изменений было осуществлено на Νконце Ес-фрагмента слитого белка (8ЕО.ГО. №.9) с получением вариантов 8ЕО.ГО. №к.12 и 15. Был получен другой вариант с введением четырех аминокислотных замен с тем, чтобы удалить сайт связывания Ес-рецептора (лейцин в положении 15 заменен глутаматом) и сайт связывания комплемента (С1с.|) (глутамат в положении 98 заменен аланином, лизин в положении 100 заменен аланином, и лизин в положении 102 заменен аланином) (см. Хш Х1ао Ζйеид е! а1., 1. 1ттипо1. 154:5590-5600 (1995)). Матрицей для данного конструкта служила 8Ер.ГО. №.15. а полученный вариант был обозначен 8Ер.ГО. Νθ.18.

Конструирование вектора рЕС-А3

Плазмида рЕС-А3, содержащая Есфрагмент тяжелой цепи иммуноглобулина 1дС-1 человека (см. Е1йкоп, ΕΧν. е! а1., ШсШс Ас1бк гек. 10: 4071-44079 (1982)) от первой аминокислоты С1и-99 смыслового домена до карбоксиконца плюс 5Ао11 сайт слияния и 3'-8а11 и ХЬа1 сайты, была получена ПЦР-амплификацией кДНКовой библиотеки селезенки человека. ПЦР проводили в конечном объеме 100 мкл с использованием 2 единиц ДНК полимеразы Уеп1 в 20 мМ Тйк-НС1 (рН 8,8), 10 мМ КС1, 10 мМ ^₄)₂8О₄, 2 мМ М§8О₄, 0,1% Тритон Х-100 с 40 мМ каждого б№ТР и 1 нг кДНКовой библиотеки, которая должна быть амплифицирована, с 1 мкМ каждого праймера. Реакцию начинали с денатурации при 95°С в течение 2 мин, за которой следовали 30 циклов: 95°С 30 с, 55°С 30 с и 73°С 2 мин. 5'-праймер содержал сайт в непосредственной близости к первому 5' остатку (С1ц-99) основного домена 1§С-1. 3'-праймер содержал сайты 8а11 и ХЬа1. Продукт ПЦР размером 717 пар оснований рестрицировали №11 и 8а11, полученный фрагмент ДНК выделяли электрофорезом в 1% агарозе, очищали и клонировали в рестрицированный и 8а11 вектор В1иезсг1р1 II К8 (§1га1адепе). Вставку в полученную плазмиду, рРС-А3, секвенировали для подтверждения надежности ПЦР.

Методы получения

Описанные ниже методы получения были использованы для продукции биологически активного рекомбинантного метионилированного аналога белка ОВ мыши и человека, а также слитых белков Рс-ОВ. Аналогичные методы можно использовать для получения биологически активного метионилированного белка ОВ человека.

Процесс ферментации

Использовали прерывистый процесс ферментации. Состав среды приведен ниже.

Ту часть среды, которая содержала в основном источники азота, стерилизовали (поднятием температуры до 120~123°С на 25-35 мин) в ферментере. После охлаждения асептически добавляли углерод, магний, фосфат и микроэлементы (соли металлов). В ферментер вносили 500 мл ночной культуры (выращенной в ЬВ бульоне) рекомбинантных бактерий, продуцирующих мышиный белок. Когда оптическое поглощение культуры (определенное при 600 нм, оно является показателем плотности культуры) достигало 15-25 единиц поглощения, к культуре добавляли раствор аутоиндуктора (0,5 мг/мл гомосерин лактона) (1 мл/л) для индукции экспрессии рекомбинантного гена. Процесс ферментации продолжали еще 10-16 ч, а затем бульон собирали центрифугированием.

Состав среды:

г/л Дрожжевой экстракт г/л Соевый пептон

0,9 г/л Хлорид калия

5,0 г/л Гексафос

1,7 г/л Лимонная кислота

120 г/л Глицерин

0,5 г/л Мд8О₄-7Н₂О

0,2 мл/л Раствор солей металлов

0,5 мл/л Антивспениватель Р2000

Раствор солей металлов:

Хлорид железа (РеС1₃-6Н₂О) 27 г/л

Хлорид цинка (2пС1₂-4Н₂О) 2 г/л

Хлорид кобальта (СоС1₂-6Н₂О) 2 г/л

Молибдат натрия (ЫаМоО₄-2Н₂О) 2 г/л Хлорид кальция (СаС1₂-2Н₂О) 1 г/л

Сульфат меди (Си8О₄-5Н₂О) 1,9 г/л

Борная кислота (Н₃ВО₃) 0,5 г/л

Хлорид марганца (МпС1₂-4Н₂О) 1,6 г/л

Цитрат натрия безводный 73,5 г/л

Процесс очистки слитого человеческого белка Рс-ОВ

Очистку слитого белка Рс-ОВ человека проводили согласно описанным ниже этапам (все этапы осуществляли при температуре 4°С, если специально не оговорено другое). Очистка белка ОВ мыши и человека описана в публикации РСТ XV О 96/05309, кирга, упоминаемой в качестве ссылки.

1. Клеточная паста. Клеточную пасту Е.сой суспендировали в пятикратном объеме дистиллированной воды. Затем суспенидированные в воде клетки разрушали двукратным пропусканием через микрогомогенизатор. Разрушенные клетки центрифугировали 1 ч при 4,2 тыс.об./мин в центрифуге Весктап 1В-6 с ротором 15-4.2.

2. Промывка телец-включений. Полученный супернатант отбрасывали, а осадок суспендировали в 5 объемах дистиллированной воды. Смесь центрифугировали так же, как на этапе 1.

3. Солюбилизация. Осадок солюбилизировали 10 объемами 50 мМ трис, рН 8,5, 8 М гуанидингидрохлорид, 10 мМ дитиотрейтол и перемешивали 1 ч при комнатной температуре. В раствор добавляли цистамин дигидрохлорид и перемешивали еще 1 ч.

4. Раствор со стадии 3 добавляли к 20-30 объемам следующего раствора для рефолдинга: 50 мМ трис, рН 8,5, 0,8 М аргинина, 2 М мочевина и 4 мМ цистеина. Рефолдинг проводили при помешивании в течение 16 ч при 8°С.

5. Смена буфера. Раствор со стадии 4 концентрировали и подвергали диафильтрации в 10 мМ трис, рН 8,5.

6. Преципитация кислотой. рН раствора со стадии 5 доводили до рН 4,75 50%-ной уксусной кислотой и инкубировали 30 мин при комнатной температуре. Затем раствор фильтровали.

7. Катионобменная хроматография. рН раствора со стадии 6 доводили до рН 7,0 и наносили на колонку СМ 8ерйагоке Рак! Р1о\у при 10°С. Через колонку пропускали 20 объемов градиента от 0 до 0,1 М №1С1 в 10 мМ фосфата, рН 7,0.

8. Анионобменная хроматография. Пул, элюированный с СМ 8ерйагоке на этапе 7, разводили в 5 раз 5 мМ трис, рН 7,5 и наносили на колонку О 8ерйагоке Рак! Р1о\\\ Через колонку пропускали 20 объемов градиента от 0 до 0,2 М №1С1 в 10 мМ трис, рН 7,5.

9. Хроматография гидрофобного взаимодействия. В собранный с О 8ерйагоке пул добавляли сульфат аммония до 0,75 М и наносили на колонку гидрофобного взаимодействия Масгоргер при комнатной температуре. Через колонку пропускали 20 объемов градиента от 0,75 до 0 М сульфата аммония в 10 мМ фосфата, рН 7,0.

10. Смена буфера. При необходимости собранный на этапе 9 пул концентрировали и диализовали против РВ8.

При том, что настоящее изобретение описано в терминах предпочтительных вариантов осуществления, для квалифицированного специалиста очевидно, что возможны определенные изменения и модификации. Поэтому считается, что приведенная ниже формула изобретения включает все подобные эквивалентные вариации, которые входят в объем настоящего изобретения.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Белок с формулой, выбранной из группы К₁-К₂ и Кз-Ь-Ю, где К₁ является белком Ес, его производным или аналогом, К₂ является белком лептином, его производным или аналогом, а Ь представляет собой линкер, причем белок Ес, его производное или аналог выбраны из группы, включающей (а) аминокислотные последовательности Ес, приведенные в 8Еф.ГО. №.9, 12, 15 и 18;

(б) аминокислотные последовательности (а), у которых различные аминокислоты делетированы или заменены в одном или нескольких из следующих положений (с использованием нумерации 8Еф.ГО. №.9):

(ί) один или несколько остатков цистеина заменены остатками аланина или серина;

(ίί) один или несколько остатков тирозина заменены остатком аланина;

(ίίί) аминокислота в положении 5 заменена аланином;

(ίν) аминокислота в положении 20 заменена глутаматом;

(ν) аминокислота в положении 103 заменена аланином;

(νί) аминокислота в положении 105 заменена аланином;

(νίί) аминокислота в положении 107 заменена аланином;

(νίίί) аминокислоты в положениях 1, 2, 3, 4 или 5 делетированы;

(ίχ) для удаления сайта связывания Есрецептора один или несколько остатков заменены или делетированы;

(х) для удаления сайта связывания комплемента (С1с.|) один или несколько остатков заменены или делетированы; и (χί) сочетание компонентов ί-χ;

(в) аминокислотные последовательности (а) или (б) с метионильным остатком на Νконце;

(г) белок Ес, аналог или производное в виде любой из последовательностей от (а) до (в), содержащий химическую часть, присоединенную к белку;

(д) производное белка (г), характеризующееся тем, что указанная химическая часть представляет собой водорастворимый полимер;

(е) производное белка (д), характеризующееся тем, что данный водорастворимый полимер представляет собой полиэтиленгликоль;

(ж) производное белка (д), характеризующееся тем, что данный водорастворимый полимер представляет собой полиаминокислотную часть;

(з) производное белка (д), характеризующееся тем, что указанная химическая часть присоединена исключительно к Ν-концу данного белка;

белок лептин, его аналог или производное выбраны из группы, включающей (а) аминокислотную последовательность 1146, приведенную в 8Еф.ГО. №.3 или 8Еф.ГО. №.6;

(б) аминокислотную последовательность 1-146, приведенную в 8Еф.ГО. №.6, имеющую остаток лизина в положении 35 и остаток изолейцина в положении 74;

(в) аминокислотную последовательность (б), в которой различные аминокислоты заменены в одном или нескольких из следующих положений (с использованием нумерации 8Еф.1Э. №>.6): 4, 32, 33, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 и 145;

(г) аминокислотную последовательность (а), (б) или (в), в которой дополнительно отсутствует глутаминиловый остаток в положении 28;

(д) аминокислотную последовательность (а), (б), (в) или (г), имеющую на Ν-конце метионильный остаток;

(е) усеченный аналог белка лептина, выбранный из следующего (с использованием нумерации 8Ер.ГО. №.6 с остатком лизина в положении 35 и остатком изолейцина в положении 74):

(ί) аминокислоты 98-146;

(ίί) аминокислоты 1-32;

(ίίί) аминокислоты 40-116;

(ίν) аминокислоты 1-99 и 112-146;

(ν) аминокислоты 1-99 и 112-146, имеющие одну или несколько аминокислот 100-111, вставленных между аминокислотами 99 и 112;

(νί) усеченный аналог последовательности (е) (ί), в котором одна или несколько из следующих аминокислот 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 и 145 заменена другой аминокислотой;

(νίί) усеченный аналог последовательности (е) (ίί), в котором одна или несколько из следующих аминокислот 4, 8 и 32 заменена другой аминокислотой;

(νίίί) усеченный аналог последовательности (е) (ίίί), в котором одна или несколько из следующих аминокислот 50, 53, 60, 64, 66, 67,

68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107,

108, 111 и 122 заменена другой аминокислотой;

(ίχ) усеченный аналог последовательности (е) (ίν), в котором одна или несколько из сле35 дующих аминокислот 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 112, 118, 136, 138, 142 и 145 заменена другой аминокислотой;

(х) усеченный аналог последовательности (е) (ν), в котором одна или несколько из следующих аминокислот 4, 32, 33, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 и 145 заменена другой аминокислотой;

(χί) усеченный аналог любой из последовательностей (е) (ί)-(χ), имеющий Νтерминальный метионильный остаток;

(ж) белок лептин, аналог или производное его в виде любого из вариантов от (а) до (е), содержащий химическую часть, присоединенную к белку;

(з) производное белка (ж), характеризующееся тем, что указанная химическая часть представляет собой водорастворимый полимер;

(и) производное белка (з), характеризующееся тем, что данный водорастворимый полимер представляет собой полиэтиленгликоль;

(к) производное белка (з), характеризующееся тем, что данный водорастворимый полимер представляет собой полиаминокислотную часть;

(л) производное любого из белков от (з) до (к), характеризующееся тем, что указанная химическая часть присоединена исключительно к Ν-концу данного белка;

причем линкер выбран из группы, включающей (а) а1а, а1а, а1а;

(б) а1а, а1а, а1а, а1а;

(в) а1а, а1а, а1а, а1а, а1а;

(г) §1у, §1у;

(д) §1у, §1у, §1у;

(ж) д1у, д1у, д1у, §1у, д1у;

(з) §1у, §1у, §1у, §1у, §1у, §1у, §1у;

(и) д1у-рго-д1у;

(к) д1у, д1у, рго, д1у, д1у;

(л) химические группы и (м) любые комбинации с (а) до (л).
2. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая белок с формулой В1-В2 или В1-Ь-В₂, где В1 является белком Гс, его производным или аналогом, В₂ является белком лептином, его производным или аналогом, а Ь представляет собой линкер, у которой белок Гс, его производное или аналог выбраны из группы, включающей (а) аминокислотные последовательности Гс, приведенные в 8Ер.ГО. №.9, 12, 15 и 18;

(б) аминокислотные последовательности (а), у которых различные аминокислоты делетированы или заменены в одном или нескольких из следующих положений (с использованием нумерации 8Е0.Ю. №.9):

(ί) один или несколько остатков цистеина заменены остатками аланина или серина;

(ίί) один или несколько остатков тирозина заменены остатком аланина;

(ίίί) аминокислота в положении 5 заменена аланином;

(ίν) аминокислота в положении 20 заменена глутаматом;

(ν) аминокислота в положении 103 заменена аланином;

(νί) аминокислота в положении 105 заменена аланином;

(νίί) аминокислота в положении 107 заменена аланином;

(νίίί) аминокислоты в положениях 1, 2, 3, 4 или 5 делетированы;

(ίχ) для удаления сайта связывания Гсрецептора один или несколько остатков заменены или делетированы;

(х) для удаления сайта связывания комплемента (С1с.|) один или несколько остатков заменены или делетированы; и (χί) сочетание компонентов ί-χ;

(в) аминокислотные последовательности (а) или (б) с метионильным остатком на Νконце;

(г) белок Гс, аналог или производное в виде любой из последовательностей от (а) до (в), содержащий химическую часть, присоединенную к белку;

(д) производное белка (г), характеризующееся тем, что указанная химическая часть представляет собой водорастворимый полимер;

(е) производное белка (д), характеризующееся тем, что данный водорастворимый полимер представляет собой полиэтиленгликоль;

(ж) производное белка (д), характеризующееся тем, что данный водорастворимый полимер представляет собой полиаминокислотную часть;

(з) производное белка (д), характеризующееся тем, что указанная химическая часть присоединена исключительно к Ν-концу данного белка;

белок лептин, его производное или аналог выбраны из группы, включающей (а) аминокислотную последовательность 1146, приведенную в 8Е0.Ю. Νθ.3 или 8Е0.Ю. №.6;

(б) аминокислотную последовательность 1-146, приведенную в 8Е0.Ю. №.6, имеющую остаток лизина в положении 35 и остаток изолейцина в положении 74;

(в) аминокислотную последовательность (б) , в которой различные аминокислоты заменены в одном или нескольких из следующих положений (с использованием нумерации 8Ер.Ш. Νθ.6): 4, 32, 33, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 и 145;

(г) аминокислотную последовательность (а), (б) или (в), в которой дополнительно отсутствует глутаминиловый остаток в положении 28;

(д) аминокислотную последовательность (а), (б), (в) или (г), имеющую на Ν-конце метионильный остаток;

(е) усеченный аналог белка лептина, выбранный из следующего (с использованием нумерации ЗЕЦ.ГО. Νο.6 с остатком лизина в положении 35 и остатком изолейцина в положении 74):

(ί) аминокислоты 98-146;

(ίί) аминокислоты 1-32;

(ίίί) аминокислоты 40-116;

(ίν) аминокислоты 1-99 и 112-146;

(ν) аминокислоты 1-99 и 112-146, имеющие одну или несколько аминокислот 100-111, вставленных между аминокислотами 99 и 112;

(νί) усеченный аналог последовательности (е) (ί), в котором одна или несколько из следующих аминокислот 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 и 145 заменена другой аминокислотой;

(νίί) усеченный аналог последовательности (е) (ίί), в котором одна или несколько из следующих аминокислот 4, 8 и 32 заменена другой аминокислотой;

(νίίί) усеченный аналог последовательности (е) (ίίί), в котором одна или несколько из следующих аминокислот 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111 и 122 заменена другой аминокислотой;

(ίχ) усеченный аналог последовательности (е) (ίν), в котором одна или несколько из следующих аминокислот 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 112, 118, 136, 138, 142 и 145 заменена другой аминокислотой;

(х) усеченный аналог последовательности (е) (ν), в котором одна или несколько из следующих аминокислот 4, 32, 33, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 и 145 заменена другой аминокислотой;

(χί) усеченный аналог любой из последовательностей (е) (ί)-(χ), имеющий Ν-терминальный метионильный остаток;

(ж) белок лептин, аналог или производное его в виде любого из вариантов от (а) до (е), содержащий химическую часть, присоединенную к белку;

(з) производное белка (ж), характеризующееся тем, что химическая часть представляет собой водорастворимый полимер;

(и) производное белка (з), характеризующееся тем, что данный водорастворимый полимер представляет собой полиэтиленгликоль;

тстасатттсасттттласттттасаассассаатаасататсстасссатссасаааст

9 ---------+---------+---------₊---------+---------₊ 68

АСАТСТАААСТСААААТТСААААТСТТССТССТТАТТСТАТАССАТСССТАССТСТТТСА

М V Р I О К V ТСАССАССАСАССААААССТТААТТААААССАТССТТАССССТАТСААССАСАТСАСТСА

69 - +---------+.......-- +---------+---------+---------+ 128

АСТССТССТСТССТТТТСОААТТААТТТТССТАССААТССССАТАСТТССТаТАСТСАСТ

ΟϋΟΤΚΤΕΙΚΤίνΤΗΙΝΟίεΗСАСССАСТСССТСТССССТАААСАСССТСТТАССССТСТССАСТТСАТССССССТСТССА

129 - +---------+......··-- +.........+---------+ --.....--1 188

СТаССТСАСССАСАСаССАТТТСТСССАСААТССССАСАССТСААбТАССССССАСЛССТ

ΤΟδνδΑΚΰ&νΤΟΕΟΓΙ Р С I. н ССССАТССТААССТТСТССААДАТССАССАСАСССТСССТОТАТАССАССАССТСТТААС

189 - +---------+---------+---------+---------*---------+ 248

ССССТАССАТТССААСАССТТТТАССТССТСТаСОАСССАСАТАТССТССТССАСААТТС

ΡΙ1, ЗЬЗКМЭОТЬАУУООУЬТФиг. 1А (к) производное белка (з), характеризующееся тем, что данный водорастворимый полимер представляет собой полиаминокислотную часть;

(л) производное любого из белков от (з) до (к), характеризующееся тем, что данная часть присоединена исключительно к Ν-концу данного белка;

причем линкер выбран из группы, включающей (а) а1а, а1а, а1а;

(б) а1а, а1а, а1а, а1а;

(в) а1а, а1а, а1а, а1а, а1а;

(г) §1у, §1у;

(д) §1у, §1у, §1у;

(ж) д1у, д1у, §1у, д1у, д1у;

(з) §1у, §1у, §1у, §1у, §1у, §1у, §1у;

(и) §1у-рто-§1у;

(к) д1у, д1у, рго, д1у, д1у;

(л) химические группы; и (м) любые комбинации с (а) до (л).
3. Вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты по п.2.
4. Вектор по п.3, отличающийся тем, что вектор является рЛМО21, а последовательность нуклеиновой кислоты соответствует п.2.
5. Прокариотическая или эукариотическая клетка-хозяин, содержащая вектор по п.3.
6. Способ получения белка по п.1, включающий этапы культивирования в соответствующих условиях клетки-хозяина по п.5 и выделения продуцируемого белка.
7. Способ по п.6, включающий дополнительно этап очистки продуцируемого белка.
8. Фармацевтическая композиция, содержащая эффективное количество белка по п.1 в фармацевтически приемлемом растворителе, адъюванте или носителе.
9. Способ лечения расстройств, выбранных из группы, включающей избыточный вес, диабет, высокий уровень липидов крови, атеросклероз, артериальные бляшки, предотвращение или снижение образования желчных камней, недостаточную массу тела, недостаточную чувствительность к инсулину и инсульт, отличающийся введением терапевтически эффективного количества белка по п.1.