EA008598B1

EA008598B1 - Применение микроорганизмов для биологической детоксикации микотоксинов, а именно охратоксинов и/или зеараленонов

Info

Publication number: EA008598B1
Application number: EA200400836A
Authority: EA
Inventors: Герд Шатцмайр; Диан Хайдлер; Элизабет Фукс; Эва-Мария Биндер
Original assignee: Эрбер Акциенгезелльшафт
Priority date: 2001-12-20
Filing date: 2002-12-19
Publication date: 2007-06-29
Also published as: PL368742A1; CA2467392A1; HU229086B1; EP1455595B1; NO20033664L; AT413540B; TW200302053A; ZA200403653B; BR0207398B1; IL161847A0; BR0207398A; IL161847A; US8119172B2; US20040208956A1; US20090098244A1; SI1455595T1; AU2002363819A1; PL207048B1; EA200400836A1; DE50212242D1

Abstract

Данное изобретение относится к микроорганизму для биологической инактивации или детоксикации микотоксинов, а именно охратоксинов и/или зеараленонов, выбранному из бактерий или дрожжей и отщепляющему фенилаланиновую группу охратоксинов или расщепляющему зеараленоны, а также к способу биологической инактивации или детоксикации микотоксинов, а именно охратоксинов и/или зеараленонов, в пищевых и кормовых продуктах микроорганизмом и к применению этого микроорганизма (этих микроорганизмов).

Description

Данное изобретение относится к микроорганизму для биологической детоксикации микотоксинов, а именно охратоксинов и/или зеараленонов, а также к способу биологической детоксикации микотоксинов, а именно охратоксинов и/или зеарелононов, в пищевых и кормовых продуктах по меньшей мере с одним микроорганизмом, а также к применению бактерий и/или дрожжей для детоксикации охратоксинов и/или зеараленонов в пищевых или кормовых продуктах.

Микотоксины представляют собой природные, вторичные продукты обмена веществ плесневых грибков, которые во всем мире поражают сельскохозяйственные продукты и уже в небольших количествах вызывают токсическое действие. Поражение сельскохозяйственных продуктов микотоксинами наносит крайне большой ущерб и, далее, вызывает микотоксикозы у людей и животных, которые имеют отчасти драматичные последствия. Из-за высоких сельскохозяйственных потерь, а также поражения людей и животных микотоксинами и вызываемыми микотоксинами микотоксикозами уже с давних пор велись поиски средств против загрязнения микотоксинами, причем из литературы известны, в принципе, два способа. Согласно первому способу пытаются предотвратить рост слизевых грибков на пищевых или кормовых продуктах, благодаря чему предотвращается одновременно продуцирование микотоксинов. Второй способ пытается дополнительно разрушить микотоксины или дезактивировать пищевые и/или кормовые продукты.

Так, например, в ΧνΟ 91/13555 описаны кормовая добавка, а также способ инактивации микотоксинов, согласно которому к корму добавляют частицы филлосиликатного минерала для инактивации микотоксинов. Для усиления действия этих филлосиликатов частицы покрыты комплексообразующим веществом для ускорения действия. Далее, из XVО 92/05706 стало известно кормовое средство, в котором в качестве кормовой добавки содержится монтмориллонитовая глина. Эти природные глинистые минералы с более высокими внутренними поверхностями должны благодаря пористости поверхностно связывать и таким образом иммобилизировать микотоксины.

Далее, из австрийской полезной модели АТ-и 504 известна кормовая добавка, содержащая ферментный препарат, способный образовывать эпоксидазы и лактоназы и разрушать микотоксины химическим путем как в кормовом продукте, так и в желудочно-кишечном тракте животных. Согласно АТ-И 504 действие этого ферментного препарата может усиливаться добавлением цеолитов и подобных им веществ.

Добавлением связывающих микотоксины средств к кормовым продуктам, которые в ходе пищеварения непосредственно в пищеварительном тракте связываются с микотоксинами, можно свести до минимума действие токсинов в промышленном животноводстве. Наряду с вышеупомянутыми возможностями к применяемым веществам причисляют люцерну посевную, бентонит, цеолит, глины, активированный уголь, гидрированные натрий-кальций-алюмосиликаты, филлосиликаты и клеточные стенки дрожжей или бактерий (И8 5165946; νθ 99/57994; И8 6045834; ЕР 0721741; И8 5165946; И8 5935623; νθ 98/34503; νθ 00/41806). Связывание токсинов с этими материалами зависит от структурных свойств токсинов. Таким образом, до настоящего времени еще не найден ни один эффективный связывающий микотоксины агент для Тпс1ю111ссспс. Следующим недостатком связывающих агентов микотоксинов является то, что они наряду с токсинами могут адсорбировать из кормовых продуктов также важные питательные вещества, такие как витамины или антибиотики.

Недавно было установлено, что микотоксины могут разрушаться микроорганизмами и тем самым частично дезактивироваться. Пример детоксикации микотоксинов, в частности Тпс1ю111ссспс. приводится в АТ-В 406166, в котором депонирована специальная чистая культура одного принадлежащего к роду ЕиЬас1етшт микроорганизма, депонированная под номером Ό8Μ 11798, а также смешанная культура рода ЕиЬас1етшт с одним Еп1етососсик, депонированная под номером 11799, которые дезактивируют ТпсНоШесепе расщеплением присутствующего на ТпсНоШесепе эпоксидного кольца.

Детоксикация охратоксинов ферментативным гидролизом уже была описана Μ.1. ΡίΙοιιΙ: Т1е Нуйго1у818 о£ осЬта!охш А Ьу коте рто1ео1уйс епхутек, ВюсНет. Р1агтасо1. 18, 485-491 (1969).

Задачей данного изобретения является поиск специальных микроорганизмов, а также их смешанных и чистых культур и их комбинаций, использование которых целенаправленно разрушает микотоксины, а именно охратоксины и/или зеараленоны, и превращает их в физиологически не вызывающие опасений, и в частности не вызывающие опасений в кормовой и пищевой промышленности, вещества.

Поставленная задача решается согласно изобретению микроорганизмом вышеупомянутого вида, в основном, отличающимся тем, что применяется микроорганизм, в частности аэробные или анаэробные детоксицирующие бактерии или дрожжи, который или которые отщепляют фенилаланиновую группу охратоксинов или расщепляют зеараленоны, причем детоксицирующие микроорганизм бактерии выбраны из родов 8рЫпдотопак, 81епо1торйотопак, ОсЬтаЬасйит, К.а1к1оша и/или ЕиЬас1етшт и/или детоксицирующих дрожжей из родов Тйсйокротоп, Стур1ососсик и/или Вйобо1ош1а. Благодаря тому, что применяют микроорганизм, в частности аэробные или анаэробные детоксицирующие бактерии или дрожжи, который или которые отщепляют фенилаланиновую группу охратоксинов или расщепляют зеараленоны, удается превратить охратоксины, в частности охратоксин А или охратоксин В, в такие метаболиты, у которых отсутствуют фенилаланиновые группы и поэтому уже не проявляется токсическое действие охратоксинов. Эта метаболизация охратоксинов осуществляется ферментом, подобным карбоксипептидазе А, который расщепляет непосредственно амидную связь охратоксина, или также мультиферментным ком

- 1 008598 плексом, при помощи которого кольцо фенилаланина гидроксилируется и в дальнейшем расщепляется и декструктируется. В конце концов, оставшийся аспартам расщепляется, вследствие чего образуется нетоксичный метаболит охратоксинов. Этот путь в простом виде может быть представлен следующим образом.

С помощью микроорганизмов данного изобретения, выбранных из бактерий и/или дрожжей, наряду с детоксикацией охратоксина А и охратоксина В, удается обеспечить также детоксикацию метаболитов 4К-гидроксиохратоксина А, 43-гидроксиохратоксина А, охратоксина С, метилового эфира охратоксина А, метилового эфира охратоксина В и этилового эфира охратоксина В. Далее, с помощью этих микроорганизмов удается осуществить расщепление и тем самым детоксикацию зеараленонов.

Особое значение имеет тот факт, что в соответствии с изобретением в качестве микроорганизмов могут использоваться как аэробные, так и анаэробные детоксицирующие бактерии или дрожжи, так как при приеме внутрь контаминированных соответствующими микроорганизмами пищевых и/или кормовых продуктов может достигаться также детоксикация после приема пищевых и/или кормовых продуктов. При этом такая детоксикация является возможной на любой стадии или в любом участке прохождения пищевого или кормового продукта в желудочно-кишечном тракте, так как каждый раз могут целенаправленно использоваться соответствующие микроорганизмы или их комбинации. Как известно, условия в желудочно-кишечном тракте от желудка до толстой кишки являются большей частью анаэробными, что означает, что окислительно-восстановительный потенциал все больше снижается, так что после приема внутрь контаминированных соответствующими микотоксинами, или охратоксинами, и/или зеараленонами пищевых и/или кормовых продуктов детоксикация может начинаться сначала аэробными бактериями и/или дрожжами, а в конце процесса пищеварения или если пищевой или кормовой продукт уже находится в отделе кишечника, в котором преобладают анаэробные условия, детоксикация может проводиться соответствующими анаэробными бактериями.

Особенно полная детоксикация микотоксинов, а именно охратоксинов и/или зеараленонов, удается, если в качестве микроорганизма применяют детоксицирующие бактерии, выбранные из родов ЗрЫидошоиак, 81епо1торйотопаз, ОсйтаЬасйит, Ка1з1оша и/или ЕиЬас1епит, и/или детоксицирующие дрожжи, выбранные из родов Тпсйозротоп, Стур1ососсиз и/или Кйойо1ош1а. Среди этих полностью детоксицирующих бактерий и/или дрожжей особенно эффективными оказались детоксицирующие бактерии, выбранные из ЗрЫпдотоиак зр. Ό3Μ 14170 и Ό3Μ 14167, 31епо1торйотоиа8 иНтИгейисеиз Ό3Μ 14168, 31епо1торйотоиа8 8р. Ό3Μ 14169, Ка1з1оша еШгорНа Ό3Μ 14171 и/или ЕиЬас1епит зр. Ό3Μ 14197, а также детоксицирующие дрожжи, выбранные из Тпсйозротоп зрес, поу. Ό8Μ 14153, Стур1ососсиз зр. Ό8Μ 14154, Кйойо1оти1а уагго\\'Н Ό8Μ 14155, ТпсНозрогоп тисоДез Ό8Μ 14156 и ТпсНозрогоп йи1сйит Ό8Μ 14162, поскольку они обеспечивают не только полное расщепление микотоксинов, но, кроме того, могут без опасений применяться в пищевых и кормовых продуктах, что не обязательно имеет место в случае множества других расщепляющих или разрушающих микотоксины бактерий и дрожжей.

Среди других, также способных разрушать микотоксины бактерий или дрожжей успешно применяются названные далее бактерии и дрожжи, причем они могут использоваться в среде или буфере или проявляют активность как в среде, так и в буфере.

Штамм	Происхождение	Разрушение в.~ .
среде	буфере
Рзеийошопаз сераста	Воден	60%	100%
ОсНгоЬасЕгиш	Войеп/Иаззег	100%	100%
АсЬготоЬасЕег	Войеп/йаззег	50%	100%
Ка1зЕоп1а	Водеп/йаззег	100%	100%
ЗЕепоЕгорНопюпаз	Водеп/йаззег	100%	100% .
КЪойососсиз егуЕЬгороИз	ϋ3Μ 1069	75%	90%
АдгоЬасЕегтит зр.	ϋ3Μ 30201	20-100%	60-100%
АдгоЬас£ег1ит Еите£ас1епз	ϋ3Μ 9674	25-40%	0-60%
Рзеийотопаз риЫйа	АТСС 700007	10-50%	0%
Сототопаз ас1с1оуогапз	АТСС 11299а	20-57%	0-50%
Азсотусе£еп-Не£е	НА 168	95%	40%
СгурЕососсиз £1ауиз	НВ 402	90%	100%
ЕУ1оВо£оги1а тисИадЕпоза	НВ 403	20%	0%
СгурЕососсиз 1аигеп£И	НВ 404	50%	0%
ипЬекаппЕ	НВ 508	30%	30%

- 2 008598

Штамм	Происхождение	Разрушение в
среде	буфере
ТгдсЬозрогоп зрес.поу.	НВ 704	40%	40%
ипЬекапгй	НВ 529	100%	95%
Аз осошусе £ еп-Не £ е	НА 1265	90%	0%
Азосогаусе£еп~Не£е	НА 1322	0%	95%
Тг1с1юзрогоп ονοίάββ	НВ 519	100%	90%
Тгхозрогоп йи1с1Рит	НВ 523	100%	100%
КЬос1о1:оги1а £и]1запепз1з	НВ 711	30%	0%
Сгурбососсиз сигуакиз	НВ 782	20%	95%
Тгд.с1юзрогоп диейоае	НВ 892	50%	20%
тгхсЬозр. согет11£огте	НВ 896	40%	20%
ТгхсЬозрогоп гаисоШез	НВ 900	100%	100%
Тг1сЬозрогоп сиЬапешп	АТСС 46446	0%	70%
Тг1с110зрогоп с1и1с1£и1П	АТСС 90777	0%	100%
Тг1с1юзрогоп 1а1Ьас1111	АТСС 90778	0%	100%
Тг1с1гозрогоп ιηοηϊ1ΐί£οπηβ	АТСС 90779	0%	60%
Сгурбососсиз Ьшп1со1из	АТСС 90770	0%	30%
ЕиЬасЬегхиш зр.	Еб	30-70%	100%
ЕиЬас£ег1шп са11ап0ег!	ϋϊ1_8	90%	100%
ЗГгерГососсиз зр.	Ώϋ2_20		40-70%
ЬасЬоЬасШиз узЛиНпиз	Ки8		0-100%
ЗЬепоЕгорНошопаз п!£гП:ге«Зисепз	Ό3Μ 17575	100%	100%
ЗЬепоЕгорИошопаз пдЪггРгейисепз	ΏΞΜ 17576	50%	100%
Збепобгоркошопаз зр.	ОЗМ 13117	50%	95%

Предпочтительным в соответствии с наиболее предпочтительным вариантом данного изобретения является то, что бактерии и/или дрожжи стабилизированны, в частности, лиофилизацией, распылительной сушкой или микрокапсулированием. В результате стабилизации микроорганизмов их жизнеспособность улучшается и продолжительность жизни повышается, и, кроме того, они являются в стабилизированном состоянии универсально пригодными и тем самым пригодными при любом применении в любое время. Стабилизация посредством лиофилизации, распылительной сушки или микрокапсулирования сама по себе известна, причем эти способы являются простыми, и быстроосуществимыми, и обеспечивающими стабильные жизнеспособные микроорганизмы.

Согласно одному из вариантов данного изобретения бактерии или дрожжи применяются в виде бесклеточного экстракта или неочищенного экстракта. При этом при применении бесклеточного экстракта бактерий или дрожжей экстракт используют в растворе, в частности в водном растворе. Водные растворы бесклеточного экстракта обладают преимуществом, а именно посредством разбрызгивания на подлежащие обработке пищевые или кормовые продукты непосредственно на поверхности приводятся в контакт с контаминирующими микотоксинами, и детоксикация может достигаться уже немедленно после разбрызгивания экстракта. Применение неочищенного экстракта из бактерий и дрожжей, который получают при помощи ультразвука, ферментативного разрушения, комбинации шокового замораживания и оттаивания, проточного гомогенизатора, Френч-пресса, автолиза при высоких концентрациях №1С1 и/или шаровой мельницы, имеет преимущество, заключающееся в том, что подобный неочищенный экстракт может быть получен особенно быстро и без проблем, в частности, в тех случаях, когда требуется быстрое применение детоксицирующих или разрушающих микотоксины веществ, применение неочищенного экстракта дает быстрые и надежные результаты. Кроме того, неочищенные экстракты могут применяться непосредственно при приготовлении кормовых средств, так что смешанные с микроорганизмами кормовые продукты потребляются животными и микроорганизмы, в частности дрожжи или бактерии, прояв

- 3 008598 ляют действие лишь в пищеварительном тракте животного. В этой связи согласно изобретению может применяться также смесь, содержащая неочищенный экстракт различных детоксицирующих бактерий и/или дрожжей.

Применение микроорганизмов в незабуференном или забуференном растворе, содержащем фосфатный или Трис-гидрохлоридный буфер с показателями рН между 1 и 12, в частности между 2 и 8, как это соответствует предпочтительной форме осуществления изобретения, обеспечивает преимущество, заключающееся в том, что микроорганизмы могут потребляться непосредственно с пищевыми или кормовыми продуктами и проявлять действие в желудочно-кишечном тракте в отделах, где окислительновосстановительный потенциал пригоден для оптимального действия применяемых микроорганизмов. Посредством применения забуференного раствора обеспечивается непосредственная адаптация к существующим в каждом отдельном случае показателям рН в желудочно-кишечном тракте, так что смешанные с забуференным раствором микроорганизмов пищевые или вкусовые вещества не вызывают смещения или нарушения показателя рН, имеющего место в желудочно-кишечном тракте, что, с одной стороны, способствует легкому перевариванию смешанных пищевых или кормовых продуктов, а, с другой стороны, не приводит к нарушению переваривания в желудочно-кишечном тракте.

Следующей задачей данного изобретения является обеспечение веществ или микроорганизмов, которые могут быть использованы для детоксикации пищевых или вкусовых продуктов, не вызывая повреждения или отрицательного влияния на живые существа и не подвергая обрабатываемые ими пищевые или вкусовые продукты, наряду с детоксикацией микотоксинов, которые присутствуют на этих пищевых или вкусовых продуктах, каким-либо отрицательным действиям или изменениям.

Для решения этих задач согласно изобретению было установлено, что применение бактерий, выбранных из 8рЫидотоиа5 5р. Ό8Μ 14170 и Ό8Μ 14167, 81спо1гор1ютопа5 Ш1п1гебисеи5 Ό8Μ 14168, 81спо1гор1ютопа5 5р. Ό8Μ 14169, Ва151оша еи1горйа Ό8Μ 14171 и/или ЕиЬас1егшт 5р. Ό8Μ 14197, и/или дрожжей, выбранных из Тпс1ю5рогоп 5рсс. поу. Ό8Μ 14153, Сгур1ососси5 5р. Ό8Μ 14154, В1юбоЮ1оги1а уагготеи Ό8Μ 14155, Тпс1ю5рогоп тисоШс5 Ό8Μ 14156 и Тпс1ю5рогоп би1сйит Ό8Μ 14162, позволяет детоксицировать находящиеся на поверхности пищевых или кормовых продуктов микотоксины, а именно охратоксины, отщеплением группы фенилаланина или расщеплять зеараленоны без какого-либо отрицательного действия или влияния на обрабатываемые пищевые или кормовые продукты.

Особенно предпочтительным для этой цели оказалось применение Тпс1ю5рогоп 5рес. поу. Ό8Μ 14153, ЕиЬас1егшт 5р. Ό8Μ 14197 или 81спо1гор1ютопа5 Ш1п1гебисеп5 Ό8Μ 14168, которые обеспечивают особенно полное разрушение микотоксинов, а именно охратоксинов и/или зеараленонов, и в отношении которых не существует никаких опасений.

Для достижения особенно экономичной детоксикации микотоксинов, в частности, в пищевых или кормовых продуктах применяют смешанные культуры или комбинации нескольких бактерий и/или дрожжей для детоксикации охратоксинов и/или зеараленонов в пищевых и/или кормовых продуктах.

Следующей задачей данного изобретения является способ биологической детоксикации микотоксинов, а именно охратоксинов и/или зеараленонов, в пищевых и кормовых продуктах с помощью микроорганизма, обеспечивающего быструю и полную дезактивацию контаминирующих токсинов непосредственно после контактирования с пищевым или кормовым продуктом или в пищеварительном тракте принимающего эти пищевые или кормовые продукты живого организма.

Поставленная задача решается способом данного изобретения, по существу, отличающегося тем, что микроорганизм согласно изобретению, в частности бактерии и/или дрожжи данного изобретения, смешивают с пищевым или кормовым продуктом в количестве 0,01-1 мас.%, в частности 0,05-0,5 мас.%. Путем смешивания в твердой форме пищевого или кормового продукта с микроорганизмом данного изобретения, в частности бактериями или дрожжами данного изобретения, можно получить стабильную форму пищевых или кормовых продуктов, смешанных с соответствующим образом стабилизированным микроорганизмом. При потреблении подобного пищевого или кормового продукта, смешанного с микроорганизмом согласно изобретению, в ходе воздействия слюны происходит образование суспензии и детоксикация пищевого или кормового продукта; в частности, распад охратоксинов начинается непосредственно после приема внутрь пищевого или кормового продукта человеком или животным. Таким путем удается полностью разрушить вредные микотоксины, а именно охратоксины и/или зеараленоны, в желудочно-кишечном тракте принимающего эту смесь живого организма, так что этот организм совершенно не обременяется вредными микотоксинами.

Если требуется прием внутрь уже детоксицированного пищевого или кормового продукта, то согласно предпочтительному варианту изобретения проводят смешивание пищевого или кормового продукта посредством перемешивания микроорганизма в водной суспензии, содержащей 20-99 мас.%, в частности 35-85 мас.% воды, при температурах 10-60°С, в частности 15-45°С, в течение 2 мин-12 ч, в частности 5 мин-2 ч. Благодаря тому, что пищевой или кормовой продукт обрабатываются посредством перемешивания в водной суспензии микроорганизма, обеспечивается, с одной стороны, тесный контакт обрабатываемого пищевого или кормового продукта с детоксицирующими микроорганизмами, а, с другой стороны, щадящая обработка микроорганизмов, благодаря чему гарантируется, что микроорганизмы посредством смешивания с пищевым или кормовым продуктом не ухудшаются или не гибнут. При сме

- 4 008598 шивании особенно важно, чтобы температуры смешивания не были ни слишком высокими, ни слишком низкими и чтобы продолжительность и состав взвеси или суспензии соблюдались в соответствии с данным изобретением, чтобы с уверенностью исключить разрушение или гибель микроорганизмов.

Далее данное изобретение поясняется более подробно примерами, относящимися к выделению микроорганизмов и их действию.

1. Выращивание, получение и извлечение дрожжей Тпсйозрогиш зрес. ηον. (Ό8Μ 14153).

Для выращивания дрожжей применяют следующий культуральный раствор:

г дрожжевого экстракта г солодового экстракта г глюкозы г пептона

400 м.д. охратоксина А л К.О-воды

Показатель рН 5,5

Этот раствор обрабатывают в течение 25 мин при 121°С в автоклаве. В колбу Эрленмейера объемом 100 мл помещают 30 мл предварительной культуры (коэффициент инокулята 0,33%). Инкубацию проводят в течение 72 ч при 25°С на качалке. Получаемое количество микроорганизмов составляет приблизительно 5х10⁷/мл.

После этого эти 30 мл предварительной культуры служат в качестве инокулята для ферментации в ферментере на 75 л. Для этой ферментации применяют следующую среду для культивирования:

Солодовый экстракт 4 г/л

Дрожжевой экстракт 10 г/л

Пептон 5 г/л

Глюкоза 10 г/л

Противовспенивающее средство 0,1%

Показатель рН 5,5

В качестве дополнительных параметров устанавливают рО₂ 40% и максимальную скорость аэрации 3 м^{2 3}/ч. Показатель рН в начале ферментации составляет 5,00, но изменяется в ходе процесса роста (он повышается до 8,5). Спустя приблизительно 40-44 ч содержимое используют в качестве инокулята для производственного ферментера 3,6 м³. Для этого ферментера применяют следующую среду:

Солодовый экстракт 17 г/л

Дрожжевой экстракт 5 г/л

Пептон 2 г/л

Противовспенивающее средство 0,1%

Скорость аэрации составляет 15 м³ воздуха в час. Спустя 40-48 ч клетки могут концентрироваться с использованием проточного сепаратора. При помощи сепаратора ферментационный бульон может концентрироваться приблизительно 1:10, причем получают количество микроорганизмов приблизительно 3х10⁹/мл.

Последующую стабилизацию осуществляют при помощи лиофилизации или распылительной сушки. В качестве криопротектора для лиофилизации служит сухая молочная сыворотка.

Ее добавляют в количестве 10% в расчете на объем концентрата. Сразу же после этого концентрат замораживают при -80°С. Лиофилизацию проводят при давлении 0,400 мбар, при регулируемой температуре поверхности 20°С. Продолжительность составляет приблизительно 30 ч при толщине слоя 1,5 см.

Параметры распылительной сушки:

Температура на входе сушильного агента (воздух) 160°С

Температура на выходе 80°С

Давление 3 бар

2. Выращивание, получение и извлечение бактерии §1епо1торйошопа5 пйтйтебисепз (Ό8Μ 14168).

Выращивание этой бактерии происходит в питательном бульоне, 1 раз в ОхоИ СМ 001 В и второй раз в СМ067 В с 400 б.д. охратоксина А. 30 мл среды автоклавируют в колбах Эрленмейера объемом 100 мл в течение 25 мин при 121°С. В качестве инокулята служит 1,5 мл трубки из Банка рабочих клеток. Инкубацию проводят в течение 72 ч при 30°С на качалке.

Пептон из мяса 5 г/л

Мясной экстракт 3 г/л

Противовспенивающее средство 0,1%

- 5 008598

В качестве дополнительных параметров устанавливают рО₂ 40% и максимальную скорость аэрации 3 м³/ч. Скорость смесителя составляет 200 об./мин. Показатель рН в начале ферментации составляет 6,86,9, но изменяется в ходе процесса роста, он повышается до 8,3. Спустя приблизительно 40-44 ч содержимое используют в качестве инокулята для производственного ферментера 3,6 м³. Для этого ферменте ра применяют следующую среду:

Соевая мука 17 г/л

Дрожжевой экстракт 5 г/л

Пептион 2 г/л

Противовспенивающее средство 0,1%

Скорость аэрации устанавливают на 15 м³ воздуха в час. Скорость смесителя составляет 250 об./мин.

Спустя 40-48 ч клетки могут концентрироваться с использованием проточного сепаратора. Отношение концентрирования составляет приблизительно 1:100.

Ее добавляют максимально в количестве 10% в расчете на объем концентрата. Сразу же после этого концентрат замораживают при -80°С (10 ч) или с использованием жидкого азота (2 ч). Лиофилизацию проводят при давлении 0,400 мбар, при регулируемой температуре поверхности 20°С. Продолжительность составляет приблизительно 30 ч при толщине слоя 1,5 см.

Параметры распылительной сушки:
Температура на входе сушильного агента (воздух)	160°С
Температура на выходе	80°С
Давление	3 бар
3. Выращивание, получение и извлечение бактерии ЕиЬас1егшт 5р. (Ό8Μ 14197)
Для выращивания этой анаэробной бактерии используют следующую среду:
Э-(+)-глюкоза	4 г/л
Пептон из казеина	2 г/л
Дрожжевой экстракт	2 г/л
Раствор минеральных веществ I [КН₂РО₄ 6 г/л]	75 мл/л
Раствор минеральных веществ II [К₂НРО₄ 6 г/л;
(N11₄)АО.\| 6 г/л; ХаС1 12 г/л; ΜΑΟΑΙΓΟ 2,5 г/л;
СаС12-2Н2О 3 г/л]	75 мл/л
Гемин	1 мг/л
Смесь жирных кислот	3,1 мл/л
Цистеин-НС1	0,5 г/л
Резазурин	1 мг/л
Охратоксин А	400 м.д.
рН	6,9

Выращивание происходит в емкостях объемом 100 мл из пирекса с силиконовой перегородкой. 80 мл автоклавированной среды наливают и смешивают с КН₂РО₄/Ыа₂НРО₄-буфером (рН 7). После добавления содержимого одной криоемкости Банка рабочих клеток в верхнее пространство сосуда подают Ν₂ (в течение 1 мин). После закрывания емкостей эту смесь инкубируют в течение 72 ч при 37°С.

После этого автоклавируют 4,5 л вышеуказанного культурального раствора в шоттовской склянке на 5 л, имеющей штуцер для разгрузки и 2 штуцера со стерильными фильтрами (для газирования инокулята). После охлаждения среды до 37°С сначала добавляют буферный раствор (1% фосфатного буфера) и затем 80 мл инокулята. После газирования в верхнее пространство азота (в течение 5 мин) отверстия закрывают и инокулят инкубируют при 37°С в течение приблизительно 64 ч. После контроля на чистоту этот раствор может использоваться в качестве инокулята для ферментера на 1 м³ (емкость 700 л). Для производства используют следующую среду:

Глюкоза	10 г/л
Дрожжевой экстракт	5 г/л
Пептон	2 г/л
Цистеин-НС1	0,5 г/л
Показатель рН	7,00

После стерилизации этой среды в ферментационном резервуаре (40 мин, 12°С, 1,21 бар) и обратном охлаждении до 37°С добавляют инокулят. Верхнее пространство ферментера промывают Ν₂. Скорость смесителя составляет 100 об./мин, для регуляции показателя рН используют гидроксид натрия (8 моль/л). Окислительно-восстановительный потенциал находится в начале ферментации при приблизительно -240 мВ

- 6 008598 и снижается в ходе выращивания до более чем -500 мВ. Время ферментации составляет приблизительно 48 ч. Концентрирование выполняют при помощи проточного сепаратора.

Последующую стабилизацию осуществляют при помощи лиофилизации, микроинкапсулирования или распылительной сушки. В качестве криопротектора для лиофилизации служит сухая молочная сыворотка.

Ее добавляют максимально в количестве 10% в расчете на объем концентрата. Сразу же после этого концентрат замораживают при -80°С (10 ч) или с использованием жидкого азота (2 ч). Лиофилизацию проводят при давлении 0,400 мбар, при установленной температуре поверхности 20°С. Продолжительность составляет приблизительно 30 ч при толщине слоя 1,5 см.

Защиту микроорганизма во время хранения или от неблагоприятных условий жизни осуществляют гранулированием в псевдоожиженном слое с растительным жиром (способ расплава, верхнее разбрызгивание).

Скорость разбрызгивания приблизительно 80-150 г/мин

Температура подаваемого воздуха50°С

Давление разбрызгивания3 бар

Количество воздуха 750-1500 м³/ч

Температура продукта<47°С

Параметры распылительной сушки:

Температура на входе сушильной среды (инертного газа)160°С

Температура на выходе80°С

Давление 3 бар

4. Детоксикация охратоксина А (ОТА) продуктами бактерий и дрожжей согласно примерам 1-3.

Из полученных в примерах 1-3 продуктов готовили логарифмическую серию разведений до степени 10^-4 в физиологическом растворе №1С1. Из степеней 10^-1-10^-4 пипетировали по 2 мл в 18 мл соответствующей среды (минимальной среды (Ыа₂НРО₄ 2,44 г/л; КН₂РО₄ 1,52 г/л; (ΝΗ₃)₂8Ο₄ 0,50 г/л; Мд8О₄-7Н₂О 0,20 г/л, СаС1₂-2Н₂О 0,05 г/л), дрожжевой среды или питательного бульона (Οχοίά СМ001В)), которые смешаны с 200 б.д. ОТА. Используемые колбы инкубируют при соответствующих условиях на горизонтальной качалке. Спустя 2,5, 5 и 24 ч пробы извлекают и исследуют при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии на расщепление ОТА. В степени разведения 10^-3 (соответствует количествам образованных микроорганизмов 10⁵) дрожжи расщепляли в минимальной среде после 5 ч 90% и после 24 ч 100% охратоксина А.

Если в качестве тест-матрикса используют комплексную дрожжевую среду, то продукты обнаруживают после 6 ч в степени разведения 10^-2 долю расщепления 90%. После 24 ч весь ОТА является детоксицированным.

Бактериальные продукты детоксицировали в минимальной среде в степени разведения 10^-3 (количество микроорганизмов 10⁶-10⁹) после 2,5 ч 40-100% и после 24 ч 100% охратоксина А. В питательном бульоне дотоксикация протекает несколько медленнее - после 2,5 ч в степени 10^-3 детоксицируются 4050% и после 24 ч 80-100%. Эти опыты показали, что микроорганизмы могут переводиться в стабильные продукты, которые проявляют детоксицирующую активность как в минимальной, так и в комплексной среде.

5. Разрушение охратоксина (ОТА) лиофилизатом в стимулируемой среде кишечника.

Тест-модель А.

С использованием этой модели исследовали лиофилизаты штаммов дрожжей Ό8Μ 14153, Ό8Μ 15154, Ό8Μ 15155, Ό8Μ 14156 и Ό8Μ 14162, а также штаммы аэробных (Ό8Μ 14170, Ό8Μ 14167, Ό8Μ 14168 и Ό8Μ 14169) и анаэробных (Ό8Μ 14197) бактерий.

Свежеубойную тонкую кишку свиньи разрезают на части приблизительно 15 см, которые затем добавляют в каждом отдельном случае к 100 мл содержащей ОТА [200 б.д.] минимальной среды. Затем эти исходные смеси инокулируют непосредственно 1 г лиофилизата и инкубируют при 35°С. Спустя 0, 6, 24 и 48 ч берут пробы для последующего ОТА-анализа с использованием ВЭЖХ и хранят в глубокозамороженном состоянии (-20°С) до анализа.

В случае дрожжей наиболее активными оказываются микроорганизмы Ό8Μ 14153, Ό8Μ 14156 и Ό8Μ 14162. Уже после первых 6 ч инкубации превращались 70-90%, 50-90% или 80-90% присутствующего токсина (через 24 ч: 90-95%). Два остальных штамма дрожжей (Ό8Μ 14154, Ό8Μ 14155) имеют меньшую активность по сравнению с указанными тремя штаммами (0-20% разрушение через 6 ч; 30-50% через 24 ч; 80% через 48 ч).

В случае аэробных бактерий микроорганизм Ό8Μ 14168 был наилучшим; после 6 ч превращались уже 50-100% присутствующего токсина, после 24 ч 80-100%. Штамм Ό8Μ 14169 также оказался вполне приемлемым: после 6 ч детоксицировались 0-90% ОТА, после 24 ч 70-95%. Два оставшихся микроорганизма были явно менее производительными (0-40% после 6 ч; 50-60% после 24 ч; 60-80% после 48 ч).

- 7 008598

Анаэробный изолят тонкой кишки Ό8Μ 14197 разрушал присутствующий микотоксин через 6 ч инкубации в количестве 0-60%; через 24 ч превращались 50-100% ОТА.

Аналогичные исследования проводили со следующими микроорганизмами:
Изолят тонкой кишки Е6	90-95% через 24 ч
Изолят толстой кишки Όί 1-8	80-95% через 24 ч
Тпсйокротоп ονοίάβδ	40-50% через 24 ч
Тпсйокротоп би1сйит	50-90% через 24 ч
Стур1ососси8 сшуаЩк	40-50% через 24 ч
Тпс1ю5рогоп ЫЬасйи	50% через 24 ч
81епо1торйотопа5 пИтйтебисепк	60-95% через 24 ч
81епо1торйотопа5 §р.	50-70% через 24 ч

Эта модель показала, что ОТА в буферной среде, находящейся в отделе кишечника с соответствующей средой (питательные вещества и кишечная флора), может дезактивироваться полученными продуктами.

Тест-модель В.

С использованием этой модели исследовали лиофилизаты штаммов дрожжей Ό8Μ 14153, Ό8Μ 14156 и Ό8Μ 14162, а также штаммы бактерий Ό8Μ 14168 (аэробный), Ό8Μ 14169 (аэробный) и Ό8Μ 14197 (анаэробный).

Свежеубойную тонкую кишку свиньи разрезали на части приблизительно 25 см, которые на их концах завязывали при помощи шовных нитей. 1 г подлежащего исследованию продукта взвешивали в центрифужной пробирке на 50 мл и ресуспендировали в 20 мл содержащей ОТА [200 м.д.] тест-среды (аэробные микроорганизмы и дрожжи в минимальной среде; анаэробные микроорганизмы в анаэробном буфере). Из хорошо перемешанной суспензии готовили необязательно также десятикратные разведения. Перемешанную суспензию (перемешанные суспензии) вводили затем в каждом отдельно случае в кусочек кишки. После взятия нулевой пробы непосредственно из кусочка кишки этот кусочек инкубировали в подвешенном состоянии в склянке из пирекса (т. е. нить конца кусочка кишки закрепляли завинчивающейся крышкой) при 35°С. Через 6, 24 и 48 ч брали дополнительные пробы для последующего анализа превращения ОТА с использованием ВЭЖХ.

В случае дрожжей (приблизительно 10⁷ КВЕ/мл) через 6 ч регистрировали разрушение ОТА до 90% (Ό8Μ 14153). Через 24 ч (максимально) смогли обнаружить для всех продуктов сравнимо высокие активности (80-100%).

Сравнимые результаты получали также с десятикратными и стократными разведениями лиофилизатов. С обеими аэробными бактериями Ό8Μ 14168 и Ό8Μ 14169 получали подобные результаты. Через 6 ч превращались 20-60% ОТА, через 24 ч 80-95%. Анаэробный микроорганизм Ό8Μ 14197 показал через 6 ч продуктивность в отношении расщепления 40-50%, которая могла повышаться через 24 ч до 90%. Кусочки кишечника, которые инкубировали с ОТА, но без продуктов, не проявили активности детоксикации.

Этими опытами доказано, что детоксицирующие охратоксин микроорганизмы могут также расщеплять этот токсин в кишечнике. Тем самым подтверждается в особенности применение этих микроорганизмов в качестве пищевой или кормовой добавки для детоксикации охратоксинов.

6. Детоксикация продовольственных и кормовых продуктов.

Детоксицирующие охратоксин микроорганизмы выращивали согласно примерам 1-3 при соответствующих условиях в течение приблизительно 66 ч. По 25 мл суспензий центрифугировали в течение 15 мин при 3210 х д и помещали в адекватный объем минимальной среды, которая была смешана с 200 м.д. ОТА. Образующуюся суспензию использовали для инокуляции 25 г или 25 мл продовольственного продукта, молотого кофе, кукурузной крупы, пшеничной крупки, пива и вина. После тщательного смешивания продовольственного продукта с суспензией микроорганизмов брали пробу (нулевую пробу). Инкубация исходных смесей происходила в течение 9 дней при 25°С. Одновременно инкубировали слепые пробы. Их обеспечивали ОТА, но не микроорганизмами. Для анализа охратоксина в жидких продовольственных продуктах точно 1 мл освобожденного от микроорганизмов продовольственного продукта подкисляли 0,5 мл 1М фосфорной кислоты и экстрагировали 5 мл метиленхлорида. 5 мл экстракта сушили в атмосфере азота. Каждую пробу обрабатывали дважды остаток после сушки помещали 1 раз в смесь ацетонитрил/вода/уксусная кислота (45:54:1) и 1 раз в смесь толуол/уксусная кислота (99:1). Анализы проб проводили как с использованием ВЖЭХ, так и ТСХ. При анализе пшеничной крупки взвешивали 5 г пробы в шоттовской склянке объемом 100 мл и встряхивали с 20 мл смеси ацетонитрил/вода (60:40) при 170 об./мин в течение 1 ч. После отфильтровывания экстракт анализировали непосредственно с помощью ВЖЭХ. Обработка анализов ОТА из кукурузной крупы и кофе была несколько более дорогостоящей. В этом случае взвешивали 5 г пробы в шоттовскую склянку объемом 100 мл и встряхивали с 20 мл смеси ацетонитрил:вода (60:40) в течение 1 ч. После отфильтровывания 4 мл экстракта смешивали с 44 мл ЗФР-буфера (0,1% Твин 20) и наносили на иммуноаффинную колонку. Затем проводили ВЭЖХ-анализ. Определяли как уменьшение ОТА, так и образование метаболита ОТа. В пробах кофе и кукурузной

- 8 008598 крупы не смогли посредством примененной колоночной очистки доказать присутствие ОТа. Получили следующие показатели разрушения.

Таблица 1

Уменьшение ОТА в процентах

Штамм Пиво Вино

ОЕМ	14153	100	(+)	99	ί + )
БЕМ	14154	100	(+)	94	( + )
ϋΕΜ	14155	30	( + )	0	(-)
ОЗМ	14156	100	¢+)	95	(+)
Ό5Μ	14162	83	¢+)	12	(+)
Ώ3Μ	14170	75	(+)	0	(-)
ΌΕΜ	14167	100	(+)	4	(+)
ОЗМ	14168	100	(+)	0	(-)
озм	14169	100	( + )	0	(-)
ϋ3Μ	14171	100	(+)	0	(-)

Кукуруза Пшеница Кофе

94	¢ + )	ιοο	( + )	-67 (+)
50	(+)	100	(+)	0 (-)
99	(+)	100	< + )	0? (-}
96.	(+)	100	¢+)	30 (+)
100	(+)	100	(+)	0 (-)
0 (	-)	89	( + )	0 (-)

(+) -90 (+) 0 (-)

50 ( + )	94	(+)	0	¢-)
0 (-)	91	(+)	0	(-)
79 (+)	81	(+)	' 0	(-)

7. Разрушение микотоксинов.

Микроорганизмы выращивали в течение приблизительно 66 ч. После этого их центрифугировали (3210 х д, 15 мин, комнатная температура) и полученные осадки ресуспендировали в минимальной среде. К минимальной среде добавляли 1 м.д. дезоксиниваленола, 1 м.д. фумонизина В₁, 1 м.д. зеараленона, 200 б.д. афлатоксина В! и 2 м.д. цитринина. Перед инкубированием исходных смесей при 30°С брали пробу (нулевая проба). Продолжительность инкубации составляла 96 ч. Исходные смеси определяли дважды, причем ВЖЭХ-анализом исследовали 1 раз супернатант (после центрифугирования) и 1 раз исходную смесь. Для очистки добавляли 3 мл супернатанта или 2 мл суммарной пробы на 15 г элюирующего материала. Через 15 мин пробы элюировали 40 мл этилацетата. По 7 мл этилацетата сушили и помещали в соответствующий растворитель. Анализ афлатоксина В1 и фумонизина В1 проводили согласно предшествующей дериватизации.

Спустя 96 ч пробы исследовали в сравнении с пробами в начале исследования на разрушение соответствующих токсинов. Для этого в случае ΌΟΝ, ΖΟΝ и АВВ1 исследовали как супернатанты (после отделения биомассы центрифугированием), так и общую пробу (с биомассой). Результаты представлены в табл. 2.

Таблица 2

	Степень разрушения	Степень разруше-	Степень разрушения	Степень разру-
		ΖΟΝ(%)	ния ГВ^ (%)	АЕВ₁	{%)	тения СП* (%)
Штаммы	Весь супернатант	Супернатант	Весь супернатант	Супернатант
Ώ5Μ 14170	0	24	0	0	0	100
Б5И 14167	0	28	0	0	10	0
ϋ3Μ 14168	0	32	0	0	10	0
БЗМ 14169	88	90	0	8	46	0
БЗМ 14171	0	43	0	0	24	0
БЗМ 14153	100	100	19	20	13	0
ϋ3Μ 14154	19	67	22	64	63	0
Бб» 14155	81	100	29	20	38	0
Б5М 14156	100	100	6	0	61	0
ϋ3Μ 14162	17	62	8	0	0	0

Из этих исследований четко видно, что некоторые микотоксины, такие как зеараленон (ΖΟΝ), афлатоксин В1 (АВВ1), фумонизин В1 (РВ1), могут быть частично чрезвычайно хорошо расщеплены. Цитринин (С1Т) мог расщепляться только бактерией ЗрЫидошоиак 8р. (Ό8Μ 14170) до 100%.

- 9 008598

В общем, удалось установить, что с помощью микроорганизмов данного изобретения можно, в частности, очень хорошо расщеплять охратоксины в пищевых и кормовых продуктах, а также в среде кишечника, но при этом расщепление зеараленонов, цитринина и т.п. также показало частично хорошие результаты.

Приложение к РСТ-заявке РСТ/АТ02/00356.

Заявитель: ЕтЬет АкПспдсьсПьсПа.П с1 а1.

Списки в соответствии с правилом 13бис, параграфом 4 введения к договору о международном сотрудничестве в области патентоведения.

Все из упомянутых в данной РСТ-заявке РСТ/АТ02/00356 микроорганизмов были депонированы в Ό8ΜΖ - Немецкой Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур СтЬН. Максйетогбсг XVед 1Ь, 38123 Втаищсйтешд, ОсиксЫапй (ΌΕ).____________________________________________________

Входящий номер	Дата поступления
ОЗМ 14156	08.03.2001
ОЗМ 14155	08.03.2001
ЛЗМ 14154	08.03.2001
ОЗМ 14153	08.03.2001
ОЗМ 14197	15.03.2001
ОЗМ 14171	08.03.2001
ОЗМ 14169	08.03.2001
ОЗМ 14168	08.03.2001
ϋ3Μ 14167	08.03.2001
ОЗМ 14170	08.03.2001
ϋ3Μ 14162	08.03.2001

Claims

1. Микроорганизм для биологической детоксикации митотоксинов, а именно охратоксинов и/или зеараленонов, выбранный из аэробных или анаэробных детоксицирующих митотоксины бактерий и/или дрожжей, которые отщепляют фенилаланиновую группу охратоксинов или расщепляют зеараленоны, причем бактерии выбраны из 8р1ипдотопа8 8р. Ό8Μ 14170 и Ό8Μ 14167, 81спо1гор1ютопа8 пйтйгсйисспв Ό8Μ 14168, 81спо1гор1ютопа8 8р. Ό8Μ 14169, РаМоша сШгорНа Ό8Μ 14171 и ЕиЬасЮгшт 8р. Ό8Μ 14197 и дрожжи выбраны из Тпс1ю8рогоп 8рсс. поу. Ό8Μ 14153, Стур1ососси8 8р. Ό8Μ 14154, РНойо1оги1а уаттотеп Ό8Μ 14155, Тпс1ю8рогоп тисоИс8 Ό8Μ 14156 и Тпс1ю8рогоп йи1сйит Ό8Μ 14162.

2. Микроорганизм по п.1, стабилизированный путем лиофилизации, распылительной сушки или микроинкапсулированием.

3. Бесклеточный или неочищенный экстракт микроорганизма по п.1 или 2.

4. Бесклеточный экстракт по п.3, находящийся в растворе, в частности в водном растворе.

5. Неочищенный экстракт по п.3, полученный посредством ультразвука, ферментативного расщепления, комбинации шокового замораживания и оттаивания, проточного гомогенизирования, с помощью Френч-пресса, автолиза при высокой концентрации ИаС1 и/или шаровой мельницы.

6. Микроорганизм или экстракт по любому из пп.1-5, находящийся в забуференном растворе, содержащем ацетатный, цитратный, фосфатный или Трис-гидрохлоридный буфер с показателями рН 1-12, в частности 2-8.

7. Применение бактерий, выбранных из 8рЫидотоиа8 8р. Ό8Μ 14170 и Ό8Μ 14167, 81спо1горНотопа8 ш1п1гсйиссп8 Ό8Μ 14168, 81спо1гор1ютопа8 8р. Ό8Μ 14169, РаМоша сШгорНа Ό8Μ 14171 и ЕиЬас1спит 8р. Ό8Μ 14197, и/или дрожжей, выбранных из Тпс1ю8рогоп 8рсс. поу. Ό8Μ 14153, Стур1ососси8 8р. Ό8Μ 14154, К1юйо1оги1а уаттотей Ό8Μ 14155, Тпс1ю8рогоп тисоИс8 Ό8Μ 14156 и Тпс1ю8рогоп би1сйит Ό8Μ 14162, или смешанных культур указанных бактерий и/или дрожжей для детоксикации микотоксинов, а именно охратоксинов и/или зеараленонов, в пищевых и/или кормовых продуктах посредством отщепления фенилаланиновой группы охратоксина или расщепления зеараленона.

8. Применение по п.7, отличающееся тем, что Тпс1ю8рогоп 8рсс. поу. Ό8Μ 14153, ЕиЬасЮгшт 8р. Ό8Μ 14197 или 8ΐсиоΐ^орйотоиа8 пйгйгсйиссщ Ό8Μ 14168 применяются для детоксикации микотоксинов, а именно охратоксинов и/или зеараленонов, в пищевых и/или кормовых продуктах.

9. Способ биологической детоксикации микотоксинов, а именно охратоксинов и/или зеараленонов, в пищевых и/или кормовых продуктах с помощью микроорганизма, отличающийся тем, что микроорганизм или экстракт по любому из пп.1-6 смешивают с пищевыми или кормовыми продуктами в количест

- 10 008598 ве от 0,01 до 1 мас.%, в частности от 0,05 до 0,5 мас.%.

10. Способ по п.9, отличающийся тем, что пищевой или кормовой продукт перемешивают с водной суспензией указанного микроорганизма, содержащей 20-99 мас.%, в особенности 35-85 мас.% воды, при температурах от 10 до 60°С, в особенности от 15 до 45°С, в течение от 2 мин до 12 ч, в особенности от 5 мин до 2 ч.