CN110563499A - 一种以黄酒糟为基质生产氨基酸叶面肥的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及现代农业领域，公开了一种利用黄酒糟为基质生产氨基酸叶面肥的方法，申请人针对黄酒糟粘度大的问题，筛选出一株适用于黄酒糟发酵的米曲霉突变株，保藏编号为CCTCC NO：M2019505，以黄酒糟为基质，接种米曲霉、黑曲霉、芽孢杆菌和酿酒酵母进行高密度发酵后进行酶解，可获得高质量的氨基酸叶面肥。将黄酒糟变废为宝，其氨基酸态氮、糖类、小肽含量高；还有大量酶，维生素，营养因子，蛋白质降解成多肽及大量氨基酸，使生物利用率高；黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮等真菌毒素被基本降解；原料成本低，工艺简单，容易操作，质量稳定；生产过程环保，无环境污染。

Description

一种以黄酒糟为基质生产氨基酸叶面肥的方法

技术领域

本发明涉及现代农业领域，具体涉及一种利用黄酒糟为基质生产氨基酸叶面肥的方法。

背景技术

近年来，黄酒行业发展迅速，规模以上黄酒生产企业115家，累计完成销售收入167.45 亿元，同比增长5.42％。黄酒企业的扩大，自然伴随副产品的增加。黄酒糟是黄酒生产过程中的主要副产物，平均出糟率为20％-30％。我国每年约产生80万吨黄酒糟，如何使堆积如山的酒糟变废为宝，是一个急需解决的难题。

黄酒糟含有大量的蛋白质、氨基酸、淀粉、糖类物质、纤维素、维生素以及香味物质。目前，对于黄酒糟的利用主要有以下几种：回收含氮物质再利用、制备调味品、作为酿酒再生资源等。对于黄酒糟的利用方式多种多样，但是无论是用于制造风味物质还是用作酿酒再生资源，对大量囤积的酒糟都不能实现大量转化。至于回收黄酒糟中的含氮物质，虽然可行，但是工艺繁琐。综合来看能够实现黄酒糟大批量生物转化的有效途径之一是用于生产氨基酸叶面肥。但是黄酒糟水分含量高，粘度较大，常规微生物固态发酵转化较为困难，需要进行微生物菌株的筛选和组合。同时，黄酒糟贮存过程中容易霉变，产生大量的黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮等真菌毒素，具有潜在的生物安全风险，影响了其使用。

植物对营养物质的吸收主要依靠根系和叶片，根系对土壤或者肥料中营养的吸收是植物生长的主要途径。此外，植物还可利用茎叶(特别是叶片)吸收营养。因此，在对植物施肥时，除考虑向土壤施肥外，还可以采用叶面施肥这一途径。用于蔬菜叶面喷施的肥料种类较多，一般以氨基酸复合肥和微量元素为主，植物生长调节剂也常用来直接喷施。叶面施肥能增加植物对营养成分吸收，从而提高叶菜、果蔬类植物的营养成分含量，改善植物品质。

近年来，氨基酸叶面肥广泛应用于农业生产中，实验证明，对水稻喷施氨基酸叶面肥，能够促进其生长发育和改善品质，最终提高作物产量。对小麦喷施氨基酸叶面肥，能够提高叶片叶绿素含量和加速干物质形成和积累，最终提高小麦产量，对粮食作物、水果和经济作物喷施氨基酸鳌合叶面肥，能够促进它们的生长。作物喷施氨基酸叶面肥后，氨基酸通过维管束输送到各种组织器官，提高作物体内蛋白质的合成水平，此外氨基酸叶面肥具有加强作物的光合作用和新陈代谢，提高作物产量的功效。朱晓华等试验表明，应用氨基酸有机肥对番茄不同时期进行喷施和灌根，不但产量高，而且表现叶片浓绿，根系发达，植株生长健壮，并能够改善土壤性状、增产和增收。

发明内容

本发明的一个目的在于提供了一种以黄酒糟为基质生产氨基酸叶面肥的方法，方法简单，易行，适于大规模生产。

本发明的另一个目的在于提供了一种以黄酒糟为基质生产氨基酸叶面肥的方法的应用。

与现有技术相比，本发明采用以下技术措施：

一种以黄酒糟为基质生产氨基酸叶面肥的方法，包括下述步骤：

1)将基料加水调整含水量为50％-60％，灭菌；

所述的基料为新鲜的黄酒糟或新鲜的黄酒糟与豆粕(按干物质的量比为1:0.5～2)的混合物；

2)按干基料的质量接种米曲霉、黑曲霉、芽孢杆菌和酿酒酵母进行混合发酵，在25～30℃条件下恒温培养48～60h；

其中，米曲霉接种量为0.5×10⁷CFU/g～5.0×10⁷CFU/g，黑曲霉接种量为0.5×10⁷CFU/g～5.0×10⁷CFU/g，芽孢杆菌接种量为0.5×10⁸CFU/g～5.0×10⁸CFU/g，酿酒酵母接种量为0.5×10⁸CFU/g～5.0×10⁸CFU/g；

所述的米曲霉孢子粉为：Aspergillus oryzae A08，保藏编号为：CCTCC NO：M2019505；

所述的芽孢杆菌为：Bacillus sp.Dca24；其余菌株为商品化菌株；

3)将步骤2)的培养物中加入水，调整pH,添加中性蛋白酶酶解后，离心，上清中加入叶面肥所需微量元素，即得。

以上所述的方法中，优选的，步骤3)中，加入2.5～3.5倍质量的水，置于酶解罐中，调整 pH7.5～8.5，添加外源中性蛋白酶至100～200U/mL，控制温度50～60℃下酶解时间10～16h。

在本发明中，所述的黄酒糟为：源自酿造黄酒的副产品，以大米为主要原料。

所述的豆粕为：大豆提取大豆油后的副产品，常用作动物饲料原料。

以上所述的方法中，所用的米曲霉A08为本发明筛选到的适用于黄酒糟为基质进行发酵的米曲霉突变株，该菌株于2019年7月1日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，分类命名：Aspergillus oryzae A08，保藏编号为CCTCC NO：M 2019505，地址：中国武汉武汉大学。该菌株在PDA培养基上生长快，28℃黑暗条件下培养4天，菌落直径为28-30mm；产孢结构较出发菌株略少形成，分生孢子头由白色渐变为黄绿色；菌落背面为浅褐色，无水溶性色素。由显微照片可见，初始菌分生孢子数量多，诱变后突变株的分生孢子数量明显下降，菌丝生长较出发菌株更加旺盛。在实验室采用三角瓶进行黄酒糟固体发酵对比实验，结果表明米曲霉突变株A08生长速度远快于初始菌株，36h菌丝可布满整个培养基质，该菌株适合高蛋白、高粘度的黄酒糟固体发酵。

一种以黄酒糟为基质生产氨基酸叶面肥的方法的应用，可用于蔬菜的中，在黄瓜、空心菜等作物上应用的效果表现为长势稳健，茎杆粗壮，明显提高产量和作物的总糖含量。

与现有技术相比，具有以下优点：

1.本发明以黄酒糟为基质制得氨基酸叶面肥产品应用广泛，可应用于各种作物。

2.与同类产品相比，本发明氨基酸叶面肥产品氨基态氮含量较高，能有效增强作物的抗逆性，有利于提升农作物品质。

3.本发明原料价格低廉，来源广泛，设备投资少，生产工艺简便，是一种废物再利用，解决环境污染的绿色产品。

4.利用本发明制得的产品需符合含氨基酸叶面肥料的GB/T17419-2018国家标准。产品的质量指标符合以下要求：pH值为2.0～9.0，有机质的含量≥100g/L，总养分的质量分数≥80g/L，微量元素总含量的质量分数≥20g/L。

具体实施方式

根据以下实施例，可以更好的理解本发明，但所述的实施例是为了更好的解释本发明，而不是对本发明的限制。

本发明实施例使用的为新鲜的黄酒糟，水分为46.23％，有浓厚的酒香味。

将该酒糟40℃干燥处理后测得干酒糟中淀粉含量为38％，其次是粗蛋白含量为36.14％。粗脂肪和粗纤维含量分别是7.26％和4.8％，另外还含有少量的多肽和还原糖。

实施例1：

米曲霉蛋白酶高产菌株的诱变筛选：

钴60诱变在湖北省农科院辐照中心进行。取新鲜的、孢子丰富的米曲霉菌株斜面，用适量的含0.1％吐温80的无菌水冲洗孢子，血球板、稀释涂平板计数，保证孢子数在10⁷个/mL以上。各取5ml孢子悬液置于4个无菌三角瓶内，分别接受剂量为185Gy、395Gy、605Gy、815Gy的钴60伽马射线照射，对照不接受辐照。将各接受射线照射后的孢子液，涂布于酪蛋白培养基上，培养、计数并挑选透明圈大的菌落70-80株，保存至PDA斜面上。

将初筛保存的菌株分别用麸皮培养基培养，测定蛋白酶酶活，保存高酶活菌株；同时将将筛选出的高酶活菌株接种于以黄酒糟为主要基质的培养基中，进行酶活测定，选取酶活最高菌株进行下一轮诱变。

经过三轮钴60诱变，筛选到一株生长速度快，产酶能力强的米曲霉高产菌株，在麸皮固体培养基上以1％(m/m)接种量接种，在28℃下生长48h，蛋白酶酶活可达5150U/g(以干基计)。

该菌株于2019年7月1日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，分类命名：Aspergillus oryzae A08，保藏编号为CCTCC NO：M 2019505，地址：中国武汉武汉大学。

酪蛋白培养基：干酪素4g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，Na₂HPO₄·7H₂O 1.07g，KH₂PO₄0.36g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH6.5-7.0，121℃灭菌30min。

PDA培养基：马铃薯(去皮)200g，蔗糖20g，水1000mL。将马铃薯去皮，切成小块，于锅中加水1000mL煮沸半小时，用双层纱布过滤，取其滤液加糖，并加水补足1000mL，琼脂20g，pH自然。121℃灭菌30min。

麸皮培养基：小麦麸皮1000g，水1000mL，pH自然。121℃灭菌30min。

实施例2：

米曲霉(Aspergillus oryzae)A08的浅盘发酵：

用接种环挑取新鲜培养的米曲霉斜面孢子，接种三角瓶麸皮培养基(麸皮装料量50g/500mL三角瓶)，28℃培养48h，获得种子培养基，测定米曲霉孢子数为119亿CFU/g 干料。

将10kg麸皮培养基装入高压灭菌锅，121℃灭菌30min，冷却备用。

采用不锈钢浅盘(长320mm，宽240mm，深45mm)作为培养容器进行米曲霉浅盘发酵，麸皮装料量为1000g。将培养的种子培养基按1％(m/m)的接种量接种至麸皮培养基，发酵温度28℃，发酵周期48h，米曲霉孢子数可达55.8亿CFU/g干料。

麸皮培养基：小麦麸皮1000g，水1000mL，pH自然。121℃灭菌30min。

实施例3：

黄酒糟为基质生产氨基酸叶面肥的方法，步骤如下：

1)称取新鲜的黄酒糟作为基料，测出其含水量，计算出干黄酒糟的质量。

2)在新鲜黄酒糟中补充水分到55％，混合均匀成混合物，121℃，30min高压蒸汽灭菌，制得培养基基质；

3)接种复合微生物菌剂：按干黄酒糟的质量接种米曲霉、黑曲霉、芽孢杆菌和酿酒酵母进行混合发酵，在28℃条件下恒温培养48h。

其中，米曲霉接种量为1×10⁷CFU/g(孢子粉接种)，黑曲霉接种量为1×10⁷CFU/g(孢子粉接种)，芽孢杆菌接种量为1×10⁸CFU/g，酿酒酵母接种量为1×10⁸CFU/g。接种量按黄酒糟干基计算。

4)在步骤3)培养物中加入3倍质量的水，置于酶解罐中，用4mol/L的氢氧化钠调整pH8.0，添加中性蛋白酶至100U/mL，控制温度55℃下酶解时间12h。在酶解过程中用4 mol/L的氢氧化钠始终控制酶解液的pH为8.0。酶解完毕后，采用管式离心机离心去除沉淀，取酶解上清液备用。

5)在酶解上清液中按质量分数添加硫酸锌1％、硫酸锰1.5％，添加磷酸二氢钾5％。

6)对酶解液成分进行分析，氨基酸含量为12.4g/100mL，氮磷钾总养分含量为86.1g/L，有机质含量为189g/L,微量元素总含量≥27g/L。采用Superdex Peptide 10/300GL层析柱进行蛋白质分子量分析，黄酒糟蛋白质大部分都降解为小分子的肽和氨基酸及氨基酸残基，分子量分布主要集中在1000Da以下，其中含氨基酸分布的峰面积比例为71.02％。产品符合含氨基酸叶面肥料的GB/T17419-2018国家标准。

所述的米曲霉孢子粉为：Aspergillus oryzae A08，保藏编号为：CCTCC NO：M2019505。

所述的黑曲霉孢子粉为：Aspergillus niger，来源于山东沂源康源生物科技有限公司。

所述的芽孢杆菌为：Bacillus sp.Dca24，来源于华中农业大学农业微生物学国家重点实验室(王海云，降解白酒糟中黄曲霉毒素B1的菌株的筛选及发酵工艺的研究，华中农业大学硕士学位论文，2013)；

所述的酿酒酵母为：来源于安琪酵母股份有限公司。

所述中性蛋白酶来源于武汉新华扬生物股份有限公司。

所述的有机质的含量具体为：烘干基质中有机碳的含量，乘以系数1.724，即为有机质含量。

所述的总养分为：烘干基质中含氮、五氧化二磷和氧化钾三者质量分数的总和。

所述的微量元素总含量为：硼、锌、锰、铁、铜、钼六种元素含量之和。

实施例4：

黄酒糟为基质生产氨基酸叶面肥的方法，步骤如下：

1)称取新鲜的黄酒糟作为基料，测出其含水量，计算出干黄酒糟的质量。

2)按质量比为1：1的比例将黄酒糟(以干质量计)和豆粕混合均匀成混合物，调整含水量55％(m/m)，121℃下30min高压蒸汽灭菌，制得培养基基质；

3)接种复合微生物菌剂：按干黄酒糟和豆粕的总质量接种米曲霉、黑曲霉、芽孢杆菌和酿酒酵母进行混合发酵，在28℃条件下恒温培养48h。

其中，米曲霉接种量为1×10⁷CFU/g(孢子粉接种)，黑曲霉接种量为1×10⁷CFU/g(孢子粉接种)，芽孢杆菌接种量为1×10⁸CFU/g，酿酒酵母接种量为1×10⁸CFU/g。接种量按黄酒糟干基计算。

4)在步骤3)培养物中加入3倍质量的水，置于酶解罐中，用4mol/L的氢氧化钠调整pH8.0，添加中性蛋白酶至100U/mL，控制温度55℃下酶解时间12h。在酶解过程中用4 mol/L的氢氧化钠始终控制酶解液的pH为8.0。

5)在酶解液中按质量分数添加硫酸锌1％、硫酸锰1.5％，添加磷酸二氢钾5％。

6)对酶解液成分进行分析，氨基酸含量为11.8g/100mL，氮磷钾总养分含量为82.5g/L，有机质含量为218g/L，微量元素总含量≥27.6g/L。采用Superdex Peptide 10/300GL层析柱进行蛋白质分子量分析，蛋白质大部分都降解为小分子的肽和氨基酸及氨基酸残基，分子量分布主要集中在1000Da以下，其中含氨基酸分布的峰面积比例为65.8％，产品符合含氨基酸叶面肥料的GB/T17419-2018国家标准。

实施例5：

实施例3中黄酒糟和氨基酸叶面肥中真菌毒素的检测：

毒素的测定方法主要利用抗原抗体反应原理。微孔板包被有针对毒素抗体的捕获抗体，加入样品溶液、毒素酶连接物和毒素抗体后，样品中游离的毒素会与毒素酶连接物竞争毒素抗***点，同时毒素抗体也与微孔板上固定的捕获抗体结合，没有结合的毒素酶连物在洗涤过程中被除去。加入发色剂后，结合的酶连接物会变成蓝色，再加入反应终止液即变为黄色。置于450nm处测量，吸光度值与样品中的毒素浓度成反比。

(1)黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1)：

取5g粉碎后的样品，加入25mL 70％甲醇溶液，用力振荡3min，过滤。将50μL标准品或处理好的样品溶液加到相应的微孔中。加入50μL酶连接物溶液。加入50μL黄曲霉毒素抗体溶液。充分混合，在室温(20-25℃)条件下孵育30min。倒出孔中的液体，将微孔板架倒置在吸水纸上拍打(每轮拍打3次)以保证完全除去孔中的液体。加入250 μLPBS-Tween缓冲液洗涤，再次倒掉微孔中液体。上述操作重复进行两遍。加入100μL 底物/发色剂，充分混合并在室温(20-25℃)条件下暗处孵育15min。加入100μL反应终止液，充分混合。在加入反应终止液后15min内于450nm处测量吸光度值。

(2)赭曲霉毒素A(Ochratoxin A)

取5g粉碎后的样品，加入12.5mL 70％甲醇溶液，用力振荡3min，过滤。将50μL 标准品或处理好的样品溶液加到相应的微孔中。加入50μL酶连接物溶液。加入50μL 赭曲霉毒素A抗体溶液。充分混合，在室温(20-25℃)条件下孵育10min。倒出孔中的液体，将微孔板架倒置在吸水纸上拍打(每轮拍打3次)以保证完全除去孔中的液体。加入 250μL蒸馏水洗涤，再次倒掉微孔中液体。上述操作重复进行两遍。加入100μL底物/ 发色剂，充分混合并在室温(20-25℃)条件下暗处孵育5min。加入100μL反应终止液，充分混合。在加入反应终止液后10min内于450nm处测量吸光度值。

(3)玉米赤霉烯酮(Zearalenon)

取5g粉碎后的样品，加入25mL 70％甲醇溶液，用力振荡3min，过滤。将50μL 标准品或处理好的样品溶液加到相应的微孔中。，加入50μL酶连接物溶液。加入50μL 玉米赤霉烯酮抗体溶液。充分混合，在室温(20-25℃)条件下孵育10分钟。倒出孔中的液体，将微孔板架倒置在吸水纸上拍打(每轮拍打3次)以保证完全除去孔中的液体。加入 250μL蒸馏水洗涤，再次倒掉微孔中液体。上述操作重复进行两遍。加入100μL底物/ 发色剂，充分混合并在室温(20-25℃)条件下暗处孵育5min。加入100μL反应终止液，充分混合。在加入反应终止液后10min内于450nm处测量吸光度值。

黄酒糟原料的毒素检测结果，以黄酒糟折算成干基进行计算，具体如下表1所示，三种毒素的含量较高，超过食品中毒素的国家限定标准。

表1黄酒糟中毒素含量

实施例3叶面肥的毒素检测结果如下表2所示，赭曲霉毒素A的含量为3.5μg/L，其他两种毒素未检出。该产品可在蔬菜等作物叶面喷施中安全使用，不会有真菌毒素的残留。

表2叶面肥中毒素含量

实施例6：

实施例3制得的叶面肥的施用效果：

按照本发明实施例3制得的氨基酸叶面肥分别应用于黄瓜和空心菜的种植，地点在湖北省武汉市汉南区某蔬菜种植基地。

试验在当地习惯施肥的基础上进行，采用配对设计，重复3次，设2个处理。处理1：喷施本发明的氨基酸叶面肥(氨基酸含量大于10％)。每次用量100mL/667m²，稀释500倍进行叶面喷施，其中黄瓜作物共喷施3次，施用时间分别为定植后、初次开花后、及果实膨大期；空心菜作物则当直播空心菜达到2～3片叶子时喷施一次，其后每收割一次喷施一次；其他施肥措施同对照。处理2：清水对照(CK)，以同处理1等量清水叶面喷施，喷施次数、数量及喷施时间同处理1，基追肥按当地常规使用情况进行。

从田间整体外观上看，喷施叶面肥处理后黄瓜、空心菜等作物长势稳健，茎杆粗壮。由表1可知，在试验条件下，喷施叶面肥后黄瓜、空心菜产量都得到了明显提高。其中黄瓜作物喷施叶面肥后产量达6954kg/667m²，比当地习惯施肥处理增产828kg/667m²，增产率达13.5％；空心菜作物喷施叶面肥后产量达3922kg/667m²，比当地习惯施肥处理增产568kg/667m²，增产率达16.9％。

表1不同蔬菜喷施氨基酸叶面肥的产量

总糖是蔬菜重要的品质指标之一，总糖含量的多少影响着蔬菜的口感品质及营养价值。喷施氨基酸叶面肥处理对黄瓜、空心菜总糖含量与对照相比均表现出增加。喷施氨基酸叶面肥处理对黄瓜、空心菜总糖含量分别比对照处理增加0.13g/100g和0.12g/100g，增加幅度分别为9.0％、和11.8％。

表2不同蔬菜喷施氨基酸叶面肥的总糖含量

Claims (4)

1.一种以黄酒糟为基质生产氨基酸叶面肥的方法，包括下述步骤：

1）将基料加水调整含水量为50%-60%，灭菌；

所述的基料为新鲜的黄酒糟或新鲜的黄酒糟与豆粕按干物质的量比为1:0.5~2的混合物；

2）按干基料的质量接种米曲霉、黑曲霉、芽孢杆菌和酿酒酵母进行混合发酵，在25~30℃条件下恒温培养48~60 h；

其中，米曲霉接种量为0.5×10⁷CFU/g~5.0×10⁷CFU/g，黑曲霉接种量为0.5×10⁷CFU/g~5.0×10⁷CFU/g，芽孢杆菌接种量为0.5×10⁸CFU/g~5.0×10⁸CFU/g，酿酒酵母接种量为0.5×10⁸CFU/g~5.0×10⁸CFU/g；

所述的米曲霉孢子粉为：Aspergillus oryzae A08，保藏编号为：CCTCC NO：M2019505；

所述的芽孢杆菌为：Bacillus sp. Dca24；

3）将步骤2）的培养物离心中加入水，调整pH,添加中性蛋白酶酶解后，离心，上清中加入叶面肥所需微量元素，即得。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3）中，加入2.5~3.5倍质量的水，置于酶解罐中，调整pH7.5~8.5，添加外源中性蛋白酶至100~200U/mL，控制温度50~60℃下酶解时间10~16 h。

3.权利要求1所述的方法制备的产品在制备叶面肥中的应用。

4.权利要求1所述的方法制备的产品在提高植物总糖含量中的应用。