CN104745493A

CN104745493A - 降解黄曲霉毒素b1的红城红球菌菌株的分离、培养和使用方法

Info

Publication number: CN104745493A
Application number: CN201310733879.6A
Authority: CN
Inventors: 黄蔚霞; 蔡军; 倪媛媛; 刘佳佳; 李慧; 刘洋; 欧静堃
Original assignee: Cofco Corp; Cofco Nutrition and Health Research Institute Co Ltd
Current assignee: Cofco Corp; Cofco Nutrition and Health Research Institute Co Ltd
Priority date: 2013-12-27
Filing date: 2013-12-27
Publication date: 2015-07-01

Abstract

本发明涉及红城红球菌（Rhodococcus erythropolis）菌株的分离、培养和使用方法，具体而言涉及降解黄曲霉毒素B1（AFB1）的红城红球菌菌株的分离方法、由所述分离方法得到的红城红球菌菌株的培养方法以及使用所述红城红球菌菌株降解AFB1的方法。本发明的菌株分离方法特异性强，效率高，操作简便；所得到的红城红球菌菌株具有来源广泛、制备简单、反应条件温和、脱毒活性高等优点。

Description

降解黄曲霉毒素B1的红城红球菌菌株的分离、培养和使用方法

技术领域

本发明涉及红城红球菌（Rhodococcus erythropolis）菌株的分离、培养和使用方法。具体而言，本发明涉及降解黄曲霉毒素B1（AFB1）的红城红球菌菌株的分离方法、由所述分离方法得到的红城红球菌菌株的培养方法以及使用所述红城红球菌菌株降解AFB1的方法。

背景技术

霉菌毒素是霉菌生长过程中产生的次级代谢产物。霉菌毒素污染一直是全球食品、饲料及农产品等行业的重大威胁，每年都给生产带来巨大的经济损失。目前对相关行业威胁最大的霉菌毒素有黄曲霉毒素（Aflatoxin，AFT）、单端孢霉烯族毒素以及玉米赤霉烯酮等。其中，作为所有真菌毒素中毒性最强的一种，黄曲霉毒素是黄曲霉（A.flavus）、特曲霉（A.nomius）及寄生曲霉（A.parasiticus）等真菌产生的次级代谢产物，现已分离出AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、AFM2、AFB2a、AFG2a、AFBM2a及AFGM2a等18种之多，而其中AFB1的毒性最强且化学性质最稳定，它具有很强的致癌性、致突变性和致畸形性，是国际上认可的A类致癌物。大量的调查研究证实，肝脏是AFB1主要作用的靶器官，AFB1能够导致肝脏坏死、肝癌的形成；此外AFB1还会影响动物胚胎发育，造成免疫抑制和反复感染，降低某些动物的产奶和产蛋量。

黄曲霉毒素广泛存在于各种饲料原料和各种食品原料中，主要包括玉米、花生等食品、饲料及原材料，既严重影响我国相关产品的进出口贸易，带来了巨大的经济损失；又严重影响了我国的食品及饲料安全与质量，造成了极大的人畜健康的危害。

因此，发明一种高效安全的黄曲霉毒素脱毒方法就显得尤为迫切。自从1960年黄曲霉毒素被发现以来，科研工作者便不断地研究该类毒素的预防和去毒方法。目前对黄曲霉毒素脱毒方法的研究主要都集中在化学处理法和物理脱毒法等，包括氨化法、碱法、介质吸附法、混合溶剂萃取法、高温法、紫外线照射法、超滤-渗滤法、霉粒挑选法等，这些方法存在效果不稳定、营养成分损失较大、感官品质影响较大、需要添加防毒害的安全设备、难以规模化生产等缺点，有些方法需要的设备价格昂贵，从而限制了实际生产中的应用。

对此，利用微生物去除黄曲霉毒素的方法由于效率高、条件温和、无副作用等越来越受到关注。利用微生物脱毒的报道，多集中于近十五年。国外的研究报道较多地集中在乳酸菌、双歧杆菌、酵母菌及白腐真菌等，橙色黄杆菌、假密环菌及根霉菌等也有报道。国内相关研究不多，主要包括刘大岭等报道（真菌提取液对黄曲霉毒素降解作用的研究[J].广东药学院学报，1995，11(2):92～94）发现一种真菌代谢产物具有降解毒素作用；计成等报道（降解黄曲霉毒素枯草芽孢杆菌的解毒性、抗菌性及抗逆性研究，饲料工业，2011，32(24):23～27）发现一株芽孢杆菌具有降解毒素作用；及刘阳等报道（高产漆酶平菇的筛选及其在降解黄曲霉毒素B1中的应用，核农学报，2012，26(7):1025-1030）发现一株平菇具有降解毒素作用等。

对乳酸菌、双歧杆菌和酵母菌的研究表明，大部分菌去除毒素的效率低于50%。而对其它一些细菌及真菌的脱毒研究同样也发现，大部分菌的毒素降解效率不高，降解效率影响因素较多，包括作用时间、溶液pH值、溶液成分、菌体数量、毒素浓度和金属离子等，同时降解操作工艺复杂，难以大规模实施。

因此，发明和推广一种使用微生物来高效地、适用面广地降解黄曲霉毒素，进而利用该微生物进行饲料、食品、酿造调味品和相应原料中黄曲霉毒素脱毒的应用，对保障饲料、食品及酿造调味品质量安全并确保人畜健康显得尤为重要，同时，这还能够促进我国相关产品的进出口贸易，具有带来巨大经济利益的潜能。

发明内容

至今为止，国内外尚无关于利用红城红球菌降解黄曲霉毒素的报道。本发明人则通过深入研究，首次发现红城红球菌能够高效率地降解AFB1，从而提供了一种降解AFB1的红城红球菌菌株的分离方法及由此得到的红城红球菌菌株；还提供了一种高效的、适用面广的、温和的、安全的、工艺简单的AFB1降解方法。

因此，根据本发明的一个方面，本发明提供了一种降解AFB1的红城红球菌菌株的分离方法。所述分离方法包括如下步骤：利用以AFB1为唯一碳源的初筛培养基进行初筛；通过16S rDNA序列分析初步选择出红城红球菌菌株；以及利用添加有AFB1的复筛培养基进行复筛，得到所述降解AFB1的红城红球菌菌株，其中，所述初筛培养基及复筛培养基中含有0.10%-1.00%的AFB1。

根据本发明的另一个方面，本发明提供了利用上述分离方法得到的降解AFB1的红城红球菌菌株。

根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种由上述分离方法得到的降解AFB1的红城红球菌菌株的发酵培养方法，所述方法包括如下步骤：将所述红城红球菌菌株接种入发酵培养基中并进行摇瓶发酵。

根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种利用由上述分离方法得到的红城红球菌菌株降解AFB1的方法。所述降解AFB1的方法包括如下步骤：取所述红城红球菌菌株的发酵液或发酵液上清加入到含AFB1的样品中，调整反应体系至pH5.5-8.5，在25-35℃及80-150r/min的条件下反应48-72h。

本发明涉及的红城红球菌菌株分离方法、由此得到的红城红球菌菌株及利用该菌株进行的降解AFB1的方法具有以下有益效果，从而有效解决了传统黄曲霉毒素AFB1脱毒方法中存在的问题：

（1）本发明的降解AFB1的红城红球菌菌株的分离方法具有原料来源广泛、适用面广、工艺简单、成本低廉等特点；

（2）利用由本发明的分离方法得到的红城红球菌菌株降解AFB1的效率高，对AFB1的降解率超过80%，甚至可达到95%；

（3）利用由本发明的分离方法得到的红城红球菌菌株降解AFB1的方法具有脱毒活性高、操作简单、反应条件温和等优势。

具体实施方式

本文所述的降解AFB1的红城红球菌菌株可从多种原料来源中分离得到。本领域技术人员熟知的是，多环芳烃（PAH）污染土壤、霉变粮食及腐败食品等样品中红城红球菌含量较高，因此，根据本发明的一些实施方式，降解AFB1的红城红球菌菌株的分离方法中可利用上述样品作为原料，但本发明并不限于此。

本发明的降解AFB1的红城红球菌菌株的分离方法中使用的初筛培养基可为本领域技术人员熟知的任何合适的化学限定培养基，只要该培养基以AFB1为唯一碳源且含有0.10%-1.00%的AFB1即可。

根据本发明的一个实施方式，所述初筛培养基包含如下成分：磷酸氢二铵0.01%-0.50%、磷酸二氢钠0.01%-0.50%、磷酸氢二钾0.01%-0.50%、硫酸镁0.01%-0.50%、硝酸钠0.01%-0.50%、AFB10.10%-1.00%、琼脂0.50%-2.00%；所述初筛培养基的pH为5.5-8.5。优选地，所述初筛培养基包含如下成分：磷酸氢二铵0.05%、磷酸二氢钠0.25%、磷酸氢二钾0.20%、硫酸镁0.05%、硝酸钠0.30%、AFB10.30%、琼脂1.25-2.00%；所述初筛培养基的pH为6.0-8.0。

根据本发明的一些实施方式，在进行初筛后，依据NCBI提供的序列信息，通过16S rDNA序列分析初步选择出红城红球菌菌株用于复筛。

本发明的降解AFB1的红城红球菌菌株的分离方法中使用的复筛培养基可为本领域技术人员熟知的任何合适的培养基，只要该培养基含有0.10%-1.00%的AFB1即可。

根据本发明的一个实施方式，在复筛过程中，可利用含有浓度为0.10%-1.00%的AFB1的牛肉膏蛋白胨培养基。根据本发明一个优选的实施方式，所述复筛培养基包含如下成分：蛋白胨0.25%-1.00%、牛肉膏0.25%-1.00%、氯化钠0.25%-1.00%、AFB10.10%-1.00%、琼脂0.50%-2.00%；所述复筛培养基的pH为5.5-8.5。

根据本发明一个优选的实施方式，由本发明的降解AFB1的红城红球菌菌株的分离方法得到的红城红球菌（Rhodococcus erythropolis）菌株分别为NHRI-1、NHRI-2、NHRI-3、NHRI-4、NHRI-5、NHRI-6及NHRI-7，所述菌株于2013年12月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）（北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），保藏编号分别为CGMCC No.8590、CGMCC No.8591、CGMCC No.8592、CGMCC No.8593、CGMCC No.8594、CGMCC No.8595及CGMCC No.8596。根据本发明一个最为优选的实施方式，由本发明的降解AFB1的红城红球菌菌株的分离方法得到的红城红球菌（Rhodococcus erythropolis）菌株为NHRI-1，所述菌株于2013年12月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为CGMCC No.8590。

对于复筛得到的红城红球菌菌株，可利用本领域常用的发酵培养方法对其进行发酵培养，合适的发酵培养基包括但不限于牛肉膏蛋白胨培养基等本领域常用的发酵培养基。根据本发明一个优选的实施方式，所述发酵培养基包含如下成分：蛋白胨0.25%-1.00%、牛肉膏0.25%-1.00%、葡萄糖0.25%-1.00%、氯化钠0.25%-1.00%；所述发酵培养基的pH为5.5-8.5。根据本发明一个更为优选的实施方式，所述发酵培养基包含如下成分：蛋白胨1.00%、牛肉膏0.50%、葡萄糖0.50%、氯化钠0.50%；所述发酵培养基的pH为7.2-7.4。

在本发明的一个实施方式中，可利用摇瓶发酵对复筛得到的红城红球菌菌株进行发酵培养。根据本发明一个优选的实施方式，所述揺瓶发酵条件为：发酵温度为25-35℃，转速为80-150r/min，pH值为6.5-8.0，发酵时间为40-60h。根据本发明一个更为优选的实施方式，所述揺瓶发酵条件为：发酵温度为30℃，转速为100r/min，pH值为7.2-7.4，发酵时间为48h。

在利用红城红球菌菌株降解AFB1的方法中，可取红城红球菌菌株的发酵液或发酵液上清加入到含AFB1的样品中，将反应体系调整至5.5-8.5，在25-35℃及80-150r/min的条件下反应48-72h即可去除样品中的AFB1。优选地，可取红城红球菌菌株的发酵液或发酵液上清加入到含AFB1的样品中，将反应体系调整至pH7.2-7.4，在30℃及100r/min的条件下反应72h后即可去除样品中的AFB1。

对于上述发酵液上清，可基于本领域技术人员掌握的常规方法由发酵液获得，例如，采用离心的方式。

对于黄曲霉毒素脱毒的效果检测，可采用本领域常规的检测方法进行，包括但不限于HPLC-MS方法。根据本发明的一个实施方式，可在反应完成后采用可商购的试剂盒来提取反应样品中残留的黄曲霉毒素，并采用HPLC-MS检测反应样品中残留的黄曲霉毒素的含量。

除非另有说明，本发明中的含量百分比是指重量体积百分比。例如，“培养基中含有0.10%的AFB1”是指每100ml培养基中含有0.10g AFB1。

在利用红城红球菌对AFB1进行处理时，术语“降解”及“脱毒”在本文中可互换使用。

本发明可由以下编号的段落中的任一项表示：

1.降解黄曲霉毒素B1（AFB1）的红城红球菌菌株的分离方法，所述分离方法包括如下步骤：

利用以AFB1为唯一碳源的初筛培养基进行初筛；

通过16S rDNA序列分析初步选择出红城红球菌菌株；以及

利用添加有AFB1的复筛培养基进行复筛，得到所述降解AFB1的红城红球菌菌株，

其中，所述初筛培养基及复筛培养基中含有0.10%-1.00%的AFB1。

2.如段1所述的分离方法，其中，从多环芳烃污染土壤、霉变粮食或腐败食品中分离所述红城红球菌菌株。

3.如段1所述的分离方法，其中，从霉变花生、霉变玉米、霉变稻谷及霉变高粱的混合物中分离所述红城红球菌菌株。

4.如段1-3中任一项所述的分离方法，其中，所述初筛培养基包含如下成分：磷酸氢二铵0.01%-0.50%、磷酸二氢钠0.01%-0.50%、磷酸氢二钾0.01%-0.50%、硫酸镁0.01%-0.50%、硝酸钠0.01%-0.50%、AFB10.10%-1.00%、琼脂0.50%-2.00%；所述初筛培养基的pH为5.5-8.5。

5.如段4所述的分离方法，其中，所述初筛培养基包含如下成分：磷酸氢二铵0.05%、磷酸二氢钠0.25%、磷酸氢二钾0.20%、硫酸镁0.05%、硝酸钠0.30%、AFB10.30%、琼脂1.25-2.00%；所述初筛培养基的pH为6.0-8.0。

6.如段1-3中任一项所述的分离方法，其中，所述复筛培养基为含有浓度为0.10%-1.00%的AFB1的牛肉膏蛋白胨培养基。

7.如段6所述的分离方法，其中，所述复筛培养基包含如下成分：蛋白胨0.25%-1.00%、牛肉膏0.25%-1.00%、氯化钠0.25%-1.00%、AFB10.10%-1.00%、琼脂0.50%-2.00%；所述复筛培养基的pH为5.5-8.5。

8.由段1-7中任一项所述的分离方法得到的降解AFB1的红城红球菌菌株。

9.如段8所述的红城红球菌菌株，其中，所述红城红球菌菌株为：于2013年12月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）的菌株NHRI-1、NHRI-2、NHRI-3、NHRI-4、NHRI-5、NHRI-6及NHRI-7，保藏编号分别为CGMCC No.8590、CGMCC No.8591、CGMCC No.8592、CGMCC No.8593、CGMCC No.8594、CGMCC No.8595及CGMCC No.8596。

10.由段1-7中任一项所述的分离方法得到的降解AFB1的红城红球菌菌株的发酵培养方法，所述方法包括如下步骤：

将所述红城红球菌菌株接种入发酵培养基中并进行摇瓶发酵。

11.如段10所述的发酵培养方法，其中，所述发酵培养基是牛肉膏蛋白胨培养基。

12.如段11所述的发酵培养方法，其中，所述发酵培养基包含如下成分：蛋白胨0.25%-1.00%、牛肉膏0.25%-1.00%、葡萄糖0.25%-1.00%、氯化钠0.25%-1.00%；所述发酵培养基的pH为5.5-8.5。

13.如段11所述的发酵培养方法，其中，所述发酵培养基包含如下成分：蛋白胨1.00%、牛肉膏0.50%、葡萄糖0.50%、氯化钠0.50%；所述发酵培养基的pH为7.2-7.4。

14.如段10-13中任一项所述的发酵培养方法，其中，所述揺瓶发酵的条件为：发酵温度为25-35℃，转速为80-150r/min，pH值为6.5-8.0，发酵时间为40-60h。

15.如段14所述的发酵培养方法，其中，所述揺瓶发酵的条件为：发酵温度为30℃，转速为100r/min，pH值为7.2-7.4，发酵时间为48h。

16.利用由段1-7中任一项所述的分离方法得到的红城红球菌菌株降解AFB1的方法，所述方法包括如下步骤：

取所述红城红球菌菌株的发酵液或发酵液上清加入到含AFB1的样品中，将反应体系调整至pH5.5-8.5，在25-35℃及80-150r/min的条件下反应48-72h。

17.如段16所述的降解AFB1的方法，其中，取所述红城红球菌菌株的发酵液或发酵液上清加入到含AFB1的样品中，将反应体系调整至pH7.2-7.4，在30℃及100r/min的条件下反应72h。

实施例

下面结合具体实施例进一步阐明本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用来限制本发明的范围。

材料与试剂：

黄曲霉毒素B1（AFB1）购自Pribolab公司（生产批号为1301010）。

PBS（0.01mol/L）的制备：称取8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na₂HPO₄和0.24g KH₂PO₄，溶于800ml蒸馏水中，用NaOH调节溶液的pH值至7.5，最后加蒸馏水定容至1L，121℃高压灭菌20min。

实施例1降解AFB1的红城红球菌菌株的初筛及初步鉴定

以霉变粮食（霉变花生、玉米、稻谷及高粱混合物）为材料，采用PBS梯度稀释分离法，利用以AFB1为唯一碳源的初筛培养基进行初筛。具体操作为：

采用PBS（0.01mol/L）配制浓度为3.00%的AFB1溶液作为初筛培养基B组分，过滤除菌；然后同初筛培养基A组分（具体配方：磷酸氢二铵0.05%、磷酸二氢钠0.25%、磷酸氢二钾0.20%、硫酸镁0.05%、硝酸钠0.30%、琼脂1.50%；pH7.2；121℃高压灭菌20min）按照1:9的体积比均匀混合制备初筛培养基并倒平板，初筛培养基中AFB1的终浓度为0.3%。

采用PBS（0.01mol/L）制备不同浓度梯度的PBS霉变粮食样品稀释液，具体操作为：称取25.00g霉变粮食样品加入到PBS溶液（0.01mol/L）中，使得终体积为250mL，均匀混合，标记为10^-1g/mL；然后采用PBS 溶液（0.01mol/L）依次10倍稀释至10^-8g/mL，即标记浓度梯度依次为10^-1g/mL、10^-2g/mL、10^-3g/mL、10^-4g/mL、10^-5g/mL、10^-6g/mL、10^-7g/mL及10^-8g/mL，分别吸取各浓度梯度稀释液100μl涂布初筛培养基平板，将其置于30℃培养箱中培养一周，观察平板培养基上菌落的生长情况，共获得86个菌落。

用灭菌竹签挑取少许菌落并分别均匀混合于含有1mL初筛液体培养基的Eppendorf管中，采用细菌16S rDNA测序通用引物：正向引物8F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG）及反向引物1492R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT）进行菌落PCR扩增，扩增产物进行序列测定分析，依据NCBI提供的序列信息进行16S rDNA序列比对，得到7株初步注释为红城红球菌的菌株，分别编号为NHRI-1、NHRI-2、NHRI-3、NHRI-4、NHRI-5、NHRI-6及NHRI-7。

从Eppendorf管中吸取相应的红城红球菌菌液进行初筛培养基平板划线以分离单菌落，镜检验证其纯度，取纯度≥99.5%的菌落试管斜面冷藏以备使用。

实施例2降解AFB1的红城红球菌菌株的复筛与鉴定

采用PBS（0.01mol/L）配制浓度为3.00%的AFB1溶液作为复筛培养基B组分，过滤除菌；然后同复筛培养基A组分（具体配方：蛋白胨1.00%、牛肉膏0.50%、氯化钠0.50%；pH7.2；121℃高压灭菌20min）按照1:9的体积比均匀混合制备得到复筛液体培养基，该培养基中AFB1的终浓度为0.3%。

将实施例1中得到的7株红城红球菌菌株NHRI-1、NHRI-2、NHRI-3、NHRI-4、NHRI-5、NHRI-6及NHRI-7的试管斜面冷藏菌落分别接种于5.0mL复筛液体培养基中，以不加菌的复筛液体培养基作为空白对照，将其置于恒温摇床中，于30℃及100r/min的条件下培养72h。

培养结束后，采用HPLC-MS方法检测复筛培养基中AFB1的浓度，参照空白培养基对照，计算红城红球菌菌株对复筛培养基中AFB1的降解率。结果如表1所示（以3份平行样品测定值的平均值±标准差的形式示出）：

菌株NHRI-1、NHRI-2、NHRI-3、NHRI-4、NHRI-5、NHRI-6及NHRI-7对复筛培养基中AFB1的降解率均超过70%，其中编号为NHRI-1的菌株对AFB1的降解率最强，超过90%，达到94.7%±2.1%。

表1复筛菌株降解AFB1的检测结果^﹡

^﹡采用不加菌的复筛液体培养基作为对照，其AFB1值设为100%。

选取所述菌株NHRI-1、NHRI-2、NHRI-3、NHRI-4、NHRI-5、NHRI-6及NHRI-7进行培养鉴定，7株红城红球菌菌株均有相类似的形态学及生理生化特征，具体如下：

形态学表现为杆状或多态性，菌落颜色为橘黄色，革兰氏染色阳性；

生理生化反应结果为：好氧；接触酶阳性；氧化酶阴性；不能水解淀粉、酪素、明胶；硝酸盐还原阳性；可以利用葡萄糖、乙酸、琥珀酸及柠檬酸；VP实验阴性；MR实验阴性；

有机物产酸结果为：葡萄糖、甘露糖、蔗糖、果糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇、肌醇、苹果酸盐、乙酸盐、乳酸盐、乙醇、丙酮酸、谷氨酸、精氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸为阳性；乳糖、棉子糖、木糖、***糖、半乳糖、赤藓醇、卫矛醇、草酸盐为阴性。

根据以上形态学及生理生化特征，参考《伯杰氏细菌鉴定手册》，将NHRI-1、NHRI-2、NHRI-3、NHRI-4、NHRI-5、NHRI-6及NHRI-7这7株菌株初步鉴定为红球菌属（Genus Rhodococcus）。

随后，再次通过16S rDNA序列分析比对，确认7株菌株均为红城红球菌（其中，与从中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心购得的红城红球菌菌株CGMCC4.1491的16S rDNA序列相似性均＞99%），以菌株NHRI-1为例（NHRI-2、NHRI-3、NHRI-4、NHRI-5、NHRI-6及NHRI-7菌株同其16S rDNA序列相似性同样均＞99%），其16S rDNA序列如下：

实施例3降解AFB1的红城红球菌菌株的保存和保藏

将经过鉴定的七株红城红球菌菌株纯菌落接种到固体培养基（组成成分为：蛋白胨1.00%、牛肉膏0.50%、葡萄糖0.50%、氯化钠0.50%、琼脂1.50%；pH7.2-7.4）平板上，30℃培养箱培养72h，镜检验证其纯度。挑取纯度≥99.5%的单菌落转接试管斜面培养后冷藏以备使用，并将菌株备份保存于甘油管中，-80℃放置低温保藏。

此外，将上述经过鉴定的七株红城红球菌菌株NHRI-1、NHRI-2、NHRI-3、NHRI-4、NHRI-5、NHRI-6及NHRI-7于2013年12月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号分别为CGMCC No.8590、CGMCC No.8591、CGMCC No.8592、CGMCC No.8593、CGMCC No.8594、CGMCC No.8595及CGMCC No.8596。

实施例4红城红球菌菌株的揺瓶发酵培养

取实施例3中七株红城红球菌菌株NHRI-1、NHRI-2、NHRI-3、NHRI-4、NHRI-5、NHRI-6、NHRI-7的甘油保藏菌液以1：1000的体积比进行液体培养基（组成成分为：蛋白胨1.00%、牛肉膏0.50%、葡萄糖0.50%、氯化钠0.50%；pH7.2-7.4）活化培养。培养条件为：温度为30℃，转速为100r/min，培养时间48h。

活化培养后，取所述7种红城红球菌菌株的活化培养液各5.0mL（活菌浓度≥10⁹CFU/ml），接种于250mL培养基中进行揺瓶发酵培养，发酵培养温度30℃，pH值7.2-7.4，转速100r/min，发酵时间48h。

其中，揺瓶发酵培养基包含如下成分：蛋白胨1.00%、牛肉膏0.50%、葡萄糖0.50%、氯化钠0.50%；培养基的pH为7.2-7.4。

发酵结束后，将发酵液保存在4℃冰箱内备用。

实施例5制备红城红球菌菌株发酵液上清

取实施例4中4℃保存的7株红城红球菌菌株的发酵液各100mL，离心（条件为：转速10000r/min，温度4℃，离心时间10min）分离得到发酵液上清。

实施例6利用红城红球菌菌株发酵液降解AFB1

分别吸取3200μl实施例4得到的红城红球菌菌株发酵液，与400μl的AFB1充分混合，AFB1终浓度为2000ppb，在30℃、100r/min、pH7.2-7.4的条件下反应72h；取3200μl同实施例4处理流程的不含红城红球菌的揺瓶发酵培养基，向其中加入400μl的AFB1作为对照组，充分混合后在30℃、100r/min、pH7.2-7.4的条件下反应72h。

反应24h、48h及72h后，分别取反应液1mL，采用HPLC-MS法检测反应液中AFB1的含量。检测结果如表2所示（降解率以3份平行样品测定值的平均值±标准差的形式示出）：

NHRI-1的AFB1降解活力最高，在24h时对AFB1的降解率接近50%；48小时可达约85%；72小时后，对AFB1的降解率超过95%，对照组中则未检测到对AFB1的降解作用。

表2红城红球菌菌株发酵液降解AFB1的检测结果^﹡

^﹡采用不加菌的发酵培养基的发酵培养液作为对照，其AFB1值设为100%。

实施例7利用红城红球菌菌株发酵液上清降解AFB1

分别吸取3200μl实施例5得到的红城红球菌菌株发酵液上清，与400μl的AFB1充分混合，AFB1终浓度为2000ppb，在30℃、100r/min、pH7.2-7.4的条件下反应72h；取3200μl同实施例4处理流程的不含红城红球菌的揺瓶发酵培养基发酵液上清，向其中加入400μl的AFB1作为对照组，充分混合后在30℃、100r/min、pH7.2-7.4的条件下反应72h。

反应24h、48h及72h后，分别取反应液1mL，采用HPLC-MS法检测反应液中AFB1的含量。检测结果如表3所示（降解率以3份平行样品测定值的平均值±标准差的形式示出）：

NHRI-1的AFB1降解活力最高，在24h时对AFB1的降解率接近45%；48小时可达约80%；72小时后，对AFB1的降解率超过92%，对照组中则未检测到对AFB1的降解作用。

表3红城红球菌菌株发酵液上清降解AFB1的检测结果^﹡

^﹡采用不加菌的发酵培养基的发酵培养液上清作为对照，其AFB1值设为100%。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明描述的基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是容易实现的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

利用以AFB1为唯一碳源的初筛培养基进行初筛；

通过16S rDNA序列分析初步选择出红城红球菌菌株；以及

其中，所述初筛培养基及复筛培养基中含有0.10%-1.00%的AFB1。

2.如权利要求1所述的分离方法，其中，从多环芳烃污染土壤、霉变粮食或腐败食品中分离所述红城红球菌菌株；

优选地，从霉变花生、霉变玉米、霉变稻谷及霉变高粱的混合物中分离所述红城红球菌菌株。

3.如权利要求1或2所述的分离方法，其中，所述初筛培养基包含如下成分：磷酸氢二铵0.01%-0.50%、磷酸二氢钠0.01%-0.50%、磷酸氢二钾0.01%-0.50%、硫酸镁0.01%-0.50%、硝酸钠0.01%-0.50%、AFB10.10%-1.00%、琼脂0.50%-2.00%；所述初筛培养基的pH为5.5-8.5，

优选地，所述初筛培养基包含如下成分：磷酸氢二铵0.05%、磷酸二氢钠0.25%、磷酸氢二钾0.20%、硫酸镁0.05%、硝酸钠0.30%、AFB10.30%、琼脂1.25-2.00%；所述初筛培养基的pH为6.0-8.0。

4.如权利要求1或2所述的分离方法，其中，所述复筛培养基为含有浓度为0.10%-1.00%的AFB1的牛肉膏蛋白胨培养基，

优选地，所述复筛培养基包含如下成分：蛋白胨0.25%-1.00%、牛肉膏0.25%-1.00%、氯化钠0.25%-1.00%、AFB10.10%-1.00%、琼脂0.50%-2.00%；所述复筛培养基的pH为5.5-8.5。

5.由权利要求1-4中任一项所述的分离方法得到的降解AFB1的红城红球菌菌株。

6.如权利要求5所述的红城红球菌菌株，其中，所述红城红球菌菌株为：于2013年12月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）的菌株NHRI-1、NHRI-2、NHRI-3、NHRI-4、NHRI-5、NHRI-6及NHRI-7，保藏编号分别为CGMCC No.8590、CGMCCNo.8591、CGMCC No.8592、CGMCC No.8593、CGMCC No.8594、CGMCCNo.8595及CGMCC No.8596。

7.由权利要求1-4中任一项所述的分离方法得到的降解AFB1的红城红球菌菌株的发酵培养方法，所述方法包括如下步骤：

8.如权利要求7所述的发酵培养方法，其中，所述发酵培养基是牛肉膏蛋白胨培养基，

优选地，所述发酵培养基包含如下成分：蛋白胨0.25%-1.00%、牛肉膏0.25%-1.00%、葡萄糖0.25%-1.00%、氯化钠0.25%-1.00%；所述发酵培养基的pH为5.5-8.5，

更优选地，所述发酵培养基包含如下成分：蛋白胨1.00%、牛肉膏0.50%、葡萄糖0.50%、氯化钠0.50%；所述发酵培养基的pH为7.2-7.4。

9.如权利要求7或8所述的发酵培养方法，其中，所述揺瓶发酵的条件为：发酵温度为25-35℃，转速为80-150r/min，pH值为6.5-8.0，发酵时间为40-60h，

优选地，所述揺瓶发酵的条件为：发酵温度为30℃，转速为100r/min，pH值为7.2-7.4，发酵时间为48h。

10.利用由权利要求1-4中任一项所述的分离方法得到的红城红球菌菌株降解AFB1的方法，所述方法包括如下步骤：

取所述红城红球菌菌株的发酵液或发酵液上清加入到含AFB1的样品中，将反应体系调整至pH5.5-8.5，在25-35℃及80-150r/min的条件下反应48-72h，

优选地，取所述红城红球菌菌株的发酵液或发酵液上清加入到含AFB1的样品中，将反应体系调整至pH7.2-7.4，在30℃及100r/min的条件下反应72h。