CN112641032B - 基于隐球酵母y3胞内酶降解赭曲霉毒素a的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物防治技术领域,涉及一种基于隐球酵母Y3胞内酶降解赭曲霉毒素A的用途;步骤为:首先将隐球酵母Y3接入NYDB培养基中,培养活化后,取菌液涂布于NYDA培养基;然后,挑选单菌落接种到PM培养基中,培养后经离心得到菌体,无菌蒸馏水清洗后,稀释成1×108cells/mL的菌悬液,接种于PM培养基中培养后,离心收集菌体,加入液氮、研磨,得到粉末状的菌体;再加入Tris‑HCl缓冲液重悬,震荡后经冰浴处理、离心,收集上清液,通过有机针孔滤膜过滤除菌,得到胞内酶溶液;在胞内酶溶液中加入赭曲霉毒素A,在避光环境下,震荡培养,即可实现降解赭曲霉毒素A的用途;本发明安全环保,可高效快速降解赭曲霉毒素A。
Description
技术领域
本发明属于生物降解毒素的方法,具体涉及一种基于隐球酵母Y3胞内酶降解赭曲霉毒素A的用途。
背景技术
真菌毒素是由真菌类微生物产生的次级代谢产物,到目前为止,人们发现了至少300种真菌毒素。世界上毒性最强的五类真菌毒素中,赭曲霉毒素A排列第二,其最明显的毒性作用是肾毒性,其次还有肝脏、免疫毒性等,被国际癌症研究机构列为2B类人类致癌物。
除了严重的毒性作用,赭曲霉毒素A在食品和饲料中污染严重。自然界中产生赭曲霉毒素A的主要霉菌有两类,第一类是Aspergillus ochraceus和Penicilliumverrucosum,这两类真菌的寄主主要是农作物,包括玉米、小麦、水稻等,该类霉菌在热带和亚热带地区发病较为严重;还有一种霉菌是Aspergillus carbonarins,其寄主主要是葡萄,该类霉菌在寒冷的地区发病比较严重。到目前为止,赭曲霉毒素A已经被发现存在于各类食品中,如酱油,葡萄及其制品,以及肉类产品和咖啡中。赭曲霉毒素A在人体中的存在也是令人担忧的问题,2019年基于葡萄牙地区的研究发现,超过90%的儿童的尿液中被检测到该毒素。
由于赭曲霉毒素A极强的毒性和广泛的污染,在食品和饲料中控制其含量是保障食品安全的重要举措。赭曲霉毒素A是由-羧基-5-氯-8-羟基-3,4-二氢-3-R-甲基异香豆素(赭曲霉毒素α)和L-β-苯丙氨酸通过酰胺键连在一起的聚酮类化合物,耐酸性和高温环境,在自然环境中较难降解。一般通过断裂酰胺键,生成赭曲霉毒素α和L-β-苯丙氨酸达到解毒的效果。
目前对赭曲霉毒素A的控制方法包括物理方式、化学方式、生物方式。物理方式降解赭曲霉毒素A包括吸附和加热降解;吸附是常见的脱除毒素的方法,但是不能彻底降解毒素,使其残留在环境中,造成二次污染;加热也是脱除赭曲霉毒素A的有效方式,但是容易造成产品品质降低的问题。化学方式降解赭曲霉毒素A也是常见的脱毒方式,而且已经研究出的降解赭曲霉毒素A的化学方式多样化,如利用过氧化物酶(POD)、蛋白质和糖类降解赭曲霉毒素A,但是操作复杂,成本较高。
近年来,采用微生物及其产生的酶降解毒素成为研究的热点,虽然已有较多的酵母菌、乳酸菌和霉菌被发现具有降解赭曲霉毒素A的功效,但是发掘出来的降解酶的种类有限、而且降解效果不佳,因此,挖掘新的高效降解酶是非常必要的。
发明内容
针对现有技术的缺陷与不足,本发明提供一株分离筛选自土壤的隐球酵母(Cryptococcus podzolicus)Y3,基于隐球酵母Y3的胞内酶降解赭曲霉毒素A,其具有高安全性和极高的降解效果。
本发明所提供的降解赭曲霉毒素A的隐球酵母系从镇江市句容市果园收集的土壤中筛选分离到的,在NYDA固体培养基平板上28℃培养3d,进行形态学观察;已经对该菌株的5.8S rDNA-ITS区序列进行分析并进行了分子生物学鉴定。同时,本发明所提供的酵母菌株,现保藏于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏编号为:CCTCC NO:M2017505,建议的分类命名为隐球酵母(Cryptococcus podzolicus)Y3。此外,本发明所利用的菌株申请人已经申请中国发明专利,CN201711183834.0,发明名称为:一株降解桔霉素的酵母菌及应用。
为了实现以上目的,本发明采用的技术方案如下:
(1)配制菌悬液:将隐球酵母Y3接入NYDB培养基中,在28~30℃、180rpm震荡条件下,培养20~24h,进行活化,得到活化后的菌液;然后取活化后的菌液涂布于NYDA固体培养基,培养温度28℃~30℃,时间48-60h;然后,挑选NYDA固体培养基生长的隐球酵母Y3单菌落接种到PM培养基中进行培养,培养后经离心得到菌体,并用无菌蒸馏水清洗数次,清洗后再次离心,收集菌体用无菌水稀释成菌悬液;
(2)取步骤(1)制备的菌悬液,接种于PM培养基中,在28~30℃、180rpm震荡条件下,培养20~24h,离心收集酵母菌体,无菌蒸馏水清洗后再次离心收集酵母菌体,然后加入液氮速冻菌体,进行研磨,得到粉末状的菌体;然后将粉末状的菌体加入Tris-HCl缓冲液(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐,50mM,pH 7.1)重悬,震荡后进行冰浴处理,处理后离心,收集上清液,即为胞内粗酶液;
(3)再将步骤(2)中得到的胞内粗酶液通过针孔滤膜过滤除菌,得到胞内酶溶液;在胞内酶溶液中加入赭曲霉毒素A,在避光环境下,震荡培养,即可实现快速降解赭曲霉毒素A的用途。
优选的,步骤(1)中所述离心的转速为7000r/min,时间为10min。
优选的,步骤(1)中所述的NYDA培养基成分如下:以1000mL计,牛肉膏8g,酵母浸出物5g,葡萄糖10g,琼脂20g,余量为蒸馏水,115℃湿热灭菌15min。
优选的,步骤(1)中所述的NYDB培养基成分如下:以1000mL计,酵母膏5g,葡萄糖10g,牛肉浸膏8g,余量为蒸馏水,pH自然,115℃湿热灭菌15min。
优选的,步骤(1)中所述PM培养基成分如下:麦芽糖2g,蔗糖10g,酵母浸5g,蛋白胨5g,一级蒸馏水1000mL,115℃湿热灭菌15min。
优选的,步骤(1)中所述单菌落接种到PM培养基中进行培养的温度为28℃~30℃,时间为48h。
优选的,步骤(1)中所述用无菌蒸馏水清洗数次具体为2~3次;所述菌悬液的浓度为1×108cells/mL。
优选的,步骤(2)中所述菌悬液接种于PM培养基中的接种量为1%~2%;即菌悬液为PM培养基体积的1%~2%。
优选的,步骤(2)中所述震荡的时间为1~2min;所述冰浴处理的时间为30~35min;所述离心的条件为:4℃,15~20min、11000×g。
优选的,步骤(3)中所述针孔滤膜的孔径为0.22μm,所述滤膜为有机滤膜;所述震荡培养的条件为:28℃,180rpm,时间0~3h。
本发明的优点:
(1)本发明提供隐球酵母Y3的胞内酶可以高效快速降解赭曲霉毒素A,胞内酶与赭曲霉毒素A混合后就能够即时降解,而且降解效果显著;在0h,针对OTA初始浓度为1μg/mL,降解率为83.2%;在OTA初始浓度提高为10μg/mL,在0h的降解率仍为70%以上。
(2)本发明使用的隐球酵母Y3,已经经过小鼠急性毒性试验,确定其具有高度安全性,对人体无害,因此可应用于控制食品、饲料及其制品等中的赭曲霉毒素A污染,保障食品及其制品的食用安全性。
附图说明
图1为隐球酵母Y3的胞内酶对PM培养基中赭曲霉毒素A的降解效果图;其中:1μg/mL、10μg/mL和20μg/mL分别表示OTA与胞内酶溶液混合后的初始浓度。
具体实施方式
通过借助以下实施实例将更加详细的说明本发明;以下实施例仅是说明性的,本发明并不受这些实施实例的限制。
实施例1:
(1)配制菌悬液:将隐球酵母Y3接入NYDB培养基中,在28℃、180rpm震荡条件下,培养24h,进行活化,得到活化后的菌液;然后取活化后的菌液涂布于NYDA固体培养基,培养温度28℃,时间48h;然后,挑选2环NYDA固体培养基生长的隐球酵母Y3单菌落,接种到50mL的PM培养基中进行培养,培养后经离心得到菌体,并用无菌蒸馏水清洗3次,清洗后再次离心,收集菌体用无菌水稀释成1×108cells/mL的菌悬液;
(2)取步骤(1)制备的菌悬液,按照2%的添加量接种于PM培养基中,在28℃、180rpm震荡条件下,培养24h,7000rpm离心10min离心收集酵母菌体,无菌蒸馏水清洗后再次离心收集酵母菌体;然后再加入无菌蒸馏水清洗、离心;如此重复清洗3次;收集菌体后加入液氮速冻菌体,进行研磨,得到粉末状的菌体;然后将粉末状的菌体加入Tris-HCl缓冲液(50mM,pH 7.1)重悬,震荡1min后进行冰浴处理30min,处理后,以11000×g离心15min,收集上清液,即为胞内粗酶液;
(3)再将步骤(2)中得到的胞内粗酶液通过0.22μm有机针孔滤膜过滤除菌,得到胞内酶溶液;在胞内酶溶液中加入赭曲霉毒素A,在避光环境下,180rpm,28℃震荡培养,即可实现降解赭曲霉毒素A的用途。
降解效果:
取样时间选择0、1、2、3h;以无菌缓冲液代替胞内酶为对照组。
在胞内酶溶液中加入赭曲霉毒素A,混合后即去取样,记为0h:
在胞内酶溶液中加入赭曲霉毒素A,混合震荡培养1h后即去取样,记为1h:
在胞内酶溶液中加入赭曲霉毒素A,混合震荡培养2h后即去取样,记为2h:
在胞内酶溶液中加入赭曲霉毒素A,混合震荡培养3h后即去取样,记为3h:
样品加入等量色谱级甲醇,涡旋振荡混匀,然后过0.22μm有机针孔滤头,置于棕色进样瓶中,放在4℃环境中,待用HPLC-FLD测定。
液相检测条件为:采用Zorbax SB-C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm);流动相:乙腈(60%):1%乙酸(40%);流速为1.0mL/min;每次进样20μL,柱温为30℃;荧光检测器的激发波长为333nm,发射波长为460nm;出峰时间约为5.4min。
如图1所示,隐球酵母Y3的胞内酶在0h时,对赭曲霉毒素A的降解率为83.2%(初始浓度为1μg/mL)、70.1%(初始浓度为10μg/mL)和52.4%(初始浓度为20μg/mL);
1h时,对赭曲霉毒素A的降解率为100%(初始浓度为1μg/mL)、99.5%(初始浓度为10μg/mL)和98.9%(初始浓度为20μg/mL);
2h时,液相条件下已经检测不到赭曲霉毒素A;3h时,液相条件下也已经检测不到赭曲霉毒素A。
综合所述,隐球酵母Y3的胞内酶对酶赭曲霉毒素A具有极好的降解效果。
说明:以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案;因此,尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明,但是本领域的普通技术人员应当理解,仍然可以对本发明进行修改或等同替换;而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进,其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。
Claims (10)
1.基于隐球酵母Y3胞内酶降解赭曲霉毒素A的用途,其特征在于,具体步骤如下:
(1)配制菌悬液:将隐球酵母Y3接入NYDB培养基中,在28~30℃、180rpm震荡条件下,培养20~24h,进行活化,得到活化后的菌液;然后取活化后的菌液涂布于NYDA固体培养基,培养温度28℃~30℃,时间48-60h;然后,挑选NYDA固体培养基生长的隐球酵母Y3单菌落接种到PM培养基中进行培养,培养后经离心得到菌体,并用无菌蒸馏水清洗数次,清洗后再次离心,收集菌体用无菌水稀释成菌悬液;
(2)取步骤(1)制备的菌悬液,接种于PM培养基中,在28~30℃、180rpm震荡条件下,培养20~24h,离心收集酵母菌体,无菌蒸馏水清洗后再次离心收集酵母菌体,然后加入液氮速冻菌体,进行研磨,得到粉末状的菌体;然后将粉末状的菌体加入Tris-HCl缓冲液重悬,震荡后进行冰浴处理,处理后离心,收集上清液,即为胞内粗酶液;
(3)再将步骤(2)中得到的胞内粗酶液通过针孔滤膜过滤除菌,得到胞内酶溶液;在胞内酶溶液中加入赭曲霉毒素A,在避光环境下,震荡培养,即可实现降解赭曲霉毒素A的用途。
2.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,步骤(1)中所述离心的转速为7000r/min,时间为10min。
3.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,步骤(1)中所述的NYDA培养基成分如下:以1000mL计,牛肉膏8g,酵母浸出物5g,葡萄糖10g,琼脂20g,余量为蒸馏水,115℃湿热灭菌15min。
4.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,所述的NYDB培养基成分如下:以1000mL计,酵母膏5g,葡萄糖10g,牛肉浸膏8g,余量为蒸馏水,pH自然,115℃湿热灭菌15min。
5.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,步骤(1)中所述PM培养基成分如下:麦芽糖2g,蔗糖10g,酵母浸膏5g,蛋白胨5g,一级蒸馏水1000mL,115℃湿热灭菌15min。
6.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,步骤(1)中所述单菌落接种到PM培养基中进行培养的温度为28℃~30℃,时间为48h。
7.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,步骤(1)中所述用无菌蒸馏水洗涤数次具体为2~3次;所述菌悬液的浓度为1×108cells/mL。
8.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,步骤(2)中所述菌悬液接种于PM培养基中的接种量为1%~2%。
9.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,步骤(2)中所述震荡的时间为1~2min;所述冰浴处理的时间为30~35min;所述离心的条件为:4℃,15~20min、11000×g。
10.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,步骤(3)中所述针孔滤膜的孔径为0.22μm,有机相;所述震荡培养的条件为:28℃,180rpm,时间0~3h。
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