ES2373852B1 - Degradación biológica de ocratoxina a en ocratoxina alfa. - Google Patents
Degradación biológica de ocratoxina a en ocratoxina alfa. Download PDFInfo
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Abstract
Degradación biológica de ocratoxina A en ocratoxina {al}.#La presente invención se refiere al uso de un microorganismo del género Brevibacterium para la degradación biológica de ocratoxina A, preferiblemente el microorganismo es Brevibacterium casei, Brevibacterium linens, Brevibacterium iodinum o Brevibacterium epidermidis. Además, la presente invención se refiere a un método para la producción de ocratoxina {al}, mediante el uso de dicho microorganismo.
Description
Degradación biológica de ocratoxina A en ocratoxina α.
Estado de la técnica anterior
Las micotoxinas son metabolitos secundarios producidos por numerosas especies de mohos, principalmente pertenecientes a los géneros Penicillium, Aspergillus y Fusarium. Actualmente se conocen más de 300 micotoxinas, entre las que se incluyen las aflatoxinas, ocratoxinas, tricotecenos, fumonisinas, zearalenona, citrinina y patulina entre otras. Aunque la toxicidad aguda y subaguda de algunas micotoxinas es bien conocida, preocupan más los efectos de su ingestión a largo plazo, puesto que las pequeñas cantidades ingeridas con los alimentos de forma continuada se acumulan en el organismo pudiendo producir, en algunos casos, efectos mutagénicos y cancerígenos (Martín et al., 1990. Revista de Agroquímica y Tecnología de los Alimentos, 30: 315-332).
Las ocratoxinas son un grupo de micotoxinas producidas sobre diferentes sustratos por algunas especies de hongos, entre las cuales destacan los géneros Aspergillus y Penicillium. Aunque existen varios tipos de ocratoxinas, la ocratoxina A (OTA) es la más tóxica. Debido a que estos mohos son capaces de crecer en una amplia variedad de alimentos, la OTA puede encontrarse en productos cárnicos y lácteos, cacao, frutas, cereales, café, aceite de oliva, frutos secos, especias, alimentos infantiles y productos fermentados como el vino y la cerveza entre otros, en condiciones de humedad, pH y temperatura muy variables (Engelhardt G. et al., 1999. Adv. Food Sci. 21, pag. 88-92; Romani S., et al., 2000. Journal of Agricultural and Food Chemistry 48, pag. 3616-3619).
La OTA es un derivado de la isocumarina que por el grupo carboxilo presenta unida una L-β-fenilalanina. Químicamente es N-[(5-cloro-3,4-dihidro-8-hidroxi-3-metil-1-oxo-1H-2-benzopirano-7-il)carbonil]-L-fenilalanina, una dihidrocumarina clorada unida a través de un grupo carboxilo por una unión amida a una molécula de L-β-fenilalanina. Otros tipos de ocratoxinas son la ocratoxina B (OTB), derivado no clorado de la OTA y menos tóxica, ocratoxina C (OTC), éster de la OTA, con un escaso potencial tóxico, ocratoxina α (OTα) y ocratoxina β (OTβ), productos de la hidrólisis de la OTA y OTB, respectivamente, que no poseen la molécula de fenilalanina y no se consideran tóxicos (Pavón et al., 2007. RCCV Vol. 1 (2)).
En los últimos años, las ocratoxinas y en particular la ocratoxina A, han recibido una especial atención, debido a su elevado poder toxicológico. La ocratoxina A, que tiene un marcado carácter nefrotóxico, se ha relacionado con enfermedades graves, como la “nefropatía endémica de los Balcanes” o tumores en el tracto urinario en personas y la “nefropatía espontánea porcina” o la “nefropatía aviar” en los animales. Además, los estudios realizados con animales y en líneas celulares humanas han puesto de manifiesto sus propiedades carcinogénicas, genotóxicas, inmunotóxicas, hepatotóxicas, neurotóxicas y teratogénicas (Kuiper-Goodman, T. 1996. Food Addit. Contam. 13, pag. 53-57) y se ha detectado en sangre humana después del consumo de alimentos contaminados con ella (Petkova-Bocharova, T. et al., 1988. Food Addit. Contam. 5, pag. 299-301).
Por ello, y para garantizar la salud de los consumidores expuestos a esta micotoxina, en la Unión Europea se han fijado límites en la concentración de OTA permitida en cereales, pasas, café tostado en grano o molido, café instantáneo, vinos y mostos de uva y especias. Los límites varían de acuerdo con la materia prima, pero se encuentran en un rango de 2-10 μg/kg. En el caso de frutos secos derivados de la vid el valor permitido es de 10 μg/kg y el límite para cereales no procesados es de 5 μg/kg, mientras que para productos de cereales procesados destinados al consumo humano directo es de 3 μg/kg. Sin embargo, se ha establecido un límite menor de 0,5 μg/kg para los alimentos procesados a base de cereales cuando éstos están destinados a lactantes y a niños (European Commission Regulation (EC) No. 1881/2006 del 19 de diciembre de 2006). Por su parte, la Organización Mundial de la Salud (OMS) ha propuesto 5 μg/kg como límite máximo de OTA en cereales.
A través del Reglamento UE 105/2010, se fija por primera vez y con carácter temporal para las especias y regaliz un contenido máximo de ocratoxina A, que entra en vigor este mes de julio y que será más estricto a partir de 2012. En el caso de las especias se establecen la concentración máxima de 30 μg/kg desde el 1.7.2010 hasta el 30.6.2012, yde15 μg/kg a partir del 1.7.2012. Las especias consideradas son: Capsicum spp. (frutos de dicho género secos, enteros o pulverizados, con inclusión de los chiles, el chile en polvo, la cayena y el pimentón), Piper spp. (frutos, con inclusión de la pimienta blanca y negra), Myristica fragrans (nuez moscada), Zingiber officinale (jengibre), Curcuma longa (cúrcuma), y mezclas de especias que contengan una o más de las especias antes mencionadas.
Debido por tanto a que OTA representa un problema real en el sector alimentario por su toxicidad y alta presencia en una gran cantidad de alimentos y bebidas, resulta necesario reducir los niveles de esta micotoxina presente en los alimentos. En este contexto, se buscan métodos fiables capaces de degradar esta micotoxina.
En la industria del café, por ejemplo, se ha descrito que la descafeinización con solventes reduce significativamente los niveles de OTA (Heilmann W. et al., 1999. Eur. Food Res. Technol. 209, pag. 297-300), además, la aplicación de tratamientos con ozono se propone también como método de destoxificación de los granos contaminados con OTA (McKenzie K.S. et al., 1997. Food Chem. Toxicol. 35, pag. 807-820). Por otra parte, en bodegas se han realizado diversos estudios para reducir la presencia de OTA en mostos de vinos y en vinos entre los que se incluyen diferentes procedimientos de descontaminación basados en la eliminación físico-química de la toxina (Castellari M. et al., 2001.
J. Agric. Food Chem. 49, pag. 3917-3921; Dumeau F., y Trionè D., 2000. Rev. Fr. Oenol. 95, pag. 37-38; García-Moruno E. et al., 2005. Am. J. Enol. Vitic. 56, pag. 73-76).
La utilización de métodos físicos o químicos para la descontaminación de micotoxinas puede eliminar, además de la micotoxina, muchas sustancias importantes desde el punto de vista organoléptico o nutricional. Por ello, los métodos de degradación biológica de toxinas constituyen una estrategia muy prometedora actualmente.
Respecto a la descontaminación biológica de OTA, en la literatura científica se han descrito enzimas con actividad carboxipeptidasa A (CPA), como la CPA de páncreas bovino (Sigma), capaces de degradar OTA. Estas enzimas hidrolizan el enlace amídico en la molécula de OTA con la producción de L-fenilalanina y ocratoxina α (OTα) (Pitout M.J. 1969. Biochem Pharmacol 18, pag. 485-491).
Posteriormente se ha descrito que algunos microorganismos poseen un mecanismo de acción en la degradación de OTA similar al que llevan a cabo las enzimas CPA, como por ejemplo Phenylobacterium immobile (Wegst W. y Lingens F. 1993. FEMS Letters 17, pag. 341-344), Acinetobacter calcoaceticus, (Hwang C.A., y Draughon F.A. 1994.
J. Food Prot. 57, pag. 410-414) ó Aspergillus niger (Abrunhosa L. y Venancio A. 2007. Biotechnol. Lett. 29, pag. 1909-1914). Además es conocido que algunas cepas de Rhodococcus son capaces de degradar una amplia variedad de compuestos orgánicos, como por ejemplo Rhodococcus erythropolis que recientemente se ha visto que puede degradar aflatoxina B1, una micotoxina estructuralmente diferente a OTA. (Teniola O.D. et al., 2005. Int. J. Food Microbiol. 105, pag. 111-117).
Sin embargo, aunque los resultados obtenidos tienen importantes implicaciones en seguridad alimentaria, ninguno de los microorganismos mencionados en el párrafo anterior y con capacidad para degradar OTA se utilizan en la industria alimentaria.
Por tanto, a pesar de que se han descrito distintos tratamientos basados en métodos físicos, químicos y biológicos para reducir los niveles de ocratoxina A, por ahora ninguno de los tratamientos descritos se pueden utilizar para la destoxificación de OTA en alimentos.
Entre los procedimientos físico-químicos habitualmente utilizados se incluyen lavados físicos-químicos, tratamientos con materiales absorbentes, extracción con solventes, etc. Estos métodos son costosos y pueden eliminar también diversos nutrientes o compuestos importantes desde un punto de vista organoléptico. Por otra parte, actualmente no existe ningún tratamiento biológico empleado para reducir el contenido de OTA en alimentos, bebidas y piensos para animales debido a que ninguno de los microorganismos que se han descrito y con capacidad para degradar OTA están relacionados con alimentos.
Por tanto, existe una dificultad manifiesta a la hora de encontrar un método adecuado para la degradación de ocratoxina A en productos alimentarios de forma que no se alteren las características del alimento tanto desde el punto de vista organoléptico como nutricional.
Descripción de la invención
La presente invención se refiere al uso de un microorganismo perteneciente al género Brevibacterium para la degradación biológica de ocratoxina A. Además, la presente invención se refiere al uso de dicho microorganismo para la producción de ocratoxina α que procede de la degradación biológica de ocratoxina A. Este microorganismo se puede utilizar para la degradación biológica de ocratoxina A en productos alimentarios.
La presente invención provee un método para la degradación biológica de ocratoxina A mediante Brevibacterium generando OTα, un producto no tóxico para rumiantes (Kiessling et al., 1984. Applied and environmental microbiology, 47(5): 1070-1073) o en otros mamíferos (Application for the Approval of the use REGENASURE® Non-Shellfish Glucosamine Hydrochloride from Aspergillus niger (RGHAN), for use in Certain Foods Products under Regulation (EC) No 258/97 for the European Parliament and of the Council of 27 January 1997 concerning novel foods and novel food ingredients. FINAL NON-CONFIDENTIAL 4 August, 2006).
Es de destacar que en la presente invención se ha estudiado el potencial de diferentes cepas pertenecientes a los géneros Pseudomonas, Brevibacterium y Rhodococcus. Sin embargo, y a pesar de que todas las cepas ensayadas tienen una demostrada actividad en la degradación de compuestos orgánicos, como por ejemplo Rhodococcus erytropolis que, como se ha comentado anteriormente, es capaz de degradar aflatoxina B1, una micotoxina estructuralmente diferente a OTA, a lo largo de la presente invención (Ejemplo 1, Tabla 1) se demuestra que de las cepas ensayadas sólo las pertenecientes al género Brevibacterium son capaces de degradar OTA, siendo dicha actividad una característica común de todas las cepas pertenecientes a dicho género.
El genero Brevibacterium se incluye entre las Actinobacterias, bacterias Gram positivas que aunque incluye especies aisladas del suelo, la mayoría de las especies de este género se han aislado de leche y quesos, como por ejemplo, pero sin limitarse, B. linens, B. casei y B. iodinum las cuales se utilizan en la industria alimentaria para aplicaciones tales como la formación de aroma, la coloración de la superficie y la maduración de varios tipos de queso.
Por tanto, la presente invención describe un método adecuado para la degradación de ocratoxina A en productos alimentarios de forma que no se alteren las características del alimento tanto desde el punto de vista organoléptico como nutricional. Además se ha comprobado que la degradación de esta micotoxina mediante la utilización de Brevibacterium da lugar a la síntesis de ocratoxina α. Por todo ello, la presente invención proporciona un método para la destoxificación biológica de OTA y la síntesis de OTα en alimentos mediante la utilización de microorganismos del género Brevibacterium.
Por tanto, mediante la presente invención se aporta al estado de la técnica una solución al problema de la degradación de ocratoxina A en productos alimentarios mediante un método biológico, respetuoso con las características organolépticas y nutricionales del alimento, basado en el uso de un microorganismo perteneciente al género Brevibacterium, ampliamente utilizado en la industria alimentaria del queso, microorganismo que no se ha relacionado con la degradación de Ocratoxina hasta el momento.
Así, un primer aspecto de la presente invención se refiere al uso de un microorganismo perteneciente al género Brevibacterium para la degradación biológica de ocratoxina A. El microorganismo se selecciona, pero sin limitarse, de la lista que comprende preferentemente microorganismos de las especies Brevibacterium casei, Brevibacterium linens, Brevibacterium iodinum o Brevibacterium epidermidis.
En adelante, para hacer referencia a cualquier microorganismo perteneciente al género Brevibacterium se emplea el término “microorganismo de la presente invención” o “microorganismo de la invención”.
El término “degradación biológica” hace referencia a la transformación de una sustancia compleja en otra de estructura más sencilla por medio de microorganismos. Tal y como se utiliza en la presente descripción, el término degradación biológica hace referencia a la transformación de ocratoxina A por medio de un microorganismo de la invención. La transformación de ocratoxina A da lugar a la aparición de otras sustancias, como por ejemplo, pero sin limitarse ocratoxina α. La ocratoxina A puede estar presente en muchos tipos de sustrato como por ejemplo pero sin limitarse, un producto alimentario, donde dicho producto alimentario es, preferentemente, un cereal o una especia.
Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso del microorganismo de la invención, donde la degradación biológica tiene lugar en, al menos, un producto alimentario.
El término “producto alimentario” tal y como se utiliza en la presente descripción, hace referencia a todas aquellas sustancias o productos de cualquier naturaleza, sólidos o líquidos, naturales o transformados que, por sus características, aplicaciones, componentes, preparación y estado de conservación son susceptibles de ser habitual e idóneamente utilizados para la normal nutrición humana o animal, como fruitivos o como productos dietéticos, en casos especiales de alimentación. Así como a todas las materias no nocivas, en sentido absoluto o relativo, que, sin valor nutritivo, puedan ser utilizadas en la alimentación, tanto humana como animal. Preferentemente, el producto alimentario está destinado al consumo humano o al consumo animal, y debido a que los contenidos más altos de ocratoxina se encuentran en los cereales, preferentemente, el producto alimentario es un cereal o una especia obtenida a partir de la planta que se selecciona de la lista que comprende, pero sin limitarse, Capsicum spp., Piper spp., Myristica fragrans, Zingiber officinale (jengibre), Curcuma longa (cúrcuma), o cualquiera de sus mezclas. Además, el producto alimentario puede ser regaliz.
Diferentes estudios (como por ejemplo Abrunhosa L. et al., 2002. J. Sgric. Food Chem. 50, pag. 7493-7496) demuestran que la hidrólisis enzimática de OTA con la enzima CPA da como resultado dos compuestos, uno de los cuales posee un tiempo de retención cercano al del estándar de OTα (obtenido mediante la hidrólisis ácida de OTA).
Por otro lado, en los ejemplos de la invención se puede ver que las cepas de Brevibacterium no sólo son capaces de degradar OTA completamente (ver ejemplo 2) sino que estudios más específicos con B. casei RM101 y B. linens DSM 20425T (ver ejemplo 3) indican también que ambas cepas pudieron crecer en ausencia de glicerol en un medio de cultivo que contenía OTA como única fuente de carbono. Además, las cantidades detectadas de OTα en los sobrenadantes de los cultivos en ambas cepas, se correspondían con la concentración teórica producida a partir de la hidrólisis completa de OTA añadida al medio (Ejemplo 3, Tabla 3).
Con todos estos datos se puede concluir que la hidrólisis de OTA puede dar lugar a L-fenilalanina y OTα, pero la Lfenilalanina liberada durante el proceso puede ser utilizada como fuente de carbono durante el crecimiento bacteriano corroborando que los diferentes extractos de B. linens ensayados contienen una enzima con actividad carboxipeptidasa y que, una vez ha hidrolizado el enlace amídico de la molécula de OTA produciendo OTα y L-fenilalanina, actúan otras enzimas en las L-fenilalaninas obtenidas metabolizándolas, explicando así, que en los ejemplos de la presente invención sólo se obtenga OTα.
Por tanto, otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de, al menos una molécula con actividad biológica producida por el microorganismo de la invención, para la degradación biológica de OTA donde preferentemente la molécula con actividad biológica según el aspecto anterior es una proteína capaz de degradar OTA en, al menos, OTα. Esta proteína preferentemente es una enzima con actividad carboxipeptidasa.
En adelante, para hacer referencia a cualquier molécula con actividad biológica producida por el microorganismo de la invención, capaz de degradar ocratoxina A en, al menos, ocratoxina α según el párrafo anterior, se puede emplear el término “molécula de la presente invención”, “molécula de la invención”, “proteína de la presente invención” o “proteína de la invención”.
Aunque el genoma del microorganismo Brevibacterium linens no está completamente secuenciado, ya hay más de 50 proteínas anotadas con función de “peptidasas” de las cuales 6 son carboxipeptidasas cuyas secuencias aminoacídicas vienen definidas por SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6. Por ello, la enzima con actividad carboxipeptidasa según se describe en el párrafo anterior puede poseer una secuencia aminoacídica que se selecciona, pero sin limitarse, de la lista que comprende: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3,SEQ ID NO: 4, SEQID NO: 5 o SEQ ID NO: 6.
Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de una composición que comprende el microorganismo de la invención y/o la molécula de la invención para la degradación biológica de ocratoxina A.
Además, debido a que como ya se ha comentado, la degradación de OTA por bacterias de Brevibacterium spp. observada en este estudio da como resultado OTα (ver ejemplo 3), otro aspecto se refiere al uso del microorganismo de la invención, la molécula de la invención, o la composición que comprende el microorganismo de la invención o que comprende la molécula de la invención, o al uso de cualquiera de las combinaciones de los productos anteriores, para la producción de OTα que procede de la degradación biológica de ocratoxina A.
Otro aspecto de la presente invención se refiere al método para la degradación biológica de ocratoxina A, en adelante “primer método de la invención” que comprende:
- a.
- utilizar al menos una bacteria perteneciente al género Brevibacterium,
- b.
- poner en contacto la bacteria del paso (a) con una solución acuosa y,
- c.
- poner en contacto el producto obtenido en el paso (b) con ocratoxina A.
En una realización preferida del primer método de la invención, la solución acuosa del paso (b) permite la supervivencia de la bacteria utilizada en el paso (a) perteneciente al género Brevibacterium.
En una realización aún más preferida del primer método de la invención, la degradación biológica de OTA produce OTα. Y, en otra realización aún más preferida, el producto en el paso (c) se pone en contacto con un producto alimentario que contiene ocratoxina A, es decir, en el paso (c) se pone en contacto el producto obtenido en el paso (b) con OTA a través de un producto alimentario que contiene esta micotoxina. Preferentemente el producto del paso (c) se pone en contacto con el producto alimentario por nebulización.
En una realización más preferida del primer método de la invención, el producto obtenido en el paso (c) se incuba a una temperatura de entre 10 y 50ºC durante un tiempo de entre 1 hora y 20 días.
Otro aspecto de la presente invención se refiere al método para la degradación biológica de OTA, en adelante “segundo método de la invención” que comprende:
- a.
- utilizar al menos una molécula con actividad biológica o molécula de la invención, aislada de una bacteria perteneciente al género Brevibacterium,
- b.
- poner en contacto la molécula con actividad biológica obtenida en el paso (a) con ocratoxina A, y
- c.
- incubar el producto obtenido en el paso (b) a una temperatura de entre 10 y 50ºC durante un tiempo de entre 30 minutos y 30 días.
donde la degradación biológica de OTA según el segundo método de la invención produce ocratoxina α.
En una realización preferida del segundo método de la invención, la molécula en el paso (b) se pone en contacto con un producto alimentario que contiene OTA, es decir, en el paso (b) se pone en contacto la molécula obtenida en el paso (a) con OTA a través de un producto alimentario que contiene esta micotoxina.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra “comprende” y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
Descripción de las figuras
Fig. 1. Cromatograma del análisis del sobrenadante de B. casei RM101 cultivado en medio salino basal sin fuente de carbono pero con OTA (40 mg/L). Detector fluorimétrico, λEx (longitud de onda de excitación) = 330 nm; λEm (longitud de onda de emisión) = 460 nm.
1A. Muestra el sobrenadante a tiempo 0 (T0). En el eje de ordenadas se representa la absorbancia medida en LU (unidades de luminiscencia) y en el eje de abscisas se representa el tiempo medido en minutos (min.).
1B. Muestra el sobrenadante después de 10 días de crecimiento. Puede observarse la desaparición del pico de OTA y la aparición del pico de OTα. En el eje de ordenadas se representa la absorbancia medida en LU (unidades de luminiscencia) y en el eje de abscisas se representa el tiempo medido en minutos (min.).
Fig. 2. Espectros UV/VIS (ultravioleta/visible) de OTα, en el sobrenadante de B. casei RM101 cultivado en medio salino basal sin fuente de carbono pero con OTA (40 mg/L).
2A. Muestra el aspecto de ocratoxina α obtenido con el detector de diodo Array (DAD). En el eje de ordenadas se representa la absorbancia medida en mAU (mili-unidad de absorción) y en el eje de abscisas se representa la longitud de onda medida en nanómetros (nm.).
2B. Muestra el aspecto de ocratoxina α obtenido con el detector fluorimétrico (FLD). En el eje de ordenadas se representa la absorbancia medida en LU (unidades de luminiscencia) y en el eje de abscisas se representa la longitud de onda medida en nanómetros (nm.). Longitud de onda de excitación (λex) =330 nm.
Fig. 3. Espectro de masas de OTα en el sobrenadante de B. casei RM101 cultivado en medio salino basal sin fuente de carbono pero con OTA (40 mg/L).
En el eje de ordenadas se representa la abundancia de iones y en el eje de abscisas se representa la relación masa/número de carga (m/z).
Ejemplos
A continuación se ilustrará la invención mediante una serie de ensayos realizados por los inventores, que ponen de manifiesto la alta eficacia que poseen los microorganismos pertenecientes al género Brevibacterium para transformar la micotoxina OTA en OTα. Se muestra como la OTA es degradada completamente por Brevibacterium y como esta degradación da lugar a la síntesis de OTα.
Además, debido al creciente uso de estos microorganismos en la industria alimentaria, resultan altamente recomendables para ser utilizados en la degradación de OTA sobre alimentos potencialmente contaminados con esta micotoxina.
Los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan en este documento de patente sirven para ilustrar la naturaleza de la presente invención. Estos ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones a la invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos más adelante ilustran la invención sin limitar el campo de aplicación de la misma. Así, aunque en los ejemplos de la presente invención se han usado algunas cepas determinadas pertenecientes a Brevibacterium, estos ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones de la invención que aquí se reivindica, siendo los resultados extrapolables a cualquier bacteria del género Brevibacterium spp., y preferentemente a las especies Brevibacterium casei, Brevibacterium linens, Brevibacterium iodinum o Brevibacterium epidermidis.
Ejemplo 1
Detección de la capacidad de degradar OTA que tienen diferentes cepas de Pseudomonas, Rhodococcus y Brevibacterium
Debido a que las bacterias del suelo son capaces de transformar una gran variedad de compuestos aromáticos, varias especies de Actinobacterias y Pseudomonas se cultivaron inicialmente en medios líquidos de cultivo sintéticos como BSM (Medio Basal Salino) en presencia de OTA (10 μg/L).
Para detectar la capacidad de degradar OTA, se han utilizado cultivos de las cepas Rhodococcus erythropolis CECT 3008, Rhodococcus eryhtropolis IGTS8, Pseudomonas putida DSMZ 291, Pseudomonas putida KT2442 y siete cepas de distintas especies del género Brevibacterium.
Rhodococcus erythropolis CECT 3008 (DSMZ 43060) fue obtenida de la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT). Pseudomonas putida DSM 291T y seis cepas de Brevibacterium pertenecían a la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (DSMZ) (Brevibacterium epidermidis DSM 20660T, Brevibacterium iodinum DSM 20626T, Brevibacterium linens DSM 20425T, Brevibacterium casei DSM 20657T, Brevibacterium casei DSM 9657, Brevibacterium casei DSM 20658). La cepa Brevibacterium casei, RM101, se aisló en el Instituto de Fermentaciones Industriales IFI-CSIC, y se ha identificado mediante la secuenciación del 16S rDNA. Rhodococcus erythropolis IGTS8 y Pseudomonas putida KT2442 fueron proporcionadas por el Dr. Eduardo Díaz, del Centro de Investigaciones Biológicas del CSIC.
Todas las bacterias se cultivaron en medio líquido “Luria-Bertani” (LB) suplementado con 0,5% de glucosa e incubado a 30ºC en condiciones aeróbicas. En la prueba de degradación de OTA, las bacterias se cultivaron en medio basal salino (BSM) que contenía un 0,2% de glicerol, 4 g de NaH2PO4-H2O,4gde K2HPO4-3H2O, 2 g de NH4Cl,
- 0.2
- g de MgCl2-6H2O, 0.001 g de CaCl2-2H2O, y 0.001 g de FeCl3-6H2O (Denome et al., 1994). El glicerol no se incluyó en los experimentos llevados a cabo para conocer el uso potencial de OTA como única fuente de carbono por parte de las bacterias analizadas.
- 1.2.
- Estándar de OTA y OTα
La OTA en forma sólida se adquirió a Sigma (Sigma-Aldrich) y se diluyó en metanol al 99% en condiciones estériles para obtener una solución stock de 500 μg/mL. También se adquirió una solución estándar de OTα (11,9 μg/mL) a LGC Standards (Alemania) que se diluyó 1:2 en acetonitrilo para obtener una solución patrón de 5,9 μg/mL.
1.3. Prueba de degradación de OTA
Inicialmente, algunas cepas de Actinobacterias (Rhodococcus erythropolis CECT 3008, Rhodococcus erythropolis IGTS8 y Brevibacterium casei RM101) y Pseudomonas (P. putida DSMZ 291T y P. putida KT2442) se cultivaron en 25 mL de medio BSM al que se le había añadido OTA (10 μg/L, aprox.) a 30ºC bajo condiciones aeróbicas hasta la fase exponencial de crecimiento. Los sobrenadantes de los cultivos se analizaron mediante HPLC para determinar la concentración de OTA presente.
En todas las pruebas de degradación, las células se separaron de los sobrenadantes mediante centrifugación a 3000 x g durante 10 min a 4ºC y se analizaron éstos últimos por HPLC. En el caso de Brevibacterium las células sedimentadas se conservaron a -80ºC para sucesivos análisis. Se prepararon también controles del medio BSM con OTA y sin bacterias.
1.4. Cuantificación por HPLC y espectrometría de masas de OTA y OTα
Se cuantificó la concentración de OTA presente en los sobrenadantes, en las células sedimentadas y en las soluciones de lavado de las células sedimentadas según el método que se divulga en Del Prete V. et al., 2007. Journal of food protection, 70(9), pag. 2155-2160.
Para la determinación y cuantificación de OTA se utilizó un cromatógrafo HPLC Hewlett-Packard modelo I, serie 1100 (Hewlett-Packard, Palo Alto, Calif.), equipado con un desgasificador, una bomba cuaternaria, un inyector automático, un detector DAD y un detector de fluorescencia (FLD). Se utilizó una columna Alltima C18 (5 μm), 200 mm 4,6 mm. La fase móvil fue: eluente (A), acetonitrilo; eluente (B), agua (grado HPLC)/acetonitrilo/ácido acético glacial
(89:10:1 v/v); eluente A:B = 37:63 (v/v), en isocrática; flujo, 1,3 mL/min; temperatura, 30ºC; tiempo del análisis, 20 min; detector FLD (λex=330 nm, λem=460 nm) y detector DAD (330 nm); volumen de inyección, 100 μL. El límite de detección para OTA en estas condiciones fue de 0,02 μg/L. El estándar de OTA se inyectó a dos concentraciones: 20 y 50 μg/L y el estándar de OTα se inyectó a una concentración de 5,9 mg/L. Las muestras, diluidas en el eluyente A:B, se inyectaron directamente para su análisis mediante HPLC.
Las células sedimentadas de Brevibacterium se resuspendieron dos veces en 2 mL de metanol absoluto durante 1
h. para extraer la OTA. Después de centrifugar a 3,000 x g durante 15 min a 20ºC, se separaron los sobrenadantes, se recogieron en viales de 5 mL y se evaporaron a sequedad mediante nitrógeno. Para determinar la concentración de OTA los residuos secos se disolvieron en la fase móvil de HPLC en el momento del análisis cromatográfico.
Para la realización del ensayo mediante espectrometría de masas se utilizó un cromatógrafo Hewlett-Packard serie 1100 MSD (Palo Alto, CA) acoplado a un detector de masas cuadrupolo con una interfase de ionización por electrospray (ESI). La separación se llevó a cabo mediante inyección directa. Los parámetros de ESI utilizados fueron: flujo de N2 a 10 L/min, temperatura de N2 330ºC; presión del nebulizador, 40 psi; voltaje capilar, 4000 V. El ESI se operó en modo negativo, empleando un rango de masas entre m/z 100 y 800, utilizando un gradiente variable en el voltaje de fragmentación.
En la Tabla 1 se muestran los resultados obtenidos de las especies de Actinobacterias y Pseudomonas analizadas, capaces de transformar una gran variedad de compuestos aromáticos.
En la tabla 1 se puede observar la disminución de ocratoxina A (OTA) en medio BSM por algunas especies de Actinobacterias y Pseudomonas. La disminución en la concentración de OTA observada es del 8 al 25% al analizar los sobrenadantes de los cultivos en las cepas de Rhodococcus erythropolis y Pseudomonas putida. La poca disminución observada parece indicar que estas bacterias no poseen un mecanismo de degradación de OTA y que probablemente la OTA se adsorbe en la superficie de las células, de manera similar a lo descrito para bacterias lácticas (Del Prete V. et al., 2007. Journal of food protection, 70(9), pag. 2155-2160) y levaduras (Cecchini F. et al., 2006. Food Microbiol. 23, pag. 411-417.). Por otra parte, en estas cepas los análisis cromatográficos mediante HPLC no muestran la presencia de productos de degradación de OTA.
En el caso de la cepa de Brevibacterium casei RM101, la OTA desapareció totalmente de los sobrenadantes de los cultivos.
Ejemplo 2
Degradación de OTA por Brevibacterium
Se realizaron pruebas adicionales utilizando un número mayor de cepas de Brevibacterium para confirmar lo observado con B. casei RM101 y para verificar si esta habilidad es una característica específica de la cepa, de la especie
o del género en estudio.
Así, para confirmar la degradación de OTA por Brevibacterium spp., las cepas se cultivaron en medio BSM con una concentración de OTA cuatro veces mayor (40 μg/L). Las cepas de Brevibacterium se cultivaron en condiciones aeróbicas en agitación a 150 rpm durante 10 días. Estos ensayos se realizaron en medios de cultivo conteniendo OTA a una concentración 40 μg/L. Niveles de OTA equivalentes a 40 μg/L se encuentran raramente en alimentos o bebidas. Las pruebas de degradación se realizaron como se describe en el ejemplo 1.
TABLA 2
Disminución de ocratoxina A (OTA) en medio BSM por Brevibacterium
Los ensayos de degradación de OTA indican una desaparición total de la toxina en todas las cepas de las diferentes especies de Brevibacterium analizadas. La OTA añadida al medio en una concentración 40 μg/L no se detectó mediante HPLC en ninguno de los sobrenadantes de los cultivos (Tabla 2). Por otra parte, después de la extracción con metanol tampoco se detectó la presencia de OTA ni en las células sedimentadas, ni en las soluciones de lavado.
Estos resultados corroboran los resultados anteriores e indican que todas las cepas de Brevibacterium son capaces de degradar OTA. El género Brevibacterium agrupa a un grupo heterogéneo de nueve especies corineformes los cuales son capaces de degradar insecticidas (DTT, DDE, etc.), así como de producir proteasas extracelulares. Estas bacterias se pueden encontrar en diferentes hábitats entre los que se incluyen el suelo, aves de corral, peces, piel humana y en alimentos.
Ejemplo 3
Mecanismo de degradación de OTA por Brevibacterium
Se utilizaron las cepas B. casei RM101 y B. linens DSM 20425T, para comprobar la capacidad de estas cepas para degradar OTA a una concentración mayor (40 mg/L), 1000 veces superior a la concentración utilizada en la prueba anterior, y para comprobar la capacidad de estas cepas para utilizar OTA como única fuente de carbono. Para ello las cepas se cultivaron en medio BSM en el cual el glicerol (0.2%) y la OTA (40 mg/L) estaban o no presentes y así estudiar la posible utilización de OTA como única fuente de carbono. Las pruebas de degradación se realizaron como se describe en el ejemplo 1.
Se ha podido elucidar el mecanismo de degradación de OTA llevado a cabo por Brevibacterium spp. al analizar los datos de HPLC y espectrometría de masas de estas cepas, B. casei RM101 y B. linens DSM 20425T.
TABLA 3
Disminución de ocratoxina A (OTA) y producción de ocratoxina α (OTα) por Brevibacterium casei RM101 y
Brevibacterium linens DSM 20425T en medio BSM con diferente composición
Los resultados obtenidos (Tabla 3) nuevamente indican que ambas cepas de Brevibacterium degradan completamente la OTA presente en el medio de cultivo. El ensayo que se ha realizado utilizando medio BSM sin la fuente de carbono tradicional (glicerol) demostró que las cepas de B. casei RM101 y B. linens DSM 20425T son capaces de utilizar OTA como única fuente de carbono.
Paralelamente, el análisis de los cromatogramas correspondientes a los sobrenadantes de los cultivos, indica la ausencia del pico correspondiente a OTA y la aparición en el perfil de elución de un pico nuevo con un tiempo de retención y espectro diferente (Figura 1). El enlace amídico presente en la OTA se puede hidrolizar enzimáticamente mediante una CPA con la consiguiente producción de L-fenilalanina y OTα. El espectro UV/VIS del compuesto generado (Figura 2) es idéntico al que presenta el estándar correspondiente a OTα. Por otra parte, los resultados del análisis HPLC-MS han permitido confirmar la identificación del producto de la degradación como OTα puesto que se observó un pico de ion molecular [M-H]-a m/z 255 en espectrometría de masas (PM OTα = 256) (Figura 3).
Las dos cepas de Brevibacterium estudiadas, B. casei RM101 y B. linens DSM 20425T, fueron capaces de crecer en ausencia de glicerol tal y como se observó mediante el aumento de la turbidez en el medio de cultivo. En un medio de cultivo conteniendo OTA como única fuente de carbono, la población bacteriana creció más lentamente si se compara con los cultivos crecidos en medio con glicerol y OTA; sin embargo, hay que señalar que en todos los casos la OTA se degradó completamente. Estos resultados indican la existencia en las cepas de Brevibacterium spp. de una enzima tipo carboxipeptidasa, que hidroliza el enlace amídico presente en la molécula de OTA. La L-fenilalanina liberada puede ser utilizada como fuente de carbono durante el crecimiento bacteriano. La Tabla 3 muestra la concentración de OTα recuperada de los sobrenadantes de los cultivos. Las dos cepas estudiadas, B. casei RM101 y B. linens DSM 20425T, producen cantidades equivalentes de OTα independientemente de si el medio BMS contiene glicerol o no. Las cantidades detectadas de OTα corresponden a la concentración teórica producida a partir de la hidrólisis completa de la OTA añadida al medio.
Claims (24)
- REIVINDICACIONES1. Uso de un microorganismo perteneciente al género Brevibacterium para la degradación biológica de ocratoxinaA.
-
- 2.
- Uso del microorganismo según la reivindicación 1, donde el microorganismo es Brevibacterium casei, Brevibacterium linens, Brevibacterium iodinum o Brevibacterium epidermidis.
-
- 3.
- Uso de un microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones1ó2, donde la degradación biológica de ocratoxina A tiene lugar en, al menos, un producto alimentario.
-
- 4.
- Uso según la reivindicación 3, donde el producto alimentario está destinado al consumo humano.
-
- 5.
- Uso según la reivindicación 3, donde el producto alimentario está destinado al consumo animal.
-
- 6.
- Uso según cualquiera de las reivindicaciones3a5, donde el producto alimentario es un cereal.
-
- 7.
- Uso según cualquiera de las reivindicaciones3a5, donde el producto alimentario es una especia.
-
- 8.
- Uso de al menos una molécula con actividad biológica producida por el microorganismo según se describe en cualquiera de las reivindicaciones1ó2, para la degradación biológica de ocratoxina A.
-
- 9.
- Uso según la reivindicación 7 donde la molécula con actividad biológica es una proteína.
-
- 10.
- Uso según la reivindicación 8, donde la proteína degrada ocratoxina A en, al menos, ocratoxina α.
-
- 11.
- Uso de una composición, que comprende el microorganismo según se describe en cualquiera de las reivindicaciones1ó2, para la degradación biológica de ocratoxina A.
-
- 12.
- Uso de una composición que comprende la molécula con actividad biológica, según se describe en cualquiera de las reivindicaciones8a10, para la degradación biológica de ocratoxina A.
-
- 13.
- Uso de una composición que comprende el microorganismo según se describe en cualquiera de las reivindicaciones1ó2yla molécula con actividad biológica según se describe en cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, para la degradación biológica de ocratoxina A.
-
- 14.
- Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, para la producción de ocratoxina α que procede de la degradación biológica de ocratoxina A.
- 15. Método para la degradación biológica de ocratoxina A, que comprende:
- a.
- Utilizar al menos una bacteria perteneciente al género Brevibacterium,
- b.
- poner en contacto la bacteria del paso (a) con una solución acuosa y,
- c.
- poner en contacto el producto obtenido en el paso (b) con ocratoxina A.
-
- 16.
- Método según la reivindicación 15, donde la solución acuosa del paso (b) permite la supervivencia de la bacteria.
-
- 17.
- Método según cualquiera de las reivindicaciones 15 ó 16, donde la degradación biológica de ocratoxina A produce ocratoxina α.
-
- 18.
- Método según cualquiera de las reivindicaciones 15 ó 16, donde el producto del paso (c) se pone en contacto con un producto alimentario que contiene ocratoxina A.
-
- 19.
- Método según la reivindicación 18, donde el producto del paso (c) se pone en contacto con el producto alimentario por nebulización.
-
- 20.
- Método según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19, donde el producto obtenido en el paso (c) se incuba a una temperatura de entre 10 y 50ºC durante un tiempo de entre 1 hora y 20 días.
- 21. Método para la degradación biológica de ocratoxina A, que comprende:a. Utilizar al menos una molécula con actividad biológica, según se describe en cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, aislada de una bacteria perteneciente al género Brevibacterium,
- b.
- poner en contacto la molécula con actividad biológica obtenida en el paso (a) con ocratoxina A, e
- c.
- incubar el producto obtenido en el paso (b) a una temperatura de entre 10 y 50ºC durante un tiempo de entre 30 minutos y 30 días.
- 22. Método según la reivindicación 21, donde la degradación biológica de ocratoxina A produce ocratoxina α.
- 23. Método según cualquiera de las reivindicaciones 21 ó 22, donde la molécula del paso (b) se pone en contacto con un producto alimentario que contiene ocratoxina A.LISTA DE SECUENCIAS<110> Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC)<120> Degradación biológica de ocratoxina A en ocratoxina α<130> 1641.696<160> 6<170> PatentIn version 3.5<210> 1<211> 390<212> PRT<213> Brevibacterium linens<400> 1 <210> 2<211> 372<212> PRT<213> Brevibacterium linens<400> 2<210> 3<211> 485<212> PRT<213> Brevibacterium linens<400> 3<210> 4<211> 359<212> PRT<213> Brevibacterium linens<400> 4 <210> 5<211> 408<212> PRT<213> Brevibacterium linens<400> 5<210> 6<211> 389<212> PRT<213> Brevibacterium linens<400> 6OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPANAINFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA51 Int. Cl. Ver Hoja Adicional21 N.o solicitud: 201031188 22 Fecha de presentaci6n de la solicitud: 29.07.2010 32 Fecha de prioridad:DOCUMENTOS RELEVANTES
- Categoria
- Documentos citados Reivindicaciones afectadas
- A
- ABRUNHOSA, L., et al. Biodegradation of ochratoxin A for food and feed decontamination. Toxins. 1-23
- Mayo 2010. Vol 2, no 5, paginas 1078-1099. ISSN 2072-6651 (Electr6nico).
- Ver todo el documento.
- A
- RODRIGUES, I., et al. Microorganisms and their enzymes for detoxifying mycotoxins posing a risk 1-23
- to l ivestock animals. I n: A CS S ymposium S eries (ISSN 0097-6156 (impreso)); M ycotoxin
- Prevention and Control in Agriculture. Edited by M. Appell et al. Washington DC. ACS 2009,
- paginas 107-117. ISBN 978-0-8412-6990-3(H). Ver todo el documento, especialmente
- paginas 110-111.
- A
- SINGH, V.P. Enzymatic transformations of xenobiotics of health and environmental concern. In: 1-23
- Biotransformations Bioremediation Technology for Health and Environmental Protection. Edited by
- Singh Ved Pal and Stapleton Raymond D. 2002, Vol. 36, paginas 129-148.
- ISBN: 978-0-444-50997-0. Ver paginas 139-141 y figura 3.
- A
- US 20040208956 A1 (SCHATZMAYR, G.; HEIDLER, D.; FUCHS. E.; BINDER, E.M.) 21.10.2004, 1-23
- todo el documento.
- Categoria de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoria A: refleja el estado de la tecnica O: referido a divulgaci6n no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentaci6n de la solicitud E: documento anterior, pero publicado despues de la fecha de presentaci6n de la solicitud
- El presente informe ha sido realizado � para todas las reivindicaciones � para las reivindicaciones no:
- Fecha de realizaci6n del informe 29.11.2011
- Examinador B. Perez Esteban Pagina 1/4
INFORME DEL ESTADO DE LA TECNICANo de solicitud: 201031188CLASIFICACION OBJETO DE LA SOLICITUDC12P17/06 (2006.01) C07D311/76 (2006.01) C12R1/13 (2006.01)Documentaci6n minima buscada (sistema de clasificaci6n seguido de los simbolos de clasificaci6n)C12P, C07D, C12RBases de datos electr6nicas consultadas durante la busqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, terminos de busqueda utilizados)INVENES, EPODOC, WPI, TXTUS0, TXTUS1, TXTUS2, TXTUS3, TXTEP1, TXTGB1, TXTWO1, MEDLINE, BIOSIS, NPL, EMBASE, XPESP, EBI (EMBL All)Informe del Estado de la Tecnica Pagina 2/4OPINION ESCRITANo de solicitud: 201031188Fecha de Realizaci6n de la Opini6n Escrita: 29.11.2011Declaraci6n- Novedad (Art. 6.1 LP 11/1986)
- Reivindicaciones 1-23 SI
- Reivindicaciones
- NO
- Actividad inventiva (Art. 8.1 LP11/1986)
- Reivindicaciones 1-23 SI
- Reivindicaciones
- NO
Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicaci6n industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y tecnico de la solicitud (Articulo 31.2 Ley 11/1986).Base de la Opini6n.-La presente opini6n se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica.Informe del Estado de la Tecnica Pagina 3/4OPINION ESCRITANo de solicitud: 2010311881. Documentos considerados.-A continuaci6n se relacionanlos documentos pertenecientes al estado de la tecnica tomados en consideraci6n para la realizaci6n de esta opini6n.- Documento
- Numero Publicaci6n o Identificaci6n Fecha Publicaci6n
- D01
- ABRUNHOSA, L., et al. Toxins. Mayo 2010. Vol 2, no 5, paginas 1078-1099. ISSN 2072-6651 (Electr6nico). Mayo-2010
- D02
- RODRIGUES, I., et al. Microorganisms a nd their enzymes for detoxifying mycotoxins posing a risk to livestock animals. In: ACS Symposium Se ries (ISSN 0097-6156 (impreso)); Mycotoxin Prevention and Control in Agriculture. Edited by M. Appell et al. Washington DC. ACS 2009, paginas 107-117. ISBN 978-0-8412-6990-3(H). 2009
- D03
- SINGH, V.P. Enzymatic transformations of xenobiotics of health and environmental concern. In: Biotransformations Bioremediation Technology for Health and Environmental Protection. Edited by Singh Ved Pal and Stapleton Raymond D. 2002, Vol. 36, paginas 129-148. ISBN: 978-0-444-50997-0. 2002
- D04
- US 20040208956 A1 (SCHATZMAYR, G.; HEIDLER, D.; FUCHS. E.; BINDER, E.M.) 21.10.2004
- 2. Declaraci6n motivada segun los articulos 29.6 y 29.7 del Reglamento de ejecuci6n de la Ley 11/1986, de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaraci6nLa presente solicitud de patente describe y reivindica el uso de un microorganismo del genero Brevibacterium, y de una molecula con actividad biol6gica producida por el, para la degradaci6n biol6gica de ocratoxina A (OTA) y la consiguiente producci6n de ocratoxina a. Preferentemente, el microorganismo es Brevibacterium casei, Brevibacterium linens, Brevibacterium iodinum o Brevibacterium epidermidis.No se han encontrado en el estado de la tecnica documentos que describan el procedimiento de la solicitud tal y como esta reivindicado, ni documentos cuya combinaci6n, obvia para el experto en la materia, conduzca de forma evidente al objeto reivindicado. Por tanto, la solicitud es nueva ytiene actividad inventiva segun los articulos 6 y 8 de la Ley11/1986 de Patentes.A continuaci6n se citan variosdocumentos cercanos a la solicitud, pero que en ningun caso afectan la novedad ni la actividad inventiva de la misma.El documento D01 es una revisi6n de los microorganismos productores de ocratoxinaA mas relevantes, y las diferentes formas que existen en el estado de la tecnica para eliminar esta toxina de los productos empleados en alimentaci6n humana y animal. Aunque se mencionan los procedimientos fisicos y quimicos, el documento se centra en los metodos biol6gicos, que utilizan microorganismos para detoxificar productos contaminados con OTA. Estos microorganismos descontaminantes incluyen pr otozoos, bact erias, l evaduras, hon gos filamentosos, e, i ncluso, cu ltivos de ce lulas vegetales. A simismo, se menciona la posibilidad de utilizar enzimas que hidrolizan OTA (como las carboxipeptidasas A e Y). Entre los microorganismos descontaminantes, se destaca el empleo de bacterias del acidolactico y de Saccharomyces cerevisiae, por su extensivo uso en la industria alimentaria. A pesar del exhaustivo estudio que se describe en el documento D01, no se menciona la posibilidad de utilizar bacterias del genero Brevibacterium, por lo que este documento no afecta la novedad ni la actividad inventiva de la presente solicitud.En los documentos D02 a D04 se divulgan tambien procesos de biotransformaci6n de micotoxinas (incluyendo ocratoxina A) mediante la utilizaci6n de microorganismos para detoxificar alimentos humanos y animales. Dado que entre los microorganismos citados enlos documentos no se incluyen las Brevibacterias, tampoco estos documentos afectan la novedad ni la actividad inventiva de la solicitud.Informe del Estado de la Tecnica Pagina 4/4
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