KR20090059719A

KR20090059719A - 폐백토를 이용한 생균제의 제조방법

Info

Publication number: KR20090059719A
Application number: KR1020070126721A
Authority: KR
Inventors: 심광경; 양호석; 김동건; 황용배; 김영희; 도진옥
Original assignee: 주식회사 제일바이오
Priority date: 2007-12-07
Filing date: 2007-12-07
Publication date: 2009-06-11
Also published as: KR100911655B1

Abstract

본 발명은 바실러스균(Bacillus sp.) 또는 황국균(Aspergillus sp.)을 배양하여 생균제를 제조하는 방법에 있어서, 배양 배지의 탄소원으로 전처리한 폐백토를 이용하는 것을 특징으로 하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 생균제 제조방법은 폐기시 환경 오염을 유발하는 폐백토를 이용하여 폐기물의 자원화 및 환경 개선에 기여할 뿐 아니라, 본 발명의 방법에 따라 제조된 생균제는 사료 첨가제로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

폐백토를 이용한 생균제의 제조방법{METHOD FOR PRODUCING DIRECT-FED MICROORGANISMS USING SPENT BLEACHING EARTH}

본 발명은 바실러스균(Bacillus sp.) 또는 황국균(Aspergillus sp.) 배양시폐백토를 탄소원으로 이용하여 생균제를 제조하는 방법에 관한 것이다.

우리나라는 자원의 부족으로 축산에서 사용되고 있는 사료의 대부분을 수입에 의존하고 있으며, 사료 자급도를 높이고자 많은 노력을 기울이고 있는데, 그 대표적인 예로 남은 음식물을 이용한 사료가 있으나, 이는 높은 염분함량, 운반 및 보관의 어려움 등의 문제점을 갖는다.

생균제(Probiotics, direct-fed microorganisms)는 장내의 미생물 균형을 도와주는 미생물이나 물질로, 항생제 대체제로서 각광받고 있다. 장내 균총은 숙주의 건강상태, 사료의 종류 및 성장환경 등에 의해 영향을 받으며, 장내 균총의 교란은 성장률 감소와 더불어 숙주의 건강에 영향을 미치는 원인이 되기도 한다. 이때 항생제는 병원성 세균을 억제시키기 위해 강력한 작용을 하는데 비하여, 생균제 는 항생제에 대한 내성발현이나 잔류하는 문제점을 가지지 않으면서 장내에서 유익한 세균의 증식을 도와 이러한 장내 균총을 교란시키지 않고 정상적인 상태가 되도록 도와주는 역할을 한다.

생균제는 사료에 사용되어 크게 살균과 건강보조의 효과를 나타내는데, 구체적으로는, 유기산, 항균성 물질 및 소화효소 등의 유익산물의 생성 및 비타민 합성 등의 역할을 통하여 사료의 소화 및 영양소의 흡수 촉진, 번식률 향상, 폐사율 감소 등의 효과를 나타낸다.

한편, 폐백토는 식용 오일(대두유, 미강유, 옥수수유)의 제조공정 중 오일의 탈색 및 탈취에 사용되는 활성백토의 폐기물로서, 오일 함유량이 과다하여 매립 처리시 오일의 용출을 일으킬 뿐만 아니라 식물에 유해한 물질이 함유되어 있어 식물의 생장을 저해하는 등 심각한 환경오염원으로서 작용한다.

폐백토의 원물질인 활성백토는 벤토나이트라는 광물 성분으로서, 비료로 이용될 뿐만 아니라 흡착성이 있어 사료에 첨가할 경우 소화과정에서 생성된 암모늄 또는 황 함유 유해 물질 및 독소와 방사성 물질과 같은 대사 저해물질을 부착시켜 그 양을 감소시킬 수 있으며, 최근에는 벤토나이트에 생물 독소로 알려진 아플라톡신(aflatoxin)도 부착한다고 보고된 바 있다(문헌[R. Capasso et al., Phytochemistry, 31, 4125, 1992] 참조). 또한, 벤토나이트는 팽윤성이 있어서 수분을 흡수하여 자체 부피의 몇 배나 되는 양으로 가축의 장 내용물의 부피를 효과적으로 증가시켜 위장관 내 영양소의 체류시간을 연장하여 효소에 의한 소화시간을 개선시키고 영양소 소화를 촉진시킬 뿐만 아니라, 높은 완충능을 지니고 있어 과산 증 예방제 역할을 수행하기도 한다.

하지만, 아직까지 폐백토를 영양원으로 이용하여 생균제를 생산하기 위한 시도는 없었다.

[문헌 1] R. Capasso et al., Phytochemistry, 31, 4125, 1992

따라서, 본 발명의 목적은 폐백토를 영양원으로 이용하여 생균제를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 바실러스균(Bacillus sp.) 또는 황국균(Aspergillus sp.)을 배양하여 생균제를 제조하는 방법에 있어서, 전처리한 폐백토를 상기 배양에 사용되는 배양 배지의 탄소원으로 이용하는 것을 특징으로 하는,

생균제의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 생균제의 제조방법은 폐기시 환경오염을 유발하는 폐백토를 이용함으로써 폐기물의 자원화 및 환경 개선에 기여할 뿐 아니라, 본 발명의 방법에 따라 제조된 생균제는 사료 첨가제로서 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 방법은 바실러스균 또는 황국균을 이용한 발효법으로 생균제를 생산하는 데에 있어서, 미생물이 이용하기 쉽도록 전처리한 폐백토를 발효 배지의 탄소원으로 사용하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 실시양태에 따른 생균제의 생산방법은, (1)폐백토를 전처리하는 단계, (2)균주를 활성화시키는 단계, 및 (3)활성화된 균주를 전처리된 폐백토를 포함하는 배지에서 배양하여 생균제를 생산하는 단계를 포함할 수 있으며, 각 단계를 보다 상세히 설명하면 다음과 같다.

<단계 (1)> 폐백토의 전처리

폐백토는 장기간 보관 중 오일이 산패되어 검은색에서 검회색으로 성상이 변하고 시큼한 냄새가 발생하면서 오일 함량이 감소되어 미생물의 이용이 어려운 문제점이 있으므로 냉장(4℃) 내지는 냉동(-20℃)에서 보관하는 것이 바람직하다. 따라서, 산업화시 발생된 폐백토를 즉시 처리할 수 있는 생산 시스템을 갖추어서 원료의 보관을 철저히 하는 것이 요구된다.

본 발명의 폐백토는 미생물이 이용하기 쉽도록 전처리하는 것이 바람직하다. 전처리 방법은 예를 들어 한국 특허 제 10-0640548 호에 개시된 전처리 방법을 이용할 수 있는데, 구체적으로는 0.8 내지 2mm의 채에 거른 폐백토를 2 내지 30%의 농도가 되도록 물에 현탁시킨 후 현탁액의 pH를 6 내지 9로 조절하면서 60 내지 100℃에서 30분 내지 2시간 동안 교반함으로써 폐백토를 전처리할 수 있다.

<단계 (2)> 균주의 활성화

배양시 폐백토 배지에서 생균제의 생산성을 증가시키기 위하여, 생산 균주인 바실러스균 및 황국균을 미리 활성화시키는 것이 바람직하다.

균주를 활성화시키기 위하여, 본 발명에서는 통상의 배양 배지에 동결 보관된 균주를 선상 도말(streaking)하거나 희석한 후 접종하여 24 내지 40℃에서 24 내지 48시간 배양한다.

<단계 (3)> 생균제의 생산

본 발명에서 바실러스균 또는 황국균을 배양하여 생균제를 제조하는 데 있어, 통상적으로 사용되는 배양 배지에서 탄소원을 폐백토로 대체하여 사용한다. 폐백토는 배양 배지 총중량에 대하여 1 내지 20중량%, 바람직하게는 3 내지 10중량%의 양으로 사용될 수 있다. 상기 배지는 추가 탄소원으로 옥수수분말, 당밀, 포도당, 대두유 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 또한, 질소원으로 대두분말, 옥수수 침출액(CSL, corn steep liquor), 탈지유, 밀기울, 효모분말, 미네랄, 유화제 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다.

상기와 같이 준비된 배지에 균주를 3 내지 15부피%, 바람직하게는 10부피%가 되도록 접종하고 24 내지 40℃, 바람직하게는 30 내지 37℃에서 8 내지 56시간, 바 람직하게는 24 내지 48시간 동안 배양한다.

또한, 생균제의 생장을 증가시키기 위하여 상기의 배양 단계 전에 전배양을 수행하는 것이 바람직하다.

전배양은 통상적으로 사용하는 트립틱 소이(Triptic soy) 배지 및 포테이토 덱스트로스(Potato dextrose) 배지 중 각 균주의 생장에 적절한 배지를 선택하여 바실러스균 또는 황국균, 바람직하게는 상기 단계 (2)에서 활성화시킨 균주를 1 루프 정도 접종하여 30 내지 37℃에서 16 내지 48시간 동안 수행할 수 있다.

생균제의 생산을 확인하기 위하여, 상기에서 얻은 배양액을 멸균한 생리식염수에 단계 희석하여 통상적으로 이용되는 활성화 배지에 도말하여 30 내지 37℃에서 16 내지 48시간 동안 배양한 후 생성된 콜로니(colony) 수를 측정하여 생균수를 측정하거나, 또는 상기에서 얻은 배양액을 여과하여 선택적 확인 배지에 첨가하여 분비된 효소(예를 들면 전분 분해효소(아밀라아제), 단백질 분해효소(프로테아제) 및 셀룰로스 분해효소(셀룰라아제))를 확인할 수 있다.

<복합 생균제의 생산>

본 발명에서는 상술한 바와 같은 단일생균제 뿐만 아니라 복합생균제를 제조할 수 있다. 상기에서 얻은 배양액에 유산균을 3 내지 10부피%, 바람직하게는 10부피%를 추가 접종하여 24 내지 40℃, 바람직하게는 30 내지 37℃에서 24 내지 56시간, 바람직하게는 30 내지 48시간 동안 배양함으로써 복합생균제를 제조할 수 있다. 이때, 유산균에 의한 2차 배양은 혐기적 조건에서 수행하는 것이 적합하다.

또한, 상기의 추가 배양 단계에 앞서, 추가 접종하는 유산균의 생장을 증가시키기 위하여 전배양을 수행하는 것이 바람직하다.

전배양은 통상적으로 사용하는 MRS(de Man, Rgosa and Shape) 배지에 유산균, 바람직하게는 상기 바실러스균 및 황국균의 활성화와 동일한 방법을 통해(단, 혐기적 조건에서) 활성화된 유산균을 1 루프 정도 접종하여 30 내지 37℃에서 16 내지 48시간 동안 수행할 수 있다.

이와 같이 수득된 배양액 전체를 건조하여 목적하는 단일생균제 및 복합생균제를 건조물의 형태로 사용할 수 있다.

본 발명의 방법으로 제조된 생균제, 즉 단일 및 복합생균제는 사료에 사료 총 중량의 0.1 내지 1중량%의 양으로 첨가하여 사용할 수 있다. 사료에 첨가시 생균제의 혼합을 용이하게 하기 위하여, 생균제를 과립화하는 것이 바람직한데 생균제 건조물에 부형제를 섞어 생균수가 10⁷ 내지 10⁸ cfu/g이 되도록 혼합한 후, 결합제 용액을 이용하여 통상적인 유동층 과립기에서 생균제의 과립을 수행할 수 있다. 상기 부형제로는 등외품, 전분, 옥수수분말, 박력분, 대두분말 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 성분을 사용할 수 있다. 상기 결합제 용액을 구성하는 결합제로는 전분, 카복시메틸 셀룰로스(carboxymethyl cellulose), 폴리비닐 피롤리돈(polyvinyl pyrrolydone), 소디움 알기네이트(sodium alginate) 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 성분을 사용할 수 있으며, 결합제 용액의 농도는 0.1 내지 5.0부피%, 바람직하게는 0.5 내지 2.0부피%가 적합하다.

본 발명에 따른 생균제의 생산방법은 폐기되는 폐백토를 영양원으로 이용하여 사료 첨가제로서 많이 사용되고 있는 생균제를 생산하므로, 매우 경제적이고 환경 친화적이다. 또한, 본 발명에 따른 방법으로 제조된 생균제는 질소, 인산, 칼륨 및 각종 무기물의 함량이 높고 유용 생균제 및 효소를 포함하고 있어 사료 첨가제로서 매우 유용하다.

이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

<단계 (1)> 폐백토의 보관 및 전처리

폐백토의 입자를 고르게 하기 위하여 폐백토를 1 mm 채로 걸러 채를 통과한 폐백토를 모아 밀봉이 잘 되는 밀폐용기에 넣어 4 내지 -20℃에서 보관하였다. 보관 기간 동안 3개월 단위로 폐백토 내의 오일 함량을 분석하여 초기 함량의 80% 이하가 되면 폐기하였다.

폐백토는 한국 특허 제 10-0640548 호에 따른 전처리 방법으로 전처리 하였다.

<단계 (2)> 균주 활성화

동결 건조된 바실러스균(Bacillus subtilis)을 트립틱 소이 아가 배지(L당 트립토판 15g, 소이톤 5g, NaCl 5g, 아가 15g)에 선상 도말하여 37℃에서 24시간 배양하여 균주를 활성화하였다.

또한, 동결 건조된 황국균(Aspergillus oryzae)을 포테이토 덱스트로스 아가 배지(BD 사)에 선상 도말하여 30℃에서 48시간 배양하여 균주를 활성화하였다.

<단계 (3)> 생균제의 생산

상기 단계 (2)에서 트립틱 소이 아가 배지에서 활성화시킨 바실러스균 또는 포테이토 덱스트로스 아가 배지에서 활성화시킨 황국균을 1 루프 또는 1 ㎖ 정도로 접종하여 37℃, 200rpm으로 24시간 또는 34℃, 150rpm으로 48시간 동안 전배양하였다.

상기 실시예 1의 단계 (1)에서 전처리한 폐백토가 10중량%가 되도록 첨가한 생균제 생산배지(L당 대두유 5g, 당밀 5g, 대두분말 20g, CSL 20mL, KH₂PO₄ 1.0 g, MgSO₄ 0.5 g, 레시틴(lecithin) 1g, 전처리한 폐백토 100 g)를 121℃에서 30분 동안 습식 멸균한 후, 여기에 전배양한 균주를 10부피%가 되도록 접종하고 37℃, 200rpm으로 24시간 또는 30℃, 150rpm으로 48시간 동안 용존 산소량(DO)을 10%로 유지하는 조건에서 배양하여 생균제를 생산하였다.

<단계 (4)> 생균제의 건조 및 과립화

상기 단계 (3)에서 생산된 생균제를 건조하기 위하여 단계 (3)의 배양액을 1mm 채로 걸러 채를 통과한 액을 모아, 분무건조기(삼영화학)를 이용하여 유입온도 190℃, 배출온도 75℃ 조건에서 건조하여 생균제 건조물을 수득하였다.

이어, 생산한 생균제 건조물에 부형제로 등외품을 사용하여 생균수가 약 10⁸ cfu/g이 되도록 첨가하여 골고루 잘 혼합하였다. 과립 결합제로 1% 전분 용액을 이용하여 유동층 과립기(청진테크)에서 유입온도 90℃, 결합제 공급속도 1mL/min 및 플랩(Flap) 30% 조건에서 상기 혼합물을 과립화하여 생균제-함유 과립제품을 수득하였다.

실험예 1 : 폐백토 보관온도에 따른 폐백토 성상 및 바실러스균 생장 비교

폐백토의 보관 온도 및 기간에 따른 특징 및 균주의 생장을 알아보기 위하여 냉동(-20℃), 냉장(4℃), 상온(25℃)에서 보관한 폐백토를 한국 특허 제 10-0640548 호에 따른 방법으로 전처리하였다. 전처리한 폐백토를 5중량%가 되도록 첨가한 배지(L당 대두분말 30g, 옥수수분말 10g, 전처리된 폐백토 50g)에 실시예 1의 단계 (3)과 같은 방법으로 활성화시킨 바실러스균을 접종하여 배양하였다. 배양 후 오일의 함량을 측정하기 위하여 배양액 5 ㎖에 핵산 20 ㎖를 첨가하여 20분간 교반하고 원심 분리기(비젼과학, VS-5500N)를 이용하여 3,000rpm으로 10분 동안 원심 분리한 후, 상층액 10 ㎖를 취하여 미리 무게를 잰 알루미늄 디쉬에 넣어 80℃에서 3시간 동안 건조하여 수득한 건조물의 무게로서 측정하였다. 균주의 생장, 즉 생균수를 측정하기 위하여 배양액을 멸균된 생리식염수에 10⁷배로 희석하여 트립 틱 소이 아가 배지에 0.1mL씩 도말한 후, 37℃ 온도의 인큐베이터(incubator, 한솔시스템, NU-4950E)에서 24시간 동안 배양하여 배지에 형성된 콜로니 수를 측정하여 결과를 표 1에 나타내었다.

상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 냉동 및 냉장 보관한 폐백토의 경우 12개월까지는 오일 함량이 약간 감소되었으나, 상온에서 보관한 것은 4개월 이후 오일 함량이 급격히 감소되었고, 검은색에서 검회색으로 색상이 변하고 시큼한 냄새가 발생하기 시작하였다. 또한, 균주의 생장(생균수) 역시 냉동 및 냉장으로 보관한 폐백토의 경우 12개월까지 10⁷cfu/mL 이상이었으나, 상온 보관 시에는 4개월부터 생장이 감소하여 12개월의 경우 10³cfu/mL로 크게 감소되었음을 확인할 수 있었다.

실시예 2

상기 실시예 1의 단계 (1)에서 전처리한 폐백토 농도를 3, 5 및 20중량%가 되도록 생균제 생산배지에 첨가하는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 생균제를 생산하였다.

실험예 2 : 폐백토 농도에 따른 바실러스균과 황국균의 생장 비교

생균제 생산배지에 첨가하는 폐백토의 농도에 따른 균주의 생장을 알아보기 위하여 실시예 1의 단계 (1)에서 전처리한 폐백토 농도를 3, 5, 10 및 20중량%가 되도록 생균제 생산배지에 첨가하여 실시예 1의 단계 (3)과 같은 방법으로 배양한 후 생균수를 측정하여 그 결과를 표 2에 나타내었다.

상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 생균수는 폐백토의 농도가 3에서 5중량%로 높아질수록 증가하였고, 10중량%의 농도까지 생균수가 유지되다가 그 이상의 농도로 높아지면 감소한다는 것을 알 수 있었다. 이것은 폐백토의 양이 증가함에 따라 폐백토에 흡착되어 있는 유지의 양도 증가함으로써 균주의 탄소원 증가에 따른 균주의 생장이 증가한 것으로 사료될 수 있다.

실험예 3 : 폐백토 농도에 따른 황국균의 효소 생산능 비교

생균제 생산배지에 첨가하는 폐백토의 농도에 따른 효소 생산능을 비교하기 위하여 실시예 1의 단계 (1)에서 전처리한 폐백토 농도를 0, 5, 10 및 20중량%가 되도록 생균제 생산배지에 첨가하고 황국균을 이용하여 실시예 1과 같은 방법으로 배양하였다. 이후 배양액 10mL을 취하여 15mL 팔콘 튜브(falcon tube)에 넣어 3000rpm에서 10분간 원심 분리하여 멸균된 0.45㎛ 시린지 필터(syringe filter, 사토리어스(Sartorius) 16555)로 상층액을 여과한 후 여액을 각 효소의 활성 확인 배지(아밀라아제: L당 가용성 전분 10g, 쇠고기 추출물 3g, 아가 12g; 프로테아제: L당 탈지유 10g, 글루코오즈 1g, 효모 추출물 3g, 아가 15g; 및 셀룰라아제: L당 카복시메틸 셀룰로오즈 5g, 효모 추출물 5g, NaCl 5g, 아가 5g)에 올려진 페이퍼 디스크(paper disc)에 20㎕씩 첨가하여 37℃에서 24시간 동안 방치하였다.

아밀라아제, 프로테아제 및 셀룰라아제의 효소 활성을 확인하기 위하여 배지에 5mM 요오드 용액을 1 내지 2mL 첨가하여 골고루 퍼지게 한 다음, 환생성 유무 및 크기를 육안으로 확인하는 실험을 수행하여 그 결과를 도 1에 나타냈다.

도 1에 나타난 바와 같이, 폐백토를 20중량%의 농도까지 첨가하였을 경우에도 아밀라아제, 프로테아제 및 셀룰라아제 효소를 생산하였으며, 프로테아제를 제외하고는 폐백토를 첨가하지 않은 경우에 비해 폐백토를 첨가하여 배양한 경우 효소 생산능이 더 높음을 알 수 있었다.

실시예 3

상기 실시예 1의 단계 (3)에서 생균제 생산배지로 L당 대두유 10g, 옥수수분말 30g, 대두분말 30g, 효모분말 30g, KH₂PO₄ 1g, MgSO₄ 0.5g, 레시틴 1g 및 전처리된 폐백토 50g을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 생균제를 생산하였다.

실시예 4

상기 실시예 3에서 대두유 10g 및 대두분말 30g 대신에 당밀 5g 및 옥수수 침출액(CSL) 30g을 사용한 것을 제외하고는 실시예 3과 동일한 방법으로 생균제를 생산하였다.

실시예 5

상기 실시예 1의 단계 (2)와 동일한 방법으로, 동결 보관된 유산균을 MRS 아가 배지(BD사)에 선상 도말하여 혐기적 조건에서 37℃에서 48시간 동안 배양하여 유산균의 활성화를 수행하였다. 이후 활성화된 유산균을 MRS 배지에 접종하여 혐기적 조건에서 37℃에서 36시간 정치배양을 통해 전배양하였다. 전배양한 유산균을 실시예 1의 단계 (3)에서 얻은 배양액에 10부피%가 되도록 접종하여 혐기적 조건으로 37℃에서 36시간 동안 배양하여 복합생균제를 생산한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하여 복합생균제를 생산하였다.

실험예 4 : 바실러스균과 유산균의 혼합 배양

상기 실시예 1의 단계 (1) 및 (2)의 방법으로 활성화 및 전배양한 바실러스균을 실시예 3의 생균제 생산배지에 10부피%가 되도록 접종하여 37℃, 200rpm으로 24시간 동안 배양한 후, 실시예 5에서 MRS 배지에서 전배양한 유산균을 10부피%가 되도록 추가 접종하여 무산소 단지(anaerobic jar)에 넣어 혐기적 조건에서 37℃에서 36시간 추가 배양하였다. 혼합된 배양물 내의 바실러스균 및 유산균의 생균수를 확인하기 위하여 멸균된 생리식염수에서 단계 희석법으로 희석한 후 희석액 0.1mL를 트립틱 소이 아가 배지 및 MRS 아가 배지에 도말하였다. 트립틱 소이 아가 배지에서는 호기적 조건으로 37℃에서 16시간 동안 배양하고, MRS 아가 배지에서는 혐기적 조건으로 37℃에서 48시간 동안 배양한 후 생성된 콜로니 수를 측정하였다. 그 결과 바실러스균의 수는 1.7X10⁹cfu/mL였고, 유산균의 수는 9.1X10⁸cfu/mL로 두 균 모두 우수한 생장을 이루며 혼합 배양되었음을 확인할 수 있었다.

실험예 5 : 황국균과 유산균의 혼합 배양

상기 실시예 1의 단계 (1) 및 (2)의 방법으로 활성화 및 전배양한 황국균을 실시예 4의 생균제 생산배지에 10부피%가 되도록 접종하여 34℃, 150rpm으로 48시간 동안 배양한 후, 실시예 5에서 MRS 배지에서 전배양한 유산균을 10부피%가 되도록 추가 접종하여 혐기적 조건에서 37℃에서 36시간 동안 배양하였다. 혼합된 배양물 내의 황국균 및 유산균의 생균수를 확인하기 위하여 멸균된 생리식염수에 단계 희석법으로 희석한 후 희석액 0.1mL를 포테이토 덱스트로스 아가 배지 및 MRS 아가 배지에 도말하였다. 포테이토 덱스트로스 아가 배지에서는 호기적 조건으로, MRS 아가 배지는 혐기적 조건으로 수행하여 37℃에서 48시간 동안 각각 배양한 후 생성된 콜로니 수를 측정하였다. 그 결과 황국균의 수는 8.1X10⁸cfu/mL였고, 유산균의 수는 8.7X10⁸cfu/mL로 두 균 모두 우수한 생장을 이루며 혼합 배양되었음을 확인할 수 있었다.

실시예 6

상기 실시예 1의 단계 (4)에서 부형제로 등외품 대신 옥수수분말 및 박력분 을 이용하는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 생균제를 생산하였다.

실시예 7

상기 실시예 1의 단계 (4)에서 과립 결합제로서 1% 전분 용액 대신 0.5 내지 1% 카복시메틸 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈 및 소디움 알기네이트를 이용하는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 생균제를 생산하였다.

실험예 6 : 사양실험

본 발명에 따른 생균제의 영향을 실험하기 위하여, 건국대학교 산란계 농장에서 하이-라인 브라운(Hy-Line Brown) 50주령을 대상으로 하기 표 3과 같이 제조된 시료들을 각각 사료 1kg 당 0.2중량%가 되도록 첨가하고 골고루 혼합하여 9주 동안 매일 공급하며 사양실험을 수행하였다(처리군). 생균제를 첨가하지 않은 사료를 공급한 경우를 대조군으로 하였다. 생균제의 급여가 산란계의 장내 환경에 미치는 영향을 알아보기 위하여 미생물상 분석과 악취 발생의 원인이 되는 암모니아 발생량을 측정하고, 실험 종료 후 장관 내용물의 미생물상을 분석하였다. 또한, 생산성 향상에 대한 영향을 알아보기 위하여 계란의 하우 유닛(Haugh unit)을 측정하여, 그 결과를 도 2 및 하기 표 4에 나타내었다.

상기 표 4에 나타낸 바와 같이, 도축 후 장내 미생물을 분석한 결과, 유산균 수는 대조군에 비해 처리군에서 전반적으로 높게 나타났으나, 유해균인 대장균 수는 대조군에 비해 복합생균제 제조물 및 상용제품과 항생제를 혼합한 처리군에서 유의하게 낮게 나타났음을 알 수 있다. 이것은 투여한 미생물이 장내에 우점종으로 자리하여 소화를 촉진하였을 뿐만 아니라, 다른 유해 세균의 성장을 억제한 결과임을 알 수 있다.

또한, 계란의 품질 측정 기준 중 하나인 하우 유닛은 상용제품, 단일생균제 제조물 및 상용제품과 항생제를 혼합한 처리군이 대조군에 비해 유의하게 높았다.

도 2에서 나타낸 바와 같이, 생균제의 급여에 따른 분변 내 암모니아 가스 발생량을 측정한 결과 분변 내 암모니아 농도는 저장 1일째부터 순차적으로 증가하여 6일째인 암모니아 가스의 최대 발생시점까지 대조군에 비해 처리군들이 낮은 경향을 나타냈고, 다른 처리군들에 비하여 복합생균제 제조물 처리군 및 상용제품과 항생제를 혼합한 처리군에서 비교적 낮은 결과를 보였음을 알 수 있다.

도 1은 생균제 생산 배지에 첨가하는 폐백토의 농도에 따른 황국균의 효소(아밀라아제, 프로테아제 및 셀룰라아제) 생산능을 나타낸 사진이다.

도 2는 생균제의 급여에 따른 산란계의 분변 내 암모니아 가스 발생량을 측정한 그래프이다.

Claims

바실러스균(Bacillus sp.) 또는 황국균(Aspergillus sp.)을 배양하여 생균제를 제조하는 방법에 있어서, 전처리한 폐백토를 상기 배양에 사용되는 배양 배지의 탄소원으로 이용하는 것을 특징으로 하는, 생균제의 제조방법.
제 1 항에 있어서,

상기 전처리한 폐백토를 배양 배지 총 중량에 대하여 1 내지 20중량%의 양으로 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서,

상기 바실러스균 또는 황국균의 배양에 이어, 배양에 의해 얻은 배양액에 유산균을 접종하여 혐기적 조건에서 추가로 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 3 항에 있어서,

상기 바실러스균, 황국균 또는 유산균이 배양에 앞서 30 내지 37℃에서 16 내지 48시간 동안 전배양되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항의 방법에 의해 제조된 생균제를 포함하는 사료.
제 5 항에 있어서,

상기 생균제를 총 중량의 0.1 내지 1중량%의 양으로 포함하는 것을 특징으로 하는 사료.
제 5 항에 있어서,

상기 생균제가 건조된 후 유동층 과립기를 통해서 과립화된 것임을 특징으로 하는 사료.
제 7 항에 있어서,

상기 생균제의 과립화에 부형제 및 결합제를 사용하는 것을 특징으로 하는 사료.