DE2450813C2 - Antibioticum FR-02A - Google Patents

Description

;£·!* =320 ;£Jl =180;

einem inerten Träger in einem wachstumsfördernden Mittel für ΉεΓε.

h) Rf=0,M4 bei der Dünnschichtchromatographie auf einer Kieselsäuregelplatte unter Entwickeln mit einem Lösungsmittelsystem aus 80% Chloroform, 20% Methanol und 1% konzentriertem Ammoniumhydioxid;

i) Rf=0,9 bei der Papierchromatographie unter Entwicklung in dem Lösungsmittelsystem aus 70% Isopropanol und 30% Phosphatpufferlösung (0,01 molar), pH 6,0;

j) kernmagnetisches Resonanzspektrum mit einem Dubleti bei 1,21,131 und 4,63 τ und einem Singulett bei 4,87 τ,

sowie die pharmazeutisch unbedenklichen, nicht-toxischen Salze davon.

2. Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums FR-02A gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces lactamdurans NRRL 3802 aerob in einem wäßrigen Nährmedium züchtet, worauf man das gebildete Antibiotikum FR-02A

a) aus der gesamten Fermentationsflüssigkeit mit einem mit Wasser nicht mischbaren polaren organischen Lösungsmittel oder

b) aus der Fermentationsflüssigkeit, von der die Feststoffe abgetrennt worden sind, mit einem mit Wasser nicht mischbaren polaren organischen Lösungsmittel oder

ς) aus den von der Fermentationsflüssigkeit abgetrennten Feststoffen mit einem polaren £>o organischen Lösungsmittel

extrahiert.

3. Verwendung des Antibiotikums FR-02A oder eines pharmazeutisch unbedenklichen, nicht-toxi- f>5 sehen Salzes davon zusammen mit einem nicht-toxischen, pharmazeutisch unbedenklichen Streckmittel in einem therapeutischen Mittel oder zusammen mit Die Erfindung betrifft das im Patentanspruch 1 angegebene Antibioticum, das im Anspruch '·£ genannte Verfahren zur Herstellung dieses Antibiotikums und die Verwendung dieses Antibiotikums, wie sie der Patentanspruch 3 nennt

FR-02A ist ein Antibioticum, das sowohl gegen gram-positive als auch gegen gram-negative Bakterien wirkt und infolgedessen zur Behandlung der verschiedensten Infektionen von Tieren verwendet werden kann, insbesondere wirkt FR-02A gegen PPLO bei Hühnern, Schweinen und Rindern. Es ist auüh wirksam gegen die Mäusecoccidiose und gegen die vorwiegendsten Arten der Hühnercoccidiose. Ferner wirkt das Antibioticum subkutan gegen durch M. gallisepticum verursachte Luftsacculitis bei Hühnern und oral bei Mäusen gegen durch Bordetella bronchiseptica verursachte Systeminfektionen. Weiterhin kann FR-02A als wuchsförderndes Mittel bei Tieren, wie Hühnern, Schweinen und Rindern, verwendet werden.

Das Antibioticum FR-02A wird durch Züchten des bereits bekannten Mikroorganismus Streptomyces lactamdurans NRRL 3802 unter gesteuerten Bedingungen in einer Fermentationsflüssigkeit und Extrahieren der ganzen Fermentationsflüssigkeit mit einem mit Wasser nicht mischbaren polaren organischen Lösungsmittel gewonnen. Die Fermentation kann in Medien, die suspendierte Nährstoffe enthalten, oder in vorwiegend klaren Medien durchgeführt werden, die praktisch frei von suspendierten Nährstoffen sind.

Wenn die Fermentation in Medien durchgeführt wird, die suspendierte Nährstoffe enthalten, findet sich das Antibioticum sowohl in den Fesl; !offen des Mycels und der suspendierten Nährstoffe sowie in der Fermentationsflüssigkeit. Das Antibioticum wird aus den Feststoffen isoliert, indem man die Feststoffe von der Fermentationsflüssigkeit durch Filtrieren, Zentrifugiren oder auf andere Weise trennt und den Feststoffkuchen mit einem organischen Lösungsmittel, vorzugsweise einem polaren organischen Lösungsmittel, extrahiert. Das Antibioticum, das in der Flüssigkeit hinterblieben ist, von der die Feststoffe zuvor abgegrennt worden sind, wird aus der Flüssigkeit durch Extraktion mit einem mit Wasser nicht mischbaren polaren organischen Lösungsmittel isoliert. Es ist zu beachten, daß durch verzögertes Abernten die Gesamtfeststoffmenge in der Fermentationsflüssigkeit vermindert wird und eine geringere Menge des Antibioticums sich in den von der Flüssigkeit gewonnenen Feststoffen findet

Bei Fermentationsmedien, die keine suspendierten Nährstoffe enthalten, findet sich der größte Teil des FR-02A in der vorwiegend klaren Fermentationsflüssigkeit. In diesen Fällen wird die gesamte Flüssigkeit mit einem mit Wasser nicht mischbaren polaren organischen Lösungsmittel, wie Chloroform, extrahiert, um das Antibioticum zu gewinnen. Man kann aber auch etwaige Feststoffe, wie Mycel, von der Fermentationsflüssigkeit abtrennen, bevor man die letztere mit dem mit Wasser nicht mischbaren polaren organischen Lösungsmittel extrahiert. Ferner wird, um alles restliche FR-02A zu gewinnen, das von der Fermentationsflüssigkeit abgetrennte Mycel mit einem geeigneten polaren organischen Lösungsmittel extrahiert.

Das bevorzugte Verfahren zur Gewinnung des Antibioticums gemäß der Erfmdung.ist das Züchten des bekannten Mikroorganismus Streptömyces lactamdurans NRRL 3802 runter gesteuerte^ Be^^ einem Medium, das suspendierte Feststoffe enthält^ oder. in einem klaren Medium, das frei von; suspendierten Feststoffen ist, und Extrahieren der gesamten; Flüssigkeit mit einem mit Wasser nicht mischbaren* polaren organischen Lösungsmittel. Die Extraktion srfolgt durch Einstellen ides pH-Wertes der Flüssigkeit auf "> einen sauren Bereich und Zusatz des Lösungsmittels zu der Flüssigkeit Wach dem Vermischen werden die Feststoffe von der Flüssigkeit abgetrennt Man läßt^die Flüssigkeit stehet bis sich die. Löstingsmitt.elschicht abgeschieden hai Die Lösungsmittelschicht wird abgezogen, mit Wjasser gewaschen, mit einem geeigneten Trockenmittel getrocknet und im Vakuum eingedampft Der Rückstand wird mit einem nicht-polaren organischen Lösungsmittel, wie Petroläther oder Hexan, gewaschen und an der Luft getrocknet So erhält man das Antibioticum FR-02A. "^r

Eine bevorzugte Methode zur Gewinnung des Antibioticums FR-02A ist die Züchtung des bekannten Mikroorganismus: Streptömyces lactamdurans NRRL 3802 unter gesteuerten Bedingungen in einem Medium, welches suspendierte Nährstoffe enthält Die Feststoffe einschließlich des Mycels und der suspendierten Nährstoffe werden von der Fermentationsflüssigkeit abfiltriert Nachdem der Filterkuchen so trocken wie möglich geblasen worden ist, wird er in ein polares » organisches Lösungsmittel eingerührt und wieder abfiltriert Nach <3em Waschen des Filterkuchens mit weiterem Lösungsmittel werden die vereinigten Lösungsmittelextraktie und Waschflüssigkeiten im Vakuum eingedampft, wobei ein wäßrige Aufschlämmung hinterbleibt Der pH-Wert wird auf einen sauren Bereich eingestellt Die wäßrige Aufschlämmung wird mit einem nicht-polaren organischen Lösungsmittel, wie Petroläther, Hexan und dergleichen, gewaschen, bis die Waschflüssigkeit»!! farblos sind. Dann wird die wäßrige Aufschlämmung mit einem polaren organischen Lösungsmittel extrahiert Der Lösungsmittelexcrakt wird getrocknet, filtriert und im Vakuum eingedampft, wobei das Antibioticum FR-02A als Rückstand hinterbleibt Nach dem Verfahren gemäß der Erfindung kann man z. B. das Antibioticum FR-02A ίίι etwa 40- bis 50prozeiitig reiner Form erhalten.

Nach der anderen Methode kann die Fermentation in einem Medium durchgeführt werden, welches praktisch frei von suspendierten Nährstoffen ist Das Mycel wird von der Fermeni:ationsflüssigkeit abfiltriert und mit einem polaren organischen Lösungsmittel extrahiert. Der Extrakt wird getrocknet und im Vakuum zur Trockne eingedampft Der Rückstand wird mit einem nicht-polaren organischen Lösungsmittel, wie Petroläther, Hexan und dergleichen, geschüttelt Das organische Lösungsmittel wird dekantiert, nachdem man den Rückstand durch 2Leritrifugieren zum Absitzen gebracht hat. Der Rückstand wird an der Luft getrocknet, und man erhält das Antibioticum FR-02A. -

Eine noch bessere Methode zur Gewinnung des Antibioticums gemäß der Erfindung ist die Züchtung des Mikroorganismus Streptömyces lactamdurans NRRL 3802 unter gesteuerten Bedingungen in einem Fermentationsmedium und Extraktion des Mediums nach dem Abtrennen der Feststoffe, nämlich des Mycels oder des Mycels und der suspendierten Nährstoffe. Der pH-Wert der Fermentationsflüssigkeit wird auf den sauren Bereich eingestellt und die Feststoffe, nämlich entweder nur Mycel oder Mycel und suspendierte Nährstoffe, werden abgetrennt Die von "Feststoffen freie Fermentationsflüssigkeit wird mit einem mit Wasser nicht mischbaren polaren organischen Lösungsmittel gemischt Nach dem Mischen läßt man die Schichten sich voneinander trennen. Die organische Schicht wird abgezogen, mit einem geeingeten Trockenmittel getrocknet und im Vakuum zur Trockne eingedampft Der Rückstand wird mit einem nicht-polaren organischen Lösungsmittel, wie Petroläther oder Hexan, gewaschen und an der Luft getrocknet, wobei das Antibioticum FR-02A hinterbleibt

Wenn die Extraktionen bei den oben beschriebenen Verfahren mit einem mit Wasser nicht mischbaren polaren organischen Lösungsmittel durchgeführt werden, kann man Lösungsmittel, wie Alkylester von niederne Alkancarbonsäuren, wie Methylformiat, Äthylformiat, Methylacetat, Äthylacetat, n-Butylacetat Isobutylacetat, Äthylpropionat, Ketone, wh Cyclohexanon, oder niedere Halogenkohlenwasserstoffe, wie Chloroform, Methylenchlorid, Tetrachlorkohlenstoff, Äthylendichlorid, l-Chlor^-dimethylpropan, Tetrachloräthylen oder Bromoform, verwenden.

Wenn die oben beschriebenen Extraktionsverfahren mit einem polaren organischen Lösungsmittel durchgeführt werden, kann man Lösungsmittel, wie niedere Alkylester von niederen Alkancarbonsäuren, wie Methylformiat Äthylformiat Methylacetfit, Äthylacetat n-Butylacetat, Isobutylacetat, Äthylpropionat, Ketone, wie Aceton, Methyläthylketon oder Cyclohexanon, oder niedere Halogenkohlenwasserstoffe, wie Chloroform, Methylenchlorid, Tetrachlorkohlenstoff, Äthylendichlorid, 1 -Chlor^-dimethylpropan, Tetrachlorethylen oder Bromoform, verwenden.

Der Mikroorganismus erzeugt nicht nur FR-02A, sondern, wie aus dem Schrifttum bekannt ist, erzeugt Streptömyces lactamdurans NRRL 3802 das Antihioticum Cephamycine (vgl »Antimicrobial Agents and Chemotherapy«, September 1972, Seite 122—131, Band 2 Ni 3, »Cephamycins, a New Family of ^-Lactam Antibiotics«, sowie BE-PS 7 64 160). Da FR-02A-,in mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmitteln stark löslich ist, während Cephamycin C in mit Wasser nicht mischbaren organischen I^ösungsrmtteln so gut wie unlöslich ist, lassen sich diese beiden Stoffe leicht voneinander trennen, und man erhält durch Extraktion der Fermentationsflüssigkeit mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel jedes der beiden Antibiotica in einer von dem anderen Antibioticum nicht verunreinigten Form.

Das aus der Fermentationsflüssigkeit isolierte Antibioticum FR-02A wird selbstverständlich weiter durch Chromatographie an einem Molekularsieb und anschließende Chromatographie an einem oberflächenaktiven Adsorptionsmittel gereinigt. Ein hierfür geeignetes Molekularsieb ist ein vernetztes Dextran, wie das Molekularsieb »Sephadex LH-20«. FR-02A kann aus diesem Molekularsieb mit einem niederen Alkanol. wie Methanol, eluiert werden. Ein geeignetes oberflächenaktives Adsorptionsmittel ist ein hydrophobes, nichtionogenes, makroporöses, mit Divinylbenzc-I vernetztes Copolymerisat des Styrols, das unter den Bezeichnungen »Amberlite XAD-I bis XAD-12« im Handel ist. Ein für die Reinigung von FR-02A bevorzugtes Harz ist »XAD-2«. Zum Eluieren des adsorbierten FR-02A geeignete Lösungsmittel sind wäßrige Lösungen von niederen Alkanolen, z. B. wäßrige Lösungen von

Methanol, Äthanol, Isopropanol, Butanol und dergleichen. Das bevorzugte Lösungsmittel zum Eluieren von FR-02A aus dem »XAD-2«-Harz ist eine 50prozentige Lösung von Isopropanol in Wasser.

Der Mikroorganismus, der FR-02A erzeugt, ist der s bereits bekannte Stamm Streptomyces lactamdurans NRLL 3802. Er wurde aus einer Bodenprobe isoliert und bei der Kultursammlung der Northern Utilization Research and Development Division, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture ίο (früher Northern Regional Research Laboratories), Peoria, Illinois 61604, für die Dauer ohne Beschränkungen der Zugänglichkeit niedergelegt und steht der Öffentlichkeit unter der Kulturnummer NRRL 3802 zur Verfügung. is

Vollständige taxonomische und morphologische Studien über Streptomyces lactamdurans finden sich in der BE-PS 7 64 ίδΟ. Aiii Grund νυϊι cäxünüriiisciieri Untersuchungen wurde Streptomyces lactamdurans als neuer Actonomycet identifiziert. Es wurde gefunden, daß er dem Genus Streptomyces angehört und viele Merkmale der bekannter. Species Streptomyces fradiae aufweist Biochemisch stimmen die beiden nahezu vollständig überein; morphologisch sind aber wichtige Unterschiede vorhanden. So ist z. B. die Farbe des Luftmycels von S. fradiae meermuschelrosa, wohingegen S. lactamdurans rahmfarbig ist Auf Grund dieses Unterschiedes und anderer charakteristischer Merkmale wurde dem Mikroorganismus der Speciesname Streptomyces lactamdurans gegeben.

FR-02A wird bei der aeroben Fermentation eines geeigneten wäßrigen Nährmedium.«; unter gesteuerten Bedingungen durch Beimpfung mit dem Organismus Streptomyces lactamdurans NRRL 3802 erzeugt. Wäßrige Medien, wie sie für die Erzeugung anderer Antibiotics verwendet werden* eignen sich auch für die Herstellung des Antibioticums FR-02A. Solche Medien enthalten durch den Mikroorganismus assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze. Die Wahl des Mediums ist nicht ausschlaggebend, und die Fermentation kann in Medien durchgeführt werden, die suspendierte Nährstoffe enthalten oder in solchen, die vorwiegend klar und praktisch frei von suspendierten Nährstoffen sind.

Im allgemeinen können Kohlehydrate, wie Zucker, z. B. Dextrose, Glucose, Arabinose, Maltose, Raffinose, Xylose, Mannit und dergleichen, und Stärken, wie Korn, ζ. B. Hafer, Roggen, Maisstärke, Maismehl und dergleichen, in dem Nährmedium entweder für sich allein oder in Kombination als Quellen für assimilierbaren Kohlen- so stoff verwendet werden. Die genaue Menge der Kohlehydratquelle oder -quellen in dem Medium hängt zum Teil von den anderen Bestandteilen des Mediums ab; im allgemeinen variiert jedoch die Kohlehydratmenge zwischen etwa I und 6 Gewichtsprozent des Mediums. Als C-Quelle kann ein einzelner Stoff verwendet werden, oder man kann mehre C-Quellen in dem Medium miteinander kombinieren. Als N-Quellen bei dem Fermentationsprozeß können viele Proteinstoffe verwendet werden. Geeignete N-Quellen sind z. B. Nährbrühe, Hefeextrakt, Hefehydrolysate, Primärhefe, Sojabohnenmehl, Baumwollsaaünehl, Caseinhydrolysate, Maisquellwasser, lösliche Schlempebestandteile oder Tomatenbrei und dergleichen. Die N-Quellen können entweder für sich allein oder m Kombination miteinan- ⁶S der in Mengen von etwa 0,2 bis 6 Gewichtsprozent des wäßrigen Mediums angewandt werden.

Die in den Beispielen beschriebenen Fermentations-

medien dienen nur zur Erläuterung der Vielzahl der verschiedenen möglichen Medien.

Die Fermentation erfolgt bei Temperaturen von etwa 20 bis 37"C; zur Erzielung der günstigsten Ergebnisse wird die Fermentation jedoch vorzugsweise bei Temperaturen von 24 bis 32° C durchgeführt. Der pH-Wert des Nährmediums für die Züchtung der Kultur von Streptomyces lactamdurans und für die Erzeugung des Antibioticums FR-02A soll im Bereich von etwa 6,0 bis 8,0 liegen.

Im kleinen Maßstab wird die Fermentation des Antibioticums zweckmäßig durchgeführt, indem man ein geeignetes Nährmedium mit der das Antibioticum erzeugenden Kultur beimpft und nach der Übertragung auf das Produktionsmedium die Fermentation mehrere Tage in der Schüttelmaschine bei konstanter Temperatur von etwa 28" C ablaufen läßt Am Ende der iiikuuaiiuiiszcii können das fviycei und die suspendierten Nährstoffe abzentrifugiert oder abfiltriert und mit einem Lösungsmittel extrahiert werden, oder man kann die gesamte Flüssigkeit mit Chloroform oder mit mit Wasser nicht mischbaren Flüssigkeiten extrahieren. Man kann aber auch die Fermentationsflüssigkeit extrahieren, nachdem man die Feststoffe, bestehend aus Mycel oder aus Mycel und suspendierten Nährstoffen, von derselben abgetrennt hat.

Dk- Fermentation wird in kleinem Maßstab in einem sterilisierten Kolben durch einstufige, zweistufige, dreistufige oder vierstufige Impfgutentwicklung durchgeführt. Als Nährmedium für die Impfstufe kann man jede geeignete Kombiantion von C- und N-Quellen verwenden. Der Impfkolben wird 1 bis 2 Tage in einer Kamme- von konstanter Temperatur bei etwa 28" C geschüttelt, und etwas von der erhaltenen Zucht wird zur Beirr, pfung entweder eines zweitstufigen Impf mediums oder des Produktksnsmediums verwendet Wenn man mit Zwischenstufen-1mpfgutentwicklungskolben arbeitet so wird das Impfgut in diesen im wesentlichen in der gleichen Weise entwickelt; d.h., ein Teil des Kolbeninhalts wird zum Beimpfen des Produktionsmediums verwendet Die beimpften Kolben werden mehrere Tage bei konstanter Temperatur geschüttelt, und am Ende der Inkubationszeit wird das Antibioticum FR-02A, wie bereits beschrieben, isoliert

Im großen Maßstab wird die Fermentation vorzugsweise in geeigneten Fermentern durchgeführt die mit einem Rührer und Einrichtungen zum Belüften des Fermentationsmediums ausgestattet sind. Nach dieser Methode wird das Nährmedium in dem Fermenter zubereitet und durch Erhitzen auf Temperaturen bis etwa 120°C sterilisiert Nach dem Kühlen wird das sterilisierte Medium mit einem zuvor gezüchteten Impfgut der Zuchtkultur beimpft und die Fermentation mehrere Tage, z.B. 2 bis 4 Tage, unter Bewegung und/oder Belüftung des Nährmedhims und Innehaltung einer Temperatur von etwa 28° C durchgeführt Die Ausbeute an FR-02A beträgt im allgemeinen 20 bis 200 mg je Liter Zuchtvolumen, bestimmt durch Bioanalyse.

Analysenverfahren

Die Analysen werden nach derTestblättchen-PIattenmethode unter Verwendung von 9,5-mm-Filterpapierblättchen durchgeführt Die Analysenplatten werden mit Difco-Nähragar und 2,0 g Difco-Hefeextrakt je Liter in einer Menge von 10 ml je Platte hergestellt Eine über Nacht entwickelte Zucht des Testorganismus Vibrio percolans (American Type Culture Collection

ATCC 8461) in Nährbrühe mit einem Gehalt von 0,2% Hefeextrakt wird in steriler Kochsalzlösung zu einer Suspension mit einer Durchlässigkeit von 40% bei einer Wellenlänge von böO πιμ verdünnt. Vor dem Begießen der Platten wird diese Suspension zu dem Medium in einer Menge von 20 ml je Liter zugesetzt.

Die Testplatten werden bis zur Verwendung (maximal 5 "Oge) auf 4° C gehalten. Nach dem Auflegen der mit dem Antibioticum gesättigten Testblättchen werden die Platten 16 bis 24 Stunden bei 28⁰C inkubiert. Die ι ο Hemmungszonen werden in mm Durchmesser abgelesen und zur Bestimmung der relativen Stärke oder, wenn sie mit einer gereinigten Bezugsnorm verglichen werden, der Stärke in y/ml verwendet. Analysen des FR-02A in Fermentationsflüssigkeiten, Mycel und den von den Fermentaitonsflüssigkeiten abgetrennten suspendierten Nährstoffen sowie in den von Nährstoffen freien Fermentationsflüssigkeiten werden nach dem Extrahieren des FR-02A mit einem geeigneten Lösungsmittel durchgeführt. Die Analysen von Lösungen, die FR-02A in einer Konzentration von 200 y/ml enthalten, zeigen bei Verwendung von 9,5-mm-Blättchen Hemmungszonen von 16 mm. Wenn eine solche Analyse quantitativ durchgeführt wird, lassen sich 50 bis 100 y/ml Antibioticum nachweisen. '

FR-02A ist aktiv gegen gram-negative und gram-positive Bakterien, Coccidien und Species von Mycoplasma. In vitro ist FR-02A wirksam gegen E acervulina, Bordetella, Streptococcus faecalis. Streptococcus faecum, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pyogenes, Proteiij vulgaris, M. hyorhinis, M. synoviae, M. arthritidis, M. gallisepticum und Species von Pasteurella. Es wurde auch Aktivität gegen Vibrio percolans (ATCC 8461), Salmonella gallinarum (MB 1287). Escherichia coli (MB 1418), Klebsieila pneumoniae (MB 1264), Pseudomonas stutzen (MB 1231) und (MB 2765), Bacillus subtilis (MB 964) und (MB 7971 Staphylococcus aureus (MB 108), (MB 210) und (MB 703) sowie gegen Pseudomonas aeruginosa (MB 3210) festgestellt

FR-02A ist sowohl als Antibioticum als auch als wuchsförderndes Mittel für Tiere verwendbar.

Wenn FR-02A als Antibioticum verwendet wird, ist die besondere Art der Darreichung an Tiere nicht besonders ausschlaggebend; alle gegenwärtig angewandten oder zur Behandlung von infizierten oder infektionsgefährdeten Tieren zur Verfugung stehenden Methoden sind zufriedenstellend.

FR-02A kann als Antibioticum, z.B. in Form von pharmazeutischen Präparaten, verwendet werden, die außerdem ein organisches oder anorganisches, festes so oder flüssiges pharmazeutisches Streckmittel enthalten, das sich für die enterale, parenterale oder lokale Darreichung eignet Geeignete Streckmittel sind Stoffe, die mit dem Antibioticum nicht reagieren, z. B. Wasser, Gelatine, Lactose, Stärken, SfearylalkohoL Magnesium- ss stearat, Talkum, pflanzliche öle, Benzylalkohol, Harze, Propylenglykol, Polyalkylenglykole, weißes Petrolatum, Cholesterin oder andere bekannte medizinische Streckmittel. Die pharmazeutischen Präparate können z. B. als Tabletten, Dragees, Salben, Cremes oder Kapseln oder in flussiger Form als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen. Sie können sterilisent werden und/oder Hilfsmittel, wie Konservierungsmittel, Stabilisiermittel, Netz- oder Emulgiermittel, Lösungsvermittler, Salze zum Regeln des osmotischen Druckes oder Puffer, enthalten. -

Wenn das Antibioticum in trockener, fester Einheitsdosisform dargereicht werden sou, verwendet man Kapseln, Pillen oder Tabletten, die die gewünschte Menge Antibioticum enthalten. Diese Dosisformen werden hergestellt, indem man den Wirkstoff innig und gleichmäßig mit geeigneten feinteiligen Verdünnungsmitteln, Füllstoffen, zerfallsfördernden Mittein und/oder Bindemitteln, wie Stärke, Lactose, Talkum, Magnesiumstearat, Pflanzenharzen und dergleichen, mischt. Solche Einheitsdosisformulierungen können je nach Faktoren, wie der Art des zu behandelnden Wirtstieres, der Schwere und Art der Infektion und dem Gewicht des Wirtstieres, hinsichtlich ihres Gesamtgewichts und ihres Gehalts an FR-02A innerhalb weiter Grenzen schwanken. Das Antibioticum kann täglich in Mengen von etwa 5 bis 100 mg je kg Körpergewicht dargereicht werden.

Die Erfindung umfaßt auch die nicht-toxischen, pharmazeutisch unbedenklichen Salze von FR-02A, z. B. die Alkali- und Erdalkalisalze, wie die Salze von Natrium, Kalium, Ammonium und Calcium, oder Salze mit organischen Basen, wie Triäthylamin, N-Äihyipiperidin und Dibenzyiäthylendiamin.

Außer als Antibioticum kann das FR-02A auch als Futterzusatz verwendet werden, um den Wuchs von Tieren, wie Hühnern, Schafen und Rindern, zu beschleunigen. Durch die Anwendung von FR-02A wird die Zeit verkürzt, die erforderlich ist, damit die Tiere das für den Verkauf erforderliche Gewicht erreichen.

Wenn FR-02A als wuchsförderndes Mittel für Tiere verwendet wird, kann es als Bestandteil des Futters oder in Lösung oder Suspension im Trinkwasser dargereicht werden.

Wenn FR-02A als Bestandteil des Futters verwendet wird, wird es zunächst als Futterzusatz formuliert In solchen Futterzusätzen ist FR-02A in verhältnismäßig hohen Konzentrationen in inniger Verteilung in einem inerten Träger oder Verdünnungsmittel enthalten. Der Futterzusatz kann direkt zu dem Futter zugesetzt oder in einer Verdünnungs- oder Mischstufe zu einer Vormischung verarbeitet werden. Ein inerter Träger ist ein solcher, der mit dem Antibioticum nicht reagiert, und der den Tieren gefahrlos dargereicht werden kann. Vorzugsweise verwendet man einen Träger, der ein Bestandteil der Nahrung der Tiere ist oder sein kann. Typische Träger oder Verdünnungsmittel, die sich für solche Gemische eignen, sind z. B. getrocknete Brennereirückstände, Maismehl, Citrusmehl, Fermentationsrückstände, gemahlene Austernschalen, Weizenmüllereiabfall, lösliche Melassebestadnteile, Maiskolbenmehl, genießbare Bohnenmühlenbeschickung, Sojagrütze, zerkleinerter Kalkstein und dergleichen. Das Antibioticum wird nach Methoden, wie-Rühren, Vermählen oder Umwälzen, innig in dem Träger dispergiert Gemische, die das Antibioticum in Konzentrationen von etwa 5 bis 50 Gewichtsprozent enthalten, eignen sich besonders als Futterzusätze.

Beispiele für typische Futterzusätze, die FR-02A in Dispersion in einem festen Träger enthalten, sind:

	FR-02A	kg
(A)	Weizenmüllereiabfall	5
	FR-02A	95
(B)	Maisbrennereirückstände	50
	50

Diese und ähnliche Futterzusätze werden durch gleichmäßiges Vermischen des Antibioticums mit dem Träger hergestellt

Der Futterzusatz kann direkt zu dem Futter zugesetzt oder durch weiteres Verdünnen oder Mischen mit einem

oral darreichbaren Träger zu einer Vormischung verarbeitet werden. Gemische, die das Antibioticum in Konzentrationen von 0,03 bis 5 Gewichtsprozent enthalten, eignen sich besonders als Vormischungen. Diese Vormischungen werden hergestellt, indem man das Antibioticum gleichmäßig mit einem oral darreichbaren Träger mischt.

Solche Zusätze oder Vormischungen werden dem Futter in solchen Mengen beigegeben, daß das fertige Futter das FR-02A in der für die Beschleunigung des ι ο Wachstums erwünschten Konzentration enthält. Für Hühner wird FR-02A in einer Endkonzentration von 50 bis 300 g je Tonne Futter dargereicht, um die gewünschte Beschleunigung des Wachstums zu erzielen. Im Falle von Schweinen, wozu auch mit M. hyorhinis infizierte Schweine gehören, kann FR-02A in dem Futter in ähnlichen Konzentrationen dargereicht werden.

In der vorstehenden Beschreibung der Erfindung ist in erster Linie auf feste Gemische Bezug genommen worden, bei denen das FR-02A in dem Futterzusatz, der sogenannten Vormischung oder in dem fertigen Futter im Gemisch mit einem genießbaren Träger vorliegt. Dieses ist die bevorzugte Methode zur Darreichung von FR-02A. Eine andere Methode besteht darin, das FR-02A im Trinkwasser der Tiere zu lösen oder zu suspendieren. Die Menge, die in dem Wasser ohne Gefahr eines zu starken Absetzens suspendiert werden kann, ist beschränkt. Man kann daher außerdem Emulgiermittel oder Tenside zusetzen.

Die Futterzusätze und fertigen Tierfuttermischungen, die FR-02A enthalten, können außerdem Vitamine, andere Antibiotica und wuchsfördernde Mittel oder andere Nährstoffe enthalten.

FR-02A ist gegen Geflügel-PPLO in Mengen im Bereich von 5 bis 100 mg/kg wirksam. Ein bevorzugter Bereich für eine Einzeldosis beträgt 35 bis 45 mg/kg. Aus Gründen der Einfachheit besteht die bevorzugte Methode der Darreichung des Antibioticums zur Behandlung von PPLO darin, das FR-02A mit dem Tierfutter zu vermisdJen. Für die Bekämpfung von PPLO beträgt ein bevorzugter Bereich 0,0055 bis 0,02 Gewichtsprozent des Futters.

Zur Behandlung von Luftsacculitis bei Hühnern beträgt der ED₅₀-Wert 40 bis 100 mg/kg. Dementsprechend kann die Dosis an FR-02A im Bereich von 10 bis 150 mg/kg variieren.

Eine Lösung oder Suspension für die subkutane Injektion zur Behandlung von Luftsacculitis bei Hühnern kann folgendermaßen hergestellt werden:

Ampulle mit subkutan applizierbarer Lösung oder Suspension, die 20 mg FR-02A enthält

FR-02A 20 mg _₅

Verdünnungsmittel:

steriles Wasser für die Injektion 2 cm³

Die für die Behandlung von Coccidiose bevorzugte Methode besteht darin, daß man das FR-02A im Futter in einer Konzentration von etwa 0,05 bis 2 Gewichtsprozent des Futters darreicht

Die darzureichende Dosis richtet sich natürlich weitgehend nach dem Zustand und dem Gewicht des Wirtstieres, und für die Behandlung von PPLO und Coccidiose wird die orale Darreichung bevorzugt Für die Verwendung als wuchsförderndes Mittel wird das FR-02A vorzugsweise im Gemisch mit dem Futter dargereicht

Beispiel 1

Herstellung des Antibioticums FR-02A

durch Schüttelkoibenfermentation von Streptomyces lactamdurans N RRL 3802

Als Impfgut dient eine gefriergetrocknete Kultur.

Die gefriergetrocknete Kultur wird in einen mit drei Umlenkorganen versehenen 250-ml-Erlenmeyerkolben eingegeben, der 40 ml erststufiges Impfmedium enthält:

Erststufiges Impfmedium

Primärhefe in destilliertem Wasser Einstellung des pH-Wertes
mit NaOH auf 7,0

1%

Der erststufige Impfkolben sowie der darauffolgende zweitstufige Kolben und der Produktionskolben werden in einer mit 220 U/min arbeitenden Schüttelmaschine bei 28⁰C inkubiert.

Nach 2 Tagen in dem erststufigen Medium wird 1 ml des erststufigen Impfgutes zum Beimpfen von 40 ml des zweitstufigen Impfmediums in einem mit drei Umlenkorganen versehenen, 250 ml fassenden Erlenmeyerkolben verwendet.

Zweitstufiges Impfmedium

»Ardamine YEP« (99F) 1%

in destilliertem Wasser;
pH-Wert mit NaOH auf 7,0
eingestellt.

Der zweitstufige Impfkolben wird einen Tag inkubiert, worauf man zehn, nicht mit Umlenkorganen versehene 250 ml-Edenmeyerkolben, die je 40 ml Produktionsmedium enthalten, mit je 1 ml dieser Kultur beimpft.

Produktionsmedium	Primärhefe	1%
Lösliche Schlempebestandteile	3/o
Glycin	0,05%
L-Phenylalanin	03%
Maisstärke	2,0%
Dimethylformamid	l.OVoL-%
»Mobil par-S«	0,25Vol.-%
als Schaumverhütungsmittel
in destilliertem Wasser;
pH-Wert mit NaOH auf 7,0
eingestellt

Durch Lösen von 12£g Na₂S₂O₃ · 5 H₂O in 100 ml destilliertem Wasser wird eine Natriumthiosulfatlösung hergestellt Diese Lösung wird filtersterilisiert, worauf man je 1 ml der Lösung zu den 10 Produktionskolben zusetzt

Die 10 Kolben werden 4 Tage bei 28° C inkubiert und dann abgeerntet

Isolierung von FR-02A

Der pH-Wert von 400 ml der so erhaltenen Fermentationsflüssigkeit wird mit Salzsäure auf 5 eingestellt, worauf man 2 Raumteile Chloroform zu der Flüssigkeit zusetzt Nach gründlichem Vermischen wird die Flüssigkeit durch einen Filterpfropfen filtriert Zur Beschleunigung der Filtration wird Wasser zugesetzt Man läßt das Filtrat stehen, bis sich die Chloroformschicht abgetrennt hat Die Chloroformschicht wird

abgezogen, zweimal mit je 500 mi Wasser gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der feste Rückstand wird mit 500 ml Petroläther versetzt, abfiltriert, vnit 50 ml Petroläther gewaschen und an der Luft getrocknet. Man erhält 144 mg FR-02A. Das FR-02A wird in das Ammoniumsalz übergeführt, indem eine Lösung des FR-02A in 50 ml Wasser, welches mit Ammoniumhydroxid auf einen pH· Wert von 10 eingestellt worden ist, gefriergetrocknet wird. Nach dem Gefriertrocknen wiegt das Produkt 140 mg.

Da FR-02A zusammen mit dem Mycel und den suspendierten Nährstoffen anfällt, kann man das Mycel und die suspendierten Nährstoffe zunächst von der Fermentationsflüssigkeit abfiltrieren und das FR-02A aus dem Filterkuchen mit einem polaren mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, wie Aceton, extrahieren. Diese Methode der Isolierung von FR-02A wird folgendermaßen durchgeführt:

Von 400 ml der bei der oben beschriebenen Fermentation erhaltenen gesamten Fermentationsflüssigkeit werden das Mycel und die suspendierten Nährstoffe abfiltriert. Der Filterkuchen wird 30 Minuten mit 40 ml Aceton verrührt und wieder filtriert. Der Kuchen wird dann mit 15 ml Aceton gewaschen. Die vereinigten Acetonextrakte und Waschflüssigkeiten werden im Vakuum bei 30⁰C eingedampft, um das Aceton abzutreiben. Der Rückstand wird in 15 ml Wasser aufgenommen. Der pH-Wjrt wird mit Salzsäure au/ 4,0 eingestellt

Man setzt ein gleiches Volumen Hexan zu und rührt 10 Minuten. Nach dem Absitzen wird das Hexan dekantiert und vei-worfen. Man extrahiert noch zweimal mit gleichen Volumenmengen an Hexan, wobei der letzte Extrakt farblos ist

Die wäßrige Aufschlämmung wird dann mit einem gleichen Volume« Chloroform extrahiert Dann extrahiert man noch einmal mit einem gleichen Volumen und vereinigt den zweiten Extrakt mit dem ersten. Die wäßrige Phase wird verworfen.

Der Chloroformextrakt wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet filtriert und im Vakuum zu 106 mg FR-02A eingedampft

Durch Chromatographie des nach dem oben beschriebenen Fermentationsverfahrens gewonnenen Materials an »Sephadex LH-20« wird bestimmt daß die Molekulargewicht des FR-02A etwa 1000 beträgt Das von dieser Behandlung gewonnene Material wird nochmals, dieses Mal an »Amberlite XAD-2«, Chromatographien, um eine analysenreine Probe zu erhalten.

Chromatographie an »Sephadex LH-20«-Gel

0,5 ml einer Methanollösung, die 106 mg des nach Beispiel 1 gewonnenen FR-02A enthält werden auf eine 75-ml-Schicht (1,25 cm Durchmesser und 56 cm Höhe) »Sephadex-LH-20«-Gel in Methanol aufgetragen. Die Kolonne wird mit Methanol entwickelt Der Eluatstrom wird mit Hilfe eines Differentialrefraktometers überwacht, und das so erhaltene Diagramm zeigt 3 Maxima. Fraktionen werden in 1- bis lOfacher Verdünnung mit 12,7-mm-Papierfalättchen auf Agar-Diffusionstestplatten analysiert, die mit Vibrio percolans beimpft sind. Es werden Hemmungszonen beobachtet, die dem festgestellten dritten Massenmaximum, (Kd = 0,3) entsprechen. Die dem dritten Massenmaximum entsprechenden Fraktionen werden miteinander vereinigt und eingedampftMan erhält 43 mg FR-02A-Wenn das Produkt nach der oben beschriebenen biologischen Agar-Diffusionsmethode mit Vibrio percolans analysiert wird, ergibt es eine Hemmungszone von 16 mm bei einer Konzentration von 200y/ml. Die Ultraviolettabsorption in einer Phosphatpufferlösung mit einem pH von 7,0 ergibt die folgenden Werte;

λ™,. 327 nm; Ei* =216
A_mat. 232 nm; E \ *_m = 464

Wenn das nach Beispiel 1 erhaltene Produkt in ίο Wasser bei einem pH-Wert von 9 (der durch Zusatz von verdünnter Natronlauge eingestellt wird) gelöst, das unlösliche Material abfiltriert und das Filtrat gefriergetrocknet wird, kann man die Reinigung mit »Sephadex LH-20«-Gel fortlassen.

Chromatographie an »Amberlite XAD-2«-Harz

Die bei der Reinigung mit »LH-20« gewonnenen 43 mg Produkt werden weiter durch Chromatographie

112 cm Höhe) »Amberlite XAD-2«-Harz in 50prozentigem Isopropanol in Wasser gereinigt. Das Ausgangsgut wird auf einen pH-Wert von 2 angesäuert, um es in die freie Säure umzuwandeln, bevor man es in die Kolonne einbringt. Die Kolonne wird mit Hilfe eines Differential-

refraktometers überwacht, und das dabei erhaltene Diagramm zeigt 2 Massenmaxima. Durch Agardiffusion mit 6,4-mm-Testblättchen unter Verwendung von Vibrio percolans durchgeführte biologische Analysen zeigen, daß die bei Kd 3,5 bis 4,0 zentrierten

Massenmaxima das Antibioticum enthalten. Die Fraktionen, die diesen Ko-Werten entsprechen, werden miteinander verienigt und im Vakuum zur Trockne eingedampft. So erhält man 16,4 mg des Antibioticums FR-02A. FR-02A wird als blaßgelber fester Stoff gewonnen, der gegen die normale Hantierung beständig ist und analytisch rein anfällt.

Beispiel 2

Herstellung des AntiDioticums FR-02A

durch Schüttelkolbenfermentation von Streptomyces lactamdurans NRRL 3802

Als Impfgut dient eine gefriergetrocknete Kulter. Die gefriergetrocknete Kultur wird in einen mit drei Umlenkorganen versehenen 250-ml-Erl8nmeyerkoiben eingegeben, der 40 ml erststufiges Impfmedium der folgenden Zusammensetzung enthält:

Erststufiges Impfmedium

Primärhefe in destilliertem Wasser, 1 % mit NaOH auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt

Der erststufige Impfkolben sowie der darauffolgende zweitstufige Kolben und der Produktionskolben werden in einer bei 220 U/min arbeitenden Schüttelmaschine bei 28°C inkubiert

Nach 2tätiger Inkubation in dem erststufigen Medium

wird 1 ml des erststufigen Impfgutes zum Beimpfen von 40 ml des zweitstufigen Impfmedhims in einem mit drei Umlenkorganen versehenen, 250 ml fassenden Erlenmeyerkolben verwendet

Zweitstufiges Impfmedium

»ArdamineYEP«(99F) 1%

in destilliertem Wasser;
mit NaOH auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt

Der zweitstufige Impfkolben wird ehrcn Tag inkubiert, worauf man zehn, nicht mit Umlenkorganen versehene 250-ml-Erlenmeyerkolben, die je 4OmI Produktionsmedium enthalten, mh je 1 ml einer jeden Kultur beimpft öas Produktionsmedium hat die folgende Zusammensetzung:

Produktionsmedium Maisquellwasser 2£ Gew.-% Cerelose 5,6 Gew.-%

»Proflo« 2,8 Gew.-%

Glycerin l,4VoL-%

Dimethylformamid l,4VoL-% in Leitungswasser, mit NaOH auf einen pH-Wert von 73 eingestellt

0,2% 1,0%

Zu jedem Kolben wird vor der Autoklavbehandlung ein Tropfen Schaumverhütungsmittd (»P-2000«) zugesetzt

Durch Lösen von 6,25 g Na₂S₂Os - 5 H₂O in 100 ml destilliertem Wasser wird eine Natriumthiosulfatiösung hergestellt Diese Lösung wird filtersteriliseirt, worauf man zu jedem der Produktionskolben nach der Autoklavbehandlung 0,5 ml dieser Natriumthiosuifatiösung zusetzt

Die zehn Produktionskolben (insgesamt 400 ml) werden 5 Tage bei 28° C inkubiert und dann abgeerntet

Der Inhalt der zehn Kolben wird vereinigt, der pH-Wert mit Salzsäure auf 5,5 eingestellt, worauf man 500 ml Chloroform zusetzt und das Gemisch </₂ Stunde bei Raumtemperatur rührt Hierauf wird das Gemisch zentrifugiert, um die Phasen voneinander zu trennen, und die wäßrige Phase wird verworfen. Die Chloroformschicht wird Ober wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum abgedampft Der Rückstand wird mit 30 ml Hexan geschüttelt Nach dem Abzentrifugieren des Rückstandes wird das Hexan dekantiert Der Rückstand wird mit 30 ml Wasser versetzt, die zuvor mit Ammoniumhydroxid auf einen pH-Wert von 10 eingestellt worden sind, wobei man eine etwas trübe Lösung erhält Für die biologische Analyse wird der pH-Wert sodann mit Salzsäure auf 83 vermindert und die Lösung mit Wasser von einem pH-Wert von 83 für die Analyse nach dem Blättchentest verdünnt Die biologische Analyse ergibt, daß die Ausbeute des Fermentationskolbens 327 γ FR-02A je ml Fermentationsflüssigkeit oder insgesamt 130 mg beträgt

Beispiel 3 Herstellung des Antibioticums FR-02A

durch Schüttelkolbenfermentation von Streptomyces lactamdurans NRRL 3802

Als Impfgut dient eine gefriergetrocknete Kultur.

Die gefriergetrocknete Kultur wird in einen mit drei Umlenkorganen versehenen 250 ml-Erlenmeyerkolben eingegeben, der 40 ml erststufiges Impf medium der folgenden Zusammensetzung enthält:

Erststufiges Impfmedium

Primärhefe in destilliertem Wasser, 1 % mit NaOH auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt

Der erststufige Impfkolben sowie der darauffolgende Produktionskolben werden in einer bei 220 U/min

arbeitenden Schüttelmaschine bei 28°CinkubierL

Nach 2tätiger Inkubation in dem erststufigen Impfmedium werden zehn nicht mit Umlenkorganen versehene 250-ml-Erlenmeyerkolben, die je 40 ml Produktionsmedium enthalten, welches praktisch frei von suspendierten Nährstoffen ist, mit je ImI des erststufigen Impfmediums beimpft Das Produktionsmedium hat die folgende Zusammensetzung:

Produktionsmedium Nährbrühe (Difco) Hefeextrakt (Difco)

Dextrose

in destilliertem Wasser.

Zu jedem Kolben wird vor der Autoklavbehandlung ein Tropfen Scbaumverhütnngsmittel (»P-2000«) zugesetzt

Dann werden die zehn Produktionskolben 5 Tage bei 28° C inkubiert und abgeerntet

Isolierung von FR-02A

Der Inhalt der zehn Produktionskolben (insgesamt 400 ml) wird vereinigt, der pH-Wert mit Salzsäure auf 5,5 eingestellt und die Fermentationsflüssigkeit filtriert, um das Mycel zu entfernea Das klare Filtrat wird mit 500 ml Chloroform gemischt und '/2 Stunde gerührt Dann wird das Gemisch zentrifugiert, um die Phasen zu trennen, und die wäßrige Phase wird verworfen. Die Chloroformschicht wird über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum zur Trockne eingedampft Der Rückstand wird mit 30 ml Hexan gewaschen, worauf man durch Trocknen an der Luft das Antibioticum FR-02A erhält

Beispiel 4 Herstellung des Antibioticums FR-02A

durch Schüttelkolbenfermentation von Streptomyces lactamdurans NRRL 3802

Als Impfgut dient eine gefriergetrocknete Kultur.

Die gefriergetrocknete Kultur wird in einen mit drei Umlenkorganen versehenen 250-ml-Erlenmeyerkolben eingegeben, der 40 ml erststufiges Impfmedium der folgenden Zusammensetzung enthält:

Erststufiges Impfmedium Primärhefe in destilliertem Wasser, 1 %

mit NaOH auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt

Der erststufige Impfkolben sowie der darauffolgende Produktionskolben werden in einer bei 220 U/min arbeitenden Schüttelmaschine bei 28^s C inkubiert

Nach 2tätiger Inkubation in dem erststufigen Impfmedium werden zehn nicht mit Umlenkorganen versehene 250-ml-Erlenmeyerkolben, die je 40 ml Produktionsmedium enthalten, welches praktisch frei von suspendierten Nährstoffen ist, mit je 1 ml des erststufigen Impfmediums beimpft Das Produktionsmedium hat die folgende Zusammensetzung:

Produktionsmedium Nährbrühe (Difco) Hefeextrakt (Difco)

Dextrose

in destilliertem Wasser.

0,8% 0,2% 1,0%

Zu jedem Kolben wird vor der Autoklavbehandlung ein Tropfen Schaumverhütungsmittel (»P-2000«) zugesetzt

Dann werden die zehn Produktionskolben 5 Tage bei 28^oCmkubiert und abgeerntet

Isolierung von FR-02A

Der Inhalt der zehn Produktionskolben (insgesamt 400 ml) wird vereinigt, der pH-Wert mit Salzsäure auf 5,5 eingestellt und das Gemisch filtriert um das Mycel zu gewinnen. Das Mycel wird mit 500 ml Chloroform extrahiert Der Chloroformextrakt wird über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum zur Trockne eingedampft Der Rückstand wird mit 30 ml Hexan gewaschen, und durch Trocknen an der Luft erhält man das Antibioticum FR-02A.

Beispiel 5 Herstellung des Antibioticums FR-02A

durch Schüttelkolbenfermentation von Streptonsyces !actsmdurans NRRL3802

Als Impf gut dient eine gefriergetrocknete Kultur.

Die gefriergetrocknete Kultur wird in einen mit drei Umlenkorganen versehenen 250 ml-Erlenmeyerkolben eingegeben, der 4OmI erststufiges Impfmedium der folgenden Zusammensetzung enthält:

Erststufiges Impfmedium

Primärhefe in destilliertem Wasser, mit NaOH auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt

1%

Produktionsmedium Nährbrühe (Difco) Hefeextrakt (Difco)

Dextrose

in destilliertem Wasser.

03% 0,2% 1,0%

Beispiel 6 Herstellung des Antibioticums FR-Ö2A

durch Schüttelkolbenfermentation . vonStreptomyceslactamdüransNRRL3802

Als Impfgut dient eme gefriergetrocknete Kultur. Die gefriergetrocknete Kultur wird in einen mit drei Umlenkorganen versehenen 250-mI-ErIenmeyerköIben eingegeben, der 40 ml erststufiges Impfmedium der ίο folgenden Zusammensetzung enthält:

15

Erststufiges Impfmedium

Primärhefe in destilliertem Wasser, mit NaOH auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt

1%

Der erststufige Impfkolben sowie der darauffolgende zweitstufige Kolben und der Produktionskolben v^xlen in einer bei 220 U/min arbeitenden Schüttelmaschine bei 28°C inkubiert

Nach 2tägiger Inkubation in dem erststufigen Medium wird I mi des erststufigen Impfgutes zum Beimpfen von 40 ml des zweitstufigen Impfmediums in

einem mit drei Umlenkorganen versehenen, 250 ml fassenden Erlenmeyerkolben verwendet

30

Der .ratstufige Impfkolben sowie die darauffolgenden Produktionskolben werden in einer bei 220 U/min arbeitenden Schüttelmaschine bei 28⁰C inkubiert

Nach 2tägiger Inkubation in dem erststufigen Impfmediuin werden zehn nicht mit Umlenkorganen versehene 250-mI-ErIenmeyerkolben, die je 40 ml Produktionsmedium enthalten, welches praktisch frei <o von suspendierten Nährstoffen ist, mit je 1 ml des erststufigen Impfmediums beimpft Das Produktionsmedium hat die folgende Zusammensetzung:

Zu jedem Kolben wird vor der Autoklavbehandlung ein Tropfen Schaumverhütungsmittel (»P-2000«) zugesetzt

Dann werden die zehn Produktionskolben 5 Tage bei 28° C inkubiert und abgeerntet.

Isolierung von FR-02A

Der Inhalt der zehn Produktionskolben (ingesamt 400 ml) wird vereinigt und der pH-Wert mit Sahsäure auf 54 eingestellt Nach Zusatz von 500 ml Chloroform wird das Gemisch '/2 Stunde bei Raumtemperatur gerührt Dann wird das Gemisch zentrifugiert, um die Phasen voneinander zu trennen, und die wäßrige Phase wird verworfen. Die Chloroformschicht wird über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird mit 30 ml Hexan gewaschen und an der Luft getrocknet. So erhält man das Antibioticum FR-02A.

Zweitstufiges Impfmedium

»Ardamine YEP« (99F) in destilliertem Wasser, mit NaOH auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt

1%

45

50

Der zweitstufige Impfkolben wird einen Tag inkubiert, worauf man zehn nicht mit Umlenkorganen versehene 250 ml-Erlenmeyerkolben, die je 40 ml Produktionsmediumenthalten, mit je 1 ml einer jeden Kultur beimpft Das Produktionsmedium hat die folgende Zusammensetzung:

Produktionsmedium Maisquellwasser 2,8 Gew.-% Cerelose 5,6 Gew.-%

»Proflo« 2fi Gew.-%

Glycerin 1,4 VoL-%

Dimethylformamid 1,4 Vol.-% in Leitungswasser, mit NaOH auf einen pH- Wert von 73 eingestellt

Zu jedem Kolben wird vor der Autoklavbehandlung ein Tropfen Schaumverhütungsmittel (»Ρ>~·800«) zugesetzt

Durch Lösen von 6,25 g NaiS^ · 5 H₂O in 100 ml destilliertem Wasser wird eine Natriumthiosulfatlösung hergestellt Diese Lösung wird filtersterilisiert, worauf man zu jedem der Produktionskolben nach der Autoklavbehandlung 04 ml dieser Natriumthiosulfatlösung zusetzt

Die zehn Produktionskolben (insgesamt 400 ml) werden 5 Tage bei 28" C inkubiert und dann abgeerntet

Isolierung von FR-02A

Der Inhalt der zehn Kolben wird vereinigt, der pH-Wert mit Salzsäure auf 54 eingestellt, und das Mycel sowie die suspendierten Nährstoffe werden von der Fermentationsflüssigkeit abfiltriert Das Filtrat wird mit 500 ml Chloroform gemischt und '/j Stunde gerührt. Das Gemisch wird zentrifugiert, um die Phasen zu trennen, worauf man die wäßrige Phase verwirft. Die

Chloroformschicht wird über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum abgetrieben. Der Rückstand wird nut 30 ml Hexan gewaschen. Durch Lufttrocknen erhält man das Antibioticum FR-02A.

Physikalische Eigenschaften

Die Elementaranalyse des FR-02A liefert das folgende Ergebnis:

C = 60,98%, H = 7,60%, N = 2,60%.

15

Die empirische Formel ist C59H90—95N2O21. Dies steht in Obereinstimmung mit dem durch Massenspektrometrie bestimmten Molekulargewicht von 1168.

In Form seoes Ammoniumsalzes ist das FR-02A in 20 Tabelle I AjIr₀I₂₀! und iB Chloroform löslich. Bei pH-Werten von 7,0 oder mehr ist es mäßig löslich in Wasser. Das Ultraviolettspektrum des Ammoniumsalzes in Wasser zeigt die folgenden Kennwerte:

X_n^ 233 nm;£}L =320 = 180

Das FR-02A ist ein praktisch reines Material, da es bei der Dünnschichtchromatographie nur einen einzigen Fleck liefert und bei der Überwachung der Analyse in der »LH-20«-Kolonne lind in der »XAD-2«-Kolonne mit dem Refraktometer ein einziges Profil von Gaußseher Form ergibt ■■

. Um das FR-02A weiter in vitro zu kennzeichnen, werden ssine Aktivitätsdaten unter Verwendung eines Profils des antibiotischen Spektrums bestüvmt Zur Durchführung dieses Tests wird ein Tropfen des Antibioticums von etwa 0,015 ml Inhalt auf die Oberfläche von beimpften Komplex-Agarplatten aufgebracht Das FR-02A liegt dabei in Lösung in lOprozentigem Methanol vor, welches für allem keine Hemmzone erzeugt Die Ergebnisse finden sich in Tabelle I als Hemmzonen in Millimeter.

Profile des antibiotischen Spektrums von FR-02 A beim Agar-Diffusionstest

Mikroorganismus, MB- FürFR-O2A,s=19xlO³.

Das kernmagnetische Resonanzspektrum des Antibioticums FR-C2A wird bei 100 MHz in CDCI₃ als Lösungsmittel mit Tetramethylsilan (TMS) als innerem Standard aufgenommen. Repräsentative Merkmale des Spektrums sind Dublette bti J ,21,1.31 und 4,63 τ und ein Singulettbei4,87T.

Das Infrarotabsorptionsspektrum des Antibioticums FR-02A in Nujol ist in der Fig. 1 dargestellt FR-02A zeigt eine charkaterisitsche Absorption im Infrarot des Spektrums bei den folgenden Wellenlängen, ausgedrückt in cm-':

Breite Bande bei 3400,

starke Banden bei 1640,1460,1380,1080 und 1020, vorspringende Banden bei 1550, 1505, 1240, 1195, 940,860,720,620.

FR-02A wurde nach verschiedenen Analysenmethoden mit den folgenden Ergebnissen untersucht:

1. »LH-20«-Kolonne in
Methylalkohol

(aufgegeben als NH„⁺-Salze) /C_D=0302

2. »XAD-2«-Kolonne;
50prozentiges lsopropanol
in Wasser

(als freie Säure aufgegeben);

Austreten bei DV.=3,5 bis 4,0

3. Dünnschichtchromatographie an Kieselsäuregel, eluiert mit
einem Gemisch aus

80 Teilen Chloroform,

20 Teilen Methylalkohol und

1 Teil konzentriertem NH₄OH R_f=0,344

4. Papierchromatographie
mit einem Gemisch aus
70 Teilen lsopropanol und
30 Teilen Phosphatpuffer

(pH =6,0; 0,01-molar) Rr=0,9

Durchmesser der Hemmzonen, mm

FR-02A 1 rag/ml

30 Bacillus sp. 633
Proteus vulgarus 1012
Pseudomonas aeruginosa 979
Serratia marcescens 252

Staphylococcus aureus 108
Bacillus substilis 964
Sarcina lutea 1101
Staphylococcus aureus 698*)
Streptococcus faecalis 753

Alcaligenes faecalis 10
Brucella bronchiseptica 965
Salmonella gallinarum 1287
Vibrio percolans 1272
Xanthomonas vesicatoria 815
Escherichia coli 1418
Ps. stutzen 1231
Klebsieila pneumoniae 1264
Aerobacter aerogenes 835
Erwinia atroseptica 1159
Corynebact. pseudodipht. 261
S. aureus 3032
S. aureus 2756
Strep, faecium 2820
Proteus vulgaris 838
E. coli 60

45

50

55

60

S. aureus (res. Erythromycin) 1909

18

10

Ϊ0Η

1OH

11

19

28

12H

11

19

18

13

21

13

15

10

16

13

12

27

12

23

20

18

10

16

H - trübe Zone.

*)Resistent gegen Streptomycin, Streptothricin, Neomycin und Viomycin.

Bei der Untersuchung an Mäusen zeigt das Antibioticum FR-02A in vivo eine geringere Toxizität und ein breites Spektrum der antibakteriellen Aktivität. Je ein Beispiel der Ergebnisse für ein gram-negatives und ein gram-positives Bakterium sind in Tabelle II zusammengefaßt.

j ; j,.	19	24 50 813	Therapie	ED50	20	toxisch
			Darreichung	1,73		>5,0
§ Tabellen		IP	0,247		5,0
m in vivo-Testergeiiiiiisse	mit FR-02A?) an Mäusen	IP		ToxMtät**)
H Infektion -			Vertragen
S Mikroorganismus	Darreichung		5,0
H Proteus vulgaris '	IP		1,25
§§ Strep, pyogenes J I- ■ ■ ;!	IP

*) Die. Werte der ti jjigen T?iibelle sind in mg je Versuchstier ausgedruckt Sowohl die Infektion als auch die Darreichung der therapeutischen Do«; j;c von FR-02 A erfolgt introperitoneaL FR-02 A wird einmal zum Zeitpunkt der Infektion und dann nochmals nach 6 Stundeini dargerefc&t.

**) Die Toxiritätstitiitersuchungen mit FR-02 A an nicht infizierten Mäusen ergeben, daß zwei Dosen zu je 2,5 mg je Versuchstier, die in eiaeiin Zeitabstaad von 6 Stunden dargereicht werden, von den Tieren vertragen werden, höhere Dosen, nämlich 5 bis 10 mg je Versuchstier, jedoch toxisch sind.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims (1)

Patentansprüche:

1. Antibiotikum FR-02A, dadurch gekennzeichnet, daß es ein blaßgelber fester Stoff mit folgenden Eigenschaften ist:

a) löslich in niederen Alkylestem von niederen Alkancarbonsäuren, Ketonen und Chloroform, schwach löslich in Wasser und unlöslich in Hexan; ^J

b) Ammoniumsalz löslich in Alkohol, Chloroform und mäßig löslich in Wasser mit pH-Werten von 7,0 oder mehr;

c) Zusammensetzung: 6038% Kohlenstoff, 7,60% Wasserstoff, 2,60% Stickstoff und 28,82% Sauerstoff;

d) Molekulargewicht etwa 1'ό8;

e) enqparische Formel CSgH₉O-SeN₂O₂₁;

f) «JlträvioJettabsorption in Phosphatpufferlösung von pH 7,0

A_(rat.327nm;£l^ =216 A_mÄ232nm;£"i^ =464;

g) Ultraviolettabsorption des Ammoniumsalzes in Wasser: