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PERFECTIONNEMENTS APPORTES AUX PROCEDES POUR LA PREPARATION D'ANTIBIO- TIQUES...
EMI1.1
Yinv6nticl1 est relative a la. préparation de nouveaux antibiotiques utiles; et elle concerne plus particulièrement;, des procédés pour "l'obtention de ces produits par pour leur réc:.upêraticn, leur concentration à partir des solutions brutes y compris les bouillons de ferne-ntationi leur purification et la. préparation de leurs sels. Les antibiotiques et leurs sels;,
EMI1.2
obtenus selon 1 invention peuvent se présenter sous forme de solutions di- luées, de concentrats bruts ou à l"'état cristallise pur.
L'" a:ntibiotique est J?>tenu, au cours de la culture dans des condi- tions réglées s. pertir dune espèce de (, qui na pas encore été décrite jusque ici et qui est dénommé &to1JVcesûsuo La description de cet o.t'gal1isme en suivant la méthode adoptée par Bergey dans son 'Xaiual cf determinative Bac sixième édition, pages 929-933:; est donnée ci- dessous
Les caractéristiques de la culture de cette espèce, voisine du
EMI1.3
Stre3,- mzees al-bus. en diffèrent par plusieurs particularités:, basées sur la souche d:> isolement;
S 3279-et sont indiquées ci-dessous sous forme d'un ta- bleau (quand les couleurs sont. suivies de R, on se réfère à la table des cou-
EMI1.4
leurs donnée dans "Pddgiïa7j Color Standards and Les indications données sont basées sur les constatations faites avec six tubes ou plaques.
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COULEUR
EMI2.1
MOI" Degré de croi--- 1.1:tceli11L1 :tr3- Pi-Eien'o - milieu sance rien et spo- soluble J."emarques
EMI2.2
<tb> ¯¯¯ <SEP> res
<tb>
<tb> Plaques <SEP> Modère <SEP> entre <SEP> blanc <SEP> jaunâtre <SEP> Colonie <SEP> plate; <SEP> bords <SEP> ir-
<tb>
EMI2.3
glucose C, bon et gris p2.- très P8,- réguliers; surface lisser
EMI2.4
<tb> asparagi- <SEP> La <SEP> plupart <SEP> le <SEP> (R) <SEP> le <SEP> sporulation <SEP> légère; <SEP> myce-
<tb>
<tb> ne <SEP> agar <SEP> subnergé <SEP> lium <SEP> aérien <SEP> léger; <SEP> envers
<tb>
<tb> presque <SEP> jaune; <SEP> ocre <SEP> (R)
<tb>
<tb>
<tb> au <SEP> centre; <SEP> chamois <SEP> colo-
<tb>
<tb> nial <SEP> aux <SEP> bords; <SEP> spirales
<tb>
<tb> très <SEP> nombreuses;
<SEP> conidies
<tb>
<tb>
<tb> en <SEP> chaînes <SEP> 0,6 <SEP> à <SEP> 0,7 <SEP> x
<tb>
EMI2.5
0, (3 â 9!; courtes et cylï.dritess plaques de
EMI2.6
<tb> . <SEP> dilution: <SEP> colonies <SEP> pour
<tb> ainsi <SEP> dire <SEP> semblables;
<tb> Colonies <SEP> isolées: <SEP> ensenbles <SEP> pelliculaires <SEP> ou <SEP> dispersés <SEP> de <SEP> grands <SEP> amas <SEP> de
<tb> spirales; <SEP> odeur <SEP> de <SEP> terre.
<tb>
<tb>
Gélatine <SEP> modéré <SEP> blanc <SEP> aucune <SEP> liquéfaction <SEP> modérée
<tb>
<tb> lait <SEP> de <SEP> bon <SEP> pellicule <SEP> blanc <SEP> gri- <SEP> partie <SEP> aucune <SEP> hydrolyse <SEP> ou <SEP> peptournesol <SEP> épaisse <SEP> sâtre <SEP> inférieure <SEP> Ionisation; <SEP> le <SEP> pH <SEP> est <SEP> in-
<tb> (à <SEP> 28 ) <SEP> du <SEP> tube <SEP> changé.
<tb> plus <SEP> légère <SEP> que <SEP> le
<tb> repère
<tb>
<tb> (à <SEP> 37 ) <SEP> très <SEP> bon <SEP> blanc <SEP> gri- <SEP> partie <SEP> su- <SEP> aucune <SEP> hydrolyse <SEP> ou <SEP> pep-
<tb>
EMI2.7
sâtre périeure Ionisation;
le pu a pas- du liquide se de 6,,l a 6,6-7? 02.
EMI2.8
<tb> presque
<tb> noire
<tb>
<tb> glucose <SEP> modérée <SEP> plus <SEP> clair <SEP> brun <SEP> jau- <SEP> envers <SEP> presque <SEP> orange
<tb>
EMI2.9
eùgz-r sec, sur- du gris Nou- nâtre (cl1I'o:WD:te) de sine CR) et face craque- ris pâle orange OC1'91.:;;:
(R)
EMI2.10
<tb> !ce <SEP> par <SEP> crois- <SEP> (R)
<tb> sance <SEP> conti-
<tb>
EMI2.11
melle de bij-
EMI2.12
<tb> phes <SEP> végétatifs
<tb>
<tb> agar <SEP> pauvre <SEP> aucun <SEP> my- <SEP> jaune <SEP> très <SEP> envers <SEP> presque <SEP> chamois
<tb> nutritif <SEP> celium <SEP> aé- <SEP> faible <SEP> et <SEP> jaune <SEP> de <SEP> miel <SEP> (R).
<tb> rien;
<SEP> cireux
<tb>
EMI2.13
bout de modéré plissé blanchâ- légerenent sycelium presque ocre
EMI2.14
<tb> pomme <SEP> de <SEP> tre <SEP> à <SEP> gris <SEP> jaunâtre <SEP> fauve <SEP> (R)
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> terre <SEP> pale <SEP> (R)
<tb>
EMI2.15
nalate de pauvre, plat aucun 1JI..yce- aucun
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<tb> calcium <SEP> lium <SEP> aérien;
<tb>
<tb> colonie <SEP> pres-
<tb>
<tb>
<tb> que <SEP> jaune <SEP> de
<tb>
<tb> Mars <SEP> CI;.)
<tb>
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COULEUR
EMI3.1
<tb> Degré <SEP> de <SEP> crois- <SEP> Mycélium <SEP> aé- <SEP> Pigment
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Milieu <SEP> sance <SEP> rien <SEP> et <SEP> spo- <SEP> soluble <SEP> Remarques.
<tb>
<tb>
<tb> res
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> plaques <SEP> pauvre;
, <SEP> très <SEP> peu <SEP> de <SEP> aucun <SEP> légère <SEP> hydrolyse
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> d'amidon <SEP> mince <SEP> mycelium <SEP> aé-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> rien; <SEP> colo-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> nie <SEP> jaune
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> cannelle
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> clair <SEP> (R)
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> agar <SEP> aucun
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> synthé-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> rique
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Cellulose <SEP> aucun
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Milieu <SEP> modéré <SEP> à <SEP> blanc <SEP> à <SEP> gris <SEP> pâle <SEP> envers <SEP> presque <SEP> orange <SEP> de
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> d'Emerson <SEP> bon; <SEP> sur- <SEP> pâle <SEP> (R) <SEP> ;
<SEP> co- <SEP> brun <SEP> zinc <SEP> (chromate <SEP> de <SEP> Zn)
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> face <SEP> fen- <SEP> lonie <SEP> en <SEP> masse <SEP> jaunâ-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> dillée <SEP> en <SEP> presque <SEP> jaune <SEP> tre <SEP> (R)
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> plusieurs <SEP> de <SEP> miel <SEP> à <SEP> cran-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> petites <SEP> piè- <SEP> ge <SEP> de <SEP> zinc <SEP> ou
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ces <SEP> éventuel- <SEP> orange <SEP> ocreux
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> lement <SEP> (R)
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Bouillon <SEP> modéré <SEP> avec <SEP> jaune <SEP> réduction <SEP> du <SEP> nitrate <SEP> de- <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Dextrose <SEP> une <SEP> pell <SEP> i- <SEP> puis <SEP> faible <SEP> à <SEP> forte <SEP> dans
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> nitrate <SEP> cule <SEP> plusieurs <SEP> tubes
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Cette <SEP> espèce <SEP> diffère <SEP> de <SEP> S. <SEP> albus <SEP> des <SEP> manières <SEP> suivantes:
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> S. <SEP> albus <SEP> (Rossi <SEP> Doria <SEP> amend. <SEP> Krainsky) <SEP> S. <SEP> rimosus
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Waksman <SEP> et <SEP> Henrici
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1. <SEP> Mycélium <SEP> aérien <SEP> abondant <SEP> 1. <SEP> Mycélium <SEP> aérien <SEP> pauvre
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 2. <SEP> Mycélium <SEP> aérien <SEP> blanc <SEP> 2. <SEP> Mycélium <SEP> aérien <SEP> non <SEP> pas
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> d'un <SEP> blanc <SEP> pur <SEP> mais <SEP> pres-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> que <SEP> d'un <SEP> gris <SEP> pâle <SEP> (R)
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 3.
<SEP> pas <SEP> de <SEP> fendillement <SEP> de <SEP> la <SEP> colonie <SEP> 3 <SEP> , <SEP> quand <SEP> une <SEP> croissance <SEP> vigou-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> reuse <SEP> se <SEP> produit, <SEP> les <SEP> colo-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> nies <SEP> se <SEP> fendillent, <SEP> d'abord
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> à <SEP> la <SEP> périphérie <SEP> et <SEP> ensuite
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> sur <SEP> toute <SEP> la <SEP> surface <SEP> et <SEP> la
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> couche <SEP> sporifère <SEP> se <SEP> craquel-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> le <SEP> en <SEP> petites <SEP> pièces <SEP> qud <SEP> se <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> détachent <SEP> par <SEP> la <SEP> croissance
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> continuelle <SEP> des <SEP> hyphes <SEP> de
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> dessous.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
4. <SEP> Le <SEP> lait <SEP> est <SEP> pentonisé <SEP> après <SEP> coa- <SEP> 4. <SEP> Le <SEP> lait <SEP> 11.' <SEP> est <SEP> pas <SEP> hydrolyse
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> gulation <SEP> ni <SEP> peptonisé.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
5. <SEP> Croissance <SEP> sur <SEP> agar <SEP> synthétique <SEP> 5. <SEP> Aucune <SEP> croissance <SEP> sur <SEP> l'agar
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> abondante <SEP> et <SEP> étalés <SEP> synthétique.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
6. <SEP> colonies <SEP> sur <SEP> la <SEP> fécule <SEP> de <SEP> pommes <SEP> 6. <SEP> Mycelium <SEP> est <SEP> presque <SEP> ocre
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> de <SEP> terre. <SEP> fauve <SEP> (R).
<tb>
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Le nom spécifique provient de i'lTi .Ss.#.S ce qui signifie 11 crac.luelélf , à cause de l'aspect fendiller craquelé de certaines colonies.
Il est à nober (lue pour la production de ces antibiotiques on ne désire pas se limiter à ce ou Go ces organismes parbiculiersy qui correspon- dent a la description indiquée plus haut et qui ont été do'nnés uniquement
EMI4.2
pour des raisons explicatives. On désire Également y inclure les organismes
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qui sont des espèces mutantes obtenues à partir du ou des organismes susdits par des moyens de mutation tels que des rayons X, des rayons ultra--rdolets,
EMI4.4
des moutardes d'azote, etc..
Les produits, obtenus selon l'invention, partagent avec les anti-
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biotiques préparés è. partir d'autres streptomyces la propriété d'avoir un
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spectre antibiotique étendu, surtout parmi les bactéries de la gamme néga- tive de Gram.
EMI4.7
Paimi les orgro1iSQes, dont la croissance est ipl1ibitée par des concentrations très faibles des nouveaux antibiotiques on peut citer les Sl1Í- vants: le Aerobacter aer,enes, le Aerol,1'1,cter ero zeres ou le Salmonella m- ratX)2hv A résistant à la st-eptotl1ricLLw, le laJzzo==*&e¯¯pe,raki%h±¯à ou le ;almonel 7..a para ;yphi.
B résistant à la stJept011lycille, le Sa.J.:8onella paratypIJJ, 3 lEscherichia eoli,le Pceudomonas .ê&±"1:i:.10sa.? le zF 3 albus le 3tap-Îlvlococqus aure1f., le 3aCÍllus subs-ï s, le Bacillus :my:coid&, 1'Eber thellajtyphosay le Shisella. po.Í'c.d18e::'1teri, le zle'Dsiella pneumoniae. ou la $c'1lonella pullorum, résistant su c'tilorsnphenicol
EMI4.8
Le tableau suivant montre les spectres comparatifs de diverses
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préparations de streptomycine;, sti=e=ototl?oeichie, chloramphenicol et aurcomyoi- ne et des antibiotiques préparés selon la présente invention. L' 6,ct:L{ité des diverses préparations antibiotiques utilisées est exprimée de deux manières: l) en unités de dilr-tion i coli et./'ou 2) en unités chlorampheniool par milli- 3à cmJ± . On entend par unité de c:ilL t3o:. =, oLz.
(UDG) par milligramme, le vo- lume maximum de bouillon nutritif en millilitres dans lequel un milligramme de la préparation antibiotiques (qui peut avoir un degré de pureté variable) peut être dilué et qui, en étant inoculé svec une dilution 10-6 (PUlle culture de 18 heures de "coli ayant poussé dsns les mêmes conditions, ne présente néanmoins aucune croissance bactérienne à la fin ci'u:i1e incubation de là heu- res a 7 a Pûr unités chlorsnphénicol ( ,il.) parmilligrsime pn entend le résultat (i'un essai pour lequel on se sert eoùzae organisme dressai du Klebsiella pneumoniae, PCI 602, et comme milieu dressai d'un bouillon :.' épreu- ve antibiotique du Laboratoire biologique de 3ëltimore, préparée selon la f croule de la Food a.nd Drug Administration pour le bouillon d'ép::'euve turbi# ,-iI.l6trique pour la streptomycine.
La m.étl1oë:.e adoptée' pour l'essai es celle c'te 1-1c Mebor" J.R. (JoBiolo Ghen, Vol. 153 ? pages 2L;,9-25, avril 19l+4) pour laquelle on a utilisé 10 mg de chlorrmphenicol nosnalisé et cristallisé ::;:8-1' litro.
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EMI5.1
TABLEAU 1
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Concentrations de la préparation antibiotique par milli- litre cPagar nutritif nécessaire pour empêcher la crois- sance bactérienne à la surface de plaques de Pétri.
1. Antibiotique :2..ia-réor:cine :3-Cllloro- 14.Strep- :5. Strep- sui;riOEi'i 1 ? ixi- : amphoni- tothri- toBTyci- vention col cille ne LDC/1né , g Ch l oro 'TJDC/ir4&-,. : 0 liloro-UDC/-. 0 hl o-" tc/i. Ti-D 0/mg. tl/T"lÔ. Ullpg 1 86 . ru ..... /
EMI5.3
<tb>
<tb>
EMI5.4
2 65 3840 7500 :1000: 1000: 2200 4000 ...., ¯¯¯-¯¯ ¯-¯¯¯ ; -¯¯¯ , --- ; ---....¯¯- e .r....------ a L¯'.1 chlore 't1, UDC Chio- UDG Chio- HDC UDO ro u. ro t1 . r. , lTli20 â, -2 2-6 J..2-20 344 1-2 4-la : 7e5 1-5 <5 2-6 12-20 e J. f-'.r'!ô3.i.ov.7C.
173 120-40f 65 192-384 375- 100- 100 220-2200 200 750 1000 S.pare.- dysente" rixe 1 1 '1 4 7,5 ici 5 2-6 4 K. pneuiM- '-bzz niae 132 24 > 5 (51 < 2 1,0 e o 134 2-5 z a 3¯9zri5-3rf5a5-?o 10 2-6 20-40 s;jul,ioz<oe1 136 tu .-65 3S 75 10 z 40-200 $JÇ,1 ±¯û5TiJbÙ là9 2-5 6-65 3S-192 75-375 5-10 5 22-110 20-40 'L.coli 21 2 5 6-65 1,'-.3 z 10 t 10 6 20-40 A.aeroge- nés 2 a os2 ¯ \0,5 <4 . a o 5. \5 2-6 zelf ? ;
Proteus Sp. 20-40 13o 3jo 3U/,,^ :750- 10 ' 10 %-lu 4-12 ... 3840 7500 Monilia aI bicans : 6o â .o .., ooo2z . o00 ô00 looo 22¯00 a2 , o00 s * au+eus 3 1-2 4-5 o , 5 4 : ' 5-in 10 6-11 S.alLlus 5-1 4 3S-192f 75 z.0 10 6-H 2 suiD.til' ruz .7 >6C) , 65 38-192:7,5-75 1-5 e 5 : 22-110 12
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EMI6.1
= , lyeoidos 1" i 0,2 o,E t <o; 5 r ± il-5 1 1 110-220 12-2' 2.subtilis t t 219 :a,2-: 0, 1-3 2 a <0 , 3 4 1-3 t a * (5 : 1-2 <2
EMI6.2
<tb> : <SEP> 1,0 <SEP> 1,0 <SEP> :
<tb>
EMI6.3
1. - An, Ob' t. M . 0" brute "" "1 , "1 II . l. - Antibiotique - Matière brute préparée coBEie C2..l1S - exeY,lp..t.e II CÎ- selon l'invention dessous, le produit précipite avec un pH=9 étant filtre, remis en suspension dans l'eau et séché
EMI6.4
après congélation.
2. - Aureomvcine - Chlorhydrate cristeJJ¯isé 3 . - Ciiloraùpheaiicol - Cristallise /. # Streptoth.rici>.1e - Sulfate de streptothricine (ex helianthate cris- tQ1lisé, SOO 1;/ù.g streptomycine) 3. - St:i.e:ptor.;vci..'1e - Sulfate de stTeptoiycine (750 u/rr..g de streptoI-- cille) .
Un intérêt additionnel présente Inactivité observée pour -une série
EMI6.5
do :1Íco-o:;:,s 1Ís.TD.e quand on se sert di l' 211t.i'biotique à l'état cristallisé.
Il est 8. noter que les différences entre les résultats obtenus avec la natiëre N.lûe ,!.."1 la oCÈ.u7..' rlS' .7.5 e'L24''E':.1'i: G 'i'e 'GZ'"'222eS c. C!BS ipL t"e'G8S G'ü1 se trouvent dans la matière brute.
EMI6.6
.AB1E.AU- II
EMI6.7
<tb> Poids <SEP> du <SEP> produit <SEP> antibiotique <SEP> obtenu <SEP> selon <SEP> 'invention <SEP> et <SEP> l'état
<tb>
EMI6.8
cristallise nécessaire pour produire l'in11ibition complète de le or-
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<tb> ganisme <SEP> dressai.
<tb>
<tb>
<tb>
Espèce <SEP> meg/ml.
<tb>
<tb>
A. <SEP> aerogenes <SEP> 1. <SEP> 0
<tb>
EMI6.10
1± lév i iel 1 a pneiamoi-iae 3.0 E.coli 5.0 1 , tjçp#io s a, 3.0 S.parat-pIiî.iA 1.0 5,p#,ra,tàTplii±1 1.0 S.paradysentsriae 1.0 S.p'ullorum 10.0 i# soEJtilis (7j)A 219) 3 .0
EMI6.11
<tb> S.albus <SEP> 1.0
<tb>
<tb> S.aureus <SEP> @ <SEP> 1.0
<tb>
<tb> M.albicans <SEP> 1000
<tb>
<tb> Proteus <SEP> sp. <SEP> 1000
<tb>
EMI6.12
Ps.aerug10sa 100 Br . b#.lci'..isepticus 3.0
EMI6.13
Une autre méthode pour distinguer l' a;n.tibiotique, préparé selon l' L"'1ve:J.tion, d'autres antibiotiques est 12. détermination de son. action sur des variétés de bactéries rendues résistances à divers antibiotiques par leur trans- fert par portions dans des bouillons contenant des concentrations progressive-
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EMI7.1
:z#:
='; croissants s deis mtibiotiqu-es par lc'nnOlt la variété ol'3i '""Jle2 'J C¯'l,1 3::::' illisible a tous les :? û1tJ10Î'! slleS, Pour Inexpérience ci-dessous on plan- a. ; un disque de 12 D...1l. :.0 papier filtrant stérile dan.:. un horcillo:.l #.2 cul- -Cura de l' 6:lTGibiotique et on le pose au centre de la surface d'une plaque
EMI7.2
nutritive d'agar. Sur le disque on recueille des cultures de Aerobacter ae-
EMI7.3
rogenes l) sensible au cliloi<ezphenicol, à la streptomycine et à la s Lrepto- 3..ric.ne, 2) résistant à la streptomycine;, 3) résistffiTG à ? la streptothrici- ne, ;':.) résista!.T.t au chloremphe=lcol* Après une incubation de 18 heures à.
37 , on trouve des sones d'inhibition pour toutes les cultures excepté celle qui était résistante au èhlor#ûphenicol, ce qui distingue 1'8ltibiotique, préparé selon l'invention;, de la sti?eptoh3-cbie et de la streptothricine. Il se distingue toutefois du ohloramphenicol par analyse polarigraphique par la- quelle la demi-onde caractéristique du chloramphenicol (pour un pH de 4,5 environ -0, G5 volts par rapport au puits de mercure mais normalise interieu- =": ûi1') n'était pas observée.
La toxicité de l' ^iîl o ? cue9 préparé selon l'invention, peut être estiEiée par rapport aux autres antibiotiques en se basant sur les consi- dérations suivantes. Une préparation de cet aDGibiotique, comparée a255 -c./'s:. de cI11018J#.I?he:nicol et à. 2000 u/mg de s rep'coi ci.e avait un ID 0 de .3,: 1:?',' quand elle était injectée dans les veines Ct'ti=.2F.' souris de 20 grs. ce qui correspond a 0,Ù93 Big de chloramphenicol et 7 mg de streptomycine. Ces anti- biotiques ont un LDO' pour une souris de 20 gruz respectivement de 0,6 5#g et de 2,5 11:.g. L'elltibiotique, préparé selon l',¯u er.i,.o2 et a l'état cristal- liss et quand il est injecté dans les veines a un IDO de 3,0 Ing pour une sou- ris due 20 Gr et 1J.:l ID 50 de L, 0 Big pour une souris de 20 gr.
Pour ci'autres 0ôsci3 on a trouvé que le LD 0 intraveineux pour le chlorhydrate de cet anti- biotique est équivalent à 103 ug du composé siaphotérique cristallisé par poids en kilogrsames des souris alors que le ID 50 est équivalent à 192 ing çr'lo;rar:le; On voit que .les impuretés;, qui se trouvent dans l'acWizov.- . J.,-e brut utilisé ci-dessus;, ont à peu près la T.10n:e toxicité que 1'a#itLDio- ticue li,1-réùie.
.,' a: L¯FJ o - cue9 préparé selon 'l' .¯wen 'c- o5x9 se distingue de l'au- reomycine par son mode d' e=rlra,ction par solvants. Une solution el' aureomycine ayant un pE de 2,0 de &,5 ou de 9,0, quand elle est extraite par l'éther, le butanol noInal, l'acétate d'éthyle;, le cétone métbyl-isobutyle, le benzène ou
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le chloroforme;, perd'son activité alors qu'une solution de l'antibiotique,
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obtenu selon l'invention, peut être extraite seulement par du butanol normal.
De meue, le. stabilité pour la chaleur est différente pour les doux antibioti-
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ques. TABLEAU III
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% de Inactivité normale
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100 pendant 15 min. 2 5 pendant une heure pli antibiotique A1..1reOTIr,f- antibiotique selon l' .3Ver1 selon . i? ii eî1- chie tien.
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<tb> tien
<tb>
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2,0 40 CO 100
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<tb> 6,5 <SEP> 50 <SEP> <25 <SEP> 100
<tb>
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9,0 80 a5 zozo
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Les comportements des différents antibiotiques ont été comparés,
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par des chromatogras.;Iaies sur papier pour lesquels on s'est servi de deux mo- des de sola'cs différents;, par des essais à 2Go pendant 24 heures, en se servant du B, xubtilns cosme organisme dressai.
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TABLEAU IV Valeur RF
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<tb> Solvant: <SEP> eau <SEP> saturée <SEP> de <SEP> Solvant: <SEP> eau <SEP> saturée <SEP> de
<tb>
<tb> n-butanol <SEP> plus <SEP> 2 <SEP> % <SEP> diacide <SEP> n-butanol.
<tb>
<tb> p-toluènesulfonique <SEP> plus
<tb>
<tb> 2 <SEP> % <SEP> pipéridine
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> antibiotique <SEP> selon <SEP> l'inven-
<tb>
<tb>
<tb> tion <SEP> -entre <SEP> 0, <SEP> 0-05 <SEP> entre <SEP> 0,0-0,1
<tb>
<tb>
<tb> aureomycine <SEP> -entre <SEP> 0,0-1,0 <SEP> entre <SEP> 0,0-0,5
<tb>
<tb> Chloramphenicol <SEP> -1,0 <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP>
<tb>
<tb>
<tb> Streptomycine <SEP> A <SEP> - <SEP> 0,2 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP>
<tb>
<tb>
<tb> Streptothricine <SEP> - <SEP> 0,03 <SEP> 0,
0
<tb>
L'invention consiste également en un procédé pour faire croître une espèce nouvelle et non encore décrite jusqu'ici de micro-organismes., S. rimosus, de préférence à 24-30 , dans des conditions submergées d'agitation et d'aération, sur un milieu constitué par une source d'hydrates de carbone, telles que des sucres, l'amidon, du glycérol; une source organique d'azote,. telle que de la farine de fèves de soja, du gluten de blé, de la farine de graines de coton, de la lactalbumine, une digestion enzymatique de caséine, du tryptone; une source de substances de croissance telles que des matières solubles de distilleries, de l'extrait de levure; des sels minéraux tels que le chlorure de sodium, du phosphate de potassium., du sulfate de magnésium., du nitrate de sodium;
un agent tampon, tel que du carbonate de calcium; et une huile végétale. Quand la croissance est achevée, le mycélium est séparé d'avec le bouillon qui contient maintenant l'antibiotique et celui-ci est re- cueilli hors du bouillon par extraction à l'aide de solvants organiques à un pH convenable ou par adsorption de l'antibiotique hors du bouillon sur du carbone activé et en le séparant d'avec le carbone à l'aide de solvants orga- niques ou d'eau à un pH approprié ou par d'autres moyens bien connus. L'an- tibiotique ainsi obtenu possède des propriétés uniques et de valeur qui le distinguent de tous les antibiotiques connus et décrits jusque ici.
Un inoculum peut être obtenu en utilisant une culture fournie à partir de souches ou flacons Roux 'inoculée avec du S. rimosus. Des milieux so- lides, qui conviennent à cette culture initiale, sont le lactose de boeuf ou de l'agar d'Emerson. Cette culture est utilisée pour inoculer le contenu de flacons secoués (shakers) où des cuves à inoculum submergées. On peut égale- ment inoculer le contenu des cuves à inoculum submergées par celui de flacons secoués. Toute culture dans des flacons secoués atteint généralement son ma- ximum en quatre jours alors que l'inoculum dans les cuves submergées se for- me, généralement, de la manière la plus favorable en deux jours.
Depuis la cuve à inoculum le bouillon contenant le micro-organisme est refoulé dans l'appareil de fermentation dans des conditons absolument aseptiques et la croissance se fait pendant une nouvelle période de deux jours. Pendant tout le temps l'aération est maintenue dans les cuves en insufflant dans celle-ci de l'air stérile par un pulvérisateur d'air avec un débit de 0,5 à 2 volumes d'air libre par volume de bouillon et par minute. Si l'on rencontre des dif- ficultés pour éviter la formation d'écumes dans la cuve, on y ajoute des an- ti-mousses tels que des huiles végétales ou animales ou des agents similaires, pour rompre l'écume.
Pendant que le bouillon est agité à une vitesse qui dé- pend du genre de l'agitateur, des conditions absolument aseptiques sont main- tenues et la température du bouillon agité reste entre 24 et 30 .
L'antibiotique peut être récupéré hors du bouillon de fermentation dans lequel il est formé de différentes manières. Le mycélium, dans le bouil- lon de fermentation, doit d'abord être enlevé et on constate que cela se fait au mieux en rendant le mélange acide, de préférence avec un pH en dessous de
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4, après quoi on sépare le mycélium par filtration. Si ce réglage du pH n'a .pas lieu;, une partie de l'antibiotique reste sur le mycélium.
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Le peut être récupéré 1'êta- pur en -braita,it le bouil- lon de fermentation filtré avec du carbone activé à un pH voisin de la neu- tralité.
L'antibiotique peut être repris de l'adsorbant à l'aide d'eau sa- turée d'un alcool partiellement miscible dans l'eau, tel que le butanol, le pH étant réglé à 1,5 par un acide, tel que l'acide chlorhydrique. Après la séparation par filtration de l'adsorbant épuisé, le pH du filtrat peut être réglé à 6-9 et l'antibiotique solide peut être récupéré par séchage après
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congélation et dans le vide. Plutôt que de sécher le filtrat, l'antibioti- que peut être extrait hors de celui-ci dans du butanol après avoir réglé le pH à environ 9.
L'extrait au butanol peut ensuite être concentré jusqu'à obtenir un antibiotique purifié ou cet extrait peut, à son tour, être soumis tire extraction par un acide aqueuse tel que l'acide chlorhydrique dilué.
Après séparation de la phase aqueuse, son pH peut être réglé à 6-9 par l'ad- dition d'une base ou par le traitement avec un échangeur d'anions, tel que
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l'Amberlite Ill4 (un produit résineux fabriqué par la Société Rol1I!l & Haas) .
Plutôt que d'absorber l'antibiotique hors d'un bouillon filtré sur un adsorbant solide,l'antibiotique peut être extrait hors de ce bouillon par certains solvants ayant un pH basique, de préférence voisin de 9. Parmi les solvants, qui peuvent être utilisés, on peut citer le butanol, l'alcool amy-
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lique et le phenylcellosolve. L'antibiotique peut être extrait avec un pH aci- de, de préférence inférieur à 3,5. Le phenylcellosolve peut être utilisé à cet effet. Après l'extraction de l'antibiotique hors du bouillon filtré avec un pH de 9 et à l'aide de butanol, le solvant peut être concentré sous vide jusqu'à une fraction de son volume initial.
Après extraction du concentrât
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au butanol à l'aide d'un acide dilué, après séparation des phases et après réglage de la phase aqueuse à un pH 6-7, on obtient la séparation d'un anti- biotique solide , Ce produit peut ¯être filtré et séché, après quoi il a une activité d'environ 600 microgrammes d'antibiotique pur par milligramme.
Pour mesurer l'activité des produits purifiés, l'antibiotique pur, à l'état cristallisé et préparé comme décrit ci-après, est pris comme norme
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et son activité est désignée par 1000 microgrammas par milligramme (mcg/mg).
Pour l'expérience on se sert d'un organisme d'essai le Klebsiella j2-neil-r-oiiiae.
Pi I 602 et comBe milieu d'essai le bouillon d'essai antibiotique du Labora- toire Biologique de Baltimore, préparé d'après la iobnule de la Food and Drug Administration pour les bouillons d'essais turbidimétriques de la strep- tomycine. La méthode d'essai est celle de Me Nahon J.R. (J.Bioi.Cb-emVol 153, pages ?.ç-5, avril 1944.). On peut également avoir recours à du chloramphe- nicol cristallisé comme norme de comparaison et on trouve que chaque milli- gramme d'antibiotique cristallisé, obtenu selon l'invention, a une activité
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4qdV±-eifLe à celle de 3,15 milligrammes de cor2mphenicol cristallisé.
L'antibiotique cristallisé peut être obtenu à partir de la matière solide amorphe, telle qu'obtenue par le processus de récupération indiqué plus haut (activité environ 600-650 mcg/mg). Ceci est obtenu en réglant le pH de la matière brute dans l'eau à 2,8 à l'aide d'un acide, tel que l'acide chlorhydrique, en filtrant la solution obtenue et en évaporant partiellement la solution sous vide. Les cristaux séparés sont filtrés, lavés et séchés.
Ils donnent 850-900 mcg/mg.
Un autre procédé pour obtenir l'antibiotique cristallisé consiste à dissoudre l'antibiotique brut, donnant à l'essai environ 670 mcg/mg, dans de l'acide chlorhydrique avec un pH 2,5. La solution aqueuse est filtrée et traitée avec du chlorure de sodium et un peu plus que la moitié de son volu- me d'alcool butylique. Après avoir secoué soigneusement le mélange, le soli- de séparé est enlevé par filtration. Il est dissous à nouveau dans le métha- nol et on ajoute un volume réduit d'eau. Après -Lui repos d'une nuit dans un réfrigérateur, les cristaux formés sont filtrés, lavés et séchés. La masse cristalline, obtenue de cette manière, donne à l'essai environ 860 mcg/mg et forme une base antibiotique mélangée à du chlorure de calcium.
Une autre méthodepour obtenir l'antibiotique cristallisé consiste
<Desc/Clms Page number 10>
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1 soumettre la matière aJOlj?l1e, donnsjit à l'essai environ 650 B-cg/ng avec une distribution à contre-courante cor::ne proposé par Craig (J. Biol. Chen. volume 155, psge 1 i i4rl . Le solvant utilisé est de l'eau, réglé à un pE de .5 par de l'acide chlorhydrique, et de l'alcool butylique. La phase aqueuse de tubes sélectionnés est évaporée sous vide pour procurer des cristaux blancs,
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prismatiques de l'antibiotique, donnant a l'essai environ 950 >icgllnig.
On peut préparer divers sels de l'antibiotique, le plus simplement en ajoutant l'acide voulu, minéral ou organique, à l'antibiotique dans l'eau jusqu'à ce qu'on obtienne une solution limpide. Les sels solides peuvent être préparés en réglant le pH d'une telle solution saline de l'antibiotique au point juste en dessous de celui auquel l'antibiotique commencerait. à se sé- parer (environ 2,5). La solution peut alors être séchée, par exemple en sou- mettant la solution congelée à un vide. Des sels acides et cristallisés de l'antibiotique sont obtenus par l'évaporation d'une solution du sel dans l'eau avec un pH réduit.
Comme acides minéraux on peut utiliser l'acide chlor- hydrique, sulfurique ou phosphorique et comme acides organiques l'acide ci- trique, tartrique, gluconique, etc. Gomme l'antibiotique est amphotérique, on peut préparer les sels de différents éléments métalliques l'aide de l'anti- biotique. En particulier,les sels des métaux alcalins de l'antibiotique sont préparés en traitant une suspension aqueuse de l'antibiotique par un hydroxy- de alcalin. Les sels métalliques solides de l'antibiotique sont obtenus par l'évaporation d'une solution aqueuse de l'antibiotique avec un pH convenable.
Diverses autres méthodes peuvent être utilisées pour purifier l'an-
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tibiotique. Il peut être extrait hors du bouillon de feruentation filtré sous forme d'un sel à l'aide d'un des acides d'un groupe d'acides sulfoniques or - ganiques. Il peut être précipité hors de solutions acides aqueuses de lama- tière brute à l'aide de l'acide picrique.
L'antibiotique peut également être précipité hors d'une solution diluée de la matière br@te à l'aide d'un acide
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arylasosulfonique ayant un pH faible, par exemple le colorant Orange II ayant un pH 2 . L'antibiotique peut être récupéré hors du sel colorant par des ré- actifs tels que le chlorure de baryum qui précipite le sel de baryum du co- lorant en laissant une solution de l'antibiotique qui peut être séchée. Il est évident que d'autres sels métalliques conviennent tout aussi bien. L'ac- tivité et la couleur de l'antibiotique impur peuvent être améliorées en dis- solvant le produit dans un acide minéral dilué et en ajoutant du naphtalène sulfonate d'ammonium à la solution.
Le précipite', de couleur sombre, est fil- tré et le pH du filtrat est augmenté pour obtenir un précipité de l'antibio- tique dont la couleur et l'activité sont améliorées.
L'antibiotique cristallise sous diverses formes suivant, le traite- ment utilisé pour sa préparation. Une de ces formes est constituée par des plaques hexagonales épaisses et une autre par des aiguilles épaisses. Les in-
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dices de réfraction de la première de ces formes sont: = bzz 0,004; 13 = 1,648 f 0,004. 1 est plus grand que 1,700. La rotation optique ou le pouvoir rotatoire d'une solution du composé cristallisé pur, dans le métha- nol, diminue rapidement au repos à la température ambiante. Si la rotation spécifique est lue peu après que la solution est préparée, elle a la valeur suivante: ([alpha])D25 ¯ égal à 26 (0,5 % dans le méthanol).
L'addition de chlorure de calcium à la solution méthanolique provoque un changement notable de la rotation spécifique jusqu'à une valeur fortement négative. Le mélange cris- tallisé de l'antibiotique et du chlorure de calcium a également une rotation spécifique fortement négative dans. le--méthanol. La rotation spécifique dans
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1-'acide, chlorhydrique dilué est de ()D2 égal 'à :t 196 (0,5 % dans l'acide chlorhydrique N/10.
Quand le spectre d'absorption de rayons ultra-violets d'un échan- tillon d'antibiotique cristallisé est déterminé, à l'aide d'un spectrophoto- mètre au quartz de Beckman - Modèle DU, . dans une solution aqueuse contenant
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i;jl0 de phosphate de potassium dihydrogéné (pH 4, 5) dans des cellules de leze, on trouve les maxima suivants: pour 'P.1% cm a 353,2 m. on a = 27,7; à 2'75s 0 m, on a à= 299 et à 247,5 m. on a [gamma] = 236.
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Quand le spectre d'absorption de rayons ultra-violets de l'an- est déterminé dans une solution diacide phosphorique dilué avec
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un pH 1,7 on obtient les maxima suivants pour E3-% a 352,5 m on a J= 277 età 267,5 :ci on a [gamma]= 379.
L'antibiotique est un composé amphotérique contenant des groupements faiblement basiques et faiblement acides. Il contient les éléments carbone,hydrogène, azote et oxygène. Les analyses chimiques de la masse cristalline donnent, en moyenne, 53,05 % de carbone, 5,91 % d'hydrogène,
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53c';. % d' azote et 35,4 d'oxygène (par différence). La matière est exempte de cendres. Elle a un point de fusion voisin de 185 et une certaine décom- position se produit à cette température. Elle est soluble dans le méthanol, l'éthanol,' l'acétone et le glycol propylénique, dans l'eau jusqu'à 0,25 mg par ml. à 25 et elle est insoluble dans l'éther et dans l'éther de pétrole.
L'antibiotique cristallisé, mélangé à de l'huile minérale, possè- de plusieurs bandes d'absorption caractéristiques dans l'infra rouge, parmi celles-ci se trouvent les fréquences suivantes (en centimètres réciproques):
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3460, 3360, 1590, 1318, 1280, 1242, 1l22, 1090, 1076, 105/j., 1031, 1012, 938, 863, 839, 772, 705, 679. Cette détermination a été faite à raide d'U11 mé- lange â l'huile minérale de la matière.
Les propriétés ci-dessus montrent que l'a<Wibzoticue9 obtenu se- lon l'invention, est nettement différent d'un quelconque des antibiotiques connus.
Les exemples, donnés ci-après, montrent comment les antibiotiques peuvent être formés, récupérés, concentrés, purifiés et convertis finalement à l'état pur et cristallisé. Les antibiotiques cristallisés et leurs sels cristallisés ont une valeur particulière à cause de leurs pureté et effica- cité élevées. Les exemples donnés ne sont nullement limitatifs ou restric-
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tifs. On se sert chaque fois d'une variété de sBreotor1Tces rimosus désignée Par le numéro d'isolement S. 3279.
Exemple I
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Milieu Formation et récupération de 1 antibioti-
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<tb> ¯¯¯ <SEP> que
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> farine <SEP> de <SEP> fèves <SEP> de <SEP> soja <SEP> 10 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
Cerelose <SEP> 10 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Solubles <SEP> de <SEP> distilleries <SEP> 0,5 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 5 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> eau <SEP> distillée <SEP> pour <SEP> faire <SEP> 1000 <SEP> ml.
<tb>
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Le pH est réglé a 7,0 avec de la soude caustique et on ajoute du carbonate de calcium en quantité de 1 gr par litre.
On introduit cinq cents parties en m1. du milieu ci-dessus à des flacons Fernbach qui sont alors stérilisés à 1210 pendant 30 minutes. Après
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refroidissement, les flacons sont inoculés avec une suspension de la culture de 12. rimo5us obtenue à la surface de souches lactose de boeuf-agar et les flacons sont secoués pendant 4 jours à 28 dans un shaker rotatif ayant un
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déplacement de 5 cm. pendant qu'il tourne, â 200 v/r.m, A la fin de ce -brai tement on constate que le bouillon, contient 640 ûDClml. et 400 u/1al de chlor- , S!J1phenicol. Le nyeelizns est séparé du bouillon par filtration et le pi de ce dernier est réglé à 9,0. L'antibiotique est extrait hors du bouillon par du butanol normal.
Quand on observe le spectre d'absorption ultra-violets
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pour la solution butanolique de l' 811tibiotique, les pointes de la courbe d'absorption se trouvent à 385 et 270 millimicrons.
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>;em±le II Formation et récupération dantibioti-
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<tb> que <SEP> brut
<tb>
<tb> Milieu
<tb>
<tb>
<tb> farine <SEP> de <SEP> fèves <SEP> de <SEP> soja <SEP> 30 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
<tb> amidon <SEP> de <SEP> blé <SEP> 5 <SEP> gr.
<tb>
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ii-Z-Indne-B (digestion enzymatique
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<tb> de <SEP> caséine) <SEP> 1 <SEP> gr.
<tb>
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[Iitrate de sodium 3 ger.
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<tb> de <SEP> l'eau <SEP> pour <SEP> faire <SEP> 1000 <SEP> ml.
<tb>
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Le pli est réglé à 7,0 et 5 gr.' de carbonate de calcium. sont aj 011- tés à chaque litre.
Deux litres de ce milieu sont dispersés dans plusieurs vases en
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verre ayant une capacité de 3,5 1. contenant des agitateurs et des a"ioniseurs pour l'admission d'air stérile. L'appareil et le milieu sont stérilisés à 121 pendant une heure, Après refroidissement, les contenus desvases étaient inoculés avec 50 ni. d'une suspension de 12. rirnosus, Après une agitation pen- dant 40 heures à 1800 t/m. on constate que le bouillon contient 1600 u/:m1 de chloramphenicol et 1280-2560 ü1JC/ml.
Sept litres de bouillon, ainsi préparé, sont séparés d'avec le my-
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célium par filtration et le pH est réglé à 7,0. On ajoute 70 gr. de A (un charbon activé) et l'ensemble est agité à la température ambiante pendant une heure. Le bouillon épuisé est séparé par filtration du charbon qui con- tient l'antibiotique par filtration et le gateau est lavé à l'eau distillée.
L'antibiotique est repis à partir du charbon activé à l'aide d'un litre d'eau distillée saturée avec du butanol normal et dont le pH est réglé à 1,5 à l' ai-
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de d'acide chlorhydrique. Le pri de la masse reprise est réglé â ;90 et elle est extraite avec un litre de n-butanol. La couche surnageant du butanol est séparée d'avec la phase aqueuse et est extraite par l'acide chlorhydrique
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I:10, La couche aqueuse et acide est séparée du butanol et son pH est ramené à 5,0 par agitation avec de l'Amberlite (un échangeur d'ions résineux) qui est séparée d'avec la solution d'antibiotique par filtration.
Cette solu- tion est congelée et séchée et donne 2,0 gr d'une poudre d'un brun-jaunâtre.
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Cette préparation donnait à l'essai 255 u/mg de chloramphénicol et 2000 u/isg de streptomycine.
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lXOE2LP--ILI Formation d'antibiotique
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<tb> Milieu <SEP> inoculum
<tb>
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lF-à-1hìe B (digestion enzymatique
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<tb> de <SEP> caséine) <SEP> 1 <SEP> %
<tb>
<tb> Cerelose <SEP> 1 <SEP> %
<tb>
<tb> Extrait <SEP> de <SEP> levure <SEP> 0,5 <SEP> %
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 0,5 <SEP> %
<tb>
<tb> Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> 0,1 <SEP> %
<tb>
On complète avec de l'eau du robinet pour faire 'un litre et on
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règle le pE à 6,
7 avec du KOEL Environ 875 litres du milieu sont introduits dans une cuve d' inoculum de 1LOO litres et maintenus à 121 pendant une heu- re. Après refroidissement à 2$ , le milieu est inoculé avec un litre d'une suspension du S.rimosus. Le contenu de la cuve est aéré et agité pendant 25 heures avant d'être utilisé pour inoculer le contenu de 1'appareil de fermen- tation.
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Le milieu de fennentation est constitué courne suit:
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<tb> farine <SEP> de <SEP> fèves <SEP> de <SEP> soja
<tb>
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cnicioiz de blé Oy5 % ;:Y-Z-J1Jnil1e B 0,1 % i:.'Lr2-e de sodium 0,3 % carbonate de calci-um 0,5 %
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<tb> huile <SEP> végétale <SEP> 0,4
<tb>
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On ccaNpIete avec de l'eau du robinet, on règle le pH à 7,0 et on stérilise en maintenant le milieu à -une température de 121 pendant une heure.
Après refroidissement à 28 , le milieu de fermentation est inocu-
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lé avec le contenu de la cuve el'inocuJ.'U111, dont question plus haut, Après 47 heures,,le pH est élevé à 8,0. On trouve que le bouillon a une activité de
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335 u/mg de chloramphénicol ou 20 uDC/ml.
Exemple IV. Récupération de l' 8l1tibiotique depuis le ---------- bouillon par adsorption.- On prend sept litres d'un bouillon de fermentation de l'antibiotique, séparé par filtration du mycélium de fermentation à un pH inférieur à 4, et qui donne à l' analyse 190 mcg/ja1, et on règle son pH à ', 0 . 0n y ajoute 70 gr. de Norit A (un charbon activé). Après avoir agité pendant une heure, le charbon est filtré et lavé à l'eau. L'antibiotique est séparé de l'absor- bant par de l'eau saturée de butanol et dont le pH est réglé à 1,5, avec de
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lucide chlorhydrique. Le pH de la masse reprise est réglé à geo après quoi l'antibiotique est extrait dans du butanol. La phase butanol est extraite à nouveau av ce un petit volume diacide clllorhydrique r,;fl0.
Le pH de la solution aqueuse est ajusté à 590 â l'aide'de l'Amberlite IR-4 (un échangeur d'anions synthétiques et résineux fabriqué par la Société Rohm. et Haas). 1,' mtibioti- que est alors récupéré à. l'état solide en séchant la solution aqueuse après congélation. Il pèse 1,5 gr. et a une activité de 80 mcg/mg. temple V. Récupération de l'antibiotique depuis le bouillon par extraction.
On règle le pH à 2,5 de 8 litres d'un bouillon de fermentation de
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.' a.nzxbâ.OtiCue, par de l'acide sulfurique et' on filtre le mycelium. Le filtrat contient 2.400.000 mcg de antibiotique. Son pII est réglé à , 0 et il est eGr8it par trois litres de butanol en différentes parties et les extraits mélangés contiennent 1.600.000 mcg de l'al1"tlbiotique. Les extraits au butanol sont concentrés sous vide jusque 650 nez cette solution contenant 2400 mcg/ mu de l'antibiotique. La solution butanolique est extraite avec un litre d'acide chlorhydrique lI/10 en plusieurs parties et les phases aqueuses mélan- gées ont leur pH réglé à 7,5 avec de la soude caustique diluée. Le produit
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précipité est filtré et séché.
Il pèse 1,69 gr. et a une activité de 625--mcg/'--- mg en antibiotique. @
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temple VI. Préparation de l' antibiotique cristallisé
L'antibiotique amorphe (20 gr.), donnant à 1.'essai 625 mcg/mg, est dissous dams 400 ml d'eau en ajoutant de l'acide chlorhydrique jusqu'%. ce que le pH soit de 2,5. La solution filtrée a un volume de 480 ml et donne à l'es-
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bali 26.400 l11cg/:mJ.. Après - addition de 50 gr, de chlorure de sodium et 300 Ni de butanol humide, le mélange est secoué soigneusement. Le précipité solide est filtré et dissous dans 150 ml. de méthanol.
La solution méthanolique don-
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nait à l'essai..31.000 racgrl, Après addition de 5 m.. d'eau, de l'arGib2oti.- que cristallisé commence à se former. On ajouteà nouveau 20 ml d'eau et le mélange est laissé au repos pendant une nuit dans un réfrigérateur. Le produit filtré et sec pèse 5,8 gr. Il a une activité de 860 mcg/mg.
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.r-:L:31:'T.,... Pj::;c::Cc.:î:..0== ds fantibiotique cristallise par ëictribution en contre-coursnt.
On dissout de 1 ' a=iti Diotiq.ae anorphey donnsnt à 1'essai 640 Iilcg/1!l6, dans de l'eau en règlent le pH à environ 3 avec de 1-'acide chlorhydrique. La solution est saturée avec du butanol et ensuite soumise à une distribution en contre-courant dans neuf tubes séparateurs en se servant de volumes égaux de butanol humide et d'acide chlorhydrique dilué (pH 3) saturé de butanol .
Chacune des phases aqueuses et butanoliques est essayée pour son activité et on a choisi les phases aqueuses estubes 6 et 7. Ces phases sont mélangées
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et concentrées sous vide jusqueà un petit volume. Les cristaux b1 J1;z séparés sont centrifugés et lavés successivement à l'eau, à l'acétone et à 1? éther.
Le produit séché a une activité de 945 mcg/mg.
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'.:era.nle VIII. Préparation du chlorhydrate de 1? a>-1-tibiotique. L' antibiotique de n' :importe quelle pureté peut être converti en chlorhydrate en traitant la matière dans l'eau, avec de l'acide chlorhydrique jusqu'à ce qu'on obtienne une solution limpide. Le pH de la solution est alors réglé à une valeur voisine de 2,5. La solution est congelée et séchée sous vide pour donner une poudre aisément soluble.
L'allure de la diffraction d'un rayon X de chlorhydrate pulvérisé
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de 1'antibiotique cristallisé est d6terninée dans une caméra Philips, ayant un razron de 57,3 1î1!D.. et en se servant du ra;rOlll1eL1eIlt alpha du cuivre ji.
Ci-dessous, on donne les écarts approximatifs des cristaux dans Ull plan ( d en unités -71gstrom) calculés à l' Gide des traits plus L-itelise5 mar- nués sur un film photographique et 1-lintensi-t',é relative et approxinative (I) de ces traits en adoptant pour le trait le plus intense la valeur 1,00.
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<tb> I <SEP> d <SEP> en-unités <SEP> A
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<tb> 0,9 <SEP> 10,32
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<tb> 0,8 <SEP> 9,39
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<tb> 0,6 <SEP> 8,30
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<tb> 0,2 <SEP> 5,26
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<tb> 1,0 <SEP> 4,19
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<tb> 0,5 <SEP> 3,92
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<tb> 0,2 <SEP> 3,20
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Exemple IX. Préparation du sel sodique de l'antibiotique.
L'antibiotique, de n'importe quelle pureté, peut-'être converti en son sel de sodium en traitant la matière dans l'eau avec de la soude causti-
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que jusque a ce que son pH soit supérieur à 9, ;- Za solution est alors conge- lée et séchée sous le vide, ce qui donne sel sodique sec sous la forme d'une poudre soluble dans l'eau.
Dans les exemples ci-dessus, les compositions des milieu:: de cul- ture sont données uniquement à titre indicatif et peuvent varier entre des limites relativement écartées, par exemple en remplaçant la farine de fèves de soja par la lactalbumine, de la farine de graines de lin ou de coton;, de la farine d'arachides, de la protéine de blé, du gluten de blé, etc.. De mène, les conditions de fermentation,telles que l'agitation, les degrés d'aération, la température, etc. peuvent être modifiées d'une manière considérable. De plus, d'autres méthodes ou des variantes de celles décrites pour récupérer,
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concentrer et purifier 1 antibiotique et ses sels peuvent être adoptées.
Par- mi les méthodes de récupération possibles on peut citer celle qui consiste à adsorber l'antibiotique directement hors du bouillon de fermentation sur des
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échangeurs datons résineux. Corme pour Ilaureolwci-ne et le c'hloramph8l1..Ícol,
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l'antibiotique est actif in vivo aussi bien qu'in vitro et présente une ac- tivité chimothérapeutique marquée contre l'infection expérimentale des souris et qui est due au streptococcus hemolyticus, au D. pneumoniae, au K pneumoniae, au S. thyphosa et autres organismes.
Le nouvel antibiotique possède une acti- vité définie antirachitique pour l'oeuf de poule embryonnaire et pour des concentrations élevées il empêche l'infection de l'embryon du poulet par une souche PR8 du virus d'influenza A.
L'antibiotique a donc une grande valeur pour le traitement de dif- férentes infections des humains et animaux. Il peut être administré par injec- tion parentérale, par voie bucale ou localement avec des dosages usuels.
Gomme il va de soi et comme il résulte, d'ailleurs, déjà de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à celui de ses modes d'appli- cations non plus qu'à ceux des modes de réalisation de ses diverses parties, ayant plus spécialement été indiqués; elle en embrasse, au contraire, toutes les variantes.
REVENDICATIONS.
1. Procédé pour la préparation, d'un antibiotique, dans lequel pro- cédé on cultive une souche de Streptomyces rimosus dans une solution aqueuse, nutritive et contenant des hydrates de carbone dans des conditions aérobiques submergées jusqu'à ce que ladite solution présente une activité antibactérien- ne substantielle, après quoi on récupère l'antibiotique ainsi obtenu hors du bouillon de fermentation 2. Procédé pour la préparation d'un antibiotiquedans lequel pro- cédé on cultive une souche de Streptomyces rimosus dans un milieu de culture aqueux contenant une substance promotrice de croissance et maintenue dans ces conditions aérobiques submergées, à une température comprise entre 24 C et 30 C environ, pendant une période allant de 2 jours à une semaine,
après quai en récupère l'antibiotique ainsi obtenu hors du bouillon de fermentation.
3. - Procédé suivant l'une ou l'autre des revendications 1 et 2, dans lequel procédé la récupération de l'antibiotique comprend le stade d'ad- sorption de l'antibiotique sur du charbon activé.
4. Procédé suivant l'une ou l'autre des revendications 1 et 2, dans lequel procédé la récupération de l'antibiotique comprend le stade d'ex- traction de celui-ci dans un solvant organique non miscible à l'eau et dans des conditions légèrement alcalines.
5 . - Procédé suivant l'une ou l'autre des revendications 1 et 2, dans lequel procédé la récupération de l'antibiotique comprend le stade d' ex- traction de celui-ci dans un solvant organique non miscible à l'eau et dans des conditions fortement acides.
6. - Procédé de production d'un antibiotique en substance tel que décrit dans les exemples ci-dessus.
7. - Nouvel antibiotique préparé par un procédé suivant l'une ou l'autre des revendications précédentes.