DE1213568B - Verwendung von Actinomyces varsoviensis zur Herstellung von Oxytetracyclin auf ueblichem biologischem Wege - Google Patents

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

Int. α.:

C12d

Deutsche Kl.: 30h-6

Nummer: 1213568

Aktenzeichen: K 40466IV a/30 h

Anmeldetag: 19. April 1960

Auslegetag: 31. März 1966

Die Erfindung betrifft die Herstellung von Oxytetracyclin auf üblichem biologischem Wege. • Es wird dabei ein Stamm von Actinomyces varsoviensis sp.nov. Nr. NCIB 9522 submers und aerob in an sich üblicher Weise in einem flüssigen Nähmedium, welches Quellen von Stickstoff, Kohlenstoff, Mineralsalze und Spurenelemente enthält, gezüchtet.

Durch die Verwendung von Actinomyces varsoviensis sp.nov. Nr. NCIB 9522 an Stelle der bekannten Verwendung von Streptomyces rimosus (deutsche Patentschrift 862 647) wird gegenüber der bekannten Arbeitsweise eine wesentlich höhere Ausbeute an Oxytetracyclm erzielt.

Die neue, bisher nicht beschriebene Art des Strahlenpilzes, dem die Benennung Actinomyces varsoviensis sp.nov. gegeben worden ist, erzeugt das obenerwähnte Antibiotikum, das Oxytetracyclin. . Die neue Species des Mikroorganismus Actinomyces varsoviensis sp.nov. wurde taxonomisch untersucht (vgl. N. A. Krasilnikow, Opredielitiel bakterii i aktinomycetow, Izd. Ak. Nauk SSSr, Moskau, 1949, sowie Bergey a Manual of Determinative Bacteriology, Williams, Wilkins, Baltimore, 1948) und als ein zu der Gattung Actinomyces (Krasilnikow) gehöriger Mikroorganismus klassifiziert.

Die neue Species Actinomyces varsoviensis sp. nov. ist hinterlegt bei der National Collection of Industrial Bacteria Torry Research Station, Aberdeen, Scotland, unter der NCIB 9522 vom 22. 9.1964.

Das Antibiotikum Oxytetracyclin wird von zahlreichen Strahlenpilzen gebildet. Die Herstellung von Oxytetracyclin ist in der Literatur vielfach beschrieben worden. Zum Beispiel ist in der USA.-Patentschrift 2516 080, in der deutschen Patentschrift 862 647 und in der britischen Patentschrift 648 417 ein Verfahren zur Herstellung von Oxytetracyclin auf dem biosynthetischen Wege bei Anwendung des Strahlenpilzstammes Streptomyces rimosus beschrieben, der sich hinsichtlich der Zucht und morphologischen Merkmale der im Jahre 1894 beschriebenen Art Streptomyces albus (Rosse— T. Dori a, Ann. Ist. IG. Sper. Roma N. S., 1894, 1, S. 399) Waksman, Henrici, nähert.

In der britischen Patentschrift 713 795 und in der kanadischen Patentschrift 520 836 ist ein Verfahren zur Gewinnung von Oxytetracyclin aus der Fermentationsflüssigkeit des Streptomyces platensis genannten Strahlenpilzes beschrieben. In der schweizerischen Patentschrift 331988 ist ein Verfahren zur Herstellung von Oxytetracyclin mittels eines neuen Verwendung von Actinomyces varsoviensis zur
Herstellung von Oxytetracyclin auf üblichem
biologischem Wege

Anmelder:

Dr. Wlodzimierz Kuryiowicz,

Dipl.-Ing. Franciszek Ulak, Warschau

Vertreter:

Dipl.-Ing. F. Weickmann,

Dr.-Ing. A. Weickmann

und Dipl.-Ing. H. Weickmann, Patentanwälte,

München 27, Möhlstr. 22

Als Erfinder benannt:

Dr. Wlodzimierz Kuryiowicz,

Dipl.-Ing. Franciszek Ulak, Warschau

Beanspruchte Priorität:

Polen vom 24. November 1959 (92 482)

Strahlenpilzes, des Streptomyces vendargensis sp.nov., beschrieben.

Auch in der französischen wissenschaftlichen Literatur ist eine neue Art eines Oxytetracyclin produzierenden Strahlenpilzes beschrieben. Diese Art erhielt den Namen Streptomyces armillatus (Mancy — Courtillet, Pinnert — Sindico, Ann. Inst. Pasteur, 1954, 87, S. 580). In dem Werk von S. A. Waksman und H. A. Lechevalier, »Actinomycetes and their Antibiotics«, Williams, Wilkins, Baltimore, 1953, erwähnen die Verfasser bei der Beschreibung der Art Streptomyces griseoflavus (Krainsky) Waksman, Henrici (vgl. A. Krainsky, ZbI. f. Bakt. [II], 1914, 41, S. 639) deren stark antagonistischen Eigenschaften und stellen fest, daß dieser Stamm Produzent des Oxytetracyclins und des Rimocidins ist. Über die Isolierung von Stämmen zahlreicher, Oxytetracyclin produzierender Strahlenpilze berichtet auch Silvestri (R. C. Ist. Sup. Sanitä, Roma, 1955, 18, S. 1227). Beide Autoren, insbesondere Silvestri, machen auf die Ähnlichkeit aufmerksam, die zwischen dem Stamm Streptomyces rimosus und der" seit dem Jahre 1914 bekannten Strahlenpilzart Streptomyces griseoflavus besteht.

Bei der Suche nach antagonistischen Strahlenpilzen wurde nun eine Strahlenpilzart isoliert, die sich durch ihre morphologischen, Zucht- und physiologischen Merkmale von den bisher in der Literatur beschriebenen Stämmen ausdrücklich unterscheidet.

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Dieser Stamm wurde sehr genauen taxonomischen Untersuchungen unterworfen, wobei alle modernen Teste zur Identifizierung' der'Gattung (genus)'"und Art (species) durchgeführt wurden. Es wurde festgestellt, daß der untersuchte Stamm zu einer neuen, bisher nicht beschriebenen Art gehört, für diq die Benennung Actinomyces varsoviensis sp.nov. gewähltwurde. ■'-■-" - ■ ^v

Die Sporen des ,Actinomyces varsoviensis sp.nov. sind gewöhnlich globose oder subglobose (0,6/ bis 0,8-3 — 0,5), die'Anzahl der Sporen "in' 'den Sporophoren gewöhnlich mehr als 10.

Actinomyces varsovieosis sp.nov, besitzt die folgenden" Morphologischen.Eigenschaften: Mohpodiale Verzweigung, Sporophoren einzeln oder verzweigt, gewöhnlich zerstreut längs der Hauptfäserchen, büschelweise Formation rudimentär. Spiralen offen, zuerst primitiv, später mit mehreren (his fünf) Schleifen;" oft unregelmäßig. "Bei den Kulturen" des Actinomyces varsoviensis zeigten sich keine Risse auf der Oberfläche, der Kolonien. Die Differen-

o zierung "wurde* mit den in der Tabelle I nachstehend aufgeführten Oxytetracyclin herstellenden Strahlenpilzarten durchgeführt.

Tabelle I
Arten von Oxytetracyclin herstellenden Strahlenpilzen

Lfd.'Nr.

Art

Literatur

Streptomyces griseoflavus

(Krainsky) Wäksman, Hehrici

Streptomyces .rimosus
Streptomyces armillatus

Streptomyces platensis
Streptromyces vendargensis

Al. Krainsky, ZbI. f. Bakt. (II), 1914, 41, S. 639;

W a k s m a η, H e.n r i c i (Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, Williams, Wilkins, Baltimore, 1948) '" "

B.A. Sobin, A.C. Finlay, J.H.Kane, USA.*· Patent 2516080, 1950 . ,

Mancy — D. Courtillet,
P.innert — S. Sindico, Ann. Inst. Pasteur, 1954, 87, S. 58O^:

J. M, McGuire, britisches Patent 713 795, 1954

A. S the em an, A. P. S tr uyk-, schweizerisches Patent 331988,: 1958 -

.Die nachstehende Tabelle II gibt die Züchtungs- liehe« Nährboden; wie z. B-. Kartoffeln, Kartoffel-

charakteristika und einige physiologischen Merkmale 35 Agar usw., sondern auch gut definierte »synthetische

des Stammes Actinomyces varsoviensis sp.nov, so- Substrate« ·■ angewandt. Actinomyces varsoviensis

wie des Stammes Streptomyces rimosus 2234 an. ' unterscheidet sich wesentlich von der Art Strepto-

Bei den taxonomischen Untersuchungen des Actino- myces rimosus; · · - ■

myces varsoviensis sp.nov. wurden nicht nur »natür- . ;

	Tabelle Π	Wachstum	Luftmycel	weiß	Gründmycel	Lösliches Pigment
Nährboden	Actinomyces varsoviensis sp. nov.
	+ + +	weiß	farblos	fehlt :
Asparagin-Agar mit Glukose	120
	+ + +	weiß	farblos	schwefelfarben
Sabouraud-Agar mit Malzzucker	120			(12L-4)
	+ + +	weiß	farblos	fehlt
Czapek-Doxa-Agar mit Saccharose	120
	+ +/+ + +	weiß	farblos	fehlt
Agar mit Dextrin	48-72
	+ + +	weiß	leinfarben	fehlt
Kartoffel	72		(12B-2)
	+ + +	weiß	farblos	fehlt
Kartoffel-Agar mit Glukose	72
	+ + +	weiß	farblos	fehlt
Agar mit Haferflocken	72
	+ + +	weiß	farblos	fehlt
Festes Triptonsubstrat	48
	4.4.4.	weiß	farblos	fehlt
Zitratsubstrat	72
	4-4-4-	weiß	farblos	fehlt
Lindenbeinsubstrat	72
	4-4-4-	farblos	fehlt
Flüssiges Triptonsubstrat	48 .		scheidet Schwefelwasserstoff aus

.Tabelle. II (Fortsetzung) .

Nährboden

Wachstum

Luftmycel

Grundmycel ' Lösliches Pigment'

Actinomyces Värsöviensis sp. nov.

Flüssiges Emersonsubstrat
Synthetischer Agar mit Peptqn.

Fleischbrühe -

Agar mit Stärke

Ca-Malat-Agar

Mohrrübe

Milch mit Lakmus

Gelatine

Agar mit Blut
Agar mit Nitraten

48-72

72

24-48

+■+ + 120

72 72

72

+ 48-72-weiß
weiß

weiß
weiß

weiß
kremweiß

farblos
farblos

kremfarben
farblos

blaß bis braunoliv

fehlt

dunkelgelb (121/5) fehlt
fehlt *

blaßbraun fehlt

farblos
säuert leicht an, peptonisiert

verflüchtigt sich nicht,

nach einiger Zeit verflüssigt sich teilweise

hämolysiert nicht

weiß

farblos

reduziert nicht Nitrate

pyritfarben (12-1-3)

Asparagin-Agar mit Glukose

Sabouraud-Agar mit Malzzucker

Czapek-Doxa-Agar mit Saccharose

Agar mit Dextrin

Kartoffel

Kartoffel-Agar mit Glukose *

Agar mit Haferflocken

Festes Triptonsubstrat

Zitratsubstrat .

Lindenbeinsubstrat

Flüssiges Triptonsubstrat

Flüssiges Emersonsubstrat

Synthetischer Agar mit Pepton

Fleischbrühe
Agar mit Stärke

Ca-Malat-Agar

Mohrrübe

Milch mit Lakmus

Gelatine

Agar mit Blut

Agar mit Nitraten

Streptomyces rimosus N. R. R. L. 2234 fehlt

gelbweiß

48-72

+ ■++■

120

120

72-96

72

+ + + 72

120

120

120

120

48

48-72

24-48

24-28

+ + 96

24-72 48 48

+.+ 48 fehlt oder weiße
Spurenelemente
fehlt

fehlt
weiß

beige

fasanenfarbert

(13 L-12)
farblos

hellbraun

(13D-4)
gelbbraun

(13J-9)
braun

grunbraungelb

(12D-2)
gelbgrün

(12F-2)
graugelbgrün

(12E-5)
Haselnuß

(13J-9)

scheidet nicht Schwefelwasserstoff aus

Citronenpigment

(lOJ-2) Sienna

(13 L-10) fehlt .,._:

Peruvianisch-

braun (13 L-10) gelb

(13 L-12) braun

(13 J-9) Isabella

(13K-7) gelb

fehlt

antikes Gold (12L-2)

weiß
fehlt

weiße

Spurenelemente
weiß oder

blaß zimtrosa
weiß

braun
farblos

farblos
gelbbraun

zimtblaß
gelb

gelbbraun

Isabella

(13 K-7) fehlt

Tenis

(12L-6) blaßbraun

fehlt

säuert an, peptonisiert

verflüssigt sich
hämolysiert rote Blutkörperchen

weiße
Spurenelemente

hellbraun
(13 D-3)

reduziert Nitrate zu Nitriten

Tenis
(12D-6)

In der Tabelle II bedeutet:

+ 4- mittelmäßiges Wachstum, + + + üppiges Wachstum.

Die Zahlen geben die Züchtungsstunden an, in denen das angegebene Wachstum festgestellt worden ist.

Die Farben sind gemäß dem »Dictionary of Color«, März und Paul, McGraw-Hill, New York, 1950, angegeben.

7 8

Nachstehend ist die Vergleichstabelle der ■Mikroorganismen'Äctinomyces varsoviensis, Streptomyces rimosus

und Streptomyces albus angegeben.

Tabellen!

	Streptomyces rimosus	Streptomyces albus
Actinomyees varsoviensis	Luftmycel schwach	(Rossi Doria emend. Krainsky) Waksman, Henrici.
Luftmycel schwach	Luftmycel ziemlich weiß -.-.	Luftmycel reich -
Luftmycel weiß"	Charakteristisches Aussehen der	Luftmycel weiß
Glattes Aussehen der Kolonie und	Kolonie und der Zucht1)	Nichtcharakteristisches Aussehen
der Zucht	Kartoffel: Grundmycel gelbbraun	der Kolonie
Kartoffel: Grundmycel leinf arben	Milch: Peptonisierung	Kartoffel: Kolonien weiß
Milch: Peptonisierung		Milch: Koagulierung, Peptonisie
	Gelatine: verflüssigt sich	rung
Gelatine: keine Verflüssigung oder		Gelatine: intensive Verflüssigung
teilweise Verflüssigung nach län
gerer Zeit	Nitrate: Reduktion zu Nitriten
Nitrate:.reduziertTiicht zu Nitriten	Stärke: leichte Hydrolyse	Nitrate: Reduktion zu Nitriten
Stärke: Hydrolyse fehlt		Stärke: hydrolysiert
	scheidet im Trypton-Medium H2S	oder hydrolysiert nicht
Scheidet im Trypton-Medium H2S	nicht aus2)
" aus	hämolysiert rote Blutkörperchen3)
Hämolisiert rote Blutkörperchen nicht	erzeugt Oxytetracyclin
Erzeugt Oxytetracyclin		erzeugt-Aktinomycin, Endomycin,
	Thiolutin

Anmerkungen:
bezeichnet, daß jegliche Angaben fehlen.

*) Ein auffallendes Merkmal, dem Streptomyces rimosus seinen Namen verdankt, ist die Bildung zahlreicher Risse auf der Oberfläche der Kolonien. Dieses Merkmal wurde beobachtet bei Sabouraud's Maltose-Agar, Emerson-Agar, Eisenpepton-Agar, Kartoflelscheiben-Agar sowie Grundmineralmedium + Trehalose. In den entsprechenden Kulturen des

Actinomyees varsoviensis stellte man keine Risse fest.

²)»jipd³) bezeichnen, daß die Angaben sich auf den Stamm Streptomyces rimqsus NRRL 2234 beziehen. Andere Einzelheiten betreffend Strept. albus und Strept. rimosus sind dem deutschen Patent 862 647 und Bergey's Manual - of Determinative Bacteriology, Williams, Wilkins, Baltimore, 1948, entnommen.

Die in der Tabelle IV enthaltenen Angaben beziehen sich auf einen Stamm von Streptomyces armillatus und sind dem Werk Mancy — D. Courtilletund Pinnert — S. Sindico, »Une nouvelle espece de Streptomyces: Streptomyces armillatus«, Ann. Inst. Pasteur, 1954, 87, S. 580, entnommen.

Actinomyees varsoviensis ap. nov.

Nährmedium	Wachstum .	Luftmycel	Grundmycel	Lösliches Pigment
Asparagin-Agar mit Glukose	+ + +	weiß	farblos .	fehlt
Czapek-Dox-Agar mit Saccharose	+ + +	weiß	farblos	fehlt
Nährboden mit Glukose und Pepton	+ + +	weiß	farblos	dunkelgelb
				: (Pl, 12,1-5)
Emerson-Nährboden	+ +/+ + + -	weiß	farblos	fehlt
			oder hellbraun
Kartoffel	+ + +";	weiß	leinenf arben	fehlt
			(Pl, 12-B-2)
Nährboden mit Stärke	+ + +	weiß	farblos	fehlt
Nährboden mit Nitraten	+ +/+ + +	reduziert nicht Nitrate zu Nitriten
Gelatine	+■+ +	verflüssigt Gelatine nicht,
		nach längerer Zeit verflüssigt sie teilweise
Müch bei 26° C	; +++ ■	peptonisiert, säuert an

Bei der Kultivierung von Actinomyees varsoviensis
sp. nov. kommen z. B. folgende Kohlenstoffquellen in
Frage:: Eruktose,; Glukose,. Galaktose,. Mannose; Trehalose, Glyzerin, Mannit, Natriumsuccinat. Schwach ausgenutzt sind: Raffinqse, ,Saccharose, Laktose, Ino- - sit sowie NatriumazetäL ',..,.. -...._ ...

9 10

Von Actinomyces varsoviensis werden in der Regel nicht assimiliert: Rhamnose, Maltose, Dulcit und Stärke

Tabelle IV
Streptomyces armillatus

Nährmedium	Wachstum	Luftmycel	Grundmycel	Lösliches Pigment
Asparagin-Agar mit Glukose	+ + +	schwach, ent wickelt, weiß fehlt	graugelb beige	fehlt
Czapek-Dox-Agar	4	entwickelt	farblos	fehlt
Nährboden mit Glukose und Pepton	+ + +	schwach, weiß	graugelb, glatt	fehlt
		entwickelt
Emerson-Nährboden	4 4-4-	schwach, weiß	gelbgrau, glatt	blaßrosa und
		entwickelt		blaßbraun
Kartoffel	+ +	graugelb, glatt	fehlt
Nährboden mit Stärke	±	sciiwacn hydrolysiert nicht Stärke
Nährboden mit Nitraten	+	reduziert nicht Nitrate zu Nitriten
Gelatine	4-4-	teilweise Verflüssigung nach 40 Tagen
Milch bei 26° C	4-4-	koaguliert, peptonisiert, säuert an

Anmerkungen:
Wachstum: ± sehr schwach, + schwach,

+ + mittelmäßig, + + + gut bis sehr üppig (üppig).

Aus »synthetischem« Nährboden nutzt Streptomyces armillatus folgende Kohlenstoff quellen aus: Glukose, Gelaktose, Mannose, Glyzerin, Erytrit. Schwächer ausgenutzt werden Arabinose, Raffinose, Mannit, Natriumazetat, Natriumzitrat und Stärke.

Streptomyces armillatus nutzt folgende Kohlenstoffquellen nicht aus: Xylose, Mannose, Lävulose,

Saccharose, Maltose, Laktose, Sorbit, Dulcit, Inosit und Natriumtartrat.

Die physiologischen Kennzeichen des Stammes Actinomyces varsoviensis, die sich auf dessen Assimilierungskapazität der Kohlenstoffquellen aus »synthetischem« Nährboden (mt. Priedham— Gottlieb) beziehen, sind in der Tabelle V angegeben.

Tabelle V

Ausnutzung der Kohlenstoffquellen aus »synthetischem« Agar durch Act. varsoviensis, Strept. armillatus und Strept. rimosus

Kohlenstoffquelle	Actinomyces varsoviensis sp. nov.	Steptomyces armillatus	Streptomyces rimosus 2234
Glukose	4-4-4-	+ 4-4-	4-4-4-
Galaktose	4-4-4-	4-4-4-	4-4-4-
Mannose	4· + +	4-4-4-	+ 4-	4- + 4-
Fruktose	+ + +		4-4- +	+ 4-
Laktose			4-4-
Maltose		.
Saccharose			+	+ 4-
Raffinose				+ +
Rhamnose	4-4-4·
Trehalose
Stärke	+ + +	4 + +
Glycerin
Mannit
Dulcit	χχχ	XX
Inosit
Natriumsuccinat
Natriumazetat

Anmerkungen:

Die Zeichen +, +, ++, + + + bezeichnen den Grad der Ausnutzung der Kohlenstoffquelle, den bestimmten Grad des Wachstums des untersuchten Stammes.
— bezeichnet Wachstumsmangel,
■ bezeichnet, daß kein Versuch gemacht worden ist.

Die Angaben betreffend Streptomyces armillatus, Streptomyces rimosus und Streptomyces griseoflavus stammen aus dem Werk Mancy — D. Courtillet

und Pinnert — S. Sindico (Ann. Inst. Pasteur, 1954, 87, S. 580). Die Angaben betreffend Actinomyces varsoviensis sp. nov. deuten darauf hin, daß

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dieser Stamm sich mit gewissen Merkmalen dem Stamm Streptomyces armillatus nähert. Darauf weist auch das Fehlen der Reduktion von Nitraten zu Nitriten sowie das Fehlen hydrolytischer Eigenschaften für Stärke hin. Von diesem Stamm unterscheidet er sich jedoch durch sein Verhalten auf Gelatine und durch Wachstumcharakter auf gewissen Nährböden, wie dies aus den in der Tabelle VI enthaltenen Angaben hervorgeht.

Auf Grund der genannten Angaben unterscheidet sich der Stamm Actinomyces varsoviensis sp.nov. bedeutend von den Stämmen Streptomyces rimosus und Streptomyces griseoflavus.

Tabelle VI

Nährb oden	Actinomyces	Streptomyces	Streptomyces	Streptomyces
^ * III H \JKJUwU	varsoviensis	armillatus	rimosus	griseoflavus
Synthetischer Nähr	schwaches Wachs	schwaches Wachs	kein Wachstum	Grundmycel orange
boden	tum, keine Pig	tum, keine Pig		oder braunrosa,
	mentierung	mentierung		Pigment blaßgelb
Kartoffel	Grundmycel lein-	Grundmycel grau	Grundmycel braun,	Grundmycel
	farben, leicht	gelb, glatt, kein	Pigment bkßgelb	Flechtentyp,krem-
	gekräuselt, kein	Pigment		f arben oder braun
	Pigment			rosa
Gelatine	Verflüssigung nach	langsame Verflüssi	Verflüssigung	schwache Verflüssi
	längerer Zeit	gung, Pigment		gung, Pigment
		braunrosa		blaßgelblich
Milch bei 26° C	Peptonisierung,	Koagulierung,	Peptonisierung	schnelle Peptonisie
	leichte Ansäue	Peptonisierung,		rung ohne Koagu
	rung	Ansäuerung		lierung
Emerson-Nährboden	Grundmycel farblos	Grundmycel grau	Grundmycel	Grundmycel
	oder hellbraun,	gelb, glatt,	orangebraun-	Flechtentyp, krem
	glatt, kein Pigment	Pigment blaßrosa	farben, rissig, Pig	farben oder braun,
	oder blaßgelb		ment gelbbraun	Pigment gelblich
Nitrate	keine Reduktion zu	keine Reduktion	Reduktion	Reduktion
	Nitriten	zu Nitriten	zu Nitriten	zu Nitriten
Stärke	keine Hydrolyse	keine Hydrolyse	schwache Hydro lyse	teilweise Hydrolyse

Die Angaben betreffend Streptomyces vendargensis und Streptomyces rimosus sind aus der schweizerischen Patentschrift 331 988 entnommen. Die Beschreibungen der dort angegebenen Stämme sind jedoch unzureichend, da sie die Charakteristik der physiologischen Grundmerkmale nicht aufweisen. Die Differenzierung zwischen Strept. vendargensis und Strept. rimosus ist in dem genannten Patent hauptsächlich darauf gestützt, daß Strept. vendargensis außer Oxytetracyclin noch ein anderes Antibiotikum »Vengicid« produziert, während Strept. rimosus außer Oxytetracyclin ein zweites Antibiotikum »Rimocidin« erzeugt. Die beiden Antibiotika »Vengicid« und »Rimocidin« unterscheiden sich voneinander durch physiochemische und biologische Eigenschaften.

Auf Grund der angeführten Angaben betreffend die Charakteristik der Züchtung der drei miteinander verglichenen Strahlenpilzstämme können grundsätzliehe Verschiedenheiten zwischen Actinomyces varsoviensis und den beiden übrigen Stämmen festgestellt werden (s. Tabellen VII und VIII). Aus dem angeführten Vergleich ist ersichtlich, daß der Stamm Actinomyces varsoviensis sp.nov. im Vergleich mit den anderen untersuchten Stämmen sich durch ein leichteres Luftmycel und ein farbloses oder leicht gelbes Grundmycel unterscheidet; außerdem erzeugt er ein gelbes, in das Substrat diffundierendes Pigment. Die Unterschiede zwischen den verglichenen Stämmen, insbesondere zwischen Actinomyces varsoviensis und Streptomyces rimosus, sind jedoch erheblich und betreffen physiologische Merkmale. Diese Unterschiede sind in der Tabelle VIII angegeben.

Tabelle VII

Nährboden	Wachs tum	Actinomyces varsoviensis	Wachs tum	Streptomyces platensis
Asparagin-Agar mit Glukose Czapek-Dox-Agar mit Saccharose	+ + + + + +	A weiß B farblos P fehlt A weiß B farblos P fehlt	+ + + +	A weißgrauolive B blaßgelb P blaßbraun A weißgrau B olivgelb P fehlt

(Fußnoten am Schluß der Tabelle.)

Anmerkung:

A = Luftmycel. B = Grundmycel.

13

(Fortsetzung Tabelle VII)

14

Nährboden	Wachs tum	Actinomyces varsoviensis	Wachs tum	Streptomyces platensis
Kartoffel	+ + +	A weiß B leinfarben P fehlt	+ + +	A weißblaßgrau B — P braun
Zitratnährboden	+ + +	A weiß B farblos P fehlt	+ +	A blaßgelb B blaßlachsfarben P blaßgrüngelb
Stärke-Agar	+ + +	A weiß B farblos P fehlt	+ +	A weißgrau B kremgelb P fehlt
Milch mit Lakmus Gelatine		peptonisiert, säuert leicht an teilweise Verflüssigung nach langer Zeit hydrolysiert nicht		koaguliert schwach, peptonisiert nach 30 Tagen schwache Verflüssigung
Stärke			hydrolysiert

P = Lösliches Pigment. — = Keine Angaben verfügbar.

Nährboden

Luftmycel

Grundmycel

Lösliches Pigment

Actinomyces varsoviensis sp. nov.

Agar mit Hafermehl Emerson-Agar Sabouraud-Agar

Kartoffel-Agar Agar mit Natriumzitrat Agar mit Glukose und Nitraten

Kartoffel
Agar mit Stärke

Agar mit Hafermehl

Emerson-Agar Sabouraud-Agar Kartoffel-Agar Agar mit Natriumzitrat

Agar mit Glukose und Nitraten

Kartoffel

Agar mit Stärke

weiß	farblos	fehlt
weiß	farblos oder hellbraun	fehlt
weiß	farblos	schwefelfarben
		(12L-4)
weiß	farblos	fehlt
weiß	farblos	fehlt
weiß	farblos	pyritfarben
		(12L-3)
weiß	leinfarben	fehlt
	(12B-2)
weißt	farblos	fehlt
nyces venc fehlt	largensis hellgelb	fehlt
	(11F-4)
weiß	hellbraun	fehlt
weiß	gelblich	fehlt
fehlt	braun	fehlt
fehlt	weiß	fehlt
	(2 A-I)
fehlt	hellgelb	fehlt
	(10 B-I)
weiß	gelb oder braun	fehlt
	(12D-5,13L-7)
weiß	farblos	fehlt

Die Beschreibung des Stammes Streptomyces vendargensis sp. nov. stammt aus der schweizerischen Patentschrift 331 998.

Tabelle VIII

Nährboden	Actinomyces varsoviensis	weiß	Streptomyces vendargensis	fehlt	A	Streptomyces rimosus
Agar mit Hafermehl	A	farblos	A	hellgelb		fehlt oder weiße
	B	fehlt	B	fehlt	B	Spurenelemente
	P		P		P	grünbraungelb
		weiß		weiß	A	dunkelgelb
Emerson-Agar	A	farblos oder hellbraun	A	hellbraun (13 D-5)	B	weiß
	B	(13 D-5)	B	fehlt	P	braun (15A-12)
		fehlt	P			gelbbraun
	P	weiß		weiß	A
Sabouraud-Agar	A	farblos	A	gelb (12E-3)	B	gelbweiß
	B	schwefelfarben	B	fehlt	P	fasanenfarben
	P	(L-412)	P			gelb
		weiß		fehlt	A
Kartoffel-Agar	•A	farblos	A	braun	B	weiß
	B	fehlt	B	fehlt	P	braun
	P	weiß	P	fehlt	A	braun
Agar mit Natriumzitrat	A	farblos	A	weiß (2 A-I)	B	fehlt
	B	fehlt	B	fehlt	P	graugelbgrün (13 J-5)
	P	weiß	P	fehlt	A	fehlt
Agar mit Glukose	A	farblos	A	hellgelb (10 B-I)	B	fehlt
und Nitraten	B	pyritfarben (12L-3)	B	fehlt	P	braun (13K-9)
	P	weiß	P	weiß	A	gelb
Kartoffel	A	leinfarben (12L-3)	- A	gelb oder braun	B	weiß
	B		B	(12 D-5,13L-7)	P	gelbbraun (12E-5)
	P	weiß	P	weiß	A	gelb
Agar mit Stärke	A	farblos	A	farblos		weiß
	B	fehlt	B	fehlt	B	(Spurenelemente)
	P		P		P	gelbbraun
				gelbbraun

Anmerkungen:
A = Luftmycel, B = Grundmycel, P = Lösliches Pigment.

Bei der Züchtung von Mikroorganismen hat man es nie mit einem statischen Zustand, sondern mit einer schwächer oder stärker ausgebildeten Veränderlichkeit zu tun. Als Folge dieser Veränderlichkeit können neue Formen entstehen, die als Varianten bezeichnet werden, d. h. veränderliche Formen, , die sich nicht vererben, sowie Mutanten, deren Merkmale vererblich sind. Dies erfordert eine oftmalige Kontrolle der Ergiebigkeit des Stammes und kann sogar eine Auswechselung mit antibiotisch. wirksameren Stämmen erfordern, die zu ein und derselben Art gehören. Die neuen Stämme müssen alle die Merkmale besitzen, die für die Art, zu welcher sie gehören, charakteristisch sind. Dieses Verhalten trifft nicht nur auf Actinomyces varsoviensis, sondern auch auf andere Strahlenpilze zu. Durch oftmalig durchgeführte Selektionen von Varianten oder Mutanten von erhöhter antibiotischer Ergiebigkeit gelingt es, Stämme von einer sehr hohen Ergiebigkeit zu gewinnen.

Die Mutanten unterscheiden sich zuweilen bedeutend von dem ursprünglichen Stamm. Die wesentlichsten Unterschiede betreffen die Färbung des Grundmycels, des im Substrat löslichen Pigmentes, die Art und Weise des Ausnutzens der Kohlenstoffquellen und des Stickstoffs aus den »synthetischen« Nährböden, und vor allem betreffen die Unterschiede die antibiotische Aktivität.

Zur Selektion »natürlicher« und »künstlicher« Mutanten wurde zum ersten Mal bei Strahlenpilzen ein Verfahren zur Bestimmung der Stammcharakteristik angewandt. Es gestattet nicht nur eine genaue Beschreibung der Population der gegebenen Mutanten, sondern auch Proben zum Auffinden des Zusammenhanges zwischen den morphologischen Merkmalen der Population und ihrer antibiotischen Aktivität. Dieses Verfahren erleichtert in hohem Maße die Selektion von in antibiotischer Hinsicht hoch ausgiebiger Stämme von Actinomyces yarsoviensis sp.nov.

Es wurde auch eine einfache, wenig aufwendige und schnelle Methode ausgearbeitet, die es erlaubt, innerhalb von 18 Stunden aus einer solchen Population Mutanten von höherer antibiotischer Leistungsfähigkeit auszusondern. Eine eingehende Beschreibung beider Selektionsmethoden ist im Biuletyn Informacyjny Instytutu Anytiotykow, Warszawa, 1959, 2. Heft 6, angegeben.

Auf Grund der erwähnten Vergleichsangaben betreffend die Stämme der Strahlenpilze: Streptomyces albus griseoflavus, Streptomyces rimosus, Streptomyces armillatus, Streptomyces platensis, und Streptomyces

17 18

yendargensis muß festgestellt werden, daß Actino- sich die Sporen über die ganze kugelförmige Obermyces varsoviensis sp.nov. mit keiner der genannten fläche der Pfianzenkömer und können danach in Gattungen identisch ist. Wasser suspendiert Werden und zum Impfen des

Actinomyces varsoviensis sp. nov. ist eine neue, flüssigen Saatnährbodens dienen, bisher nicht beschriebene, Oxytetracyclin herstellende 5 Die erwähnten Arbeitsweisen zum Aufbewahren Strahlenpilzenart. des ,Stammes Actinomyces varsoviensis sp.nov.

■ Zwecks Erzeugung von Oxytetracyelin züchtet man siehern diesen Stamm vor Änderungen seiner physioden Stamm Actinomyces varsoviensis sp.nov. in.an logischen Merkmale und antibiotischen Eigensich üblicher Weise, submers und aerob in flüssigem schäften.

Nährmedium, zweckmäßig auf dem Schüttelapparat iq Der Sporulationsnährboden für den Stamm Actino- und in geschlossenen Gefäßen, die vor Verunreini- myces varsoviensis sp.nov. kann außer natürlichen gungen durch andere Mikroorganismen schützen; Stickstoff quellen, wie z.B. Kartoffelextrakt, Weizengleichzeitig wird belüftet, zweckmäßig durch Zu- kleieextrakt und anderen pflanzlichen oder tierischen führung von steriler Luft oder sterilem Sauerstoff. Extrakten, auch Aminosäuren, Ammoniumsulfat

Im allgemeinen werden besondere Bedingungen 15 oder Natriumnitrat enthalten. Geeignete Kohlenstoffeingehalten, unter denen die für die Biosynthese des quellen sind einfache Zucker oder Polysaccharide, Oxytetracyclins günstige Züchtung des Stammes höhere Alkohole, Melasse oder Malzextrakt. Außer-Actinomyces varsoviensis sp. nov. erfolgt und die dem kann das Sporulationsnährmedium einen Zusatz den Zyklus der Biosynthese, die Substrate, die Züch- an Mineralsalzen und einen Zusatz an Spurentungstemperatur, die eigentliche Fermentation und die 20 elementen, z. B. Kobaltsalz in einer Menge von 0,1 Zeitdauer derselben, die Belüftung usw. betreffen. bis 1 mg °/o, enthalten neben 1,5 bis 3 % Agar.

Der Stamm Actinomyces varsoviensis sp. nov. wird Als zum Impfen des Saatnährbodens dienendes

zweckmäßig auf einem entsprechenden Sporulations- Inoculum kann die 6- bis 14tägige Züchtung des nährboden oder in Lyophilform aufbewahrt. Actinomyces varsoviensis sp. nov. bei optimal 26° C

Bei der Aufbewahrung wird am besten wie folgt as dienen, aus der eine Sporensuspension hergestellt verfahren: Die Stämme des Actinomyces varsoviensis wird.

sp. nov. auf Sporulationsnährboden können ohne Zusammensetzung geeigneter Sporulationsmedien

Veränderung etwa 6 Wochen im Gefrierapparat für Actinomyces varsoviensis sp.nov.: (bei —20° C) und in der Kühlvorrichtung (bei
+ 4° C) sowie etwa 3 bis 6 Monate bei Zimmer- 30 Nahrmedium 1

temperatur (etwa bei +18° C). aufbewahrt werden. Glukose 10 g

Bei der Aufbewahrung bei Zimmertemperatur wer- CoCl₂ 0,0005 g

den zwecks Verhütung eventueller ungünstiger An- Agar 25 g

derungen, die in der Züchtung vorkommen können, Wäßriger Kartoffelextrakt (erhalin die Probiergläser mit schrägem Agar einige Milli- 35 ten durch Extraktion binnen liter flüssigen, sterilen Paraffins, das die ganze 2 bis 3 Stunden in fließendem Kulturfläche bedecken muß, gegossen. Dampf) 1000 ml

Actinomyces varsoviensis sp. nov. kann man in pH 6,6 bis 6,8

einem entsprechenden Eiweiß- und Kohlenhydrate

enthaltenden Medium, in Lösungen von Amino- 40 Nährmedium 2

säuren oder einigen organischen Säuren, oft mit Zu- Maisweichextrakt (50%) 4 g

gäbe einer schützenden Substanz zwecks Verhütung Kartoffelstärke 15 g

von Verlusten der Vitalität bei Resuspension des (NH) SO 4 g

lyophisierten Materials lyophilieren. Es wurde fest- KH PO 2 g

gestellt, daß das beste Medium für die Sporen des 45 CaCO 3 g

Actinomyces varsoviensis ein Gemisch von lO°/oiger Agar ? 15 g

Saccharoselösung und l%iger Gelatinelösung ist. Die Destilliertes Wasser 100.0 ml

Endfeuchtigkeit des lyophilisierten Materials muß pjf 6_;6 bis 6,8

hierbei 0,2 bis 1% betragen. Die Ampullen oder

Flaschen, in denen die lyophilisierten Sporen des 50 Nährmedium 3

Actinomyces varsoviensis sp. nov. aufbewahrt wer- Malzextrakt 10 ε

den, müssen dabei unter vermindertem, 30 bis Hefeextrakt 4 s

100 mm Hg ausmachendem Druck dicht verschlossen Glukose 4 g

(zugeschmolzen) oder mit Stickstoff gefüllt werden. ^ 201

Die Sporen des Actinomyces varsoviensis sp. nov. 55 Destilliertes Wasser'.'.'.'.'.'.'.'.'.'.'.'.' 1000 ml kann man auch m einem Gemisch von Erde und u g 5 kj_s 6 8

Sand bei Zimmertemperatur (etwa +18° C) oder bei '' ' .'

Kühlhaustemperatur (etwa +4⁰C) aufbewahren. Die In der Biosynthese des Oxytetracyclins durch den

mit Sand vermischte Erde, in der die Sporensuspen- Stamm Actinomyces varsoviensis sp.nov. in großsion eingeführt worden ist, kann langsam bei Zimmer- 60 technischem Maßstab wird vorteilhaft ein aus drei temperatur getrocknet werden, oder sie kann aus dem Etappen bestehender Züchtungszyklus verwendet: Gefrierzustand im hohen Vakuum getrocknet werden. . _Tr , , .^ · ■, *

Eine andere Aufbewahrungsmethode von Sporen ^A· ^^orh%^e^ ^des vegetativen Saatmaterials auf der Stämme Actinomyces varsoviensis sp.nov. ist die ^dem kcnuttelapparat;

Aufbewahrung derselben auf vorher sterilisierten und 65 B- Vorbereitung eines größeren Volumens an vegegetrockneten Pflanzenprodukten, z.B.-auf Hirse- tativem Saatinoculum im Fermentationstank und

grütze. Nach vorheriger mehrtätiger Ausbrütung bei C. die eigentliche Fermentation, während welcher entsprechender Temperatur (24 bis 26° C) verteilen das Antibiotikum Oxytetracyclin gebildet wird.

■ΪΦ13&68

19 2Ö

In allen drei Etappen der im großtechnischen Substrates muß in der Regel für jeden'Mutanten

Maßstab geführten Biosynthese -wird die Submers- gesondert festgelegt- werden; Bei einfachen Zuckern

Züchtung sowohl auf dem Sehüttelapparät als auch beträgt er 0,5 bis 5%, für öle 0,5 bis -3 %>.·""" '■''

in Fermentationstanks verschiedenen Volumens an- ' ■ ' -

gewandt. Die Tanks müssen hierbei mit Vorrichtun- -·5 · Beispiel 1 gen versehen sein, die eine kontinuierliche Belüftung

der Züchtung mittels steriler Luft, das Mischen des ^: Die Kultivierung eines Stammes von Actinomyces Nährbodens, die Aufrechterhaltung einer konstanten varsoviensis sp.nov. wird in drei Etappen durchTemperatur gestatten, sowie mit Vorrichtungen aus- geführt.

gerüstet sein, die es erlauben, den Verlauf der Fer- io Diel erste Etappe des Eermentationszyklus dauert mentation zu kontrollieren und zu registrieren. Diese 24 bis 48 Stunden, abhängig von der Menge der für Vorrichtungen gestatten die Bestimmung und die Auf- die Inokulation angewandten Sporen des Mikrorechterhaltung eines optimalen pH-Wertes des Nähr- Organismus, der Zusammensetzung des Nährmediums, bodens, die Ergänzung der während der Fermenta- der Züchtungstemperatur, der Intensität der Belüftion erschöpften Bestandteile des Nährbodens, z. B. 15 tang, die wiederum vom Typ des Schüttelapparates, der Kohlenstoffquellen, die Einführung von die der Zahl der Schüttelungen bzw. Umdrehungen sowie Erzeugung von Oxytetracyclin anregenden Verbin- vom Hub, schließlich von der Gestalt des Gefäßes düngen sowie Mittel zur Verhinderung des Schau- und des Verhältnisses des Volumens des Gefäßes mens der Nährlösung u. dgl. zum Volumen des in ihm befindlichen Nährmediums

Die einzelnen Etappen bei der genannten Arbeits- 20 abhängig ist.

weise unterscheiden sich voneinander durch eine ver- Für Actinomyces varsoviensis sp. nov. erwiesen

schiedene Zusammensetzung und durch einen ver- sich in der ersten Etappe als optimale Bedingungen

schiedenen pH-Wert der Nährlösung, verschiedene die folgenden:

Temperatur und Zeitdauer der Züchtung sowie durch 2 bis 5% Suspension der Sporen eines Schrägederen verschiedene Lüftungsbedingungen. 25 agars ein einen Maisweichextrakt enthaltendes Sub-Die Nährlösung enthält eine Stickstoffquelle, z. B. strat, das Erdnußmehl, Ammoniumsulfat, Stärke, eine organische oder anorganische Stickstoff quelle Natriumchlorid und Kalziumkarbonat in entsprechen- oder ein Gemisch beider, sowie eine Kohlenstoff- dem Verhältnis enthält, 80 ml dieses Nährbodens quelle, eine Mineralsalzquelle und eine Quelle für werden in einen 500-ml-Erlenmayer-Kolben gegeben, Spurenelemente; die Nährlösung kann außerdem 30 das Nährmedium wird nach der Impfung mit Sporen Kalziumkarbonat enthalten. auf einen Schüttelapparat mit 180 Umdrehungen pro Als Quellen für Mineralsalze und Spurenelemente Minute, mit einem Hub von 3 bis 5 cm gebracht und kommen allgemein die »natürlichen« Bestandteile bei einer Temperatur von 20° C, meistens 24 Standes Nährmediums, die pflanzlicher oder animalischer den lang, ausgebrütet. Es können in dieser Etappe Herkunft sind, in Betracht. Die Hauptstickstoffquelle 35 zwei Siebungen von dem ärmeren Nährmedium auf im Nährstoff bilden z. B. Maisweichextrakt, Fleisch- das eine reichere, Kohlenstoffquelle enthaltende extrakt u. dgl. Nährmedium vorgenommen werden.

Von den am meisten angewandten Stickstoff quellen

sind zu erwähnen: Fleischextrakt, Pepton, Fischmehl, Nährmedium 4

Hefe, Hefeextrakt, Hefehydrolysat, Gasein, saures 40

Caseinhydrolysat mit Bauchspeicheldrüsenferment, Glukose 10 g

geätztes Casein, Maisweichextrakt, Sojamehl, Kobaltcblorid 0,0005 g

Extrakte und Hydrolysate aus diesem Mehl, Erdnuß- Kalziumkarbonat 4 g

mehl, gemahlene Erdnüsse, Extrakte und Hydro- Wäßriger Kartoffelextrakt 1000 ml

lysate aus Erdnüssen, Mehl aus Baumwollsamen, 45 Sojaöl 5 ml

Mehl aus Sonnenblumensamen und andere natürliche pH-Wert 6,6 bis 6,8

Stickstoffquellen pflanzlicher und animalischer Herkunft sowie aus diesen hergestellte Extrakte, ge- Nährmedium 5 quollene Erzeugnisse und Hydrolysate; an Stelle der

oder neben den erwähnten Stickstoffquellen können 50 Maisweichextrakt 5 g

außerdem Ammoniumsulfat oder Nitrate verwendet Gemahlene Arachidschnitzel ... 10 g

werden. Der Zusatz einiger der erwähnten Stickstoff- Kartoffelmehl 25 g

quellen, z. B. Maisweichextrakt, zum Nährstoff, in Ammoniumsulfat 4 g

dem die Hauptstickstoffquelle gemahlene Erdnüsse Natriumchlorid 5 g

sind, haben einen stimulierenden Einfluß auf die 55 Kalziumkarbonat 5 g

Erzeugung des Oxytetracyclins. Destilliertes Wasser 1000 ml

Als Kohlenstoffquellen kann man lösliche oder pH-Wert 5,7 bis 5,8

unlösliche Kohlenhydrate verwenden, z. B. Saccharosen, Maltosen, Glukosen und andere einfache Nährmedium 6 Zucker oder deren Gemische, Stärke, Kartoffelmehl, 60

Maismehl, Malzextrakt oder Gemische mit den vorher Maisweichextrakt 7 g

erwähnten einfachen Zuckern. Man kann auch höhere Arachidschnitzel 20 g

Alkohole verwenden, z. B. Glyzerin, Mannit u. a. Für Kartoffelmehl 45 g

einige »natürliche« und »künstliche« Mutanten des Ammoniumsulfat 4 g

Actinomyces varsoviensis sp. nov. haben sich pflanz- 65 Kalziumkarbonat 7 g

liehe Öle, z. B. Arachisöl, Sojaöl, Sonnenblumenöl Kobaltsulfat 0,02 g

und andere als geeignete Kohlenstoffquellen erwiesen. . Destilliertes Wasser 1000 ml

Der Prozentgehalt der einzelnen Bestandteile des pH-Wert 6,0 bis 6,2

21 22

Nährmedium 7 Die Ausbeute nach der angegebenen Zeit der

Fermentation im Kolben auf dem Schüttelapparat

Glukose 30 % beträgt 282 meg pro Milliliter; pH 7,1.

Maisweichextrakt (50%) 20 g

Kalziumkarbonat 5 g ₅ Nährmedium 10

Sojamehl 5g Erdnußmehl 20g

Natriumchlorid 5 g Maisweichextrakt (50 %>) 4 g

Ammoniumsulfat 4 g Natriumsulfat 2 g

Destilliertes Wasser 1000 ml Malzextrakt ,.. ■ 2 g

pH-Wert 6,6 ₁₀ Natriumchlorid 4 g

Kalziumkarbonat 10 g

Die zweite Etappe des Züchtungszyklus dauert Sojaöl 10 g

ebenfalls 24 bis 48 Stunden, abhängig von den Fer- Wasser 1000 ml

mentationsbedingungen. In einem etwa 6001 ent- pH-Wert natürlich

sprechenden Nährboden enthaltenden 1000-1-Fer- 15 ^r-_{h A}- _ΛΛ

mentationstank beträgt bei 28° C die Züchtungszeit «anrmearam 11

etwa 30 Stunden. Das Nährmedium enthält ein Gemahlene Arachidschnitzel 22,5 g

Gemisch entsprechender Mengen Maisweichextrakt, Maisweichextrakt 6,3 g

Ammoniumsulfat, Kartoffelmehl, Natriumchlorid, Kartoffelmehl 40,0 g

Kalziumkarbonat und Arachidöl (als Antischäu- ao Ammoniumsulfat 3,6 g

mungsmittel für die Nährlösung). Das Volumen des Kobaltsulfat .. 0,018 g

aus der ersten Etappe der Züchtung auf dem Schüttel- Arachisöl 1,8 g

apparat stammenden vegetativen Inoculums beträgt Kalziumkarbonat 6,3 g

mehr als 0,05%, z.B. 0,1 bis 1% des gesamten Wasser 1000ml

Volumens der Nährlösung des 10004-Tanks. Die 35 pH-Wert 6,3 bis 6,5

Lüftungsbedingungen der Züchtung sind: 0,2 bis 0,6

des Luftvolumens auf 1 Volumen des Nährbodens In der 48. und 60. Fermentationsstunde ist je

pro Minute. Die Drehzahl des Rührers muß 120 bis 2,5 g Sojaöl zuzugeben. Im Nährmedium 10 bildet

360 pro Minute betragen. das Sojaöl, ähnlich wie der Malzextrakt, eine Kohlen-

30 stoffquelle.

Nährmedium 8 ^^e Ausbeute nach 120 Fermentationsstunden in

Kolben auf dem Schüttelapparat beträgt: 320E in

Erdnußmehl 20 g 1 ml; pH 6,8 für das Nährmedium 10 und 356 E in

Maisweichextrakt 4 g 1 ml; pH 6,9 für das Nährmedium 11.

Natriumchlorid 4 g Erdnußmehl 40 g

Kalziumkarbonat 10 g Sojamehl 20 g

Sojaöl 5 ml Glukose 60 g

Destilliertes Wasser 1000 ml 40 Maisweichextrakt (50%) 5 g

pH-Wert 6,6 bis 6,8 Ammoniumsulfat 5 g

Kalziumkarbonat 4 g

Die dritte Etappe des Züchtungszyklus des Kobaltsulfat 0,05 g

Stammes Actinomyces varsoviensis sp. nov., in der Sojaöl 8 g

die eigentliche Fermentation stattfindet, während 45 Schmalz 3 g

welcher das Oxytetracyclin erzeugt wird, dauert, Wasser 1000 ml

abhängig von den Züchtungsbedingungen, 100 bis pH-Wert 6,6 bis 6,8

150 Stunden. In den Fermentationstanks mit Volumen von 5000 bis 15000 1, enthaltend 3500 bis Auf dem Nährboden 12 im Fermentationstank von 10 0001 Nährmedium, zusammengesetzt aus Arachid- 50 50001 Volumen, enthaltend 35001 des Nährmediums, mehl, Sojamehl, Maiweichextrakt, Ammoniumsulfat, hat man nach 100 Stunden Fermentation 2300 mcg/ml Kartoffelmehl, Kobaltsalz, Kalziumkarbonat, Glukose, bei pH 6,2 erhalten.

Arachidenöl, Sojaöl oder Schmalz (als Antischäu- Während die dritte Etappe zur Biosynthese des

mungsmittel) dauert die Fermentation 100 bis Oxytetracyclins führt, dienen die zwei ersten Etappen

150 Stunden, bei einer Temperatur von 28° C und 55 zur Herstellung des Inoculums zum Beimpfen des

bei einer Züchtungsbelüftung, die 0,6 bis 1,0 des Nährmediums der Etappe drei, d. h. zum Beimpfen

Luftvolumens auf ein Nährmediumsvolumen pro des eigentlichen Fermentationsnährbodens.

Minute beträgt. In allen Züchtungsetappen wird das Inoculum

mittels cytochemischen Methoden kontrolliert; in nach

Nährmedium 9 ^6o der Grammethode gefärbten Präparaten muß das

Saatinoculum zu 90% grampositiv sein. Eine wich-

Maisweichextrakt (50%) 5 g tige Rolle spielt auch die Kontrolle und die AufKartoffelmehl 37,5 g rechterhaltung des entsprechenden pH-Wertes des

Ammoniumsulfat 6 g Mediums in den einzelnen Etappen, insbesondere

Natriumchlorid 5 g 55 des pH-Wertes des Saatinoculums und des pH-Wertes

Wasser 1000 ml der Nährlösung während der eigentlichen Fermen-

Sojaöl 2 tation. In der dritten Etappe muß der pH-Wert der

pH-Wert 6,0 bis 6,2 Nährlösung in den folgenden Grenzen aufrechterhal-

23 24

ten werden: vor der Impfung mittels des aus dem gewaschen, wonach das adsorbierte Oxytetracyelin

IQOO-l-Tank stammenden Saatinoculums muß der mittels mit HCl gesättigtem Methanol eluiert wird.

pH-Wert des Nähimediums in den Grenzen von 6,2 Die Durchflußgeschwindigkeit des sauren Methanols

bis 6,9 liegen, während der Fermentation kann er beträgt 30 ml/cm²/Std." ■ ■ . ■

bis 6,8 bis 8,8 ansteigen, und am Schluß der Fer- -5 Die Ausbeute des Eluierungsprozesses hängt von

mentation muß. er in den Grenzen der Ausgangswerte der Konzentration des adsorbierten Antibiotikums

6,2 bis, 6,9 liegen. auf den Ionenaustauschern ab und beträgt 50

Mittels der Papierchromatographie in Systemen, bis 97%;

mit wassergesättigten Äthylazetat mit Butylketon- Die Kontrolle des Adsorptions- und Ehjierungs-

methylisobutyl-n-butanolazetat im Verhältnis von io prozesses wird durch Entnahme von Proben aus den

5:15:2 wurde im Fermentationsnährmedium die einzelnen Fraktionen und durch Bestimmung des in

Anwesenheit nur einer antibakteriellen Substanz, bei ihnen enthaltenen Antibiotikums mittels allgemein

der biologischen Entwicklung des Chromatogramms bekannter chemischer und biologischer Methoden

mittels. des. Bacillus subtilis 6633 festgestellt. Die durchgeführt.

Lage dieser Substanz auf dem Löschpapierstreifen 15 Das das adsorbierte Antibiotikum enthaltende

entsprach der Lage der durch das Oxytetracyclin saure Methanoleluat kann durch eine NaOH-Lösung

hervorgerufenen Hemmungszone. neutralisiert werden, jedoch bewirkt dieses Verfah-

Nach Beendigung der Fermentation des Nähr- ren ein zusätzliches Einführen von anorganischen

mediums kann man das Oxytetracyclin durch ver- Salzen in die Lösung, wodurch die Reinigung des

schiedene bekannte Verfahren aus der Fennen- ao Antibiotikums erschwert wird,

tationsflüssigkeit isolieren. Vorteilhaft ist es, zum Neutralisieren des neuen

Zwecks Abtrennung des Mycels wird die Fennen- Eluats einen Anionenaustauscher, z. B. Amberlit IR

tationsflüssigkeit. auf.pH= 1,5 bis.2,0, vorzugsweise oder Dowex 1,2, von basischem Charakter anzuwen-

pH =. 1,8,- mit Oxalsäure bei stetigem Rühren an- den. Die Neutralisierung auf einem Anionenaus-

gesäuert. In diesen pH-Grenzen erfolgt die Zerset- as tauscher erfolgt zusammen mit der Adsorbierung von

zung der während der Fermentation entstandenen Chlorionen aus der Lösung und mit der Ausscheidung

Oxytetracyclinkomplexsalze mit Kalzium und Magne- von Wasser. Die Neutralisierung wird so durch-

sium sowie .der ^vollkommene Übergang des Anti- geführt, daß die Methanollösung des Antibiotikums

biotikums in, die Lösung. Bei diesen Bedingungen einen pH-Wert von 3,0 bis 3,5 aufweist.

• erfogt auch die teilweise Niederschlagung von Eiweiß 30 Während der Neutralisierung erreichen die Anti-

und anderer in der Mischung enthaltenen Ver- biotikumverluste bis zu 7%. Das neutralisierte Eluat

unreinigungen, was. das Filtrieren erleichtert und den wird im Vakuumverdampfer bei 35 bis 40° C bis zu

Erhalt eines durchsichtigen Filtrates gestattet. Nach einem kleinen Volumen eingedickt und dadurch das

dem Ansäuern wird etwa 6% Kieselgur als Filtrier- Hydrochlorid des Oxytetracyclins mittels konzen-

hilfsmittel zugegeben; das Ganze wird 30 Miauten 35 trierter Salzsäure ausgefällt. Der gefällte Niederschlag

lang energisch gerührt und danach das Mycel zu- wird nach dem Filtrieren und Waschen abwechselnd

'sammen init dem niedergeschlagenen Kalziumoxalat mit Methanol und Aceton gewaschen und darauf

abfiltriert, bei einer Temperatur von 40⁰C getrocknet. Die

Aus dein durchsichtigen Filtrat kann man das Endausbeute des Prozesses beträgt etwa 36%. Die

Antibiotikum mittels eines der allgemein bekannten 40 Aktivität des erhaltenen Hydrochloride des Oxy-

Verfahren zum. Isolieren und Reinigen der Anti- tetracyclins beträgt ungefähr 670 mcg/mg.

biotika ausscheiden. Zwecks Erlangung eines Produktes mit höherer

Das Oxytetracyclin weist als amphotere Verbin- Aktivität kann man das erhaltene Oxytetracyclin

dung sowohl sauere als auch basische Gruppen mit mittels allgemein bekannter Methoden umkristalli-

den Dissoziationskonstanten pH 3,5, 7,6, 9,2 auf, 45 sieren (s. Beispiel 5).

welche die Adsorptionsfähigkeit des Antibiotikums -, . . ,

durch Ionenaustauscher bestimmen. .Beispiel I

Zur chemischen Aufarbeitung des Antibiotikums 101 einer gemäß Beispiel 1 erhaltenen Gärbrühe werden folgende Ionenaustauscher angewandt: werden unter ständigem Rühren mit Oxalsäure bis Kationenaustauscher Dowex 50 W (ein sulfoniertes 50 zu einem pH-Wert von 2,0 angesäuert. Danach wer-Polymerisationsprodukt von Styrol und Butadien), den 500 g Kieselgur zugegeben und das Ganze Anionenaustauscher Amberlit IR 45 (ein Polymeri- 30 Minuten lang gerührt, worauf der Nährboden auf sationsprodukt von Melanin und Formaldehyd), der Zentrifuge abgeschieden wird. Wenn das Filtrat Anionenaustauscher Dowex 1,2 (ein Polymerisations- trübe ist, muß das Filtrieren bis zur Erlangung eines produkt von Äthylendiamin und Formaldehyd, mit 55 durchsichtigen Filtrats wiederholt werden,
welchem eine Säule bis 20 cm Höhe gefüllt wird). Das klare Filtrat mit einem pH-Wert von 2,0 Das Verhältnis des Durchmessers der Säule zu ihrer bis 2,5 wird durch eine mit dem Kationenaustauscher Höhe beträgt 1:10. Die Durchflußgeschwindigkeit gefüllte Säule mit einer Geschwindigkeit von des Nährmedmmfiltrats durch die Ionenaustauscher- 200 ml/cm²/Std. geführt. Nach dem Durchlauf des säule beträgt 200 ml/cm²/Std. Die Ausbeute an ad- 60 Nährbodens wird die Säule mit 500 ml destilliertem sorbiertem Antibiotikum auf dem Ionenaustauscher Wasser und danach mit 250 ml Methanol gehängt im hohen Maße von der Konzentration des waschen. Das auf dem Kationenaustauscher adsor-Oxytetracyclins in den Fermentationsmedien ab und bierte Antibiotikum wird mit 1500 ml N der Hälfte schwankt in den Grenzen von 200 bis 1000 mg pro einer HCl-Lösung in Methanol mit einer Durchfluß-Gramm des Austauschers, : . 65 geschwindigkeit von SOml/cm/Std. eluiert.

Nach Beendigung der Adsorption wird die Ionen- Das gewonnene Oxytetracyclineluat enthält 2,19 g

austauschersäule mit dem adsorbierten Antibiotikum Oxytetracyclin, das ist 49% der ursprünglichen

abwechselnd mit. destilliertem Wasser und. Methanol Menge, .

25 26

Das saure Eluat wird mittels eines Anionenaus- abfiltriert, mit Alkohol und danach mit Äther getauschers bis zu einem pH-Wert von 3,0 bis 3,5 waschen und bei 40° C getrocknet,
neutralisiert und danach im Vakuumverdampfer bei Die Potenz des gewonnenen Hydrochlorids des 35 bis 40° C bis zu einem Volumen von 50 ml ein- Oxytetracyclins beträgt 640 meg in 1 mg. Die Ausgedickt. 5 beute des Prozesses beträgt 46%.

Das Oxytetracyclinmethanolkonzentrat wird mit Eine andere Verfahrensweise zum Ausscheiden des

konzentrierter Salzsäure versetzt und im Laufe des Oxytetracyclins aus der Nährlösung beruht auf dem

Zugebens erfolgt das Aussalzen des Hydrochlorids Aussalzen des Antibiotikums mittels Kochsalz aus

des Oxytetracyclins. Der abfiltrierte Niederschlag dem alkalischen Medium. Ein geringer Butanolzusatz

wird abwechselnd mit Methanol und Äther ge- ίο zum Filtrat bewirkt eine Vergrößerung der Reinheit

waschen und dann bei 40° C getrocknet. des niedergeschlagenen Oxytetracyclins.

Es wurde 1,6 g Oxytetracyclin mit einer Potenz Der abfiltrierte Niederschlag wird nach dem

von 670 mcg/mg gewonnen. Waschen und Trocknen in einer Methanollösung des

Eine andere Arbeitsweise zur Isolierung von Oxy- Kalziumchlorids aufgelöst, aus dem der Niederschlag

tetracyclin aus dem Fermentationsmedium beruht 15 des Oxytetracyclinhydrochlorids mit konzentrierter

auf der Extraktion des Antibiotikums aus der Salzsäure gefällt wird. Der abfiltrierte Niederschlag

Wasserphase mit einem organischen Lösungsmittel, wird abwechselnd mit Methanol und Äther ge-

das bei dem angewandten pH-Wert mit Wasser nicht waschen und danach bei 40° C getrocknet,
mischbar ist. Als Lösungsmittel können Butyl- und

Amylalkohol und deren Ester sowie Gemische von 20 Beisüiel4

Alkoholen und deren Estern mit niedrigen organi- ^p

sehen Säuren angewandt werden. Das klare Fermen- 101 einer gemäß Beispiel 1 erhaltenen Fermentationsmedium wird bei ständigem Rühren mit einem tationsbrühe werden mit Oxalsäure bis zu einem Gemisch von Butanol und Butylazetat versetzt, pH-Wert von 1,8 angesäuert. Dann werden 500 g wonach eine 2O°/oige NaOH-Lösung zwecks Ein- 35 Kieselgur zugegeben und das Ganze wird 30 Minuten stellung eines pH-Wertes von 9,5 zugegeben wird. lang gerührt, und danach wird der Nährboden auf Unter diesen Bedingungen geht das Oxytetracyclin einer Zentrifuge abfiltriert. Bei trübem Filtrat wird aus der Wasserphase in die organische Phase über. der Filtrierprozeß bis zur Erlangung eines durchsich-Nach der Trennung der Phasen wird die das extra- tigen Filtrats wiederholt.

hierte Antibiotikum enthaltende organische Phase 30 Dem filtierten Nährboden werden bei ständigem

mit einer Schwefelsäurelösung versetzt und dadurch Rühren 2,5 kg Kochsalz und 500 ml Butanol zu-

der pH-Wert bis 2,0 erhöht. Das Antibiotikum geht gegeben, wonach mit einer NaOH-Lösung bis zu

in die Wasserphase über, aus der nach Abscheidung einem pH-Wert von 9,0 bis 9,5 alkalisiert wird,

der organischen Phase das Hydrochlorid des Oxy- Das Ganze wird 1 Stunde lang gerührt und zwecks

tetracyclins mit Kochsalz bei einem pH-Wert von 35 Phasenabscheidung stehengelassen. In der Zwischen-

5,5 ausgesalzen wird. Der gefällte Hydrochlorid- phase auf der Grenze der Wasserphase und der

niederschlag des Oxytetracyclins wird nach dem organischen Phase ist der Niederschlag der Komplex-

Filtrieren mit Methanol und danach mit Äther ge- salze des Oxytetracyclins suspendiert. Nach dem

waschen. Abscheiden der Wasserphase wird die organische

Beispiel 3 ⁴° P^nase zusammen mit der Zwischenphase mit Kieselgur versetzt und nach dem Rühren der Niederschlag

101 einer gemäß Beispiel 1 erhaltenen Fermen- der Komplexsalze des Oxytetracyclins und des

tationsbrühe werden mittels Oxalsäure zu einem Kieseigurs abfiltriert.

pH-Wert von 1,8 bei ständigem Rühren angesäuert. Nach dem Waschen und Trocknen bei 40° C Danach werden 500 g Kieselgur zugegeben und das 45 wurden 27 g Komplexsalzniederschlag des Anti-Ganze V2 Stunde lang gerührt, wonach das Mycel biotikums mit einer Potenz von 115 meg in lmg und das ausgefüllte Kalziumoxalat abfiltriert werden. erhalten, was 72 % der ursprünglichen Menge des Bei Erhalt eines trüben oder opalisierenden Filtrates Antibiotikums entspricht. Der gewonnene Niederist der Filtrierprozeß zu wiederholen. schlag wird fünfmal in 80 ml einer Methanollösung

Das durchsichtige Filtrat mit einem pH-Wert von 50 des Kalziumchlorids extrahiert, wobei zu der ersten 1,8 wird mit 1000 ml eines Gemisches von Butanol Extraktion 30 ml und zur folgenden zweiten und und Butylazetat im Verhältnis von 93:7 versetzt und dritten je 15 ml, zur vierten und fünften je 10 ml anbei kontinuierlichem Rühren wird eine 2O°/oige gewendet wurden.

NaOH-Lösung zugegeben und der pH-Wert auf 9,5 Zu dem in einer Menge von 58 ml erhaltenen

gebracht. Nach der Einstellung des pH-Wertes wird 55 Methanolfiltrat werden 6 ml konzentrierter Salzsäure

das Ganze 1 Stunde lang gerührt und danach zum bei ständigem Rühren eingetropft. Unter diesen Be-

Trennen der Phasen absitzen gelassen. dingungen scheiden sich Hydrochloridkristalle des

Die Ausbeute aus dem Nährboden bis zur organi- Oxytetracyclins ab, die nach dem Filtrieren und

sehen Phase beträgt 85%. Waschen mit 99%igem Methanol bei 40° C getrock-

Die von der Wasserphase getrennte organische ⁶° net werden.

Phase wird mit 0,1 n-H₂SO₄ bei ständigem Rühren Es wurden 1,78 g Hydrochlorid des Oxytetraextrahiert und der pH-Wert auf 1,8 gebracht. Nach cyclins mit einer Stärke von 860 meg in 1 mg geEinstellung des pH-Wertes wird das Ganze 1 Stunde wonnen. Bei dem bekannten Verfahren der Gewinlang gerührt und dann zur Phasentrennung stehen- nung von Oxytetracyclin mit Streptomyces rimosus gelassen. Die Wasserphase wird mit kristallischem 65 (deutsche Patentschrift 862 647) werden dagegen aus NaCl versetzt, der pH-Wert auf 5,5 gebracht und 8 1 Gärflüssigkeit 1,69 g Produkt von einer Potenz zwecks Auskristallisierung des Hydrochlorids des von 625 meg in 1 mg erhalten, das entspricht Oxytetracyclins abgestellt. Der Niederschlag wird 211,2 mg Produkt aus einem Liter Gärflüssigkeit.

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Dieses Produkt ergibt nach weiterer Reinigung 61,25 mg, ebenfalls mit einer Potenz von 860 meg in 1 mg.

Man erhält also aus 11 Gärbrühe beim erfindungsgemäßen Verfahren 178 mg Produkt gegenüber nur 61,25 mg Produkt gleicher Potenz beim bekannten Verfahren.

Beispiel 5

301 der Fermentationsbrühe von 2300mcg/lml Aktivität werden mit konzentrierter Oxalsäure bis zum pH-Wert 1,7 bis 1,8 angesäuert, danach wird. 0,5% Kieselgur zugesetzt und das Ganze abfiltriert.

Dem erhaltenen Filtrat, dessen Volumen 251 betrug, werden 1 tyoo Kaliumferricyanid, 0,3 %o Zinksulfat, 2°/oo Kafhexol sowie 3%o Kieselgur zugesetzt.. Der entstandene Niederschlag wurde abfiltriert. Zu dem erhaltenen Filtrat wurden l%o Kathexol, 1% Magnesiumsulfat, l°/oo Ammoniumarsenat, 0,3°/oo Natriumsuhlt und 2°/oo Kieselgur zugesetzt. Der pH-Wert der Mischung wurde mittels einer verdünnten Ammoniaklösung auf 8,5 bis 8,7 eingestellt. Der Niederschlag des Oxytetracyclin enthaltenden Komplexes wird ausgeschieden, abfiltriert und mit Wasser nachgewaschen. Aus der erhaltenen Komplexverbindung wurde die rohe Oxytetracyclinbase gewonnen.

Hierzu wurde der feuchte Komplexniederschlag mit einer Mischung von 30 ml n-Butanol und 50 ml Wasser vermengt und gut vermischt. Das Ganze wurde dann mit einer Mischung aus 30%iger Schwefelsäure und konzentrierter Oxalsäure bis zum pH-Wert 1,9 bis 2,0 angesäuert und nach Erwärmung auf 28° C wurden l%o Ammoniumarsenat und 0,5 %o Natriumsulfit zugefügt und danach der pH-Wert auf 4,5 mittels Ammoniakwassers eingestellt. Der entstandene Niederschlag wurde abfiltriert, mit n-Butanol und Wasser nachgewaschen und getrocknet.

Im weiteren Verlauf der Prozedur wurde die rohe Base in das Hydrochlorid übergeführt und mittels Kristallisation gereinigt. Die erhaltene Oxytetracyclinbase wurde hierzu mit einer 4%igen Lösung von Kalziumchlorid in Methanol vermengt und gut vermischt. Der erhaltene Niederschlag wurde abfiltiert und mit der Methanollösung des Kalziumchlorids nachgewaschen. Das Grundfütrat und die Waschlösung werden vereinigt und im Vakuum bis zu einer Konzentration des Antibiotikums von· 120000 mcg/ml eingedampft.

Die erhaltene Lösung wird, alsdann mit konzentrierter Salzsäure bis zum pH-Wert 0,2 bis 0,3 angesäuert und zur Kristallisierung abgestellt. Die aus-', geschiedenen Kristalle werden abfiltriert, mit Metha-

ίο nol und danach mit Azeton nachgewaschen und im Vakuum bei 50° C getrocknet.

Man erhielt 41 g des HydrocHorids der Oxytetracyclin von großer Reinheit als gelbes kristallinisches Pulver. Dies entspricht einer Ausbeute des Isolierungsprozesses von über 70 %.

Beispiel 6

Zum Umkristallisieren des gemäß den Beispielen 1 bis 4 erhaltenen Oxytetracyclirihydrochlorids werden 3,5 g Oxytetracyclinhydrochlorid mit einer Potenz von 670 E in 1 mg mit 1,2 g Triäthylamin und 30 ml der Methanollösung des Kalziumchlorids vermischt und 4,5 ml konzentrierter Salzsäure zugegeben. Der Niederschlag des Oxytetracyclinhydrochlorids wird abfiltriert und danach abwechselnd mit Methanol· und Äther gewaschen und bei einer Temperatur von 40° G getrocknet.

Es wurden 2,6 g Oxytetracyclinhydrochlorid mit einer Potenz von 920 meg in 1 mg erhalten.

Die Kontrolle wurde mittels allgemein bekannter chemischer und biologischer Methoden durchgeführt.

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verwendung von Actinomyces varsoviensis sp.nov. Nr. NCIB 9522 zur Herstellung von Oxytetracyclin auf üblichem biologischem Wege.

   In Betracht gezogene Druckschriften:
   Deutsche Patentschrift Nr. 862 647;
   britische Patentschriften Nr. 648 417, 713 795; USA.-Patentschrift Nr. 2516 080;
   canadische Patentschrift Nr. 520 836;
   schweizerische Patentschrift Nr. 331988.

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