DE1213568B - Verwendung von Actinomyces varsoviensis zur Herstellung von Oxytetracyclin auf ueblichem biologischem Wege - Google Patents
Verwendung von Actinomyces varsoviensis zur Herstellung von Oxytetracyclin auf ueblichem biologischem WegeInfo
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Description
BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND
DEUTSCHES
PATENTAMT
AUSLEGESCHRIFT
Int. α.:
C12d
Deutsche Kl.: 30h-6
Nummer: 1213568
Aktenzeichen: K 40466IV a/30 h
Anmeldetag: 19. April 1960
Auslegetag: 31. März 1966
Die Erfindung betrifft die Herstellung von Oxytetracyclin auf üblichem biologischem Wege.
• Es wird dabei ein Stamm von Actinomyces varsoviensis sp.nov. Nr. NCIB 9522 submers und
aerob in an sich üblicher Weise in einem flüssigen Nähmedium, welches Quellen von Stickstoff, Kohlenstoff,
Mineralsalze und Spurenelemente enthält, gezüchtet.
Durch die Verwendung von Actinomyces varsoviensis sp.nov. Nr. NCIB 9522 an Stelle der bekannten
Verwendung von Streptomyces rimosus (deutsche Patentschrift 862 647) wird gegenüber der bekannten
Arbeitsweise eine wesentlich höhere Ausbeute an Oxytetracyclm erzielt.
Die neue, bisher nicht beschriebene Art des Strahlenpilzes, dem die Benennung Actinomyces
varsoviensis sp.nov. gegeben worden ist, erzeugt das obenerwähnte Antibiotikum, das Oxytetracyclin.
. Die neue Species des Mikroorganismus Actinomyces varsoviensis sp.nov. wurde taxonomisch
untersucht (vgl. N. A. Krasilnikow, Opredielitiel bakterii i aktinomycetow, Izd. Ak. Nauk SSSr,
Moskau, 1949, sowie Bergey a Manual of Determinative Bacteriology, Williams, Wilkins, Baltimore,
1948) und als ein zu der Gattung Actinomyces (Krasilnikow) gehöriger Mikroorganismus klassifiziert.
Die neue Species Actinomyces varsoviensis sp. nov. ist hinterlegt bei der National Collection of Industrial
Bacteria Torry Research Station, Aberdeen, Scotland, unter der NCIB 9522 vom 22. 9.1964.
Das Antibiotikum Oxytetracyclin wird von zahlreichen Strahlenpilzen gebildet. Die Herstellung von
Oxytetracyclin ist in der Literatur vielfach beschrieben worden. Zum Beispiel ist in der USA.-Patentschrift
2516 080, in der deutschen Patentschrift 862 647 und in der britischen Patentschrift 648 417
ein Verfahren zur Herstellung von Oxytetracyclin auf dem biosynthetischen Wege bei Anwendung des
Strahlenpilzstammes Streptomyces rimosus beschrieben, der sich hinsichtlich der Zucht und
morphologischen Merkmale der im Jahre 1894 beschriebenen Art Streptomyces albus (Rosse—
T. Dori a, Ann. Ist. IG. Sper. Roma N. S., 1894, 1, S. 399) Waksman, Henrici, nähert.
In der britischen Patentschrift 713 795 und in der kanadischen Patentschrift 520 836 ist ein Verfahren
zur Gewinnung von Oxytetracyclin aus der Fermentationsflüssigkeit des Streptomyces platensis genannten
Strahlenpilzes beschrieben. In der schweizerischen Patentschrift 331988 ist ein Verfahren zur Herstellung
von Oxytetracyclin mittels eines neuen Verwendung von Actinomyces varsoviensis zur
Herstellung von Oxytetracyclin auf üblichem
biologischem Wege
Herstellung von Oxytetracyclin auf üblichem
biologischem Wege
Anmelder:
Dr. Wlodzimierz Kuryiowicz,
Dipl.-Ing. Franciszek Ulak, Warschau
Vertreter:
Dipl.-Ing. F. Weickmann,
Dr.-Ing. A. Weickmann
und Dipl.-Ing. H. Weickmann, Patentanwälte,
München 27, Möhlstr. 22
Als Erfinder benannt:
Dr. Wlodzimierz Kuryiowicz,
Dipl.-Ing. Franciszek Ulak, Warschau
Beanspruchte Priorität:
Polen vom 24. November 1959 (92 482)
Strahlenpilzes, des Streptomyces vendargensis sp.nov., beschrieben.
Auch in der französischen wissenschaftlichen Literatur ist eine neue Art eines Oxytetracyclin
produzierenden Strahlenpilzes beschrieben. Diese Art erhielt den Namen Streptomyces armillatus
(Mancy — Courtillet, Pinnert — Sindico, Ann. Inst. Pasteur, 1954, 87, S. 580). In dem Werk
von S. A. Waksman und H. A. Lechevalier, »Actinomycetes and their Antibiotics«, Williams, Wilkins,
Baltimore, 1953, erwähnen die Verfasser bei der Beschreibung der Art Streptomyces griseoflavus
(Krainsky) Waksman, Henrici (vgl. A. Krainsky, ZbI. f. Bakt. [II], 1914, 41, S. 639) deren stark
antagonistischen Eigenschaften und stellen fest, daß dieser Stamm Produzent des Oxytetracyclins und des
Rimocidins ist. Über die Isolierung von Stämmen zahlreicher, Oxytetracyclin produzierender Strahlenpilze
berichtet auch Silvestri (R. C. Ist. Sup. Sanitä, Roma, 1955, 18, S. 1227). Beide Autoren, insbesondere
Silvestri, machen auf die Ähnlichkeit aufmerksam, die zwischen dem Stamm Streptomyces
rimosus und der" seit dem Jahre 1914 bekannten Strahlenpilzart Streptomyces griseoflavus besteht.
Bei der Suche nach antagonistischen Strahlenpilzen wurde nun eine Strahlenpilzart isoliert, die
sich durch ihre morphologischen, Zucht- und physiologischen Merkmale von den bisher in der Literatur
beschriebenen Stämmen ausdrücklich unterscheidet.
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Dieser Stamm wurde sehr genauen taxonomischen Untersuchungen unterworfen, wobei alle modernen
Teste zur Identifizierung' der'Gattung (genus)'"und Art (species) durchgeführt wurden. Es wurde festgestellt,
daß der untersuchte Stamm zu einer neuen, bisher nicht beschriebenen Art gehört, für diq die
Benennung Actinomyces varsoviensis sp.nov. gewähltwurde. ■'-■-" - ■ v
Die Sporen des ,Actinomyces varsoviensis sp.nov.
sind gewöhnlich globose oder subglobose (0,6/ bis 0,8-3 — 0,5), die'Anzahl der Sporen "in' 'den
Sporophoren gewöhnlich mehr als 10.
Actinomyces varsovieosis sp.nov, besitzt die folgenden"
Morphologischen.Eigenschaften: Mohpodiale
Verzweigung, Sporophoren einzeln oder verzweigt, gewöhnlich zerstreut längs der Hauptfäserchen,
büschelweise Formation rudimentär. Spiralen offen, zuerst primitiv, später mit mehreren (his fünf)
Schleifen;" oft unregelmäßig. "Bei den Kulturen" des
Actinomyces varsoviensis zeigten sich keine Risse auf der Oberfläche, der Kolonien. Die Differen-
o zierung "wurde* mit den in der Tabelle I nachstehend
aufgeführten Oxytetracyclin herstellenden Strahlenpilzarten durchgeführt.
Tabelle I
Arten von Oxytetracyclin herstellenden Strahlenpilzen
Arten von Oxytetracyclin herstellenden Strahlenpilzen
Lfd.'Nr.
Art
Literatur
Streptomyces griseoflavus
(Krainsky) Wäksman, Hehrici
Streptomyces .rimosus
Streptomyces armillatus
Streptomyces armillatus
Streptomyces platensis
Streptromyces vendargensis
Streptromyces vendargensis
Al. Krainsky, ZbI. f. Bakt. (II), 1914, 41, S. 639;
W a k s m a η, H e.n r i c i (Bergey's Manual of Determinative
Bacteriology, Williams, Wilkins, Baltimore, 1948) '" "
B.A. Sobin, A.C. Finlay, J.H.Kane, USA.*·
Patent 2516080, 1950 . ,
Mancy — D. Courtillet,
P.innert — S. Sindico, Ann. Inst. Pasteur, 1954, 87, S. 58O:
P.innert — S. Sindico, Ann. Inst. Pasteur, 1954, 87, S. 58O:
J. M, McGuire, britisches Patent 713 795, 1954
A. S the em an, A. P. S tr uyk-, schweizerisches Patent 331988,: 1958 -
.Die nachstehende Tabelle II gibt die Züchtungs- liehe« Nährboden; wie z. B-. Kartoffeln, Kartoffel-
charakteristika und einige physiologischen Merkmale 35 Agar usw., sondern auch gut definierte »synthetische
des Stammes Actinomyces varsoviensis sp.nov, so- Substrate« ·■ angewandt. Actinomyces varsoviensis
wie des Stammes Streptomyces rimosus 2234 an. ' unterscheidet sich wesentlich von der Art Strepto-
Bei den taxonomischen Untersuchungen des Actino- myces rimosus; · · - ■
myces varsoviensis sp.nov. wurden nicht nur »natür- . ;
Tabelle Π | Wachstum | Luftmycel | weiß | Gründmycel | Lösliches Pigment | |
Nährboden | Actinomyces varsoviensis sp. nov. | |||||
+ + + | weiß | farblos | fehlt : | |||
Asparagin-Agar mit Glukose | 120 | |||||
+ + + | weiß | farblos | schwefelfarben | |||
Sabouraud-Agar mit Malzzucker | 120 | (12L-4) | ||||
+ + + | weiß | farblos | fehlt | |||
Czapek-Doxa-Agar mit Saccharose | 120 | |||||
+ +/+ + + | weiß | farblos | fehlt | |||
Agar mit Dextrin | 48-72 | |||||
+ + + | weiß | leinfarben | fehlt | |||
Kartoffel | 72 | (12B-2) | ||||
+ + + | weiß | farblos | fehlt | |||
Kartoffel-Agar mit Glukose | 72 | |||||
+ + + | weiß | farblos | fehlt | |||
Agar mit Haferflocken | 72 | |||||
+ + + | weiß | farblos | fehlt | |||
Festes Triptonsubstrat | 48 | |||||
4.4.4. | weiß | farblos | fehlt | |||
Zitratsubstrat | 72 | |||||
4-4-4- | weiß | farblos | fehlt | |||
Lindenbeinsubstrat | 72 | |||||
4-4-4- | farblos | fehlt | ||||
Flüssiges Triptonsubstrat | 48 . | scheidet Schwefelwasserstoff aus | ||||
.Tabelle. II (Fortsetzung) .
Nährboden
Wachstum
Luftmycel
Grundmycel ' Lösliches Pigment'
Actinomyces Värsöviensis sp. nov.
Flüssiges Emersonsubstrat
Synthetischer Agar mit Peptqn.
Synthetischer Agar mit Peptqn.
Fleischbrühe -
Agar mit Stärke
Ca-Malat-Agar
Mohrrübe
Milch mit Lakmus
Gelatine
Agar mit Blut
Agar mit Nitraten
Agar mit Nitraten
48-72
72
24-48
+■+ + 120
72 72
72
+ 48-72-weiß
weiß
weiß
weiß
weiß
weiß
weiß
kremweiß
kremweiß
farblos
farblos
farblos
kremfarben
farblos
farblos
blaß bis braunoliv
fehlt
dunkelgelb (121/5) fehlt
fehlt *
fehlt *
blaßbraun fehlt
farblos
säuert leicht an, peptonisiert
säuert leicht an, peptonisiert
verflüchtigt sich nicht,
nach einiger Zeit verflüssigt sich teilweise
hämolysiert nicht
weiß
farblos
reduziert nicht Nitrate
pyritfarben (12-1-3)
Asparagin-Agar mit Glukose
Sabouraud-Agar mit Malzzucker
Czapek-Doxa-Agar mit Saccharose
Agar mit Dextrin
Kartoffel
Kartoffel-Agar mit Glukose *
Agar mit Haferflocken
Festes Triptonsubstrat
Zitratsubstrat .
Lindenbeinsubstrat
Flüssiges Triptonsubstrat
Flüssiges Emersonsubstrat
Synthetischer Agar mit Pepton
Fleischbrühe
Agar mit Stärke
Agar mit Stärke
Ca-Malat-Agar
Mohrrübe
Milch mit Lakmus
Gelatine
Agar mit Blut
Agar mit Nitraten
Streptomyces rimosus N. R. R. L. 2234 fehlt
gelbweiß
48-72
+ ■++■
120
120
72-96
72
+ + + 72
120
120
120
120
48
48-72
24-48
24-28
+ + 96
24-72 48 48
+.+ 48 fehlt oder weiße
Spurenelemente
fehlt
Spurenelemente
fehlt
fehlt
weiß
weiß
beige
fasanenfarbert
(13 L-12)
farblos
farblos
hellbraun
(13D-4)
gelbbraun
gelbbraun
(13J-9)
braun
braun
grunbraungelb
(12D-2)
gelbgrün
gelbgrün
(12F-2)
graugelbgrün
graugelbgrün
(12E-5)
Haselnuß
Haselnuß
(13J-9)
scheidet nicht Schwefelwasserstoff aus
Citronenpigment
(lOJ-2) Sienna
(13 L-10) fehlt .,.:
Peruvianisch-
braun (13 L-10) gelb
(13 L-12) braun
(13 J-9) Isabella
(13K-7) gelb
fehlt
antikes Gold (12L-2)
weiß
fehlt
fehlt
weiße
Spurenelemente
weiß oder
weiß oder
blaß zimtrosa
weiß
weiß
braun
farblos
farblos
farblos
gelbbraun
gelbbraun
zimtblaß
gelb
gelb
gelbbraun
Isabella
(13 K-7) fehlt
Tenis
(12L-6) blaßbraun
fehlt
säuert an, peptonisiert
verflüssigt sich
hämolysiert rote Blutkörperchen
hämolysiert rote Blutkörperchen
weiße
Spurenelemente
Spurenelemente
hellbraun
(13 D-3)
(13 D-3)
reduziert Nitrate zu Nitriten
Tenis
(12D-6)
(12D-6)
In der Tabelle II bedeutet:
+ 4- mittelmäßiges Wachstum, + + + üppiges Wachstum.
Die Zahlen geben die Züchtungsstunden an, in denen das angegebene Wachstum festgestellt worden ist.
Die Farben sind gemäß dem »Dictionary of Color«, März und Paul, McGraw-Hill, New York, 1950, angegeben.
7 8
Nachstehend ist die Vergleichstabelle der ■Mikroorganismen'Äctinomyces varsoviensis, Streptomyces rimosus
und Streptomyces albus angegeben.
Streptomyces rimosus | Streptomyces albus | |
Actinomyees varsoviensis | Luftmycel schwach | (Rossi Doria emend. Krainsky) Waksman, Henrici. |
Luftmycel schwach | Luftmycel ziemlich weiß -.-. | Luftmycel reich - |
Luftmycel weiß" | Charakteristisches Aussehen der | Luftmycel weiß |
Glattes Aussehen der Kolonie und | Kolonie und der Zucht1) | Nichtcharakteristisches Aussehen |
der Zucht | Kartoffel: Grundmycel gelbbraun | der Kolonie |
Kartoffel: Grundmycel leinf arben | Milch: Peptonisierung | Kartoffel: Kolonien weiß |
Milch: Peptonisierung | Milch: Koagulierung, Peptonisie | |
Gelatine: verflüssigt sich | rung | |
Gelatine: keine Verflüssigung oder | Gelatine: intensive Verflüssigung | |
teilweise Verflüssigung nach län | ||
gerer Zeit | Nitrate: Reduktion zu Nitriten | |
Nitrate:.reduziertTiicht zu Nitriten | Stärke: leichte Hydrolyse | Nitrate: Reduktion zu Nitriten |
Stärke: Hydrolyse fehlt | Stärke: hydrolysiert | |
scheidet im Trypton-Medium H2S | oder hydrolysiert nicht | |
Scheidet im Trypton-Medium H2S | nicht aus2) | |
" aus | hämolysiert rote Blutkörperchen3) | |
Hämolisiert rote Blutkörperchen nicht |
erzeugt Oxytetracyclin | |
Erzeugt Oxytetracyclin | erzeugt-Aktinomycin, Endomycin, | |
Thiolutin | ||
Anmerkungen:
bezeichnet, daß jegliche Angaben fehlen.
bezeichnet, daß jegliche Angaben fehlen.
*) Ein auffallendes Merkmal, dem Streptomyces rimosus
seinen Namen verdankt, ist die Bildung zahlreicher Risse auf der Oberfläche der Kolonien.
Dieses Merkmal wurde beobachtet bei Sabouraud's Maltose-Agar, Emerson-Agar, Eisenpepton-Agar,
Kartoflelscheiben-Agar sowie Grundmineralmedium + Trehalose. In den entsprechenden Kulturen des
Actinomyees varsoviensis stellte man keine Risse fest.
2)»jipd3) bezeichnen, daß die Angaben sich auf den Stamm
Streptomyces rimqsus NRRL 2234 beziehen. Andere Einzelheiten betreffend Strept. albus und
Strept. rimosus sind dem deutschen Patent 862 647 und Bergey's Manual - of Determinative Bacteriology,
Williams, Wilkins, Baltimore, 1948, entnommen.
Die in der Tabelle IV enthaltenen Angaben beziehen sich auf einen Stamm von Streptomyces armillatus und
sind dem Werk Mancy — D. Courtilletund Pinnert — S. Sindico, »Une nouvelle espece de Streptomyces:
Streptomyces armillatus«, Ann. Inst. Pasteur, 1954, 87, S. 580, entnommen.
Actinomyees varsoviensis ap. nov.
Nährmedium | Wachstum . | Luftmycel | Grundmycel | Lösliches Pigment |
Asparagin-Agar mit Glukose | + + + | weiß | farblos . | fehlt |
Czapek-Dox-Agar mit Saccharose | + + + | weiß | farblos | fehlt |
Nährboden mit Glukose und Pepton | + + + | weiß | farblos | dunkelgelb |
: (Pl, 12,1-5) | ||||
Emerson-Nährboden | + +/+ + + - | weiß | farblos | fehlt |
oder hellbraun | ||||
Kartoffel | + + +"; | weiß | leinenf arben | fehlt |
(Pl, 12-B-2) | ||||
Nährboden mit Stärke | + + + | weiß | farblos | fehlt |
Nährboden mit Nitraten | + +/+ + + | reduziert nicht Nitrate zu Nitriten | ||
Gelatine | +■+ + | verflüssigt Gelatine nicht, | ||
nach längerer Zeit verflüssigt sie teilweise | ||||
Müch bei 26° C | ; +++ ■ | peptonisiert, säuert an |
Bei der Kultivierung von Actinomyees varsoviensis
sp. nov. kommen z. B. folgende Kohlenstoffquellen in
Frage:: Eruktose,; Glukose,. Galaktose,. Mannose; Trehalose, Glyzerin, Mannit, Natriumsuccinat. Schwach ausgenutzt sind: Raffinqse, ,Saccharose, Laktose, Ino- - sit sowie NatriumazetäL ',..,.. -...._ ...
sp. nov. kommen z. B. folgende Kohlenstoffquellen in
Frage:: Eruktose,; Glukose,. Galaktose,. Mannose; Trehalose, Glyzerin, Mannit, Natriumsuccinat. Schwach ausgenutzt sind: Raffinqse, ,Saccharose, Laktose, Ino- - sit sowie NatriumazetäL ',..,.. -...._ ...
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Von Actinomyces varsoviensis werden in der Regel nicht assimiliert: Rhamnose, Maltose, Dulcit und Stärke
Tabelle IV
Streptomyces armillatus
Streptomyces armillatus
Nährmedium | Wachstum | Luftmycel | Grundmycel | Lösliches Pigment |
Asparagin-Agar mit Glukose | + + + | schwach, ent wickelt, weiß fehlt |
graugelb beige | fehlt |
Czapek-Dox-Agar | 4 | entwickelt | farblos | fehlt |
Nährboden mit Glukose und Pepton | + + + | schwach, weiß | graugelb, glatt | fehlt |
entwickelt | ||||
Emerson-Nährboden | 4 4-4- | schwach, weiß | gelbgrau, glatt | blaßrosa und |
entwickelt | blaßbraun | |||
Kartoffel | + + | graugelb, glatt | fehlt | |
Nährboden mit Stärke | ± | sciiwacn hydrolysiert nicht Stärke |
||
Nährboden mit Nitraten | + | reduziert nicht Nitrate zu Nitriten | ||
Gelatine | 4-4- | teilweise Verflüssigung nach 40 Tagen | ||
Milch bei 26° C | 4-4- | koaguliert, peptonisiert, säuert an |
Anmerkungen:
Wachstum: ± sehr schwach, + schwach,
Wachstum: ± sehr schwach, + schwach,
+ + mittelmäßig, + + + gut bis sehr üppig (üppig).
Aus »synthetischem« Nährboden nutzt Streptomyces
armillatus folgende Kohlenstoff quellen aus: Glukose, Gelaktose, Mannose, Glyzerin, Erytrit.
Schwächer ausgenutzt werden Arabinose, Raffinose, Mannit, Natriumazetat, Natriumzitrat und
Stärke.
Streptomyces armillatus nutzt folgende Kohlenstoffquellen nicht aus: Xylose, Mannose, Lävulose,
Saccharose, Maltose, Laktose, Sorbit, Dulcit, Inosit und Natriumtartrat.
Die physiologischen Kennzeichen des Stammes Actinomyces varsoviensis, die sich auf dessen
Assimilierungskapazität der Kohlenstoffquellen aus »synthetischem« Nährboden (mt. Priedham—
Gottlieb) beziehen, sind in der Tabelle V angegeben.
Ausnutzung der Kohlenstoffquellen aus »synthetischem« Agar durch Act. varsoviensis, Strept. armillatus und Strept. rimosus
Kohlenstoffquelle | Actinomyces varsoviensis sp. nov. |
Steptomyces armillatus |
Streptomyces rimosus 2234 |
|
Glukose | 4-4-4- | + 4-4- | 4-4-4- | |
Galaktose | 4-4-4- | 4-4-4- | 4-4-4- | |
Mannose | 4· + + | 4-4-4- | + 4- | 4- + 4- |
Fruktose | + + + | 4-4- + | + 4- | |
Laktose | 4-4- | |||
Maltose | . | |||
Saccharose | + | + 4- | ||
Raffinose | + + | |||
Rhamnose | 4-4-4· | |||
Trehalose | ||||
Stärke | + + + | 4 + + | ||
Glycerin | ||||
Mannit | ||||
Dulcit | χχχ | XX | ||
Inosit | ||||
Natriumsuccinat | ||||
Natriumazetat |
Anmerkungen:
Die Zeichen +, +, ++, + + + bezeichnen den Grad der Ausnutzung der Kohlenstoffquelle, den bestimmten Grad des
Wachstums des untersuchten Stammes.
— bezeichnet Wachstumsmangel,
■ bezeichnet, daß kein Versuch gemacht worden ist.
— bezeichnet Wachstumsmangel,
■ bezeichnet, daß kein Versuch gemacht worden ist.
Die Angaben betreffend Streptomyces armillatus, Streptomyces rimosus und Streptomyces griseoflavus
stammen aus dem Werk Mancy — D. Courtillet
und Pinnert — S. Sindico (Ann. Inst. Pasteur, 1954, 87, S. 580). Die Angaben betreffend Actinomyces
varsoviensis sp. nov. deuten darauf hin, daß
609 540/375
dieser Stamm sich mit gewissen Merkmalen dem Stamm Streptomyces armillatus nähert. Darauf weist
auch das Fehlen der Reduktion von Nitraten zu Nitriten sowie das Fehlen hydrolytischer Eigenschaften
für Stärke hin. Von diesem Stamm unterscheidet er sich jedoch durch sein Verhalten auf
Gelatine und durch Wachstumcharakter auf gewissen Nährböden, wie dies aus den in der Tabelle VI enthaltenen
Angaben hervorgeht.
Auf Grund der genannten Angaben unterscheidet sich der Stamm Actinomyces varsoviensis sp.nov.
bedeutend von den Stämmen Streptomyces rimosus und Streptomyces griseoflavus.
Nährb oden | Actinomyces | Streptomyces | Streptomyces | Streptomyces |
^ * III H \JKJUwU | varsoviensis | armillatus | rimosus | griseoflavus |
Synthetischer Nähr | schwaches Wachs | schwaches Wachs | kein Wachstum | Grundmycel orange |
boden | tum, keine Pig | tum, keine Pig | oder braunrosa, | |
mentierung | mentierung | Pigment blaßgelb | ||
Kartoffel | Grundmycel lein- | Grundmycel grau | Grundmycel braun, | Grundmycel |
farben, leicht | gelb, glatt, kein | Pigment bkßgelb | Flechtentyp,krem- | |
gekräuselt, kein | Pigment | f arben oder braun | ||
Pigment | rosa | |||
Gelatine | Verflüssigung nach | langsame Verflüssi | Verflüssigung | schwache Verflüssi |
längerer Zeit | gung, Pigment | gung, Pigment | ||
braunrosa | blaßgelblich | |||
Milch bei 26° C | Peptonisierung, | Koagulierung, | Peptonisierung | schnelle Peptonisie |
leichte Ansäue | Peptonisierung, | rung ohne Koagu | ||
rung | Ansäuerung | lierung | ||
Emerson-Nährboden | Grundmycel farblos | Grundmycel grau | Grundmycel | Grundmycel |
oder hellbraun, | gelb, glatt, | orangebraun- | Flechtentyp, krem | |
glatt, kein Pigment | Pigment blaßrosa | farben, rissig, Pig | farben oder braun, | |
oder blaßgelb | ment gelbbraun | Pigment gelblich | ||
Nitrate | keine Reduktion zu | keine Reduktion | Reduktion | Reduktion |
Nitriten | zu Nitriten | zu Nitriten | zu Nitriten | |
Stärke | keine Hydrolyse | keine Hydrolyse | schwache Hydro lyse |
teilweise Hydrolyse |
Die Angaben betreffend Streptomyces vendargensis und Streptomyces rimosus sind aus der schweizerischen
Patentschrift 331 988 entnommen. Die Beschreibungen der dort angegebenen Stämme sind jedoch
unzureichend, da sie die Charakteristik der physiologischen Grundmerkmale nicht aufweisen.
Die Differenzierung zwischen Strept. vendargensis und Strept. rimosus ist in dem genannten Patent
hauptsächlich darauf gestützt, daß Strept. vendargensis außer Oxytetracyclin noch ein anderes Antibiotikum
»Vengicid« produziert, während Strept. rimosus außer Oxytetracyclin ein zweites Antibiotikum
»Rimocidin« erzeugt. Die beiden Antibiotika »Vengicid« und »Rimocidin« unterscheiden
sich voneinander durch physiochemische und biologische Eigenschaften.
Auf Grund der angeführten Angaben betreffend die Charakteristik der Züchtung der drei miteinander
verglichenen Strahlenpilzstämme können grundsätzliehe Verschiedenheiten zwischen Actinomyces varsoviensis
und den beiden übrigen Stämmen festgestellt werden (s. Tabellen VII und VIII). Aus dem angeführten
Vergleich ist ersichtlich, daß der Stamm Actinomyces varsoviensis sp.nov. im Vergleich mit
den anderen untersuchten Stämmen sich durch ein leichteres Luftmycel und ein farbloses oder leicht
gelbes Grundmycel unterscheidet; außerdem erzeugt er ein gelbes, in das Substrat diffundierendes Pigment.
Die Unterschiede zwischen den verglichenen Stämmen, insbesondere zwischen Actinomyces varsoviensis
und Streptomyces rimosus, sind jedoch erheblich und betreffen physiologische Merkmale.
Diese Unterschiede sind in der Tabelle VIII angegeben.
Nährboden | Wachs tum |
Actinomyces varsoviensis | Wachs tum |
Streptomyces platensis |
Asparagin-Agar mit Glukose Czapek-Dox-Agar mit Saccharose |
+ + +
+ + + |
A weiß B farblos P fehlt A weiß B farblos P fehlt |
+ +
+ + |
A weißgrauolive B blaßgelb P blaßbraun A weißgrau B olivgelb P fehlt |
(Fußnoten am Schluß der Tabelle.)
Anmerkung:
A = Luftmycel. B = Grundmycel.
13
(Fortsetzung Tabelle VII)
14
Nährboden | Wachs tum |
Actinomyces varsoviensis | Wachs tum |
Streptomyces platensis |
Kartoffel | + + + | A weiß B leinfarben P fehlt |
+ + + | A weißblaßgrau B — P braun |
Zitratnährboden | + + + | A weiß B farblos P fehlt |
+ + | A blaßgelb B blaßlachsfarben P blaßgrüngelb |
Stärke-Agar | + + + | A weiß B farblos P fehlt |
+ + | A weißgrau B kremgelb P fehlt |
Milch mit Lakmus Gelatine |
peptonisiert, säuert leicht an teilweise Verflüssigung nach langer Zeit hydrolysiert nicht |
koaguliert schwach, peptonisiert nach 30 Tagen schwache Verflüssigung |
||
Stärke | hydrolysiert |
P = Lösliches Pigment. — = Keine Angaben verfügbar.
Nährboden
Luftmycel
Grundmycel
Lösliches Pigment
Actinomyces varsoviensis sp. nov.
Agar mit Hafermehl Emerson-Agar Sabouraud-Agar
Kartoffel-Agar Agar mit Natriumzitrat Agar mit Glukose und Nitraten
Kartoffel
Agar mit Stärke
Agar mit Stärke
Agar mit Hafermehl
Emerson-Agar Sabouraud-Agar Kartoffel-Agar Agar mit Natriumzitrat
Agar mit Glukose und Nitraten
Kartoffel
Agar mit Stärke
weiß | farblos | fehlt |
weiß | farblos oder hellbraun | fehlt |
weiß | farblos | schwefelfarben |
(12L-4) | ||
weiß | farblos | fehlt |
weiß | farblos | fehlt |
weiß | farblos | pyritfarben |
(12L-3) | ||
weiß | leinfarben | fehlt |
(12B-2) | ||
weißt | farblos | fehlt |
nyces venc fehlt |
largensis hellgelb |
fehlt |
(11F-4) | ||
weiß | hellbraun | fehlt |
weiß | gelblich | fehlt |
fehlt | braun | fehlt |
fehlt | weiß | fehlt |
(2 A-I) | ||
fehlt | hellgelb | fehlt |
(10 B-I) | ||
weiß | gelb oder braun | fehlt |
(12D-5,13L-7) | ||
weiß | farblos | fehlt |
Die Beschreibung des Stammes Streptomyces vendargensis sp. nov. stammt aus der schweizerischen Patentschrift 331 998.
Nährboden | Actinomyces varsoviensis | weiß | Streptomyces vendargensis | fehlt | A | Streptomyces rimosus |
Agar mit Hafermehl | A | farblos | A | hellgelb | fehlt oder weiße | |
B | fehlt | B | fehlt | B | Spurenelemente | |
P | P | P | grünbraungelb | |||
weiß | weiß | A | dunkelgelb | |||
Emerson-Agar | A | farblos oder hellbraun | A | hellbraun (13 D-5) | B | weiß |
B | (13 D-5) | B | fehlt | P | braun (15A-12) | |
fehlt | P | gelbbraun | ||||
P | weiß | weiß | A | |||
Sabouraud-Agar | A | farblos | A | gelb (12E-3) | B | gelbweiß |
B | schwefelfarben | B | fehlt | P | fasanenfarben | |
P | (L-412) | P | gelb | |||
weiß | fehlt | A | ||||
Kartoffel-Agar | •A | farblos | A | braun | B | weiß |
B | fehlt | B | fehlt | P | braun | |
P | weiß | P | fehlt | A | braun | |
Agar mit Natriumzitrat | A | farblos | A | weiß (2 A-I) | B | fehlt |
B | fehlt | B | fehlt | P | graugelbgrün (13 J-5) | |
P | weiß | P | fehlt | A | fehlt | |
Agar mit Glukose | A | farblos | A | hellgelb (10 B-I) | B | fehlt |
und Nitraten | B | pyritfarben (12L-3) | B | fehlt | P | braun (13K-9) |
P | weiß | P | weiß | A | gelb | |
Kartoffel | A | leinfarben (12L-3) | - A | gelb oder braun | B | weiß |
B | B | (12 D-5,13L-7) | P | gelbbraun (12E-5) | ||
P | weiß | P | weiß | A | gelb | |
Agar mit Stärke | A | farblos | A | farblos | weiß | |
B | fehlt | B | fehlt | B | (Spurenelemente) | |
P | P | P | gelbbraun | |||
gelbbraun |
Anmerkungen:
A = Luftmycel, B = Grundmycel, P = Lösliches Pigment.
A = Luftmycel, B = Grundmycel, P = Lösliches Pigment.
Bei der Züchtung von Mikroorganismen hat man es nie mit einem statischen Zustand, sondern mit
einer schwächer oder stärker ausgebildeten Veränderlichkeit zu tun. Als Folge dieser Veränderlichkeit
können neue Formen entstehen, die als Varianten bezeichnet werden, d. h. veränderliche Formen, ,
die sich nicht vererben, sowie Mutanten, deren Merkmale vererblich sind. Dies erfordert eine oftmalige
Kontrolle der Ergiebigkeit des Stammes und kann sogar eine Auswechselung mit antibiotisch.
wirksameren Stämmen erfordern, die zu ein und derselben Art gehören. Die neuen Stämme müssen alle
die Merkmale besitzen, die für die Art, zu welcher sie gehören, charakteristisch sind. Dieses Verhalten
trifft nicht nur auf Actinomyces varsoviensis, sondern auch auf andere Strahlenpilze zu. Durch oftmalig
durchgeführte Selektionen von Varianten oder Mutanten von erhöhter antibiotischer Ergiebigkeit
gelingt es, Stämme von einer sehr hohen Ergiebigkeit zu gewinnen.
Die Mutanten unterscheiden sich zuweilen bedeutend von dem ursprünglichen Stamm. Die
wesentlichsten Unterschiede betreffen die Färbung des Grundmycels, des im Substrat löslichen Pigmentes,
die Art und Weise des Ausnutzens der Kohlenstoffquellen und des Stickstoffs aus den »synthetischen«
Nährböden, und vor allem betreffen die Unterschiede die antibiotische Aktivität.
Zur Selektion »natürlicher« und »künstlicher« Mutanten wurde zum ersten Mal bei Strahlenpilzen
ein Verfahren zur Bestimmung der Stammcharakteristik angewandt. Es gestattet nicht nur eine genaue
Beschreibung der Population der gegebenen Mutanten, sondern auch Proben zum Auffinden des Zusammenhanges
zwischen den morphologischen Merkmalen der Population und ihrer antibiotischen Aktivität.
Dieses Verfahren erleichtert in hohem Maße die Selektion von in antibiotischer Hinsicht hoch
ausgiebiger Stämme von Actinomyces yarsoviensis sp.nov.
Es wurde auch eine einfache, wenig aufwendige und schnelle Methode ausgearbeitet, die es erlaubt,
innerhalb von 18 Stunden aus einer solchen Population Mutanten von höherer antibiotischer Leistungsfähigkeit
auszusondern. Eine eingehende Beschreibung beider Selektionsmethoden ist im Biuletyn Informacyjny
Instytutu Anytiotykow, Warszawa, 1959, 2. Heft 6, angegeben.
Auf Grund der erwähnten Vergleichsangaben betreffend die Stämme der Strahlenpilze: Streptomyces
albus griseoflavus, Streptomyces rimosus, Streptomyces
armillatus, Streptomyces platensis, und Streptomyces
17 18
yendargensis muß festgestellt werden, daß Actino- sich die Sporen über die ganze kugelförmige Obermyces
varsoviensis sp.nov. mit keiner der genannten fläche der Pfianzenkömer und können danach in
Gattungen identisch ist. Wasser suspendiert Werden und zum Impfen des
Actinomyces varsoviensis sp. nov. ist eine neue, flüssigen Saatnährbodens dienen,
bisher nicht beschriebene, Oxytetracyclin herstellende 5 Die erwähnten Arbeitsweisen zum Aufbewahren
Strahlenpilzenart. des ,Stammes Actinomyces varsoviensis sp.nov.
■ Zwecks Erzeugung von Oxytetracyelin züchtet man siehern diesen Stamm vor Änderungen seiner physioden
Stamm Actinomyces varsoviensis sp.nov. in.an logischen Merkmale und antibiotischen Eigensich
üblicher Weise, submers und aerob in flüssigem schäften.
Nährmedium, zweckmäßig auf dem Schüttelapparat iq Der Sporulationsnährboden für den Stamm Actino-
und in geschlossenen Gefäßen, die vor Verunreini- myces varsoviensis sp.nov. kann außer natürlichen
gungen durch andere Mikroorganismen schützen; Stickstoff quellen, wie z.B. Kartoffelextrakt, Weizengleichzeitig wird belüftet, zweckmäßig durch Zu- kleieextrakt und anderen pflanzlichen oder tierischen
führung von steriler Luft oder sterilem Sauerstoff. Extrakten, auch Aminosäuren, Ammoniumsulfat
Im allgemeinen werden besondere Bedingungen 15 oder Natriumnitrat enthalten. Geeignete Kohlenstoffeingehalten,
unter denen die für die Biosynthese des quellen sind einfache Zucker oder Polysaccharide,
Oxytetracyclins günstige Züchtung des Stammes höhere Alkohole, Melasse oder Malzextrakt. Außer-Actinomyces
varsoviensis sp. nov. erfolgt und die dem kann das Sporulationsnährmedium einen Zusatz
den Zyklus der Biosynthese, die Substrate, die Züch- an Mineralsalzen und einen Zusatz an Spurentungstemperatur,
die eigentliche Fermentation und die 20 elementen, z. B. Kobaltsalz in einer Menge von 0,1
Zeitdauer derselben, die Belüftung usw. betreffen. bis 1 mg °/o, enthalten neben 1,5 bis 3 % Agar.
Der Stamm Actinomyces varsoviensis sp. nov. wird Als zum Impfen des Saatnährbodens dienendes
zweckmäßig auf einem entsprechenden Sporulations- Inoculum kann die 6- bis 14tägige Züchtung des
nährboden oder in Lyophilform aufbewahrt. Actinomyces varsoviensis sp. nov. bei optimal 26° C
Bei der Aufbewahrung wird am besten wie folgt as dienen, aus der eine Sporensuspension hergestellt
verfahren: Die Stämme des Actinomyces varsoviensis wird.
sp. nov. auf Sporulationsnährboden können ohne Zusammensetzung geeigneter Sporulationsmedien
Veränderung etwa 6 Wochen im Gefrierapparat für Actinomyces varsoviensis sp.nov.:
(bei —20° C) und in der Kühlvorrichtung (bei
+ 4° C) sowie etwa 3 bis 6 Monate bei Zimmer- 30 Nahrmedium 1
+ 4° C) sowie etwa 3 bis 6 Monate bei Zimmer- 30 Nahrmedium 1
temperatur (etwa bei +18° C). aufbewahrt werden. Glukose 10 g
Bei der Aufbewahrung bei Zimmertemperatur wer- CoCl2 0,0005 g
den zwecks Verhütung eventueller ungünstiger An- Agar 25 g
derungen, die in der Züchtung vorkommen können, Wäßriger Kartoffelextrakt (erhalin
die Probiergläser mit schrägem Agar einige Milli- 35 ten durch Extraktion binnen
liter flüssigen, sterilen Paraffins, das die ganze 2 bis 3 Stunden in fließendem
Kulturfläche bedecken muß, gegossen. Dampf) 1000 ml
Actinomyces varsoviensis sp. nov. kann man in pH 6,6 bis 6,8
einem entsprechenden Eiweiß- und Kohlenhydrate
enthaltenden Medium, in Lösungen von Amino- 40 Nährmedium 2
säuren oder einigen organischen Säuren, oft mit Zu- Maisweichextrakt (50%) 4 g
gäbe einer schützenden Substanz zwecks Verhütung Kartoffelstärke 15 g
von Verlusten der Vitalität bei Resuspension des (NH) SO 4 g
lyophisierten Materials lyophilieren. Es wurde fest- KH PO 2 g
gestellt, daß das beste Medium für die Sporen des 45 CaCO 3 g
Actinomyces varsoviensis ein Gemisch von lO°/oiger Agar ? 15 g
Saccharoselösung und l%iger Gelatinelösung ist. Die Destilliertes Wasser 100.0 ml
Endfeuchtigkeit des lyophilisierten Materials muß pjf 6;6 bis 6,8
hierbei 0,2 bis 1% betragen. Die Ampullen oder
Flaschen, in denen die lyophilisierten Sporen des 50 Nährmedium 3
Actinomyces varsoviensis sp. nov. aufbewahrt wer- Malzextrakt 10 ε
den, müssen dabei unter vermindertem, 30 bis Hefeextrakt 4 s
100 mm Hg ausmachendem Druck dicht verschlossen Glukose 4 g
(zugeschmolzen) oder mit Stickstoff gefüllt werden. ^ 201
Die Sporen des Actinomyces varsoviensis sp. nov. 55 Destilliertes Wasser'.'.'.'.'.'.'.'.'.'.'.'.' 1000 ml
kann man auch m einem Gemisch von Erde und u g 5 kjs 6 8
Sand bei Zimmertemperatur (etwa +18° C) oder bei ''
' .'
Kühlhaustemperatur (etwa +40C) aufbewahren. Die In der Biosynthese des Oxytetracyclins durch den
mit Sand vermischte Erde, in der die Sporensuspen- Stamm Actinomyces varsoviensis sp.nov. in großsion
eingeführt worden ist, kann langsam bei Zimmer- 60 technischem Maßstab wird vorteilhaft ein aus drei
temperatur getrocknet werden, oder sie kann aus dem Etappen bestehender Züchtungszyklus verwendet:
Gefrierzustand im hohen Vakuum getrocknet werden. . Tr , , .^ · ■, *
Eine andere Aufbewahrungsmethode von Sporen A· ^orh%e^ des vegetativen Saatmaterials auf
der Stämme Actinomyces varsoviensis sp.nov. ist die dem kcnuttelapparat;
Aufbewahrung derselben auf vorher sterilisierten und 65 B- Vorbereitung eines größeren Volumens an vegegetrockneten
Pflanzenprodukten, z.B.-auf Hirse- tativem Saatinoculum im Fermentationstank und
grütze. Nach vorheriger mehrtätiger Ausbrütung bei C. die eigentliche Fermentation, während welcher
entsprechender Temperatur (24 bis 26° C) verteilen das Antibiotikum Oxytetracyclin gebildet wird.
■ΪΦ13&68
19 2Ö
In allen drei Etappen der im großtechnischen Substrates muß in der Regel für jeden'Mutanten
Maßstab geführten Biosynthese -wird die Submers- gesondert festgelegt- werden; Bei einfachen Zuckern
Züchtung sowohl auf dem Sehüttelapparät als auch beträgt er 0,5 bis 5%, für öle 0,5 bis -3 %>.·""" '■''
in Fermentationstanks verschiedenen Volumens an- ' ■ ' -
gewandt. Die Tanks müssen hierbei mit Vorrichtun- -·5 · Beispiel 1
gen versehen sein, die eine kontinuierliche Belüftung
der Züchtung mittels steriler Luft, das Mischen des : Die Kultivierung eines Stammes von Actinomyces
Nährbodens, die Aufrechterhaltung einer konstanten varsoviensis sp.nov. wird in drei Etappen durchTemperatur
gestatten, sowie mit Vorrichtungen aus- geführt.
gerüstet sein, die es erlauben, den Verlauf der Fer- io Diel erste Etappe des Eermentationszyklus dauert
mentation zu kontrollieren und zu registrieren. Diese 24 bis 48 Stunden, abhängig von der Menge der für
Vorrichtungen gestatten die Bestimmung und die Auf- die Inokulation angewandten Sporen des Mikrorechterhaltung
eines optimalen pH-Wertes des Nähr- Organismus, der Zusammensetzung des Nährmediums,
bodens, die Ergänzung der während der Fermenta- der Züchtungstemperatur, der Intensität der Belüftion
erschöpften Bestandteile des Nährbodens, z. B. 15 tang, die wiederum vom Typ des Schüttelapparates,
der Kohlenstoffquellen, die Einführung von die der Zahl der Schüttelungen bzw. Umdrehungen sowie
Erzeugung von Oxytetracyclin anregenden Verbin- vom Hub, schließlich von der Gestalt des Gefäßes
düngen sowie Mittel zur Verhinderung des Schau- und des Verhältnisses des Volumens des Gefäßes
mens der Nährlösung u. dgl. zum Volumen des in ihm befindlichen Nährmediums
Die einzelnen Etappen bei der genannten Arbeits- 20 abhängig ist.
weise unterscheiden sich voneinander durch eine ver- Für Actinomyces varsoviensis sp. nov. erwiesen
schiedene Zusammensetzung und durch einen ver- sich in der ersten Etappe als optimale Bedingungen
schiedenen pH-Wert der Nährlösung, verschiedene die folgenden:
Temperatur und Zeitdauer der Züchtung sowie durch 2 bis 5% Suspension der Sporen eines Schrägederen
verschiedene Lüftungsbedingungen. 25 agars ein einen Maisweichextrakt enthaltendes Sub-Die
Nährlösung enthält eine Stickstoffquelle, z. B. strat, das Erdnußmehl, Ammoniumsulfat, Stärke,
eine organische oder anorganische Stickstoff quelle Natriumchlorid und Kalziumkarbonat in entsprechen-
oder ein Gemisch beider, sowie eine Kohlenstoff- dem Verhältnis enthält, 80 ml dieses Nährbodens
quelle, eine Mineralsalzquelle und eine Quelle für werden in einen 500-ml-Erlenmayer-Kolben gegeben,
Spurenelemente; die Nährlösung kann außerdem 30 das Nährmedium wird nach der Impfung mit Sporen
Kalziumkarbonat enthalten. auf einen Schüttelapparat mit 180 Umdrehungen pro Als Quellen für Mineralsalze und Spurenelemente Minute, mit einem Hub von 3 bis 5 cm gebracht und
kommen allgemein die »natürlichen« Bestandteile bei einer Temperatur von 20° C, meistens 24 Standes
Nährmediums, die pflanzlicher oder animalischer den lang, ausgebrütet. Es können in dieser Etappe
Herkunft sind, in Betracht. Die Hauptstickstoffquelle 35 zwei Siebungen von dem ärmeren Nährmedium auf
im Nährstoff bilden z. B. Maisweichextrakt, Fleisch- das eine reichere, Kohlenstoffquelle enthaltende
extrakt u. dgl. Nährmedium vorgenommen werden.
Von den am meisten angewandten Stickstoff quellen
sind zu erwähnen: Fleischextrakt, Pepton, Fischmehl, Nährmedium 4
Hefe, Hefeextrakt, Hefehydrolysat, Gasein, saures 40
Caseinhydrolysat mit Bauchspeicheldrüsenferment, Glukose 10 g
geätztes Casein, Maisweichextrakt, Sojamehl, Kobaltcblorid 0,0005 g
Extrakte und Hydrolysate aus diesem Mehl, Erdnuß- Kalziumkarbonat 4 g
mehl, gemahlene Erdnüsse, Extrakte und Hydro- Wäßriger Kartoffelextrakt 1000 ml
lysate aus Erdnüssen, Mehl aus Baumwollsamen, 45 Sojaöl 5 ml
Mehl aus Sonnenblumensamen und andere natürliche pH-Wert 6,6 bis 6,8
Stickstoffquellen pflanzlicher und animalischer Herkunft sowie aus diesen hergestellte Extrakte, ge- Nährmedium 5
quollene Erzeugnisse und Hydrolysate; an Stelle der
oder neben den erwähnten Stickstoffquellen können 50 Maisweichextrakt 5 g
außerdem Ammoniumsulfat oder Nitrate verwendet Gemahlene Arachidschnitzel ... 10 g
werden. Der Zusatz einiger der erwähnten Stickstoff- Kartoffelmehl 25 g
quellen, z. B. Maisweichextrakt, zum Nährstoff, in Ammoniumsulfat 4 g
dem die Hauptstickstoffquelle gemahlene Erdnüsse Natriumchlorid 5 g
sind, haben einen stimulierenden Einfluß auf die 55 Kalziumkarbonat 5 g
Erzeugung des Oxytetracyclins. Destilliertes Wasser 1000 ml
Als Kohlenstoffquellen kann man lösliche oder pH-Wert 5,7 bis 5,8
unlösliche Kohlenhydrate verwenden, z. B. Saccharosen, Maltosen, Glukosen und andere einfache Nährmedium 6
Zucker oder deren Gemische, Stärke, Kartoffelmehl, 60
Maismehl, Malzextrakt oder Gemische mit den vorher Maisweichextrakt 7 g
erwähnten einfachen Zuckern. Man kann auch höhere Arachidschnitzel 20 g
Alkohole verwenden, z. B. Glyzerin, Mannit u. a. Für Kartoffelmehl 45 g
einige »natürliche« und »künstliche« Mutanten des Ammoniumsulfat 4 g
Actinomyces varsoviensis sp. nov. haben sich pflanz- 65 Kalziumkarbonat 7 g
liehe Öle, z. B. Arachisöl, Sojaöl, Sonnenblumenöl Kobaltsulfat 0,02 g
und andere als geeignete Kohlenstoffquellen erwiesen. . Destilliertes Wasser 1000 ml
Der Prozentgehalt der einzelnen Bestandteile des pH-Wert 6,0 bis 6,2
21 22
Nährmedium 7 Die Ausbeute nach der angegebenen Zeit der
Fermentation im Kolben auf dem Schüttelapparat
Glukose 30 % beträgt 282 meg pro Milliliter; pH 7,1.
Maisweichextrakt (50%) 20 g
Kalziumkarbonat 5 g 5 Nährmedium 10
Sojamehl 5g Erdnußmehl 20g
Natriumchlorid 5 g Maisweichextrakt (50 %>) 4 g
Ammoniumsulfat 4 g Natriumsulfat 2 g
Destilliertes Wasser 1000 ml Malzextrakt ,.. ■ 2 g
pH-Wert 6,6 10 Natriumchlorid 4 g
Kalziumkarbonat 10 g
Die zweite Etappe des Züchtungszyklus dauert Sojaöl 10 g
ebenfalls 24 bis 48 Stunden, abhängig von den Fer- Wasser 1000 ml
mentationsbedingungen. In einem etwa 6001 ent- pH-Wert natürlich
sprechenden Nährboden enthaltenden 1000-1-Fer- 15 ^r-h A- ΛΛ
mentationstank beträgt bei 28° C die Züchtungszeit «anrmearam 11
etwa 30 Stunden. Das Nährmedium enthält ein Gemahlene Arachidschnitzel 22,5 g
Gemisch entsprechender Mengen Maisweichextrakt, Maisweichextrakt 6,3 g
Ammoniumsulfat, Kartoffelmehl, Natriumchlorid, Kartoffelmehl 40,0 g
Kalziumkarbonat und Arachidöl (als Antischäu- ao Ammoniumsulfat 3,6 g
mungsmittel für die Nährlösung). Das Volumen des Kobaltsulfat .. 0,018 g
aus der ersten Etappe der Züchtung auf dem Schüttel- Arachisöl 1,8 g
apparat stammenden vegetativen Inoculums beträgt Kalziumkarbonat 6,3 g
mehr als 0,05%, z.B. 0,1 bis 1% des gesamten Wasser 1000ml
Volumens der Nährlösung des 10004-Tanks. Die 35 pH-Wert 6,3 bis 6,5
Lüftungsbedingungen der Züchtung sind: 0,2 bis 0,6
des Luftvolumens auf 1 Volumen des Nährbodens In der 48. und 60. Fermentationsstunde ist je
pro Minute. Die Drehzahl des Rührers muß 120 bis 2,5 g Sojaöl zuzugeben. Im Nährmedium 10 bildet
360 pro Minute betragen. das Sojaöl, ähnlich wie der Malzextrakt, eine Kohlen-
30 stoffquelle.
Nährmedium 8 ^e Ausbeute nach 120 Fermentationsstunden in
Kolben auf dem Schüttelapparat beträgt: 320E in
Erdnußmehl 20 g 1 ml; pH 6,8 für das Nährmedium 10 und 356 E in
Maisweichextrakt 4 g 1 ml; pH 6,9 für das Nährmedium 11.
Natriumchlorid 4 g Erdnußmehl 40 g
Kalziumkarbonat 10 g Sojamehl 20 g
Sojaöl 5 ml Glukose 60 g
Destilliertes Wasser 1000 ml 40 Maisweichextrakt (50%) 5 g
pH-Wert 6,6 bis 6,8 Ammoniumsulfat 5 g
Kalziumkarbonat 4 g
Die dritte Etappe des Züchtungszyklus des Kobaltsulfat 0,05 g
Stammes Actinomyces varsoviensis sp. nov., in der Sojaöl 8 g
die eigentliche Fermentation stattfindet, während 45 Schmalz 3 g
welcher das Oxytetracyclin erzeugt wird, dauert, Wasser 1000 ml
abhängig von den Züchtungsbedingungen, 100 bis pH-Wert 6,6 bis 6,8
150 Stunden. In den Fermentationstanks mit Volumen von 5000 bis 15000 1, enthaltend 3500 bis Auf dem Nährboden 12 im Fermentationstank von
10 0001 Nährmedium, zusammengesetzt aus Arachid- 50 50001 Volumen, enthaltend 35001 des Nährmediums,
mehl, Sojamehl, Maiweichextrakt, Ammoniumsulfat, hat man nach 100 Stunden Fermentation 2300 mcg/ml
Kartoffelmehl, Kobaltsalz, Kalziumkarbonat, Glukose, bei pH 6,2 erhalten.
Arachidenöl, Sojaöl oder Schmalz (als Antischäu- Während die dritte Etappe zur Biosynthese des
mungsmittel) dauert die Fermentation 100 bis Oxytetracyclins führt, dienen die zwei ersten Etappen
150 Stunden, bei einer Temperatur von 28° C und 55 zur Herstellung des Inoculums zum Beimpfen des
bei einer Züchtungsbelüftung, die 0,6 bis 1,0 des Nährmediums der Etappe drei, d. h. zum Beimpfen
Luftvolumens auf ein Nährmediumsvolumen pro des eigentlichen Fermentationsnährbodens.
Minute beträgt. In allen Züchtungsetappen wird das Inoculum
mittels cytochemischen Methoden kontrolliert; in nach
Nährmedium 9 6o der Grammethode gefärbten Präparaten muß das
Saatinoculum zu 90% grampositiv sein. Eine wich-
Maisweichextrakt (50%) 5 g tige Rolle spielt auch die Kontrolle und die AufKartoffelmehl 37,5 g rechterhaltung des entsprechenden pH-Wertes des
Ammoniumsulfat 6 g Mediums in den einzelnen Etappen, insbesondere
Natriumchlorid 5 g 55 des pH-Wertes des Saatinoculums und des pH-Wertes
Wasser 1000 ml der Nährlösung während der eigentlichen Fermen-
Sojaöl 2 tation. In der dritten Etappe muß der pH-Wert der
pH-Wert 6,0 bis 6,2 Nährlösung in den folgenden Grenzen aufrechterhal-
23 24
ten werden: vor der Impfung mittels des aus dem gewaschen, wonach das adsorbierte Oxytetracyelin
IQOO-l-Tank stammenden Saatinoculums muß der mittels mit HCl gesättigtem Methanol eluiert wird.
pH-Wert des Nähimediums in den Grenzen von 6,2 Die Durchflußgeschwindigkeit des sauren Methanols
bis 6,9 liegen, während der Fermentation kann er beträgt 30 ml/cm2/Std." ■ ■ . ■
bis 6,8 bis 8,8 ansteigen, und am Schluß der Fer- -5 Die Ausbeute des Eluierungsprozesses hängt von
mentation muß. er in den Grenzen der Ausgangswerte der Konzentration des adsorbierten Antibiotikums
6,2 bis, 6,9 liegen. auf den Ionenaustauschern ab und beträgt 50
Mittels der Papierchromatographie in Systemen, bis 97%;
mit wassergesättigten Äthylazetat mit Butylketon- Die Kontrolle des Adsorptions- und Ehjierungs-
methylisobutyl-n-butanolazetat im Verhältnis von io prozesses wird durch Entnahme von Proben aus den
5:15:2 wurde im Fermentationsnährmedium die einzelnen Fraktionen und durch Bestimmung des in
Anwesenheit nur einer antibakteriellen Substanz, bei ihnen enthaltenen Antibiotikums mittels allgemein
der biologischen Entwicklung des Chromatogramms bekannter chemischer und biologischer Methoden
mittels. des. Bacillus subtilis 6633 festgestellt. Die durchgeführt.
Lage dieser Substanz auf dem Löschpapierstreifen 15 Das das adsorbierte Antibiotikum enthaltende
entsprach der Lage der durch das Oxytetracyclin saure Methanoleluat kann durch eine NaOH-Lösung
hervorgerufenen Hemmungszone. neutralisiert werden, jedoch bewirkt dieses Verfah-
Nach Beendigung der Fermentation des Nähr- ren ein zusätzliches Einführen von anorganischen
mediums kann man das Oxytetracyclin durch ver- Salzen in die Lösung, wodurch die Reinigung des
schiedene bekannte Verfahren aus der Fennen- ao Antibiotikums erschwert wird,
tationsflüssigkeit isolieren. Vorteilhaft ist es, zum Neutralisieren des neuen
Zwecks Abtrennung des Mycels wird die Fennen- Eluats einen Anionenaustauscher, z. B. Amberlit IR
tationsflüssigkeit. auf.pH= 1,5 bis.2,0, vorzugsweise oder Dowex 1,2, von basischem Charakter anzuwen-
pH =. 1,8,- mit Oxalsäure bei stetigem Rühren an- den. Die Neutralisierung auf einem Anionenaus-
gesäuert. In diesen pH-Grenzen erfolgt die Zerset- as tauscher erfolgt zusammen mit der Adsorbierung von
zung der während der Fermentation entstandenen Chlorionen aus der Lösung und mit der Ausscheidung
Oxytetracyclinkomplexsalze mit Kalzium und Magne- von Wasser. Die Neutralisierung wird so durch-
sium sowie .der ^vollkommene Übergang des Anti- geführt, daß die Methanollösung des Antibiotikums
biotikums in, die Lösung. Bei diesen Bedingungen einen pH-Wert von 3,0 bis 3,5 aufweist.
• erfogt auch die teilweise Niederschlagung von Eiweiß 30 Während der Neutralisierung erreichen die Anti-
und anderer in der Mischung enthaltenen Ver- biotikumverluste bis zu 7%. Das neutralisierte Eluat
unreinigungen, was. das Filtrieren erleichtert und den wird im Vakuumverdampfer bei 35 bis 40° C bis zu
Erhalt eines durchsichtigen Filtrates gestattet. Nach einem kleinen Volumen eingedickt und dadurch das
dem Ansäuern wird etwa 6% Kieselgur als Filtrier- Hydrochlorid des Oxytetracyclins mittels konzen-
hilfsmittel zugegeben; das Ganze wird 30 Miauten 35 trierter Salzsäure ausgefällt. Der gefällte Niederschlag
lang energisch gerührt und danach das Mycel zu- wird nach dem Filtrieren und Waschen abwechselnd
'sammen init dem niedergeschlagenen Kalziumoxalat mit Methanol und Aceton gewaschen und darauf
abfiltriert, bei einer Temperatur von 400C getrocknet. Die
Aus dein durchsichtigen Filtrat kann man das Endausbeute des Prozesses beträgt etwa 36%. Die
Antibiotikum mittels eines der allgemein bekannten 40 Aktivität des erhaltenen Hydrochloride des Oxy-
Verfahren zum. Isolieren und Reinigen der Anti- tetracyclins beträgt ungefähr 670 mcg/mg.
biotika ausscheiden. Zwecks Erlangung eines Produktes mit höherer
Das Oxytetracyclin weist als amphotere Verbin- Aktivität kann man das erhaltene Oxytetracyclin
dung sowohl sauere als auch basische Gruppen mit mittels allgemein bekannter Methoden umkristalli-
den Dissoziationskonstanten pH 3,5, 7,6, 9,2 auf, 45 sieren (s. Beispiel 5).
welche die Adsorptionsfähigkeit des Antibiotikums -, . . ,
durch Ionenaustauscher bestimmen. .Beispiel I
Zur chemischen Aufarbeitung des Antibiotikums 101 einer gemäß Beispiel 1 erhaltenen Gärbrühe
werden folgende Ionenaustauscher angewandt: werden unter ständigem Rühren mit Oxalsäure bis
Kationenaustauscher Dowex 50 W (ein sulfoniertes 50 zu einem pH-Wert von 2,0 angesäuert. Danach wer-Polymerisationsprodukt
von Styrol und Butadien), den 500 g Kieselgur zugegeben und das Ganze Anionenaustauscher Amberlit IR 45 (ein Polymeri- 30 Minuten lang gerührt, worauf der Nährboden auf
sationsprodukt von Melanin und Formaldehyd), der Zentrifuge abgeschieden wird. Wenn das Filtrat
Anionenaustauscher Dowex 1,2 (ein Polymerisations- trübe ist, muß das Filtrieren bis zur Erlangung eines
produkt von Äthylendiamin und Formaldehyd, mit 55 durchsichtigen Filtrats wiederholt werden,
welchem eine Säule bis 20 cm Höhe gefüllt wird). Das klare Filtrat mit einem pH-Wert von 2,0 Das Verhältnis des Durchmessers der Säule zu ihrer bis 2,5 wird durch eine mit dem Kationenaustauscher Höhe beträgt 1:10. Die Durchflußgeschwindigkeit gefüllte Säule mit einer Geschwindigkeit von des Nährmedmmfiltrats durch die Ionenaustauscher- 200 ml/cm2/Std. geführt. Nach dem Durchlauf des säule beträgt 200 ml/cm2/Std. Die Ausbeute an ad- 60 Nährbodens wird die Säule mit 500 ml destilliertem sorbiertem Antibiotikum auf dem Ionenaustauscher Wasser und danach mit 250 ml Methanol gehängt im hohen Maße von der Konzentration des waschen. Das auf dem Kationenaustauscher adsor-Oxytetracyclins in den Fermentationsmedien ab und bierte Antibiotikum wird mit 1500 ml N der Hälfte schwankt in den Grenzen von 200 bis 1000 mg pro einer HCl-Lösung in Methanol mit einer Durchfluß-Gramm des Austauschers, : . 65 geschwindigkeit von SOml/cm/Std. eluiert.
welchem eine Säule bis 20 cm Höhe gefüllt wird). Das klare Filtrat mit einem pH-Wert von 2,0 Das Verhältnis des Durchmessers der Säule zu ihrer bis 2,5 wird durch eine mit dem Kationenaustauscher Höhe beträgt 1:10. Die Durchflußgeschwindigkeit gefüllte Säule mit einer Geschwindigkeit von des Nährmedmmfiltrats durch die Ionenaustauscher- 200 ml/cm2/Std. geführt. Nach dem Durchlauf des säule beträgt 200 ml/cm2/Std. Die Ausbeute an ad- 60 Nährbodens wird die Säule mit 500 ml destilliertem sorbiertem Antibiotikum auf dem Ionenaustauscher Wasser und danach mit 250 ml Methanol gehängt im hohen Maße von der Konzentration des waschen. Das auf dem Kationenaustauscher adsor-Oxytetracyclins in den Fermentationsmedien ab und bierte Antibiotikum wird mit 1500 ml N der Hälfte schwankt in den Grenzen von 200 bis 1000 mg pro einer HCl-Lösung in Methanol mit einer Durchfluß-Gramm des Austauschers, : . 65 geschwindigkeit von SOml/cm/Std. eluiert.
Nach Beendigung der Adsorption wird die Ionen- Das gewonnene Oxytetracyclineluat enthält 2,19 g
austauschersäule mit dem adsorbierten Antibiotikum Oxytetracyclin, das ist 49% der ursprünglichen
abwechselnd mit. destilliertem Wasser und. Methanol Menge, .
25 26
Das saure Eluat wird mittels eines Anionenaus- abfiltriert, mit Alkohol und danach mit Äther getauschers
bis zu einem pH-Wert von 3,0 bis 3,5 waschen und bei 40° C getrocknet,
neutralisiert und danach im Vakuumverdampfer bei Die Potenz des gewonnenen Hydrochlorids des 35 bis 40° C bis zu einem Volumen von 50 ml ein- Oxytetracyclins beträgt 640 meg in 1 mg. Die Ausgedickt. 5 beute des Prozesses beträgt 46%.
neutralisiert und danach im Vakuumverdampfer bei Die Potenz des gewonnenen Hydrochlorids des 35 bis 40° C bis zu einem Volumen von 50 ml ein- Oxytetracyclins beträgt 640 meg in 1 mg. Die Ausgedickt. 5 beute des Prozesses beträgt 46%.
Das Oxytetracyclinmethanolkonzentrat wird mit Eine andere Verfahrensweise zum Ausscheiden des
konzentrierter Salzsäure versetzt und im Laufe des Oxytetracyclins aus der Nährlösung beruht auf dem
Zugebens erfolgt das Aussalzen des Hydrochlorids Aussalzen des Antibiotikums mittels Kochsalz aus
des Oxytetracyclins. Der abfiltrierte Niederschlag dem alkalischen Medium. Ein geringer Butanolzusatz
wird abwechselnd mit Methanol und Äther ge- ίο zum Filtrat bewirkt eine Vergrößerung der Reinheit
waschen und dann bei 40° C getrocknet. des niedergeschlagenen Oxytetracyclins.
Es wurde 1,6 g Oxytetracyclin mit einer Potenz Der abfiltrierte Niederschlag wird nach dem
von 670 mcg/mg gewonnen. Waschen und Trocknen in einer Methanollösung des
Eine andere Arbeitsweise zur Isolierung von Oxy- Kalziumchlorids aufgelöst, aus dem der Niederschlag
tetracyclin aus dem Fermentationsmedium beruht 15 des Oxytetracyclinhydrochlorids mit konzentrierter
auf der Extraktion des Antibiotikums aus der Salzsäure gefällt wird. Der abfiltrierte Niederschlag
Wasserphase mit einem organischen Lösungsmittel, wird abwechselnd mit Methanol und Äther ge-
das bei dem angewandten pH-Wert mit Wasser nicht waschen und danach bei 40° C getrocknet,
mischbar ist. Als Lösungsmittel können Butyl- und
mischbar ist. Als Lösungsmittel können Butyl- und
Amylalkohol und deren Ester sowie Gemische von 20 Beisüiel4
Alkoholen und deren Estern mit niedrigen organi- p
sehen Säuren angewandt werden. Das klare Fermen- 101 einer gemäß Beispiel 1 erhaltenen Fermentationsmedium
wird bei ständigem Rühren mit einem tationsbrühe werden mit Oxalsäure bis zu einem
Gemisch von Butanol und Butylazetat versetzt, pH-Wert von 1,8 angesäuert. Dann werden 500 g
wonach eine 2O°/oige NaOH-Lösung zwecks Ein- 35 Kieselgur zugegeben und das Ganze wird 30 Minuten
stellung eines pH-Wertes von 9,5 zugegeben wird. lang gerührt, und danach wird der Nährboden auf
Unter diesen Bedingungen geht das Oxytetracyclin einer Zentrifuge abfiltriert. Bei trübem Filtrat wird
aus der Wasserphase in die organische Phase über. der Filtrierprozeß bis zur Erlangung eines durchsich-Nach
der Trennung der Phasen wird die das extra- tigen Filtrats wiederholt.
hierte Antibiotikum enthaltende organische Phase 30 Dem filtierten Nährboden werden bei ständigem
mit einer Schwefelsäurelösung versetzt und dadurch Rühren 2,5 kg Kochsalz und 500 ml Butanol zu-
der pH-Wert bis 2,0 erhöht. Das Antibiotikum geht gegeben, wonach mit einer NaOH-Lösung bis zu
in die Wasserphase über, aus der nach Abscheidung einem pH-Wert von 9,0 bis 9,5 alkalisiert wird,
der organischen Phase das Hydrochlorid des Oxy- Das Ganze wird 1 Stunde lang gerührt und zwecks
tetracyclins mit Kochsalz bei einem pH-Wert von 35 Phasenabscheidung stehengelassen. In der Zwischen-
5,5 ausgesalzen wird. Der gefällte Hydrochlorid- phase auf der Grenze der Wasserphase und der
niederschlag des Oxytetracyclins wird nach dem organischen Phase ist der Niederschlag der Komplex-
Filtrieren mit Methanol und danach mit Äther ge- salze des Oxytetracyclins suspendiert. Nach dem
waschen. Abscheiden der Wasserphase wird die organische
Beispiel 3 4° Pnase zusammen mit der Zwischenphase mit Kieselgur
versetzt und nach dem Rühren der Niederschlag
101 einer gemäß Beispiel 1 erhaltenen Fermen- der Komplexsalze des Oxytetracyclins und des
tationsbrühe werden mittels Oxalsäure zu einem Kieseigurs abfiltriert.
pH-Wert von 1,8 bei ständigem Rühren angesäuert. Nach dem Waschen und Trocknen bei 40° C
Danach werden 500 g Kieselgur zugegeben und das 45 wurden 27 g Komplexsalzniederschlag des Anti-Ganze
V2 Stunde lang gerührt, wonach das Mycel biotikums mit einer Potenz von 115 meg in lmg
und das ausgefüllte Kalziumoxalat abfiltriert werden. erhalten, was 72 % der ursprünglichen Menge des
Bei Erhalt eines trüben oder opalisierenden Filtrates Antibiotikums entspricht. Der gewonnene Niederist
der Filtrierprozeß zu wiederholen. schlag wird fünfmal in 80 ml einer Methanollösung
Das durchsichtige Filtrat mit einem pH-Wert von 50 des Kalziumchlorids extrahiert, wobei zu der ersten
1,8 wird mit 1000 ml eines Gemisches von Butanol Extraktion 30 ml und zur folgenden zweiten und
und Butylazetat im Verhältnis von 93:7 versetzt und dritten je 15 ml, zur vierten und fünften je 10 ml anbei
kontinuierlichem Rühren wird eine 2O°/oige gewendet wurden.
NaOH-Lösung zugegeben und der pH-Wert auf 9,5 Zu dem in einer Menge von 58 ml erhaltenen
gebracht. Nach der Einstellung des pH-Wertes wird 55 Methanolfiltrat werden 6 ml konzentrierter Salzsäure
das Ganze 1 Stunde lang gerührt und danach zum bei ständigem Rühren eingetropft. Unter diesen Be-
Trennen der Phasen absitzen gelassen. dingungen scheiden sich Hydrochloridkristalle des
Die Ausbeute aus dem Nährboden bis zur organi- Oxytetracyclins ab, die nach dem Filtrieren und
sehen Phase beträgt 85%. Waschen mit 99%igem Methanol bei 40° C getrock-
Die von der Wasserphase getrennte organische 6° net werden.
Phase wird mit 0,1 n-H2SO4 bei ständigem Rühren Es wurden 1,78 g Hydrochlorid des Oxytetraextrahiert
und der pH-Wert auf 1,8 gebracht. Nach cyclins mit einer Stärke von 860 meg in 1 mg geEinstellung
des pH-Wertes wird das Ganze 1 Stunde wonnen. Bei dem bekannten Verfahren der Gewinlang
gerührt und dann zur Phasentrennung stehen- nung von Oxytetracyclin mit Streptomyces rimosus
gelassen. Die Wasserphase wird mit kristallischem 65 (deutsche Patentschrift 862 647) werden dagegen aus
NaCl versetzt, der pH-Wert auf 5,5 gebracht und 8 1 Gärflüssigkeit 1,69 g Produkt von einer Potenz
zwecks Auskristallisierung des Hydrochlorids des von 625 meg in 1 mg erhalten, das entspricht
Oxytetracyclins abgestellt. Der Niederschlag wird 211,2 mg Produkt aus einem Liter Gärflüssigkeit.
-■■■-"-■ --■■---■■ - 609540/375
Dieses Produkt ergibt nach weiterer Reinigung 61,25 mg, ebenfalls mit einer Potenz von 860 meg
in 1 mg.
Man erhält also aus 11 Gärbrühe beim erfindungsgemäßen Verfahren 178 mg Produkt gegenüber nur
61,25 mg Produkt gleicher Potenz beim bekannten Verfahren.
301 der Fermentationsbrühe von 2300mcg/lml
Aktivität werden mit konzentrierter Oxalsäure bis zum pH-Wert 1,7 bis 1,8 angesäuert, danach wird.
0,5% Kieselgur zugesetzt und das Ganze abfiltriert.
Dem erhaltenen Filtrat, dessen Volumen 251 betrug,
werden 1 tyoo Kaliumferricyanid, 0,3 %o Zinksulfat,
2°/oo Kafhexol sowie 3%o Kieselgur zugesetzt.. Der entstandene Niederschlag wurde abfiltriert. Zu
dem erhaltenen Filtrat wurden l%o Kathexol, 1% Magnesiumsulfat, l°/oo Ammoniumarsenat,
0,3°/oo Natriumsuhlt und 2°/oo Kieselgur zugesetzt. Der pH-Wert der Mischung wurde mittels einer verdünnten
Ammoniaklösung auf 8,5 bis 8,7 eingestellt. Der Niederschlag des Oxytetracyclin enthaltenden
Komplexes wird ausgeschieden, abfiltriert und mit Wasser nachgewaschen. Aus der erhaltenen Komplexverbindung
wurde die rohe Oxytetracyclinbase gewonnen.
Hierzu wurde der feuchte Komplexniederschlag mit einer Mischung von 30 ml n-Butanol und 50 ml
Wasser vermengt und gut vermischt. Das Ganze wurde dann mit einer Mischung aus 30%iger Schwefelsäure
und konzentrierter Oxalsäure bis zum pH-Wert 1,9 bis 2,0 angesäuert und nach Erwärmung
auf 28° C wurden l%o Ammoniumarsenat und 0,5 %o Natriumsulfit zugefügt und danach der
pH-Wert auf 4,5 mittels Ammoniakwassers eingestellt. Der entstandene Niederschlag wurde abfiltriert,
mit n-Butanol und Wasser nachgewaschen und getrocknet.
Im weiteren Verlauf der Prozedur wurde die rohe Base in das Hydrochlorid übergeführt und mittels
Kristallisation gereinigt. Die erhaltene Oxytetracyclinbase wurde hierzu mit einer 4%igen Lösung
von Kalziumchlorid in Methanol vermengt und gut vermischt. Der erhaltene Niederschlag wurde abfiltiert
und mit der Methanollösung des Kalziumchlorids nachgewaschen. Das Grundfütrat und die
Waschlösung werden vereinigt und im Vakuum bis zu einer Konzentration des Antibiotikums von·
120000 mcg/ml eingedampft.
Die erhaltene Lösung wird, alsdann mit konzentrierter
Salzsäure bis zum pH-Wert 0,2 bis 0,3 angesäuert und zur Kristallisierung abgestellt. Die aus-',
geschiedenen Kristalle werden abfiltriert, mit Metha-
ίο nol und danach mit Azeton nachgewaschen und im
Vakuum bei 50° C getrocknet.
Man erhielt 41 g des HydrocHorids der Oxytetracyclin
von großer Reinheit als gelbes kristallinisches Pulver. Dies entspricht einer Ausbeute des Isolierungsprozesses
von über 70 %.
Zum Umkristallisieren des gemäß den Beispielen 1 bis 4 erhaltenen Oxytetracyclirihydrochlorids werden
3,5 g Oxytetracyclinhydrochlorid mit einer Potenz von 670 E in 1 mg mit 1,2 g Triäthylamin und 30 ml
der Methanollösung des Kalziumchlorids vermischt und 4,5 ml konzentrierter Salzsäure zugegeben. Der
Niederschlag des Oxytetracyclinhydrochlorids wird abfiltriert und danach abwechselnd mit Methanol·
und Äther gewaschen und bei einer Temperatur von 40° G getrocknet.
Es wurden 2,6 g Oxytetracyclinhydrochlorid mit einer Potenz von 920 meg in 1 mg erhalten.
Die Kontrolle wurde mittels allgemein bekannter chemischer und biologischer Methoden durchgeführt.
Claims (1)
- Patentanspruch:Verwendung von Actinomyces varsoviensis sp.nov. Nr. NCIB 9522 zur Herstellung von Oxytetracyclin auf üblichem biologischem Wege.In Betracht gezogene Druckschriften:
Deutsche Patentschrift Nr. 862 647;
britische Patentschriften Nr. 648 417, 713 795; USA.-Patentschrift Nr. 2516 080;
canadische Patentschrift Nr. 520 836;
schweizerische Patentschrift Nr. 331988.609 S40/375 3.66 © Bundesdruckerei Berlin
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
PL1213568X | 1959-11-24 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE1213568B true DE1213568B (de) | 1966-03-31 |
Family
ID=19949690
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DEK40466A Pending DE1213568B (de) | 1959-11-24 | 1960-04-19 | Verwendung von Actinomyces varsoviensis zur Herstellung von Oxytetracyclin auf ueblichem biologischem Wege |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
BE (1) | BE592687A (de) |
DE (1) | DE1213568B (de) |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US2516080A (en) * | 1949-10-13 | 1950-07-18 | Pfizer & Co C | Terramycin and its production |
GB648417A (en) * | 1948-04-08 | 1951-01-03 | Baker Platinum Ltd | Improvements in or relating to the recovery of insoluble solids from waste liquors |
DE862647C (de) * | 1949-10-13 | 1953-01-12 | Pfizer & Co C | Verfahren zur Herstellung eines Antibiotikums |
GB713795A (en) * | 1952-01-31 | 1954-08-18 | Lilly Co Eli | Improvements in or relating to terramycin |
CA520836A (en) * | 1956-01-17 | M. Mcguire James | Oxytetracycline ("terramycin") and process of producing the same | |
CH331988A (de) * | 1953-10-23 | 1958-08-15 | Koninklijke Gist Spiritus | Verfahren zur Herstellung von Antibiotika |
-
1960
- 1960-04-19 DE DEK40466A patent/DE1213568B/de active Pending
- 1960-07-06 BE BE592687A patent/BE592687A/fr unknown
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CH331988A (de) * | 1953-10-23 | 1958-08-15 | Koninklijke Gist Spiritus | Verfahren zur Herstellung von Antibiotika |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
BE592687A (fr) | 1960-10-31 |
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