DE69837896T2

DE69837896T2 - Peptidagonisten von karzinoembryonalem Antigen (CEA)

Info

Publication number: DE69837896T2
Application number: DE69837896T
Authority: DE
Inventors: Jeffrey Potomac SCHLOM; Maria Elena Frederick SALAZAR nee BARZAGA; Sam Rockville ZAREMBA
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 1997-10-10
Filing date: 1998-09-22
Publication date: 2008-02-14
Anticipated expiration: 2018-09-23
Also published as: DE69824023T2; CA2308127C; AU745863B2; JP2002500002A; ATE364048T1; WO1999019478A1; ES2286530T3; EP1017810A1; DK1447414T3; ES2217585T3; ATE267213T1; CY1107706T1; EP1017810B1; JP4291508B2; DE69837896D1; PT1447414E; AU9500498A; DE69824023D1; CA2308127A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
–Die Erfindung betrifft die Herstellung und Verwendung von Peptiden, die als Agonisten von humanem karzinoembryonalem Antigen (CEA) wirken können. Insbesondere kann das Agonistenpeptid erfindungsgemäß als Immunogen entweder alleine oder in priming- oder boosting-Protokollen mit anderen Immunogenen wie rV-CEA für eine Vielzahl neoplastischer Zustände verwendet werden. Diese können kolorektalen Krebs, Lungenkrebs, Pankreaskrebs und Brustkrebs umfassen. Deshalb betrifft die Erfindung auch die Herstellung und die Verwendung von Impfstoffen gegen Krebs. Peptidagonisten können erfindungsgemäß auch verwendet werden, um die Vermehrung von T-Zellen, z.B. aus geimpften Patienten für adoptive Transferstudien, zu fördern.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Eine bedeutende Herausforderung der modernen Krebsimmunotherapie stellt die Bestimmung zytotoxischer T-Lymphozyten-(CTL)Epitope aus definierten Tumor-assoziierten Antigenen (TAA) dar, die eine Lyse der Tumorzellen fördern. Der Großteil der Antigene auf humanen Krebstypen ist nicht Tumor-spezifisch und wird in bösartigen Zellen im Vergleich zu Zellen normaler Gewebe überexprimiert. Deshalb mag sich die Immunität gegen Krebs im Menschen hauptsächlich auf die Entwicklung einer wirksamen Immunantwort stützen, welche hauptsächlich gegen Eigenmoleküle, die qualitativ allen Zelltypen gemein sind, gerichtet ist.
Humanes karzinoembryonales Antigen (CEA) ist ein 180 kD Glykoprotein, welches auf der Mehrheit der Tumore des Dickdarms, Rektums, Magens und Pankreas (1), etwa 50% der Brustkarzinome (2) und 70% der Lungenkarzinome (3) exprimiert wird. CEA wird auch in fötalem Darmgewebe und zu einem geringeren Anteil auf normalem Dickdarmepithel exprimiert. Die Immunogenizität des CEA war ungewiss, da mehrere Studien die Anwesenheit von Anti-CEA-Antikörpern in Patienten berichten (4-7), obwohl andere Studien dies nicht taten (8-10). 1965 wurde CEA erstmals als Krebs-spezifisches fötales Antigen im Adenokarzinom des humanen Verdauungstraktes beschrieben (Gold, P. und Freeman, S.O. (1965) Exp. Med. 121: 439-462). Seit dieser Zeit wurde CEA als ein Zelloberflächenantigen beschrieben, welches in fast allen festen Tumoren des humanen Gastroin-testinaltraktes im Überschuss hergestellt wird. Das Gen für das humane CEA-Protein wurde kloniert (Oikawa et al. (1987) Biochim. Biophys. Res. 142: 511-518; europäische Veröffentlichung Nr. EP 0346710 ).
Vor Kurzem wurde der erste Nachweis einer humanen CTL-Antwort gegen CEA berichtet (11; WO 96/26271 ). Dieses CAP1-Peptid wies den höchsten Grad an T2-Zellbindung unter den verschiedenen CEA-Peptiden, die mit Stimulierung von T-Zellen getestet wurden, auf, was zu der Erzeugung zytotoxischer T-Zelllinien führte. Aufgrund einer Bindung an HLA-A2 und der Fähigkeit, aus mononukleären Zellen aus peripherem Blut (PBMC) aus Karzinompatienten, welche mit einem rekombinanten Vacciniavirus, welches CEA (rV-CEA) exprimiert, immunisiert worden waren, spezifische CTL zu erzeugen, haben wir ein 9-mer-Peptid, CAP1 genannt (mit der Sequenz YLSGANLNL) (SEQ ID NO: 1), identifiziert. Zum Beispiel wiesen periphere Blutlymphozyten (PBLs) von fünf Patienten nach einer Immunisierung mit rV-CEA Anzeichen einer T-Zellantwort gegen CAP1-Peptid auf. Seitdem haben zwei andere Labore in vitro unter Verwendung Peptid-gepulster dendritischer Zellen als Antigen-präsentierende Zellen (APC) CAP1-spezifische CTL erzeugt (12). Es wurde auch kürzlich berichtet (13), dass CAP1-spezifische CTL aus PBMC von Karzinompatienten, welche mit dem Avipox rekombinanten ALVAC-CEA immunisiert waren, erzeugt werden können. Mehrere Gruppen haben auch von der Erzeugung Anti-CEA-Antikörper und von CEA-spezifischer proliferativen T-Zellantworten nach einer Immunisierung mit entweder einem Anti-Id zu einem Anti-CEA-monoklonalem Antikörper (MAb) (14), rekombinantem CEA-Protein (15), oder rV-CEA (16), berichtet.
Mehrere Forscher haben durch in vitro-Stimulation von PBMC mit einem immunodominanten Peptid CTL gegen Tumor-assoziierte und virale Antigene eingeführt. Neuere Arbeiten mit dem gp100-Melanomantigen (17-19), einem HIV-Polymerasepeptid (20) und dem Papillomavirustumorantigen E6 (21) zeigten nach Veränderungen der Peptidsequenzen eine verbesserte Immunogenität. In diesen Studien befanden sich die Auswechslungen an Ankerpositionen und waren dazu bestimmt, die Bindung an murine- oder humanen MHC-Antigene zu erhöhen. Dieser Ansatz basierte auf einem nachgewiesenen Zusammenhang zwischen Immunogenität und Peptidbindungsaffinität zu Klasse I-MHC (großer Histokompatibilitätskomplex) Molekülen bei viralen Antigenepitopen (22).
Vorherige Forscher haben auch mit CEA-Fragmenten gearbeitet. Aus diesem Grund berichtet Shively (1989) in einer europäischen Patentveröffentlichung ( EP Nr. 0343946 A2 ) von etlichen CEA-Fragmenten, die ein einzigartiges Epitop (definiert durch seine Reaktivität mit einem Antikörper) umfassen. Das letztere CEA-Fragment ist 177 Aminosäurereste lang und umfasst die 9-mer-Sequenz des CAP1. Jedoch wurden keine kürzeren CEA-Fragmente beschrieben, die die CAP1-Sequenz umfassen.
Insgesamt leidet die alleinige Verwendung von rV-CEA als Mittel, um die CEA-spezifische Immunantwort von rV-CEA zu verstärken, an dem Nachteil, dass sie eine Immunantwort gegen Vaccinia virus fördert. Die neuartige Kombination aus rV-CEA und CAP1 gab sich uns jedoch als ein „zweites Generations-Protokoll" zur Behandlung von Krebspatienten zu erkennen.
Es ist ein anerkannter Grundsatz, dass ein immunogenes Peptid, wenn es in einer konservierten Art und Weise (z.B., eine hydrophobe Aminosäure wird durch eine hydrophobe Aminosäure ersetzt) verändert wird, dass das veränderte Peptid wahrscheinlich eine ähnliche immunogene Aktivität aufgrund der Erhaltung der Form, Ladung und der hydrophoben Beschaffenheit des Moleküls aufweist.
Insbesondere hat eine Studie von Madden (33) spezifische Aminosäurepräferenzen in Peptiden für MHC-Komplexierung, einen Vorläuferschritt zur T-Zellerkennung, bestimmt. Madden wie auch andere Forscher (31) schlagen vor, dass spezifische Aminosäurepositionen in Peptiden für T-Zellerkennung zur Verfügung stehen.
Skipper et al. (40) beschreibt die Identifizierung und Charakterisierung eines natürlich vorkommenden Peptidepitopes der Tyrosinase, wobei die Peptidsequenz von der, die von der DNA vorhergesagt wird, abweicht. Dieses modifizierte Peptid wird von Tyrosinase-spezifischen humanen zytotoxischen T-Lymphozyten („CTL") wirkungsvoller erkannt als das direkte Translationsprodukt und stellt das einzige der zwei Peptide dar, welches von HLA-A2.1-Molekülen auf der Zelloberfläche präsentiert wird. Die Änderung ist der Austausch eines Asparagins gegen eine Asparaginsäure. Die Autoren schlagen vor, dass das Asparagin während der Proteinsynthese in dem endoplasmatischen Retikulum N-glykosyliert wird, und posttranslational deamidiert wird.
Im Fall von CAP1 werden die primären und sekundären Anker an Positionen 2, 9 und 1 schon durch bevorzugte Aminosäuren besetzt und aus diesem Grund wurde eine unterschiedliche Methode verwendet, um die Peptidimmunogenität zu verbessern, indem versucht wurde, seine Fähigkeit den TCR zu binden, zu verbessern. Es erschien uns, dass man durch die Veränderung der Aminosäurereste, die voraussichtlich den TCR kontaktieren, ein CAP1-Analog mit Substitutionen an Nicht-MHC-Ankerpositionen entwickeln könnte. Solch ein Analog könnte dann einen T-Zellverstärkeragonisten darstellen, der dazu imstande ist, CTL wirksamer als das native Peptid zu stimulieren. Frühere Ergebnisse unterstützten das Konzept, dass einige Peptidanaloga als T-Zellantagonisten wirken könnten, indem sie Antworten auf das antigene Peptid hemmen (23-29). Eine solche Hemmung erwies sich als TCR-spezifisch und konnte nicht durch Konkurrenz um die Peptidbindung an das MHC-Protein erklärt werden. In gleicher Weise würde ein Peptidverstärkeragonist ein Analogon darstellen, welches die Effektorfunktion ohne einhergehende Erhöhungen an MHC-Bindung heraufsetzt. Wir strebten deshalb danach, die CAP1-Immunogenität zu erhöhen, indem wir Reihen von Analoga analysierten, die einzelne Aminosäureaustausche zu Resten umfassten, von denen wir voraussagten, dass sie mit dem T-Zellrezeptor (TCR) CAP1-spezifischer CTL interagieren würden. Die Erfindung betrifft die Darstellung eines neuen T-Zellverstärkeragonisten für das CAP1-Peptid, das erste solche Beispiel für ein humanes CTL-Epitop.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung bezieht sich auf die Bestimmung von Peptiden, welche einzelne oder zweifache Aminosäureaustausche der CAP-1-Peptidsequenz darstellen. Das CAP-1-Peptid wurde als höchst immunogenes Epitop des karzinoembryonalen Antigens (hierin als „CEA" bezeichnet) identifiziert, welches dafür geeignet ist, CEA-spezifische cytolytische T-Zell („CTL")-Antworten zu stimulieren. CEA ist ein Zelloberflächenantigen, das im Übermaß auf mehreren Krebszellarten gefunden wird. Aus diesem Grund stellen CEA-Peptide, die dafür geeignet sind, eine cytolytische CTL-Antwort zu stimulieren, wie z.B. CAP-1, mögliche Immunogene für die Verwendung bei der Krebsimmuntherapie dar.
Die Peptide der Erfindung sind Agonisten von CAP-1 und CEA; das heißt, sie fördern die Wechselwirkung zwischen dem MHC-Komplex der Antigen-präsentierenden Zelle und dem T-Zellrezeptor („TCR")-Komplex der T-Zelle. Deswegen können diese Peptide als Immunogene dienen, um Patienten mit CEA-exprimierenden Krebsgeschwüren zu behandeln und/oder zu impfen. Diese Peptide können auch zur Stimulation von T-Zellen in Kultur für einen adoptiven Transfer von T-Zellen zu Krebspatienten verwendet werden. Vier solcher Peptide haben die Aminosäuresequenzen:

(1) YLSGADLNL (Agonist CAP1-6D) (SEQ. ID NO: 2);
(2) YLSGADINL (Agonist CAP1-6D, 7I) (SEQ. ID NO: 3);
(3) YLSGANINL (Agonist CAP1-7I) (SEQ. ID NO: 4); und
(4) YLSGACLNL (agonist CAP1-6C) (SEQ. ID NO.: 5).

Die unterstrichenen Aminosäuren zeigen die Aminosäureaustausche gegenüber der CAP-1-Peptidsequenz auf. Die Peptide CAP1-6D und CAP1-6D, 7I, stellen erfindungsgemäß besonders bevorzugte Peptide dar und weisen im Vergleich zu der CAP-1-Aktivität eine erhöhte Aktivität auf. Die Peptide CAP1-7I und CAP1-6C weisen eine Aktivität ähnlich wie CAP-1 auf.
Die Erfindung umfasst Kits umfassend ein Agonistenpeptid und einen Vektor, der ein Gen umfasst, welches für CEA oder ein rekombinant hergestelltes CEA-Protein kodiert. Darüber hinaus kann das Kit ein immunstimulierendes Molekül enthalten.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein oder mehrere Agonistenpeptide allein oder in Kombination mit einem immunstimulierenden Molekül und einem pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung bezieht sich auf die Verwendung dieser Peptide für Krebsimmuntherapie. Die Agonistenpeptide sind nützlich, eine cytolytische Immunantwort gegen CEA zu stimulieren, was zu einer Tumorver-kleinerung und/oder Verhinderung führt. Folglich bezieht sich die Erfindung auch auf ein Verfahren, Krebspatienten mit den Peptiden zu behandeln sowie auf einen Krebsimpfstoff.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1A–1D: Wirkung einzelner Aminosäuresubstitutionen in dem CEA-CAP1-Peptid auf die Lyse durch CEA-CTL-T-Vac8 C1R-A2-Zellen wurden mit ¹¹¹In markiert und für eine Stunde mit jedem substituierten Peptid bei 1 (ausgefüllt), 0,1 (offen) und 0,01 (schraffiert) μg/ml in Vertiefungen mit rundem Boden (2.000 pro Vertiefung) inkubiert. T-Vac8 CTL wurden bei E:T = 1,45:1 hinzugegeben und die Isotopenfreisetzung wurde nach vier Stunden gemessen. Die spontane Freisetzung wurde für jedes Peptid bei 1 μg/ml bestimmt. Alle Untersuchungen wurden dreifach ausgeführt. 1A–1D beschreiben jeweils Substitutionen an Positionen p5 bis p8. Aminosäuren werden durch den Einbuchstabencode markiert; die Aminosäure, die die native CAP-1-Sequenz kodiert, ist in jeder Figur und entlang des rechten Seitenrandes gekennzeichnet.
2A und 2B: CAP1 und Analoga zeigen unterschiedliche Sensitivität auf CEA CTLT-Vac8-Zytotoxizität 2A T2 und 2B C1R-A2 Targetzellen wurden mit ⁵¹Cr markiert und mit CAP1 (
) oder substituierten Peptiden CAP1-6D (☐) oder CAP1-7I (♢) in 96 Lochplatten mit rundem Boden (10.000 pro Vertiefung) in den angegebenen Konzentrationen inkubiert. Nach einer Stunde wurden T-Vac8 CTL bei E:T = 2,5:1 hinzugegeben und Isotopenfreisetzung wurde nach 4 Stunden bestimmt. Alle Untersuchungen wurden dreifach durchgeführt. NCA571 (Δ) ist ein 9-mer-Peptid, welches nach optimalem Abgleich von CEA mit dem verwandten Gen NCA (11) erhalten wurde.
3A und 3B: Wirkung einzelner Aminosäuresubstitutionen im CAP1-Peptid auf die Bindung an und die Stabilität von HLA-A2-Komplexen T2-Zellen wurden in serumfreiem Medium gesammelt, dann über Nacht (10⁶ Vertiefung) mit den Peptiden CAP1 (
), CAP1-6D (☐), oder CAP1-7I (♢) in den angegebenen Konzentrationen inkubiert (3A). Zellen wurden gesammelt und auf Zelloberflächenexpression funktioneller HLA-A2-Moleküle durch Färbung mit konformationsempfindlichem MAb BB7.2, HLA-spezifischem Antikörper W6/32 (nicht gezeigt) und Isotypenkontrollantikörper Ab MOPC-195 (nicht gezeigt) untersucht. Die durchschnittliche Fluoreszenzintensität wurde anhand einer lebenden gegatterten Zellpopulation ermittelt.
3B: Zellen wurden mit Peptid bei 100 μg/ml über Nacht inkubiert, dann von ungebundenem Peptid freigewaschen und bei 37°C inkubiert. Zu den angezeigten Zeiten wurden Zellen für die Anwesenheit von Zelloberflächenpeptid-HLA-A2-Komplexen gefärbt. Die Fehlerbalken zeigen SEM für zwei Experimente.
4A und 4B: CTL, welches von offensichtlich gesunden Individuen mit CAP1-6D-Peptid erzeugt wurden, erkennen CAP1 und CAP1-6D CTL-Linien (als T-N1 und T-N2 gekennzeichnet) wurden mit CAP1-6D erzeugt und wurden auf Peptidspezifität untersucht. T-N1 wurde nach 5 Stimulationszyklen bei einem Effektor zu Target-Verhältnis von 20:1 untersucht (4A). T-N2 wurde nach 10 Zyklen bei einem Effektor zu Target-Verhältnis von 15:1 untersucht (4B). ⁵¹Cr-markierte C1R-A2-Targets (5000/Vertiefung) wurden mit der gezeigten Menge an CAP1 (
) oder CAP1-6D (☐) Peptid inkubiert. Nach vier Stunden wurde die Menge an Isotopenfreisetzung in einem Gammazähler bestimmt. Die Werte wurden von Kulturen in dreifacher Ausfertigung bestimmt.
5A und 5B: CAP1-6D, aber nicht CAP1 erzeugte T-Zelllinien von offensichtlich gesunden Spendern erkennen Tumorzellen, die endogenes CEA exprimieren CAP1-6D generierte T-N2 CTL (5A) und T-Zellen, hergestellt mit nativem CAP1 (5B), wurden nach 9 Zyklen in vitro-Stimulation gegen Tumortargets SW480 und SW1463 (CEA⁺, HLA-A2⁺,
bzw.
), SKme124 (CEA^–, -A2⁺, ☐) und K562 (♢) untersucht. Um HLA hoch zuregulieren, wurden Tumorzellen für 72 Stunden in der Gegenwart von γ-IFN kultiviert. Zellen wurden trypsiniert und mit ⁵¹Cr markiert und mit T-N2 CTL (5000 Zellen/Vertiefung) bei zunehmenden Effektor-zu-Target-Verhältnissen inkubiert. Die Kulturen wurden für 4 Stunden inkubiert und die Menge an Isotopenfreisetzung in einem Gammazähler ermittelt. Die Werte wurden von Kulturen in dreifacher Ausfertigung bestimmt.
6: MHC-Klasse I A2.1-Restriktion der CTL-Linie (T-N2), die von dem CAP1-6D-Agonisten abgeleitet wurde CTL-Linie T-N2 wurde als ein Effektor für die humane Dickdarmkarzinom SW837-Targetzelle verwendet. SW837 ist CEA-positiv und HLA-A2.1-negativ. SW837 wurden zu einem MOI von 10:1 mit entweder einem rekombinanten Vaccinia der das A2.1 Transgen umfasst (
) oder mit einem Wildtyp-Vaccinia (Δ) infiziert.
7A und 7B: CTL, die mit CAP1-6D erzeugt wurden, lysierten CEA-positive, HLA-A2-positive Tumore: Wirkung der IFN-Hochregulierung Die T-N1-CTL, die mit CAP1-6D erzeugt wurden, wurden gegen verschiedenen Tumorzelllinien untersucht: SW480 (CEA⁺ und HLA-A2⁺,
), SW1116 (CEA⁺ aber -A2^–, ☐) und CaOV3 (CEA^– aber -A2⁺, ♢). Die Tumorzellen wurden 72 Stunden in der Abwesenheit (7A) oder Gegenwart (7B) von γ-IFN kultiviert, trypsiniert und mit ⁵¹Cr markiert, dann mit T-N1 CTL bei zunehmenden Effektor zu Targetverhältnissen inkubiert (5,000 Zellen/Vertiefung). Die Kulturen wurden für 4 Stunden inkubiert und die Menge an Isotopenfreisetzung in einem Gammazähler ermittelt. Die Werte wurden von Kulturen in dreifacher Ausfertigung ermittelt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung ist ein Peptidagonist des nativen CEA-Epitopes, CAP-1 (SEQ ID NO: 1). Der Agonist ist durch seine Fähigkeit gekennzeichnet, Antigen-spezifische zytotoxische T-Lymphozyten auszulösen, welche das Wachstum inhibieren oder Krebszellen, welche CEA oder CEA-Epitope exprimieren, abzutöten.
Die Peptidagonisten der Erfindung umfassen ungefähr 8-13 Aminosäuren, vorzugsweise 9-10 Aminosäuren. In einer Ausführungsform umfasst der Agonist im Vergleich zu dem nativen CAP-1 (SEQ ID NO: 1) eine Sequenz mit einer Substitution an Position 6. In einer anderen Ausführungsform umfasst der Agonist eine Sequenz mit einer Aminosäuresubstitution an Position 7 im Vergleich zu der nativen CAP-1 (SEQ ID NO: 1). In wieder einer anderen Ausführungsform umfasst der Agonist im Vergleich zu dem nativen CAP-1 eine Sequenz mit einer Aminosäuresubstitution an Position 6 und an Position 7. Die substituierte Aminosäure dient zur Verstärkung der Wechselwirkung des TCR-Komplexes auf den zytotoxischen T-Lymphozyten mit dem Peptid-MHC-Antigenligandenkomplex. Solche verstärkte Wechselwirkung führt zu einer größeren Effektorfunktion durch die zytotoxischen T-Lymphozyten.
Ein Beispiel für eine Substitution umfasst Asp und Cys an Position 6 oder ein Ile an Position 7.
In einer Ausführungsform umfasst der Peptidagonist die folgende Aminosäuresequenz:
Das Agonistenpeptid der Erfindung kann durch rekombinante DNA-Technologie oder durch chemische Peptidsynthese erhalten werden.
Das Agonistenpeptid kann zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger in eine pharmazeutische Zusammensetzung für die Verwendung als Immunogen in einem Säugetier vorzugsweise einem Menschen formuliert werden. Die Zusammensetzung kann, um die Immunantwort zu verbessern, des Weiteren einen oder mehrere Komponenten umfassen, die ohne Einschränkung immunstimulierende Moleküle wie beispielsweise Interleukin-2, Interleukin-6, Interleukin-12, Interferon gamma, Tumornekrosefaktor alpha, GM-CSF, B7.1, B7.2, ICAM-1, LFA-3, CD72, und Cyclophosphamid umfassen.
Das Agonistenpeptid wird einem Säugetier in einer Menge verabreicht, die wirksam ist, eine CEA-spezifische Immunantwort vorzugsweise eine zelluläre Immunantwort zu erzeugen. Die Wirksamkeit des mutanten ras-Peptides als Immunogen kann durch in vivo- oder in vitro-Parameter, wie sie im Stand der Technik bekannt sind, bestimmt werden. Diese Parameter umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Antigen-spezifische Zytotoxizitätsuntersuchungen, Rückgang von Tumoren, die CEA oder CEA-Epitope exprimieren, die Hemmung von Krebszellen, die CEA oder CEA-Epitope exprimieren, die Produktion von Cytokinen und Ähnliches.
Mindestens ein oder mehrere Agonistenpeptide können in einer Dosis von ungefähr 0,05 mg bis ungefähr 10 mg pro Impfung des Säugetiers vorzugsweise ungefähr 0,1 mg bis 5 mg pro Impfung verabreicht werden. Mehrere Dosen können über eine Dauer von Wochen wie angegeben verordnet werden. In einer Ausführungsform wird eine Dosis monatlich über drei Monate verordnet. Das Agonistenpeptid kann allein oder in Kombination mit Adjuvantien, verbunden mit Liposomen ( US-Patent Nrn. 5,643,599 ; 5,464,630 ; 5,059,421 ; 4,885,172 ), mit Cytokinen, biologischen Reaktionsmodifikatoren oder anderen Reagenzien, die im Stand der Technik dafür bekannt sind, die Immunantwort zu verstärken, verabreicht werden. Adjuvantien umfassen ohne Einschränkung RIBI Detox^TM, QS21, Alaun und unvollständiges Freund'sches Adjuvant. In einer Ausführungsform wird das mutante ras-Peptid in Kombination mit Detox^TM (RIBI Immunochem Research, Hamilton, MT) verabreicht. RIBI Detox^TM enthält als aktive Bestandteile das Zellwandskelett aus Mycobacterium phlei und Monophosphoryl-Lipid A aus Salmonella minnesota R595, die als Öl-in-Wasser-Emulsion mit Squalen und Tween 80 zubereitet wird.
Die Agonistenpeptide können auch an Helferpeptide oder an große Trägermoleküle gebunden werden, um die Immunogenität des Peptides zu verstärken. Diese Moleküle umfassen, beschränken sich aber nicht auf das Influenzapeptid, Tetanustoxoid, Tetanustoxoid CD4-Epitop, Pseudomonas Exotoxin A, Poly-L-Lysin, ein Lipid-Schwanz, endoplasmatisches Retikulum (ER)-Signalsequenz und Ähnliches.
Die Peptide der Erfindung können auch unter Verwendung von im Stand der Technik anerkannten Verfahren mit einem Immunglobulinmolekül verbunden werden. Das Immunglobulinmolekül kann für einen Oberflächenrezeptor, der auf Tumorzellen vorhanden aber auf normalen Zellen abwesend oder in sehr geringen Mengen vorhanden ist, spezifisch sein. Das Immunglobulin kann auch für ein spezifisches Gewebe spezifisch sein. Solch ein Peptidimmunglobulinkonjugat lässt das Targeting des Peptides auf ein spezifisches Gewebe und/oder Zelle zu.
Eine weitere wirksame Form des Agonistenpeptides zur Erzeugung einer Peptid-spezifischen Immunantwort in einem Säugetier ist eine Agonistenpeptid-gepulste Antigen-präsentierende Zelle. Die Antigen-präsentierende Zelle umfasst ist aber nicht beschränkt auf dendritische Zellen, B-Lymphozyten, Monozyten, Makrophagen und ähnliche. In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die Agonistenpeptid-gepulste Antigen-präsentierende Zelle eine dendritische Zelle dar.
Für CEA und das Agonistenpeptid spezifische zytotoxische T-Lymphozyten können in vivo oder in vitro durch die Stimulierung von Lymphozyten aus einer Quelle mit einer wirksamen Menge an Agonist alleine oder in Kombination mit einem immunstimulierenden Molekül und/oder Adjuvant oder in einer Liposomformulierung hergestellt werden. Die Quellen für Lymphozyten umfassen, sind aber nicht beschränkt auf peripheres Blut, Tumorgewebe, Lymphknoten und Ergüsse wie z.B. Pleuralflüssigkeit oder Aszitesflüssigkeit und ähnliches.
Die CEA und Agonistenpeptid-spezifischen zytotoxischen T-Lymphozyten sind mit CEA-Agonist oder Peptid immunreaktiv. Die zytotoxischen T-Lymphozyten verhindern das Auftreten von Tumorzellen und Krebs und verhindern das Wachstum oder töten exprimierende Tumorzellen, die CEA oder Epitope davon exprimieren, oder Tumorzellen, die Agonist exprimieren, ab. Die zytotoxischen T-Lymphozyten sind MHC-Klasse I-restringiert und darüber hinaus Antigen-spezifisch. In einer Ausführungsform sind die zytotoxischen T-Lymphozyten MHC-Klasse I HLA-A2-restringiert. Die zytotoxischen T-Lymphozyten haben einen CD8⁺-Phänotyp.
Ausgewählte Patienten, die Karzinomzellen tragen, die CEA oder CEA-Epitope exprimieren, werden subkutan bis zu dreimal in monatlichen Abständen mit Detox^TM-Adjuvant geimpft, das mit dem geeigneten Peptidagonisten vermischt wurde, können auch Karzinompatienten sein, die mit autologen peripheren blutmononukleären Zellen geimpft wurden, die ex vivo mit einem Peptidagonisten alleine oder in Kombination mit einem Peptidagonisten vorgepulst wurden. Anti-CEA-T-Zell-Antworten werden ausgewertet, wie sie durch Proliferationsuntersuchungen gemessen werden.
Die Impfung mit CEA-Agonistpeptiden der Erfindung ruft höchst spezifische und systemische anti-CEA zelluläre Immunantworten hervor. Darüber hinaus hat die Entwicklung solcher MHC-Klasse I-restringierten Agonistenpeptide wichtige Auswirkungen für sowohl aktive (d.h. Impfung) wie passive (d.h. ex vivo-Expansion für den zellulären adoptiven Transfer) Immuntherapien, die zur Induzierung und Vermehrung spezifischer CD8⁺-CTL-Antworten in Krebspatienten verwendet werden können.
Patienten mit soliden Tumoren, die CEA oder Epitope davon exprimieren und ohne Einschränkung Dickdarmkrebs, Lungenkrebs, Pankreaskrebs, Krebs des Endome triums, Brustkrebs, Schilddrüsenkrebs, Melanom, Mundkrebs, Kehlkopfkrebs, Seminom, häpatozellulärem Krebs, Krebs des Gallengangs, akute myeloblastische Leukämie, Basalzellenkarzinom, Plattenepithelkarzinom, Prostatakrebs und ähnliche umfassen, profitieren von einer Immunisierung mit den Agonistenpeptiden. Patienten, die für eine Behandlung unter Verwendung der Agonistenpeptide der Erfindung empfänglich sind, sind solche Patienten, die Tumore mit CEA oder CEA-Epitopen aufweisen.
Peptide können chemisch unter GMP-Bedingungen synthetisiert werden und mit HPLC bis > 95% Reinheit aufgereinigt werden und lyophilisiert werden. Pharmazeutische Zusammensetzungen werden durch die Wiederherstellung der Peptide mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger wie z.B. Natriumchlorid formuliert. In einem Beispiel beinhaltet jeder Milliliter der Lösung 1500 μg eines Agonistenpeptides zuzüglich 9,0 mg Natriumchlorid.
Wenn das Agonistenpeptid mit einem Adjuvant verabreicht wird, ist es wünschenswert, das Peptid kurz vor der Verabreichung an den Patienten mit dem Adjuvant zu vermischen.
Das Agonistenpeptid kann einem Patienten über verschiedene Wege verabreicht werden, umfassend aber nicht beschränkt auf subkutan, intramuskulär, intradermal, intraperitoneal, intravenös und ähnliche. In einer Ausführungsform wird das Agonistenpeptid subkutan verabreicht. Das Peptid kann an einem oder mehreren Stellen dem Patienten verabreicht werden. In einer Ausführungsform wird das Peptid allein oder in Kombination mit einem Adjuvant subkutan in drei Stellen über den Deltamuskeln, den Schenkeln und dem Abdomen verabreicht.
In einem weiteren Verfahren, eine Immunantwort hervorzurufen, werden dem Patienten Agonistenpeptide-gepulste Antigen-präsentierende Zellen in einer Menge, die wirksam ist, eine Antigen-spezifische Immunantwort hervorzurufen, verabreicht. Die Antigen-präsentierenden Zellen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf dendritische Zellen, B-Lymphozyten, Monozyten, Makrophagen und ähnliche. In einer Ausführungsform werden dendritische Zellen aus einem Patienten nach von Romani, N. et al. (1994) beschriebenen Verfahren isoliert. Die isolierten dendritischen Zellen werden in vitro mit einem Agonistenpeptid für einen Zeitraum von ungefähr 0,5 bis ungefähr 3 Stunden kultiviert und gewaschen, um nicht gebundene Peptide zu entfernen. Die Agonistenpeptid-gepulsten dendritischen Zellen werden, in einer Konzentration von ungefähr 10⁶ zu ungefähr 10⁹ dendritischen Zellen, zurück in den Patienten transferiert. Solch eine Konzentration ist wirksam, in dem Patienten eine Immunantwort hervorzurufen, was die Erzeugung Agonistpeptid-spezifischer zytotoxischer T-Lymphozyten umfasst, welche imstande sind, das Wachstum zu hemmen oder Tumorzellen zu töten.
Die Merkmale, eine Antitumorantwort in einem immunisierten Patienten festzustellen, sind wie folgt:

1. Vollständige Remission (CR): Vollständiges Verschwinden jeder Anzeichen eines Tumors und Rückkehr abnormaler Tests zu normalen Schwellwerten für mindestens vier Wochen.
2. Teilweise Antwort (PR): Reduzierung um mindestens 50% in der Summe der Produkte der senkrechten Durchmesser aller vermessenen Läsionen in der Abwesenheit des Fortschreitens irgendeiner Läsion noch das Auftreten irgendwelcher neuen Läsionen für mindestens vier Wochen.
3. Gleichbleibende Krankheit (SD): Veränderung in messbarer Krankheit zu klein, um die Anforderungen für eine teilweise Antwort oder Fortschritt zu erfüllen und das Erscheinen keiner neuen Läsion über einen Zeitraum von mindestens zwölf Wochen. Es sollten keine Verschlechterungen der Symptome auftreten.
4. Fortschreiten der Krankheit (PD) oder Rückfall: Jede der Merkmale unten muss erfüllt sein, damit eine Krankheit als fortgeschritten betrachtet wird: Entwicklung irgendeines neuen Bereiches bösartiger Krankheit (messbar oder tastbar), Zunahme (> 25%) irgendeines Vorbehandlungsbereiches der messbaren bösartigen Krankheit. Die immunologische Antwort auf eine Immunisierung mit den Agonistenpeptiden wird durch eine in vitro T-Zellproliferationsuntersuchung und/oder durch eine in vitro-T-Zellen zytotoxische Untersuchung vor und nach der Impfung festgestellt.

Die Erfindung ermöglicht eine in vitro-Immunisierung für T-Zellproliferation und zur Erzeugung zytotoxischer T-Zelllinien für das Tumor-spezifische Agonistenpeptid. In vitro-Kultivierung Peptid-spezifischer T-Zellen aus peripheren blutmononuk leären Zellen (PBMC), Lymphknotengeweben (LNT), oder Tumor-infiltrierenden Lymphozyten (TIL) mit einem Agonistenpeptid und IL-2 erzeugt CEA und Agonistpeptid-spezifische T-Zellen. Diese T-Zellen werden, wie hierin beschrieben, auf Zytotoxizität gegen Agonistenpeptid ge-primete APC (autologe EBV-transformierte B-Zellen oder autologe Tumorzellen) getestet. Erzeugte T-Zellklone werden phänotypisch mit Durchflusscytometrie durch die Expression von CD3, CD4 und CD8 charakterisiert. Agonistpeptid-spezifische zytotoxische Lymphozyten können einem Patienten adoptiv transferiert werden, um CEA oder CEA-Epitop exprimierende Tumorzellen zu hemmen oder zu töten. Die Patienten können dann mit Agonistenpeptid vorzugsweise in Adjuvant reimmunisiert werden.
Üblicherweise werden zwischen ungefähr 1 × 10⁵ und 2 × 10¹¹ zytotoxische T-Zellen pro Infusion in z.B. 1 bis 3 Infusionen zu je ungefähr 200 bis ungefähr 250 ml über einen Zeitraum von 30 bis 60 Minuten verabreicht. Nach Abschluss der Infusionen kann der Patient mit einem biologischen Reaktionsmodifikator wie z.B. Interleukin 2 (IL-2) behandelt werden. In dem Fall von IL-2 wird rekombinantes IL-2 intravenös in einer Dosierung von 720,000 IU pro Kilogramm Körpergewicht alle acht Stunden verabreicht. Nach adoptivem Transfer der Antigen-spezifischen zytotoxischen T-Zellen in den Patienten kann der Patient zusätzlich mit dem Agonistenpeptid, welches zum Primen der zytotoxischen T-Zellen benutzt wurde, behandelt werden, um die T-Zellanzahl in vivo weiter zu vergrößern.
Ein Agonistenpeptid kann durch eine DNA-Sequenz und Varianten davon kodiert werden.
In einer Ausführungsform stellt die DNA-Sequenz, die für das Agonistenpeptid kodiert, eine Variante der DNA-Sequenz dar, welche umfasst:
TAC CTT TCG GGA GCG AAC
Tyr Leu Ser Gly Ala Asn
CTC AAC CTC (SEQ. ID No: 6)
Leu Asn Leu (SEQ. ID No: 1).
Eine Variante der SEQ ID NO: 6 umfasst, aber ist nicht beschränkt auf ein Codon ATC (Ile) anstelle des Codons CTC (Leu an Position 7). Eine weitere Variante der SEQ ID NO: 6 umfasst, aber beschränkt sich nicht auf ein Codon TGT (Cys) anstatt des Codons AAC (Asn an Position 6).
In einer weiteren Ausführungsform umfasst die DNA-Sequenz, die das Agonistenpeptid kodiert:
TAC CTT TCG GGA GCG GAC
Tyr Leu Ser Gly Ala Asp
CTC AAC CTC (SEQ. ID No: 7)
Leu Asn Leu (SEQ. ID No: 2)
und Varianten davon.
In noch einer weiteren Ausführungsform umfasst die DNA-Sequenz, die das Agonistenpeptid kodiert:
TAC CTT TCG GGA GCG GAC
Tyr Leu Ser Gly Ala Asp
ATC AAC CTC (SEQ. ID No: 8)
Ile Asn Leu (SEQ. ID No: 3)
oder Varianten davon.
Mit inbegriffen sind konservative Substitutionen, die auf Codondegeneration basieren, vorausgesetzt die Veränderung ergibt ein funktionelles äquivalentes Agonistenpeptid oder ein Peptid mit verbesserter Immunogenität.
Vektoren und Plasmide, die eine DNA-Sequenz, welche für ein Agonistenpeptid kodiert, umfassen, umfassen aber beschränken sich nicht auf E. coli-Plasmid, einen Listeria-Vektor und einen rekombinanten viralen Vektor. Rekombinante virale Vektoren umfassen, beschränken sich aber nicht auf Orthopox-Virus, Avipox-Virus, Capripox-Virus, Suipox-Virus, Vaccinia, Baculovirus, humanes Adenovirus, SV40, Rinderpapillomavirus, und ähnliche, die die DNA-Sequenz, welche für ein Agonistenpeptid kodiert, umfassen.
Rekombinantes Agonistenpeptid kann unter Verwendung eines Baculovirusexpressionssystems gemäß des Verfahrens von Bei et al. J. Clin. Lab. Anal. 9: 261-268 (1995) erhalten werden. Rekombinante virale Vektoren können nach im Stand der Technik bekannten Verfahren wie z.B. nach U.S. Patent Nr. 5,093,258 ; WO 96/104 19 ; Cepko et al. Cell 37: 1053-1062 (1984); Morin et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 4626-4630 (1987); Lowe et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3896-3900 (1987); Panicali & Paoletti, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 4927-4931 (1982); Mackett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 7415-7419 (1982); WO 91/19803 ; Perkus et al. Science 229: 981-984 (1985); Kaufman et al. Int. J. Cancer 48: 900-907 (1991); Moss Science 252: 1662 (1991); Smith und Moss BioTechniques Nov/Dez, S. 306-312 (1984); U.S. Patent Nr. 4,738,846 ; Sutter und Moss Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10847-10851 (1992); Sutter et al., Virology (1994) und Baxby und Paoletti, Vaccine 10: 8-9 (1992), erstellt werden.
Wirtszellen, die die DNA exprimieren können, die für das Agonistenpeptid kodiert, die von Vektoren oder Plasmiden getragen wird, sind prokaryotische und eukaryotische Wirtszellen und umfassen, beschränken sich aber nicht auf E. coli, Listeria, Bacillus Spezies, COS-Zellen, Verozellen, Hühnerembryo, Fibroblasten, Tumorzellen, Antigen-präsentierende Zellen und ähnliche. Wenn die Wirtszelle eine Antigen-präsentierende Zelle ist, sollte die Wirtszelle zusätzlich ein MHC-Klasse I-Molekül exprimieren.
Wir haben kürzlich einen Nachweis von CTL-Antworten auf CEA in Patienten, die mit rV-CEA immunisiert waren, berichtet (11). Das 9-mer-Peptid CAP1 wurde eingesetzt, um in vitro CTL zu expandieren, aufgrund von: (a) seiner starken Bindung an HLA-A2, und (b) seiner Nicht-Identität zu anderen Mitgliedern der CEA-Genfamilie, die auf normalen Geweben exprimiert wird. CTLs wurden von Postimmunisierungs-PBMC aus Patienten erzeugt, während Präimmunisierungsblut derselben Patienten sich nicht in der Lage war, sich zu vermehren. Darüber hinaus stimulierten CAP1-gepulste dendritische Zellen in vitro das Wachstum von -A2 restringierten CTL aus peripherem Blut nicht-immunisierter Krebspatienten (12). Schließlich war, wenn in vitro CTL durch Stimulierung mit dendritischen Zellen, welche Volllängen CEA mRNA kodierten, erzeugt wurden, die Zytotoxizität gegen CAP1 höher als die Aktivität gegen sechs andere -A2 bindende CEA-Peptide (S. Nair und E. Gilboa, persönliche Mitteilung oder unveröffentlichte Beobachtung). Solche Ergebnisse stärken die Idee, dass CAP1 ein immunodominantes Epitop des CEA-Moleküls darstellt.
Die Erfindung beabsichtigt es, die Immunogenität des CAP1-Peptids durch die Einführung von Aminosäuresubstitutionen an Nicht-Ankerpositionen zu verbessern, um die Agonistenpeptide der Erfindung zu bilden. Wenn T-Vac8-CTL als Effektor verwendet wird, sensibilisierte das Analogon CAP1-6D die Targetzellen für die Lyse weitaus besser als CAP1 allein. Weitere Studien zeigten, dass die cytolytische Aktivität einer zweiten -A2 restringierten, CAP1-spezifischen CTL, T-Vac-24, mit CAP1-6D genauso gut oder besser war als mit CAP1. Diese Darstellungen verbesserter Reaktivität konnten nicht durch eine verbesserte Präsentierung von Klasse I-MHC erklärt werden. Schließlich konnte CAP1-6D dazu verwendet werden, um in vitro CTL von PBMC von sowohl Karzinompatienten als auch von normalen Spendern zu stimulieren. Vor der Erfindung waren Bestrebungen, Anti-CAP1 CTL aus normalen Spender unter Verwendung derselben Methodik zu stimulieren, nicht erfolgreich. Die Erfindung betrifft die Stimulierung normaler Spender mit CAP1-6D im Gegensatz zu nativem CAP1, wobei die Stimulierung mit der nativen Sequenz keine spezifische zytotoxische Aktivität ergab. Demgegenüber erzeugte eine Stimulierung mit CAP1-6D mehrere CTL mit einer spezifischen anti-CAP1 Peptidreaktivität sowie einer Antitumorreaktivität. Daher ist das Peptidanalogon CAP1-6D dazu imstande, eine Population von CAP1-spezifischen humanen CTL wirksamer als natives CAP1 zu selektieren. Solch ein Agonist kann bei der Entwicklung von T-Zell-gerichteten Impfstoffen gegen CEA exprimierende Karzinome Verwendung finden.
Die Erfindung bezieht sich auch auf die wirksamere Erzeugung und Expansion Tumor-spezifischer T-Zellen für adoptive Immuntherapie. In den letzten Jahren wurde bei der Charakterisierung Tumor-assoziierter Antigenpeptide, die den CTL durch Klasse I-HLA-Antigene präsentiert werden können, ein großer Fortschritt erzielt. In Fällen, bei denen Mutationen Neo-Antigene erzeugen, wie z.B. das Punkt-mutierte ras (35, 36), p53 (37, 38) oder β-Catenin (39) zielen Impfstrategien auf die neue Sequenz in der Annahme, dass das Immunsystem für ein Antigen nicht „tolerant" ist, welches es nie gesehen hatte. Vor noch kürzerer Zeit wurde vorgeschlagen, dass Neo-Antigene auch durch posttranslationale Deamidierungen entstehen könnten (29, 40). Dennoch sind in vielen Fällen die beabsichtigten Ziele der Tumortherapie nicht Neo-Antigene, sondern vielmehr normale onkofötale oder Differenzierungsantigene, die überexprimiert sind oder von malignen Zellen ektopisch exprimiert werden. Dies ist bei CEA der Fall (41). Unter solchen Umständen sagen Modelle, welche sich auf „Toleranz" berufen, voraus, dass das Immunsystem diesen Antigenen begegnet ist, und es weniger dazu imstande ist, auf diese zu reagieren. Dieses klassische Bild wurde in den letzten Jahren durch zahlreiche Berichte über Immunität, die von überexprimierten Differenzierungsantigenen, Onkogenen, und Tumorsuppressorgenen hervorgerufen wurde, in Frage gestellt (37, 38, 42-44). Trotzdem ist es oftmals experimentell schwierig, T-Zellen mit gewünschter Antitumoraktivität zu erzeugen und zu expandieren und deshalb ist es wünschenswert, für die Erzeugung von CTL neue Strategien zu entwickeln.
Es wurden einige Klasse II-Bindepeptide beschrieben, bei welchen Substitutionen die Reaktionen von Maus- und menschlichen Th-Klonen verbessern, ohne die Bindung an Klasse II-Antigene zu erhöhen (29, 45-47). Unter humanen Klasse I-Peptiden stellten jedoch die einzigen Substitutionen, die für die Erzeugung von CTL beschrieben waren, solche dar, die die Bindung an HLA erhöhen (17-20). Die Substitutionen in diesen Studien waren auf Reste an den primären oder sekundären Ankerpositionen gerichtet, die die Bindungsmotive an Klasse I-MHC-Antigenen definieren. Selbst Substitutionen, die auf eine Nichtankerposition ausgerichtet waren (19), erzielten ihren Verstärkungseffekt, indem sie die Bindung an HLA-A2 verstärkten. Das Analogon CAP1-6D des vorliegenden Berichts verkörpert anscheinend eine unterschiedliche Klasse substituierter CTL-Peptide, Agonisten, die die Erkennung des Peptid-MHC-Liganden durch den T-Zellrezeptor verstärken und erzielen eine größere Effektorfunktion ohne Zunahmen in der Bindung. Unseres Wissens nach stellt dies das erste solche Verstärker-Agonistenpeptid, welches für eine menschliche CTL beschrieben wurde, dar.
Die Zunahme an lytischer Empfindlichkeit der Targets in der Gegenwart von CAP1-6D tritt wahrscheinlich nicht aufgrund besserer Antigenpräsentation auf. Bindeexperimente zeigen, dass HLA-A2 das native CAP1, und die Analoga CAP1-6D und CAP1-71 ungefähr gleichwertig präsentiert. Eine weitere Möglichkeit ist, dass CAP1-6D eine erhöhte Aktivität zeigt, weil es von mehr als einem Allel dargestellt wird und T-Vac8 gegenüber Peptid-MHC-Komplexen nicht spezifisch ist. T-Vac8, T-Vac24 und CTL, welche von nicht-immunisierten Patienten stammten, zeigen jedoch eine verbesserte Lyse mit CAP1-6D. Da HLA-A2 das einzige Masse I-MHC auf den verwendeten Targets darstellt, kann die verbesserte Lyse nicht durch die Rekrutierung einer weiteren Masse I-MHC erklärt werden.
Da Anti-CAP1 CTL von mehreren Spendern eine Agonistenkreuzreaktivität zeigt, ist es möglich, dass CAP1-6D dafür verwendet werden könnte, um das Wachstum der CTL von zahlreichen -A2 Individuen zu stimulieren. Wir sind durch die ziemlich ausgeprägten Unterschiede zwischen T-Vac8 und T-Vac24 in dem Ausmaß der Re aktion auf den Agonisten ermutigt; dies bedeutet, dass jeder Effektor unterschiedliche TCR-Gensegmente verwendet und dass sie trotzdem sowohl die native Sequenz als auch die CAP1-6D Substitution erkennen können. Die Fähigkeit von CAP1-6D als ein Agonist für T-Zellen, welche verschiedene T-Zellrezeptoren exprimieren, zu fungieren, vergrößert deutlich sein therapeutisches Potential. Aus diesem Grund bezieht sich die Erfindung auch auf die Stimulierung durch den Agonisten und nachfolgender Erzeugung von T-Zellen, welche die normale Sequenz in nicht immunisierten Individuen erkennen. Solchen Individuen ist vermutlich die modifizierte Sequenz niemals begegnet und da der Agonist wirksamer ist, eine T-Zellantwort auszulösen, könnten solche Agonisten dazu imstande sein, CTL leichter zu selektieren als Immunogene, die auf der nativen Sequenz beruhen.
Damit von Peptid stammende CTL nützliche therapeutische Reagenzien darstellen, ist es wesentlich zu zeigen, dass sie Tumorzellen, welche endogenes Antigen exprimieren, lysieren können (48, 49). Wir hatten vorher gezeigt (11), dass Tumorzellen CEA prozessieren und Antigene präsentieren, welche von CTL erkannt werden, die durch Stimulation mit CAP1 erzeugt wurden. Im Einklang mit der Erfindung sind CTL, die von normalen Spendern durch die Stimulierung mit CAP1-6D aufgezogen wurden, auch dazu in der Lage, allogene CEA-positive, HLA-A2-positive Tumorzellen zu erkennen. Diese T-Zellen sind nicht dazu in der Lage, -A2 negative Tumorzellen oder -A2 positive Zellen, denen eine CEA-Expression fehlt, zu erkennen.
Wir haben auch gezeigt, dass CTL, die mit dem CAP1-6D-Agonisten selektiert wurden, durch nachfolgende Stimulation mit der nativen CAP1-Sequenz erhalten werden können. Dies ist eine wichtige Erkenntnis, da eine CTL in Patienten, gleich ob sie in vivo durch eine aktive Immunisierung geschaffen wurden oder nach einer ex vivo-Expansion adoptiv transferiert wurden, voraussichtlich nur der nativen Sequenz begegnen wird. Dies ermöglicht es, den CTLs, über eine ausgedehnten Zeitraum in vivo erhalten zu bleiben.
Einer der ursprünglichen Gründe CAP1 zu wählen und zu testen, war seine Nicht-Identität mit anderen berichteten Sequenzen in dem humanen Genom. Es wurde deshalb vorhergesagt, dass jede erzielte Immunantwort wahrscheinlich nicht normales Gewebe, welches andere Antigene trägt, beschädigen würde. Aus diesem Grund wurde eine ähnliche Recherche in Proteindatenbanken für die Peptide CAP1-6D und CAP1-7I durchgeführt und es wurde offenbart, dass diese nicht als humane Sequenzen an anderer Stelle in der Genbank (Genetics Computer Group, Madison, WI) berichtet werden. Jedoch werden zwei ähnliche Sequenzen, YLNVQDLNL (SEQ ID NO: 9) und YLHDPEFNL (SEQ ID NO: 10), für Antigene von afrikanischem Schweinefiebervirus bzw. Masernvirus gemeldet. Diese Sequenzen entsprechen dem Konsensusmotiv für HLA-A2 und ermöglichen infizierten Individuen aus diesem Grund kreuzreagierende Antigene zu CAP1 zu exprimieren. Eine interessante Möglichkeit besteht darin, dass die Anwesenheit von Anti-CAP1 CTL in einigen Patienten ein Beispiel von Epitopnachahmung darstellt (50).
Zwei aktuellere Berichte schlagen vor, dass modifizierte Asparaginreste die Immunogenität von Klasse I-MHC-Peptiden verbessern könnten. Skipper et al. (40) verwendete CTL, welche in gemischten Lymphozytentumorzellkulturen erzeugt wurden, um Antigene in Extrakten von Melanomzellen zu identifizieren. Ein antigenes Peptid war an 8 von 9 Positionen identisch zu einer Tyrosinasesequenz mit einem Asparagin zu Asparaginsäure-Austausch an Position 3. Als die CTL unter Verwendung synthetischer Peptide getestet wurden, waren sie gegen das Asparaginsäurepeptid aktiver als gegen das Peptid, welches das genetisch vorhergesagte Asparagin enthielt. Diese Autoren stellen Vermutungen an, dass posttranslationale Deamidierungen aus normalen Differenzierungsantigenen antigene Peptide erzeugen können. Kürzlich berichteten Chen et al. (51) die Erzeugung von Maus-CTL für ein stabilisiertes Succinimid-Derivat eines Asparagin-haltigen antigenen Peptides. Obwohl diese CTL Targets, die mit dem natürlichen Asparaginpeptid gepulst waren, töten konnten, taten sie dies mit einer geringeren Empfindlichkeit. Sie sprechen die Möglichkeit an, dass in vivo und in vitro eine Deamidierung von Proteinen kurzlebige Succinimidintermediate erzeugen kann, die veränderte Selbstliganden darstellen, die dazu fähig sind, eine Immunantwort zu hervorzurufen. An dem anderen Extrem ersetzten Kersh und Allen (52) in einem Hämoglobinpeptid ein TCR-Kontakt Asparagin mit Asparaginsäure und beseitigten die Reaktionsfreudigkeit gegen ein Maus-Th-Klon. Gegenwärtig können wir die Möglichkeit nicht ausschließen, dass die verbesserte Reaktivität von CAP1-6D durch die Deamidierung der nativen Sequenz verursacht wurde, die wiederum die Reaktion vorbereitet, welche wir mit CAP1 nachweisen. Unsere wiederholte Unfähigkeit, anti-CAP1 CTL aus präimmunisierten PBMC derselben Patienten zu züchten, von denen wir postimmunisierte CTL erzeugt haben, spricht jedoch dagegen. Außerdem könnten mutmaßliche Deamidierungen nicht die Erkennung anderer Analoga wie z.B. CAP1-6C oder CAP1-7I durch T-Vac8-CTL erklären. Stattdessen scheint es vernünftiger, dass T-Zellrezeptoren von T-Vac8 und T-Vac24 so wie die neuen hier beschriebenen Linien, irgendeine Abweichung von der nativen CAP1-Sequenz erkennen können.
Als Zusammenfassung ermöglichte uns die Synthese von Analoga eines immundominanten CEA-Peptides mit Aminosäuresubstitutionen an Positionen, von denen vorhergesagt wurde, dass sie möglicherweise mit dem T-Zellrezeptor interagieren, einen Verstärkeragonisten zu identifizieren. Dieser Agonist wurde durch zwei verschiedene CEA CTL erkannt und erhöht die Aktivität einer dieser um 2-3 Größenordnungen. Der Agonist war auch geeignet, das Wachstum von CTL von peripherem Blut nicht immunisierter normaler Spender mit weitaus größerer Leichtigkeit zu stimulieren, als die native Peptidsequenz. Am wichtigsten war es, dass die CTL, welche unter Verwendung der Verstärkeragonisten erzeugt wurden, geeignet waren, Targets, die die native Sequenz präsentieren, inklusive Tumorzelllinien, die endogenes CEA exprimieren, zu erkennen und zu lysieren. Erfindungsgemäß ermöglicht die Charakterisierung dieses Verstärkeragonistenpeptides aggressivere Antitumortherapien, wenn es als Immunogen in vivo oder für die ex vivo-Expansion autologer Antitumor-CTL eingesetzt wird. Der synthetische Ansatz, der gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird, ist auch für die Verbesserung der Immunogenität anderer Peptid-CTL-Epitope nützlich.
MATERIAL UND METHODEN
PEPTIDE
Eine Reihe von einzelnen Aminosäuresubstitutionen an Positionen p5 bis p8 des CEA-Peptides CAP1 wurde durch f-moc-Chemie unter Verwendung der Nadel-technologie (Chiron Mimotopes, Victoria, Australien) hergestellt. CAP1 (YLSGANLNL) und CAP1-6D (YLSGADLNL), in über 96%-er Reinheit, wurden auch von Multiple Peptide Systems (San Diego, CA) hergestellt. Zusätzliche Peptide CAP1-7I und NCA571 wurden an einem Applied Biosystems 432A-Synthesizer synthetisiert und waren nach C18-Umkehrphasen-HPLC mehr als 90% rein.
ZELLLINIEN
T-Vac8 (53) und T-Vac24 (11) sind humane CTL spezifisch für das CEA-Peptid CAP1. Diese Zelllinien wurden durch in vitro-Stimulation von PBMC unter Verwen dung von CAP1 und IL-2, gemäß vorher publizierter Verfahren (11), erzeugt. Kurzgefasst stammten Postimmunisierungs-PBMC aus HLA-A2⁺-Individuen mit fortgeschrittenem Karzinom, welchen in einem Phase I-Versuch rV-CEA verabreicht worden war. PBMC wurden auf Gradienten mit Lymphozytentrennungsmedium (Organon Teknika, Durham, NC) isoliert und 2 × 10⁵ Zellen wurden in den Vertiefungen steriler 96 Lochkulturplatten (Corning Costar, Cambridge, MA) zusammen mit 50 μg/ml Peptid platziert. Nach 5-tägiger Inkubation bei 37°C in einer befeuchteten Atmosphäre, die 5% CO₂ enthielt, wurden die Überstände entfernt und durch ein Medium, welches 10 U/ml humanes IL-2 enthielt (ein Geschenk der Surgery Branch, NCI), ersetzt. Die Kulturen wurden alle drei Tage über 11 Tage mit IL-2 gefüttert und dann mit bestrahlten (4000 rad) autologen PMC (5 × 10⁵) und Peptid erneut stimuliert. Frisches IL-2 wurde jeden dritten Tag zur Verfügung gestellt und nachfolgende erneute Stimulationen wurden alle zwei Wochen getätigt. CTL werden in vollständigem RPMI (GIBCO/BRL, Grand Island, NY) Medium mit Glutamin (GIBCO/BRL), Penicillin, Streptomycin und 10% vereinigtes humanes AB-Serum (Gemini Bioproducts, Inc., Calabasas, CA) gehalten.
Die Zelllinie C1R-A2 (zur Verfügung gestellt von Dr. W. Biddison, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, Bethesda, MD) wird in vollständigem RPMI mit 10% fötalem Kälberserum (FBS, Biofluids Inc., Rockville, MD), Glutamin, nicht-essenziellen Aminosäuren und Pyruvat (Biofluids) und 1 mg/ml G418 gehalten. Die Zelllinie 174.CEM-T2 (zur Verfügung gestellt von Dr. P. Creswell, Yale University School of Medicine, New Haven, CT) ist in ihrer endogenen Peptidprozessierung gestört und wird in Iscove's (GIBCO/BRL) mit 10% FBS gehalten. Sowohl C1R-A2 als auch T2-Linien präsentieren exogene Peptide mit HLA-A2.
CEA-positive Tumorzelllinien SW480, SW1463, SW1116 und SW837 wurden von der American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) bezogen und wöchentlich in entsprechendem Kulturmedium, welches in dem ATCC-Katalog beschrieben wird, passagiert. Die CEA-negative Melanomlinie SKme124 (zur Verfügung gestellt von Dr. S. Rosenberg, National Cancer Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD) wurde wöchentlich in RPMI 1640, 10% FBS und 10 μg/ml Gentamicin (Life Technologies) passagiert. Der CEA-negative Eierstockkrebs CaOV3 wurde von Dr. R. Freedman (MD Anderson Cancer Center, Houston, TX) zur Verfügung gestellt und wurde in RPMI mit 15% FBS, Glutamin, 12 μg/ml Insulin (Sigma, St. Louis, MO), 10 μg/ml Hydrocortison (Biofluids) und 10 μg/ml Gentamicin kultiviert. Alle Tumorlinien wurden mit Trypsin/Versene (Biofluids) für 5-10 Minuten vor der Isotopenmarkierung mit für CTL-Untersuchungen trypsinisiert. Das hochsensible natürliche Killer (NK)-Target K562 wurde von ATCC bezogen und wöchentlich mit RPMI 1640, 10% FBS passagiert.
ERZEUGUNG VON CTL
Die T-Zelllinien T-N1 und T-N2 wurden durch in vitro-Stimulation mit Peptid aus PBMC zweier normaler HLA-A2-positiver Spender wie folgt erzeugt. Für den ersten Stimulationszyklus wurden T-Zellen positiv durch das Schwenken in CD3+ MicroCellector-Flaschen (Applied Immune Sciences, Santa Clara, CA) selektiert. CD3+-Zellen (3 × 10⁶) wurden mit 10⁶ 174.CEM-T2-Zellen, welche vorher mit Vaccinia Virus infiziert waren, das humanes B7 bei einer Infektionsvielfalt von 10 exprimiert, kultiviert, mit 50 μg/ml CAPI oder CAPI-6D-Peptid und 2 μg/ml humanem β2-Mikroglobulin (Intergen, Purchase, NY) gepulst und bestrahlt (10000 rad) waren. Die Kulturen wurden bei 37°C in einer befeuchteten Atmosphäre, welche 5% CO₂ enthält, in T25-Flaschen in RPMI mit 10% humanem Serum, 2 mM Glutamin und 10 μg/ml Gentamicin in einem Gesamtvolumen von 10 ml mit 2 × 10⁷ bestrahlten (2500 rad) autologen PBMC als Futterzellen inkubiert. Nach 24 Stunden in Kultur wurden 10 U/ml huIL-2 und 0,1 ng/ml rIL-12 (R & D Systems, Minneapolis, MN) hinzugefügt. Nach 9 Tagen in Kultur wurden die Zellen erneut unter Verwendung von bestrahlten (10,000 rad) autologen EBV-B-Zellen, welche mit 25 μg/ml Peptid, in einem Verhältnis von 2,5:1 Stimulatorzellen zu T-Zellen vor-inkubiert waren, stimuliert und IL-2 und IL-12 wurden wiederum 24 Stunden später hinzugefügt. Die Peptidkonzentration wurde mit jedem weiteren Stimulationszyklus halbiert, bis eine Endkonzentration von 3,12 μg/ml erreicht wurde.
Zusätzlich wurden CTL von postimmunisierten PBMC aus Krebspatient Vac8 durch die Stimulation mit CAPI-6D gemäß der bereits publizierten Verfahren (11) erzeugt.
CTL-VERFAHREN
Targetzellen wurden mit ⁵¹Cr oder ¹¹¹In markiert, dann zu 2,000-10,000 pro Vertiefung mit oder ohne Peptiden in Mikrotiterplatten mit rundem Boden (Corning Costar) inkubiert. Eine Stunde später wurden T-Zellen hinzugefügt. Überstände wurden nach vier Stunden geerntet (Skatron, Inc., Sterling, VA) und die Isotopenfreisetzung wurde gemessen. Alle Untersuchungen wurden dreifach ausgeführt und die prozentuale spezifische Freisetzung wurde berechnet nach:
wobei die spontane Freisetzung durch das Weglassen der T-Zellen erhalten wurde und die maximale Freisetzung durch Zugabe von 1% Triton X100 erhalten wurde.
BINDEUNTERSUCHUNG
Die Bindung der Peptide an HLA-A2 wurde durch die Inkubation mit Prozessierungs-gestörten 174.CEM-T2-Zellen und die Messung der Stabilität der Zelloberflächenpeptid-A2-Komplexe (30) bestimmt. In Kürze, Zellen wurden geerntet und mit serumfreien RPMI gewaschen, dann über Nacht zu 1-2 × 10⁶ Zellen/Vertiefung mit verschiedenen Peptidkonzentrationen inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Zellen gesammelt, in Ca²⁺, Mg²⁺ und 5% FBS in PBS gewaschen, dann für einzelfarben, durchflusscytometrische Analyse in Aliquots geteilt. Die Zellen wurden ohne Antikörper, mit Anti-A2-Antikörper A2,69 (One Lambda, Inc., Canoga Park, CA) oder mit Isotopen-angepasstem Kontrollantikörper UPC-10 (Organon Teknika) eine Stunde auf Eis inkubiert, dann gewaschen und eine Stunde mit Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) Ziege anti-Maus Ig (Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL) gefärbt. Die Zelloberflächenfärbung wurde in einem Becton Dickinson-Durchflusscytometer (Mountain View, CA) gemessen und die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) wurde für 10,000 lebende Zellen gegen die Peptidkonzentration aufgetragen.
TCR-KETTENVERWENDUNG
T-N1 CTL wurden wie beschrieben für 5 Zyklen antigener Stimulation unter Verwendung des CAP1-6D-Analogons kultiviert. Die Linie wurde dann geteilt und doppelte Kulturen wurden für 5 zusätzliche Stimulationszyklen entweder mit CAP1 oder CAP1-6D gehalten. Ficoll-gereinigte T-Zellen (5 × 10⁵) wurden mit einer Reihe aus 19 Anti-Vβ und 2 anti-Vα monoklonalen Maus-Antikörpern gegen humane αβ T-Zellrezeptor-variable Regionen gefärbt. Die Zellen wurden für 30 Minuten mit 10 μg/ml gereinigter Antikörper bei 4°C inkubiert. Die unmarkierten Monoklonalen, die hier verwendet wurden: Vβ3.1 Klon 8F10, Vβ5(a) Klon 1C1, Vβ5(b) Klon W112, Vβ5(c) Klon LC4, Vβ6.7 Klon OT145, Vβ8(a) Klon 16G8, Vβ12 Klon S511, Vβ13 Klon BAM13, Vα2 Klon F1 und Vα12.1 Klon 6D6 (T Cell Diagnostics, Woburn, MA) und Vβ18 (Immunotech, Westbrook, ME). Die Zellen wurden mit 10 μg/ml FITC-markierter Ziege anti-Maus IgG Antikörper (Southern Biotechnology Associates) für 30 Minuten im Dunkeln gefärbt. Direkt markierte Monoklonale waren: FITC-markierter Vβ11, Vβ21.3, Vβ13.6, Vβ14, Vβ16, Vβ17, Vβ20 und Vβ22 und PE-markierter Vβ9 und Vβ23 (Immunotech). Die Zellen wurden mit 1% Paraformaldehyd fixiert, mit FACSFlow-Puffer (Becton Dickinson) gewaschen und unter Verwendung eines Becton Dickinson Durchflusscytometers analysiert.
BEISPIELE
CAP1-substituierte Peptide
Mehrere Faktoren wurden berücksichtigt, um zu entscheiden, welche Positionen für Auswirkungen auf T-Zellaktivität untersucht werden sollen. Sequenzier- und Kartierungsexperimente haben ein Bindungsmotiv bestimmt, in welchem Position 2 und die C-Terminalen (Position 9 oder 10) für die Peptidpräsentierung von HLA-A2 entscheidend sind (für einen Überblick siehe 31). Zusätzlich wurde Tyrosin an Position 1 als ein wirksamer zweiter Anker identifiziert (20, 32). Da das CEA-Peptid CAP1 schon die bevorzugten Aminosäuren an diesen drei Positionen aufweist, wurden diese Reste nicht verändert. Stattdessen haben wir unsere Aufmerksamkeit auf Reste gerichtet, von denen vorhergesagt wurde, dass sie mit dem TCR interagieren, in der Hoffnung Analoga zu finden, die humane CAP1-spezifische zytotoxische T-Zellen stimulieren würden. Röntgenstrahlkristallographische Studien mehrerer Peptide, welche an lösliches HLA-A2 gebunden sind, weisen darauf hin, dass alle Bindungspeptide eine gemeinsame Konformation in der Peptidbindungsfurche einnehmen (33). Bei der Untersuchung von fünf Modellpeptiden ragen Reste 5-8 aus der Bindungsspalte heraus und stehen möglicherweise für die Bindung an einen TCR zur Verfügung. Aus diesem Grund wurde eine Reihe aus 80 CAP1-Analogpeptiden hergestellt, in welchen die Reste an Positionen 5-8 (p5-p8) mit jeder der 20 natürlichen Aminosäuren synthetisiert wurden. Unter Verwendung des Einzelbuchstabenaminosäurencodes werden die Peptide CAP1-pAA bezeichnet, wobei p sich auf die Position des Peptids bezieht und AA sich auf die Austauschaminosäure bezieht; d.h. CAP1-6D, bei welchem Position 6 durch Asparaginsäure belegt ist.
Verstärkte CTL-Sensitivität der Targets für CAP1-6D-Analogon
Die Wirkungen dieser Aminosäuresubstitutionen auf eine mögliche TCR-Erkennung wurden unter Verwendung einer CAP1-spezifischen, HLA-A2-restringierten humanen CTL-Linie genannt T-Vac8 untersucht. In Kürze, T-Vac8 wurde, wie in Material und Methoden beschrieben, durch in vitro-Peptidstimulation von PBMC aus einem Patienten hergestellt, welchem rV-CEA verabreicht worden war. Für das anfängliche Screenen wurde T-Vac8 in einer zytotoxischen Untersuchung verwendet, um ¹¹¹In-Freisetzung aus markierten C1R-A2-Zellen, die mit jedem Element der Peptidreihe (in drei Peptidkonzentrationen) inkubiert wurden, zu messen. Die spontane Freisetzung aus den Targets (in der Abwesenheit von T-Vac8) wurde für jedes einzelne Peptid bestimmt.
Die Ergebnisse sind in 1A bis 1D gezeigt. Von den 80 einzelnen Aminosäuresubstitutionen aktivierten die meisten keine Zytotoxizität von T-Vac8. Jedoch bewahrten sechs unabhängige Substitutionen Reaktivität. An Position 5 lieferten drei Analoga CAP1-5F, CAP1-5I und CAP1-5S eine Stimulation jedoch zu verringerten Ausmaß im Vergleich zu CAP1 allein. An Position 6 aktivierten die Substitutionen CAP1-6C und CAP1-6D T-Vac8 Zytotoxizität und schienen gleich oder besser als CAP1 zu sein, da sie bei einer mittleren (0,1 μg/ml) Peptidkonzentration wirksamer waren. An Position 7 schien das Analogon CAP1-7I auch wirksam zu sein. Schließlich waren keine Analoga an Position 8 geeignet, Targets für eine Lyse durch T-Vac8 zu sensitivieren. Die zwei aktivsten Analoga (CAP1-6D und CAP1-7I) wurden dann eingehend untersucht, während CAP1-6C aus Sorge um Disulfidbildung unter oxidierenden Bedingungen weggelassen wurde.
Es wurden reinere Präparate (90-96% rein) nativen CAP1 und der Analoga CAP1-6D und CAP1-7I synthetisiert und unter Verwendung von zwei verschiedener Zelllinien als Targets (2A und 2B) in einer CTL-Untersuchung über einen breiteren Bereich von Peptidkonzentrationen verglichen. Analogon CAP1-6D war mindestens 10²-mal effektiver als natives CAP1 unter Verwendung von T2-Zellen. Die lytische Aktivität von CAP1-6D war bei 10^–4 μg/ml halbmaximal (2A). Demgegenüber waren das CAP1-7I-Analogon und die native CAP1-Sequenz miteinander über den gesamten Bereich der Peptidtitration vergleichbar und zeigten eine halbmaximale Lyse bei 10^–2 μg/ml. Bei der Verwendung von C1R-A2-Zellen als Targets war CAP1-6D in ähnlicher Weise zwischen 10² und 10³-mal effektiver, eine Lyse zu vermitteln als CAP1 (2B).
Das CAP1-6D-Peptid wurde unter Verwendung einer zweiten CEA-spezifischen T-Zelllinie, T-Vac24 (11) auch getestet. Diese Linie wurde aus rV-CEA-PBMC postimpfung eines anderen Karzinompatienten durch in vitro-Stimulation mit dem nativen CAP1-Peptid erzeugt; im Unterschied zu vorwiegend CD8⁺ T-Vac8 weist T-Vac24 einen hohen Anteil von CD4⁺CD8⁺ doppelt-positiven Zellen (11) auf. In einer 4 Stunden ¹¹¹In-Freisetzungsuntersuchung unter Verwendung von T-Vac24 war CAP1-6D geringfügig wirksamer (30% Lyse) als die native CAP1-Sequenz (20% Lyse); obwohl die Unterschiede nicht so ausgeprägt waren wie mit T-Vac8, wurde die erhöhte Sensitivität auf das Analogon in drei getrennten Experimenten gesehen. Das analoge Peptid belegte eindeutig den lytischen Apparat einer zweiten CAP1-spezifischen CTL.
Analoga und natives Peptid weisen eine identische Präsentierung durch HLA-A2 auf
Die erhöhte Wirksamkeit des CAP1-6D in CTL-Untersuchungen könnte auf eine verbesserte Präsentierung durch das Target zurückzuführen sein. Die wirksamsten CAP1-Analoga wurden auf die Bindung an HLA-A2 getestet, indem Zelloberflächen-HLA-A2 in der Transport-gestörten humanen Zelllinie T2 gemessen wurde. Natives CAP1 und die zwei Analoga CAP1-6D und CAP1-7I präsentierten alle gleichmäßig auf T2-Zellen, als sie über einen 4-Log-Bereich an Konzentrationen verglichen wurden. Zusätzlich weisen Dissoziationsexperimente darauf hin, dass die HLA-A2-Komplexe, die mit den drei Peptiden entstehen, keine merklichen Unterschiede in der Stabilität zeigen (3 – Einlage). Als Peptid-gepulste T2-Zellen von ungebundenem Peptid freigewaschen wurden, betrugen die Halbwertszeiten der Zelloberflächenpeptid-A2-Komplexe 12,5 Stunden (CAP1), 9,7 Stunden (CAP1-6D) und 10,8 Stunden (CAP1-7I). Wenn überhaupt, scheint der Komplex, welcher sich mit dem Agonistenpeptid gebildet hat, geringfügig weniger stabil. Da es bei der Bindung an HLA-A2 keine Unterschiede gibt, scheint die verbesserte Wirksamkeit von CAP1-6D in den CTL-Untersuchungen auf eine bessere Bindung durch den T-Zellrezeptor zurückzuführen sein, ein Verhalten, welches für ein Verstärkeragonistenpeptid typisch ist.
Mit CAP1-6D erzeugte humane CTL erkennen auch natives CAP1
Der CAP1-6D-Agonist könnte für sowohl experimentelle als auch klinische Anwendungen nützlich sein, wenn es Wachstum CEA-spezifischer CTL von Patienten mit bestehenden Karzinomen stimulieren kann. In einem Experiment wurden Post-rV-CEA-Immunisierungs-PBMC aus Krebspatient Vac8 (derselbe rV-CEA-Patient aus welchem T-Vac8-CTL gebildet wurden) mit CAP1-6D in vitro stimuliert und nach fünf Stimulationsrunden auf CTL-Aktivität gegen Targets, die mit CAP1 oder CAP1-6D beschichtet waren, untersucht. Diese neue Linie zeigte Peptid-abhängige zytotoxische Aktivität gegen Targetzellen, welche entweder mit CAP1-6D oder nativem CAP1 beschichtet waren (Tabelle 1).
Postimmunisierungs-PBMC aus Patienten Vac8 und Vac24 wurden schon aufgezeigt, eine CTL-Aktivität zu erzeugen, als sie mit CAP1 stimuliert wurden, während die Präimmunisierungs-PBMC negativ waren (11,34). Darüber hinaus waren vorherige Versuche, CTL-Aktivität von gesunden nicht immunisierten Spendern mit dem CAP1-Peptid zu stimulieren, nicht erfolgreich. Um zu untersuchen, ob das Agonistenpeptid in der Tat immunogener als natives CAP1 ist, versuchten wir, CTL aus gesunden nicht immunisierten Spender unter Verwendung von CAP1-6D zu erzeugen. HLA-A2⁺ PBMC aus offensichtlich gesunden Individuen wurden in vitro entweder mit CAP1 oder dem CAP1-6D-Agonisten stimuliert. Nach vier in vitro-Stimulationszyklen wurden die Zelllinien auf Spezifität gegen C1R-A2-Zellen, die mit entweder CAP1 oder CAP1-6D gepulst waren, untersucht.
Während Stimulierungen mit CAP1 oder dem CAP1-6D-Peptid T-Zelllinien hervorbrachten, wurde eine Peptid-spezifische Lyse nur in den Linien, die mit CRP1-6D erzeugt wurden, erhalten. Zwei unabhängige T-Zelllinien aus verschiedenen Spendern wurden unter Verwendung von CRP1-6D erlangt und als T-N1 und T-N2 bezeichnet (4A bzw. 4B). Beide CTL-Linien lysieren C1R-A2-Targets, die mit nativem CAP1-Peptid gepulst sind. Jedoch wird eine wirksamere Lyse unter Verwendung des CAP1-6D-Agonisten erzielt. T-N1 CTL erkennen CAP1-6D bei einer 3-10-fach geringeren Peptidkonzentration als CAP1, und T-N2 erkennt den Agonisten 100-fach besser als CAP1. Demgegenüber ergaben Versuche, eine CTL-Zelllinie aus normalen Spender durch die Stimulierung mit CAP1 zu erzeugen, Linien ohne Peptid-abhängige Lyse und den Verlust der Linien in frühen Stimulationszyklen. Demnach zeigten die Versuche, T-Zelllinien unter Verwendung der zwei Peptide zu erzeugen, die Fähigkeit, von CAP1-6D als Agonist nicht nur im Effektor stadium bei der Lyse der Targets, sondern auch bei der Auswahl von T-Zellen, die vermutlich in geringen Vorläuferhäufigkeiten bestehen, zu wirken.
Um festzustellen, ob CTL, die mit dem Agonisten erstellt wurden, auf der nativen CAP1-Sequenz gehalten werden könnten, wurde T-N1 für 5 Zyklen wie beschrieben unter Verwendung von CAP1-6D kultiviert, dann in doppelte Kulturen geteilt, welche auf dem Agonisten oder auf CAP1 gehalten wurden. T-N1 wuchs weiterhin, als sie mit jedem der Peptide stimuliert wurde und reagierte auf beide Peptide in CTL-Untersuchungen. Eine phänotypische Analyse der TCR-Verwendung in T-N1 deutet darauf hin, dass die Mehrzahl an Zellen (71%) Vβ12 benutzt, wobei eine geringere Population Vβ5.3 benutzt (Tabelle 2). Dasselbe TCR Vβ-Verwendungsmuster wurde beobachtet, nachdem die Zellen für fünf weitere Stimulationszyklen auf CAP1 gewechselt wurden. Dieses Vβ-Verwendungsmuster war anders als das der T-Vac8. Diese Daten weisen darauf hin, dass der Agonist T-Zellen selektieren kann, die wahrscheinlich in geringer Vorläuferhäufigkeit auftreten, aber dass, einmal ausgewählt, solche CTL mit dem nativen CAP1 gehalten werden können.
CTL, welche mit CAP1-6D erzeugt wurden, lysierten spezifisch CEA⁺, HLA-A2⁺-Tumorzellen
Es wurden Studien durchgeführt, um die Fähigkeit der CTL, welche mit dem Verstärkeragonisten erzeugt waren, zu bestimmen, humane Tumorzellen, welche endogen CEA exprimieren, zu lysieren. T-N1 und T-N2 wurden gegen eine Reihe aus Tumorzellen, welche CEA⁺/A2⁺ (SW480 und SW1463), CEA⁺/A2^– (SW1116) oder CEA^–/A2⁺ (CaOV3 und SKme124) sind, getestet. Eine T-Zelllinie (T-N2) eines normalen Spenders wurde auf die Fähigkeit hin untersucht, Tumortargets, die endogen CEA exprimieren, zu lysieren. T-N2 CTL, die mit dem Agonisten erzeugt waren, lysierten Tumorzellen, die sowohl CEA als auch HLA-A2 exprimieren, obwohl sie keine titrierbare Lyse der CEA^–/A2⁺ SKme124-Melanomzellen aufweisen (5A). Es wurde keine signifikante Lyse der K562 beobachtet. Dagegen zeigten Zelllinien, welche durch die Stimulation mit nativem CAP1 erzeugt waren, keine nachweisbare Antitumoraktivität (5B). Die HLA-A2.1-Restriktion der T-N2-Antwort auf CEA-positive Tumortargets wurde des Weiteren durch die spezifische Lyse einer CEA-positiven HLA-A2.1-negativen Tumorzelle, SW837 nach Infektion mit einem Vaccinia A2.1-Konstrukt (rV-A2.1) gezeigt. Keine Lyse wurde beobachtet, als SW837-Targets mit Kontroll-Wildtyp-Vaccinia ohne A2.1-Transgen infiziert wurden (6).
Die Fähigkeit einer CTL-Linie (T-N1), welche von einem zweiten Spender stammte, Karzinomtargets, welche endogenes CEA exprimieren, abzutöten, wird in 7A und 7B gezeigt. T-N1 lysierte spezifisch SW480-Tumorzellen. Dies wird durch die Vorbehandlung der Tumorzellen mit IFN-γ drastisch auf 79% Lyse verstärkt, einer Behandlung, die die Zelloberflächendichte von sowohl HLA-A2 als auch CEA erhöht. Die Spezifität der T-N1-Abtötung wird durch seine Unfähigkeit gezeigt, CEA^–/A2⁺-Tumore wie z.B. den aus Eierstock stammenden Tumor CaOV3, den Melanomtumor SKme124 oder das NK-Target K562 zu lysieren. Schließlich wird die Restriktion durch HLA-A2 durch das Versagen von T-N1 gezeigt (7A), CEA⁺/A2^– SW1116-Tumorzellen, selbst nach IFN-γ-Behandlung (7B) zu lysieren. Tabelle 1: CTL, welche durch die Stimulation mit dem CAP1-6D-Analogon aus PBMC eines HLA-A2-Patienten, welcher mit rVCEA immunisiert wurde, erzeugt wurden

% Lyse

Effektor/Target-Verhältnis Kein Peptid CAP1 CAP1-6D

25:1 10% 41% 40%

6,25:1 0,5% 38% 46%
T-Zellen wurden nach 5 in vitro-Stimulationen untersucht. Die zytotoxische Aktivität wurde in einer 4-stündigen Freisetzungsuntersuchung mit Peptid zu 25 μg/ml bestimmt. Tabelle 2: TCR-Verwendung einer CTL-Linie, welche an einem CAP1-6D-Agonisten gebildet wurde

TCR-Verwendung^a T-Nl^b T-Nl^c

% positive MFI % positive MFI

Vβ12 71 83 70 83

Vβ5.3 18 47 20 57

Vβ3.1 6 48 8 46

Vβ8 3 30 6 26

Vβ13.6 2 19 3 39

Vβ12.1 3 43 3 40

^a Bestimmt durch FACS-Analyse unter Verwendung einer Reihe aus 19 Vβ und 2 Vα-Antikörpern (siehe Material und Methoden). Nur positiv gefärbte Antikörper sind gezeigt.
^b CTL-Linie, die, wie im Material und Methoden-Teil beschrieben, selektiert und auf CAP1-6D-Agonist gehalten wurde.
^c CTL-Linie, die für fünf Stimulationszyklden auf dem CAP1-6D-Agonist selektiert und auf CAP1 für weitere 10 Zyklen gehalten wurde.

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SEQUENZLISTE

Claims

Peptid, umfassend einen Agonisten einer MHC-Klasse I-bindenden nativen Sequenz:
wobei der Agonist in einer Aminosäuresubstitution an der Position 6 und/oder der Position 7 zu SEQ ID NO: 1 variiert, und der Agonist im Vergleich zu der nativen Sequenz eine verbesserte Immunogenizität aufweist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die mindestens ein Peptid gemäß Anspruch 1 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 2, die ferner ein immunstimulatorisches Molekül umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 3, wobei das immunstimulatorische Molekül ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus IL-2, B7.1, B7.2, ICAM-1, LFA-3, CD72, GM-CSF, TNFα, INFγ, IL-12, IL-6 und Kombinationen davon.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 2, die ferner ein HLA-Klasse I-Molekül oder eine Zelle, die ein HLA-Klasse I-Molekül exprimiert, umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 2, die ferner ein Chemotherapeutikum, Antibiotikum, Antivirusmittel, Antimykotikum, oder Cyclophosphamid umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 2, die ferner ein Adjuvanz umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 7, wobei das Adjuvanz ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Alaun, unvollständigem Freundschem Adjuvanz, QS21 und Ribi Detox^TM.
Peptid-Immunglobulin-Konjugat, das das Peptid gemäß Anspruch 1 und ein Immunglobulinmolekül umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 2, wobei das Peptid in ein Liposom eingebaut ist.
Peptid-Trägermolekül-Konjugat, das das Peptid gemäß Anspruch 1 in Konjugation an ein Trägermolekül umfasst.
Peptid-Trägermolekül-Konjugat gemäß Anspruch 11, wobei das Trägermolekül ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Influenzapeptid, Tetanustoxoid, Tetanustoxoid-CD4-Epitop, Pseudomonas Exotoxin A, Poly-L-Lysin, einem Lipidschwanz und einer Signalsequenz für das endoplasmatische Retikulum.
Kit, der das Agonisten-Peptid gemäß Anspruch 1 und einen Vektor, umfassend eine für CEA kodierende Nukleinsäuresequenz, umfasst.
Kit gemäß Anspruch 13, der ferner ein immunstimulatorisches Molekül umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 5, wobei das HLA-Klasse I-Molekül HLA-A2 ist.
Kit gemäß Anspruch 13, wobei das kodierte CEA ein Epitop YLSGANLNL (SEQ ID NO: 1) umfasst.
Kit gemäß Anspruch 14, wobei das immunstimulatorische Molekül GM-CSF ist.
Peptid gemäß Anspruch 1 für eine Verwendung in der Medizin.
Verwendung des Peptids gemäß Anspruch 1 für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für Krebs-Immuntherapie.
Verwendung gemäß Anspruch 19, wobei die Krebs-Immuntherapie eine Behandlung und/oder eine Vakzinierung eines Patienten mit einem CEA-exprimierenden Krebs umfasst.
Verwendung gemäß Anspruch 19 oder 20, wobei der Krebs ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus colorektalem Krebs, Darmkrebs, Lungenkrebs, Pankreaskrebs, Krebs des Endometriums, Brustkrebs, Schilddrüsenkrebs, Melanom, Mundkrebs, Kehlkopfkrebs, Seminom, hepatozellulärem Krebs, Krebs des Gallengangs, akuter myeloblastischer Leukämie, Basalzellenkarzinom, Plattenepithelkarzinom und Prostatakrebs.