DE69725428T2 - Menschliches krebsagent des tyrosinase ähnlichen proteins 1 und gene, die es kodieren - Google Patents

Menschliches krebsagent des tyrosinase ähnlichen proteins 1 und gene, die es kodieren Download PDF

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf den Bereich der Krebsdiagnostik und der Therapeutika, einschließlich eines Impfstoffs gegen Krebs. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf die Isolierung und Aufreinigung eines neuen Krebspeptides und einer DNA-Sequenz eines alternativen offenen Leserahmens, die für das Krebspeptid kodiert. Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf die Isolierung und Aufreinigung eines neuen Tumorantigens, das als Werkzeug zur Behandlung und Prävention von Krebs dienen kann, und auf eine DNA-Sequenz, die für das Krebsantigen kodiert. Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf neue Krebspeptide, die von einer DNA-Sequenz eines alternativen offenen Leserahmens kodiert werden, die vom Tyrosinase-verwandten Protein-1-Gen (TRP1) abstammen. Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf Verfahren zum Nachweis und zur Diagnose und zur Behandlung von Krebs und Vorstufen von Krebs in einem Individuum.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Der adoptive Transfer von Tumor-infiltrierenden Lymphozyten (TIL) kann in Patienten mit metastasierendem Melanom zum Rückgang des Tumors führen, was nahelegt, dass tumorabstoßende Antigene, die von T-Zellen erkannt werden, auf diesen Tumorzellen vorhanden sind. Die Existenz solcher T-Zellen hat es ermöglicht, die Gene zu klonieren und zu sequenzieren, die für menschliche Melanomantigene kodieren. Die bisher von menschlichem Melanom identifizierten Antigene können aufgrund ihres Expressionsmusters in zwei Klassen eingeteilt werden. Die Antigene der ersten Klasse werden von Genen kodiert, die nur in Tumor- und Hodengewebe, aber nicht in anderen normalen menschlichen Geweben exprimiert werden. MAGE1, MAGE3, GAGE und BAGE sind Beispiele dieser Klasse. Die zweite Klasse von Antigenen stellt Differenzierungsantigene dar, die von Genen kodiert werden, die nur in Melanozyten, Melanomen und in der normalen Retina exprimiert werden. MART-1/Melan-A, gp100 und Tyrosin sind Beispiele dieser Klasse. All diese Antigene sind nicht-mutierte Selbst-Proteine. Untersuchungen, die Unterschiede bei der Expression mutmaßlicher Antigene, die von Pigmentgenen kodiert werden, zwischen melanotischen und relativ amelanotischen Bestandteilen primärer und fortgeschrittener Mausmelanome zeigen, wurden von Orlow SJ et al., PNAS USA 195, Bd. 92: 10152–10156, gezeigt. Es wurde jedoch auch nachgewiesen, dass einige mutierte Antigene von T-Zellen erkannt werden, einschließlich CDK 4, B-Catenin und Mum-1. Kawakami Y. et al., J. Exp. Med. 1994, Bd. 180: 347–352, zeigen in Untersuchungen, dass die Melanomproteine MART-1 und gp100 durch HLA-A2-restringierte melanomspezifische zytotoxische T-Lymphozyten erkannt wurden, die von tumor-infiltrierenden Lymphozyten (TIL) abgeleitet waren. Die Identifizierung der antigenen Epitope, die von entsprechenden Genprodukten abgeleitet sind, die von T-Zellen erkannt werden, ist nicht nur für das Verständnis der Mechanismen der Immunantwort gegen Selbst-Antigene notwendig, aber auch zur Entwicklung neuer, wirksamer Strategien zur Immuntherapie mit diesen Antigenen oder mit synthetischen Peptiden zur Behandlung von Krebspatienten.
  • Frühere Studien zeigten, dass die Infusion von TIL586 mit IL-2 in einen autologen Patienten mit Melanom zu einem objektiven Rückgang der Metastasen führte. Erst kürzlich wurde das Gen für Tyrosinase-verwandtes Protein 1 (TRP-1 oder gp75), das das von TIL586 zusammen mit HLA-A31 erkannte Tumorantigen kodiert, kloniert. Interessanterweise wurde das Genprodukt gp75 ursprünglich als ein Antigen identifiziert, das in IgG-Antikörpern im Serum eines Patienten mit metastasierendem Melanom erkannt wurde. Es wurde nachgewiesen, dass das Gen in Melanomen, normalen Melanozyten-Zelllinien und in Retina, aber nicht in anderen untersuchten normalen Geweben exprimiert wird. Daher ist dieses Gen ein Mitglied der zweiten Klasse von Antigenen, einschließlich MART-1/Melan-A, gp100 und Tyrosinase. Wang R. F et al., J. Exp. Med. 1995, Bd. 181: 799–804, offenbaren die Identifizierung eines Gens, das ein Melanomtumor-Antigen kodiert, das von HLA-A31-restringierten Tumorinfiltrierenden Lymphozyten erkannt wird, dessen cDNA fast identisch zu dem Gen ist, das für Glykoprotein gp75 kodiert.
  • Es war schwierig, ein Epitop auf einer Krebszelle zu identifizieren, das zur Verwendung als Immunogen oder Impfstoff zum Schutz eines Individuums vor der Krebsentstehung nützlich sein würde. Die vorliegende Erfindung besteht in der Identifizierung eines Krebspeptids und des innerhalb des Peptids enthaltenen Antikrebs-Epitops, das von einer Sequenz eines alternativen offenen Leserahmen innerhalb des TRP-1-Gens kodiert wird, das spezifisch durch T-Zellen erkannt wird. Yokoyama K. et al., Biochimica et Biophysica Acta 1994, 1217: 317–321, offenbaren die Klonierung von cDNAs, die für Tyrosinase-verwandtes Protein-2 (TRP-2) kodieren, aus einer menschlichen Melanom-cDNA-Bibliothek.
  • Das erfindungsgemäße Krebspeptid ist als Immunogen und Impfstoff zur Hemmung oder Vorbeugung von Krebs in einem Säuger nützlich.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein neues Peptid und Teile davon bereitzustellen, die durch T-Lymphozyten als Krebsantigen erkannt werden.
  • Das erfindungsgemäße Krebspeptid und das antigene Krebsepitop des Krebspeptids wird durch eine alternative offene Leserahmen-DNA-Sequenz eines Gens kodiert, die sich von der offenen Leserahmen-DNA-Sequenz unterscheidet, die dazu verwendet wird, ein normales Protein oder Peptid desselben Gens zu kodieren. Hierunter fällt das Gen TRP-1.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung besteht in einem Tumorantigen, das von einer alternativen offenen Leserahmen-DNA-Sequenz eines Gens kodiert wird, das sich von der offenen Leserahmen-DNA-Sequenz unterscheidet, die für ein normales Protein oder Peptid desselben Gens kodiert. Hierunter fällt das Gen TRP-1.
  • Andere Gegenstände der vorliegenden Erfindung sind Peptidfragmente von TRP-1 und Varianten davon, die als Krebspeptid wirksam sind.
  • TRP-2 ist ein Mitglied der Tyrosinase-verwandten Genfamilie. TRP-2 wird gegenwärtig als neues und starkes Tumorantigen identifiziert, das dazu führen kann, dass T-Zellen eine Immunantwort auslösen.
  • Ein Aspekt der Erfindung sind Krebspeptide, die vom TRP-1-Gen kodiert werden oder Varianten davon, die sich als Krebsimpfstoff eignen und dazu fähig sind, den Empfänger vor der Krebsentstehung zu schützen. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zur Verabreichung des Krebsimpfstoffs in einer wirksamen Menge, um Krebs zu verhindern.
  • Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Krebspeptid oder ein antigenes Krebsepitop davon alleine oder in Kombination mit einem oder mehreren immunstimulatorischen Molekülen enthält. Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine pharmazeutische Zusammensetzung umfassend das TRP-1-Krebsantigen alleine oder in Kombination mit einem oder mehreren koimmunstimulatorischen Molekülen. Ein anderer Gegenstand der Erfindung ist eine pharmazeutische Zusammensetzung umfassend TRP-1 oder Kombinationen davon, die T-Zellen stimulieren, um eine immunogene Antwort gegen Tumoren und Krebs auszulösen. Das Krebspeptid oder das antigene Krebsepitop davon kann als Immunogen oder als Impfstoff zur Vorbeugung oder Behandlung von Krebs bereitgestellt werden. Die pharmazeutische Zusammensetzung eignet sich zur Verwendung in Verfahren zur Behandlung oder Vorbeugung von Krebs in einem Säuger. In dem Behandlungsverfahren wird die pharmazeutische Zusammensetzung an den Säuger in einer Menge verabreicht, die wirksam ist, Krebs im Säuger vorzubeugen oder zu hemmen.
  • Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Erzeugung von Krebspeptiden und des antigenen Krebsepitops innerhalb des Peptids durch Translation einer DNA-Sequenz eines alternativen offenen Leserahmens eines Gens, die sich von der Sequenz eines offenen Leserahmens unterscheidet, der für das normale Protein desselben Gens kodiert.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis und zur Identifizierung eines Genprodukts eines Krebspeptids und von Teilen davon, die von einer DNA-Sequenz eines alternativen offenen Leserahmens eines Gens kodiert werden, die sich von dem Genprodukt unterscheidet, das von der offenen Leserahmen-DNA-Sequenz translatiert wird, die für das normale Protein oder Peptid kodiert.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die DNA- oder RNA-Sequenz eines alternativen offenen Leserahmens, die für ein Krebspeptid oder Teile davon kodiert und die Verwendung der DNA- oder RNA-Sequenz in Verfahren zur Erzeugung des Krebspeptids oder Teilen davon. Die Erfindung stellt weiterhin Oligonukleotide der DNA- oder RNA-Sequenz eines alternativen offenen Leserahmens zur Verwendung als Sonden oder Primer bereit.
  • Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin Vektoren bereit, die eine DNA-Sequenz mit einem alternativen offenen Leserahmen, der für ein Krebspeptid oder Teile davon kodiert, alleine oder in Kombination mit einer zweiten DNA-Sequenz umfassen, die wenigstens für ein immunstimulatorisches Molekül kodiert. Die DNA-Sequenz des alternativen offenen Leserahmens kann vom TRP-1-Gen oder von einer Variante davon abstammen.
  • Die Erfindung stellt ebenfalls Wirtszellen bereit, die mit einem Vektor transfiziert oder transduziert sind, der eine DNA-Sequenz eines alternativen offenen Leserahmens umfasst, der für ein Krebspeptid oder Teile davon kodiert allein oder in Kombination mit einer zweiten DNA-Sequenz die für wenigstens ein immunstimulatorisches Molekül kodiert.
  • Die Vektoren und Wirtszellen können als Impfstoffe dienen, bei denen die Expression eines Tumorantigens oder von Krebspeptiden zur Stimulierung von tumorantigen-spezifischen T-Lymphozyten in einem Säuger führt, der mit dem Impfstoff immunisiert wurde.
  • Die Vektoren und Wirtszellen können als Impfstoffe dienen, in denen die Expression eines Krebspeptids oder Teilen davon zur Stimulierung der Krebspeptid-spezifischen T-Lymphozyten in einem Säuger führt, der mit dem Impfstoff immunisiert wurde.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Diagnose menschlicher prä-neoplastischer und neoplastischer Zellen und Gewebe.
  • Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Diagnose von Krebs oder Vorstufen von Krebs in einem Säuger durch Nachweis von Krebspeptiden oder Teilen davon bereit, die von einer Nukleinsäuresequenz eines alternativen Leserahmens eines Gens kodiert werden, der sich von der Nukleinsäuresequenz eines offenen Leserahmens unterscheidet, der zur Kodierung eines normalen Proteins des gleichen Gens verwendet wird, wobei das Krebspeptid oder Teile davon durch T-Lymphozyten erkannt werden. Eine Nukleinsäuresequenz eines alternativen Leserahmens kann vom TRP-1-Gen oder von einer Variante davon abstammen.
  • Es ist ein weiterer Gegenstand der Erfindung, ein Verfahren zur Diagnose menschlicher prä-neoplastischer und neoplastischer Zellen und Gewebe bereitzustellen. Erfindungsgemäß umfasst das Verfahren die Isolierung von menschlichen Zellen, Geweben oder Extrakten daraus und Nachweis der DNA-Sequenz, RNA-Sequenz oder von Teilen eines alternativen offenen Leserahmens, der für ein Krebspeptid kodiert, oder den Nachweis des Krebspeptids oder Teilen davon, die von der DNA- oder RNA-Sequenz eines alternativen offenen Leserahmens kodiert werden, wobei der Nachweis von/oder der Anstieg der DNA- oder RNA-Sequenz oder des Expressionsproduktes des alternativen offenen Leserahmens Prä-Neoplasie und Neoplasie anzeigt.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung besteht in der Bereitstellung eines transgenen Tieres, das in seinem Genom eine oder mehrere Kopien der DNA-Sequenz eines alternativen offenen Leserahmens trägt, der für ein Krebspeptid oder Teile davon kodiert. Eine Nukleinsäuresequenz eines alternativen Leserahmens kann vom TRP-1-Gen oder von dessen Varianten stammen. Der Einbau der DNA-Sequenz des alternativen offenen Leserahmens führt zur Überexpression oder Expression multipler Formen oder Varianten des Krebspeptids. Solche transgenen Tiere eignen sich zum Screening therapeutischer Agenzien, die zur Krebsbehandlung nützlich sind.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung besteht in der Bereitstellung eines transgenen Tieres, das in seinem Genom eine oder mehrere Kopien des erfindungsgemäßen Tumorantigens trägt. Solche transgenen Tiere eignen zum Screening auf therapeutische Agenzien, die zur Behandlung von Krebs nützlich sind.
  • Die Erfindung umfasst ebenfalls Antisense-Oligonukleotide, die spezifisch auf Nukleinsäuresequenzen eines alternativen offenen Leserahmens gerichtet sind, an diesen binden und die Expression des Krebspeptids oder des Tumorantigens hemmen, ohne die Expression des normalen Proteins desselben Gens nachteilig zu beeinflussen.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung sind monoklonale und polyklonale Antikörper, die mit dem Krebspeptid und davon abstammenden antigenen Krebsepitopen reaktiv sind, einschließlich des TRP-1-Krebspeptids zur Verwendung in diagnostischen Tests und Nachweistests. Die monoklonalen und polyklonalen Antikörper können in der Form eines Kits alleine oder zusammen mit anderen, häufig in diagnostischen und Nachweiskits verwendeten Reagenzien bereitgestellt werden.
  • Kurze Beschreibung der Abbildungen
  • Diese und andere Gegenstände, Eigenschaften und viele Vorteile der Erfindung werden anhand der begleitenden Zeichnungen veranschaulicht:
  • 1A und 1B zeigen die Position der gp75-Nukleotidsequenz, die für die von TIL586 erkannten Antigen-Peptide kodiert.
  • 1A zeigt die Gesamtlängen-cDNA, die einen offenen Leserahmen von gp75 in einer Länge von 1584 Basenpaaren umfasst. Die Nummerierung der Nukleotide, die zu einem Protein, bestehend aus einer Leader-Sequenz und dem reifen gp75, translatiert werden, beginnt am Start-Codon. pcDNA776 ist eine partielle cDNA von gp75, der die ersten 246 Nukleotide des kodierenden Bereichs fehlen. Diese wurde aus einer cDNA-Bibliothek mit einem Assay isoliert, der auf der Fähigkeit der cDNA beruht, GM-CSF durch Sekretion von TIL586 zu stimulieren, wenn COS-7-Zellen zusammen mit dem Gen HLA-A31 kotransfiziert werden. Eine Reihe von Deletionskonstrukten und PCR DNA-Fragmenten wurde hergestellt.
  • pD776A ist ein Derivat von pcDNA776 nach Verdau mit dem Apal-Restriktionsenzym.
  • 1B zeigt die Freisetzung von GM-CSF durch TIL586. Die Freisetzung von GM-CSF durch TIL586 wurde nach Ko-Kultivierung mit COS-7 gemessen, die mit den in 1A gezeigten DNA-Fragmenten und dem HLA-A31-Genkode ko-transfiziert wurden. Kontrollstimulator-Zellen umfassen 586mel, 397mel/A31+, COS-7 allein und COS-7 transfiziert entweder mit HLA-A31 oder der cDNA pcDNA776.
  • 2 zeigt die Nukleotid-, Aminosäure-Sequenz und die offenen Leserrahmen des gp75-Gens. Die partiellen Nukleotid- und Aminosäuresequenzen der ersten 157 Aminosäuren wurden vom Start-Codon für die Translation von ORF1 (gp75) gezeigt. Das DNA-Fragment, das die Fähigkeit verlieh, die Freisetzung von GM-CSF aus TIL586 zu stimulieren, ist unterstrichen. Zwei mögliche Start-Codons, ATG (254–256) und ATG (294–296) sind fett gedruckt dargestellt und können zur Translation von ORF2 bzw. ORF3 führen. Die aus ORF3 erkannte Peptidsequenz, die von TIL586 erkannt wird, ist fett gedruckt und unterstrichen.
  • 3A und 3B zeigen ein antigenes Peptid und die Translation eines alternativen offenen Leserahmens.
  • 3A zeigt die Lage und Länge der durch PCR amplifizierten PCR-Fragmente. DNA-Fragmente wurden durch PCR-Amplifikation erhalten und dann in den PCR3-Expresasionsvektor kloniert. Der Austausch von ATG an den Positionen 294–296 durch ATC wurde wie in Material und Methoden beschrieben durchgeführt.
  • 3B zeigt das Austesten von DNA-Fragmenten und Mutationskonstrukten zur Stimulierung der Cytokin-Freisetzung aus TIL586. Der GM-CSF-Freisetzungs-Assay wurde wie in 1 durchgeführt.
  • 4A–4C zeigen die Charakterisierung des von TIL586 erkannten antigenen Peptids.
  • 4A zeigt die Freisetzung von GM-CSF durch HLA-A31-restringierte TIL586 nach Ko-Inkubation mit verschiedenen Stimulatoren. Transfektions- und Cytokin-Assays wurden wie in 1A und B durchgeführt. Als positive und negative Kontrollen für die Reaktivität von TIL586 wurden 586mel und 397mel verwendet. Das ORF3P-Peptid wurde mit 586EBV-(A31+) und T2-(nicht-A31)-Zellen in einer Konzentration von 1 μg/ml für 90 min inkubiert. Die Stimulation der GM-CSF-Freisetzung durch TIL586 stieg signifikant bei Koinkubation mit autologem 586EBV- und allogenen 1510EBV-(A31+)Zellen an, die mit Peptid ORF3P beladen wurden, aber nicht bei Koinkubation entweder mit 586EBV alleine oder T2-(nicht-A31)-Zellen, die mit dem ORF3P-Peptid beladen waren.
  • 4B zeigt die cytotoxische Lyse der Zielzellen durch TIL586. 586mel (-∎-) und 397mel (☐-) wurden als positive bzw. negative Kontrollen verwendet. 586EBV-B-Zellen wurden mit ORF3 (pep) (-
    Figure 00080001
    -) mit einem irrelevanten Peptid (ipep) (-•-), ohne Peptid (-Δ-) und T2-Zellen inkubiert, die mit ORF3P (-O-) beladen wurden. Nach Inkubation wurde TIL586 zugegeben und mit den Zielzellen vermischt. Die cytolytische Aktivität von TIL586 wurde in einem 4 Std. andauernden Chrom-Freisetzungstest gemessen.
  • 4C zeigt die Titrierung der Peptid-Konzentration, um die Zielzellen für die Lyse durch TIL586 zu sensibilisieren. 586EBV-Zellen wurden getrennt mit Reihenverdünnungen von ORF3P (pep) (-
    Figure 00090001
    -) oder irrelevanten Peptiden (ipep) (-•-) und T2-Zellen mit dem ORF3P-Peptid (-O-) für 90 min inkubiert. Die cytolytische Aktivität von TIL586 wurde für 4 Std. in einem 51Cr-Freisetzungs-Assay bei einem Verhältnis von Effektor : Ziel (E : T) von 40 : 1 ausgewertet.
  • 5A und 5B zeigen die Hemmung der Lyse von 51Cr-markierten Zielzellen durch nichtmarkierte 586EBV-Zellen, die mit dem ORF3P-Peptid beladen sind.
  • 5A zeigt 586mel-Zellen, die für 90 min mit Chrom als radioaktiv-markiertes Ziel markiert wurden. Mit ORF3P-(-
    Figure 00090002
    -)-beladene 586EBV-Zellen mit irrelevantem Peptid (-Δ-) und mit ORF3P-(-☐-)-beladene T2-Zellen wurden als nicht-markierte Zielzellen verwendet. Nach dem Waschen wurden markierte und nicht-markierte Zielzellen nochmals gezählt und in einem Verhältnis von nicht-markiert zu markiert von 1 : 1, 5 : 1, 10 : 1 und 20 : 1 vermischt. TIL586 wurde in einem Verhältnis von Effektor : markiertes Ziel (E : T) von 20 : 1 zugegeben. Die Freisetzung von Chrom wurde 4 Std. nach der Inkubation gemessen.
  • 5B zeigt, dass die Lyse von 51Cr-markiertem 624mel („markierte Zielzellen) durch as gp100 erkannte, nicht durch mit ORF3P-(-
    Figure 00090003
    -)-beladene 586EBV-Zellen gehemmt wurde, verglichen zu 586EBV-Zellen, die mit einem irrelevantem Peptid (-Δ-) beladen wurden. Markierte und nicht-markierte Zielzellen wurden in den angegebenen Verhältnissen vermischt. TIL1200 wurde in einem Verhältnis von Effektor : markiertem Ziel (E : T) von 30 : 1 zugegeben. Die cytolytische Aktivität von TIL1200 wurde über 4 Std. in einem 51CR-Freisetzungsassay bewertet.
  • 6A–6D zeigen die Erkennung der antigenen Peptid-T-Zellklone der TIL586-Zelllinie, T-Zellklone wurden aus der TIL586-Zelllinie generiert. 586EBV-B-Zellen wurden mit dem ORP3-Peptid oder einem irrelevanten Peptid beladen. T-Zellklone oder TIL586-Zellen wurden hinzugegeben und ko-inkubiert. Für 586mel wurden 397mel/A31+ Tumoren und NHEM680 Melanozytenzellen in einer Konzentration von 1 × 105 Zellen pro Vertiefung mit 1 × 1205 Zellen zu T-Zellklonen, TIL586-C1 (6A), TIL586-C4 (6B) und TIL586-C6 (6C) oder TIL586 (6D) für jeweils 18–24 Std. inkubiert. Der GM-CSF-Assay wurde wie in 1B beschrieben durchgeführt.
  • 7. Erkennung verschiedener Zielzellen und des antigenen Peptids durch von TIL586 abgeleitete CTL-Klone. T-Zellklone wurden durch limitierende Verdünnung (1 Zelle pro Vertiefung) aus der TIL586-Zelllinie erzeugt und in AIM-V-Medium, das 6000 IU/ml IL-2 enthielt, weiter expandiert. Die Sekretion von GM-CSF durch den CTL-Klon 586TIL-C1 und durch Klon 4 wurde nach der Ko-Kultivierung mit einer normalen Melanozyten-Zelllinie (HLA-A31+), mit dem ORF3-Peptid oder mit irrelevantem Peptid behandelten 586EBV-B-Zellen, mit 397mel- oder 586mel-Zellen gemessen.
  • 8. Identifizierung von TRP-2 als neues, von CTL-Klon 4 erkanntem Tumorantigen. Die Freisetzung von GM-CSF aus dem CTL-Klon 4 wurde nach Ko-Kultur mit COS-7 gemessen, die mit HLA-A31-cDNA zusammen mit Genen ko-transfiziert wurden, die für MART-1, gp75/TRP-1, gp100, Tyrosinase, p15 und TRP-2 kodieren. Kontrollstimulatorzellen umfassten 586mel, 397mel, COS-7 alleine und COS-7, transfiziert mit HLA-A31-cDNA.
  • 11A bis 11C. Charakterisierung des vom CTL-Klon 4 erkannten antigenen Peptids. 11A. Freisetzung von GM-CSF aus T-Zellen bei verschiedenen Peptidkonzentrationen. 586EBV (A31+) wurden mit dem TRP197–205-Peptid (-
    Figure 00100001
    -) und T2-(nicht-A31)-Zellen wurden mit dem TRP197–205 (-•-) bei verschiedenen Peptid-Konzentrationen für 90 min beladen. 586EBV-B-Zellen (-Δ-) wurden mit ORF3P als Kontrollpeptid beladen. Die Freisetzung von GM-CSF durch den CTL-Klon 4 wurde nach Ko-Inkubation mit 586EBV-B-Zellen, die mit TRP197–205 und ORF3P beladen waren, und T2-Zellen, die mit TRP197–205 beladen wurden, bestimmt. 11B. Sensibilisierung der Zielzellen für die Lyse durch den CTL-Klon 4 bei verschiedenen Peptid-Konzentrationen. 586EBV-B-Zellen wurden bei verschiedenen Peptid-Konzentrationen inkubiert mit TRP197–205 (-
    Figure 00100002
    -), mit einem irrelevanten Peptid ORP3P (-Δ-) und mit T2-Zellen, die mit TRP197–205 (-•-) behandelt wurden. Nach der Peptid-Inkubation wurden die Zielzellen für 30 min markiert. Nach den Waschschritten wurden die cytolytische Aktivität des CTL-Klons 4 in einem Verhältnis von E : T von 40 : 1 nach einer 4-stündigen Inkubation von T-Zellen mit Zielzellen gemessen. 11C. Lyse der Zielzellen durch den CTL-Klon 4 in verschiedenen E : T-Verhältnissen. Die Zielzellen 586EBV wurden getrennt mit TRP197–205 (-
    Figure 00110001
    -) oder den irrelevanten Peptiden ORF3P (-Δ-) inkubiert und die Zielzellen T2 wurden mit TRP197–205 (-•-) für 90 min inkubiert. Als positive bzw. negative Kontrollen wurden 586mel (-Δ-) und 397mel (-
    Figure 00110002
    -) verwendet.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung umfasst Krebspeptide, Tumorantigene und Teile, Derivate oder Varianten davon, die durch T-Lymphozyten des Immunsystems immunologisch erkannt werde. Die vorliegende Erfindung umfasst weiterhin das/die antigene(n) Krebsepitop(e), die in den Krebspeptiden oder Tumorantigenen enthalten sind. Das antigene Krebsepitop löst spezifisch eine zellulär vermittelte Immunantwort durch Interaktion mit T-Zellen des Immunsystems aus. Diese Interaktion zwischen dem antigenen Krebsepitop und den T-Zellen führt dazu, dass die T-Zellen gegen den Krebs reagieren und in einem Säuger, einschließlich Menschen, Krebs vorbeugen, eliminieren oder vermindern.
  • In einer Ausführungsform unterscheiden sich die Krebspeptide und das antigene Krebsepitop, das in den Krebspeptiden der vorliegenden Erfindung enthalten sind, von normalen Proteinen oder Peptiden insofern, dass die Krebspeptide durch einen alternativen offenen Leserahmen eines Gens kodiert werden, der sich von dem offenen Leserahmen unterscheidet, der für das normale Protein oder Peptid innerhalb des Gens kodiert. Das Krebspeptid und Teile davon fehlen charakteristischerweise in normalen Zellen oder sind dort in sehr niedrigen Konzentrationen anwesend und sind in Prä-Krebs- oder Krebszellen in hohen Konzentrationen anwesend. Die Expression des Krebspeptids in hohen Konzentrationen korreliert mit der Transformation von normalen Zellen zu einer Prä-Krebs- oder Krebszelle.
  • Die Krebspeptide der vorliegenden Erfindung sind Teile von Krebsarten oder sind von Krebsarten abgeleitet, die primäres oder metastasierendes Melanom, Thymom, Lymphom, Sarkom, Lungenkrebs, Leberkrebs, Nicht-Hodgkin's-Lymphom, Hodgkin's-Lymphom, Leukämien, Uteruskrebs, Zervixkrebs, Blasenkrebs, Nierenkrebs und Adenokarzinome, wie Brustkrebs, Prostatakrebs, Ovarialkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs und ähnliche einschließen, aber nicht darauf beschränkt sind.
  • Der Begriff Melanom beinhaltet in nicht beschränkender Weise Melanome, metastasierende Melanome, Melanome, die entweder aus Melanozyten oder Melanozyten-verwandten Nevus-Zellen abgeleitet sind, Melanokarzinome, Melanoepitheliome, Melanosarkome, In-situ-Melanom, sich oberflächlich ausbreitendes Melanom, knötchenförmiges Melanom, Lentigomalignes Melanom, akrales lentiginöses Melanom, invasives Melanom oder familiären atypischer Leberfleck und Melanom-(FAM-M)-Syndrom.
  • Von besonderem Interesse sind Krebspeptide, Fragmente oder Derivate davon, die in Patienten mit Krebs, insbesondere Melanom, durch autologe CTL erkannt werden. Von weiterem Interesse sind Krebspeptide, Fragmente oder Derivate davon, die von MHC-restringierten CTL, insbesondere MHC-Klasse-1-restringierten CTLs erkannt werden.
  • Das „Tumorantigen" der vorliegenden Erfindung umfasst das Krebs- oder Tumorprotein und irgendeinen Teil oder Peptid des Krebs- oder Tumorproteins, das in Säugern eine Anti-Tumorantwort auslösen kann.
  • Der hier verwendete Begriff „Krebspeptide" umfasst jedes Epitop oder Fragment eines Krebs- oder Tumorproteins, das als Tumorantigen wirkt.
  • Der hier verwendete Begriff „Fragment" bezeichnet jedes Segment eines Proteins oder Gens, das wenigstens 5 oder 6 Aminosäuren im Fall eines Proteinfragments und wenigstens 15–18 Nukleotide im Fall eines Gens aufweist.
  • In einer Ausführungsform entstehen die erfindungsgemäßen Krebspeptide durch Expression einer DNA-Sequenz eines alternativen offenen Leserahmens eines normalen Gens. Anstelle der Expression des normalen Genproduktes wird ein Krebspeptid exprimiert, das immunologisch durch T-Lymphozyten in einer MHC-restringierten Weise erkannt werden kann. Die MHC-restringierten T-Lymphozyten sind zur Identifizierung des Genproduktes des alternativen offenen Leserahmens, das mit Krebs und Vorstufen von Krebs assoziiert ist, nützlich.
  • Von besonderem Interesse sind Krebspeptide, die mit TRP-1 (gp75); dem Protein p19ARF assoziiert sind, das aus einem alternativen Leserahmen des Tumorsuppressor INK4a-Gens der Maus (Quelle, D. E. et al. Cell Bd. 83, Seiten 993–1000, 1995) entsteht; das antigene Octapeptid SVVEFSSL, d. h. JAL8, ein allogenes Peptid, das durch bm1-anti-B6 alloreaktive bm1BT19.4-T-Zellen erkannt wird (Malarkannan, S. et al. J. Exp. Med. Bd. 182, Seiten 1739– 1750, 1995) und ähnliche.
  • In einer Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Krebspeptid, Fragment oder Derivat davon ein antigenes Krebsepitop, das immunologisch durch tumorinfiltrierende Lymphozyten (TIL) erkannt wird, die von einem Krebs oder Tumor eines Säugers abgeleitet sind. Von besonderem Interesse sind antigene Krebsepitope, die von für Krebsantigen spezifischen zytotoxischen T-Zellen (CD8+) erkannt werden.
  • In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das Krebspeptid etwa 24 Aminosäuren und wird von der DNA-Sequenz des alternativen offenen Leserahmens 3 des gleichen Gens exprimiert, die für Tyrosinase-verwandtes Protein 1 kodiert, wie in 2 gezeigt, oder von Homologen oder Varianten davon.
  • In einer Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Krebspeptid die folgende Aminosäuresequenz:
    MXaaLQRQFLRTQLWDVPSWLERSCL, (SEQ. ID No. 7) und Fragmente oder Derivate davon, wobei Xaa = Ser oder Ala ist. Die Erfindung umfasst ebenfalls Krebspeptide oder Teile davon, die eine partielle Sequenzhomologie mit SEQ. ID Nr. 6 aufweisen. Partielle Aminosäuresequenz-Homologie bezeichnet ein Peptid mit wenigstens 85% Sequenzhomologie zu SEQ. ID Nr. 6, bevorzugt wenigstens 95% Sequenzhomologie oder mehr, und das die biologische Funktion der Stimulierung der Bildung von Krebsantigenspezifischen T-Lymphozyten besitzt.
  • In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann das Krebspeptid durch die folgende Formel dargestellt sein:
    Met Xaa Leu Gln Arg Gln Phe Leu Arg (SEQ. ID Nr. 8) und Fragmente und Derivate davon, wobei Xaa = Ser oder Ala ist.
  • In einer Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Krebspeptid die Aminosäuresequenz:
    MSLQRQFLR (SEQ.-ID-Nr. 9) und Fragmente oder Derivate davon.
  • In einer anderen Ausführungsform sind die Krebspeptide und das antigene Krebsepitop, das im Tumorantigen der vorliegenden Erfindung erhalten ist, vom TRP-2-Protein abgeleitet, das vorwiegend in Melanomen, normalen Melanozyten-Zelllinien und in der Retina exprimiert wird. Das erfindungsgemäße Tumorantigen ist in den meisten normalen Zellen in wesentlich niedrigeren Konzentrationen anwesend als die erhöhten Konzentrationen, die man in Vorstufen von Krebs- und Krebszellen findet. Die erhöhte Expression des Tumorantigens korreliert mit der Transformation von normalen Zellen zu einer Vorstufe von Krebs- oder Krebszelle. TRP-2 ist auf dem menschlichen Chromosom 13 lokalisiert und wurde als Mitglied der Tyrosinase-verwandten Genfamilie identifiziert und weist eine 40–45%-ige Aminosäuresequenz-Identität zu Tyrosinase und gp75/TRP-1 auf (Yokoyama et al., (1994); Bouchard et al. (1994)). TRP-2 kodiert für ein Protein mit 519 Aminosäuren. Es konnte gezeigt werden, dass es eine DOPA-Chrom-Tautomerase-Aktivität besitzt, die an der Melaninsynthese beteiligt ist (Bouchard et al. (1994)).
  • Von weiterem Interesse sind Krebspeptide, Fragmente oder Derivate davon, die durch MHC-restringiertes CTL erkannt werden, insbesondere MHC-Klasse-1-restringierte CTLs. Ein bevorzugter HLA-Subtyp, welcher durch Krebspeptide erkannt wird, ist der HLA-A31-Subtyp.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf funktionell äquivalente Varianten der TRP-1-Krebspeptide. „Funktionell äquivalente Varianten" beinhaltet Peptide mit teilweiser Sequenzhomologie, Peptide mit einer oder mehreren spezifischen konservativen und/oder nicht-konservativen Aminosäureveränderungen, Peptid-Konjugate, chimäre Proteine, Fusionsproteine und Peptid-Nukleinsäuren.
  • Die Krebspeptide, das Tumorantigen und deren antigene Krebsepitope können aus natürlichen Quellen wie aus primären klinischen Isolaten, Zelllinien und ähnlichen aufgereinigt und isoliert werden. Das Krebspeptid und Teile davon sind wenigstens zu 90%, bevorzugt wenigstens 95% und insbesondere bevorzugt zu 100% rein. Die Krebspeptide und ihre antigenen Epitope können ebenfalls durch chemische Synthese oder durch rekombinante DNA-Verfahren erhalten werden. Verfahren für die chemische Synthese werden in J. M. Steward und J. D. Young, „Solid Phase Peptide Synthesis", W. H. Freeman & Co., San Francisco, 1969; M. Bodansky et al. „Peptide Synthesis", John Wiley & Sons, 2. Ausgabe, 1976, und J. Meienhofer, „Hormonal Proteins and Peptides", Bd. 2, S. 46, Academic Press, New York, 1983 und E. Schroder und K. Kubke, „The Peptides", Bd. 1, Academic Press, New York, 1965, beschrieben.
  • Die Krebspeptide und ihre antigenen Krebsepitope können mit pharmazeutisch verträglichen Trägern durch bekannte Verfahren zu pharmazeutischen Zusammensetzungen formuliert werden. Die Zusammensetzung eignet sich als Impfstoff zur Vorbeugung oder zur Behandlung von Krebs. Die Zusammensetzung kann weiterhin wenigstens ein immunstimulatorisches Molekül umfassen. Immunstimulatorische Moleküle, die zusammen mit dem Krebspeptid oder einem Teil davon zur Stimulierung Antigen-spezifischer T-Zellantwort verwendet werden sollen, beinhalten in nicht-beschränkender Weise eines oder mehrere Haupt-Histokompatibilitätskomplex-(MHC)-Moleküle, wie Klasse-I- und Klasse-II-Moleküle, bevorzugt ein Klasse-I-Molekül. Die Zusammensetzung kann weiterhin in nicht beschränkender Weise andere stimulatorische Moleküle beinhalten, einschließlich B7.1, B7.2, ICAM-1, ICAM-2, LFA-1, LFA-3, CD72 und ähnliche, und Zytokine, die IL-1 bis IL-15 umfassen, TNFα, IFNγ, RANTES, G-CSF, M-CSF, INFα, CTAP III, ENA-78, GRO, I-309, PF-4, IP-10, LD-78, MGSA, MIP-1α, MIP-1β oder Kombinationen daraus und ähnliche zur Verstärkung der Immunantwort.
  • Das stimulatorische Molekül kann als physikalisch separate Einheit oder in der Membran einer Antigen-präsentierenden Zelle, wie einer B-Zelle, Makrophage oder dentritischer Zelle, in der Membran eines Liposoms oder auf der Oberfläche einer transduzierten oder transfizierten Zelle exprimiert bereitgestellt werden. DNA-Sequenzen von MHC-immunstimulatorischen Molekülen sind von GenBank und ähnlichen erhältlich.
  • Die Krebspeptide, das Tumorantigen und deren antigene Krebsepitope sind in Verfahren zur Vorbeugung oder zur Behandlung von Krebs nützlich und in diagnostischen Assays zum Nachweis von Krebs oder Vorstufen von Krebs in einem Säuger, einschließlich Menschen. Die Krebspeptide oder Fragmente davon können in Form eines Derivates vorliegen, an das andere Bestandteile gekoppelt sind, wie radioaktive Markierungen, Biotin, Fluorescein. Ein gezieltes Agens kann ebenfalls an ein Tumorantigen, Krebspeptide oder Teile davon angeheftet sein, die die Ausrichtung auf ein spezifisches Organ, einen Tumor oder Zelltypen ermöglichen. Solche Zielagenzien können Hormone, Zytokine, zelluläre Rezeptoren und Ähnliches sein. Das Krebspeptid, Tumorantigen oder Teile davon können in Form eines Kits, allein oder in Kombination mit anderen Reagenzien zubereitet werden.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Impfstoff, der zur Induzierung einer tumorspezifischen, zellvermittelten Immunität gegen Krebs nützlich ist.
  • Ansätze in der Immuntherapie gegen Krebs können in die aktive oder passive Kategorie eingeteilt werden. Die aktive Immuntherapie beinhaltet die direkte Immunisierung von Krebspatienten mit Krebsantigenen als Versuch, Immunantworten gegen den Krebs zu fördern. Passive Immuntherapie bezieht sich auf die Verabreichung vom Immunreagenzien, wie Immunzellen oder Antikörper mit Anti-Tumor-Reaktivität mit dem Ziel, Anti-Tumor-Antworten direkt zu vermitteln.
  • Die meisten früheren Versuche der aktiven Immuntherapie verwendeten entweder intakte Krebszellen oder Krebszellextrakte mit der Erwartung, dass diese Materialien Tumorantigene in einer Menge und Form enthalten, die zur Stimulierung von Immunantworten führen kann. Die molekulare Identifizierung von Krebsantigenen hat jedoch neue Möglichkeiten zur Entwicklung von Immuntherapien für die Behandlung von Krebs beim Menschen erschlossen. Eine Zusammenfassung dieser Ansätze ist in Tabelle 1 dargestellt.
  • Tabelle 1. Krebstherapien, die auf der molekularen Identifizierung von Krebsantigenen beruhen
    • 1. Aktive Immuntherapie mit:
    • a. Immundominanten Peptiden
    • 1) allein
    • 2) kombiniert mit Adjuvanzien
    • 3) gekoppelt an Helferpeptide, Lipide oder Liposome
    • 4) auf Antigen-präsentierenden Zellen
    • b. Immundominanten Peptiden mit Aminosäureaustauschen zur Steigerung der Bindung an MHC-Moleküle
    • c. Proteinen allein oder in Kombination mit Adjuvanzien
    • d. „nackter" DNA, die für Krebsantigene kodiert
    • 1) „gene gun" zur intradermalen Injektion
    • 2) intramuskuläre Injektion
    • 3) gekoppelt an Lipide
    • e. Rekombinanten Viren, wie Vaccinia, Fowlpox- oder Adenoviren, die kodieren für
    • 1) Krebsantigene allein
    • 2) Krebsantigene plus Gene, die für Zytokine, ko-stimulatorische Moleküle oder andere Gene kodieren, um die Immunantwort zu steigern
    • f. Rekombinanten Bakterien, wie BCG, Salmonella oder Listeria, die für Krebsantigene alleine oder in Kombination mit immunstimulatorischen Molekülen kodieren
    • 2. Aktive Immuntherapie (oben), gefolgt von der Verabreichung immunstimulatorischer Zytokine
    • 1. IL-2
    • 2. IL-6
    • 3. Il-10
    • 4. IL-12
    • 5. IL-15 und ähnliche
    • 3. Passive Immuntherapie mit Anti-Tumorlymphozyten, die durch In-vitro-Sensibilisierung von TIL oder PBL gebildet wurden gegen
    • 1. immundominante Peptide auf Antigen-präsentierenden Zellen (führen zu CD8-Zellen)
    • 2. antigene Proteine, die mit Antigen-präsentierenden Zellen ko-inkubiert wurden (exogener Weg der Antigen-Präsentation zur Erzeugung von CD4-Zellen).
  • Der Einbau des Gens, das für Krebsantigene kodiert, in hocheffiziente Expressionssysteme, wie E.-coli, Hefe oder Baculovirus oder ähnliche, stellt die Möglichkeit bereit, große Mengen an aufgereinigtem Tumorantigen zur Verwendung bei der Immunisierung zu erhalten. Alternativ können die immundominanten Peptide dieser Tumorantigene leicht in vitro synthetisiert und in großen Mengen lediglich für die Immunisierung oder in einer Form aufgereinigt werden, die dazu dienen soll, ihre Immunogenität zu erhöhen, wie z. B. in Kombination mit Adjuvanzien, Kopplung an Lipide/Liposome oder Helferpeptide oder auf Antigen-präsentierenden Zellen. Die Modifikation individueller Aminosäuren der immundominanten Peptide zur Verbesserung der Bindungseffizienz an MHC-Antigene kann potentiell die Immunogenität, verglichen zum nativen Peptid, erhöhen.
  • Mit neueren Techniken, bei denen „nackte" DNA direkt in den Muskel oder in die Haut injiziert wird, konnten zelluläre und humorale Immunantworten gegen kodierte Antigene hervorgerufen werden (Cooney, E. L., A. C. Collier, P. D. Greenberg, R. W. Coombs, J. Zarling, D. E. Arditti, M. C. Hoffinan, S. L. Hu und L. Correy, 1991, Lancet. 337: 567; Wolff, J. A., R. W. Malone, P. Williams, W. Chong, G. Acsadi, A. Jani und P. L. Felgner, 1990, Science 247: 1465; Davis, H. L., R. G. Whalen und B. A. Demeniex, 1993, Hum. Gene Ther. 4: 151; Yang, N. S., J. Burkholder, B. Roberts, B. Martinelli und D. McCabe, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 9568; Williams, R. S., S. A. Johnston, M. Riedy, M. J. DeVit, S. G. McElligott und J. C. Sanford, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 2726; Fynan, E. R., Webster, D. H. Fuller, J. R. Haynes, J. C. Santoro und H. L. Robinson, 1995 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 11478; Eisenbraum, M. D., D. H. Fuller und J. R. Haynes, 1993, DNA and Cell Bio. 12: 791; Fuller, D.H. und J. R.. Haynes, 1994, AIDS Res. Hum. Retrovir. 10(11): 1433; Acsadi, G., G. Dickson, D. R. Love, A. Jani, F. S. Walsh, A. Gurusinghe, J. A. Wolff und K. E. Davies, 1991, Nature 352: 815). Die Verwendung nicht lebensfähiger DNA-Vektoren besitzt den Vorteil der einfachen Herstellung und der Sicherheit bei der Verabreichung. Die alternative Nukleinsäuresequenz der vorliegenden Erfindung ist als Immunogen und als DNA-Impfstoff gegen Krebs nützlich. Die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz des alternativen offenen Leserahmens von TRP-1 oder von erfindungsgemäßen Peptiden können unter Verwendung einer Gene-Gun in Mengen verabreicht werden, um eine zelluläre Antwort gegen eine Krebszelle auszulösen. Für solche Zwecke sind Mengen im Nanogramm-Bereich nützlich.
  • Eine wirksame Form der Immunisierung beinhaltet den Einbau von Genen, die immunogene Moleküle kodieren, in rekombinante Bakterien, wie BCG, Salmonella oder Listeria, oder in rekombinante Viren, wie Vaccinia, Fowlpox- oder Adenoviren und ähnliche. Die Gene, die für Krebsantigene kodieren, können entweder alleine oder in Kombination mit Genen exprimiert werden, die für immunstimulatorische Moleküle kodieren, oder mit anderen Genen, die nach Infektion die Immunantwort steigern können. Untersuchungen mit Modell-Tumorantigenen in Mausmodellen haben gezeigt, dass der Einbau des Gens für Interleukin-2 (Il-2) oder B7.1 die Immunogenität von Modell-Tumorantigenen steigern und auch den Rückgang von etablierten Lungenmetastasen, die diese Antigene tragen, vermitteln kann. Zur Verbesserung von Immunantworten kann auch aktive Immuntherapie, gefolgt von der exogenen Verabreichung immunstimulatorischer Zytokine, wie IL-2, IL-6, Il-10, IL-12 oder IL-15, verwendet werden.
  • Passive Immuntherapie mit genetisch modifizierten Immunzellen (diese wird im Allgemeinen als adoptive Immuntherapie bezeichnet), die menschliche Tumorantigene erkennen können, ist in ausgewählten Patienten mit metastasierendem Melanom bei der Vermittlung des Rückgangs von Krebs wirksam. Es wurde In-vitro-Verfahren entwickelt, in denen menschliche Lymphozyten in vitro gegen immundominante Peptide von Tumorantigenen sensibilisiert werden, die auf Antigen-präsentierenden Zellen präsentiert werden. Durch wiederholte In-vitro-Stimulierung können Zellen abgeleitet werden, die eine weit höhere Kapazität besitzen, menschliche Tumorantigene zu erkennen als die TIL, die zur Klonierung der Gene verwendet wurden, die für diese Antigene kodieren. Somit konnten durch wiederholte In-vitro-Sensibilisierung mit Krebspeptiden Lymphozyten gewonnen werden, die 50- bis 100-fach wirksamer sind als TIL. Der adoptive Transfer dieser Zellen kann bei der Vermittlung des Tumorrückgangs in vivo effektiver sein als konventionell gewachsene TIL.
  • In den Verfahren zur Vorbeugung oder zur Hemmung von Krebs können die Krebspeptide oder Teile davon auf einem der vielen Verabreichungswege verabreicht werden, umfassend in nicht-beschränkender Weise intravenöse, intramuskuläre, subkutane, intradermale, intraperitoneale, intrathekale, intrapleurale, intrauterine, rektale, vaginale, topische, intratumorale und ähnliche Verabreichung.
  • Die Verabreichung kann über transmukosale oder transdermale Mittel erfolgen. Zur transmukosalen oder transdermalen Verabreichung werden penetrierende Agenzien, die für die zu durchdringende Grenze geeignet sind, in der Zusammensetzung verwendet. Solche penetrierenden Agenzien sind im Stand der Technik bekannt und beinhalten z. B. zur transmukosalen Verabreichung Gallensalze und Fusidinsäure-Derivate. Zusätzlich können zur Erleichterung der Permeation Detergenzien verwendet werden. Die transmukosale Verabreichung kann über Nasensprays. oder z. B durch Suppositorien erfolgen. Für die orale Verabreichung liegen das Krebspeptid, Tumorantigen, Teile oder Varianten davon in herkömmlichen Formen zur oralen Verabreichung, wie Kapseln, Tabletten und toxischen Stoffen vor.
  • Im Allgemeinen ist es wünschenswert, an den Empfänger eine Dosierung des Krebspeptids oder eines Teils davon von wenigstens etwa 1 pg pro kg Körpergewicht zu verabreichen, bevorzugt wenigstens 1 ng pro kg Körpergewicht, insbesondere bevorzugt wenigstens 1 μg oder mehr pro kg Körpergewicht des Empfängers. Ein Bereich von etwa 1 ng pro kg Körpergewicht bis 100 mg pro kg Körpergewicht wird bevorzugt, obwohl auch eine höhere oder niedrigere Dosis verabreicht werden kann. Die Dosierung ist wirksam im „Priming", bei der Stimulierung und/oder Auslösung der klonalen Expansion des für T-Lymphozyten spezifischen Krebsantigens, bevorzugt zytotoxische T-Lymphozyten, die im Gegenzug im Empfänger Krebs vorbeugen oder verhindern können.
  • Die Dosis wird wenigstens einmal verabreicht und kann als einmaliger Bolus oder kontinuierliche Verabreichung bereitgestellt werden. Multiple Verabreichungen der Dosierung über einen Zeitraum von einigen Wochen bis Monaten kann bevorzugt sein. Aufeinander folgende Dosierungen können wie angegeben verabreicht werden.
  • In einem Behandlungsverfahren wird ein Impfstoff, der das Krebspeptid oder Teile davon enthält, an einen Säuger in einer Menge verabreicht, die Krebs in den Säugern wirksam verhindern kann. Von besonderem Interesse ist ein Impfstoff, der das Krebspeptid oder Teile davon, die durch ORF3 des TRP-1-Gens kodiert werden, zur Vorbeugung von Melanom umfasst.
  • Zur Reduzierung der Tumorbelastung in Tieren, die an Tumoren leiden, umfasst das Verfahren die Verabreichung einer wirksamen Menge eines antigenen Krebsepitops an einer Stelle der Tumorerkrankung, wobei diese Menge an dieser Stelle die Größe des Tumors reduzieren kann.
  • In einem anderen Behandlungsverfahren können autologe, zytotoxische Lymphozyten oder tumorinfiltrierende Lymphozyten aus einem Krebspatienten erhalten werden. Die Lymphozyten werden in Zellkultur kultiviert und für Krebsartigen spezifische Lymphozyten werden durch Kultivierung in Anwesenheit spezifischer Krebspeptide oder artigener Krebsepitope alleine oder in Kombination mit wenigstens einem immunstimulatorischen Molekül mit Zytokinen expandiert. Die Antigen-spezifischen Lymphozyten werden dann in einer Menge in den Patienten zurückgeführt, die ausreicht, im Patienten die Tumoren zu vermindern oder zu eliminieren.
  • Nach der Immunisierung kann die Effizienz des Impfstoffs anhand der Produktion von Immunzellen bewertet werden, die das Krebsantigen erkennen, wie durch spezifische lytische Aktivität, spezifische Zytokinproduktion, Tumorrückgang oder eine Kombination davon bewertet werden kann. Wenn der zu immunisierende Säuger bereits an Krebs oder metastasierendem Krebs leidet, dann kann der zu verabreichende Impfstoff zusammen mit andere therapeutischen Behandlungen, wie Immunmodulatoren, z. B. IL-2, IL-6, IL-10, IL-12, IL-15, Interferon, Tumornekrosefaktor und ähnlichen chemotherapeutischen Arzneistoffen, wie Cisplatin, antiviralen Stoffen, wie Gancyclovir, Amphotericin B, Antibiotika und Ähnlichem, verabreicht werden.
  • Ein anderer Aspekt der Erfindung besteht in der DNA-Sequenz eines alternativen offenen Leserahmens eines Gens, der sich von der DNA-Sequenz eines offenen Leserahmens unterscheidet, der für ein normales Protein oder Peptid kodiert, wobei die DNA-Sequenz des alternativen offenen Leserahmens für Krebspeptide und Teile davon kodiert, die von den T-Zellen des Immunsystems immunologisch erkannt werden.
  • DNA-Sequenzen alternativer offener Leserahmen beinhalten in nicht-beschränkender Weise DNA-Sequenzen des TRP-1-Gens, des INK4a-Gens und von ähnlichen Genen. Von Interesse sind DNA-Sequenzen eines alternativen offenen Leserahmens eines melanogenen Gens. Melanogene Gene beinhalten in nicht-beschränkender Weise Gene, die für MART-1/Melan-A, Tyrosinase, gp100, gp75 (TRP-1) und Ähnliches kodieren.
  • Eine andere Ausführungsform der Erfindung betrifft eine DNA-Sequenz eines alternativen offenen Leserahmens oder Teile davon, die für ein Krebspeptid innerhalb der Gensequenz kodiert, die für Tyrosinase-verwandtes Protein kodiert. Die Gensequenz von TRP1 wurde in der EMBL-Datenbank unter der Zugangsnummer X51455, wie beschrieben durch Vijayasaradhi, S. et al. (1990, J. Exp. Med. 171: 1375–80) und die EMBL-Zugangsnummer X51420, wie beschrieben durch Cohen, T. et al., 1990 Nucleic Acids Research, Bd. 18: 2807, offengelegt.
  • In einer Ausführungsform umfasst die DNA-Sequenz des alternativen offenen Leserahmens die in 2 gezeigte SEQ. ID Nr. 5 von ORF3, Teile davon und funktionell äquivalente Sequenzvarianten davon, die für ein Krebspeptid oder Teile davon kodieren, die von Krebsartigen-spezifischen T-Lymphozyten, einschließlich tumorinfiltrierenden Lymphozyten, erkannt werden. Die vorliegende Erfindung umfasst auch komplementäre und anti-komplementäre Sequenzen zu dem in 2 gezeigten ORF3.
  • In einer anderen Ausführungsform umfasst die DNA-Sequenz des alternativen offenen Leserahmens die Sequenz ATGTCACTGCAACGGCAATTTCTCAGG (SEQ. ID Nr: 10). Die Gensequenz für TRP-2 wurde durch GenBank unter der Zugangsnummer D 17547, wie beschrieben von Yokoyama et al. (1994) und GenBank-Zugangsnumer S69231, wie beschrieben durch Bouchard et al. (1994), offenbart.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst auch komplementäre und anti-komplementäre Nukleinsäuresequenzen zu einer Sequenz, die für LLGPGRPYR kodiert und äquivalente Sequenzvarianten davon.
  • Aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes führen Variationen in der DNA-Sequenz zur Translation eines äquivalenten Krebspeptids. Als Ergebnis sind Substitutionen solange im Schutzumfang der Erfindung enthalten, wie die Substitutionen zur Expression eines Krebspeptids führen, das durch Krebsartigen-MHC-restringierte T-Zellen erkannt wird. Eine erfindungsgemäß umfasste Substitution ist die Substitution von TCA, das für Ser kodiert, gegen GCT, GCC, GCA oder GCG, die für Ala kodieren. Die vorliegende Erfindung umfasst auch Homologa aus anderen Säugerspezies.
  • Die DNA-Sequenz des vollständigen alternativen offenen Leserahmens oder Teile davon, wie vom TRP-1-Gen und von ähnlichen Genen, können als Sonden zur Identifizierung und Isolierung der Homologa der Krebspeptide in anderen Säugerspezies verwendet werden. In einer Ausführungsform wird eine cDNA-Sequenz von der Maus dazu verwendet, eine cDNA-Bibliothek von Säugern hinsichtlich einer humanen homologen Nukleinsäuresequenz zu screenen. Positive Klone werden selektiert und sequenziert. Beispiele für Gewebequellen, aus denen eine cDNA-Bibliothek synthetisiert werden kann, umfassen in nicht-beschränkender Weise Dermis, Epidermis, feste Tumoren, Melanome, Melanozyten und Ähnliches. Die geeigneten Hybridisierungsbedingungen zum Nachweis der Homologa sind dem Fachmann bekannt. Herkömmliche Verfahren zur Nukleinsäurehybridisierung von Bibliotheken und Klonierungsverfahren werden in Sambrook et al. (Hrsg.) (1989) in „Molecular Cloning. A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Press, Plainview, New York, und Ausubel et al. (Hrsg.) in „Current Protocols in Molecular Biology" (1987), John Wiley and Sons, New York, New York, beschrieben.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung sind Nukleinsäuresonden zum Nachweis und zur Quantifizierung von RNA, die zu Krebspeptiden, wie TRP-1, Krebspeptiden und Ähnlichem in biologischen Proben transkribiert wird, die aus Säugern mit Krebs isoliert wurden. Veränderungen in der Konzentration der RNA verglichen zu einer Kontroll-RNA-Probe sind nützlich zur Diagnose und Prognose der Krankheit in einem Säuger.
  • In einer Ausführungsform wird mRNA vom Gewebe eines Patienten abgeleitet, bei dem man Krebs oder Vorstufen von Krebs vermutet, und mit mRNA verglichen, die von einem gesunden Kontrollversuchspatienten abgeleitet ist. Eine quantitative und/oder qualitative Steigerung der mRNA des alternativen offenen Leserahmens, der für ein Krebspeptid im Patienten kodiert, im Vergleich zur Kontrolle, zeigt die Anwesenheit von Krebs oder Vorstufen von Krebs im Patienten an. Die mRNA kann mit Oligonukleotid-Sonden nachgewiesen werden, die mit der mRNA hybridisieren können. In einer Ausführungsform hybridisiert die Sonde mit dem Transkriptionsprodukt von ORF3 von TRP-1.
  • Veränderungen in der Konzentration der RNA verglichen zu einer Kontroll-RNA-Probe sind nützlich zur Diagnose und Prognose der Krankheit im Säuger.
  • Die mRNA kann unter Verwendung von Oligonukleotid-Sonden nachgewiesen werden.
  • Kombinationen von Oligonukleotid-Paaren, die auf der Sequenz beruhen, die für das Krebspeptid oder Teile davon kodieren, können als PCR-Primer verwendet werden, um unter Verwendung der Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) zur Amplifikation von ausgewählten RNA-Sequenzen mRNA in biologischen Proben nachzuweisen. Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls in situ PCR und in situ RT-PCR zum Nachweis von DNA und RNA, die für Krebspeptide oder Teile davon kodieren. Dieses Verfahren wird bevorzugt, wenn die Kopiezahl der Zielnukleinsäure sehr gering ist, oder wenn verschiedene Formen von Nukleinsäuren unterschieden werden müssen. Das Verfahren ist insbesondere nützlich beim Nachweis und zur Unterscheidung von Vorstufen von Krebs und Krebszellen von normalen Zellen.
  • Die vorliegende Erfindung beinhaltet ein Verfahren zur Identifizierung eines antigenen Krebsepitopes, das mit antigen-spezifischen T-Zellen reaktiv ist, umfassend die Erzeugung von Nukleinsäure-Deletionsfragmenten eines Gens. Die Deletionsfragmente werden in einen geeigneten Vektor eingebaut, der wiederum in eine Wirtszelle zur Expression des Nukleinsäureproduktes transfiziert oder transduziert wird. Optional kann die Wirtszelle auch ein immunstimulatorisches Molekül exprimieren. Krebsantigen-spezifische T-Zellantworten werden in Anwesenheit der Wirtszellen, die das Deletionsprodukt exprimieren, bestimmt.
  • In dem Fall, in dem die Wirtszelle nur das Deletionsprodukt exprimiert, kann ein immunstimulatorisches Molekül durch eine Antigen-präsentierende Zelle, wie eine B-Zelle, einen Makrophagen, eine dentritische Zelle oder ähnliche, oder durch eine Zelle, die mit einem stimulatorischen Molekül transfiziert ist, bereitgestellt werden. In einer Ausführungsform ist das immunstimulatorische Molekül ein MHC-Klasse-I-Molekül.
  • Durch die Kartierung anhand dieses Verfahrens wird die DNA-Sequenz des alternativen offenen Leserahmens, der für das Krebspeptid oder das antigene Krebsepitop kodiert, bestimmt.
  • Ein alternatives Verfahren zur Identifizierung des Krebsantigens und des antigenen Krebsepitops besteht in der Erzeugung synthetischer Peptide, der Beladung Antigen-präsentierender Zellen mit den synthetischen Peptiden und der Zugabe der mit Peptid beladenen Antigen-Präsentierenden Zellen zu Antigen-spezifischen T-Zellen und Messung der Antigen-spezifischen Antwort der T-Zellen in Anwesenheit der Peptid-behandelten Antigen-präsentierenden Zellen. Synthetische Peptide, die zu Antigen-spezifischen T-Zell-Antworten führen, enthalten das erfindungsgemäße antigene Krebsepitop.
  • Optional kann der Vektor auch eine DNA-Sequenz umfassen, die wenigstens ein immunstimulatorisches Molekül umfasst. In einer Ausführungsform umfasst der Vektor ORF3 des TRP-1-Gens.
  • Optional kann der Vektor auch eine DNA-Sequenz umfassen, die wenigstens ein ko-immunstimulatorisches Molekül umfasst.
  • Eukaryotische Expressionsvektoren beinhalten retrovirale Vektoren, Vaccinia-Virus-, Adenovirus-, Herpesvirus-, Fowlpox-, Baculovirus-, menschliche Papillomavirus-, Pferde-Enzephalitis-, Influenzavirus-Vektoren und ähnliche, sind aber nicht darauf beschränkt.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst neue rekombinante Viren, die ein Krebspeptid oder Teile davon exprimieren, die von einer Nukleinsäuresequenz eines alternativen offenen Leserahmens eines Gens kodiert werden, der sich von der Nukleinsäuresequenz des offenen Leserahmens unterscheidet, der dazu verwendet wird, ein normales Protein oder Peptid des gleichen Gens zu kodieren. Das rekombinante Virus kann ebenfalls wenigstens ein immunstimulatorisches Molekül exprimieren. Das rekombinante Virus kann eine zellvermittelte Immunantwort in einem Säuger hervorrufen oder heraufregulieren zum Zweck der Vorbeugung oder Behandlung von Krebs im Säuger, insbesondere bei Menschen.
  • Das rekombinante Virus trägt in seinem Genom oder in Teilen davon eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Krebspeptid, Teile davon, oder für ein antigenes Krebspeptid 'kodiert, allein oder in Kombination mit einem oder mehreren Genen, die für ein immunstimulatorisches Molekül kodieren. In einer Ausführungsform trägt das rekombinante Virus in seinem Genom eine Nukleinsäuresequenz, die für ein TRP-1-Krebspeptid oder Teile davon kodiert. Eine mit dem rekombinanten Virus infizierte Wirtszelle exprimiert das Krebspeptid, Teile davon oder das antigene Krebsepitop alleine oder in Kombination mit wenigstens einem immunstimulatorischen Molekül.
  • Verfahren zur Konstruktion und zur Expression von exogenen Genprodukten aus rekombinanten Vaccinia-Virus-Vektoren werden offenbart von Perkus et al. Science 229: 981– 984, 1985, Kaufman et al., Int. J. Cancer 48: 900–907, 1991, Moss Science 252: 1662, 1991, Smith und Moss Bio Techniques Nov./Dez., Seiten 306–312, 1984 und US-PS 4,738,846 ; Sutter und Moss (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 10847–10851, 1992) und Sutter et al. (Virology 1994) beschreiben die Konstruktion und die Verwendung des nicht-replizierenden rekombinanten Ankara-Virus (MVA, modified vaccinia Ankara) als Vektor, der erfindungsgemäß als viraler Vektor verwendet werden kann. Baxby und Paoletti Vaccine 10: 8–9, 1992) offenbaren die Konstruktion und Verwendung eines nicht-replizierenden Pox-Virus, einschließlich Canarypox-Virus, Fowlpox-Virus und anderer Vogelspezies zur Verwendung als viraler Vektor in der vorliegenden Erfindung.
  • Die Vektoren der vorliegenden Erfindung können zur Expression des Krebspeptids oder des antigenen Krebsepitops in eine geeignete Wirtszelle eingebracht werden. Eukaryotische Wirtszellen beinhalten COS-Zellen, CHO-Zellen, Hela-Zellen, NIH/3T3-Zellen, Insektenzellen, Antigen-präsentierende Zellen, wie dentritische Zellen, und Ähnliches, sind aber nicht darauf beschränkt. Optional kann die Wirtszelle auch ein stimulatorisches Molekül exprimieren. In dem Fall, in dem die Wirtszellen sowohl das Krebspeptid oder das antigene Krebsepitop in Kombination mit wenigstens einem MHC-Molekül exprimieren, ist es bevorzugt, dass zur Gewährleistung einer korrekten Glykosylierung ein eukaryotisches Expressionssystem verwendet wird. Die Expression sowohl des Krebsantigens als auch des immunstimulatorischen Moleküls durch die Wirtszelle stellt das notwendige MHC-restringierte Peptid den spezifischen T-Zellen zur Verfügung und das geeignete Signal an die T-Zellen, um bei der Antigen-Erkennung und der Proliferation oder klonalen Expansion der Antigen-spezifischen T-Zellen zu helfen. Das Gesamtergebnis ist die Heraufregulierung des Immunsystems. Die Heraufregulierung des Immunsystems zeigt sich in einem Anstieg Krebsantigen-spezifischer, zytotoxischer Lymphozyten, die das Wachstum von Krebs oder Vorstufen von Krebszellen abtöten oder hemmen kann.
  • Die DNA kann in die Wirtszelle durch Transfektion, Transduktion, Liposomen und ähnliche bekannte Verfahren inseriert werden (Sambrook et al., 1989, in: „Molecular Cloning. A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press, Plainview, New York). Für Liposomen werden kationische Lipide bevorzugt, z. B. Polykation-Lipide, Dimyristyloxypropyl-3-dimethyl-hydroxyethyl-Ammonium (DMRIE), komplexiert mit dem neutralen Phospholipid-Dioleyl-Phosphatidyl-Ethanolamin (DOPE), wie offenbart von Nabel, E. G. et al., 1992, Hum. Gene. Ther. 3: 367–275; Nabel, G. J. et al., 1992, Hum. Gene. Ther. 3: 649–656; Stewart, M. J. et al. 1992 Hum. Gene. Ther. 3: 399–410; Nabel, G. J. et al. 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 11307–11311; und Harrison, G. S. et al. 1995 Bio Techniques 19: 816–823.
  • Das von den Wirtszellen exprimierte rekombinante Krebsprotein, Tumorantigen oder antigene Krebsepitop kann aus den Zelllysaten oder Zellüberständen durch bekannte Standard-Protein-Aufreinigungsverfahren aufgereinigt werden. Diese beinhalten molekulare Sieb-Chromatographie, Ionenaustausch-Chromatographie, isoelektrische Fokussierung, Gel-Elektrophorese, Affinitäts-Chromatographie, HPLC, Reverse-Phase-HPLC und Ähnliches, sind aber nicht darauf beschränkt. (Ausubel et al., 1987, in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York, NY). Die Immunaffinitäts-Chromatographie kann auch zur Aufreinigung unter Verwendung von Anti-Krebsprotein-Antikörpern oder Antigenbindenden Fragmenten davon als Immunaffinitäts-Reagens verwendet werden.
  • Das rekombinante Virus kann ebenfalls als Therapeutikum oder Impfstoff verwendet werden. Bei solchen Verwendungen ist es wünschenswert, an den Empfänger eine Dosierung des rekombinanten Virus im Bereich von etwa 105 bis etwa 1010 Plaque-bildenden Einheiten/mg Säuger bereitzustellen, obwohl eine höhere oder niedrigere Dosis ebenfalls verabreicht werden kann.
  • Der rekombinante virale Vektor kann an einen Säuger entweder vor einem Anzeichen von Krebs, wie Melanom, verabreicht werden oder um in einem Säuger, der bereits an Krebs, wie z. B. Melanom, leidet, den Rückgang zu vermitteln. Beispiele der Verfahren zur Verabreichung des viralen Vektors in Säuger beinhalten die Behandlung der Zellen mit dem rekombinanten Virus ex vivo oder die Injektion des rekombinanten Virus in das befallene Gewebe oder die intravenöse, subkutane, intradermale, intramuskuläre und ähnliche Verabreichung des Virus, ist aber nicht darauf beschränkt. Alternativ dazu können der rekombinante virale Vektor oder Kombinationen rekombinanter viraler Vektoren lokal durch die direkte Injektion in die krebsartige Läsion oder die topische Anwendung in einem geeigneten pharmazeutisch verträglichen Träger verabreicht werden. Die Menge an rekombinantem viralem Vektor, der die interessierenden Nukleinsäuresequenz enthält, basiert auf dem Titer der Viruspartikel. Ein bevorzugter Bereich zur Immunisierung liegt zwischen 105 bis 1010 Viruspartikeln pro Säuger, bevorzugt ein Mensch.
  • Das erfindungsgemäße Krebsantigen-Epitop, das an der Tumorabstoßung beteiligt ist, ist nicht auf die hier spezifisch beschriebenen beschränkt. Anhand der in der vorliegenden Erfindung offenbarten Verfahren können andere Krebsantigen-Epitope, die in anderen alternativen Leserahmen enthalten sind, von anderen Tumor-assozierten Antigenen identifiziert werden (Van der Bruggen, P. et al. 1991 Science 254: 1643–47; Gaugler, B. et al. 1994 J. Exp. Med. 179: 921–30; Boel, P. et al. 1995 Immunity. 2: 167–75; Brichard, V. et al. 1993, J. Exp. Med. 178: 489–95; Robbins, P. F. et al. 1994, Cancer Research 54: 3124–26; Kawakami, Y. et al. 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91: 3515–19; Coulie, P. G et al., 1994 J. Exp. Med. 180: 35–42; Bakker, A. et al. 1994, J. Exp. Med. 179: 1005–09) wie von MART-1/Melan-A (Kawakami et al. J. Exp. Med. 180: 347–352, 1994), MAGE-3 (Gaugler et al. J. Exp. Med. 179: 921–930, 1994), gp100 (Kawakami et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91: 6458–6462, 1994), Tyrosinase (Brichard et al. J. Exp. Med. 178: 489, 1993), TRP-2, CEA, CA-19-A, CA-125, PSA, erb-2 (Boon et al. Ann. Rev. Immunol. 12: 337, 1994).
  • Tumor-infiltrierende Lymphozyten (TILs), die von an Tumor erkrankten Patienten abgeleitet sind, erkennen Tumor-assoziierte Antigene, die durch Haupt-Histokompatibilitätskomplex-(MHC)-Klasse-I-Moleküle präsentiert werden. Die Infusion von TIL586 zusammen mit Interleukin-2 (IL-2) in den autologen Patienten mit metastasierendem Melanom führte zum objektiven Rückgang des Tumors. Ein Gen, das für ein Tumorantigen kodiert, das von TIL586 erkannt wird, wurde kürzlich isoliert. Es wurde gezeigt, dass es für gp75 kodiert. Die vorliegende Erfindung besteht in der Identifizierung und Isolierung eines antigenen Peptids, MSLQRQFLR (SEQ. ID Nr. 9), das von TIL586 erkannt wird, und das nicht vom normalen gp75-Protein abgeleitet ist. Stattdessen entsteht dieses Nonamer-Peptid aus der Translation eines alternativen offenen Leserahmens des gleichen Gens. Somit kodiert das gp75-Gen für zwei völlig unterschiedliche Polypeptide; für gp75, ein Antigen, das durch IgG-Antikörper in Seren eines Patienten mit Krebs erkannt wird, und für ein 24-Aminosäureprodukt als von T-Zellen erkanntes Tumor-Abstoßungs-Antigen. Somit wird zum ersten Mal gezeigt, dass ein menschliches Tumorabstoßungsantigen von einem normalen zellulären Gen generiert werden kann unter Verwendung eines offenen Leserahmens, der sich von dem unterscheidet, der für das normale Protein kodiert. Diese Erkenntnis zeigte einen neuen Mechanismus zur Generierung von Tumorantigenen auf die als Impfstoffe nützlich sein können, um eine tumorspezifische, zellvermittelte Immunität gegen Krebs zu induzieren.
  • Durch das Verfahren der ExoIII/SI-Deletionanalyse wurde das Krebsepitop in einem kleinen DNA-Fragment des gp75-Gens lokalisiert. Das Krebsepitop fehlte im normalen gp75-Protein. Das erfindungsgemäße Krebspeptid, das durch TIL586 erkannt wird, ist vom gleichen Genprodukt abgeleitet und wird von einem alternativen offenen Leserahmen desselben Gens translatiert, das das normale gp75-Protein kodiert. Der Austausch von ATG gegen ATC an den Nukleotiden 294–296 führte zu einem vollständigen Verlust der Fähigkeit, die Zytokinfreisetzung aus TIL586 zu stimulieren. Unmarkierte Zielhemmungsexperimente zeigten, dass das identifizierte Krebsepitop mit einem natürlich prozessierten Peptid, das auf Tumorzellen anwesend ist, um die T-Zellerkennung konkurrieren kann. Sechs T-Zell-Klone, die aus der TIL586-Zelllinie generiert wurden, konnten 586mel Tumorzellen, 586EBV-B-Zellen, die mit diesem Peptid beladen waren, und normale Melanozyten in einer HLA-A31-restringierten Weise erkennen, was ebenfalls nahelegt, dass das vom alternativen offenen Leserahmen kodierte Genprodukt sowohl in Tumorzellen als auch in normalen Melanozyten anwesend ist.
  • Die Erfindung stellt ein transgenes Tier bereit, das in seinem Genom eine oder mehrere Kopien der DNA-Sequenz des alternativen offenen Leserahmens trägt, die für ein Krebspeptid oder einen Teil davon kodiert. Das allgemeine Verfahren zur Herstellung von transgenen Tieren wird beschrieben in Krimpenfort et al., US-PS Nr. 5,175,384, Leder et al. US-PS Nr. 5,175,383, Wagner et al. US-PS Nr. 5,175,385, Evans et al. US-PS Nr. 4,870,009 und Berns US-PS Nr. 5,174,986. Der Einbau des Gens führt zur Überexpression, veränderter Expression oder zur Expression multipler Formen oder Varianten der Krebspeptide. Die entstehenden transgenen Tiere eignen sich für Untersuchungen der Entwicklung von Krebs oder zur Untersuchung der Tumorantigene der vorliegenden Erfindung. Das Tiermodell ist nützlich bei Suche nach Impfstoffen und nach chemotherapeutischen Arzneistoffen für die Krebsbehandlung. Das transgene Tier ist ebenfalls nützlich für Untersuchungen zur Krebsentstehung.
  • Diese Erfindung umfasst weiterhin einen Antikörper oder einen Antigen-bindenden Teil davon, dessen Bildung durch Immunisierung durch das Krebspeptid oder das erfindungsgemäße antigene Krebsepitop hervorgerufen wird. In dem Fall, in dem das Krebspeptid oder das antigene Krebsepitop nur aus wenigen Aminosäuren besteht, kann das Krebspeptid oder das antigene Krebsepitop zum Auslösen einer Antikörper-Reaktion an ein Trägerprotein konjugiert sein. Trägerproteine, wie KLH, Tetanustoxin und ähnliche und Verfahren zur Konjugierung sind im Stand der Technik bekannt. Der Antikörper ist für das erfindungsgemäße Krebspeptid und das antigene Krebepitop spezifisch und reagiert oder bindet daran.
  • Beispielhafte Antikörpermoleküle sind intakte Immunglobulinmoleküle, im Wesentlichen intakte Immunglobulinmoleküle oder jene Teile eines Immunglobulinmoleküls, die die Antigen-Bindestelle enthalten, einschließlich jenen Teilen der Immunglobulinmoleküle, die man als F(ab), F(ab'), F(ab')2, humanisierten chimären Antikörper und F(v) kennt. Polyklonale oder monoklonale Antikörper können anhand bekannter Verfahren erzeugt werden. (Kohler und Milstein (1975) Nature 256, 495–497; Campbell „Monoclonal Antibody Technology, the Production and Characterization of Rodent and Human Hybridomas" in Burdon et al. (Hrsg.) (1985) „Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology", Bd. 13, Elsevier Science Publishers, Amsterdam). Die Antikörper- oder Antigenbindenden Fragmente können ebenfalls durch rekombinante Verfahren erzeugt werden. Die Technik zur Expression sowohl von schwere- als auch leichte-Ketten Genen ist das Thema der PCT-Patentanmeldungen: Veröffentlichungsnummer WO 901443, WO 9014424, Huse et al. (1989) Science 246: 1275–1281, und US-PS Nr. 4,946,778.
  • In einer Ausführungsform werden die erfindungsgemäßen Antikörper in Immunassays verwendet, um Krebspeptide einschließlich TRP-1-Peptide oder Teile davon in biologischen Proben nachzuweisen. Die Antikörper oder antigenbindenden Fragmente davon können dazu verwendet werden, Krebspeptide in Gewebebiopsieproben eines Säugers nachzuweisen, der an Krebs leidet. Die Bewertung des Krebsantigens in einem erkrankten Gewebe kann dazu verwendet werden, das Fortschreiten der Krankheit in einem Säuger zu prognostizieren oder um die Wirksamkeit einer Behandlung zu diagnostizieren. Der Immunassay kann ein Radio-Immunassay, Western-Blot-Assay, Immunfluoreszenz-Assay, Enzymimmun-Assay, Chemilumineszenz-Assay, immunhistochemischer Assay und Ähnliches sein und kann in vitro, in vivo oder in situ durchgeführt werden. Im Stand der Technik bekannte Verfahren für einen ELISA werden beschrieben in „Methods in Immunodiagnosis", 2. Auflage, Rose und Bigazzi, Hrsg. John Wiley & Sons, 1980; Campbell et al., „Methods and Immunology" W. A. Benjamin, Inc., 1964; und Oellerich, M. 1984, J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 22: 895–904. Herkömmliche Verfahren für Immunhistochemie sind in Harlow und Lane (Hrsg.) (1988) in „Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York; Ausubel et al. (Hrsg.) (1987) in „Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons (New York, NY) beschrieben. Biologische Proben, die sich für solche Nachweis-Assays eignen, beinhalten Zellen, Gewebebiopsien, Vollblut, Plasma, Serum, Auswurf, Zerebrospinalflüssigkeit, Pleuraflüssigkeit, Urin und Ähnliches, sind aber nicht darauf beschränkt.
  • Die erfindungsgemäßen Antikörper oder antigenbindenden Fragmente können ebenfalls in der Immuntherapie verwendet werden. Die Antikörper oder das Antigen-bindende Fragment davon werden an einen Säuger in einer Menge verabreicht, die ausreicht, das Ausmaß oder die Dauer des Krebses zu verhindern, zu vermindern oder den Schweregrad zu erleichtern.
  • Alle zitierten Artikel und Patente werden durch Inbezugnahme in die Beschreibung mit aufgenommen.
  • Während die Erfindung in Bezug auf bestimmte spezifische Ausführungsformen beschrieben wird, sind viele Variationen möglich und es können auch alternative Materialien und Reagenzien verwendet werden. In einigen Fällen können solche Variationen und Substitutionen zusätzliche Experimente erforderlich machen, aber dies sind lediglich Routineverfahren.
  • Die vorausgegangene Beschreibung der spezifischen Ausführungsformen legt den allgemeinen Charakter der Erfindung deutlich dar. Somit können Dritte durch Anwendung des Standardwissens die spezifischen Ausführungsformen an verschiedene Anwendungen anpassen, ohne vom allgemeinen Konzept abzuweichen, und somit befinden sich solche Anpassungen und Modifikationen innerhalb des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung. Jeglicher Bezug auf TRP-2 in den folgenden Beispielen dient lediglich zur Veranschaulichung.
  • Beispiel 1
  • Material und Methoden
  • Chemikalien und Reagenzien
  • Die folgenden Chemikalien und Reagenzien wurden von den genannten Herstellern bezogen: RPMI 1640, AIM-V-Medium, Lipofectamin, G418 (GIBCO BRL, Gaithersberg, MD); der eukaryotische Expressionsvektor pCR3 (Invitrogen, San Diego, CA); anti-HLA-A31 monoklonale Antikörper (One lambda, Canoga Park, CA); Antümmunglobulin-M- Antikörper, konjugiert an Fluoresceinisothiocyanat (Vector Laboratories, Inc. Burlingame, CA).
  • Zytotoxische T-Lymphozyten (CTLs) und Zelllinien
  • TIL586 wurden aus der Tumorprobe eines Patienten mit metastasierendem Melanom isoliert und in Medium kultiviert, das IL-2 (6000 IU/ml) (Chiron) enthielt, für 32–60 Tage, wie vorhergehend beschrieben (Topalian, S., D. Solomon, F. P. Avis, A. E. Chang, D. L. Freeksen, W. M. Linehan, M. T. Lotze, C. N. Robertson, C. A. Seipp, P. Simon, C. G. Simpson und S. A. Rosenberg, 1988, J. Clin. Oncol. 6: 839–53. TIL586 waren hauptsächlich CD8+-T-Zellen. TIL1200 wurden unter den gleichen Bedingungen kultiviert, wie für TIL586 beschrieben. Die T-Zellklone wurden durch limitierende Verdünnung aus der TIL586-Zelllinie generiert und dann in AIM-V-Medium, das 600 IU/ml IL-2 enthielt, expandiert.
  • Die Melanom-Zelllinien 397mel, 397mel/A31, 586mel, 624mel und mit EBV transformierte B-Zelllinien 586EBV und 1510EBV wurden in diesem Labor etabliert und in RPMI-1640-Medium kultiviert, das 10%-iges fötales Kälberserum (FCS) enthielt. Normale kultivierte Melanozyten aus Säuglingsvorhaut (NHEM680 von Clonetics, CA) wurden in Melanozyten-Wachstumsmedium (MGM; Clonetics, CA) kultiviert. Die COS-7-Zelllinie wurde von Dr. W. Leonard (NIH) zur Verfügung gestellt.
  • GM-CSF-Sekretions-Assay
  • Die DNA-Transfektion und der GM-CSF-Assay wurden, wie vorhergehend beschrieben, durchgeführt (Wang, R. F., P. F. Robbins, Y. Kawakami, X. Q. Kang und S. A. Rosenberg, 1995, J. Exp. Med. 181: 799–804). 200 μg DNA mit einem unterschiedlichen Fragment und 50 ng der HLA-A31-DNA wurden mit 2 μl Lipofectamin in 100 μl DMEM für 15–45 min vermischt. Das DNA-Lipofectamingemisch wurde dann zu den COS-7 Zellen (5 × 104) hinzugegeben und über Nacht inkubiert. Am nachfolgenden Tag wurden die Zellen zweimal mit DMEM-Medium gewaschen. TIL586 wurden in einer Konzentration von 1 × 105 Zellen/Vertiefung in AIM-V-Medium hinzugegeben, das 120 IU/ml IL-2 enthielt. Nach einer 18–24-stündigen Inkubation wurden 100 μl des Überstandes gesammelt und GM-CSF in einem Standard-ELISA-Assay (R + D Systems, Minneapolis, MN) gemessen. Für die Peptide wurden 586EBV, 1510EBV und T2-Zellen mit den Peptiden bei 37°C für 90 min inkubiert und dann dreimal mit AIM-V-Medium gewaschen, das 120 IU/ml IL-2 enthielt. TIL586 wurde zugegeben und für zusätzliche 18–24 Std. inkubiert, 100 μl des Überstands wurden für den GM-CSF-Assay gesammelt.
  • Exo-III/SI-Deletionskonstrukte und PCR-Fragmente
  • Um eine Reihe von Deletionen herzustellen, wurde das pcDNA776-Plasmid mit Xba I verdaut und mit alpha-Phosphorothioat-Desoxyribonukleotidtriphosphaten aufgefüllt, um den Exo-III-Nukleaseverdau zu blockieren. Das psDNA776-Plasmid ist ein Derivat des pcDNA3-Vektors, der ein 2,4 kb DNA-Fragment und einen CMV-Promotor zur Kontrolle der Transkription enthält. Die linearisierte DNA wurde einem zweiten Verdau mit Xho I unterzogen, um ein Ende zu erzeugen, das für Exo III empfindlich ist. Exo III-Nuklease/Mungobohnen-Nukleasedeletion wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers (Stratagene, CA) durchgeführt. Das ausführliche Protokoll ist wie folgt:
    • 1. 10 μg DNA wird mit XbaI verdaut und mit alpha-Phosphorothioat-Dessoxyribonukleotid aufgefüllt.
    • 2. Die DNA wird mit dem zweiten Enzym XhoI verdaut, gefolgt von Phenolextraktion und Ethanolpräzipitation.
    • 3. Das DNA-Pellet wird getrocknet und in 125 μl 2 × Exo-Puffer, 25 μl 100 mM β-Mercaptoethanol, 100 μl Wasser suspendiert.
    • 4. Nachdem alle Aliquots entfernt und auf Trockeneis gegeben wurden, werden die Röhrchen für 15 min auf 68°C erhitzt und dann auf Eis gegeben.
    • 5. 15 Einheiten Mungobohnen-Nuklease wird zu jedem Röhrchen zugegeben (verdünnt mit 1 × Mungobohnenverdünnungspuffer) und für 30 min bei 30°C inkubiert.
    • 6. Hinzugegeben werden: 4 μl 20% SDS 10 μl 1 M Tris-HCl, pH 9,5 20 μl 8 M LiCl 250 μl Puffer-equilibriertes Phenol : Chloroform
    • 7. Die Proben werden gevortext, 1 Minute in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert, die obere wässrige Schicht wird entfernt und mit Chloroform extrahiert, um das Mungobohnen-Protein von der DNA zu entfernen.
    • 8. 25 μl 3 M NaCOAc pH 7,0 wird zur wässrigen Phase zugegeben. Als Träger für die Präzipitation wird tRNA in einer Endkonzentration von 10 ng/μl verwendet.
    • 9. 650 μl kaltes Ethanol wird hinzugegeben. Die Proben werden auf Trockeneis für 10 Minuten abgekühlt und dann in einer Mikrofuge für 20 Minuten zentrifugiert.
    • 10. Der Überstand wird abgegossen und die Pellets mit 80%-igem Ethanol gewaschen.
    • 11. Das Pellet wird getrocknet.
    • 12. Das DNA-Pellet wird in 15 μl 10 mM Tris-Cl pH 7,5, 0,1 mM EDTA aufgelöst.
  • B. Ligation
    • 13. DNA-Deletionen werden unter den folgenden Bedingungen ligiert: 1,0 μl Exo/Mungo-behandelte DNA 2,0 μl 10-fach Ligationspuffer 500 mM Tris-HCl, pH 7,5 70 mM MgCl2 10 mM DTT 2,0 μl 5 mM ATP, pH 7,0–7,5 2,0 μl T4-DNA-Ligase (Katalognummer 600011; als Kit bereitgestellt) 13,0 μl H2O 20,0 μl Gesamtreaktionsvolumen inkubiert bei Raumtemperatur Stratagene bietet einen DNA-Ligations-Kit (Katalognummer 203003) zur Ligation von Inserts in Vektoren an.
    • 14. 7 μl der verbleibenden 14 μl der Exo-/Mungo-behandelten DNA werden für Gel-Elektrophoreseanalyse verwendet.
    • 15. 1 μl der Ligationsreaktion wird dazu verwendet, 100 μl von Epicurian-coli-RecA-JM109 oder XL1-Blue-Zellen zu transformieren; diese werden auf LB/AMP-Platten ausplattiert.
  • C. Agarose-Gel-Elektrophorese mit niedrigem Schmelzpunkt
  • Um das Screenen von Deletionen zu minimieren, wurde ein Teil der Deletion in einem Agarose-Gel mit niedrigem Schmelzpunkt aufgetrennt, die interessierende Bande ausgeschnitten und die Ligation fortgesetzt. Die Konzentration von Agarose wurde in der Ligationsreaktion unter 0,5% gehalten.
  • Die PCR-Amplifikation wurde bei 94°C für 2 min durchgeführt, gefolgt von 25 Zyklen bei 94°C für 1 min, 55°C für 45 sec und 72°C für 1 min. Die Primer gpN (5'AGAATGAGTGCTCCTAAACTCCTCTCTCTGGG) (SEQ. ID Nr. 42) und gp11B (5'CATGTGAGA AAAGCTGGTCCCTCA) (SEQ. ID Nr. 43) wurden dazu verwendet, das DNA-Fragment (1–667) zu erzeugen, das dann in den pCR3-Expressionsvektor kloniert wurde, um pPCR110 zu erzeugen. Die Plasmide pPCR210 und pPCR220 sind pCR3-Vektoren, die DNA-Insertionsfragmente enthalten, die unter Verwendung der Primer gp-1 (5'TGGATATGGCAAAGCGC ACAACTC) (SEQ. ID Nr. 44) und gp11B, gp-1 und gp22 (5'TAAATGGAA ATGTTCTCAAATTGT GGCGTG) (SEQ. ID Nr. 45) amplifiziert wurden.
  • Assay zur zytotoxischen Lyse
  • Der zytolytische Assay wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt (Kawakami, Y et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 6458–62). Die Zielzellen wurden für 90 min mit Chrom inkubiert. Nach dreimaligen Waschschritten wurden die Zellen mit Peptiden in einer Konzentration von 1 μg/ml für 90 min inkubiert, nochmals gewaschen, gezählt und dann mit TIL586 in dem angegebenen Verhältnis von Effektor : Ziel (E : T) vermischt. Die Freisetzung von Chrom wurde 4 Std. nach der Inkubation gemessen. Die Peptide wurden unter Verwendung eines Peptid-Synthesegeräts (Modell AMS 422, Gilson Co., Inc., Worthington, OH) mit einem Festphase-Verfahren synthetisiert. Einige Peptide wurden durch HPLC aufgereinigt und waren mehr zu als 98% rein. Zur Titration des von TIL586 erkannten ORF3P-Peptids wurden 586EBV-B-Zellen mit verschiedenen Konzentrationen des aufgereinigten ORF3P-Peptids inkubiert. Der Prozentsatz der spezifischen Lyse wurde aus der Gleichung (A – B)/(C – B) × 100 bestimmt, wobei A die Lyse der 586EBV-B-Zellen durch TIL586 in Anwesenheit eines Peptids und B die spontane Freisetzung aus 586EBV-B-Zellen in Anwesenheit des gleichen Peptids ist, aber in Abwesenheit von Effektorzellen und C ist die maximale Chromfreisetzung. Die unmarkierte Zielhemmung der Zytolyse wurde durchgeführt unter Verwendung von 51Cr-markierten 586mel- oder 624mel-Zellen als markierte Ziele und 586EBV-B- und T2-Zellen, die mit Peptiden beladen waren als „unmarkierte" Ziele.
  • Ortsgerichtete Mutagenese
  • Zur Erzeugung der ortsgerichteten Mutagenese wurden die mutierten Primer GPMUT1 (5' GCCATGGGCAGAGATGATCGGGAGGTCTGGCCCTTGCGCTTCTTCAATAGGACAT CTCACTGCAAC (SEQ. ID Nr. 11) und GPA1 dazu verwendet, ein PCR-Fragment zu erzeugen, das eine Mutation (G zu C) am Nukleotid 296 enthielt. Die Wildtyp-DNA-Fragmente wurden durch die Primer GPF1 (5'GAAGATCTGCCATGGGCAGAGATGATCGGGAGG TCTG (SEQ. ID Nr. 12), GPE1 5'GAATTCGTTG TGT CCTGAGAAATTGCCGTTG (SEQ. ID Nr. 13), GPE2 (5'GA ATTCGACTATGAGAACCCTCTGGTCACAGGC (SEQ. ID Nr. 14) und GPA1 (5'AAGATCTGGGCC CGGACAAAGTGGTTCTTTTC (SEQ. ID Nr. 15), die in 3A durch Pfeile markiert sind, amplifiziert. Die aufgereinigten PCR-Produkte wurden dann in den PCR3-Expressions-Vektor kloniert. Alle Plasmide, die PCR-Fragmente enthielten, wurden sequenziert, um die Orientierung und die Nukleotidsequenz zu bestätigen.
  • Beispiel 2
  • Lokalisation des antigenen Peptids, das von TIL586 erkannt wird
  • Um das antigene Epitop von gp75 zu identifizieren, wurden eine Reihe von „nested" Deletionen des gp75-Gens vom 3'-Ende unter Verwendung von ExoIII-/SI-Nuklease als auch zusätzliche DNA-Fragmente von gp75 durch PCR-Amplifiaktionen (1A) generiert. pcDNA775 wurde als Ausgangsmaterial für die Deletionsuntersuchungen verwendet, da dieser Klon anfänglich durch ein Bibliotheks-Screening identifiziert wurde und die Fähigkeit verlieh, Zytokinfreisetzung aus TIL586 zu stimulieren. Das Plasmid pcDNA776 wurde bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD unter den Bedingungen des Budapester Vertrags am 19. Januar 1996 hinterlegt. Es wurde die Hinterlegungsnummer ATCC 97423 zugeordnet. Nachdem das Ziel dieser Untersuchung darin bestand, das von TIL586 erkannte Epitop zu identifizieren, wurden so kurze Fragmente wie möglich verwendet, (die verkürzte Form von gp75 anstatt der Gesamtlängen-cDNA), so dass das Epitop in einem relativ kleinen DNA-Fragment schnell lokalisiert werden konnte. Diese Deletionskonstrukte wurden dann zusammen mit dem pBK-CMV-Plasmid, das das HLA-A31-Gen enthält, in COS-7-Zellen transfiziert (Wang, R. F. et al. 1995, J. Exp. Med. 181: 799.804). Nach 24 Stunden wurden die transfizierten COS-7-Zellen untersucht, um nachzuweisen, das Konstrukt die Zytokinfreisetzung durch TIL586 stimulieren konnte. Ein kleines verkürztes DNA-Fragment im Bereich von Nukleotid 247 bis 771, dem das normale gp75-Initiations-Codon fehlte, behielt die Fähigkeit bei, die Freisetzung von GM-CSF aus TIL586 zu stimulieren, was nahelegt, dass das von TIL586 erkannte Epitop in dem DNA-Fragment lokalisiert ist, das die Nukleotide 247 bis 771 enthält. Da im Zusammenhang mit einer Kozak-Sequenz (GATATGG) (SEQ.-ID Nr. 16), die an den Nukleotiden 445–447 liegt, ein ATG-Start-Codon lokalisiert ist, und im gleichen Leserahmen wir gp75 vorliegt, überlegte man sich, dass das von TIL586 erkannte Epitop im Bereich von Nukleotid 445–771 vorliegt. Somit wurden pPCR210 und pPCR220 konstruiert, die Derivate des pCR3-Expressionsvektors darstellen und ein internes ATG-Codon im Leserahmen mit gp75 (GATATGG) (SEQ.-ID Nr. 16) enthielten, das bei 445 bp lokalisiert war als Start-Codon zur Translation des verkürzten, normalen gp75-Proteins. Jedoch konnten weder pPCR210 noch pPCR220 die Fähigkeit verleihen, die Zytokinsekretion aus TIL586 nach Ko-Transfektion von COS-7 mit dem HLA-A31-Gen (1B) zu stimulieren, was nahelegte, dass sich das Epitop stromaufwärts dieser Fragmente befand. Deshalb wurde ein zusätzliches Plasmid pD776A konstruiert, das die Nukleotidsequenz von 247–442 enthielt und kein ATG-Codon im gleichen Leserahmen wie gp75, aber zwei ATG-Codons in verschiedenen offenen Leserahmen im Vergleich zu gp75 enthielt. Dieses Plasmid stimulierte die Zytokinfreisetzung aus TIL586 bei Ko-Transfektion mit A31 cDNA in COS-7-Zellen. Das Plasmid pPCR110, das das authentische Start-Codon von gp75 enthielt, stimulierte die Zytokinfreisetzung wesentlich geringer als es pDel5 oder pD776A taten, bei Ko-Transfektion mit dem HLA-A31-Gen (1B). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die von TIL586 erkannten Epitope im Bereich der Nukleotide 247–442 liegen.
  • Obwohl dieser Bereich (Nukleotide 247–442) im normalen offenen Leserahmen von gp75 kein ATG-Start-Codon enthalten, wurde ebenfalls die Initiation der Translation von Nicht-ATG-Codons, wie ACG, CTG und GTG in einigen Fällen berichtet (Hann, S. R., 1994, Biochimie 76: 880–86; Muralidar, S. et al., J. Virol. 1994, 68: 17076). Um das Epitop in diesem Bereich zu identifizieren, wurden synthetische Peptide, basierend auf dem Peptid-Bindemotiv von HLA-A31 (hydrophober Rest an Position 2 und positiv geladener Rest an C-Terminus) (2) (Falk, K. et al., Immunogenetics 1994, 40: 238–41) erzeugt. Die Mehrzahl der für diese Untersuchung ausgewählten Peptide waren Nonamere, obwohl einige 10 mere und 11 mere dabei waren. Diese Peptide wurden auf 586EBV-B-Zellen geladen und die Fähigkeit dieser Zellen, die Zytokinfreisetzung aus TIL586 zu stimulieren (Tabelle 1), wurde gemessen. Ein Peptid, AACDQRVLIVRR (SEQ.-ID Nr. 25) induzierte in sehr geringem Ausmaß GM-CSF- Freisetzung aus TIL586. Dieses Peptid konnte Peptid-beladene 586EBV-B-Zellen für die Lyse durch TIL586 (Tabelle 1) nicht sensibilisieren.
  • Tabelle 1 Tabelle 1. Screening synthetischer Peptide, die für TIL586 reaktiv sind
    Figure 00380001
  • 586EBV-Zellen wurden mit einzelnen Peptiden in einer Konzentration von 1 μg/ml für 90 min inkubiert. Freisetzung von GM-CSF wurde nach Ko-Inkubation von Peptid-beladenen 586EBV-Zellen mit TIL586 gemessen. Sekretion von GM-CSF durch TIL586 alleine ohne Stimulatoren wurde abgezogen. 586EBV ist eine mit EBV transformierte B-Zelllinie, die HLA-A31 exprimiert. Cytotoxische Lyse Peptid-beladener 586EBV durch TIL586 wurde in einem 4 h Chrom-Freisetzungsassay durchgeführt.
  • Da dieses Peptid die Cytokinfreisetzung aus TIL586 nur dann schwach stimulierte, wenn 586EBV-B-Zellen in hohen Konzentrationen inkubiert wurden (> 1 μg/ml) und die Zielzellen für die Lyse durch TIL586 auch bei 10 μg/ml Peptidkonzentration (Daten nicht gezeigt) nicht sensibilisierte, stellt es nicht das prädominante T-Zellepitop dar, das von TIL586 erkannt wird.
  • Zur weiteren Definition des Bereichs, der das prädominante T-Zellepitop enthält, wurden zusätzliche Plasmide erzeugt, die PCR-Fragmente enthielten, die durch die Primer GPF1, GPE1 bzw. GPE2 (3A) amplifiziert wurden. Wie in 3B gezeigt, verliehen beide Plasmide, die ein ATG-Start-Codon am Beginn des kleineren PCR-Fragmentes enthielten, die Fähigkeit, die Zytokinfreisetzung aus TIL586 in Assoziation mit HLA-A31 zu stimulieren, was nahelegt, dass das von T-Zellen erkannte Epitop innerhalb einer 82-Nukleotidsequenz zwischen den Basen 247 und 329 der gp75 cDNA kodiert wird. Achtundzwanzig überlappende Peptide (9 mere oder 10 mere) in ORF1 wurden basierend auf der Aminosäuresequenz von gp75 in diesem Bereich synthetisiert, aber keines stimulierte die Freisetzung von GM-CSF oder sensibilisierte 586EBV-B-Zellen für die Lyse durch TIL586 (Daten nicht gezeigt).
  • Beispiel 3
  • Antigene Peptide, die durch Translation eines alternativen offenen Leserahmens des gp75-Gens entstehen
  • Die fehlende Identifizierung eines Epitops in diesem kleinen Bereich, das durch TIL586 erkannt wird, legte nahe, dass alternative offene Leserahmen translatiert werden könnten. In diesem Bereich (Nukleotide 247–442) fanden sich im Vergleich zum offenen Leserahmen von gp75 (ORF1) (2) zwei ATG-Codons in relativ gutem Zusammenhang. Die Translation des ersten ATGs (251 GAGATGA257) (SEQ. ID Nr. 29) führte zu einem offenen Leserahmen, der 45 Aminosäuren (ORF2) kodiert, während die Translation, beginnend an dem ATG zwischen den Nukleotiden 294–296 (GACATGT) (SEQ. ID Nr. 30) zu einem Genprodukt (ORF3) (2) von 24 Aminosäuren führte. Drei Peptide, abgeleitet von ORF2, und zwei Peptide von ORF3 wurden selektiert und auf der Basis des HLA-A31-Bindemotivs (Tabelle 2 und 2) synthetisiert. Überraschenderweise wurde ein Peptid (MSLQRQFLR) (SEQ. ID Nr. 9) (bezeichnet als ORF3P), das vom ORF3 abgeleitet war, deutlich von TIL586 erkannt, wenn es auf 586EBV-B-Zellen (Tabelle 2) geladen wurde. Die Erkennung des ORF3P-Peptids (MSLQRQFLR) (SEQ. ID Nr. 9) durch TIL586 wurde nur beobachtet, wenn das Peptid auf autologe 586EBV-B-Zellen und 1510EBV-B-(A31+)-Zellen geladen wurde, aber nicht, wenn das Peptid auf T2-(nicht HLA-A31)-Zellen (4A) geladen wurde, was nahelegt, dass die Erkennung dieses Peptids durch TIL586 HLA-A31 restringiert ist. Die Peptidmasse von ORF3P wurde durch massenspektrometrische Analyse bestätigt. Wie in 4B gezeigt, lysierten TIL586 586EBV-B-Zellen, die mit dem ORF3P-Peptid beladen waren, konnten aber keine 586EBV-B-Zellen lysieren, die mit irrelevanten Peptiden beladen waren, die die Kriterien des Peptid-Bindemotivs von HLA-A31 erfüllten, aber nicht von TIL586 oder T2-Zellen erkannt wurden, die mit dem ORF3P-Peptid beladen waren. Die Sensibilisierung für die Lyse durch das Peptid zeigte einen maximalen Effekt bei 100 nM, obwohl lytische Aktivität auch bei 1 nM Peptid-Konzentration (4C) nachgewiesen wurde. TIL586 erkannte weder die Peptide MSLQRQFLRT (SEQ.-ID Nr. 33) oder SLQRQFLRT (SEQ.-ID Nr. 34) oder modifizierte Peptide (Substitutionen an den Ankerresten an den Positionen 2, 6 und 9) MLLQRQFLR (SEQ.-ID Nr. 36), MRLQRQFLR (SEQ.-ID Nr. 37), MSLQRLFLR (SEQ.-ID Nr. 38), MSLQRQFLE (SEQ.-ID Nr. 39), MSLQRQFLK (SEQ.-ID Nr. 40), abgeleitet von MSLQRQFLR (SEQ.-ID Nr. 9) (Tabelle 2). TIL586 erkannte nur das Peptid MALQRQFLR (SEQ.-ID Nr. 35) mit einer Substitution von Ser gegen Ala an der Position 2, verglichen mit dem Peptid MSLQRQFLR (SEQ.-ID Nr. 9) (Tabelle 2).
  • Tabelle 2. Identifizierung von antigenen Peptiden mit Reaktivität gegenüber TIL586
    Figure 00410001
  • Bedingungen für Peptid-Inkubation mit 586EBV-B-Zellen und GM-CSF-Freisetzungsassay waren identisch zu Tabelle 1. Sekretion von GM-CSF durch TIL586 allein ohne Stimulatoren wurde abgezogen. Modifizierte Peptide wurden durch Austausch von Aminosäuren an den Positionen 2, 6 und 9 bezogen auf MSLQRQFLR (Seq.-ID Nr. 9) hergestellt. Cytotoxische Lyse Peptid-beladener 586EBV durch TIL586 wurde in einem 4-stündigen Chrom-Freisetzungsassay durchgeführt.
  • Beispiel 3
  • Translation ist zur Erzeugung des natürlich prozessierten antigenen Peptids notwendig
  • Da in den sechs Nukleotiden stromaufwärts des ATG-Start-Codons von ORF3 (294–296) (2) ein Stopp-Codon TAG (288–290) lokalisiert war, war es unwahrscheinlich, dass das ORF3P-Peptid aus einer Leserasterverschiebung resultierte. Die DNA-Sequenzanalyse bestätigte auch, dass im stromaufwärts gelegenen Bereich keine Deletion oder Insertion vorlag. Um zu untersuchen, ob das an den Nukleotiden 294–296 lokalisierte ATG eine wichtige Rolle bei der Translation des 24 Aminosäureprodukts spielte, wurde ATGT (294– 297) bis ATCT mutiert (294–297), um die Translation von ORF3 zu eliminieren, was zu einer Veränderung von Cys (UGU) zu Ser (UCU) in ORF1 (gp75)/3A) führen würde. Ein Plasmid, das das mutierte Gen (pGFMUT1) enthielt, wurde hinsichtlich seiner Fähigkeit getestet, Erkennung durch TIL586 bei Ko-Transfektion in COS-7 zusammen mit der HLA-A31 cDNA zu verleihen. 3B zeigte, dass das mutierte Gen die Fähigkeit vollständig verloren hatte, die Freisetzung von GM-CSF durch TIL586 zu stimulieren, verglichen mit einem Konstrukt, das das Wildtyp-Gen enthielt. Diese Beobachtung zeigte, dass das ATG an den Nukleotidpositionen 294–296 in ORF3 zur Translation des 24 Aminosäureproduktes notwendig war, und somit für die Erzeugung des von TIL586 erzeugten T-Zellepitops essentiell ist.
  • Da Met (ATG) in Position 1 des Peptidepitops vorliegt und die Mutation von ATG zu ATC an den Nukleotiden 294–296 zu einer Veränderung von Met zu Ile an Position 1 des Peptids führte, wurde die Möglichkeit untersucht, dass der Verlust der Erkennung des mutierten Gens durch TIL586 auf den Verlust der Fähigkeit des mutierten Peptids zurückzuführen sein könnte, an MHC-Klasse-I-Moleküle zu binden. Ein synthetisches Peptid (ISLQRQFLR) (SEQ. ID Nr. 41) mit der gleichen Aminosäuresequenz, wie vom mutierten Gen kodiert, wurde erzeugt und hinsichtlich der Erkennung durch TIL586 untersucht. Man fand heraus, dass das synthetische mutierte Peptid noch in vergleichbaren Konzentrationen wie das Wildtyp-Peptid von TIL586 erkannt wurde. Weiterhin wurde, wenn die gleiche Mutation in die Gesamtlängen-cDNA eingebracht wurde, keine Reaktivität gegenüber TIL586 beobachtet, während die Wildtyp-cDNA die Cytokinfreisetzung aus TIL586 in einer ähnlichen Konzentration wie pPCR110 stimulieren konnte. Dies stimmt mit den Deletionsergebnissen überein und legt nahe, dass TIL586 keine Peptide in anderen Bereichen des Gens erkannte. Diese Ergebnisse legen nahe, dass der Verlust der Erkennung des mutierten Gens (ATG zu ATC an den Nukleotiden 294–296) durch T-Zellen auf die Inaktivierung der Translationsinitiation von ORF3 zurückzuführen ist.
  • Beispiel 4
  • Erkennung des antigenen Peptids auf Tumorzellen wie auch auf Melanozyten
  • Zur Beantwortung der Frage, ob TIL586 ein natürlich prozessiertes Peptid erkennt, das identisch oder ähnlich zum ORF3-Peptid auf Tumorzellen ist, wurde die Fähigkeit des ORF3P-Peptids, das auf 586EBV B-Zellen geladen wurde, um die Lyse von 51Cr-markierten 586mel-Zellen zu hemmen, in einem unmarkierten Zielhemmungsassay untersucht. Signifikante Hemmung der Lyse von 51Cr-markierten 586mel wurde mit 586EBV-B-Zellen beobachtet, die mit dem ORF3P-Peptid beladen waren, aber nicht mit 586EBV-B-Zellen, die mit irrelevanten Peptiden beladen waren, oder T2-Zellen, die mit dem ORF3P-Peptid beladen waren (5A). Dies zeigt, dass dieses Peptid-Epitop mit einem natürlich prozessierten Peptid auf Tumorzellen um die T-Zellerkennung konkurrieren kann. Wie vorhergesagt, hemmten die mit ORF3P-beladenen 586EBV-B-Zellen die Lyse von 624mel Zielzellen durch TIL 1200 nicht, die das gp100-Antigen in einem HLA-A2-Kontext erkennt, verglichen mit 586EBV-B allein (5B). Zur weiteren Untersuchung, ob T-Zellklone sowohl mit dem ORF3P-Peptid beladene EBV-Zellen und Tumor-Zelllinien erkennen können, wurden T-Zellklone aus der TIL586-Zelllinie durch Endpunkt-Verdünnung (1 Zelle/Vertiefung in einer 96-Loch-Platte) erzeugt und weiter in Kultur expandiert. T-Zellklone wurden durch Endpunkt-Verdünnung (1 Zelle pro Vertiefung) aus der TIL586-Zelllinie erzeugt. T-Zellklone wurden weiter in AIM-V-Medium, das 6000 IU/ml IL-2 enthielt, expandiert. 586EBV-B-Zellen wurden mit dem ORF3P-Peptid oder einem irrelevanten Peptid für 90 min bei 37°C beladen. Nach dreimaligem Waschen wurden der T-Zellklon oder TIL586-Zellen hinzugegeben und für zusätzliche 18–24 Std. ko-inkubiert. Für 586mel, 397mel/A31+-Tumoren und NHEM680 Melanozyten-Zellen wurden 1 × 105 Zellen pro Vertiefung mit 1 × 105 Zellen von T-Zellklonen, TIL586-C (6A), TIL586-C4 (6B) und TIL586-C6 ( 6C) oder TIL586 (6D) für 18–24 Std. inkubiert. Der GM-CSF-Assay wurde wie in 1B beschrieben durchgeführt. Sechs T-Zellklone konnten 586mel-Tumorzellen, 586EBV-B-Zellen, beladen mit dem ORF3P-Peptid und HLA-A31 positive Melanozyten, aber nicht 397mel/A31 oder 586EBV-B-Zellen alleine erkennen. Repräsentative Ergebnisse werden in den 6A–6D gezeigt. Diese Ergebnisse legten nahe, dass T-Zellklone wahrscheinlich ein natürlich prozessiertes Peptid, das entweder ähnlich oder identisch zu dem ORF3-Peptid auf Tumorzellen und normalen Melanozyten ist, erkannten.
  • Da zwischen gp75 und Tyrosinase, gp100 und TRP-2 eine 40–45%-ige Aminosäuresequenz- Identität besteht, wurde die Möglichkeit getestet, ob das von T-Zellklonen erkannte Peptid nicht von gp75 abgeleitet ist, sondern von einem der anderen Proteine. COS-7-Zellen wurden mit HLA-A31 plus Tyrosinase, gp100 bzw. TRP-2 cDNAs transfiziert. Keine davon wurde von den sechs T-Zellklonen erkannt, während COS-7, transfiziert mit HLA-A31 und gp75 cDNA die Freisetzung von GM-CSF aus diesen Klonen (Ergebnisse nicht gezeigt) stimulierte. Eine Computer-Datenbankrecherche zeigte ebenfalls, dass keine bekannten Proteine einschließlich Tyrosinase, gp100 und TRP-2 in der Datenbank Aminosäuresequenzen mit dem Peptid-Bindemotiv von HLA-A31 und signifikanter Ähnlichkeit zu dem von TIL586 erkannten Peptid-Epitop enthielt.
  • Beispiel 5
  • In-vivo-Schutzassay
  • Für in-vivo-Schutz-Assays wurden MHL-A31+ transgene Mäuse mit 0,1 pg, 1,0 ng, 1,0 μg, 1 mg oder 100 mg des Krebspeptids (SEQ.-ID Nr. 9) intravenös am Tage 0 und am Tage 14 vor einer subkutanen „Challenge" mit 104 Trp-1+ B16-Maus-Melanomzellen oder einer intravenösen „Challenge" mit 5 × 105 Trp-2+ B16-Maus-Melanomzellen immunisiert. Mäuse, die Tumorzellen subkutan erhalten, werden zweimal die Woche hinsichtlich Tumorentwicklung untersucht und die Größe wird bestimmt. Mäuse, die Tumorzellen intravenös erhalten, werden am Tag 12 getötet und die Anzahl von Lumenmetastasen wird wie durch Houghton, A. N. 1994 J. Exp. Med. 180: 1–40, beschrieben, bestimmt.
  • Beispiel 6
  • In-vivo-Behandlungsassay
  • Für die In-vivo-Behandlung wurden MHL-A31+-transgene Mäuse entweder mit 1 × 105 oder 5 × 105 Trp-1+ B16-Maus-Melanom-Zellen intravenös infiziert, um Lungenmetastasen zu etablieren. Die Mäuse werden nachfolgend mit einem rekombinanten Virus, der das Krebspeptid (SEQ. ID Nr. 9) exprimiert, mit 105 PFU/mg Körpergewicht geimpft. Die Mäuse werden am Tag 12 getötet und die Anzahl der Lungenmetastasen in geimpften gegenüber ungeimpften Mäusen wird bestimmt.
  • Beispiel 7
  • Immuntherapie mit Krebsartigen-spezifischen T-Lymphozyten
  • Für ein Melanom-Antigen prä-sensibilisierte T-Lymphozyten können bei der therapeutischen Behandlung von Säugern wirksam sein, die an einem Melanom leiden. Die T-Lymphozyten werden aus peripherem Blut oder Melanom-Tumorsuspensionen isoliert und in vitro kultiviert (Kawakami, Y. et al., 1988, J. Exp. Med. 168: 2183–2191).
  • Die T-Lymphozyten werden dem Krebspeptid (SEQ. ID Nr. 6) in einer Konzentration von 1 μg/ml alleine oder in der Gegenwart von IL-2 ausgesetzt, resensibilisiert und in Kultur expandiert. T-Lymphozyten, die mit dem Krebspeptid behandelt wurden, werden an einen Säuger in einer Konzentration von etwa 109 bis 1012 Lymphozyten pro Säuger verabreicht. Die Lymphozyten werden entweder intravenös, intraperitoneal oder intraläsional verabreicht. Die Behandlung kann gleichzeitig mit anderen therapeutischen Behandlungen, wie Zytokinen, chirurgischer Behandlung von Melanom-Läsionen und chemotherapeutischen Arzneistoffen verabreicht werden.
  • Beispiel 8
  • Behandlung von Patienten mit metastasierendem Melanom
  • In diesem Protokoll werden Patienten mit fortgeschrittenem Melanom mit einem Antigen-Krebsepitop immunisiert.
  • Für diesen Versuch auszuwählende Patienten müssen ein messbares, metastasierendes Melanom aufweisen, das einer standardmäßigen wirksamen Therapie nicht zugänglich ist. Patienten müssen Tumoren aufweisen, die das TPR-1-Antigen exprimieren, wie durch PCR- oder Northern-Blot-Analyse von Tumorzell-RNA nachgewiesen wurde.
  • Die Patienten erhalten entweder 1 ng, 1 μg, 1 mg oder 500 mg/kg Körpergewicht eines Krebspeptids (SEQ.-ID Nr. 6) intravenös am Tage 0, am Tag 7 oder am Tag 14 alleine oder in Kombination mit IL-2 und/oder einem immunstimulatorischen Molekül. Die Patienten werden hinsichtlich der Toxizität der immunologischen Effekte und der therapeutischen Wirksamkeit untersucht.
  • Lymphozyten werden aus den behandelten Patienten entnommen und hinsichtlich der spezifischen Antwort gegen das Krebsantigen untersucht, das die Aminosäuresequenz MSLQRQFLR (SEQ.-ID Nr. 6) umfasst.
  • Eine vollständige Reaktion wird definiert als das Verschwinden jeglicher klinischer Anzeichen der Krankheit, das wenigstens vier Wochen anhält. Eine partielle Reaktion bezeichnet einen 50%-igen oder einen stärkeren Rückgang der Summe der Produkte des lotrechten Durchmessers aller messbarer Läsionen für wenigstens vier Wochen ohne das Auftreten neuer Läsionen oder der Vergrößerung irgendeiner Läsion. Geringfügige Reaktionen werden definiert als eine Abnahme von 25–49% der Summe der Produkte der lotrechten Durchmesser der messbaren Läsionen ohne das Auftreten neuer Läsionen und ohne Zunahme irgendeiner Läsion. Ein Patient mit weniger als einer teilweisen Reaktion wird als Non-Responder betrachtet. Das Auftreten neuer Läsionen oder eines Anstiegs des Produktes des lotrechten Durchmessers der früheren Läsionen um mehr als 25% nach einer partiellen oder vollständigen Reaktion wird als Rückfall bezeichnet.
  • Beispiel 9
  • Materialien und Methoden für TRP-2
  • Chemikalien und Reagenzien
  • Die folgenden Chemikalien und Reagenzien wurden von den genannten Herstellern bezogen: RPMI 1640, AIM-V-Medium, Lipofectamin, G418 (GIBCO BRL, Gaithersberg, MD); der eukaryotische Expressionsvektor pCR3 (Invitrogen, San Diego, CA); anti-HLA-A31 monoklonale Antikörper (One lambda, Canoga Park, CA); Antümmunglobulin-M-Antikörper, konjugiert an Fluoresceinisothiocyanat (Vector Laboratories, Inc. Burlingame, CA).
  • T-Zellklone und -linien
  • Die T-Zellklone wurden durch beschränkende Verdünnung (1 Zelle/Vertiefung) aus der TIL586-Zelllinie generiert. Allogene PBL (1 × 103 Zellen/Vertiefung) wurden in RPMI1640, das 10% humanes AB-Serum und 50 IU IL-2 enthielt, als Feeder-Zellen verwendet. Nach 12 Tagen wurden T-Zellklone dann in AIM-V-Medium, das 6000 IU/ml IL-2 enthielt, expandiert. Um eine optimale Expansion zu erhalten, verwendeten wir das OKT3-Expansionsverfahren, das von S. Riddell beschrieben wurde (Walter et al. 1995, N. Engl. J. Med. 333: 1038–1044). Am Tage 0 wurden 5 × 104 T-Zellen mit HLA-A31-PBL (500 : 1, Verhältnis von PBL zu T-Zellen) und 586EBV-B-Zellen (10 : 1, Verhältnis von EBV zu T-Zellen) in 25 ml RPMI 1640, das 11% humanes Serum, 30 ng/ml OKT3-Antikörper und Antibiotika enthielt, ko-kultiviert. Am Tage 1 wurde IL-2 in einer Endkonzentration von 180 IU/ml zugegeben. Die Medien wurden am Tag 5 gegen frische Medien ausgetauscht, die 11% humanes Serum, 180 IU/ml IL-2 enthielten. Medium wurde dann alle drei Tage ausgetauscht. An den Tagen 12–14 wurden die T-Zellen geerntet, gezählt und cryo-konserviert. Aus der Tumorprobe eines Patienten mit metastasierendem Melanom wurden TIL586 isoliert und in Medium, das IL-2 (600 IU/ml) (Chiron) enthielt, für 32–60 Tage wie vorstehend beschrieben kultiviert (Topalian et al. 1988, J. Clin. Oncol. 6: 839–853). TIL586 waren vorwiegend CD8+-T-Zellen.
  • Melanoma-Zellinien 397mel, 397mel/A31, 586mel, 624mel, 624mel/A31 und EBV-transformierte B-Zelllinien 586EBV und 1510EBV wurden in unserem Labor etabliert und in RPMI 1640 Medium kultiviert, das 10% fötales Kälberserum enthielt (FCS). Normale kultivierte Melanozyten aus Säuglingsvorhaut wurden in Melanozyten-Wachstumsmedium (MOM; Clonetics, CA) kultiviert. Die COS-7-Zelllinie wurde von Dr. W. Leonard (NIH) zur Verfügung gestellt.
  • GM-CSF-Sekretions-Assay
  • Die DNA-Transfektion und die GM-CSF-Assays wurden wie vorhergehend beschrieben durchgeführt (Wang et al. 1995, J. Exp. Med. 181: 799–804). 200 ng DNA, die für Antigene kodiert, und 50 ng der HLA-A31-DNA wurden mit 2 μl Lipofectamin in 100 ml DMEM für 15–45 min vermischt. Das DNA-/Lipofectamingemisch wurde dann zu den COS-7-Zellen (5 × 104) hinzugegeben und über Nacht inkubiert. Am folgenden Tag wurden die Zellen zweimal mit DMEM-Medium gewaschen. TIL586 wurde in einer Konzentration von 1 × 105 Zellen/Vertiefung in AIM-V-Medium, das 120 IU/ml IL-2 enthielt, zugegeben. Für die T-Zellklone wurden nur 1 × 104 Zellen/Vertiefung zugegeben. Nach 18–24 Std. Inkubation wurden 100 μl Überstand abgenommen und GM-CSF wurde in einem Standard-ELISA-Assay gemessen (R + D Systems, Minneapolis, MN). Um die Erkennung der Peptide zu testen, wurden 586EBV- oder T2-Zellen mit Peptiden bei 37°C für 90 min inkubiert und dann dreimal mit AIM-V-Medium, das 120 IU/ml IL-2 enthielt, gewaschen. T-Zellen wurden zugegeben und für weitere 18–24 Std. inkubiert, 100 μl des Überstandes wurde für den GM-CSF-Assay abgenommen.
  • Exo-III/SI-Deletionskonstrukte und Subklonierung
  • TRP-2 cDNA war ein Geschenk von Dr. Shibahara (Yokoyama et al. 1994, Biochim. Biophys. Acta 1217: 317–321). Die cDNA wurde in den PCR-Vektor mit einem CMV-Promotor für die Expression subkloniert. Um eine Reihe von Deletionen herzustellen, wurde das Plasmid PCR3, das die TRP-2 cDNA enthielt, mit Xba-I verdaut und mit alpha-Phosphorothioat-Desoxyribonukleotid-Triphosphaten aufgefüllt, um den Verdau durch Exo III zu blockieren. Die linearisierte DNA wurde einem zweiten Restriktionsenzym-Verdau unterzogen, um ein Ende zu generieren, das gegenüber Exo III-Nuklease/Mungobohnennuklease-Deletion sensitiv ist. Dies wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers (Stratagene, CA) durchgeführt. Alle Deletionskonstrukte wurden sequenziert, um die Lokalisation der deletierten DNA-Sequenz zu bestimmen. Das pTA-Plasmid war ein Derivat von pCR3-TRP2, in dem ein Apa I DNA-Fragment von dem 3'-Ende des TRP-2-Gens deletiert war. pTK wurde nach Entfernung eines KpnI-DNA-Fragments vom 3'-Ende des TRP-2-Gens erzeugt. pTP wurde durch Deletion eines internen Pst-I-Fragments durch Religation erzeugt.
  • Northern-Blot-Analyse
  • Gesamt-RNA wurde durch die Guanidinium-Isothiocyanat-/Cäsiumchlorid-Zentrifugationsmethode isoliert. Gesamt-RNA aus normalem menschlichen Gewebe wurde von Clontech, CA, käuflich erworben. 20 μg Gesamt-RNA wurden der Elektrophorese in einem 1,2%-igem Agarose-Formaldehydgel unterzogen und auf eine Nylonmembran überführt. Ein 2,0 kb DNA-Fragment des TRP2-Gens wurde mit 32P-α-CTP durch das „Random-Priming"-Verfahren markiert. Die Prä-Hybridisierung und die Hybridisierung wurden gemäß dem QuickHyb-Protokoll (Stratagene) durchgeführt. Die Membranen wurden zweimal mit 2 × SSC/0,1% SDS bei Raumtemperatur für 15 min und zweimal mit 0,1 × SSC/0,1% SDS bei 60°C für 30 min gewaschen. Die Autoradiographie wurde bei –70°C durchgeführt.
  • Cytotoxizitäts-Assay
  • Die Zytolyse wurde unter Verwendung von Calcein AM (Molecular Probes, Eugene, OR) durchgeführt. T2- oder 586EBV-B-Zellen wurden mit den Peptiden in RPMI 1640/5%FCS für 90 min beladen. Tumorzellen und die mit Peptid beladenen EBV-B-Zellen wurden mit Calcein AM (15 μl von 1 mg/ml Calcein AM für jeweils 1 × 106 Zellen) für 30 min bei 37°C markiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen dreimal mit AIM-V/120 IU IL-2 gewaschen. 1 × 103 Zielzellen wurden mit T-Zellen in verschiedenen E : T-Verhältnissen vermischt. Nach einer 4-stündigen Inkubation bei 37°C wurden 5 μl einer bovinen Hämoglobin-Quencherlösung, die Ethidiumbromnid enthielt, zugegeben. Die Platte wurde durch einen Lambda-Scan abgelesen. Der Prozentsatz der Lyse wurde anhand der folgenden Gleichung berechnet: [1 – (A – B)/(C – B)] × 100, wobei A der abgelesene Wert der nicht-lysierten Zellen in Anwesenheit von T-Zellen ist, B ist der Wert des Hintergrundsignals und C ist der maximale Signalwert von Zielzellen.
  • Die Peptide wurden unter Verwendung eines Peptid-Synthesegeräts (Modell AMS 422, Gilson Co., Inc., Worthington, OH) synthetisiert. Einige Peptide wurden durch HPLC aufgereinigt und waren zu mehr als 98% rein. Die Peptidmasse einiger Peptide wurde durch massenspektrometrische Analyse bestätigt.
  • Beispiel 10
  • Erkennung neuer Antigene auf Tumorzellen durch CTL-Klone
  • In früheren Studien haben wir eine Anzahl von T-Zellklonen aus der TIL586-Zelllinie durch beschränkende Verdünnung isoliert (Wang et al., 1996b, J. Exp. Med. 183: 1131–1140). Sechs dieser Klone erkannten 586EBV-Zellen, die mit dem ORF3-Peptid beladen waren, das von einem Genprodukt abgeleitet ist, das von einem alternativen offenen Leserahmen des TRP-1-gp75-Gens translatiert wird, und die autologen 586mel-Tumorzellen, erkannten aber nicht 586EBV-B-Zellen, die mit einem irrelevanten Peptid beladen waren. TIL586-C1 wurde als ein Vertreter dieser Zellklone ausgewählt, wie in 7b gezeigt. Einige T-Zellklone, die von der gleichen TIL586-Zelllinie isoliert wurden, erkannten jedoch weder 586EBV-Zellen, die mit dem TRP-1-Peptid ORF3P beladen waren, noch COS-Zellen, die mit TRP-1 und HLA-A31 cDNAs transfiziert waren, konnten aber 586mel als auch HLA-A31+-Melanozyten ( 7) erkennen. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die T-Zellklone zusätzliche Tumorantigene auf den 586mel-Tumorzellen erkennen. Diese T-Zellklone wurden dann expandiert, um ausreichend Zellen zum Screening von cDNA-Bibliotheken zu erhalten oder um andere cDNAs hinsichtlich der Erkennung anhand von Verfahren zu testen, die in dem Material- und Methodenabschnitt (Beispiel 9) beschrieben sind. Einer der Klone, der CTL-Klon 4, wurde erfolgreich expandiert und für die nachstehend beschriebenen weiteren Untersuchungen verwendet.
  • BEISPIEL 11
  • Identifizierung einer cDNA, die für ein von T-Zellklonen erkanntes Tumorantigen kodiert
  • Um das HLA-Molekül zu bestimmen, das für die Präsentation von Antigen an den CTL-Klon 4 verantwortlich ist, transfizierten wir HLA-A31-cDNA in A31-negative Tumorlinien, wie 397mel und 624mel und untersuchten auch die Erkennung durch den CTL-Klon. Transfektanten von 397mel und 624mel, die HLA-A31 exprimieren, wurden in signifikanter Weise durch den CTL-Klon 4 erkannt (Tabelle 3). Weiterhin konnten diese T-Zellen ebenfalls die HLA-A31-positive allogene Tumorlinie 1353mel erkennen, was anzeigt, dass die Erkennung des Tumorantigens durch den CTL-Klon 4 HLA-A31 restringiert ist.
  • Tabelle 3: Spezifische Sekretion von GM-CSF durch CTL-Klon 4 ist HLA-A31-restringiert
    Figure 00500001
  • GM-CSF im Überstand wurde nach 24 h Inkubation von 2 × 104 Zellen des CTL-Klon 4 entweder mit Melanom-Zelllinien oder mit COS-7-Zellen, die mit der HLA-A31 cDNA transfiziert waren, gemessen.
  • Da nur eine begrenzte Anzahl von T-Zellen erhältlich war, untersuchten wir zunächst, ob diese T-Zellen früher identifizierte Tumorantigene oder Melanozyten-Linien-Differenzierungungsproteine erkannten oder nicht. Die Erkennung von COS-7-Zellen, die mit HlA-A31 cDNA transfiziert waren, und Genen, die für bekannte Tumorantigene oder mutmaßliche Antigene kodieren, einschließlich MART-1 (Kawakami et al. 1994a Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 3515–3519), gp75 (Wang et al. 1995, J. Exp. Med. 181: 799.804), gp100 (Kawakami et al. 1994b, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 6458–6462), Tyrosinase (Brichard et al. 1993, J. Exp. Med. 178: 489–495, plS (Robbins et al. 1995, J. Immunol. 154: 5944–5950) und TRP-2 (Yokoyama et al. 1994, Biochim. Biophys. Acta 1217: 317–321; Bouchard et al. 1994, Eur. J. Biochem. 219: 127–134) durch den CTL-Klon 4 wurde untersucht. COS-Zellen, die mit HLA-A31 alleine oder TRP-2 alleine transfiziert wurden, verliehen keine Erkennung durch die T-Zellklone. COS-Zellen, die mit HLA-A31 und TRP-2-DNA transfiziert wurden, stimulierten jedoch die Freisetzung von GM-CSF aus T-Zellen, wobei COS-Zellen, die mit HLA-A31 und anderen Genen transfiziert waren, dies nicht taten. Dies zeigt, dass der T-Zellklon 4 TRP-2 als Tumorantigen in einer HLA-A31-restringierten Weise erkannte.
  • Die Analyse der strukturellen Ähnlichkeiten bei HLA-A3, A11, A31, A33 und A68 und deren Peptid-Bindemotiv legte die Anwesenheit eines A3-artigen Supermotivs nahe (Sidney et al. 1996, Human Immunol. 45: 79–93). Ein einzelnes Epitop-Peptid könnte mit HLA-A3, A11, A31, A33 und A68-Molekülen kreuzreagieren, die in etwa 40–50% der allgemeinen Population kumulativ exprimiert werden. Es wurde berichtet, dass das gleiche Peptid-Epitop, das vom Hepatitis-B-Virus-Nukleokapsidprotein abgeleitet ist, durch HLA-A31 – und -A68-Moleküle präsentiert und durch die entsprechenden HLA-A31- oder -A68-restringierten CTL erkannt werden konnte (Missale et al. 1993, J. Exp. Med. 177: 751–762). Wir untersuchten, ob HLA-A31-restringierte T-Zellen TRP-1 und TRP-2-Epitope erkannten, wenn sie auf HLA-A3-positive EBV-B-Zellen geladen wurden. Interessanterweise wurde eine schwache Erkennung nachgewiesen, basierend auf der GM-CSF-Freisetzung aus T-Zellen. Es wurde jedoch keine Erkennung der HLA-A3-positiven Tumorzellen nachgewiesen.
  • BEISPIEL 12
  • Expression des TRP-2-Gens
  • Northern-Blot-Analysen wurden durchgeführt mit der TRP-2-cDNA als Sonde, um das Expressionsmuster von TRP-2 in unterschiedlichen Geweben nachzuweisen. Es konnte gezeigt werden, dass normales Retina-Gewebe unter den normalen untersuchten menschlichen Geweben das einzige Gewebe war, das positiv für die Expression von TRP-2 war. Das Expressionsmuster von TRP-2 in Melanom-Zelllinien und anderen Zelllinien ist in der nachstehenden Tabelle 4 aufgelistet. Fünfundzwanzig von dreißig Melanom-Zelllinien exprimieren TRP-2. Die Burkitt's-8-Zellinie Daudi und die Brustkrebs-Zellinie MDA231 waren negativ, in Übereinstimmung mit früheren Ergebnissen (Bouchard et al., 1994, Eur. J. Biochem. 219: 127–134). Somit schien wie bei Tyrosinase, TRP-1, gp100 und MART-1 das Expressionsmuster dieses Gens auf Melanome, normale Melanozyten-Zelllinien und die Retina beschränkt zu sein.
  • Tabelle 4: Expression von TRP-2 in verschiedenen untersuchten Zelllinien und menschlichen Geweben
    Figure 00520001
  • Expression von TRP-2 wurde durch Northern-Blot Analyse mit ~ 10–20 g Gesamt-RNA untersucht und mit dem TRP-2 cDNA-Fragment hybridisiert. Daudi ist eine Burkitt-B-Zelllinie und MDA231 ist eine Brustkrebs-Zelllinie.
  • BEISPIEL 13
  • Von T-Zellen erkannte Peptidepitope
  • Zur Bestimmung der antigenen Epitope von TRP-2 wurde eine Serie von „nested"-Deletionen des TRP-2-Gens vom 3'-Ende unter Verwendung von Exo III/SI-Nuklease als auch DNA-Fragmenten, die für die verkürzte Form von TRP-2 kodieren, generiert. Diese Deletionen und subklonierten Konstrukte wurden zusammen mit dem pBK-CMV-Plasmid, das die HLA-A31-cDNA enthält, in COS-7-Zellen transfiziert. Die Erkennung der transfizierten COS-Zellen wurde mit CTL-Klonen allein durch Messung der Freisetzung von GM-CSF-Cytokin aus dem CTL-Klon gemessen. 9 zeigt, dass die pTD1-, 2- und 3-Konstrukte die Fähigkeit beibehielten, die Cytokin-Freisetzung aus dem CTL-4-Klon zu stimulieren, aber pTD4- und pTDS verloren die stimulierende Aktivität gegenüber dem CTL-Klon 4, was anzeigt; dass das/die vom CTL-4-Klon erkannte(n) Epitope) in der Region der Nukleotide 836–1045 lokalisiert war(en). Dies stimmte mit den Ergebnissen aus den Subklonierungsexperimenten überein. Obwohl pTA und pTB die Fähigkeit verloren, die Cytokin-Freisetzung aus dem CTL-Klon 4 zu stimulieren, so bleibt pTK im Cytokin-Freisetzungs-Assay immer noch positiv. Deshalb befinden sich die Epitope in einem DNA-Fragment, das von den ersten PstI- und KpnI-Schnittstellen flankiert ist, wie in 10 gezeigt.
  • Um die Epitope der kodierenden Region dieses kleinen DNA-Fragments zu identifizieren, wurden fünf synthetische Peptide, basierend auf dem synthetischen Peptid-Bindemotiv für HLA-A31 (hydrophobe Reste an Position 2 und positiv geladene Reste an Position 9) (Rammensee et al. 1995, Immunogenetics 41: 178–228) synthetisiert. Diese Peptide wurden auf 586EBV-B-Zellen geladen und hinsichtlich ihrer Fähigkeit untersucht, die Cytokin-Freisetzung durch den CTL-Klon 4 zu stimulieren. Wie in Tabelle 5 gezeigt, wurde das Peptid TRP197–205 durch den CTL-Klon 4 deutlich erkannt, wenn es auf 586EBV-B-Zellen geladen war. Die Erkennung dieses Peptids durch den CTL-Klon 4 wurde nur dann beobachtet, wenn das Peptid auf HLA-A31+-EBV-B-Zellen, wie 586EBV und 1510EBV, geladen war, aber nicht bei HLA-A31-negativen T2-Zellen. Der CTL-Klon 4 erkannte das vom alternativen offenen Leserahmen des TRP-1-Gens abgeleitete ORF3P-Peptid nicht. Diese Ergebnisse zeigten, dass TIL586-C1 spezifisch das ORF3P-Peptid von TRP-1 und der CTL-Klon 4 spezifisch das von TRP-2 abgeleitete Peptid erkannten. Es wurde keine Kreuzreaktivität beobachtet, während ORF3P- und TRP-2-p197 durch HLA-A31-Moleküle den T-Zellen präsentiert wurden.
  • Tabelle 5. Identifizierung von synthetischen Peptiden mit Reaktivität für T-Zellklone
    Figure 00540001
  • 586EBV-Zellen wurden mit einzelnen Peptidett in einer Konzentration von ~ 1 g/ml für 90 min inkubiert. Freisetzung von GM-CSF wurde nach Ko-Inkubation von Peptid-beladenen 586EBV-Zellen mit T-Zellklonen gemessen, die entweder TRP-1 oder TRP-2 erkennen. Sekretion von GM-CSF durch T-Zellen alleine ohne Stimulation wurde abgezogen. 586EBV und 1510EBV sind mit EBV transformierte B-Zelllinien, die HLA-A31 exprimieren.
  • BEISPIEL 14
  • Charakterisierung des TRP197–205-Peptids
  • Durch Titrationsexperimente wurde gezeigt, dass 1 nM des Peptids ausreichten, um die Freisetzung von GM-CSF aus dem T-Zellklon 4 zu stimulieren. Die Stimulierung erreichte bei 500 nM ein Plateau (10A). Die Lyse von 586EBV-B-Zellen, die mit TRP197–205 beladen waren, durch den CTL-Klon 4, wurde ebenfalls bei verschiedenen Peptid-Konzentrationen bestimmt (10B) und ähnlich wie in Cytokin-Freisetzungs-Assays wurde die Lyse von Zielzellen durch den CTL-Klon 4 bei 1 nM Peptid-Konzentration nachgewiesen. Die maximale Lyse wurde bei 100 nM Peptid-Konzentration nachgewiesen. Der CTL-Klon 4 konnte 586EBV-Zellen, die mit TRP-2-p197 beladen waren und 586mel-Tumorzellen sogar bei einem geringen E : T-Verhältnis lysieren, konnte jedoch 586EBV-B-Zellen alleine oder 586EBV-B-Zellen, die mit dem Kontroll-Peptid ORF3P beladen waren oder die HLA-A31 negative 397mel-Linie (10) nicht lysieren.
  • Die Mehrheit der bis heute identifizierten menschlichen Melanomantigene sind nicht-mutierte Selbst-Antigene und die T-Zell-Erkennung und die Bindeaffinität dieser Selbst-Peptide für die entsprechenden MHC-Moleküle hat in manchen Fällen durch die Substitution von Aminosäuren an Ankerresten Verbesserung erfahren. Eine Anzahl synthetischer Peptide einschließlich von 8-meren oder 10-meren und modifizierter Peptide, wie in Tabelle 6 gezeigt, wurden hergestellt und hinsichtlich der Erkennung durch den CTL-Klon 4 bei Beladung auf 586EBV-B-Zellen untersucht. Das 10mer-TLLGPGRPYR, in dem eine Aminosäure am N-Terminus von TRP197–205 verlängert war, wurde durch den CTL-Klon 4 immer noch erkannt, wenn es auf 586EBV-B-Zellen geladen wurde, aber die Reaktivität betrug nur 60% gegenüber dem überlappenden 9mer LLGPGRPYR. Basierend auf dem Bindemotiv von HLA-A31 wurden einige modifizierte Peptide durch Substitution von Aminosäuren an Ankerrestpositionen 2 und 9 als auch an anderen Positionen erzeugt. Der Rest Arg an der Position 9 im C-Terminus konnte gegen den Lys-Rest ausgetauscht werden und das modifizierte Peptid behielt 60% der Aktivität des parentalen Peptids bei. Austausch eines Leu-Restes an Position 2 gegen entweder Ser-, Ile- oder Val-Reste behielt die gleiche Aktivität bei oder reduzierte die Aktivität auf 60% des parentalen Peptids, während die Substitution mit Ala oder Phe an dieser Position die Fähigkeit, Cytokin-Freisetzung aus T-Zellen (Tabelle 6) zu stimulieren, verringerte. Andere Modifikationen führten zu unterschiedlicher Krebspeptid-Aktivität bei der T-Zellerkennung.
  • Tabelle 6. Vergleich der T-Zell-Reaktivität modifizierter Peptide
    Figure 00560001
  • 586EBV-Zellen wurden mit einzelnen Peptiden in einer Konzentration von ~ 0,5 g/ml für 90 min inkubiert. Freisetzung von GM-CSF wurde nach Koinkubation von Peptid-beladenen 586EBV-Zellen mit den Zellen des CTL-Klon 4 gemessen. Sekretion von GM-CSF durch T-Zellen alleine ohne Stimulatoren wurde abgezogen. 586EBV ist eine mit EBV transformierte B-Zelllinie, die HLA-A31 exprimiert.
  • Das TRP-2-Protein enthält zwei mutmaßliche Kupfer-Bindestellen, Cystein-reiche Bereiche und eine Transmembran-Domäne. Menschliches TRP-2 wurde auf das Chromosom 13 kartiert, während das Gegenstück der Maus auf den Chromosom 14 im Bereich der Fellfarben-Mutation Slaty kartiert wurde. Zwischen TRP-2 und Tyrosinase oder TRP-1/gp75 besteht eine 40%-ige Aminosäure-Sequenzidentität, aber bisher konnte keine CTL-Linie oder ein Klon gefunden werden, die/der ein gemeinsames Peptid-Epitop innerhalb der Tyrosinase-Proteinfamilie erkennt.
  • Das 9mer-TRP197–205-Peptid, das durch den CTL-Klon 4 erkannt wird, ist an einer der Kupfer-Bindestellen in der kodierenden Region von TRP-2 lokalisiert. Dieses Peptid stimulierte die Freisetzung von Zytokinen aus T-Zellen am effizientesten, verglichen mit anderen Peptiden, einschließlich modifizierten Peptiden, die in dieser Untersuchung getestet wurden. Dies stimmte mit dem vorhergesagten HLA-A31-Bindemotiv überein, das zeigt, dass Leu an Position 2 und Arg an Position 9 die begünstigten Reste sind. Obwohl Leu an Position 2 und Arg an Position 9 durch Ile und Ser an Position 2 bzw. Lys an Position 9 ersetzt werden konnten, ohne zu einem größeren Verlust der Reaktivität gegenüber der T-Zell-Erkennung zu führen, führten Substitutionen der Aminosäuren an den Positionen 1, 3 oder 6 zu einem gewissen Reaktivitätsverlust.
  • BEISPIEL 15
  • In-vivo-Behandlungs-Assay
  • Für die In-vivo-Behandlung werden MHL-A31+-transgene Mäuse mit entweder 1 × 105 oder 5 × 105 TRP-1+ B16 Maus-Melanomzellen intravenös infiziert, um Lungenmetastasen zu etablieren. Die Mäuse werden nachfolgend mit einem rekombinanten Virus, das ein Krebspeptid, LLGPGRPYR bei 105 PFU/mg Körpergewicht exprimiert, geimpft. Die Mäuse werden am Tag 12 getötet und die Anzahl der Lungenmetastasen in geimpften Mäusen gegenüber ungeimpften Mäusen werden bestimmt.
  • BEISPIEL 16
  • Immuntherapie mit Krebsantigen-spezifischen T-Lymphozyten
  • Für ein Melanom-Antigen prä-sensibilisierte T-Lymphozyten können bei der therapeutischen Behandlung von Melanom-Patienten wirksam sein. Die T-Lymphozyten werden aus peripherem Blut oder Melanom-Tumorsuspensionen isoliert und in vitro kultiviert (Kawakami, Y. et al., 1988, J. Exp. Med. 168: 2183–2191).
  • Die T-Lymphozyten werden dem Krebspeptid LLGPGRPYR in einer Konzentration von 1 μg/ml alleine oder in der Gegenwart von IL-2 ausgesetzt, resensibilisiert und in Kultur expandiert. T-Lymphozyten, die mit dem Krebspeptid behandelt wurden, werden an einen Säuger in einer Konzentration von etwa 109 bis 1012 Lymphozyten pro Säuger verabreicht.
  • Die Lymphozyten werden entweder intravenös, intraperitoneal oder intraläsional verabreicht. Die Behandlung kann gleichzeitig mit anderen therapeutischen Behandlungen, wie Zytokinen, chirurgischer Behandlung von Melanom-Läsionen und chemotherapeutischen Arzneistoffen verabreicht werden.
  • BEISPIEL 17
  • Behandlung von Patienten mit metastasierendem Melanom
  • In diesem Protokoll werden Patienten mit fortgeschrittenem Melanom mit einem Antigen-Krebsepitop immunisiert.
  • Für diesen Versuch auszuwählende Patienten müssen ein messbares, metastasierendes Melanom aufweisen, das einer standardmäßigen wirksamen Therapie nicht zugänglich ist. Patienten müssen Tumoren aufweisen, die das TPI-2-Antigen exprimieren, wie durch PCR- oder Northern-Blot-Analyse von Tumorzell-RNA nachgewiesen wurde.
  • Die Patienten erhalten entweder 1 ng, 1 μg, 1 mg oder 500 mg/kg Körpergewicht eines Krebspeptids LLGPGRPYR intravenös am Tage 0, am Tag 7 oder am Tag 14 alleine oder in Kombination mit IL-2 und/oder einem ko-immunstimulatorischen Molekül. Die Patienten werden hinsichtlich der Toxizität der immunologischen Effekte und der therapeutischen Wirksamkeit untersucht.
  • Lymphozyten werden aus den behandelten Patienten entnommen und hinsichtlich der spezifischen Antwort gegen das Krebsantigen, das die Aminosäuresequenz LLGPGRPYR enthält, untersucht.
  • Eine vollständige Reaktion wird definiert als das Verschwinden jeglicher klinischer Anzeichen der Krankheit, das wenigstens vier Wochen anhält. Eine partielle Reaktion bezeichnet einen 50%-igen oder einen größeren Rückgang der Summe der Produkte des lotrechten Durchmessers aller messbarer Läsionen für wenigstens vier Wochen ohne das Auftreten neuer Läsionen oder Vergrößerung irgendeiner Läsion. Geringfügige Reaktionen werden definiert als eine Abnahme von 25–49% der Summe der Produkte der lotrechten Durchmesser der messbaren Läsionen ohne das Auftreten neuer Läsionen und ohne Zunahme irgendeiner Läsion. Ein Patient mit weniger als einer teilweisen Reaktion wird als Non- Responder betrachtet. Das Auftreten neuer Läsionen oder eines Anstiegs des Produktes des lotrechten Durchmessers der früheren Läsionen um mehr als 25% nach einer partiellen oder vollständigen Reaktion wird als Rückfall bezeichnet.
  • Diskussion
  • Es wurden einige antigene T-Zell-Epitope, die von dem normalen offenen Leserahmen des entsprechenden nicht-mutierten, gemeinsamen Melanom-Antigen, wie Tyrosinase, MART-1/Melan-A und gp100 abgeleitet sind, identifiziert. In dieser Untersuchung wurde gezeigt, dass das von TIL586 erkannte antigene Peptid von einem zweiten Genprodukt des gp75-Gens abgeleitet ist. Unserem Wissensstand nach ist dies das erste Beispiel dafür, dass T-Zellen ein antigenes Peptid erkennen, das aus der Translation eines überlappenden offenen Leserahmens des gleichen Gens resultiert, und es ist weiterhin das einzige Beispiel in eukaryotischen Zellen, das zwei vollständig unterschiedliche Proteine und/oder Peptide von überlappenden offenen Leserahmen eines einzelnen zellulären Gens translatiert werden können. ORF3 von gp75 kodiert für ein kurzes Protein von 24 Aminosäuren. Das von TIL586 erkannte antigene Peptid wird durch die Sequenz kodiert, die unmittelbar hinter dem ATG (294–296) Start-Codon des alternativen offenen Leserahmens liegt.
  • Obwohl gp75 40–45% Sequenzhomologie zu Tyrosinase, gp100 und TRP-2 aufweist, konnte eine Ko-Transfektion von HLA-A31 und Tyrosinase, gp100 bzw. TRP-2-DNAs in COS-7-Zellen keine Freisetzung von GM-CSF aus T-Zellklonen, die von TIL586 abgeleitet waren, auslösen. Eine Datenbanksuche ergab keine Proteine, die das HLA-A31-Peptid-Bindemotiv aufweisen und auch keine signifikante Sequenzhomologie zu den Peptid-Epitopen, die von TIL586 und davon abgeleiteten T-Zellklonen erkannt werden. Zusätzlich zeigten frühere Studien, dass Melanom-Transfektanten (gp75+/A31+ die Fähigkeit verliehen, die Freisetzung von GM-CSF aus TIL586 zu stimulieren, aber gp75–-Melanom-Transfektanten (gp75–/A31+ taten dies nicht (Wang, R. F. et al. 1995 J. Exp. Med. 181: 799–804). Ähnliche Ergebnisse wurden mit zusätzlichen Melanom-Zelllinien erhalten (gp75–/A31+). Da das oRF3P-Peptid das einzige durch das gp75-Gen identifizierte Epitop war und von sechs T-Zellklonen erkannt wurde, die von TIL586 abgeleitet waren, kann dieses Peptid zu dem natürlich prozessierten Peptid auf Tumorzellen und Melanozyten ähnlich oder identisch sein. Dies wurde weiter unterstützt durch unmarkierte Zielhemmungsexperimente, da dieses Peptid mit einem natürlichen Peptid auf Tumorzellen um die T-Zell-Erkennung konkurrieren konnte.
  • Es wurde berichtet, dass T-Zell-Epitop-Peptide, die von der Leserasterverschiebung des mutierten adenomatösen Polyposis-coli-(APC)-Gens bei Colon-Krebs abgeleitet waren, durch CTLs erkannt wurden, die von geimpften BALB/c-Mäusen erzeugt wurden (Townsend, A. et al. 1994 Nature 371: 662). Die Ergebnisse in 3 zeigten, dass das ATG an den Nukleotiden 294–296 für die Translation des 24-Aminosäure-Produkts nötig war, das wiederum zu dem von TIL586 erkannten antigenen Peptid prozessiert wurde. TIL586 erkannte immer noch das mutierte synthetische Peptid, wenn es auf 586EBV-B-Zellen geladen war, aber nicht das mutierte Gen, wenn es in COS-7-Zellen mit HLA-A31 cDNA ko-transfiziert wurde, was darauf hinweist, dass der Verlust der Erkennung des mutierten (ATG zu ATC)-Gens durch TIL586 aus der Eliminierung der Translation des ORF3-Produktes resultierte. Diese Ergebnisse plus die DNA-Sequenzanalyse schlossen die Möglichkeit aus, dass das von TIL586 erkannte antigene Peptid von einem Leseraster-Verschiebungsprodukt von gp75 abgeleitet wurde. Es ist daher möglich, dass multiple Peptide oder Proteine häufig von überlappenden offenen Leserahmen eines einzelnen eukaryotischen Gens translatiert werden, aber das Mittel zum Nachweis dieser alternativen Produkte nicht erhältlich waren. Die außerordentliche Sensitivität von T-Zellen, natürlich prozessierte Peptide nachzuweisen, kann viele andere Beispiele dieses Phänomens aufzeigen.
  • Der Mechanismus, durch den der überlappende offene Leserahmen (ORF3) in vivo translatiert wird, ist gegenwärtig unklar. Obwohl Beispiele von zellulären mRNAs bekannt sind, die an mehr als einem AUG-Codon initiieren, und die in seltenen Fällen an beiden AUG- und Nicht-AUG-Codons, wie CUG, initiieren, um N-terminal verlängerte identische Sequenzen zu generieren, wurde die Verwendung überlappender offener Leserahmen (d. h. Translation zweier vollständig unterschiedlicher Peptide) von einer einzelnen eukaryotischen zellulären mRNA bisher nie beschrieben. Verschiedene Beispiele der Translation überlappender Leserahmen von einer einzelnen mRNA wurden beschrieben, waren aber ausschließlich auf virale Gene beschränkt. Der Nachweis dieser Produkte in überlappenden Leserahmen in viralen Genen war möglich aufgrund der Existenz reaktiver Antikörper in den Seren virusinfizierter Wirte. In der vorliegenden Erfindung wurde ein T-Zell-Assay dazu verwendet, das von T-Zellen erkannte Epitop-Peptid zu identifizieren. Dieser Ansatz unterscheidet sich stark von herkömmlichen Western-Blots oder Immun-Präzipitationsanalysen und ist sensitiver. Obwohl zwischen dem authentischen Start-Codon und dem Start-Codon von ORF3 fünf ATG-Codons liegen, behielt das Konstrukt pPCR110, das den N-terminalen Teil von ORF1 (gp75), den vollständigen ORF2 und ORF3 (Nukleotide 1–667) umfasste, immer noch die Fähigkeit, Zytokin-Freisetzung aus TIL586 zu stimulieren. Der Grad der Stimulierung war jedoch um einiges niedriger als die Stimulierung durch die 5'-verkürzte (ohne die ersten 246-Nukleotide)-Form von gp75 (1A und 1B), was nahelegt, dass die stromaufwärts gelegenen ATG-Codons die Expression von ORF3 partiell inhibiert haben. Einige Faktoren haben es möglich gemacht, die Expression des ORF3-Produktes in diesem System nachzuweisen. Zunächst schienen die stromaufwärts gelegenen ATG-Codons, die vor dem ATG-Start-Codon von ORF3 liegen, nicht im optimalen Kontext vorzuliegen, wodurch ermöglicht werden kann, dass das stromabwärts gelegene ATG als Start-Codon durch das „Leaky Scanning"-Modell verwendet wird. Zweitens kann die relativ hohe Expression von transfizierten Genen in COS-7-Zellen und die Verfügbarkeit des T-Zell-Assays als extrem sensitives Mittel den Nachweis sehr geringer Konzentrationen der translatierten Produkte ermöglichen.
  • Interessanterweise wurde das ORF3-Produkt durch T-Zellen sowohl in Tumorzellen als auch in normalen Melanozyten nachgewiesen (6A–6D), was nahelegt, dass das ORF3-Protein kein Genprodukt ist, das auf genetische Veränderungen in Tumorzellen zurückzuführen ist. In früheren Studien wurde gezeigt, dass TIL586 multiple untersuchte Tumor-Zelllinien erkannte (gp75+/A31+), was nahelegt, dass TIL586 ein nicht-mutiertes, von vielen Tumorzellen verwendetes Tumorantigen ist (Wang, R. F. et al., ibid). Da das gp75-Gen in Melanomen basierend auf Northern-Blot und PCR-Analyse (Wang, R. F. et al., ibid) stark exprimiert wird und das zugehörige Genprodukt, das gp75-Protein, das in Melanomzellen und Melanozyten am stärksten exprimierte intrazelluläre Glykoprotein ist (Tai, T., Eisinger, M., Ogata, S. und Lloyd, K. O. 1983, Cancer Res. 43: 2773–2779; Thomson, T. N., Mattes, J. M., Roux, L., Old, L. J. und Lloyd, K. O. 1985, J. Invest. Dermat. 85: 169–174; Thomson, T. N.. real, F. X., Mutakami, S., Cordon-cardo, C., Old, L. J. und Houghton, A. N. 1988, J. Invest. Dermat. 90, 459–466), ist es nicht überraschend, dass die T-Zellklone das ORF3P-Peptid erkannten, wenn es auf 586EBV-B-Zellen (A31+), Melanom (gp75+/A31+) als auch auf A31+-Melanozyten geladen war, aber nicht gp75–/A31+-Melanomzellen oder ORF3P, das auf nicht-A31-T2-Zellen geladen war. Eine andere Möglichkeit, die Peptidexpression in Tumorzellen und Melanozyten zu erklären, besteht darin, dass ORF3 von separaten mRNA-Transkripten translatiert wird, die durch alternatives Splicing der gp75-mRNA oder durch einen unterschiedlichen Promoter erzeugt werden. Nach unserem Wissensstand werden mRNA- Transkripte, die durch alternatives Splicing erzeugt werden, durch Verwendung der gleichen offenen Leserahmen in Isoform-Proteine translatiert. In unserem Fall wurde jedoch ein separates Transkript erzeugt und als Matrize für die Translation verwendet, aber ein komplett unterschiedlicher offener Leserahmen wurde im Vergleich zu gp75 zur Translation des ORF3-Produktes verwendet. Zur Aufklärung des Mechanismus der Translation des ORF3-Proteins in vivo sind weitere Experimente notwendig. Nichtsdestotrotz schließen sich die vorhergehend genannten Möglichkeiten nicht gegenseitig aus.
  • SEQUENZPROTOKOLL
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Claims (32)

  1. Ein isoliertes Krebspeptid oder ein antigener Teil davon, kodiert von einer isolierten alternativen offenen Leserahmen Nukleinsäuresequenz von einem Gen, die anders ist, als eine offene Leserahmen Sequenz, die ein normales Protein oder Peptid desselben Gens kodiert; wobei die isolierte offene Leserahmen Nukleinsäuresequenz von einem TRP-1 Gen ist, wobei die Nukleinsäuresequenz aus ORF3 besteht, identifiziert durch SEQ ID NO: 5, oder Teilen davon, wobei dieser Teil wenigsten 15 Nukleotide umfasst und wobei das Krebspeptid oder ein Teil davon T-Lymphozyten stimuliert, die dieses Krebspeptid oder einen Teil davon als ein Krebsantigen zur Auslösung einer immunogenen Antwort gegen Tumore und Krebs erkennen.
  2. Krebspeptid oder ein antigener Teil davon gemäß Anspruch 1, wobei das Krebspeptid von MHC-beschränkten T-Lymphozyten erkannt wird.
  3. Krebspeptid oder ein antigener Teil davon gemäß Anspruch 1, wobei die T-Lymphozyten MHC Klasse I-beschränkt sind.
  4. Krebspeptid oder ein antigener Teil davon gemäß Anspruch 1, wobei das Krebspeptid von einem Krebs, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus, Melanommetastasen und Melanom stammt oder wobei das Krebspeptid von einem Tumor-assoziierten Antigen stammt.
  5. Krebspeptid oder ein antigener Teil davon gemäß Anspruch 1, wobei die alternative offene Leserahmen Nukleinsäuresequenz aus der Formel ATGTCACTGCAACGGCAATTTCTCAGG (SEQ ID NO: 10) oder einem Teil davon besteht.
  6. Krebspeptid gemäß Anspruch 1, bestehend aus der Aminosäuresequenz: MSLQRQFLRTQLWDVPSWLERSCL (SEQ ID NO: 6) oder einem antigenen Teil davon, bestehend aus mindestens 5 Aminosäuren, die T-Lymphozyten stimulieren.
  7. Krebspeptid gemäß Anspruch 6, wobei das Krebspeptid aus der Formel: MSLQRQFLR (SEQ ID NO: 9) besteht.
  8. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend das Krebspeptid oder einen antigenen Teil davon gemäß den Ansprüchen 1 bis 7 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
  9. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 8, weiterhin umfassend ein immunstimulierendes Molekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus, einem MHC Klasse I Molekül, einem MHC Klasse II Molekül, B7.1, B7.2, ICAM-1, ICAM-2, LFA-1, LFA-3, CD72, IL-1 bis IL-15, TNFα, IFNγ, RANTES, G-CSF, M-CSF, IFNα, CTAP III, ENA-78, GRO, I-309, PF-4, IP-10, LD-78, MGSA, MIP-1α, MIP-1β und Kombinationen davon.
  10. Immunogen umfassend das Krebspeptid oder einen antigenen Teil davon gemäß den Ansprüchen 1 bis 7, allein oder in Kombination mit wenigstens einem immunstimulierenden Molekül.
  11. Immunogen gemäß Anspruch 10, wobei das immunstimulierende Molekül ein MHC Molekül ist.
  12. Isolierte Nukleinsäuresequenz, bestehend aus einer alternativen offenen Leserahmen Nukleinsäuresequenz, ein Krebspeptid oder einen antigenen Teil davon kodierend, gemäß einem der Ansprüche 1–7.
  13. Rekombinanter Expressionsvektor, umfassend die Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 12.
  14. Isolierte Wirtszelle oder ein nicht-humaner Wirtsorganismus, transformiert oder transfiziert mit einem rekombinanten Expressionsvektor gemäß Anspruch 13.
  15. Oligonukleotid bestehend aus einer Nukleinsäuresequenz, die komplementär zu der Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 12 ist.
  16. Rekombinantes Virus, das in seinem Genom die alternative offene Leserahmen Nukleinsäuresequenz oder einen antigenen Teil davon gemäß Anspruch 12 umfasst.
  17. Rekombinantes Virus gemäß Anspruch 16, weiterhin umfassend wenigstens ein Gen, das ein immunstimulierendes Molekül kodiert.
  18. Rekombinantes Virus gemäß Anspruch 16, wobei das Virus ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus, Retrovirus, Baculovirus, Ankara Virus, Geflügelpocken, Adenovirus und Vaccinia Virus.
  19. Rekombinantes Virus gemäß Anspruch 16, wobei das Krebspeptid von Melanozyten stammt.
  20. Rekombinantes Virus gemäß Anspruch 17, wobei das immunstimulierende Molekül ein MHC Klasse I Molekül ist.
  21. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend das rekombinante Virus gemäß den Ansprüchen 16 bis 20, allein oder in Kombination einem exogenen immunstimulierenden Molekül, Chemotherapie-Mittel, Antibiotikum, antimykotischem Mittel, antiviralen Mittel oder Kombinationen davon und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
  22. Verwendung des rekombinanten Virus gemäß einem der Ansprüche 16 bis 20, allein oder in Kombination mit einem exogenen immunstimulierenden Molekül zu Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verhinderung oder Inhibierung von Krebs in einem Säuger, wobei eine wirksame Menge des rekombinanten Virus allein oder in Kombination mit einem exogenen immunstimulatorischen Molekül zur Verabreichung an einen Säuger geeignet ist.
  23. Verfahren zu Herstellung eines rekombinanten Krebspeptids oder einem antigenen Teil davon gemäß Anspruch 1, umfassend: a. Einfügen einer isolierten Nukleotidsequenz von ORF3, identifiziert durch SEQ ID NO: 5, oder eines antigenen Teils davon, in einen Expressionsvektor, wobei dieser Teil wenigstens 15 Nukleotide umfasst, wobei die Nukleotidsequenz von ORF3 oder einem Teil davon ein Krebsantigen oder einen antigenen Teil davon kodiert, mit der biologischen Funktion T-Lymphozyten zu stimulieren; b. Übertragen des Expressionsvektors in eine Wirtszelle; c. Kultivieren der Wirtszelle unter Bedingungen, die zur Expression des Krebspeptids oder des antigenen Teil davon geeignet sind; und d. Ernten des rekombinanten Krebspeptids oder des antigenen Teil davon.
  24. Verfahren gemäß Anspruch 23, weiterhin umfassend in Schritt (a) Einfügen einer Nukleotidsequenz, die ein MHC Klasse 1 Molekül kodiert, oder eines funktionellen Teils davon in den Expressionsvektor.
  25. Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit von Krebs oder Präkanzerose in einem Säuger, umfassend: a. In Kontakt bringen einer isolierten Nukleotidsequenz von ORF3, identifiziert durch SEQ ID NO: 5, oder eines antigenen Teils davon, wobei dieser Teil wenigstens 15 Nukleotide umfasst, mit einer biologischen mRNA Testprobe aus einem Säuger, unter Bedingungen, die es ermöglichen, dass sich zwischen den Sequenzen und der mRNA ein Komplex bildet, wobei der Teil ein Krebsantigen kodiert, dieses Krebsantigen besitzt die biologische Funktion T-Lymphozyten zu stimulieren, die Erkennung dieses Krebsantigens löst eine Immunantwort gegen Tumore und Krebs aus; b. Nachweisen des Komplexes; c. Vergleichen der Menge an mRNA in der Testprobe mit der Menge an mRNA aus einer bekannten normalen biologischen Probe, wobei eine gesteigerte Menge an mRNA in der Testprobe Krebs oder Präkanzerose anzeigt.
  26. Verfahren gemäß Anspruch 25, wobei der Krebs oder Präkanzerose Melanom ist.
  27. Verfahren zum Nachweis einer ORF3 Nukleinsäuresequenz eines TRP-1 Gens in einer biologischen Probe, die eine genomische Nukleinsäuresequenz umfasst, umfassend: a. In Kontakt bringen der genomischen Nukleinsäuresequenz mit einer isolierten ORF3 Nukleinsäuresequenz eines TRP-1 Gens, wobei die isolierte ORF3 Nukleinsäuresequenz identifiziert ist durch SEQ ID NO: 5 oder mit einem antigenen Teil davon, unter Bedingungen, dies es ermöglichen, das sich zwischen der genomischen Nukleinsäuresequenz und der ORF3 Nukleinsäuresequenz oder einem antigenen Teil davon ein Komplex bildet, wobei die ORF3 Nukleinsäuresequenz oder ein Teil davon ein Krebsantigen oder einen antigenen Teil davon, bestehend aus wenigstens 5 Aminosäuren, kodiert; und b. Nachweisen des Komplexes.
  28. Verfahren zum Nachweis des Krebspeptids oder eines antigenen Teils davon, gemäß den Ansprüchen 1 bis 7, in einer biologischen Probe, umfassend: a. In Kontakt bringen der Probe mit Antikörpern, die spezifisch für dieses Krebspeptid sind, unter Bedingungen, einen Immunkomplex zu bilden, und b. Nachweisen der Anwesenheit es Immunkomplex.
  29. Nicht-humanes transgenen Tier, das ein exogenes Gen, identifiziert durch SEQ ID NO: 5 oder ein Fragment davon trägt, welches ein Krebspeptid oder einen antigenen Teil davon, bestehend aus mindestens 5 Aminosäuren, kodiert.
  30. Nicht-humanes transgenes Tier, das ein Krebspeptid oder einen antigenen Teil davon gemäß Anspruch 29, exprimiert.
  31. Verwendung des Krebspeptides oder eines antigenen Teils davon, gemäß den Ansprüchen 1 bis 7, allein oder in Kombination mit einem MHC Molekül, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Inhibierung von Krebs im Säuger, wobei eine wirksame Menge des Krebspeptids oder eines antigenen Teils davon allein oder in Kombination mit einem MHC geeignet ist zur Verabreichung an einen Säuger.
  32. Verwendung des Krebspeptides oder eines antigenen Teils davon, gemäß den Ansprüchen 1 bis 7, allein oder in Kombination mit einem MHC Molekül, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Inhibierung von Melanom in einem Säuger, wobei a. T-Lymphozyten in vitro dem Krebspeptid oder einem antigenen Teil davon, gemäß Ansprüchen 1–7, allein oder in Kombination mit einem MHC Molekül, ausgesetzt werden, für eine Zeit, die ausreichend ist, die T-Lymphozyten zu stimulieren, um eine Immunantwort gegen das Krebspeptid auszulösen; b. die T-Lymphozyten zur Verabreichung an den Säuger geeignet sind, in einer Menge, die ausreichend ist Melanom zu inhibieren.
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