DE69931482T2

DE69931482T2 - Isolierte peptide die aminosäuresequenzen von ny-eso-1 entsprechen und an mhc-klasse i und mhc klasse ii moleküle binden, und deren verwendungen

Info

Publication number: DE69931482T2
Application number: DE69931482T
Authority: DE
Inventors: Elisabeth New York STOCKERT; Elke Jager; Yao-Tseng New York CHEN; Matthew New York SCANLAN; Knuth Alexander; J. Lloyd New York OLD; Ali New York GURE; Gerd New York RITTER; Dr. Dept of Imm. & Blood Transf. Jan DRIJFHOUT
Original assignee: Ludwig Institute for Cancer Research Ltd; Ludwig Institute for Cancer Research New York
Current assignee: Ludwig Institute for Cancer Research Ltd; Ludwig Institute for Cancer Research New York
Priority date: 1998-04-17
Filing date: 1999-03-24
Publication date: 2007-05-03
Anticipated expiration: 2019-03-25
Also published as: CA2325605A1; EP1071443B1; US6723832B1; ATE326981T1; US7115729B2; AU754961B2; US20040158044A1; EP1071443A1; DE69931482D1; JP3995884B2; KR20010074487A; CN100378121C; CA2325605C; KR100483480B1; WO1999053938A1; AU3370699A; EP1071443A4; JP2002538074A; CN1303300A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft HLA-Bindungspeptide, die von einem Antigen abstammen, das mit Krebs assoziiert ist. Diese Peptide binden sich an Klasse-II-MHC-Moleküle.
HINTERGRUND UND STAND DER TECHNIK
Es ist durchwegs anerkannt, dass zahlreiche pathologische Leiden, wie z.B. Infektionen, Krebs, Autoimmunerkrankungen und dergleichen, durch die ungeeignete Expression bestimmter Moleküle gekennzeichnet sind. Diese Moleküle dienen somit als "Marker" für ein bestimmtes pathologisches oder anormales Leiden. Abgesehen von ihrer Verwendung als Diagnose"Targets", d.h. als Materialien, die es zu identifizieren gilt, um diese anormalen Leiden zu diagnostizieren, dienen die Moleküle als Reagenzien, die verwendet werden können, um diagnostische und/oder therapeutische Mittel zu entwickeln. Ein keineswegs einschränkendes Beispiel hierfür ist die Verwendung von Krebsmarkern, um Antikörper zu bilden, die für einen bestimmten Marker spezifisch sind. Wiederum ein anderes, nicht einschränkendes Beispiel ist die Verwendung eines Peptids, das mit einem MHC-Molekül Komplexe bildet, um zytolytische T-Zellen gegen anormale Zellen zu bilden.
Die Herstellung solcher Materialien setzt natürlich eine Quelle für die Reagenzien voraus, die verwendet werden, um diese zu bilden. Die Reinigung aus Zellen ist ein arbeitsaufwendiges und keineswegs sicheres Verfahren hierzu. Ein anderes bevorzugtes Verfahren ist die Isolierung von Nucleinsäuremolekülen, die für einen bestimmten Marker kodieren, gefolgt von der Verwendung des isolierten kodierenden Moleküls, um das erwünschte Molekül zu exprimieren.
Bis heute wurden zwei Vorgehensweisen zur Detektion solcher Antigene, z.B. in menschlichen Tumoren, verwendet. Diese werden als der genetische Ansatz und der biochemische Ansatz bezeichnet. Der genetische Ansatz wird z.B. von dePlaen et al., Proc. Natl. Sci. USA 85, 2275 (1988), dargestellt. In diesem Ansatz werden mehrere hundert Pools von Plasmiden einer cDNA-Bibliothek, die aus einem Tumor ge wonnen wurde, in Rezipientenzellen wie z.B. COS-Zellen oder in Antigen-negative Varianten von Tumorzelllinien, die auf die Expression des spezifischen Antigens getestet werden, transfiziert. Der biochemische Ansatz, der z.B. von O. Mandelboim et al., Nature 369, 69 (1994), beschrieben wird, basiert auf Säureelution von Peptiden, die sich an MHC-Klasse-I-Moleküle von Tumorzellen gebunden hatten, gefolgt von Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC). Antigene Peptide werden identifiziert, nachdem sie sich an leere MHC-Klasse-I-Moleküle von mutierten Zelllinien binden, die in der Antigen-Verarbeitung defekt sind, und spezifische Reaktionen mit zytotoxischen T-Lymphozyten induzieren. Diese Reaktionen umfassen die Induktion von CTL-Proliferation, TNF-Freisetzung und Lyse von Targetzellen, die in einem MTT-Test oder einem ⁵¹Cr-Release-Assay messbar sind.
Diese zwei Ansätze zur molekularen Definition von Antigenen haben die folgenden Nachteile: erstens sind sie äußerst mühsam, zeitaufwendig und kostspielig; und zweitens hängen sie von der Erstellung zytotoxischer T-Zelllinien (CTLs) mit vorgegebener Spezifität ab.
Die den bekannten Ansätzen zur Identifikation und molekularen Definition von Antigenen innewohnenden Probleme werden am besten durch die Tatsache aufgezeigt, dass beide Verfahren bisher zur erfolgreichen Definition von nur sehr wenigen neuen Antigenen in menschlichen Tumoren führten. Siehe z.B. van der Bruggen et al., Science 254, 1643-1647 (1991); Brichard et al., J. Exp. Med. 178, 489-495 (1993); Coulie et al., J. Exp. Med. 180, 35-42 (1994); Kawakami et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 3515-3519 (1994).
Darüber hinaus hängen die beschriebenen Verfahren von der Verfügbarkeit von erstellten, permanenten Zelllinien des betreffenden Krebstyps ab. Es ist sehr schwierig, Zelllinien aus bestimmten Krebstypen zu erstellen, wie z.B. von Oettgen et al., Immunol. Allerg. Clin. North. Am. 10, 607-637 (1990), gezeigt wird. Es ist auch bekannt, dass manche Epithelzelltyp-Krebsarten in vitro gegenüber CTLs nur schwach empfindlich sind, was eine Routineanalyse ausschließt. Diese Probleme motivierten Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung, zusätzliche Methoden zur Identifikation von Krebs-assoziierten Antigenen zu entwickeln.
Ein zentrales Verfahren wird von Sahin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 11810-11913 (1995), beschrieben. Siehe auch das US-Patent Nr. 5.698.396 und das US-Patent 5.804.388. Zusammenfassend gesagt umfasst das Verfahren die Expression von cDNA-Bibliotheken in einem prokaryotischen Wirt. (Die Bibliotheken werden aus einer Tumorprobe entnommen.) Die exprimierten Bibliotheken werden dann mit absorbierten und verdünnten Seren immungescreent, um jene Antigene zu detektieren, die humorale Antworten mit hohem Titer hervorrufen. Dieses Verfahren ist als das SEREX-Verfahren bekannt ("Serological identification of antigens by Recombinant Expression Cloning"; serologische Identifikation von Antigenen durch rekombinantes Expressionsklonieren). Das Verfahren wurde verwendet, um Expression von davor identifizierten, Tumor-assoziierten Antigenen zu bestätigen sowie um neue zu detektieren. Siehe die oben angeführten Patentanmeldungen und Sahin et al., s.o., sowie Crew et al., EMBO J. 144, 2333-2340 (1995).
Das SEREX-Verfahren wurde an Proben aus Speiseröhrenkrebs angewandt, und ein Antigen wurde daraus identifiziert sowie sein kodierendes Nucleinsäuremolekül isoliert und kloniert. Dies ist Inhalt mehrerer Patentanmeldungen. Für das Antigen und trunkierte Formen wurde erkannt, dass sie mit Antikörpern im Serum von Krebspatienten reaktiv sind. Auch wurde erkannt, dass sich Peptide, die aus diesem Molekül stammen, mit MHC-Molekülen binden und sowohl Antworten von zytolytischen T-Zellen als auch T-Helfer-Zellen hervorrufen. Auf diese Eigenschaften der Erfindung wird in der folgenden Offenbarung eingegangen.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung stellt ein isoliertes NY-ESO-1-Polypeptid bereit, das sich an MHC-Klasse-II-HLA-DR53-Moleküle bindet, worin das Polypeptid aus der aus Seq.-ID Nr. 8, 9 und 10 bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
In einem anderen Aspekt wird ein isolierter Komplex aus MHC-Klasse-II-Molekül NLA-DR53 und einem Polypeptid der Erfindung, wie es im vorangehenden Absatz definiert ist, bereitgestellt. Ebenfalls bereitgestellt wird ein isoliertes Nucleinsäuremolekül, das aus einer Nucleotidsequenz besteht, die für das isolierte Polypeptid der Erfindung kodiert, sowie ein Expressionsvektor, der das isolierte Nucleinsäuremolekül, operabel an einen Promotor gebunden, umfasst, und eine rekombinante Zelle, die das isolierte Nucleinsäuremolekül oder den Vektor umfasst.
In einem weiteren Aspekt wird ein In-vitro-Verfahren zur Stimulation der Proliferation von T-Helfer-Zellen bereitgestellt, umfassend das Kontaktieren einer T-Zelle, die die Probe enthält, mit einem Komplex aus MHC-Klasse-II-Molekül NLA-DR53 und dem aus der aus Seq.-ID Nr. 8, 9 und 10 bestehenden Gruppe ausgewählten Peptid in einem ausreichenden Ausmaß, um Proliferation von T-Helfer-Zellen, die den Komplex erkennen, zu stimulieren.
In einem anderen Aspekt wird ein Peptid, ausgewählt aus der aus Seq.-ID Nr. 8, 9 und 10 bestehenden Gruppe, zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung eines NLA-DR53-positiven Patienten, worin das Verfahren die Stimulation von T-Helfer-Zellen über Komplexbildung des Peptids mit HLA-DR53 umfasst, und die Verwendung eines Peptids, ausgewählt aus der aus Seq.-ID Nr. 8, 9 und 10 bestehenden Gruppe, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines HLA-DR53-Patienten, worin die Behandlung in der Stimulierung von T-Helfer-Zellen über Komplexbildung des Peptids mit NLA-DR53 besteht, bereitgestellt.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Diagnose eines Krebsleidens bei einer Person, umfassend das Kontaktieren einer immunreaktive Zellen enthaltenden Probe aus dieser Person mit einer Zelllinie, die mit einem isolierten Nucleinsäuremolekül transfiziert ist, das für ein Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2 kodiert, sowie das Bestimmen von Wechselwirkung der transfizierten Zelllinie mit der immunreaktiven Zelle, wobei eine solche Wechselwirkung ein Hinweis auf das Krebsleiden ist.
Ein anderes Verfahren der Erfindung dient der Bestimmung von Regression, Progression oder Ausbruch von Krebsleiden, umfassend das Beobachten einer Probe aus einem Patienten mit dem Krebsleiden auf einen Parameter, der aus der aus (i) einem Komplex aus einem Peptid der Erfindung und einem MHC-Klasse-II-Molekül, (ii) T-Helfer-Zellen, die für diese Komplexe spezifisch sind, bestehenden Gruppe ausgewählt ist, worin der Wert dieses Parameters ein Hinweis auf die Progression oder Regression oder den Ausbruch des Krebsleidens ist.
Die Erfindung stellt auch eine Zusammensetzung bereit, die das isolierte Peptid von Seq.-ID Nr. 7 und zumindest ein anderes Peptid, dessen Aminosäuresequenz im Protein, für das Seq.-ID Nr. 1 kodiert, vorliegt und das das durch die Seq.-ID Nr. 8, 9 oder 10 definierte Peptid ist, umfasst.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt das Expressionsmuster von RNA für das NY-ESO-1-Antigen in verschiedenen Gewebetypen.
2 zeigt Northern-Blot-Analyse von NY-ESO-1-mRNA, die in Hoden und der Zelllinie SK-MEL-19, jedoch nicht in verschiedenen anderen Zell- und Gewebeproben, gefunden wurde.
3 zeigt potenzielle Stellen für Modifikation der abgeleiteten Aminosäuresequenz von NY-ESO-1.
4 ist ein Diagramm zur Hydrophilie von NY-ESO-1, das hydrophile Domänen im Aminoterminus und einen langen, hydrophoben Abschnitt in der Nähe des Carboxyl-Endes zeigt.
5 zeigt die Resultate von CTL-Lyse-Untersuchungen unter Verwendung verschiedener Zellen, die HLA-A2-positiv, NY-ESO-1-positiv, positiv für beide oder positiv für keines der beiden sind.
6 stellt Daten dar, die zeigen, dass HLA-A2 das präsentierende Molekül zur Präsentation von von Seq.-ID Nr. 1 abstammenden Peptiden ist.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG BEVORZUGTER AUSFÜHRUNGSFORMEN
Beispiel 1
Gesamt-RNA wurde aus einem schockgefrorenen Muster von gut bis mäßig differenziertem Plattenepithelkarzinom der Speiseröhre unter Verwendung von durchwegs bekannten Verfahren extrahiert. Siehe z.B. Chomzynski, J. Analyt. Biochem. 162, 156-159 (1987), für ein Beispiel eines solchen Verfahrens. Diese RNA wurde verwendet, um eine cDNA-Bibliothek herzustellen, die dann gemäß den Anweisungen des Herstellers in λZAP-Phagenvektoren transfiziert wurde. Die λZAP-Bibliothek wurde dann in E. coli transfiziert, was 1,6 × 10⁶ Primärisolate ergab.
Anschließend wurde das SEREX-Verfahren von Sahin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 11810-11813 (1995), hierin durch Verweis aufgenommen, verwendet. Kurz zusammengefasst wurde autologes Serum von Antikörpern gegen Moleküle, die zu E. coli endogen sind, durch Kombinieren des Serums mit Lysaten von E. coli, das mit Phagen λZAP transfiziert war, der die cDNA-Klone aus den Speiseröhrenkrebszellen nicht enthielt, entfernt.
Das abgereicherte Serum wurde dann verdünnt und mit Nitrocellulosemembranen, die Phagenplaques enthielten, vermischt. Die Plaques wurden über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Es folge ein Waschschritt, und dann wurden die Filter mit mit alkalischer Phosphatase konjugierten, sekundären Ziege-Anti-Mensch-FCγ-Antikörpern inkubiert, und reaktive Phagenplaques wurden durch Inkubieren mit 5-Brom-4-chlor-indolylphosphat und Nitroblau-Tetrazolium sichtbar gemacht. Insgesamt wurden 13 positive Klone gefunden.
Beispiel 2
Nach der Identifikation wurden die reaktiven Klone bis zur Monoklonalität über Verdünnungsklonieren und Testen mit menschlichem Serum subkloniert. Diese Klone wurden dann gereinigt, in vitro ausgeschnitten und unter Einhaltung der Anweisungen des Herstellers zu pBK-CMV-Plasmidformen umgesetzt. Die insertierte DNA wurde dann unter Verwendung von EcoRI-XbaI-Restriktionskartierung bewertet, um verschiedene Inserts zu bestimmen. Acht verschiedene Inserts im Bereich von etwa 500 bis etwa 1,3 kbp wurden identifiziert. Die Klone wurden unter Verwendung eines automatisierten ABI-PRISM-Sequenziergeräts sequenziert.
Tabelle 1 fasst die Resultate zusammen. Ein Gen war durch vier überlappende Klone vertreten, ein zweites durch drei überlappende Klone und die verbleibenden sechs nur durch einen Klon.
Eine Homologiesuche zeigte auf, dass die Klone, die als NY-ESO-2, -3, -6, -7 bezeichnet wurden, bereits bekannt waren. Siehe Elisei et al., J. Endocrin. Invest. 16, 533-540 (1993); Spritz et al., Nucl. Acids Res. 15, 10373-10391 (1987); Rabbits et al., Nature Genetics 4, 175-180 (1993); Crozat et al., Nature 363, 640-644 (1993); GenBank H18368 und D25606. Für zwei der Klone (NY-ESO-3 und NY-ESO-6) wurde bereits davor gezeigt, dass sie in verschiedenen normalen menschlichen Geweben exprimiert werden. Es wurde kein Beweis für Abstammungseinschränkung gefunden. NY-ESO-6 (cDNA) scheint der 3'-untranslatierte Abschnitt des FUS/TLS-Gens zu sein. In Versuchen, über die hierin nicht berichtet wird, brachten Sequenzieren und Southern-Blot-Analyse von NY-ESO-6 keinen Beweis für Translokation oder Punktmutationen im Krebs. Vier der Klone, d.h. NY-ESO-1, -4, -5 und -8, zeigten keine starke Homologie zu Sequenzen aus der durchsuchten Datenbank und wurden somit näher untersucht. Tabelle 1. Gene, die aus Speiseröhrenkrebs-Bibliothek durch Immunscreening mit autologem Serum isoliert wurden
Beispiel 3
Es wurden Untersuchungen durchgeführt, um mRNA-Expression der NY-ESO-1, -4-, -5- und -8-Klone zu bewerten. Hierzu wurden spezifische Oligonucleotidprimer für jede Sequenz entworfen, sodass cDNA-Segmente mit 300-400 bp amplifiziert werden konnten und sodass die Primer-Schmelztemperatur im Bereich von 65-70°C lag. Umkehrtranskriptions-PCR wurde anschließend unter Verwendung von im Handel erhältlichen Materialien und Standard-Arbeitsvorschriften durchgeführt. Zahlreiche normale und Tumorzelltypen wurden getestet. Die Klone NY-ESO-4 und NY-ESO-8 kamen überall vor und wurden nicht näher untersucht. NY-ESO-5 zeigte ein hohes Expressionsniveau im ursprünglichen Tumor und im normalen Speiseröhrengewebe, was darauf schließen lässt, dass es ein Differenzierungsmarker war.
Für NY-ESO-1 wurde erkannt, dass es in Tumor-mRNA und in Hoden, jedoch nicht in normalem Kolon-, Nieren-, Leber- oder Gehirngewebe exprimiert wird. Dieses Expressionsmuster stimmt mit anderen Tumorabstoßungs-Antigenvorläufern überein.
Beispiel 4
Der oben erläuterte RT-PCR-Test wurde für NY-ESO-1 an einer viel vollständigeren Reihe von normalen und Tumorgeweben durchgeführt. Die Tabellen 2, 3 und 4 zeigen diese Resultate. Kurz zusammengefasst wurde für NY-ESO-1 erkannt, dass es in normalen Hoden- und Eierstockzellen hoch exprimiert wird. Geringe Mengen an RT-PCR-Produktion wurden in normalem uterinem Myometrium und nicht im Endometrium gefunden, doch die positiven Signale waren nicht beständig. Plattenepithel von verschiedenen Zelltypen, einschließlich normaler Speiseröhre und Haut, waren auch negativ.
Wurden Tumoren von nicht verwandten Zelllinien getestet, so zeigten 2 von 11 Melanomzelllinien starke Expression, wie auch 16 von 67 Melanommustern, 6 von 33 Brustkrebsmustern und 4 von 4 Blasenkrebsmustern. Es wurde auch sporadische Expression in anderen Tumortypen festgestellt. Tabelle 2: mRNA-Verteilung von NY-ESO-1 in normalen Geweben

* Gewebe aus mehreren Stellen, getestet mit IL-2 und PHA
** schwach positiv in manchen Mustern, negativ durch Northern-Blot

* Nicht-Hodkin-, Nicht-Burkitt-Typen

Eine weitere Reihe von Versuchen wurde durchgeführt, um festzustellen, ob die Gegenwart von Anti-NY-ESO-1-Antikörper in Krebspatientenseren mittels einer ELISA bestimmt werden könnte.
Hierzu wurde rekombinantes NY-ESO-1 in einer Lösung von Beschichtungspuffer (15 mM Na₂CO₃, 30 mM NaHCO₃, pH 9,6, 0,02% NaN₃) in einer Konzentration von 1 μg/ml an Mikrowellplatten adsorbiert (10 μl Lösung pro Well) und dann über Nacht bei 4°C gehalten. Die Platten wurden mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen und über Nacht bei 4°C mit 10 μl/Well von 2% Rinderserumalbumin/phosphatgepufferter Kochsalzlösung blockiert. Nach dem Waschen wurden 10 μl/Well verdünntes Serum in 2% Rinderserumalbumin zu den Wells zugesetzt. Nach zwei Stunden Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Platten gewaschen, und 10 μl/Well Konjugate zwischen Ziege-Anti-Mensch-IgG und alkalischer Phosphatase wurden bei einer Verdünnung von 1:1.500 zugesetzt. Diese Lösung wurde eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert, gefolgt von Waschen und Zusatz einer Substratlösung für die alkalische Phosphatase (10 μl/Well). Nach 25 min bei Raumtemperatur wurden die Wells mit einem Fluoreszenzplattenleser abgelesen. Die Resultate sind in der folgenden Tabelle dargestellt:
Um zu bestimmen, ob es einen Zusammenhang zwischen der Expression von mRNA für NY-ESO-1 in Tumoren und Antikörperantwort auf das NY-ESO-1-Protein gab, wurden Daten von 62 Melanom-Patienten verglichen. Alle Patienten, deren Serum mit NY-ESO-1-Protein reaktiv war (d.h. Antikörper gegen NY-ESO-1 enthielt), wiesen auch NY-ESO-1-positive Tumoren auf, während keine Patienten mit NY-ESO-1-negativen Tumoren Antikörper gegen NY-ESO-1 in ihrem Serum zeigten. Es gab einen Prozentsatz an NY-ESO-1-positiven Patienten, denen der Antikörper fehlte. Angesichts dessen, dass etwa 20-40% der Melanome NY-ESO-1 exprimierten und nur Patienten mit NY-ESO-1-positiven Tumoren Antikörper aufweisen, lassen die Daten darauf schließen, dass ein hoher Prozentsatz an Patienten mit NY-ESO-1-positiven Tumoren Antikörper gegen das Protein entwickelt, was einen breit angelegten Test vorschlagen würde, der für die Diagnose und das Ansprechvermögen auf eine Behandlung nützlich wäre.
Beispiel 5
Northern-Blot-Analyse wurde anschließend durchgeführt, um die Größe des NY-ESO-1-Transkripts zu untersuchen und um Gewebeexpressionsmuster zu bestätigen. Das Verfahren von Ausubel et al., Current Protocols In Molecular Biology (John Wiley & Sons, 1995), wurde verwendet. Im Detail beschrieben wurden 20 μg von Gesamt-RNA pro Spur in einem Formamid- und Formaldehyd-hältigen Puffer aufgelöst, auf 65°C erhitzt und dann auf einem 1,2%igen Agarosegel mit 3% Formaldehyd getrennt, gefolgt von Transfer auf Nitrocellulosepapier. Hybridisierung wurde dann unter Verwendung einer ³²P-markierten Sonde ausgeführt, woraufhin ein Waschschritt unter hochstringenten Bedingungen erfolgte. Der abschließende Waschschritt erfolgte bei 0,1 × SSC, 0,1% SDS, 60°C, 15 min lang.
RNA aus Hoden und eine Melanomzelllinie (SK-MEL-19), die in den vorangehenden Tests für NY-ESO-1 positiv war, zeigte ein RNA-Transkript mit etwa 0,8-0,9 kb. Ein Speiseröhrenkarzinommuster zeigte eine Unschärfe im Bereich von 0,4-0,9 kb, was auf teilweisen Abbau hinweist. RNA aus zusätzlichen getesteten Geweben oder Zelllinien wies kein Transkript auf.
Um cDNA zu erhalten, die für das vollständige Transkript kodiert, wurde die Speiseröhren-cDNA-Bibliothek unter Verwendung von Plaque-Hybridisierung und des ursprünglichen cDNA-Klons als Hybridisierungssonde gescreent. Wurden 3 × 10⁵ Klone gescreent, so wurden sechs positive gefunden. Die drei längsten Klone wurden sequenziert. Eine Analyse von offenen Leserastern zeigte, dass alle drei die gesamte Kodierregion und 5'-untranslatierte Regionen unterschiedlicher Größe enthielten. Der längste Klon mit einer Länge von 755 Basenpaaren (ausschließlich polyA) enthält eine 543 Basenpaare umfassende Kodierregion zusammen mit 53 untranslatierten Basen am 5'-Ende und 151 untranslatierten Basenpaaren am 3'-Ende. Siehe Seq.-ID Nr. 1 (siehe auch 3).
Der lange ORF wies darauf hin, dass die abgeleitete Sequenz von NY-ESO-1-Protein 180 Aminosäuren umfasst. Der einzelne immunopositive Klon enthielt eine Sequenz, die für 173 von diesen kodiert. Das daraus abgeleitete Molekulargewicht beträgt 17.995 Da.
Eine Analyse zeigt, dass es ein Übermaß an Glycinresten im N-terminalen Abschnitt (30 unter den ersten 80, 4 in den verbleibenden 100) gibt. Hydrophilie-Analyse wies darauf hin, dass es hydrophile antigene Sequenzen in der N-terminalen Hälfte des Moleküls mit alternierenden hydrophoben und hydrophilen Sequenzen gab, die mit einem langen, C-terminalen hydrophoben Schwanz (Aminosäuren 152-172), gefolgt von einem kurzen hydrophilen Schwanz, endeten. Dieses Muster lässt auf eine Transmembrandomäne schließen. Es gibt mehrere potenzielle N-Myristorylierungsstellen, 3 Phosphorylierungsstellen und keinen Hinweis auf N-Glykosylierungsstellen.
Beispiel 6
Eine Melanomzelllinie "NW-MEL-38" wurde im Jahr 1995 aus einem Patienten, der an einem malignen Melanom erkrankt war, erstellt. Serumproben, periphere Blutlymphozyten und Tumorproben wurden der Person entnommen und eingefroren, bis die hierin beschriebene Arbeit daran durchgeführt wurde. Vorausblickend, dass die Antitumor-T-Zellen-Antwort in diesem Patienten bewertet werden soll, wurde der Patient als HLA-A1 und HLA-A2 HLA-typisiert.
Um zu bestimmen, ob das Melanom aus diesem Patienten NY-ESO-1 exprimierte, wurde Gesamt-RNA sowohl aus Tumorproben als auch aus der Zelllinie NW-MEL-38 unter Verwendung von Standardverfahren isoliert. Anschließend wurden zwei μg Gesamt-RNA aus jeder Probe, wiederum unter Verwendung von Standardverfahren, cDNA-Synthese unterzogen.
Die cDNA wurde dann in RT-PCR-Versuchen unter Verwendung der folgenden Primer verwendet:
5'-CACACAGGAT CCATGGATGC TGCAGATGCG G'-3' (Seq.-ID Nr. 2) und
CACACAAAGC TTGGCTTAGC GCCTCTGCCC TG-3' (Seq.-ID Nr. 3).
Diese Primer sollten ein Segment von Seq.-ID Nr. 1 amplifizieren, das die Nucleotide 271 bis 599 überspannt.
Amplifikation wurde über 35 Zyklen unter Verwendung einer Anellierungstemperatur von 60°C durchgeführt. Die PCR-Produkte wurden über Ethidiumbromidfärbung an einem 1,5%igen Agarosegel sichtbar gemacht.
Die Resultate wiesen darauf hin, dass sowohl der Tumor als auch die Zelllinie Seq.-ID Nr. 1 exprimierten. Die Zelllinien- und Tumorproben wurden in späteren Versuchen verwendet.
Beispiel 7
Das oben erläuterte isolierte cDNA-Molekül wurde dann verwendet, um rekombinantes Protein zu bilden. Detailliert beschrieben wurde die cDNA mittels PCR unter Verwendung herkömmlicher Verfahren amplifiziert und wurde anschließend in einen im Handel erhältlichen Plasmidvektor, d.h. pQE9, kloniert, der His-Markierungen enthält. In einer hierin nicht erläuterten Arbeit wurde auch ein zweiter Vektor, pQE9K, verwendet. Dieser unterscheidet sich von pQE9 darin, dass durch pQE9K Kanamycinresistenz, und nicht Ampicillinresistenz, verliehen wird.
Der Plasmidvektor wurde in E.-coli-Stamm XL1-Blue transformiert, und positive Transformanten wurden über Restriktionskartierung und DNA-Sequenzierung identifiziert. Die Produktion von rekombinantem Protein wurde unter Verwendung von Isopropyl-β-D-thiogalactosid induziert, und das Protein wurde an einer Ni²⁺-Ionenchromatographiesäule gemäß durchwegs bekannten Verfahren gereinigt. Das Protein wurde, als es mittels 15%iger SDS-PAGE und Silberfärbung analysiert wurde, als ein Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 22 kDa identifiziert. Dies stimmt mit der antizipierten Größe des Proteins aus seiner Sequenz überein. Zwei andere Formen des rekombinanten Proteins wurden ebenfalls identifiziert. Diese bestanden aus den Aminosäuren 10-180 und 10-121 der in Seq.-ID Nr. 1 gezeigten Aminosäuresequenz. Sie weisen mittels SDS-PAGE, wie oben beschrieben durchgeführt, Molekulargewichte von etwa 14 kD bzw. 20 kD auf.
Eine zusätzliche Reihe von Versuchen wurde durchgeführt, um NY-ESO-1 in Baculovirus zu exprimieren. Detailliert beschrieben wurde das NY-ESO-1-cDNA-Insert aus dem pQE9-Vektor durch Spalten mit BamHI und HindIII freigesetzt. Dieses Insert wurde dann in einen handelsüblichen Baculovirusvektor subkloniert, der mit denselben Enzymen gespalten worden war. Positive Klone wurden unter Verwendung von Standardverfahren bestimmt und in Rezipienten-Sf9-Zellen transfiziert. Rekombinante Viren wurden dann verwendet, um Insektenzellen unter Verwendung eines Standardmediums (IPL-41), ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum, zu infizieren. Die Infektionsmultiplizität für die Arbeit betrug 20. Expression von rekombinantem Protein wurde wie oben beschrieben bestimmt. Das in diesem Vektor produzierte rekombinante Protein trägt eine His-Markierung, und so wurde es an Ni²⁺-Affinitätssäulen gereinigt, die auch bereits oben beschrieben wurden. Das Protein besteht aus den Aminosäuren 10-180 und weist ein mittels SDS-PAGE ermitteltes Molekulargewicht von 20 kD auf.
Anschließend wurden zusätzliche eukaryotische Transfektanten produziert. Hierzu wurde die NY-ESO-1-Kodiersequenz aus dem oben beschriebenen pQE9-Vektor isoliert und dann in BamHI-HindIII-Stellen von eukaryotischer Expressionsvektor-pcDNA 3.1 kloniert. Als Nächstes wurden COS-7-Zellen mit diesem Vektor durch Kontaktie ren von Zellproben mit 150 ng des zuvor erläuterten Plasmids und 150 ng von Plasmid-pcDNA 1 Amp, das entweder cDNA für HLA-A2.1 oder cDNA für HLA-A1 enthielt, transfiziert. Es wurde das durchwegs bekannte DEAE-Dextranchloroquinverfahren verwendet. Die Zellen wurden dann bei 37°C 48 h lang inkubiert, wonach sie in einem CTL-Stimulationstest getestet wurden. Im Besonderen wurde hierzu der Test gemäß Traversari et al., Immunogenetics 35, 145-148 (1992), eingesetzt. Kurz zusammengefasst wurden 2.500 CTLs (NW38-IVS-1, siehe Beispiel 9, unten) in 100 μl RPMI, ergänzt mit 100% menschlichem Serum, und 25 E/ml rekombinantes IL-2 zu Mikrowells, die COS-7-Transfektanten (20.000 Zellen/Well) enthielten, zugesetzt. Nach 24 h wurden 50 μl Überstand aus jedem Well abgenommen, und TNF-α-Konzentrationen wurden in einem Standardtest, d.h. in einem, in dem Zytotoxizität gegen WEHI-164-Klon-13-Zellen getestet wurde, unter Verwendung von MTT bestimmt. Positive Zellen wurden in der Western-Blot-Analyse, die im nachfolgenden Beispiel beschrieben wird, verwendet.
Die verwendeten CTLs waren CTL NW38-IVS-1, hergestellt gemäß Knuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 3511-3515 (1984). Im Detail wurden gemischte Lymphozyten-T-Zellen-Kulturen durch Kombinieren von 10⁵ autologen NW38-MEL-1-Tumorzellen und 10⁶ peripheren Blutlymphozyten, die der Person entnommen wurden, erstellt. Das Cytokin IL-2 wurde zugesetzt, und die gemischte Kultur wurde eine Woche lang bei 37°C inkubiert. Tumorzellen wurden entfernt, und eine neue Aliquote von 5 × 10⁴ Tumorzellen wurde zusammen mit IL-2 zugesetzt. Dieser Vorgang wurde wöchentlich wiederholt, bis eine starke Antwort beobachtet werden konnte, wenn gegen ⁵¹Cr-markierte NW-MEL-38-Zellen getestet wurde. Die Antwort-T-Zellen wurden abgenommen und eingefroren, bis sie in weiteren Versuchen verwendet wurden.
Beispiel 8
Western-Blot-Analyse wurde dann unter Verwendung der oben beschriebenen Serumproben sowie der oben beschriebenen Zelllysaten, die aus der Zelllinie NW-MEL-38 entnommen wurden, und den oben beschriebenen COS-7-Transfektanten und dem gereinigten rekombinanten Protein, ebenfalls oben beschrieben, durchgeführt. Serumproben wurden zu verschiedenen Zeitpunkten der Therapie des Patienten entnommen. Es gab keinen Unterschied in den Resultaten.
In diesen Tests wurden 1 μg rekombinantes NY-ESO-1-Protein oder 5 μl Zelllysate von jedem Typ in SDS verdünnt und fünf Minuten lang gekocht und anschließend an einem 15%igen SDS-Gel Elektrophorese unterzogen. Nach dem Blotting über Nacht auf Nitrocellulose (0,45 μm) und Blockieren mit 3% BSA wurden die Blots mit Serum, verdünnt auf 1:1.000, 1:10.000 und 1:100.000, oder mit einem monoklonalen Antikörper gegen NY-ESO-1, verdünnt auf 1:50, als eine positive Kontrolle inkubiert. Der monoklonale Antikörper wurde gemäß Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 5915-5919 (1996), wie folgt beschrieben hergestellt. BALB/C-Mäuse wurden mittels fünf subkutaner Injektionen von rekombinantem NY-ESO-1-Protein in 2- bis 3-wöchigen Intervallen immunisiert. Die Immunisierungsformulierung umfasst 50 μg rekombinantes Protein in Adjuvans. Bei der ersten Injektion wurde komplettes Freundsches Adjuvans verwendet, und inkomplettes Freundsches Adjuvans wurde danach verwendet. Milzzellen wurden den immunisierten Mäusen entnommen und mit Maus-Myelomzelllinie SP2/0 fusioniert, um Hybridome zu bilden. Das repräsentative Hybridom E978 wurde zur Bildung von mAbs verwendet.
Nachdem die Hybridome gebildet waren, wurden sie kloniert, und ihre Überstände wurden gegen rekombinantes Protein unter Verwendung einer Standard-Festphasen-ELISA an Mikrotiterplatten gescreent. Der Test erfolgte gemäß Dippold et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 6114-6118 (1980). Eine Reihe von negativen Kontrollen wurden unter Verwendung von rekombinantem NY-ESO-1 ebenfalls durchgeführt. Serumantikörper, die sich an rekombinantes Protein banden, produziert durch E. coli wie oben beschrieben, wurden unter Verwendung von Ziege-Anti-Mensch-IgG, markiert mit alkalischer Phosphatase bei einer 1:10.000-Verdünnung, sichtbar gemacht und wurden dann mit NBT-Phosphat sichtbar gemacht. Nicht transfizierte COS-7-Zellen wurden auch als Kontrolle verwendet. Serum aus einer gesunden Person wurden ebenfalls als Kontrolle verwendet.
Starke Reaktivität gegen das rekombinante Protein wurde bei Serumverdünnungen bis hinunter zu 1:100.000 erkannt, und es wurde auch Reaktivität gegen Lysat von NW-MEL-38 beobachtet. Es wurde keine Reaktivität gegen die nicht transfizierten COS-7-Zellen gefunden, und das Serum aus einer gesunden Person zeigte auch keine Reaktivität.
Beispiel 9
Vier verschiedene Formen von NY-ESO-1 werden oben beschrieben, d.h. die durch Seq.-ID Nr. 1 in E. coli produzierte Form sowie eine, die aus den Aminosäuren 10-180 besteht, eine, die aus den Aminosäuren 10-121 besteht, und eine Form, die im oben erläuterten Baculovirus-Vektorsystem exprimiert wird und aus den Aminosäuren 10-180 besteht. Jede Form wurde in ELISAs gemäß der oben beschriebenen Arbeitsvorschrift verwendet. Alle Formen des Proteins erwiesen sich als gleich reaktiv mit Antikörpern, die verschiedenen Patienten entnommen wurden, sowie mit den oben erläuterten, murinen monoklonalen Antikörpern.
Beispiel 10
Bei der Untersuchung der COS-7-Transfektanten, siehe oben, und dem in diesem Beispiel erläuterten Test wurde eine zytolytische T-Zelllinie "NW38-IVS-1" verwendet. Diese "CTL" wurde über In-vitro-Stimulation der oben erwähnten peripheren Blutlymphozyten unter Verwendung der Tumorzelllinie NW-MEL-38 gebildet. Dies erfolgte unter Verwendung von Standardverfahren.
Die CTL wurde in einem Zytotoxizitätstest mit NW-MEL-38 (die HLA-A1-, -A2-positiv und NY-ESO-1-positiv war) zusammen mit zwei allogenen Zelllinien, die NY-ESO-1- und HLA-A2-positiv waren (SK-MEL-37 und MZ-MEL-19), einer Zelllinie, die MHC-Klasse-I-negativ ist (SK-MEL-19), einer Zelllinie, die HLA-A2-positiv, jedoch NY-ESO-1-negativ ist (NW-MEL-145), zusammen mit Kontrollzelllinien K562 und autologen, Phytohämagglutinin-stimulierten Blasten verwendet. Verschiedene Effektor/Target- Verhältnisse wurden verwendet, und Lyse von ⁵¹Cr-markierten Targetzellen war der gemessene Parameter. 5 zeigt dies.
Die Resultate wiesen darauf hin, dass die CTL NW38-IVS-1 sowohl die autologe Zelllinie NW MEL-38 als auch die allogenen Zelllinien, die HLA-A2- und ESO-1-positiv waren, lysierte. Somit war die CTL mit allogenen Materialien reaktiv. Siehe 6.
Beispiel 11
Da Patient NW38 HLA-A1- und HLA-A2-positiv war, wurden Versuche durchgeführt, um zu bestimmen, welches MHC-Molekül das präsentierende Molekül war.
Derselbe Versuch, der oben mit COS-7-Zellen beschrieben wurde, wurde durchgeführt, mit der Ausnahme, dass in diesen Versuchen darauf geachtet wurde, separate Gruppen von Co-Transformanten sicherzustellen, die entweder mit HLA-A1-cDNA oder mit HLA-A2-cDNA, jedoch nicht mit beiden, transformiert worden waren. Diese Resultate zeigen, dass die CTL-NW38-IVS-1 ausschließlich COS-7-Transfektanten, die sowohl NY-ESO-1 als auch HLA-A2 enthielten, lysierten. Siehe 6. Die Arbeit bestätigte auch die Spezifität der CTL, da die NY-ESO-1-negativen, HLA-A2-positiven Zellen, die in Beispiel 9 beschrieben wurden, für andere Moleküle positiv waren, die dafür bekannt sind, zu Peptiden verarbeitet zu werden, die von HLA-A2-Molekülen präsentiert werden.
Beispiel 12
Nachdem das präsentierende MHC-Molekül als HLA-A2 identifiziert worden war, wurde unter Verwendung des Modells von D'Amaro et al., Human Immunol. 43, 13-18 (1995), und Drijfhout et al., Human Immunol. 43, 1-12 (1995), ein Screening der Aminosäuresequenz auf NY-ESO-1 durchgeführt, um alle Peptide zu identifizieren, die diesem Motiv entsprechen. Peptide, die allen der dadurch abgeleiteten Aminosäuresequenzen entsprechen, wurden unter Verwendung herkömmlicher Verfahren synthetisiert und wurden anschließend in Zytotoxizitätstests gemäß Knuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 3511-3515 (1984), verwendet. Im Detail wurde die Zelllinie CEMX721.174.T2 (nachstehend als "T2" bezeichnet) verwendet, da sie keine Antigene gegen Peptide im Komplex mit MHC verarbeitet, was sie ideal für Versuche des hierin beschriebenen Typs macht. Proben von T2-Zellen wurden mit 100 μCi von Na(⁵¹Cr)O₄ unter Verwendung von Standardverfahren markiert und wurden dann dreimal gewaschen, woraufhin Inkubation mit 10 μg/ml Peptid und 2,5 μg/ml β2-Mikroglobulin folgte. Die Inkubation dauerte eine Stunde bei Raumtemperatur. Dann wurden Antwortzellen (100 μl einer Suspension von CTL NW38-IVS-1) in einem Verhältnis Effektor:Target von 90:1 zugesetzt und vier Stunden lang in einer wassergesättigten Atmosphäre mit 5% CO₂ bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Platten bei 200xg fünf Minuten lang zentrifugiert, 100 μl Überstand wurden entfernt, und Radioaktivität wurde gemessen. Der Prozentsatz von ⁵¹Cr-Freisetzung wurde gemäß bekannten Vorgehensweisen bestimmt. Es wurde erkannt, dass die Peptide SLLMWITQCFL (Seq.-ID Nr. 4), SLLMWITQC (Seq.-ID Nr. 5) und QLSLLMWIT (Seq.-ID Nr. 6) die drei besten Stimulatoren von CTLs waren. Vergleichbare Resultate wurden erhalten, wenn NW-MEL-38 und die Zelllinien SK-MEL-37 und MZ-MEL-19 als Targets verwendet wurden, wie oben bereits gezeigt.
Beispiel 13
Die Aminosäuresequenz des Proteins, für das Seq.-ID Nr. 1 kodiert, wurde auf Peptidsequenzen analysiert, die HLA-Bindungsmotiven entsprechen. Dies erfolgte unter Verwendung des von Parker et al., J. Immunol. 142, 163 (1994), beschriebenen Algorithmus. In der folgenden Tabelle sind die Aminosäuresequenz, das HLA-Molekül, an das sie sich wahrscheinlich bindet, und die Positionen in Seq.-ID Nr. 1 angegeben. Die resultierenden Komplexe sollten eine zytolytische T-Zellantwort hervorrufen. Dies könnte von Fachleuten gemäß Verfahren, die z.B. von van der Bruggen et al., J. Eur. J. Immunol. 24, 3038-3043 (1994), beschrieben werden, bestimmt werden.
Beispiel 14
Weitere Versuche wurden durchgeführt, um zusätzliche relevante Peptide zu identifizieren. In diesen Versuchen wurde eine stabile Tumorzelllinie, d.h. MZ-MEL-19, verwendet. Diese Zelllinie wurde von einem Patienten, der als MZ19 bezeichnet wird, unter Verwendung von Verfahren, die von Jäger et al., J. Exp. Med. 187, 265-269 (1998), hierin durch Verweis aufgenommen, beschrieben werden, erstellt. Eine zytolytische T-Zelllinie, d.h. MZ2-MEL-19-IVS-1, wurde unter Verwendung von MZ-MEL-19 und den in Beispiel 7, s.o., sowie von Jäger et al., s.o., beschriebenen Verfahren ebenfalls erstellt. Diese CTL lysierte die autologe Tumorzelllinie auf eine auf HLA-A2 eingeschränkte Weise. Dies wurde unter Verwendung von Standardverfahren bestimmt. Das von D'Amaro et al., s.o., beschriebene Modell wurde verwendet, um alle Sequenzen in ESO-1 zu identifizieren, die den HLA-A2-Bindungsmotiven entsprechen. Sechsundzwanzig Peptid wurden auf diese Weise identifiziert. Alle wurden unter Verwendung von herkömmlichen Verfahren synthetisiert, gereinigt und auf Integrität getestet. Die Peptide wurden dann synthetisiert und in den Versuchen, die im Folgenden beschrieben werden, getestet. MZ19-IVS-1 wurde zusammen mit den T2-Zellen, die in Beispiel 12 beschrieben wurden, verwendet. Die Peptide der Seq.-ID Nr. 4 und 5 banden sich an HLA-A2-Moleküle und wurden von CTL MZ19-IVS-1 erkannt, die die Zellen lysierte. Diese CTL erkannte auch Komplexe von HLA-A2 und dem Decapeptid:
LLMWITQCFL
(Seq.-ID Nr. 7), das an den Positionen 156-167 von Seq.-ID Nr. 1 zu finden ist.
Beispiel 15
Weitere Untersuchungen zielten darauf ab, zu bestimmen, ob CD4+-T-Helfer-Zellen Komplexe von MHC-Klasse-II-Molekülen und Peptiden erkannten.
Tumorzelllinie MZ-MEL-19 wurde als HLA-DR53-positiv typisiert. Somit wurde NY-ESO-1 unter Einbezug von Futaki et al., Immunogenetics 42, 299-301 (1995), die Bindungsmotive für HLA-DR53 beschrieben, gescreent. Insgesamt achtundzwanzig Peptide, die sich theoretisch an HLA-DR53 binden würden, und Antigene, die Zellen alleine präsentieren.
Periphere Blutlymphozyten ("PBLs") wurden aus zwei Patienten mit metastatischem Melanom isoliert, die als HLA-DR53-positiv typisiert worden waren.
Das Typisieren erfolgte unter Verwendung von herkömmlichen, im Handel erhältlichen Reagenzien. Ein Patient wurde als positiv für HLA-DRB1 (Allele 1501-05, 1601-1603, 1605 und 0701), HLA DRB4* (Allele 0101-0103) und DRB5* (Allele 0101) typisiert, während der zweite Patient als positiv für HLA-DRB1* (Allele 1401, 1407, 1408 und 0901), HLA-DRB3* (Allele 0201-0203) und DRB4* (Allele 0101-0103) typisiert wurde. Alle Allele von HLA-DRB4* werden gemäß Bodmer et al., Human Immunol. 34, 4-18 (1992), als NLA-DR53 bezeichnet.
Die PBLs wurden mit magnetischen Kügelchen, beschichtet mit geeigneten Antikörpern, um CD4+- und CD8+-T-Lymphozyten zu verarmen, behandelt. Die verbleibenden Zellen wurden in 24-Well-Platten bei 4 × 10⁶ Zellen/Well überimpft und wurden an den Kunststoff der Wells 24 h lang anhaften gelassen. Jegliche nicht-anhaftende Zelle wurde entfernt, und die verbleibenden Zellen wurden als Antigen-präsentierende Zellen verwendet. Diese Zellen wurden mit GM-CSF (1.000 E/ml) und IL-4 (1.000 E/ml) 5 Tage lang in flachbödigen 96-Well-Nitrocellulose-Platten, die über Nacht bei 4°C mit 5 μg/ml Anti-γ-Interferon-Antikörpern beschichtet worden waren, stimuliert. Die Zellen wurden bei 3,5 × 10⁵ Zellen/Well überimpft.
Die Zellen wurden dann mit 4 μg/Well Testpeptid oder 2 μg/Well des kompletten NY-ESO-1-Proteins als Kontrolle gepulst.
Anschließend wurden CD4+-T-Zellen (1 × 10⁵ Zellen/Well) in RPMI-1640-Medium, ergänzt mit 10% menschlichem Serum, L-Asparagin (50 mg/l), L-Arginin (242 mg/l) und L-Glutamin (300 mg/l), zusammen mit 2,5 ng/ml IL-2 auf ein Endvolumen von 100 μl zugesetzt.
Dieses Gemisch wurde 48 h lang bei 37°C in einer wassergesättigten Atmosphäre inkubiert. Dann wurden die Platten sechsmal mit einer Lösung von 0,05% Tween 20/PBS gewaschen, und anschließend wurde biotinylierter Anti-Interferon-γ-Antikörper bei 0,5 μg/ml zugesetzt. Der Antikörper wurde 2 h lang bei 37°C inkubiert, wonach die Platten mit Standardreagenzien 1 h lang entwickelt wurden. Das Substrat 3-Ethyl-9-aminocarbazol wurde zugesetzt und 5 min lang inkubiert, wobei Positive als rote Punkte dargestellt sind. Die Nummer an roten Punkten/Well wies auf die Häufigkeit von CD4+-T-Lymphozyten hin, die Komplexe von Peptid und HLA-DR53 oder HLA-DR53 und einem Peptid, das aus rekombinantem NY-ESO-1-verarbeitet war, erkannte. Als Kontrollen wurden Tests unter Verwendung von Reagenzien alleine (d.h. CD4+-Zellen alleine und dem Farbstoff alleine) durchgeführt.
Für die folgenden Peptide wurde erkannt, dass sie die CD4+-T-Lymphozyten sensibilisieren, sodass sie γ-Interferon freisetzen.
AADHRQLQLSISSCLQQL
VLLKEPTVSGNILTIRLT
PLPVPGVLLKEFTVSGNI
(Seq.-ID Nr. 8-10)
Diese drei Peptide entsprechen dem Motiv für Bindung an HLA-DR53, das von Futaki et al., s.o., beschrieben wird und das ein Ankerrest von Tyr, Phe, Trp oder Leu, gefolgt von Ala oder Ser drei Reste stromab, ist.
Für zusätzliche Peptide wurde erkannt, dass sie sich an HLA-DR53 binden.
Diese Peptide sind:
GAASGLNGCCRCGARGPE
SRLLEFYLAMPFATPMEA
TVSGNILTIRLTAADHRQ
(Seq.-ID Nr. 11-13).
Die obigen Beispiele beschreiben das Isolieren eines Nucleinsäuremoleküls, das für ein mit Speiseröhrenkrebs assoziiertes Antigen kodiert. "Assoziiert" wird hierin verwendet, da, während eindeutig ist, dass das relevante Molekül durch Speiseröhren krebs exprimiert wird, andere Krebsarten, wie Melanom, Brust-, Prostata und Lungenkrebs, das Antigen auch exprimieren.
Die Erfindung betrifft jene Nucleinsäuremoleküle, die für die Peptide der Seq.-ID Nr. 8, 9 oder 10 kodieren. "Stringente Bedingungen" wie hierin verwendet bezieht sich auf Bedingungen wie jene, die im US-Patent Nr. 5.342.774 erläutert werden, d.h. 18 h Hybridisierung bei 65°C, gefolgt von vier einstündigen Waschschritten bei 2 × SSC, 0,1% SDS und einem abschließenden Waschschritt bei 0,2 × SSC, noch bevorzugter 0,1 × SSC, 0,1% SDS, 30 min lang, sowie alternierende Bedingungen, die dasselbe Stringenzniveau hervorbringen, und stringentere Bedingungen.
Ebenfalls Teil der Erfindung sind Expressionsvektoren, die die Nucleinsäuremoleküle der Erfindung inkorporieren, in operabler Bindung (d.h. "operabel gebunden") an einen Promotor. Die Konstruktion solcher Vektoren liegt durchwegs innerhalb des Gebiets der Erfindung, wie auch die Transformation oder Transfektion von Zellen, um eukaryotische Zelllinien oder prokaryotische Zellstämme zu bilden, die für das Molekül von Interesse kodieren. Beispiele für Wirtszellen, die auf diese Weise verwendet werden können, sind COS-Zellen, CHO-Zellen, Hefezellen, Insektenzellen (z.B. Spodoptera frugiperda), NIH-3T3-Zellen und dergleichen. Prokaryotische Zellen, wie z.B. E. coli und andere Bakterien, können auch verwendet werden.
Wie aus der Offenbarung klar hervorgeht, können die Proteine und Nucleinsäuremoleküle der Erfindung zu diagnostischen Zwecken verwendet werden. Das hierin besprochene SEREX-Verfahren geht von einer Immunantwort auf ein Pathologieassoziiertes Antigen aus. Somit kann auf die relevante Pathologie über z.B. Testen einer Körperflüssigkeitsprobe einer Person, wie z.B. Serum, auf Reaktivität mit dem Antigen an sich getestet werden. Es wird angenommen, dass Reaktivität ein Hinweis auf mögliche Gegenwart der Pathologie ist, und das könnte auch ein Test auf Expression des Antigens mittels jedes beliebigen der herkömmlichen Nucleinsäure-Hybridisierungstests, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind und hierin nicht beschrieben werden müssen, erfüllen. Es könnte unter Verwendung von Standard-Immuntests auch auf Antikörper gegen das vorliegende Molekül getestet werden.
Eine weitere Analyse, wie oben erläutert, zeigt auf, dass das Molekül zu Peptiden verarbeitet wird, die Lyse durch zytolytische T-Zellen hervorrufen. Beispiel 7 zeigte, wie dieser Typ von Motivanalyse für HLA-A2-Moleküle durchgeführt werden kann. Es liegen bereits zahlreiche Arbeiten vor, die sich mit den Motiven verschiedener MHC- oder HLA-Moleküle befassen und hierin anwendbar sind. Somit ist ein weiterer Aspekt der Erfindung ein therapeutisches Verfahren, worin ein oder mehrere Peptide, das/die sich an ein HLA-Molekül an der Oberfläche von Tumorzellen eines Patienten bindet/binden, dem Patienten in ausreichender Menge verabreicht wird/werden, sodass sich die Peptide an die MHC/HLA-Moleküle binden und Lyse durch T-Zellen hervorrufen. Diese oben angeführte, beispielhafte Darstellung für HLA-A2-Moleküle ist keineswegs die einzige Art dieser Verabreichung, die verwendet werden kann. Jegliche Kombination von Peptiden kann verwendet werden, wie z.B. jene für andere HLA-Moleküle, wie oben beschrieben wurde. Diese Peptide, die alleine oder in Kombination verwendet werden können, sowie das gesamte Protein oder immunreaktive Teile davon können einer Person, die dieser Behandlung bedarf, unter Verwendung jeder beliebigen standardmäßigen Art von Verabreichung verabreicht werden, wie z.B. intravenös, intradermal, subkutan, oral, rektal und transdermal. Standardmäßige pharmazeutische Träger, Adjuvanzien, wie Saponine, GM-CSF und Interleukine und dergleichen können auch verwendet werden. Darüber hinaus können diese Peptid und Proteine mit dem aufgelisteten Material zu Vakzinen formuliert werden wie auch dendritische Zellen oder andere Zellen, die relevante MHC/Peptid-Komplexe aufweisen. Diese Peptide können auch verwendet werden, um multimere Komplexe von HLA/Peptiden, wie jene, die von Dunbar et al., Curr. Biol. 8, 413-416 (1998), beschrieben werden, zu bilden, worin vier Peptid/MHC/Biotin-Komplexe an ein Streptavidin- oder Avidinmolekül gebunden werden. Solche Komplexe können verwendet werden, um T-Zell-Vorläufer zu identifizieren und/oder zu stimulieren.
In ähnlicher Weise zieht die Erfindung Therapien in Betracht, worin das Nucleinsäuremolekül, das für die Peptide der Erfindung kodiert, in einen Vektor wie z.B. einen Adenovirus-basierten Vektor inkorporiert ist, um es in eukaryotische Zellen wie z.B. menschliche Zellen transfizierbar zu machen. In ähnlicher Weise können Nucleinsäuremoleküle, die für ein oder mehrere der Peptide kodieren, in diese Vektoren inkor poriert werden, die dann die Hauptkonstituenten von Nucleinsäure-basierten Therapien sind.
Jeder dieser Tests kann auch in Progression/Regressions-Studien verwendet werden. Es kann der Verlauf einer Anomalie, die Expression von NY-ESO-1 einbindet, einfach durch Beobachten der Konzentrationen des Proteins, seiner Expression und dergleichen unter Verwendung jedes beliebigen der oben erläuterten Verfahren überwacht werden.
Es sollte klar verständlich sein, dass diese Vorgehensweisen auch verwendet werden können, um die Wirksamkeit eines Therapieplans zu überprüfen. Im Wesentlichen kann ein Basislinienwert für das NY-ESO-1-Protein unter Verwendung eines beliebigen der oben erläuterten Tests herangezogen werden, ein gegebenes therapeutisches Mittel verabreicht werden und anschließend die Konzentration des Proteins hiernach beobachtet werden, wobei Änderungen der ESO-1-Konzentrationen als Indikatoren für die Wirksamkeit des Therapieplans zu betrachten sind.
Wie bereits zuvor angegeben, umfasst die Erfindung u.a. die Erkennung einer "integrierten" Immunantwort auf die Peptide der Erfindung. Ein Teilbereich hierzu ist die Fähigkeit, den Verlauf einer Krebstherapie zu beobachten. In diesem Verfahren, das Teil der Erfindung ist, erhält eine Person, die der Therapie bedarf, eine Impfung eines hierin beschriebenen Typs. Solch eine Impfung führt z.B. zu einer T-Zellen-Antwort gegen Zellen, die HLA/Peptid-Komplexe an ihren Zellen präsentieren. Die Antwort umfasst auch eine Antikörperantwort, möglicherweise ein Resultat der Freisetzung von Antikörper-hervorrufenden Proteinen über die Lyse von Zellen durch die T-Zellen. Somit kann die Wirkung einer Vakzine durch Beobachten einer Immunantwort kontrolliert werden. Wie bereits zuvor angegeben, kann ein Anstieg des Antikörpertiters oder der T-Zell-Zahl als ein Indikator für den Fortschritt mit einer Vakzine betrachtet werden, und umgekehrt. Somit ist ein weiterer Aspekt der Erfindung ein Verfahren zur Beobachtung der Wirksamkeit einer Vakzine nach deren Verabreichung durch Bestimmen der Konzentrationen von Antikörpern in der Person, die für die Vakzine selbst spezifisch sind, oder von großen Molekülen, von denen die Vakzine einen Teil darstellt.
Die Wirkungen einer Vakzine können auch durch Beobachten der T-Zellen-Antwort der Person, der die Vakzine verabreicht wird, gemessen werden. Zahlreiche Tests können verwendet werden, um die Vorläuferhäufigkeit von diesen in vitro stimulierten T-Zellen zu messen. Diese umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Cr-Release-Assays, TNF-Release-Assays, IFNγ-Release-Assays und ELISPOT-Assay und dergleichen. Änderungen in den Vorläufer-T-Zellen-Häufigkeiten können gemessen und mit der Wirksamkeit der Vakzine korreliert werden. Zusätzliche Verfahren, die verwendet werden können, umfassen die Verwendung multimerer Komplexe von MHC und Peptiden. Ein Beispiel für solche Komplexe ist das tetramere HLA/Peptid-Biotin-Streptavidin-System von Dunbar et al., Curr. Biol. 8, 413-416 (1998).
Die Identifikation von NY-ESO-1-Proteinen, die in pathologische Leiden wie Krebs eingebunden sind, wirft auch die Möglichkeit zahlreicher therapeutischer Ansätze zusätzlich zu jenen, die bereits oben erläutert wurden, auf. Die oben beschriebenen Versuche führen zu dem Ergebnis, dass Antikörper in Reaktion auf Expression des Proteins produziert werden.
T-Zellen können ebenfalls verabreicht werden. Es gilt anzumerken, dass die T-Zellen in vitro unter Verwendung von immunreaktiven Zellen wie dendritischen Zellen, Lymphozyten oder jeglichen anderen immunreaktiven Zellen aktiviert und anschließend in die zu behandelnde Person reperfundiert werden können.
Es gilt anzumerken, dass die Bildung von T-Zellen und/oder Antikörpern auch durch Verabreichen von Zellen, vorzugsweise behandelt, sodass sie nicht-proliferativ sind, die relevante T-Zellen- oder B-Zellen-Epitope für die Antwort, wie die oben erläuterten Epitope, präsentieren, erreicht werden kann.
Das HLA-A2-Molekül ist ein MHC-Klasse-I-Molekül, und T-Zellen, die auf Komplexe von Peptiden und Klasse-I-Molekülen reagieren, sind im Allgemeinen CD8⁺-Zellen.
Eine andere Untergruppe von T-Zellen, CD4⁺-Zellen, reagieren auf Komplexe von MHC-Klasse-II-Molekülen und Peptiden, und auf MHC-Klasse II eingeschränkte CD4⁺-T-Zellen-Antworten gegen rekombinantes NY-ESO-1, präsentiert von autologen kultivierten dendritischen Zellen, wurden in Melanom-Patienten nachgewiesen. Näher beschrieben wurden in den hierin nicht beschriebenen Resultaten CD4⁺-Zellen von anderen Zellen aus PBLs oder Serumproben unter Verwendung von bekannten Verfahren getrennt. Anschließend wurden sie mit dendritischen Zellen vermischt, die mit NY-ESO-1-Protein gepulst worden waren. Die Proliferation von CD4⁺-Zellen wurde beobachtet, was einen weiteren Aspekt zur hierin erläuterten, integrierten Immunantwort brachte.
Wie die Beispiele zeigen, wird ESO-1 auch zu Peptiden verarbeitet, die mit MHC-Klasse-II-Molekülen, HLA-DR53 insbesondere, Komplexe bilden. Diese Moleküle entsprechen dem von Futaki et al., s.o., beschriebenen Motiv, d.h. Tyr, Phe, Trp oder Leu, 3 Aminosäuren später gefolgt von Ala oder Ser. Solche Peptide müssen zumindest 18 Aminosäuren lang sein und sind vorzugsweise nicht mehr als 25 Aminosäuren lang. Vorzugsweise bestehen sie aus 18 Aminosäuren, wie beispielsweise aus Seq.-ID Nr. 8, 9, 10, 11, 12 und 13. Diese Peptide dienen dazu, HLA-DR53-positive Zellen zu identifizieren. Darüber hinaus können sie im Fall der Peptide der Erfindung, nämlich Seq.-ID Nr. 8, 9 und 10, verwendet werden, um Proliferation von T-Helfer-Zellen hervorzurufen, wie die Beispiele zeigen. Alle der oben genannten Anmeldungen bezüglich der auf MHC-Klasse I eingeschränkten Peptide sind auf diese auf Klasse II eingeschränkten Peptid anwendbar. Weiters können, da sich die Art der Immunantwort zwischen MHC-Klasse-I/Peptid-Komplexen und MHC-Klasse-II/Peptid-Komplexen unterscheidet, beide Typen von Peptiden, beispielsweise in Immunzusammensetzungen, kombiniert werden, wodurch eine kombinierte Immunantwort erzielt wird. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes NY-ESO-1- (Seq.-ID Nr. 1) Polypeptid, ausgewählt aus den Peptiden der Seq.-ID Nr. 8, 9 und 10, das sich an MHC-Klasse-II-HLA-DR53-Moleküle bindet.
Isoliertes Peptid nach Anspruch 1, worin das Peptid Erkennung und Proliferation von CD4+-Zellen stimuliert, die für Komplexe dieser Peptide mit HLA-DR53-Molekülen spezifisch sind.
Isolierter Komplex des MHC-Klasse-II-Moleküls HLA-DR53 mit einem Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2.
Zusammensetzung, umfassend ein isoliertes Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2 und zumindest ein Adjuvans.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül, bestehend aus einer Nucleotidsequenz, die für ein isoliertes Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2 kodiert.
Expressionsvektor, umfassend ein isoliertes Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 5, das operabel an einen Promotor gebunden ist.
Rekombinante Zelle, umfassend ein isoliertes Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 5 oder einen Vektor nach Anspruch 6.
In-vitro-Verfahren zur Stimulierung der Proliferation von T-Helfer-Zellen, umfassend das Kontaktieren einer T-Zell-hältigen Probe mit einem Komplex aus dem MHC-Klasse-II-Molekül HLA-DR53 und einem aus der aus Seq.-ID Nr. 8, 9 und 10 bestehenden Gruppe ausgewählten Peptid in ausreichendem Ausmaß, um Proliferation von T-Helfer-Zellen, die diesen Komplex erkennen, zu stimulieren.
Peptid, ausgewählt aus der Gruppe der Seq.-ID Nr. 8, 9 und 10, zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung eines HLA-DR53-positiven Patienten, wo bei die Behandlung in der Stimulierung von T-Helfer-Zellen über Komplexbildung des Peptids mit HLA-DR53 besteht.
Verwendung eines aus der aus Seq.-ID Nr. 8, 9 und 10 bestehenden Gruppe ausgewählten Peptids zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines HLA-DR53-Patienten, wobei die Behandlung in der Stimulierung von T-Helfer-Zellen über Komplexbildung des Peptids mit HLA-DR53 besteht.
In-vitro-Verfahren zur Diagnose eines Krebsleidens bei einer Person, umfassend das Kontaktieren einer immunreaktive Zellen enthaltenden Probe aus dieser Person mit einer Zelllinie, die mit einem isolierten Nucleinsäuremolekül transfiziert ist, das für ein Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2 kodiert, sowie das Bestimmen von Wechselwirkung der transfizierten Zelllinie mit der immunreaktiven Zelle, wobei eine solche Wechselwirkung ein Hinweis auf das Krebsleiden ist.
Verfahren nach Anspruch 11, worin die immunreaktive Zelle eine T-Helfer-Zelle ist.
In-vitro-Verfahren zur Bestimmung von Regression, Progression oder Ausbruch von Krebsleiden, umfassend das Beobachten einer Probe aus einem Patienten mit dem Krebsleiden auf einen Parameter, der aus der aus (i) einem Komplex aus einem Peptid nach Anspruch 1 oder 2 und einem MHC-Klasse-II-Molekül, (ii) T-Helfer-Zellen, die für diese Komplexe spezifisch sind, bestehenden Gruppe ausgewählt ist, worin der Wert dieses Parameters ein Hinweis auf die Progression oder Regression oder den Ausbruch des Krebsleidens ist.
Zusammensetzung, umfassend das isolierte Peptid von Seq.-ID Nr. 7 und zumindest ein anderes Peptid, dessen Aminosäuresequenz im Protein, für das Seq.-ID Nr. 1 kodiert, vorliegt und das das durch die Seq.-ID Nr. 8, 9 oder 10 definierte Peptid ist.