JP2002500002A - 癌胎児性抗原（ｃｅａ）のアゴニストおよびアンタゴニストペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明はヒト癌胎児性抗原（CEA）のアゴニストおよびアンタゴニストとして作用するペプチドの調製および使用に関する。CEAペプチドのアゴニスト、CAP1が開示され、そしてCEAに対する免疫反応の亢進におけるそれらの有用性が立証される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の分野 本発明は、ヒト癌胎児性抗原（CEA）のアゴニストおよびアンタゴニストとし て作用することが可能であるペプチドの調製および使用に関する。より詳細には
、多様な腫瘍性（neoplastic）状態に対し、本発明のアゴニストペプチドを、単
独で、またはrV-CEAなどの他の免疫原と共に初回抗原刺激および追加免疫プロト
コルで、免疫原として用いることができる。これらには、結腸直腸癌、肺癌、膵
臓癌、および乳癌が含まれうる。したがって、本発明はまた、癌に対するワクチ
ンの産生および使用にも関する。本発明のペプチドアゴニストはまた、養子移入
研究のため、例えばワクチン投与されている患者由来のT細胞の増殖を容易にす るのに用いることもできる。本発明のペプチドアンタゴニストは、T細胞が関与 するものなどの自己免疫反応がワクチン投与されている患者で起こった際、この
ような反応を抑制するのに有用性があることが見出される。したがって、本発明
はまた、自己免疫疾患、特にリンパ球および他の抗原提示細胞により媒介される
自己免疫疾患に対するワクチンの産生および使用にも関する。

【０００２】 発明の背景 現代の癌免疫療法の主要な問題は、腫瘍細胞の溶解を促進する明示されている
腫瘍関連抗原（TAA）からの細胞傷害性Tリンパ球（CTL）エピトープの同定であ る。ヒト癌の抗原の大部分は、腫瘍特異的ではなく、そして正常組織の細胞とは
対照的に悪性細胞で過剰発現されている。したがって、ヒトの癌に対する免疫は
大部分、主にすべての細胞種に質的に共通の自己分子に対して向けられる、有効
な免疫反応の成立に、かかっている。

【０００３】 ヒト癌胎児性抗原（CEA）は、大部分の結腸、直腸、胃および膵臓腫瘍（1）、
50%程度の***癌腫（2）および70%の肺癌腫（3）上に発現している180 kDの糖タ
ンパク質である。CEAはまた、胎児消化管組織にも、そしてより少ない程度に正 常結腸上皮細胞にも発現している。CEAの免疫原性は、はっきりしておらず、患 者において抗CEA抗体の存在を報告するいくつかの研究がある（4−7）一方、他 の研究では見られていない（8−10）。CEAは、最初に、1965年にヒト消化管の腺
癌における癌特異的胎児抗原として記載された（Gold, P.およびFreeman, S.O.
(1965) Exp. Med. 121:439-462）。それ以来、CEAはヒト胃腸管のほとんどすべ ての固形腫瘍において過剰に産生されている細胞表面抗原として性質決定されて
きている。ヒトCEAタンパク質に対する遺伝子がクローンされている（Oikawaら
(1987) Biochim. Biophys. Res. 142:511-518；欧州特許出願第EP 0346710号） 。

【０００４】 最近、CEAに対するヒトCTL反応の最初の証拠が報告された（11）。このCAP1ペ
プチドは、試験された多様なCEAペプチドの中で最も高いレベルのT2細胞結合を 示し、該T細胞の刺激は、細胞傷害性T細胞株の生成を生じた。我々は、HLA-A2に
対する結合、およびCEAを発現している組換えワクシニアウイルス（rV-CEA）で 免疫されている癌腫患者由来の末梢血単核細胞（PBMC）から特異的なCTLを生成 する能力に基づき、9量体のペプチドを同定し、CAP1（配列YLSGANLNLを持つ）（
SEQ ID NO:1）と名付けた。例えば、5人の患者由来の末梢血リンパ球（PBL）は 、rV-CEAでの免疫後、CAP1ペプチドに対するT細胞反応の徴候を示した。他の2つ
の研究室は、その後、ペプチドでパルスされている樹状細胞を抗原提示細胞（AP
C）として使用し、in vitroでCAP1特異的CTLを生成している（12）。また、最近
、アビポックス組換え体ALVAC-CEAで免疫されている癌腫患者由来のPBMCから、C
AP1特異的CTLを生成することが可能であることも報告されてきている（13）。い
くつかのグループもまた、抗CEA抗体の生成、および抗CEAモノクローナル抗体（
MAb）に対する抗Id（14）、組換えCEAタンパク質（15）、またはrV-CEA（16）の
いずれかでの免疫に続くCEA特異的増殖性T細胞反応を報告してきている。

【０００５】 何人かの研究者は、免疫優性（immunodominant）ペプチドでのPBMCのin vitro
刺激により、腫瘍関連抗原およびウイルス抗原に対するCTLを導入してきている 。gp100黒色腫抗原（17−19）、HIVポリメラーゼペプチド（20）およびパピロー
マウイルス腫瘍抗原E6（21）を用いた最近の研究は、ペプチド配列への修飾後、
免疫原性が亢進していることを立証した。これらの研究において、置換はアンカ
ー位であり、そしてネズミまたはヒトMHC抗原に対する結合を増加させることを 意図していた。このアプローチは、ウイルス抗原エピトープに関する、免疫原性
およびクラスI MHC（主要組織適合遺伝子複合体）分子に対するペプチド結合親 和性の間で、立証されている相関関係に基づいた（22）。

【０００６】 以前の研究者はまた、CEA断片でも研究している。このように、Shively（1989
）は、欧州特許出願公開（EP第0343946 A2号）において、特有のエピトープ（抗
体との反応性により定義されるような）を含む、多くのCEA断片を報告している 。後者のCEA断片は長さ177アミノ酸残基であり、CAP1の9量体配列を含む。しか し、CAP1配列を含む、より短いCEA断片は何ら記載されなかった。

【０００７】 つまり、rV-CEAのCEA特異的免疫反応を追加免疫するための剤としてのrV-CEA 単独の使用は、ワクシニアウイルスに対する免疫反応を刺激するという障害を被
る。しかし、rV-CEAおよびCAP1の新規の組み合わせは、それ自体、癌患者の治療
に対する「第二世代プロトコル」として示唆された。

【０００８】 免疫原性ペプチドが、保存的方式で修飾されている場合（例えば、疎水性アミ
ノ酸が疎水性アミノ酸に置換されている場合）、修飾されたペプチドは、分子の
形状、電荷および疎水性特性の維持に基づき、おそらく同様の免疫原性活性を有
することは、認められている原理である。

【０００９】 より詳細には、Maddenによる研究（33）は、T細胞認識の前駆段階であるMHC複
合体化のためのペプチドにおける特定のアミノ酸の優先を同定してきている。Ma
ddenと共に他の研究者も（31）ペプチドにおける特定のアミノ酸位置がT細胞認 識に利用可能であることを示唆している。

【００１０】 Skipperら（40）は、チロシナーゼの天然発生ペプチドエピトープの同定およ び性質決定を記載し、この中で、ペプチド配列はDNAから予測されるものとは異 なっている。この修飾ペプチドは、チロシナーゼ特異的ヒト細胞傷害性Tリンパ 球（「CTL」）による方が、直接の翻訳産物によるよりも効率よく認識され、そ して細胞表面上のHLA-A2.1分子により提示される2つのペプチドのただ1つである
。該修飾は、アスパラギンをアスパラギン酸で置換することである。著者は、該
アスパラギンはタンパク質合成中に小胞体においてN糖鎖付加され、そして翻訳 後、脱アミド化されると提唱している。

【００１１】 CAP1の場合、位置2、9、および1での一次および二次アンカーは、すでに好ま しいアミノ酸で占められており、そしてしたがって、異なるアプローチを取って
、TCRに対し結合する能力を亢進させるのを試みることにより、ペプチド免疫原 性を改善した。TCRと接触すると期待されるアミノ酸残基を改変することにより 、非MHCアンカー位置での置換を持つCAP1類似体（analog）を生成することが可 能であると思われた。こうした類似体は、その後、天然ペプチドよりも効率よく
CTLを刺激することが可能なT細胞エンハンサーアゴニストに相当する可能性があ
る。以前の結果は、いくつかのペプチド類似体は、抗原性ペプチドに対する反応
を阻害することにより、T細胞アンタゴニストとして作用することが可能である という概念を支持した（23−29）。こうした阻害は、TCR特異的であることが示 され、そしてMHCタンパク質に対するペプチド結合の競合によっては説明できな かった。同様に、ペプチドエンハンサーアゴニストは、MHC結合の増加を伴わず に、エフェクター機能を増加させる類似体であるであろう。したがって、我々は
、CAP1特異的CTLのT細胞受容体（TCR）と相互作用するであろうと我々が予測し た残基に対する単一アミノ酸置換を含む類似体のパネルを解析することにより、
CAP1免疫原性を増加させようと努めた。本発明は、ヒトCTLエピトープに関する 最初のこうした例である、CAP1ペプチドに対する新規T細胞エンハンサーアゴニ ストの構築に関する。

【００１２】 発明の概要 本発明は、CAP-1ペプチド配列由来の単一または二重アミノ酸変化であるペプ チドの同定に関する。CAP-1ペプチドは、癌胎児性抗原（本明細書において「CEA
」と称される）の高度に免疫原性であるエピトープとして同定されてきており、
CEA特異的細胞溶解性T細胞（「CTL」）反応を刺激することが可能である。CEAは
いくつかの種類の癌細胞に多量に見られる細胞表面抗原である。したがって、CA
P-1などの、細胞溶解性CTL反応を刺激することが可能なCEAペプチドは、癌免疫 療法において使用するための潜在的な免疫原である。

【００１３】 本発明のペプチドのいくつかは、CAP-1およびCEAのアゴニストである；すなわ
ち、これらは抗原提示細胞のMHC複合体およびT細胞のT細胞受容体（「TCR」）複
合体との間の相互作用を容易にする。したがって、これらのペプチドは、CEA発 現癌を伴う患者を治療するおよび／または該患者にワクチン投与するための、免
疫原として利用することが可能である。また、これらのペプチドは、癌患者への
T細胞の養子移入のため、培養中のT細胞を刺激するのに用いることも可能である
。4つのこうしたペプチドはアミノ酸配列： （1）YLSGADLNL（アゴニストCAP1-6D）（SEQ ID NO:2）； （2）YLSGADINL（アゴニストCAP1-6D、7I）（SEQ ID NO:3）； （3）YLSGANINL（アゴニストCAP1-7I）（SEQ ID NO:4）；および （4）YLSGACLNL（アゴニストCAP1-6C）（SEQ ID NO:5） を有する。下線のアミノ酸はCAP-1ペプチド配列からのアミノ酸変化を同定する 。ペプチドCAP1-6DおよびCAP1-6D、7Iは、本発明にしたがう特に好ましいペプチ
ドであり、そしてCAP-1活性に比べ亢進した活性を有する。ペプチドCAP1-7Iおよ
びCAP1-6Cは、CAP-1と同様の活性を有する。

【００１４】 本発明の他のペプチドは、CEAのアンタゴニストとして作用する；すなわち、 これらは、MHC−ペプチド複合体およびTCR複合体の相互作用を通じて起こる、CE
A特異的T細胞活性化および殺傷を減少させまたは除去する。

【００１５】 本発明は、アゴニストペプチドおよびCEAをコードする遺伝子を含むベクター または組換え的に産生されているCEAタンパク質を含むキットを含む。さらに、 該キットは、免疫刺激性分子を含んでもよい。

【００１６】 本発明はまた、アンタゴニストペプチドを単独でまたは免疫抑制性剤と組み合
わせて含むキットも含む。

【００１７】 本発明の別の目的は、1つまたはそれ以上のアゴニストペプチドを単独でまた は免疫刺激性分子と組み合わせて、および薬学的に許容しうるキャリアーを含む
薬剤組成物である。

【００１８】 本発明の別の目的は、1つまたはそれ以上のアンタゴニストペプチドを単独で または免疫抑制性剤と組み合わせて、および薬学的に許容しうるキャリアーを含
む薬剤組成物である。

【００１９】 本発明の本側面は、少なくとも1つのアゴニストペプチドをコードする核酸配 列または少なくとも1つのアンタゴニストペプチドをコードする核酸配列である 。

【００２０】 本発明の別の側面は、少なくとも1つのアゴニストペプチドをコードする核酸 配列または少なくとも1つのアンタゴニストペプチドをコードする核酸配列を含 むベクターおよびこうしたベクターを含む宿主細胞である。

【００２１】 本発明の別の側面は、癌免疫療法におけるこれらのペプチドの使用に関する。
アゴニストペプチドは、CEAに対する細胞溶解性免疫反応を刺激するのに有用で あり、腫瘍減少および／または予防を生じる。したがって、本発明はまた、癌ワ
クチンと共に該ペプチドで癌患者を治療する方法にも関する。アンタゴニストペ
プチドは、CEAまたはCAP-1に対する自己免疫反応を調節する方法において有用で
ある。

【００２２】 本発明のさらに別の側面は、アゴニストパルスされている抗原提示細胞である
。

【００２３】 発明の詳細な説明 本発明は、天然のCEAエピトープ、CAP-1（SEQ ID NO:1）のペプチドアゴニス トであり、SEQ ID NO:1のアンタゴニストでもある。このアゴニストは、CEAまた
はCEAエピトープを発現している癌腫細胞の増殖を抑制するかあるいはそれを殺 す、抗原特異的な細胞傷害性Tリンパ球を誘導する能力を特徴とする。本発明の アンタゴニストは、CEA特異的な免疫応答を抑制あるいは阻止するのに役立つ。 そのようなペプチドは、CAP-1またはCEAに対するどんな不必要な免疫応答を止め
るのにも用い得る。アンタゴニストのそのような利用の一例は、治療が腫瘍細胞
を根絶やしにし、CEAを発現している正常細胞を攻撃し始めるという、癌の免疫 療法の際に起こり得る、可能性のあるどんな自己免疫反応をも制御することであ
る。本発明に従い、アンタゴニストは正常組織に対する甚大な被害を都合よく阻
止するだろう。

【００２４】 本発明のペプチドアゴニストは、約8-13アミノ酸、好ましくは9-10アミノ酸を
含む。好ましい態様においては、本発明のアゴニストペプチドは、少なくとも1 個のアミノ酸置換を非アンカー部位に含む。一態様では、アゴニストは天然のCA
P-1（SEQ ID NO:1）と比較して位置6に置換を有する配列を含む。別の態様では 、アゴニストは天然のCAP-1（SEQ ID NO:1）と比較して位置7にアミノ酸置換を 有する配列を含む。さらに別の態様では、アゴニストは、天然のCAP-1と比較し て位置6および位置7にアミノ酸置換を含む。置換されたアミノ酸は、細胞傷害性
Tリンパ球上のTCR複合体とペプチド-MHC抗原リガンド複合体との相互作用を増強
するのに役立つ。そのように増強された相互作用の結果、細胞傷害性Tリンパ球 によるエフェクター機能がより大きくなる。

【００２５】 置換の一例には、位置6でのAspおよびCysあるいは位置7でのIleが含まれる。 一態様においては、ペプチドアゴニストには以下のアミノ酸配列が含まれる。 位置 1 2 3 4 5 6 7 8 9 天然CAP-1 ペプチド Y L S G A N L N L（SEQ ID NO:1） アゴニスト Y L S G A D L N L（SEQ ID NO:2） アゴニスト Y L S G A D I N L（SEQ ID NO:3） アゴニスト Y L S G A N I N L（SEQ ID NO:4） アゴニスト Y L S G A C L N L（SEQ ID NO:5） 本発明のアゴニストペプチドは、組み換えDNA技術あるいは化学ペプチド合成 により得ることができる。

【００２６】 アゴニストペプチドは、ほ乳動物、このましくはヒトにおいて免疫原として利
用するために薬学的に許容可能なキャリアーと組み合わせて薬剤組成物中に製剤
化することができる。この組成物には、免疫応答を増強するために１つあるいは
それ以上の他の成分がさらに含まれており、それらにはインターロイキン2、イ ンターロイキン6、インターロイキン12、インターフェロンガンマ、腫瘍壊死因 子アルファ、GM-CSF、B7.1、B7.2、ICAM-1、LFA-3、CD72、およびシクロフォス ファミドといった、免疫刺激分子が含まれるが、それらに限定はされない。

【００２７】 アゴニストペプチドは、CEA特異的免疫応答、好ましくは細胞性免疫応答を誘 導するのに効果的な量を動物個体に投与する。免疫源としての変異体rasペプチ ドの効力は、この技術分野で知られているようなin vivoあるいはin vitroのパ ラメーターにより決定し得る。これらのパラメーターには、抗原特異的細胞傷害
性アッセイ、CEAあるいはCEAエピトープを発現している腫瘍の縮退、CEAあるい はCEAエピトープを発現している癌細胞の阻害、サイトカイン産生等が含まれる が、これらに限定はされない。

【００２８】 少なくとも１つあるいはそれ以上のアゴニストペプチドは、ほ乳類のワクチン
接種あたり、約0.05 mgから約10 mg、好ましくはワクチン接種あたり約0.1 mgか
ら約5 mgの用量で投与し得る。いくつかの用量を、表示してあるように数週間の
期間に渡って提供し得る。一態様においては、1ヶ月毎に3ヶ月間、ある用量を提
供する。アゴニストペプチドは、リポソームに取り込まれて、単独で、あるいは
アジュバントと組み合わせて、免疫応答を増強すると知られている、サイトカイ
ン、生物応答修飾物質、あるいはこの技術分野で他の試薬と共に投与し得る（ア
メリカ合衆国特許番号、5,643,599; 5,464,630; 5,059,421; 4,885,172）。アジ
ュバントには、RIBI Detox^TM、QS21、ミョウバンおよび不完全フロイントアジュ
バントが含まれるが、これらに限定はされない。一態様においては、変異体ras ペプチドをDetox^TM（RIBI Immunochem Research, Hamilton, MT）と組み合わせ て投与し得る。RIBI Detox^TMには、スクアレンおよびtween 80との水中油型の懸
濁液として調製された、Mycobacterium phlei由来の細胞壁骨格およびSalmonewl
la minnesota R595由来のモノホスホリル脂質Aが活性成分として含まれている。

【００２９】 アゴニストペプチドは、ペプチドの免疫原性を増強するためにヘルパーペプチ
ドあるいは巨大なキャリアー分子と結合させることもできる。これらの分子には
、インフルエンザペプチド、破傷風毒素、破傷風毒素CD4エピトープ、シュード モナス外毒素A、ポリ-L-リジン、脂質尾部、小胞体（ER）シグナル配列および類
似のものが含まれるが、これらに限定はされない。

【００３０】 本発明のペプチドは、この技術分野で是認されている手法を用いて免疫グロブ
リン分子と結合させることもできる。免疫グロブリン分子は、腫瘍細胞上にはあ
るが、正常細胞上にはないかあるいは極めて低量しかない表面受容体に特異的で
あり得る。免疫グロブリンは、特定の組織に特異的であってもよい。そのような
ペプチド-免疫グロブリン結合体により、特異的な組織および/または細胞へのペ
プチドのターゲッティングが可能になる。

【００３１】 ペプチド特異的な免疫応答をほ乳類個体に誘導するための、アゴニストペプチ
ドのもう一つの効果的な形態は、アゴニストペプチドをパルスした抗原提示細胞
である。抗原提示細胞には、樹状細胞、Bリンパ球、単球、マクロファージおよ び類似のものが含まれるが、これらに限定はされない。好ましい態様においては
、アゴニストペプチドをパルスした抗原提示細胞は、樹状細胞である。

【００３２】 本発明は、効果的な量のアゴニストを単独で、あるいは免疫刺激分子および/ またはアジュバントと組み合わせて、あるいはリポソーム製剤中で用いて、供給
源由来のリンパ球を刺激することにより、CEAおよびアゴニストペプチド特異的 な細胞傷害性Tリンパ球をin vivoあるいはin vitroで生み出す方法をも提供する
。リンパ球の供給源には、末梢血、腫瘍組織、リンパ節、および胸膜液あるいは
腹水および類似のものといった滲出液が含まれるが、これらに限定はされない。

【００３３】 本発明の、CEAおよびアゴニストペプチド特異的な細胞傷害性Tリンパ球は、CE
Aアゴニストあるいはペプチドと免疫反応性がある。この細胞傷害性Tリンパ球は
、腫瘍細胞および癌の発生を抑制し、CEAあるいはそのエピトープを発現してい る腫瘍細胞あるいはアゴニストを発現している腫瘍細胞の増殖を抑制するか、あ
るいは殺す。この細胞傷害性Tリンパ球は、抗原特異的であることに加え、MHCク
ラスI拘束性である。一態様においては、細胞傷害性Tリンパ球はMHCクラスI HLA
-A2拘束性である。細胞傷害性Tリンパ球はCD8⁺の表現型を有する。

【００３４】 CEAあるいはCEAエピトープを発現している癌腫細胞を保有する、選択された患
者に、適切なペプチドアゴニストを混ぜたDETOX^TMアジュバントを、1ヶ月間の間
隔で3回まで皮下にワクチン接種し、ペプチドアゴニストをex vivoであらかじめ
パルスした自己由来の末梢血単核球を単独であるいはペプチドアゴニストと組み
合わせて、癌腫患者にワクチン接種することもできる。抗CEA T細胞応答は、増 殖アッセイにより測定して評価する。

【００３５】 本発明のCEAアゴニストペプチドによるワクチン接種は、高度に特異的かつ全 身性の抗CEA細胞性免疫応答を誘導する。さらに、そのようなMHCクラスI拘束性 のアゴニストペプチドの開発は、癌患者において特異的なCD8⁺ CTLの誘導および
増殖のために用い得る、能動的（すなわちワクチン接種）および受動的（すなわ
ち細胞養子移入のためのex vivo拡大）免疫療法の双方に重要に密接に関係して いる。

【００３６】 結腸癌、肺癌、膵臓癌、子宮内膜癌、乳癌甲状腺癌、メラノーマ、口腔癌、喉
頭癌、精上皮腫、肝細胞癌、胆管癌、急性骨髄芽球性白血病、基底細胞癌腫、扁
平上皮癌腫、前立腺癌および類似のものを含むがそれらに限定はされない、CEA あるいはそのエピトープを発現している固形腫瘍を持った患者は、アゴニストペ
プチドによる免疫の恩恵を受ける。本発明のアゴニストペプチドを用いた治療に
敏感に反応する患者は、CEAあるいはCEAエピトープを有する癌を持った患者であ
る。

【００３７】 ペプチドは、GMP条件下で化学的に合成し、HPLCにより>95％の純度にまで精製
し、凍結乾燥することができる。薬剤組成物は、ペプチドを塩化ナトリウムなど
の薬学的に許容可能なキャリアーとともに再構成することにより製剤化する。一
例においては、それぞれミリリットルの溶液には1500 μgのアゴニストペプチド
と9.0 mgの塩化ナトリウムが含まれる。

【００３８】 アゴニストペプチドをアジュバントと投与する場合は、患者に投与する直前に
ペプチドをアジュバントと混ぜるのが望ましい。

【００３９】 アゴニストペプチドは、皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、静脈内および類似のも
のを含むがそれらに限定はされない様々な経路で患者に投与することができる。
一態様においては、アゴニストペプチドは皮下に投与する。ペプチドは、１つあ
るいはそれ以上の部位で患者に投与し得る。一態様においては、ペプチドは、単
独であるいはアジュバントと組み合わせて、三角筋、大腿および腹の上の3箇所 に皮下投与する。

【００４０】 免疫応答を誘導するもう一つの方法では、アゴニストペプチドをパルスした抗
原提示細胞を、抗原特異的な免疫応答を誘導するのに効果的な量で患者に投与す
る。抗原提示細胞には、樹状細胞、Bリンパ球、単球、マクロファージおよび類 似のものが含まれるが、これらに限定はされない。一態様においては、樹状細胞
をRomani, N.ら（1994）に記載の方法により患者から単離する。単離された樹状
細胞をアゴニストペプチドと共に約0.5から約3時間の間、in vitroで培養し、洗
浄して、結合していないペプチドを除く。アゴニストペプチドをパルスした樹状
細胞を、約10⁶から約10⁹個の樹状細胞の濃度で患者に戻し移入する。そのような
濃度は、腫瘍細胞の増殖を抑制するかあるいは殺すことのできるアゴニストペプ
チド特異的な細胞傷害性Tリンパ球の誘導を含む、患者において免疫応答を誘導 するのに効果的である。

【００４１】 免疫した患者における抗腫瘍応答を決定するための基準は以下の通りである。 1. 完全寛解（CR）：腫瘍のあらゆる証拠の完全な消失および最低4週間の、 異常分析の正常レベルへの復帰。

【００４２】 2. 部分的応答（PR）：少なくとも4週間、どの病変部の進行もなく、いかな る新たな病変部の出現もない状態で、測定した全ての病変部の垂直直径（perpen
dicular diameters）の結果の合計の、少なくとも50％の減少。

【００４３】 3. 安定した疾患（SD）：部分的応答あるいは進行に必要とされるものを満た
すには小さすぎるような、測定可能な疾患の変化であり、すくなくとも12週間、
新たな病変部が全く出現しない。疾患の悪化はない場合がある。

【００４４】 4. 進行性の疾患（PD）あるいは再発：進行性の疾患であるとみなされるため
には、以下の基準のうちのどの１つも満たされていなければならない： 悪性疾患の新たな領域の発生（測定可能あるいは触診可能） 測定可能な悪性疾患の処理前の領域の増加（>25％）。

【００４５】 アゴニストペプチドによる免疫化に対する免疫学的応答は、ワクチン接種の前
後の、in-vitro T細胞増殖アッセイおよび/またはin-vitro T細胞細胞傷害性ア ッセイにより評価する。

【００４６】 本発明には、腫瘍特異的なアゴニストペプチドに対する、T細胞増殖および細 胞傷害性T細胞株の樹立のためのin vitro免疫が含まれる。末梢血単核球（PBMC ）、リンパ節組織（LNT）、あるいは腫瘍浸潤リンパ球（TIL）由来のペプチド特
異的なT細胞の、アゴニストペプチドおよびIL-2によるin vitro培養は、CEAおよ
びアゴニストペプチド特異的なT細胞を生み出す。これらのT細胞を、アゴニスト
ペプチドにより感作されたAPC（EBVトランスフォームされた自己のB細胞あるい は自己の腫瘍細胞を本明細書中で記載した）に対する細胞傷害性に関して分析す
る。生み出されたT細胞クローンを、CD3、CD4、およびCD8の発現に関してフロー
サイトメトリーにより表現型を特徴づける。CEAあるいはCEAエピトープを発現し
ている腫瘍細胞を抑制あるいは殺すために、アゴニストペプチド特異的な細胞傷
害性リンパ球を、患者に養子移入することができる。次に、好ましくはアジュバ
ントと共にアゴニストペプチドで、患者を再免疫し得る。

【００４７】 概して、例えば、30から60分間に及ぶ、それぞれ約200から約250 mlの、1から
3回の注入など、注入毎に約1 x 10⁵と2 x 10¹¹個の間の細胞傷害性T細胞を投与 する。注入の完結後、患者をインターロイキン2（IL-2）といった生物学的応答 修飾物質にて処理し得る。IL-2の場合、組み換えIL-2を静脈内に、8時間毎にkg 体重あたり720,000 IUの用量で投与する。抗原特異的な細胞傷害性T細胞の患者 への養子移入後、in vivoでT細胞の数をさらに拡大させるために、細胞傷害性T 細胞を感作するのに用いたアゴニストペプチドにて患者をさらに処理し得る。

【００４８】 本発明は、アゴニストペプチドをコードするDNA配列およびその変異体を包含 する。

【００４９】 一態様においては、アゴニストペプチドをコードするDNA配列は、以下の配列 、 TAC CTT TCG GGA GCG AAC CTC AAC CTC (SEQ. ID No:6) Tyr Leu Ser Gly Ala Asn Leu Asn Leu (SEQ. ID No:1) を含むDNA配列の変異体である。

【００５０】 SEQ. ID No:6の変異体の１つには、コドンCTC（位置7のLeu）の代わりにコド ンATC（Ile）が含まれるが、それに限定はされない。SEQ. ID No:6の別の変異体
には、コドンAAC（位置6のAsn）の代わりにコドンTGT（Cys）が含まれるが、そ れに限定はされない。

【００５１】 別の態様においては、アゴニストペプチドをコードするDNA配列には以下のも の、 TAC CTT TCG GGA GCG GAC CTC AAC CTC (SEQ. ID No:7) Tyr Leu Ser Gly Ala Asp Leu Asn Leu (SEQ. ID No:2) およびその変異体が含まれる。

【００５２】 さらに別の態様においては、アゴニストペプチドをコードするDNA配列には、 以下のもの、 TAC CTT TCG GGA GCG GAC ATC AAC CTC (SEQ. ID No:8) Tyr Leu Ser Gly Ala Asp Ile Asn Leu (SEQ. ID No:3) またはその変異体が含まれる。

【００５３】 本発明の範囲内には、機能的に等価なアゴニストペプチドあるいは増強された
免疫原性を有するペプチドをもたらす修飾を提供する、コドン縮重性に基づく保
存的な置換が含まれる。

【００５４】 本発明はさらに、アゴニストペプチドをコードするDNAを含むベクターおよび プラスミドを提供する。このベクターには、E. coliプラスミド、リステリアベ クターおよび組み換えウイルスベクターが含まれるがこれらに限定はされない。
組み換えウイルスベクターは、アゴニストペプチドをコードするDNA配列を含む 、オルトポックスウイルス、アビポックスウイルス、カプリポックスウイルス、
スイポックスウイルス、ワクシニア、バキュロウイルス、ヒトアデノウイルス、
SV40、ウシパピローマウイルス等を含むがそれらに限定はされない。

【００５５】 組み換えアゴニストペプチドは、Bei et al J. Clin. Lab. Anal. 9:261-268
(1995)の方法に従い、バキュロウイルス発現系を用いて得ることができる。組み
換えウイルスベクターは、アメリカ合衆国特許番号5,093,258；WO96/10419；Cep
ko et al Cell 37:1053-1062 (1984)；Morin et al Proc. Natl. Acad. Sci USA 84:4626-4630 (1987)；Lowe et al Proc. Natl. Acad. Sci USA 84:3896-3900
(1987)；Panicali & Paoletti, Proc. Natl. Acad. Sci USA 79:4927-4931 (198
2)；Mackett et al, Proc. Natl. Acad. Sci USA 79:7415-7419 (1982)；WO 91/
19803；Perkus et al Science 229:981-984 (1985)；Kaufman et al Int. J. Ca ncer 48:900-907 (1991)；Moss Science 252:1662 (1991)；Smith and Mos, Bio Techniques , Nov/Dec, p.306-312 (1984)；アメリカ合衆国特許番号4,738,846；
Sutter and Moss Proc. Natl. Acad. Sci USA 89:10847-10851 (1992)；Sutter
et al Virology (1994)；およびBaxby and Paeletti Vaccine 10:8-9 (1992)な どの、この技術分野で知られている方法により構築することができる。

【００５６】 ベクターあるいはプラスミドにより運ばれるアゴニストペプチドをコードする
DNAを発現し得る宿主細胞は、原核および真核の宿主細胞であり、E. coli、リス
テリア、バチルス種、COS細胞、Vero細胞、トリ胚、線維芽細胞、腫瘍細胞、抗 原提示細胞および類似のものが含まれるが、それらに限定はされない。宿主細胞
が抗原提示細胞の場合は、宿主細胞はさらにMHCクラスI分子を発現していなけれ
ばならない。

【００５７】 我々は、最近、rV-CEAで免疫した患者におけるCEAに対するCTL応答の証拠を報
告した（11）。(a)HLA-A2に対する強い結合する、および(b)正常組織上に発現し
ているCEA遺伝子ファミリーのうちの他のメンバーとの非同一性のため、9-merの
ペプチドCAP1を用いてCTLはin vitroで拡大させた。同じ患者の免疫前血液では 増殖しなかったのに対し、CTLが免疫後の患者のPBMCから生じた。加えて、CAP1 をパルスした樹状細胞は、免疫していない癌患者の末梢血由来の-A2拘束性CTLの
in vitroの増殖を刺激した（12）。最終的に、全長CEA mRNAをコードする樹状細
胞で刺激することによりCTLをin vitroで生じさせた場合は、CAP1に対する細胞 傷害性は、他の6個の-A2結合性CEAペプチドに対する活性よりも高かった（S. Na
ir and E. Gilboa、私信あるいは未発表の観察）。そのような結果は、CAP1はCE
A分子の免疫上優位なエピトープであるという意見を指示する。

【００５８】 本発明は、非アンカー位置にアミノ酸置換を導入して本発明のアゴニストペプ
チドを形成することにより、CAP1ペプチドの免疫原性を改善することを意図する
。エフェクターとしてT-Vac8 CTLを用いる場合は、類似体CAP1-6DはCAP1そのも のよりもずっとよく、溶解する標的細胞を感作した。さらなる研究により、第二
の-A2拘束性、CAP1特異的CTLであるT-Vac24の細胞溶解活性は、CAP1-6Dにより、
CAP1によるのと同程度かあるいはそれよりも大きかったということが示された。
これらの増強された反応性の証明は、クラスI MHCによる改善された提示という ことでは説明できない。結局、CAP1-6Dは、癌腫患者および正常なドナーの両者 のPBMCから、in vitroでCTLを刺激するのに用いることができた。本発明に先行 して、この同じ方法論を用いて正常なドナーから抗CAP-1 CTLを刺激するという 試みは、成功しなかった。本発明は、天然の配列による刺激が特異的な細胞傷害
活性を生み出すのに失敗した、天然のCAP1による刺激とは対照的に、CAP1-6Dで 正常なドナーを刺激することに関連する。対照的に、CAp1-6Dによる刺激により 、特異的な抗CAP1ペプチド反応性も抗腫瘍反応性をも有するいくつかのCTLが生 み出された。したがって、類似体ペプチドCAP1-6Dは天然のCAP1よりも効果的に 、CAP1特異的なヒトCTLの集団を選択することができる。そのようなアゴニスト は、CEAを発現している癌腫に対するT細胞指向性のワクチンの設計に応用できる
だろう。

【００５９】 本発明は、養子免疫療法のための腫瘍特異的T細胞のより効率的な誘導および 拡大にも関連する。近年、クラスI HLA抗原によりCTLに提示され得る腫瘍関連抗
原ペプチドの特徴づけにおいて多大な進展が達成された。点突然変異したras（3
5、36）、p53（37、38）あるいはβ-カテニン（39）などの、変異がネオ抗原を 生み出すような例では、ワクチン接種戦略は、免疫系は一度も出会ったことのな
い抗原に対しては“寛容”ではないという仮説のもと、新規の配列を標的とする
。さらに最近では、ネオ抗原は翻訳後脱アミノ化によっても生じ得るということ
が提唱された（29、40）。しかし、多くの例では、癌療法の意図した標的はネオ
抗原ではなく、むしろ、悪性細胞により過剰発現されたあるいは異所性に発現さ
れた、正常の腫瘍胎児性あるいは分化抗原である。それがCEAの場合である（41 ）。そのような状況では、“寛容”に頼ったモデルから、免疫系はこれらの抗原
に出会ったことがあり、それらに対してはあまり応答できないと予想される。こ
の古典的な概念は近年、過剰発現した分化抗原、癌遺伝子、および癌抑制遺伝子
（37、38、42-44）に対して引き出される免疫に関する多数の報告により疑われ ている。それにも関わらず、目的の抗腫瘍活性を持ったT細胞を誘導し拡大させ ることはしばしば経験的に困難であり、それゆえ、CTLを誘導するための新しい 戦略を工夫することが望まれている。

【００６０】 いくつかのクラスII結合性ペプチドが、置換によりクラスII抗原への結合を増
加させることなくマウスおよびヒトのThクローンの応答を増強すると記載された
（29、45-47）。しかし、ヒトのクラスIペプチドの中では、CTLの誘導に関して 記載されている唯一の置換は、HLAに対する結合を増加させるものであった（17-
20）。それらの研究における置換は、クラスI MHC抗原に対する結合モチーフを 規定する一次あるいは二次アンカー位置にある残基を目的としていた。非アンカ
ー位置を目的とした置換（19）であっても、HLA-A2に対する結合性をあげること
によりその増強効果を達成していた。本報告中の類似体CAP1-6Dは、異なる種類 の置換CTLペプチド、T細胞受容体によるペプチド-MHCリガンドの認識を増強し、
結合を上昇させることなくより大きなエフェクター機能を生み出すアゴニストで
あるとみられるものの典型である。我々の知る限り、これは、ヒトのCTLについ て記載された最初のそのようなエンハンサーアゴニストペプチドである。

【００６１】 CAP1-6Dの存在下における標的の溶解感受性の上昇は、よりよい抗原提示によ るものではないようである。結合実験により、HLA-A2は天然のCAP1を提示し、類
似体CAP1-6DおよびCAP1-7Iをほぼ同程度に提示することが示される。別の可能性
は、CAP1-6Dは１つ以上の対立遺伝子により提示されるT-Vac8はペプチド-MHC複 合体に対して無差別であるために、活性の上昇を示す、というものである。しか
し、T-Vac8、T-Vac24、および免疫していない患者由来のCTLは、CAP1-6Dにより 、よりよい溶解を示した。HLA-A2は用いた標的上の唯一のクラスI MHCであるた め、改善された溶解は別のクラスI MHCの補充では説明できない。

【００６２】 複数のドナー由来の抗CAP1 CTLはアゴニスト交差反応性を示すため、多数の-A
2個体由来のCTLの増殖を刺激するのにCAP1-6Dを用いることができたということ があり得る。T-Vac8とT-Vac24の間の、アゴニストに対する応答の程度における 極めて明確な違いにより、我々は励まされている；このことは、それぞれのエフ
ェクターはことなるTCR遺伝子区分を利用しているいうこと、および、それにも 関わらずそれらは天然の配列およびCAP1-6D置換の両方を認識することができる ということを意味している。CAP1-6Dの、異なるT細胞受容体を発現しているT細 胞を伴うアゴニストとして作用する能力は、治療能力を明らかに拡大させる。し
たがって、本発明は、アゴニストで刺激し、その結果、免疫していない個体にお
いて正常の配列を認識するT細胞を誘導することにも関連する。そのような個体 は、おそらく、修飾された配列には一度も出会ったことがないだろし、そして、
アゴニストはT細胞応答を誘発することにおいてより効率的であるため、そのよ うなアゴニストは天然の配列に基づいた免疫原よりも容易にCTLを選択すること ができるだろう。

【００６３】 ペプチド由来のCTLは有用な治療剤であるためには、内在性の抗原を発現する 腫瘍細胞を溶解することができるということを証明することが必須である（48、
49）。以前（11）に、我々は、腫瘍細胞はCEAを加工し、CAP1による刺激によっ て生み出されたCTLにより認識される抗原を提示しているということを示した。 本発明に従い、CAP1-6Dによる刺激によって正常なドナーから増殖させたCTLも、
同種異系のCEA陽性、HLA-A2陽性の腫瘍細胞を認識することができる。これらのT
細胞は-A2陰性の腫瘍細胞あるいはCEA発現のない-A2陽性の細胞を認識できない 。

【００６４】 我々は、CAP1-6Dアゴニストによって選択されるCTLは、その後に天然のCAP1配
列による刺激によって維持することができるということも示した。患者のCTLは 、in vivoで能動的な免疫によって樹立されたか、ex vivo拡大後に養子移入され
たかによらず、天然の配列のみに出会うとみられるため、このことは重要な知見
である。これにより、CTLをin vivoで延長した期間維持することができる。

【００６５】 CAP1を選択し試した元々の理由のうちの１つは、ヒトゲノム中の報告されてい
る他の配列と同一でないことであった。それゆえ、達成されたあらゆる免疫応答
は他の抗原を持った正常組織を傷害しないだろうと予想された。この理由により
、ペプチドCAP1-6DおよびCAP1-7Iに関してタンパク質データベースの同様の検索
に着手し、それらがGenebank（Genetics Computer Group, Madison, WI）の他の
場所にはヒトの配列としては報告されていないことが明らかになった。しかし、
2つの類似の配列、YLNVQDLNL（SEQ. ID No: 9）およびYLHDPEFNL（SEQ. ID No:
10）がそれぞれアフリカ豚コレラウイルスおよび麻疹ウイルス由来の抗原につい
て報告されている。これらの配列はHLA-A2の共通モチーフに一致しており、それ
ゆえ感染された個体にCAP1と交差反応性の抗原を発現させる。興味深い可能性の
１つは、何人かの患者に抗CAP1 CTLが存在することはエピトープ模倣の一例を表
しているということである（50）。

【００６６】 最近の2つの報告では、修飾されたアスパラギン残基はクラスI MHCペプチドの
免疫原性を増強し得ると示唆している。Skipperら（40）はリンパ球腫瘍細胞混 合培養にて誘導したCTLを用いて、メラノーマ細胞の抽出物中の抗原を同定した 。抗原性のある1つのペプチドは、チロシナーゼ由来の配列と9位置中8個が同一 であり、位置3のアスパラギンがアスパラギン酸に置き換わっていた。合成ペプ チドを用いて分析したところ、CTLは遺伝的に予想されたアスパラギンを含むペ プチドに対してよりもアスパラギン酸ペプチドに対してより活性であった。これ
らの著者らは、翻訳後脱アミノ化が正常の分化抗原から抗原性のあるペプチドを
生み出し得ると予想している。最近、Chenら（51）は、アスパラギンを含む抗原
性ペプチドの安定化されたサクシミド誘導体に対するマウスCTLの誘導を報告し ている。これらのCTLは天然のアスパラギンペプチドでパルスした標的を殺すこ とができるが、その感受性は低かった。彼らは、in vivoおよびin vitroにおけ るタンパク質の脱アミノ化は、免疫応答を誘導することができる、改変された自
己リガンドを表す、一過性のサクシミド中間体を作りだし得るという可能性をあ
げている。KershおよびAllen（52）は、ヘモグロビンペプチド中のTCRに接触す るアスパラギンをアスパラギン酸と置き換え、マウスThクローンに対する応答性
を完全に破壊した。現在のところ、我々はCAP1-6Dの増強された反応性が天然の 配列の脱アミノ化により、その結果CAP1によって我々が検出する反応を感作する
という可能性を排除できない。しかし、免疫後のCTLを誘導したのと同じ患者の 免疫前のPBMCから抗CAP1 CTLを誘導することが繰り返し不成功であったことが、
これに対する反論である。同様に、予想される脱アミノ化は、T-Vac8 CTLによる
CAP1-6CあるいはCAP1-7Iなどの他の類似体の認識を説明できなかった。それより
も、T-Vac8およびT-Vac24の両方に由来するT細胞受容体も、本明細書中で記載す
る新しい株に由来するものも、天然のCAP1配列からいくらかの偏りがあることを
認識し得るということの方が原因であるとみられる。

【００６７】 まとめると、T細胞受容体と潜在的に相互作用すると予想される位置にアミノ 酸置換を持った免疫上優位なCEAペプチドの類似体の合成により、我々はエンハ ンサーアゴニストを同定できた。このアゴニストは、2つの異なるCEA CTLによっ
て認識され、それらのうちの一方の活性を2-3オーダーの規模で上昇させる。ア ゴニストは、天然のペプチド配列よりもずっと容易に、免疫していない正常のド
ナー由来の末梢血由来のCTLの増殖を刺激することもできた。最も重要なのは、 エンハンサーアゴニストを用いて誘導したCTLは、内在性のCEAを発現している腫
瘍細胞株を含め、天然の配列を提示する標的をも認識し、溶解できたことである
。本発明に従い、このエンハンサーアゴニストペプチドの特徴づけが、in vivo で免疫源として、あるいは自己の抗腫瘍CTLのex vivo拡大のために用いた場合に
、より攻撃的な抗腫瘍免疫療法を容易にする。本発明にしたがって用いた合成ア
プローチは、他のペプチド性CTLエピトープの免疫原性を改善するのにも有用で ある。

【００６８】 材料と方法 ペプチド CEAペプチドCAP1の位置p5からp8に対する単一アミノ酸置換のパネルは、ピン 法（pin technology）（Chiron Mimotopes, Victoria, Australia）を使用するf
-moc化学により作製された。CAP1（YLSGANLNL）およびCAP1-6D（YLSGADLNL）は 、96％以上の純度であり、マルチプルペプチドシステム（Multiple Peptide Sys
tems）（San Diego, CA）によっても作製される。さらなるペプチドCAP1-7Iおよ
びNCA571は、アプライドバイオシステム432Aシンセサイザーで合成され、C18逆 相HPLCにより90％以上の純度にされた。

【００６９】 細胞株 T-Vac8（53）およびT-Vac24（11）は、CEAペプチドCAP1に特異的なヒトCTLで ある。これらの細胞株は、以前に発表した方法（11）に従って、CAP1およびIL-2
を使用するPBMCのin vitro刺激によって生成された。簡単に言うと、後免疫化PB
MCは、第I相試験においてrV-CEAを投与された、進行性のガンを持つHLA-A2+個体
由来であった。PBMCはリンパ球分離培地（Organon Teknika, Durham, NC）の密 度勾配で分離され、2×10⁵の細胞を50μg/mlのペプチドと共に滅菌96穴培養プレ
ート（Corning Costar, Cambridge, MA）のウェルに静置した。5％のCO₂を含む 加湿雰囲気中で37℃で5日間インキュベートした後、上清を捨て、10 U/mlのヒト
IL-2（外科部門からの譲与, NCI）を含む培地に置き換えた。培養細胞は3日毎に
11日間に渡ってIL-2を与え、そして放射線照射（4000 rad）した自己由来のPBMC
（5×10⁵）とペプチドを用いて再刺激した。新鮮なIL-2は3日ごとに供給し、2週
間毎に引き続く再刺激を行った。CTLは、グルタミン（GIBCO/BRL）、ペニシリン
、ストレプトマイシンおよび10％の保存ヒトAB血清（Gemini Bioproducts, Inc.
, Calabasas, CA）を含むコンプリートRPMI（GIBCO/BRL, Grand Island, NY）培
地で維持した。

【００７０】 細胞株C1R-A2（Dr. W. Biddison, National Institute of Neurological Diso
rders and Stroke, National Institutes of Health, Bethesda, MDからの提供 ）は、10％牛胎児血清（FBS, Biofluids Inc., Rockville, MD）、グルタミン、
非必須アミノ酸、およびピルビン酸（Biofluids）、および1 mg/ml G418を含む コンプリートRPMIで維持した。細胞株174.CEM-T2（Dr. P. Creswell, Yale Univ
ersity School of Medicine, New Haven, CTより提供）は、内因性ペプチドプロ
セッシングを欠損しており、10％FBSを含むIscove's（GIBCO/BRL）で維持した。
C1R-A2およびT2の両細胞株は、HLA-A2と共に内因性ペプチドを提示する。

【００７１】 CEA陽性腫瘍細胞株SW480、SW1463、SW1116およびSW837は、American Type Cul
ture Collection（ATCC, Rockville, MD）から入手し、ATCCカタログに記載され
ている各々の培地中で毎週継代した。CEA陰性黒色腫株Skmel24（Dr. S. Rosenbe
rg, National Cancer Institute, National Institutes of Health, Bethesda,
MDからの提供）は、RPMI 1640、10％FBSおよび10μg/mlゲンタマイシン（Life T
echnologies）中で毎週継代した。CEA陰性卵巣腫瘍CaOV3はDr. R. Freedman（MD
Anderson Cancer Center, Houston TX）から提供され、15％FBS、グルタミン、
12μg/mlインシュリン（Sigma, St. Louis, MO）、10μg/mlヒドロコルチゾン（
Biofluids）および10μg/mlゲンタマイシンを含むRPMIで培養した。全ての腫瘍 株は、CTLアッセイのためにアイソトープで標識する前に、トリプシン/ベルセン
（Versene）（Biofluids）で5-10分間トリプシン処理をした。高感受性ナチュラ
ルキラー（NK）標的K562はATCCから入手し、RPMI 1640、10％FBS中で毎週継代し
た。

【００７２】 細胞の生成 T細胞株T-N1およびT-N2は、以下の通りにペプチドを用いたin vitro刺激によ り二人の正常HLA-A2陽性ドナーのPBMCから生成した。最初の刺激サイクルでは、
T細胞を、CD3+ MicroCellectorフラスコ（Applied Immune Sciences, Santa Cla
re, CA）上でのパンニングによってポジティブ選択した。CD3+細胞（3×10⁶）は
、感染重度（multiplicity of infection）が10でヒトB7を発現するワクチニア ウィルスによりあらかじめ感染し、50μg/ml CAP1あるいはCAP-6Dペプチドおよ び2μg/mlヒトβ2ミクログロブリン（Intergen, Purchase, NY）でパルスし、放
射線照射（10,000 rad）した、10⁶ の174.CEM-T2細胞と共に培養した。培養細胞
は5％のCO₂を含む37℃の加湿雰囲気中にて、フィーダー細胞として放射線照射（
2500 rads）された2×10⁷の自己由来PBMCと共に、総量10 ml中に10％ヒト血清、
2 mMグルタミンおよび10μg/mlゲンタマイシンを含むRPMIの入ったT25フラスコ 内でインキュベートした。培養中で24時間後、10 U/mlのhuIL-2および0.1 ng/ml
のrIL-12（R&D Systems, Minneapolis, MN）を加えた。培養中で9日後、細胞は 、T細胞に対する刺激細胞と2.5:1の割合で25μg/mlペプチドと共にあらかじめイ
ンキュベートした、放射線照射（10,000 rads）した自己由来EBV-B細胞を使用し
て再刺激し、そしてIL-2およびIL-12を24時間後再び加えた。ペプチド濃度は、 最終濃度が3.12μg/mlに達するまで各々の続く刺激サイクルで半分にした。

【００７３】 加えて、CTLは、既報の手順（11）に従いCAP1-6Dを用いた刺激によってVac8の
ガン患者の後免疫化PBMCから生成した。

【００７４】 CTLアッセイ 標的細胞は⁵¹Crまたは¹¹¹Inで標識して、そして丸底マイクロプレート（Corni
ng Costar）にてペプチドと共にまたはペプチドを伴わずにウェル毎に2,000-10,
000でインキュベートした。1時間後、T細胞を加えた。4時間後、上清を回収し（
Skatron, Inc., Sterling VA）、アイソトープ放出を測定した。全てのアッセイ
は３回繰り返し、特異的放出パーセントは以下に従って計測した。

【００７５】

【数１】

【００７６】 ここでは、自然放出はT細胞を除くことで得られ、最大放出は1％トライトンX100
を加えることで得られる。

【００７７】 結合アッセイ HLA-A2に対するペプチドの結合を、プロセッシング欠損174.CEM-T2細胞と共に
インキュベートし、細胞表面ペプチド-A2複合体の安定性を測定することにより 評価した。（30）。簡単に言うと、細胞を回収し、血清無しRPMIで洗浄した後、
様々な濃度のペプチドを用いて1-2×10⁶cells/wellで一晩インキュベートした。
翌日、細胞を回収し、Ca²⁺、Mg²⁺および5％FBSを含むPBSで洗浄した後、単一色 フローサイトメトリー解析のため小分けした。細胞を、抗体無し、抗A2抗体A2,
69（One Lambda, Inc., Canoga Park, CA）あるいはアイソタイプ適合コントロ ール抗体UPC-10（Organon Teknika）と共に、氷上にて1時間インキュベートした
後、洗浄し、フルオレッセンス-イソチオシアネート（FITC）ヤギ抗マウスIg（S
outhern Biotechnology Associates, Birmingham, AL）で1時間染色した。細胞 表面の染色はBecton Dickinsonフローサイトメーター（Mountain View, CA）に て測定され、10,000の生細胞の平均蛍光強度（MFI）をペプチド濃度に対してプ ロットした。

【００７８】 TCR鎖の使用 T-N1 CTLは、CAP1-6D類似体を使用した抗原刺激の5サイクルについて、記述し
た通りに培養した。そして、株を分離し、二分した培養細胞を5回のさらなる刺 激サイクルのためそれぞれCAP1あるいはCAP1-6Dを用いて維持した。フィコール で精製したT細胞（5×10⁵）を、ヒトαβT細胞受容体の様々な領域に対する19種
の抗Vβおよび2種の抗Vαマウスモノクローナル抗体のパネルを用いて染色した 。細胞は10μg/mlの精製抗体と共に、30分間4℃でインキュベートした。使用し た非標識モノクローナルは：Vβ3.1クローン8F10、 Vβ5 (a)クローン1C1、 Vβ
5 (b)クローンW112、 Vβ5 (c)クローンLC4、 Vβ6.7クローンOT145、 Vβ8 (a)
クローン16G8、 Vβ12クローンS511、 Vβ13クローンBAM13、 Vα2クローンF1お
よびVα12.1クローン6D6（T Cell Diagnostics, Woburn, MA）およびVβ18（Imm
unotech, Westbrook, ME）であった。細胞を、10μg/mlのFITC標識ヤギ抗マウス
IgG抗体（Southern Biotechnology Associates）を用いて暗所で30分間染色した
。直接に標識したモノクローナルは：FITC標識Vβ11、 Vβ21.3、 Vβ13.6、 V β14、 Vβ16、 Vβ17、 Vβ20とVβ22およびPE標識Vβ9とVβ23（Immunotech）
であった。細胞を1％パラホルムアルデヒドで固定し、FACSFlowバッファー（Bec
ton Dickinson）で洗浄してBecton Dickinsonフローサイトメーターを使用して 解析した。

【００７９】

【実施例】

CAP1置換ペプチド T細胞活性についての効果を調べるための位置を決定するにはいくつかの要因 が考えられた。シークエンシングおよびマッピング実験により結合モチーフが決
定され、その中の位置2およびC末端（位置9あるいは10）はHLA-A2によるペプチ ド提示に重要である（概観のため、31参照）。加えて、位置1のTyrは効果的な二
次的アンカーとして同定された（20、32）。CEAペプチドのCAP1がこれら三つの 位置で好ましいアミノ酸を持っているため、これらの残基は変更しなかった。そ
のかわり、ヒトCAP1特異的細胞障害性T細胞を刺激しうる類似体を発見すること を期待して、我々はTCRとの相互作用が予想される残基に注目した。可溶性HLA-A
2に結合するいくつかのペプチドのX線結晶学的研究から、全ての結合ペプチドは
ペプチド結合溝に共通な立体構造をとることが示唆される（33）。五つの型のペ
プチドを調べたとき、残基5から8は結合溝から突き出ており、潜在的にTCRとの 結合に有用である。そのため、位置5から8（p5-p8）の残基を20種の天然アミノ 酸それぞれを用いて合成した80種の CAP1類似体ペプチドのパネルを産生した。 それらのペプチドをCAP1-pAAと表し、そこではpはペプチド中の位置を示してお り、AAは置換アミノ酸を示し、一文字のアミノ酸コードを使用している；すなわ
ち、CAP1-6Dは位置6がアスパラギン酸で占められているということである。

【００８０】 CAP1-6D類似体に対する標的の亢進したCTL感受性 潜在的TCR認識におけるこれらアミノ酸置換の効果は、T-Vac8と命名されたCAP
1特異的、HLA-A2拘束性ヒトCTL株を使用して研究された。簡単に言うと、T-Vac8
は材料と方法で述べたように、rV-CEAを投与されていた患者からのPBMCをin vit
roでペプチド刺激することによって生成された。最初のスクリーニングのため、
T-Vac8を細胞障害アッセイに使用して、（三つのペプチド濃度における）ペプチ
ドパネルの各々の構成分子と共にインキュベートして標識したC1R-A2細胞からの ¹¹¹ In放出を測定した。（T-Vac8不在下での）標的からの自然放出は各々の個々 のペプチドにより決定した。

【００８１】 その結果は図1Aから1Dに示す。80種のの単一アミノ酸置換のうち、ほとんどで
T-Vac8の細胞障害性を活性化することに失敗した。しかし、 6つの独立した置換
体は反応性を持続させた。位置5において、3つの類似体CAP1-5F、CAP1-5Iおよび
CAP1-5Sは、CAP1自身と比較して減少したレベルであったにもかかわらず、刺激 を提供した。位置6において、置換体CAP1-6CおよびCAP1-6DはT-Vac8の細胞障害 性を活性化し、それらは中間的な（0.1μg/ml）ペプチド濃度においてより活性 化したため、CAP1と同じかあるいはそれ以上になるようである、からである。位
置7において、類似体CAP1-7Iもまた活性を示した。最後に、位置8においては、 ひとつの類似体もT-Vac8による溶解に対する標的を感受性にすることはなかった
。その後、二つの最も活性の高い類似体（CAP1-6DおよびCAP1-7I）を詳細に解析
し、CAP1-6Cは酸化的条件の下でジスルフィド形成に関与するために除いた。

【００８２】 天然CAP1および類似体CAP1-6DとCAP1-7Iのより純粋な調製品（純度90-96％） を合成し、ペプチド濃度のより広い範囲で、標的として二つの異なる細胞株を使
用してCTLアッセイを行って比較した（図2Aと2B）。T2細胞を使用すると、類似 体CAP1-6Dは、天然CAP1よりも少なくとも10²倍効果的であった。CAP1-6Dの細胞 溶解活性は10^-4μg/mlで最大値の1/2であった（図2A）。これに対し、CAP1-7I類
似体と天然CAP1の配列は、ペプチド力価の全領域においてそれぞれ他方と対比で
き、10^-2μg/mlで最も効果的な溶解の半分を示した。標的としてC1R-A2細胞を使
用すると、CAP1-6Dは溶解を媒介する点でCAP1と比較して同様に10²倍と10³倍の 間で効果的であった（図2B）。

【００８３】 CAP1-6Dペプチドもまた、第２のCEA特異的T細胞株、T-Vac24を用いて試験した
（11）。この株は、天然CAP1ペプチドを用いてin vitro刺激することによる様々
なガン患者のrV-CEA後ワクチン化PBMCから生成した；支配的なCD8+T-Vac8と比較
すると、T-Vac24はCD4+CD8+両陽性細胞を高い割合で持っている（11）。T-Vac24
を使用した4時間の¹¹¹In放出アッセイでは、CAP1-6Dは天然CAP1配列（20％溶解 ）より僅かに効果的であった（30％溶解）；その違いはT-Vac8の時よりも顕著で
はなかったが、類似体に対する感度の増加は三つの別々な実験においてみられた
。類似体ペプチドは明らかに、第２のCAP1特異的CTLの溶解装置に関与している 。

【００８４】 類似体および天然ペプチドはHLA-A2による同一の提示を示す CTLアッセイにおけるCAP1-6Dの有効性の増加は、標的によるより良い提示によ
っている可能性がある。最も活性の高いCAP1類似体は、輸送欠損ヒト細胞株T2に
おける細胞表面HLA-A2を測定することにより、HLA-A2に対する結合について試験
された。濃度の4-log範囲にわたり比較したとき、天然CAP1および二つの類似体C
AP1-6DとCAP1-7Iは全て等しくT2細胞上に提示した（図3）。加えて、分離実験は
３つのペプチドで形成するHLA-A2複合体には安定性に関して明らかな違いが見ら
れないことを示す（図3-挿入）。ペプチドでパルスしたT2細胞を非結合ペプチド
を取り除くように洗浄した時、細胞表面ペプチド-A2複合体の半減期は12.5時間 （CAP1）、9.7時間（CAP1-6D）、および10.8時間（CAP1-7I）であった。どちら かといえば、アゴニストペプチドで形成される複合体は僅かに安定性が低くなる
ようだ。HLA-A2への結合に関して違いがないため、CTLアッセイにおけるCAP1-6D
の有効性の改善は、T細胞受容体によるより良い関与、エンハンサーアゴニスト ペプチドの作動特性、によっている可能性がある。

【００８５】 CAP1-6Dを用いて生成されたヒトCTLも天然CAP1を認識する CAP1-6Dアゴニストは、もしそれが確立した癌腫を持つ患者由来のCEA特異的CT
Lの成長を刺激することができれば、実験的および臨床的な応用に有用であろう 。一つの実験では、 Vac8のガン患者（T-Vac8 CTLを確立した患者と同じrV-CEA 患者からのもの）由来の後rV-CEA免疫化PBMCを、CAP1-6Dを用いてin vitroで刺 激し、刺激の5周目の後、CAP1あるいはCAP1-6Dでコートされている標的に対する
CTL活性について検査した。この新たな株は、CAP1-6Dあるいは天然CAP1のどちら
かでコートされた標的細胞に対して、ペプチド依存性細胞障害活性を示した（表
1）。

【００８６】 Vac8およびVac24の患者由来の後免疫化PBMCは、前免疫化PBMCが陰性であるの に対しCAP1で刺激されるとき、既にCTL活性を産生することが示されていた（11,
34）。さらに、健常で非免疫のドナーからのCTL活性をCAP1ペプチドを用いて刺
激するという以前の試みは成功していなかった。アゴニストペプチドが実際に天
然CAP1よりも免疫原性が高いかどうかを試験するため、我々は、CAP1-6Dを使用 し、健常で非免疫のドナーからCTLを生成することを試みた。外見上健常な個人 由来のHLA-A2+ PBMCは、CAP1あるいはCAP1-6Dアゴニストのいずれかでin vitro にて刺激された。in vitro刺激の4サイクルの後、細胞株を、CAP1あるいはCAP1-
6DのいずれかでパルスしたC1R-A2細胞に対する特異性について検査した。

【００８７】 CAP1あるいはCAP1-6Dペプチドでの刺激によりT細胞株を産生する一方で、ペプ
チド特異的溶解はCAP1-6Dを用いて生成された株内でのみ得られた。異なるドナ ー由来の二つの独立したT細胞株はCAP1-6Dを使用して導き出され、T-N1およびT-
N2と称された（各々、図4Aおよび図4B）。両CTL株は天然CAP1ペプチドでパルス したC1R-A2標的を溶解する。しかし、さらに効率的な溶解はCAP1-6Dアゴニスト を使用することで得られる。T-N1 CTLはCAP1よりも3-10倍低いペプチド濃度でCA
P1-6Dを認識し、T-N2はCAP1よりも100倍良くそのアゴニストを認識する。これに
対して、CAP1を用いた刺激によって健常なドナーからCTL細胞株を生成する試み により、結果としてペプチド依存性溶解を持たない株が生じ、そして初期刺激サ
イクルでの細胞株の損失をもたらした。このように、二つのペプチドを使用して
T細胞を生成する試みは、エフェクターステージ、すなわち標的の溶解において だけでなく、おそらく低い前駆体頻度におけるT細胞の選択においても、アゴニ ストとしての活動を行うCAP1-6Dの能力を示した。

【００８８】 アゴニストを用いて確立されたCTLが天然CAP1配列で維持できるかどうかを決 定するため、T-N1をCAP1-6Dを使用して前述のように5サイクルの間培養し、そし
てデュプリケートの培養に分け、アゴニストあるいはCAP1上で維持した。T-N1は
どちらかのペプチドを用いて刺激される場合に成長を続け、CTLアッセイでは両 ペプチドに反応した。T-N1におけるTCR使用の表現型的解析により、多数の細胞 （71％）がVβ12を利用し、Vβ5.3を利用するのは少数であることが示される（ 表2）。TCR Vβ使用の同パターンは、5回のさらなる刺激サイクルの間に本細胞 がCAP1に対してスイッチした後に観察された。このVβ使用のパターンはT-Vac8 使用パターンとは異なっていた。これらのデータは、本アゴニストがおそらく低
い前駆体頻度であるT細胞を選択することができることを示し、しかしひとたび 選択されれば、そのようなCTLは天然CAP1で維持されうることを示す。

【００８９】 CAP1-6Dを用いて生成されたCTLは特異的にCEA⁺, HLA-A2⁺ 腫瘍細胞を溶解した 研究は、エンハンサーアゴニストを用いて生成されたCTLが内因的にCEAを発現
するヒト腫瘍細胞を溶解するという能力を決めるために行われた。T-N1およびT-
N2を、CEA⁺/A2⁺（SW480とSW1463）、CEA⁺/A2^-（SW1116）あるいはCEA^-/A2⁺（CaO
V3とSKmel24）である腫瘍細胞のパネルに対して試験した。健常なドナーからのT
細胞株（T-N2）を、内因的にCEAを発現する腫瘍標的を溶解するという能力につ いて試験した。アゴニストを用いて生成されたT-N2 CTLは CEAおよびHLA-A2の両
方を発現する腫瘍細胞を溶解し、その一方でCEA^-/A2⁺ Skmel24黒色腫細胞の検出
可能な（titratable）溶解は示さなかった（図5A）。K562の著しい溶解は観察さ
れなかった。これに対して、天然CAP1を用いた刺激により生成した細胞株は検出
可能な抗腫瘍活性を示さなかった（図5B）。CEA陽性腫瘍標的に対するT-N2の反 応のHLA-A2.1の拘束性は、CEA陽性HLA-A2.1陰性腫瘍細胞、ワクチニア-A2.1構造
物（rV-A2.1）の感染後のSW837、の特異的溶解によってさらに示された。SW837 標的がA2.1トランスジーン無しのコントロール野生型ワクチニアに感染されたと
き、溶解は観察されなかった（図6）。

【００９０】 第２のドナーから得られたCTL株（T-N1）が内因性CEAを発現する癌腫標的を殺
す能力を図7Aおよび7Bに示す。T-N1は特異的にSW480腫瘍細胞を溶解する。これ は、IFN-γを用いて腫瘍細胞を前処理、つまりHLA-A2およびCEAの両方の細胞表 面密度を高める処理、をすることで79％溶解まで劇的に亢進する。T-N1殺傷の特
異性は、卵巣由来腫瘍CaOV3、黒色腫瘍Skmel24、あるいはNK標的K562などのCEA^- /A2⁺ 腫瘍を溶解する能力の無さによって示される。最後に、HLA-A2による拘束 性は、T-N1がCEA⁺/A2^- SW1116腫瘍細胞を（図7A）、 IFN-γ処理の後でさえも（
図7B）、溶解できないことにより示される。

【００９１】

【表１】

【００９２】

【表２】

【００９３】 本発明は、それについての好ましい態様を含めて詳細に記述されている。しか
し、当業者は、本開示を考慮して、本発明の精神と目的からはずれずにそれにつ
いての修正および改良を行いうる。

【００９４】 引用した参考文献はここに参考文献として援用する。 参考文献 1. Muraro, R., Wunderlich, D., Thor, A., Lundy, J., Noguchi, P., Cunni
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【図面の簡単な説明】

【図１】 図１Ａ−１Ｄ： CEA CTL T-Vac8による溶解に対するCEA CAP1ペプチドにお ける単一アミノ酸置換の影響 。C1R-A2細胞を¹¹¹Inで標識し、そして1μg/ml（黒
）、0.1μg/ml（白）および0.01μg/ml（斜線）の各置換ペプチドとともに、丸 底ウェル（2,000／ウェル）中で1時間インキュベーションした。T-Vac8 CTLをE:
T=1.45:1で添加し、そして同位体放出を4時間後に測定した。各ペプチドに関し 、自然放出を1μg/mlで測定した。すべてのアッセイは、トリプリケートで行っ た。図1A−1Dは、それぞれ、位置p5からp8での置換を表す。アミノ酸は、一文字
記号で示している；天然CAP1配列をコードするアミノ酸は、各図に示してあり、
そして右端にある。

【図２】 図２Ａおよび２Ｂ： CAP1および類似体は、CEA CTL T-Vac8細胞傷害性に対 し、異なる感受性を示す 。図2AのT2および図2BのC1R-A2標的細胞を⁵¹Crで標識し
、そして示されている濃度のCAP1とともに（●）または置換ペプチドCAP1-6Dと ともに（○）またはCAP1-7Iとともに（◇）、丸底96ウェルプレート（10,000／ ウェル）中でインキュベーションした。1時間後、T-Vac8 CTLをE:T=2.5:1で添加
し、そして同位体放出を4時間後に測定した。すべてのアッセイは、トリプリケ ートで行った。NCA571（△）は、CEAと関連遺伝子NCAの最適整列の後に得られた
9量体ペプチドである（11）。

【図３】 図３： HLA-A2複合体への結合および該複合体の安定性に対するCAP1ペプチ ドにおける単一アミノ酸置換の影響 。T2細胞を血清不含培地中に回収し、その後
、示されている濃度で、ペプチドCAP1とともに（●）、CAP1-6Dとともに（□） 、またはCAP1-7Iとともに（◇）一晩インキュベーションした（10⁶／ウェル）。
細胞を回収し、コンホメーション感受性MAb BB7.2、HLA特異的抗体W6/32（示さ れていない）およびアイソタイプコントロールAb MOPC-195（示されていない） での染色により、機能的HLA-A2分子の細胞表面発現に関しアッセイした。平均蛍
光強度を、生存しているゲート化（gated）細胞集団で測定した。 図挿入：細胞を100μg/mlのペプチドと一晩インキュベーションし、その後、非 結合ペプチドを含まないよう洗浄し、そして37℃でインキュベーションした。示
されている時間で、細胞表面ペプチド-HLA-A2複合体の存在に関し、細胞を染色 した。エラーバーは、2つの実験に対するSEMを示す。

【図４】 図４Ａおよび４Ｂ： 外見上健康な個人からCAP1-6Dを用い生成されたCTLは 、CAP1およびCAP1-6Dを認識する 。CAP1-6Dを用いCTL株（T-N1およびT-N2と称さ れる）を生成し、そしてペプチド特異性に関しアッセイした。エフェクター対標
的比20:1での刺激5サイクルの後、T-N1をアッセイした（図4A）。エフェクター 対標的比15:1で10サイクルの後、T-N2をアッセイした（図4B）。⁵¹Cr標識C1R-A2
標的（5,000／ウェル）を、示されている量のCAP1（●）またはCAP1-6D（□）ペ
プチドとインキュベーションした。4時間後、ガンマカウンターで同位体放出の 量を測定した。値は、トリプリケート培養から測定した。

【図５】 図５Ａおよび５Ｂ： 外見上健康なドナー由来のCAP1-6D生成T細胞株は内因 性CEA発現腫瘍細胞を認識するがCAP1生成T細胞株はしない 。CAP1-6D生成T-N2 CT
L（図5A）および天然CAP1で生成されたT細胞（図5B）を、腫瘍標的SW480およびS
W1463（CEA⁺、HLA-A2⁺、それぞれ●および▲）、SKmel24（CEA‐、-A2⁺、□）お
よびK562（◇）に対するin vitro刺激9サイクルの後、アッセイした。HLAを上方
制御するためγ−IFNの存在下で、腫瘍細胞を72時間培養した。細胞をトリプシ ン処理し、そして⁵¹Crで標識し、そして増加するエフェクター対標的比でT-N2 C
TLとインキュベーションした（5,000細胞／ウェル）。培養を4時間インキュベー
ションし、そして、ガンマカウンターで同位体放出の量を測定した。値は、トリ
プリケート培養から測定した。

【図６】 図６： CAP1-6Dアゴニストに由来するCTL株（T-N2）のMHCクラス1 A2.1拘 束性 。CTL株T-N2を、ヒト結腸癌腫SW837標的細胞に対するエフェクターとして用
いた。SW837はCEA陽性であり、そしてHLA-A2.1陰性である。SW837は、A2.1トラ ンスジーンを含む組換えワクシニア（黒四角）または野生型ワクシニア（△）の
いずれかで10:1のMOIで感染させた。

【図７】 図７Ａおよび７Ｂ： CAP1-6Dで生成されたCTLは、CEA陽性、HLA-A2陽性腫 瘍を溶解する：IFN上方制御の影響 。CAP1-6Dで生成されたT-N1 CTLを多様な腫瘍
細胞株：SW480（CEA⁺およびHLA-A2⁺、●）、SW1116（CEA⁺だが-A2‐、□）およ びCaOV3（CEA‐だが-A2⁺、◇）に対しアッセイした。腫瘍細胞をγ−IFNの非存 在下（図7A）または存在下（図7B）で72時間培養し、トリプシン処理し、そして ⁵¹ Crで標識し、その後、増加するエフェクター対標的比でT-N1 CTLとインキュベ
ーションした（5,000細胞／ウェル）。培養を4時間インキュベーションし、そし
て、ガンマカウンターで同位体放出の量を測定した。値は、トリプリケート培養
から測定した。

【手続補正書】

【提出日】平成１２年１２月２６日（２０００．１２．２６）

【手続補正１】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】全図

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 37/02 Ｃ０７Ｋ 14/705 43/00 １１１ 16/28 Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 16/28 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ， ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，Ｌ Ｕ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ， ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，Ｕ Ｇ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ザレンバ，サム アメリカ合衆国メリーランド州20852，ロ ックビル，ローリンズ・アベニュー 243， ナンバー 102 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA36 BA41 CA04 CA07 DA02 DA03 EA02 EA04 GA03 GA11 HA01 4B065 AA90X AA94X AB01 AB04 BA02 BA08 CA24 CA25 CA44 4C084 AA07 AA13 AA17 BA01 BA08 BA17 BA23 MA01 MA02 NA14 ZB022 ZB072 ZB262 ZC751 4H045 AA10 AA11 BA10 BA41 CA40 DA76 DA86 EA28 FA34 FA72 FA74

Claims (43)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 天然配列： 【化１】 のアゴニストを含むペプチド。
2. 【請求項２】 アゴニストがSEQ ID NO:1の位置6でアミノ酸置換において変
   化する、請求項1のペプチド。
3. 【請求項３】 アゴニストがSEQ ID NO:1の位置7でアミノ酸置換において変
   化する、請求項1のペプチド。
4. 【請求項４】 アゴニストがSEQ ID NO:1の位置6および位置7でアミノ酸置 換において変化する、請求項1のペプチド。
5. 【請求項５】 YLSGADLNL（SEQ ID NO:2）、YLSGADINL（SEQ ID NO:3）、YL
   SGANINL（SEQ ID NO:4）、YLSGACLNL（SEQ ID NO:5）、またはそれらの組み合わ
   せを含む、請求項1のペプチド。
6. 【請求項６】 アミノ酸配列YLSGADLNL（SEQ ID NO:2）、YLSGADINL（SEQ I
   D NO:3）、またはYLSGANINL（SEQ ID NO:4）、YLSGACLNL（SEQ ID NO:5）からな
   るペプチド。
7. 【請求項７】 請求項1のペプチドおよび薬学的に許容しうるキャリアーを 含む、薬剤組成物。
8. 【請求項８】 さらに免疫刺激性分子を含む、請求項7の薬剤組成物。
9. 【請求項９】 免疫刺激性分子がIL-2、B7.1、B7.2、ICAM-1、LFA-3、CD72 、GM-CSF、TNFα、INFγ、IL-12、IL-6およびそれらの組み合わせからなる群よ り選択される、請求項8の薬剤組成物。
10. 【請求項１０】 さらにHLAクラスI分子またはHLAクラスI分子を発現してい
    る細胞を含む、請求項7の薬剤組成物。
11. 【請求項１１】 さらに化学療法薬剤、抗生物質、抗ウイルス薬剤、抗真菌
    薬剤、またはシクロホスファミドを含む、請求項7の薬剤組成物。
12. 【請求項１２】 さらにアジュバントを含む、請求項7の薬剤組成物。
13. 【請求項１３】 アジュバントが、ミョウバン、不完全フロイントアジュバ
    ント、QS21、およびRibi Detox^TMからなる群より選択される、請求項12の薬剤組
    成物。
14. 【請求項１４】 請求項１のペプチドおよび免疫グロブリン分子を含む、ペ
    プチド−免疫グロブリン結合体。
15. 【請求項１５】 ペプチドがリポソームに取り込まれている、請求項7の薬 剤組成物。
16. 【請求項１６】 キャリアー分子に結合している請求項1のペプチドを含む 、ペプチド−キャリアー分子結合体。
17. 【請求項１７】 キャリアー分子が、インフルエンザペプチド、破傷風トキ
    ソイド、破傷風トキソイド−CD4エピトープ、シュードモナス（Pseudomonas）外
    毒素A、ポリ−L−リジン、脂質テールおよび小胞体シグナル配列からなる群より
    選択される、請求項15のペプチド−キャリアー分子結合体。
18. 【請求項１８】 請求項1のアゴニストペプチドおよびCEAをコードする核酸
    配列を含むベクターを含むキット。
19. 【請求項１９】 さらに免疫刺激性分子を含む、請求項18のキット。
20. 【請求項２０】 請求項1のペプチドまたはその変異体（variant）をコード
    するヌクレオチド配列を含む単離DNA。
21. 【請求項２１】 SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、
    またはそれらの組み合わせを含むペプチドをコードする単離DNA。
22. 【請求項２２】 SEQ ID NO:7または8のヌクレオチド配列を含む単離DNA。
23. 【請求項２３】 請求項20、21または22のDNAを含むベクター。
24. 【請求項２４】 ベクターが大腸菌（E. coli）プラスミド、リステリア(Li
    steria)ベクター、オルトポックス（orthopox）ウイルス、アビポックス（avipo
    x）ウイルス、カプリポックス（capripox）ウイルス、スイポックス（suipox） ウイルス、ワクシニア（vaccinia）ウイルス、バキュロウイルス（baculovirus ）、ヒトアデノウイルス（adenovirus）、SV40またはウシパピローマ（papillom
    a）ウイルスである、請求項23のベクター。
25. 【請求項２５】 さらに、少なくとも1つのHLAクラスI分子をコードするヌ クレオチド配列を含む、請求項23または24のベクター。
26. 【請求項２６】 請求項23のベクターを含む宿主細胞。
27. 【請求項２７】 さらにHLAクラスI分子を発現する、請求項26の宿主細胞。
28. 【請求項２８】 抗原提示細胞である、請求項26の宿主細胞。
29. 【請求項２９】 樹状細胞である、請求項28の宿主細胞。
30. 【請求項３０】 CEAまたはそのエピトープを発現している腫瘍を有する宿 主を治療するための方法であって、CEAまたはそのエピトープに特異的な細胞傷 害性Tリンパ球を宿主に導入し、そしてその後、定期的な間隔で、請求項１のア ゴニストペプチドを宿主に導入することを含む、前記方法。
31. 【請求項３１】 ペプチドが、SEQ ID NO:2、3、4、5またはそれらの組み合
    わせからなる群より選択される、請求項30の方法。
32. 【請求項３２】 患者においてCEAエピトープ発現癌腫細胞を阻害する方法 であって、前記患者に請求項1のペプチドの有効量を投与することを含む、前記 方法。
33. 【請求項３３】 さらに免疫刺激性分子の投与を含む、請求項32の方法。
34. 【請求項３４】 免疫刺激性分子がIL-2、B7.1、B7.2、ICAM-1、LFA-3、CD7
    2、GM-CSF、TNFα、INFγ、IL-12、IL-6およびそれらの組み合わせからなる群よ
    り選択される、請求項33の方法。
35. 【請求項３５】 さらにアジュバントの投与を含む、請求項32の方法。
36. 【請求項３６】 癌腫細胞が、胃腸、***、膵臓、膀胱、卵巣、肺、または
    前立腺癌腫細胞である、請求項32の方法。
37. 【請求項３７】 さらに、CEAをコードする遺伝子を含むベクターの投与を 含む、請求項32の方法。
38. 【請求項３８】 CEAエピトープ発現癌腫細胞を阻害するかまたは殺傷する 方法であって： （A）供給源からのリンパ球を、請求項1のアゴニストペプチド単独でまたは免
    疫刺激性分子との組み合わせの有効量で刺激することにより、CEAエピトープま たはアゴニストペプチド特異的細胞傷害性Tリンパ球をin vitroで生成し；そし て （B）CEAエピトープまたはアゴニストペプチド特異的細胞傷害性Tリンパ球を 単独でまたはアゴニストペプチドと組み合わせて、CEAエピトープ発現癌腫細胞 を阻害するかまたは殺傷するのに十分な量で、哺乳動物に養子性に（adoptively
    ）移入する ことを含む、前記方法。
39. 【請求項３９】 哺乳動物において、CEAエピトープ発現癌腫細胞を阻害す るかまたは殺傷する方法であって： （A）請求項１のアゴニストペプチドの有効量、CEAをコードする核酸配列を含
    むベクターの有効量またはアゴニストペプチドでパルスした（pulsed）抗原提示
    細胞の投与により、CEAエピトープまたはアゴニストペプチド特異的細胞傷害性T
    リンパ球をin vivoで生成し；そして （B）定期的間隔で、請求項1のアゴニストペプチドを単独でまたはアジュバン
    トと組み合わせて提供し；ここでそのように生成された、CEAエピトープまたは アゴニストペプチド特異的細胞傷害性Tリンパ球は、CEAエピトープ発現癌腫細胞
    を阻害しまたは殺傷する ことを含む、前記方法。
40. 【請求項４０】 天然配列：YLSGANLNL（SEQ ID NO:1）のアンタゴニストを
    含むペプチドであって、該アンタゴニストがSEQ ID NO:1の少なくとも1つのアミ
    ノ酸位置で変化し、そして該アンタゴニストがCEA特異的免疫反応を阻害する、 前記ペプチド。
41. 【請求項４１】 請求項36のペプチドおよび薬学的に許容しうるキャリアー
    を含む、薬剤組成物。
42. 【請求項４２】 請求項40のペプチドを、CEA特異的免疫反応を阻害するの に有効な量で投与することを含む、CEA特異的免疫反応を阻害する方法。
43. 【請求項４３】 CEAまたはそのエピトープに特異的な細胞傷害性Tリンパ球
    が阻害される、請求項42の方法。