DE60318608T2

DE60318608T2 - Ptprk-immunogenes peptid

Info

Publication number: DE60318608T2
Application number: DE60318608T
Authority: DE
Inventors: Chiara Castelli; Giorgio Parmiani
Original assignee: Istituto Nazionale per lo Studio e la Cura die Tumori
Current assignee: Istituto Nazionale per lo Studio e la Cura die Tumori
Priority date: 2002-11-14
Filing date: 2003-11-12
Publication date: 2009-01-15
Anticipated expiration: 2023-11-13
Also published as: EP1560848A2; WO2004043988A2; PT1560848E; JP2006506064A; ES2299748T3; WO2004043988A3; US20060159691A1; EP1560848B1; AU2003293677A1; DE60318608D1; ITMI20022412A1; WO2004043988A8; DK1560848T3; HK1076476A1; ATE383371T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft immunoge Peptide, die aus dem Protein PTPRK (Rezeptorartiges Protein Tyrosin-Phosphatase Kappa) isoliert wurden und deren Verwendung in der Diagnose und in der vorbeugenden oder therapeutischen Behandlung von Tumoren. Insbesondere, stellt die Erfindung ein neues HLA-Klasse II eingeschränktes Epitop bereit, das durch CD4+ T-Zellen erkannt wird und seine Verwendung in der Diagnose, Vorbeugung oder Immuntherapie von Patienten mit Melanomen, die PTPRK exprimieren.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Identifizierung der tumorassoziierten Antigene, die in der Lage sind sind, eine spezifische Antitumor-T-Zellenantwort zu induzieren, hat eine neue immunologische Herangehensweise für die Behandlung von Tumoren zur Verfügung gestellt. Die breite Mehrheit der tumorassoziierten Antigene, die bis jetzt identifiziert worden sind, werden durch HLA-Klasse I eingeschränkte cytotoxische T-Lymphozyten (CTL) erkannt, trotz der entscheidenden Rolle, welche CD4+ T-Zellen, die HLA-Klasse II Antigene erkennen, für die Erzeugung und Aufrechterhaltung einer wirksamen Immunantwort bei einer Vireninfektion sowie bei Krebs spielen. Ein Mangel an Tumor-spezifischen Epitopen, die in der Lage sind, eine T-Zellen-vermittelte Helferantwort auszulösen und die Eigenart der Mehrheit der HLA-Klasse I eingeschränkten Tumor-bezogenen Antigene stellen die Hauptfaktoren dar, welche die therapeutische Wirksamkeit der Impfversuche bei Krebspatienten begrenzen. Folglich scheint die Charakterisierung neuer MHC-Klasse II Tumor-spezifischer Antigene von hoher Bedeutung zu sein, um neue und wirksamere Peptid-basierte Impfstoffe zur Verfügung zu stellen. Der Mechanismus des MHC-Klasse II Antigen-Verarbeitungs/Präsentationsweges scheint recht komplex und nicht vollständig verstanden zu sein. Technische Schwierigkeiten haben die Entdeckung von Klasse II HLA-eingeschränkten Tumorantigenen behindert und so die Verfügbarkeit bekannter Tumor-spezifischer Helferepitope für Melanome, den immunogensten unter den menschlichen Tumoren, begrenzt.
PTPRK gehört der Familie der rezeptorartigen Plasmamembran-durchspannenden PTP-Moleküle und es ist durch die Anwesenheit von Fibronectin-Typ III Wiederholungen, Immunoglobulin und Meprin/A5/tμ (MAM) Domänen (30, 31) in seinem extrazellularen Teil gekennzeichnet. PTPRK wird in normalen Geweben wie Milz, Prostata, Eierstöcken und keratinocytischen epidermialen Zelllinien aber nicht in PBL und hämatologischen Zelllinien (24) exprimiert. Obwohl die exakte physiologische Rolle von PTPRK noch unklar ist, legen seine strukturellen Merkmale und die Fähigkeit, homophile Wechselwirkungen unter Zellen zu vermitteln zusammen mit der Beobachtung, dass die Expression von PTPRK durch Zelldichte verursacht wird, eine entscheidende Rolle dieses Proteins in der Regelung der Zelle-Zelle-Kontaktanordnung (30) stark nahe. Außerdem ist vor kurzem gezeigt worden, dass bei Menschen PTPRK colokalisiert und mit β- und γ-Catenin an der Zell-Zell-Berührungsfläche von angrenzenden Zellen (25) verbunden ist. Diese Feststellung unterstützen stark die Beteiligung dieses Proteins an der negativen Regulierung der Tätigkeit von Tyrosin-Kinase-induzierten Vorgängen an den Zellenkontaktstellen, möglicherweise durch die Dephosphorilierung von β- und γ-Catenin. Diese funktionellen Aufgaben und die Feststellung, dass das menschliche PTPRK-Gen dem mutmaßlichen Tumor-unterdrückenden Genbereich 6q22.2–q22.3 (31, 32) zugeordnet wurde, der häufig in Melanomen (33, 34) fehlt, unterstützen insgesamt die Hypothese, dass ein Verlust der Expression sowie, in den funktionellen Domänen des PTPRK Proteins auftretende, Mutationen, den Phänotyp der normal wachsenden Zellen direkt beeinflussen und eine Rolle in der Tumortransformation und -Weiterentwicklung spielen könnten.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Mit dem Ziel HLA-Klasse II Melanomantigene zu identifizieren, haben wir die CD4+ Antitumorantwort bei einem Melanompatienten untersucht, der eine vorteilhafte Prognose erfuhr, nachdem er 9 Jahre nach chirurgischer Entfernung einer Lymphknotenmetastase gesund war. Diese positive klinische Entwicklung war mit einer starken und anhaltenden CD8-vermittelten Antitumorantwort verbunden, die gegen das Differenzierungs-Antigen gp-100 und TRP-2 gerichtet war. Da CD4-T-Zellen dafür bekannt sind, für die Erzeugung und die Aufrechterhalung der CD8-T-Zellen wesentlich zu sein, erforschten wir die Möglichkeit, dass der Patient auch eine Tumor-spezifische CD4-vermittelte Antwort entwickelt hatte.
Von Tumor-infiltrierten Lymphknoten erhaltene T-Lymphozyten wurden wiederholt in vitro mit dem autologen Tumor stimuliert und T-Zellenklone wurden erzeugt, indem die Verdünnung begrenzt wurde. CD4+ T-Zellklone, die den autologen Tumor auf eine HLA-DR eingeschränkte Weise erkennen, wurden erhalten, die sich in vitro durch ihre genaue Spezifizität auszeichnen und als zellulare Sonde in einem genetischen Ansatz verwendet wurden, der auf das Bestimmen der molekulare Natur des erkannten Antigens zielt. Das Screening einer cDNA Expressions-Bibliothek, die unter Verwendung der RNA des autologogen Melanoms als Template bzw. Matrix erzeugt wurde, führte zur Identifizierung des Tyrosinphosphatrezeptor-K-Gens (R-PTP-K) als jenes, welches das Antigen kodiert, das durch die CD4+ Melanom-spezifischen Klone erkannt wird. Die R-PTP-K mRNA, die durch Melanomzellen kloniert wurde, enthält eine nicht-konservative Gly→Arg Mutation in der vierten Fibronectin III-artigen Domäne des Proteins. Dieser Aminosäure-Austausch erzeugt ein T-Zellenepitop, das durch das HLA-DRβ1·1001 präsentiert wird, das durch den CD4 T-Zellenklon erkannt wird, der zum Screenen der Tumor-cDNA-Bibliothek verwendet wird und durch alle 5 unterschiedlich Klone von den Tumor-infilrierten Lymphknoten des gleichen Patienten isoliert wurden. Das Antigenepitop wurde in der Region 667–682 von PTPRK_Gly677→Arg identifiziert und es hat die Sequenz PYYFAAELPPRNLPEP (SEQ ID No. 1).
Ein erster Aspekt der Erfindung ist auf das immungene Peptid SEQ ID No. 1 gerichtet und dessen Verwendung bei der Erzeugung von Antikörpern und/oder T-Helfern oder cytotoxischen Zellen, allgemeiner auf die Induktion einer Tumor-spezifischen Immunantwort, für diagnostische oder therapeutische Anwendungen, insbesondere für die Diagnose, die Verhinderung oder die Immuntherapie von Tumoren, die PTPRK_Gly677→Arg exprimieren.
Das Peptid der Erfindung kann nach unterschiedlichen Verfahren hergestellt werden. Beispielsweise kann es gemäß herkömmlicher Verfahren oder unter Verwendung eines automatischen Synthetisierers in Lösung oder fester Phase synthetisiert werden. Die Theorie und die Praxis der Peptidsynthese sind jedem Fachmann bekannt, siehe zum Beispiel Stewart und Young (1984) Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., Pierce Chemical Co.; Tam et al., J. Am. Chem. Soc., (1983) 105: 6442; Merrifield, The Peptides, Gross and Meinenhofer eds. Academic Press (1979) New York, pp. 1-284, welche hierin unter Bezugnahme aufgenommen werden.
Für die Verwendung in der Therapie wird das Peptid in geeigneter Weise zusammen mit pharmazeutisch Verträglichen Hilfsmitteln formuliert. Geeignete Formulierungen für die vorbeugende oder therapeutische Behandlung können oral oder parenteral verabreicht werden, vorzugsweise subkutan oder intramuskulär, und sie enthalten eine wirksame Menge des Peptids. Die Menge sollte in der Lage sein eine humorale oder zellvermittelte Immunantwort auszulösen, die gegen den Tumor gerichtet ist und wird abhängig vom Allgemeinzustand des Patienten, dem Fortschreiten der Krankheit und anderen Faktoren schwanken.
Vorzugsweise wird das Peptid der Erfindung in Form eines Impfstoffs, entweder zur vorbeugenden Behandlung Melanom-anfälliger Einzelpersonen oder für die therapeutische Behandlung der Melanompatienten, verabreicht. Der Impfstoff kann entsprechend einem Einzel- oder Mehrfachdosierungsschema mit unterschiedlichen Dosen und in unterschiedlichen Zeitabständen verabreicht werden, um die Immunantwort aufrecht zu erhalten oder zu verstärken. Die Peptidimmunogenität kann durch Vernetzung oder Koppelung mit immunogenen Trägern oder durch Verwendung geeigneter Hilfsstoffe erhöht werden. Außerdem kann das Peptid mit Lipiden, Glucosid-Resten oder anderen Peptiden konjugiert sein, um die Bioverfügbarkeit oder die Affinität zu HLA Molekülen zu erhöhen.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung polyklonale oder monoklonale Antikörper, Fragmente oder Derivate davon bereit, wie beispielsweise Fab, Fv oder scFv, die in der Lage sind, das Peptid SEQ ID No. 1 zu erkennen und zu binden. Die isolierten Antikörper können in der Tumor-Immuntherapie oder in Immundiagnoseverfahren verwendet werden, um Tumoren zu bestimmen, die PTPRK_Gly677→Arg exprimieren.
In noch einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung isolierte CD4+ T-Zellen zur Verfügung, die spezifisch einen Tumor erkennen, der PTPRK_Gly677→Arg exprimiert, und deren Verwendung für das Auslösen einer zellvermittelten Immunantwort gegen einen solchen Tumor. Diese Zellen können von PBMC isoliert werden, das von dem Patienten erhalten wird, welcher der Behandlung unterworfen werden soll, und sie können mit dem Peptid SEQ ID N. 1 in vitro aktiviert werden, wahlweise in Anwesenheit von Cytokinen oder unter Verwendung von Zellen, die das Peptid in Verbindung mit HLA-Klasse II Molekülen tragen, wie beispielsweise APC (Antigen-präsentierende Zellen), welches das Allel HLA-DRβ1·1001 exprimieren, welches das Peptid trägt. APCs können genetisch modifiziert sein, beispielsweise durch Transfektion mit einem viralen oder retroviralen Vektor, um so das spezifische Allel HLA oder das Peptid oder ein Vorläufer davon zu exprimieren. Modifizierte HLA-Zellen können benutzt werden, um T-Zellen entweder in vitro oder in vivo zu aktivieren. In vitro aktivierte T-Zellen können dem Patienten anschließend wieder zugeführt werden, um den Ausbruch der Tumorzellen zu verhindern, ihr Wachstum aufzuhalten oder ihre Menge zu verringern. Bevor sie dem Patienten wieder zugeführt werden, können Lymphozyten, z. B. mittels einer Affinitätssäule gereinigt werden, die einen Antikörper verwendet, der gegen CD4 oder andere Marker gerichtet ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein isoliertes Nukleinsäuremolekül bereit, welches das Epitop von PTPRK_Gly67→Arg kodiert, welches hierin beschrieben ist, vorzugsweise die Sequenz
sowie einen Vektor und eine Wirtszelle, welche diese Sequenz beinhalten. Die DNA-Moleküle, welche die Peptid-Kodiersequenz oder ein Teil davon enthalten und die Genkonstrukte daraus können bei der Impfung von Subjekten mit dem Risiko der Entwicklung von Tumoren, insbesondere von Melanomen, oder der Krebspatienten verwendet werden. DNA-Immunisierung kann entsprechend bekannter Verfahren durchgeführt werden (Donnelly J. J. et al., 1994, The Immunologist 2:1). Der intramuskuläre Verabreichungsweg ist bevorzugt, aber auch die parenteralen und mucosalen Wege können verwendet werden (pnas 1986, 83, 9551; WO90/11092 ). Außerdem kann DNA für die subkutane Verabreichung mit einer biolistischen Vorrichtung auf Goldpartikel absorbiert sein (Johnston, 1992 Nature, 356, 152).
Zusätzlich zu den oben beschriebenen therapeutischen Verwendungen können Nukleinsäuremoleküle, welche die Peptidkodiersequenz oder einen Teil davon enthalten, sowie das Peptid selbst, in der Diagnose von Melanomen verwendet werden, welche PTPRK_Gly667→Arg exprimieren, zum Beispiel durch PCR-Analyse oder Immunoassays mit epitopspezifischen Antikörpern. Außerdem können Komplexe des Peptids SEQ ID N. 1 mit HLA-DRβ1·1001-Zellen für die in vitro oder ex vivo Überwachung der Immunantwort von Subjekten verwendet werden, die mit dem Peptid geimpft wurden.
BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1
Funktionelle Charakterisierung des Antimelanom-T-Lymphozyt Klons
TB515. (A) Empfindlichkeit von ⁵¹Cr-markierten Me15392 und LCL15392 Zellen gegenüber Lyse durch TB515 Klone: ⁵¹Cr-Freisetzung wurde nach 5 h gemessen. Die Untersuchung wurde in Abwesenheit
oder in Anwesenheit
von anti-HLA-DR Ab, L243 durchgeführt. (B) Cytokinfreisetzungsuntersuchung: TB515 Klon wurde über Nacht mit autologem Tumor oder 15392LCL bei 1:1 Zellverhältnis in Anwesenheit oder Abwesenheit von L243 inkubiert. Der Überstand wurde gesammelt und der Inhalt von INF-γ, GM-CSF, TNF-α und IL-2 wurde durch einen handelsüblichen ELISA Test ausgewertet. S. D. ≤ 5%.
2
Komplementäre DNA vom Klon #11 kodiert für das TB515 erkannte Antigen. (A) CIITA⁺293 wurden mit cDNA #11 in pEAK8.5-Ii alleine oder zusammen mit pcDNA3.1-DRB1·0102 bzw. pcDNA3.1-DRB1·1001 tranfiziert. CIITA⁺293, welches einzeln mit pcDNA3.1-DRB1·102 oder pcDNA3-DRB1·1001 transfiziert wurde, und CIITA⁺293, welches mit rekombinanter pcDNA3, das grün fluoreszierendes Protein (GFP) kodiert, und pcDNA3.1-DRB1·1001 cotranfiziert wurde, wurden als Negativprobe verwendet. (B) cDNA#11 wurde in pcDNA3.1 subkloniert und mit pcDNA3.1-DRB1·1001 in CIITA⁺293 cotransfiziert. Klon TB515 (1 × 10⁵ Lymphocyten/Well bzw. Well) wurde jedem Transfektanten hinzugefügt und nach 24 h wurden die Überstände gesammelt und der Inhalt von IFN-γ durch ELISA ausgewertet. In beiden Platten wurde Me15392 als Positivekontrolle verwendet. Alle Transfektanten wurden auf die Fähigkeit untersucht, IFN-γ-Freisetzung durch TB515 zu induzieren.
3

(A) PTPRK mRNA Expression in Me15392 Zellen. 10 μg Poly(A)⁺mRNA, die aus Me15392 erhalten wurde, wurde durch Northern Blot analysiert. Hybrisierung wurde mit einem äquimolaren Gemisch von drei ³²P markierten Sonden durchgeführt, welche die extrazellularen, die transmembranen und die intrazellulären Bereiche der PTPRK cDNA durchspannen (siehe Materialien und Verfahren für Einzelheiten). Supen wurden mit einer vergleichbaren Menge mRNA beladen, wie sie durch konstitutive β-Actin Genhybridisierung (Daten nicht gezeigt) festgestellt wurde. Proben: Me15392, mRNA erhalten aus kultivierten 15392 Melanomzellen; PBL, Pool von mRNA von 4 gesunden Spender; A431, mRNA von epidermoider Tumorzelllinie.
(B) RT-PCR Analyse vom PTPRK mRNA Expressionsprofil. Der Bereich, der die intrazelluläre Phosphatasedomäne durchspannt, wurde durch die Primer F3/Rδ amplifiziert, die eine spezifische Amplifizierungsbande von 650 bp erzeugen. Die Reaktionsbedingungen wurden innerhalb des linearen Bereiches der DNA Amplifizierung eingestellt. Die Menge des Templats wurde abgestimmt, um vergleichbare Niveaus von β-Actin zu erhalten, und so einen direkten Vergleich des amplifizierten PTPRK unter den überprüften Proben zu erlauben. Als repräsentatives Beispiel wird die Auswertung der PTPRK Expression durch RT-PCR Analyse für 5 aus 10 überprüften Melanomzelllinien beschrieben: 4 metastatische (Me15392, Me335, Me337 und Me349) und eine primäre (Me366) Melanomenzelllinie. Ein PBL Pool von 4 gesunden Spender (PBL) und normale Melanocyten (FM2093) sind ebenfals eingeschlossen.

Die Abbildung ist repräsentativ für 3 unabhängige Experimente.
4
Charakterisierung von cDNA #11. cDNA #11 und verwandte Minigene werden als Kasten dargestellt, die zu einer schematischen Struktur des PTPRK Proteins ausgerichtet sind. Ein schwarzes Quadrat in jedem Minigene zeigt die Position eines ATG-Codons im Leseraster mit dem Start-ATG des Gens voller Länge an (GenBank NM_002844). Das mutierte Nucleotid (g→a), welches in Position 2249 auftritt, wird angezeigt. Minigene wurden durch PCR-Amplifizierung von cDNA #11 unter Verwendung eines identischen Primers (F2), synthetisiert, welcher mit unterschiedlichen, verschachtelten, umgekehrten Primer, die stromabwärts (downstream) der Mutation kartieren (EPR1, umgekehrter Primer EPR2, EPR2WT und EPR3, durch die Pfeile gezeigt). Minigenes wurden in den Expressionvektor pcDNA3/TOPO kloniert und dann mit pcDNA3-DRB1·1001 oder pcDNA3-DRB1·0102 in CIITA⁺-293 Zellen cotransfiziert. Klon TB515 (1 × 10⁵ Zellen/Well) wurde jedem Transfektanten hinzugefügt, und nach 24 h wurden die Überstände mittels ELISA hinsichtlich IFN-γ ausgewertet. In der Tabelle: +, positive Erkennung durch TB515; –, keine Erkennung durch TB515. EP2wt Minigen enthielt das nicht-mutierte (g) Nucleotid. Die Aminosäuresequenz an der Unterseite der Abbildung wurde aus der Sequenzierung von cDNA #11 abgeleitet. Abkürzungen in der Abbildung: LS, Leitsequenz; MAM, meprin/A5/R-PTPμ Motiv; Ig, immunoglobulinartige Domäne; FNIII, Fibronectin Typ III-artige Domäne; TM, Transmembran; PTP, Protein-Tyrosin-Phosphatasedomäne; R, Arginin, das von der Nucleotid g→a-Mutation abgeleitet ist.
5
Identifikation des TB515 Epitops. (A, B, C) LCL15392 Zellen (5 × 10³ Zellen/Well) für 2 h bei 37°C mit synthetischen Peptiden bei unterschiedlichen Konzentrationen gepulst wurden, wurden verwendet, um TB515-T-Lymphozyten zu stimulieren. Das TB515 (5 × 10³ Zellen/Well) wurde zugegeben und nach 18 h wurde das Medium gesammelt und IFN-γ mittels ELISA gemessen. Identische Resultate wurden mit LCL3700 erreicht und teilten nur das DRB·1001 mit pt15392 (nicht dargestellt). (D) 5 × 10³ LCL15392 Zellen wurden mit verschiedenen Konzentrationen der konkurrierenden Peptide für 15 Min. inkubiert. Konkurrierende Peptide schlossen ein: PYGFAAELPPRNLPEP, modifiziert in Position 3, der Wildtyp PYYFAAELPPGNLPEP und das HLA-A3 bindende Peptid ILRGSVAHK, welches als Negativprobe verwendet wurde. PYYFAAELPPRNLPEP Peptid wurde dann bei 100 nM hinzugefügt. Nach 1 Stunde zusätzlichem Inkubieren bei 37°C wurde TB515 (5 × 10³ Zellen/Well) hinzugegeben und das Medium wurde nach 18 h gesammelt und IFN-γ mittels ELISA gemessen. Identische Ergebnisse wurden mit LCL3700 erhalten, welches nur das DRB·1001 mit pt15392 teilt. Mutierte Aminosäure ist fett gedruckt; substituierte Aminosäuren sind unterstrichen.
6
Peptidspezifität des T Lymphozytklons TB48. LCL15392 Zellen (5,0 × 10³ Zellen/Well), die für 2 h bei 37°C mit den synthetischen Peptiden in unterschiedlichen Konzentrationen gepulst wurden, wurden verwendet, um TB48 zu stimulieren. Der Klon TB48 (5 × 10³ Zellen/Well) wurde zugegben und das Medium wurde nach 18 h gesammelt und IFN-γ mittels ELISA gemessen. Identische Ergebnisse wurden mit LCL3700 erreicht und teilten nur das DRB·1001 mit pt15392.
7
PTPRK epitopspezifische Immunität in PBMCs von pt 15392. PBMCs von pt15392, welche während der krankheitsfreien Periode 12 Monate nach der Operation erhalten wurden, wurden in vitro mit dem veränderten PYYFAAELPPRNLPEP Peptid stimuliert. Am Ende der dritten Woche des Züchtens, wurden die erzeugten T-Zelllinien durch die ELISPOT Untersuchung hinsichtlich der Fähigkeit untersucht, IFN-γ als Antwort auf Peptid- oder autologe Tumor-Stimulation in Anwesenheit oder in Abwesenheit des Anti-HLA-DR Ab L243 freizusetzen. T Zellen wurden inkubiert mit (1) Medium, (2) LCL15392, (3) LCL15392, gepulst mit 4 μg PYYFAAELPPRNLPEP, (4) LCL15392, gepulst mit 4 μg PYYFAAELPPRNLPEP und inkubiert mit 10 μg/ml Anti-HLA DR L243 Ab, (5) LCL15392 gepulst mit 2 μg PYYFAAELPPRNLPEP, (6) LCL 15392 gepulst mit 2 μg PYYFAAELPPRNLPEP und inkubiert mit 10 μg/ml Anti-HLA DR Ab L243, (7) LCL15392 gepulst mit 4 μg vom Wildtyp Peptid PYYFAAELPPGNLPEP, (8) autologes Me15392, (9) autologes Me15392 inkubiert mit Anti-HLA DR Ab L243.
Abkürzungen: pt15392, Patient 15392; LN, Lymphknoten, gp100, Glycoprotein 100; TRP-2, Tyrosinase-verwndtes Protein 2; PTPRK, rezeptorartiges Tyrosin-Phosphatase kappa Protein; RT-PCR, umgekehrt transkribierende Polymerasekettenreaktion; CIITA, Klasse II Transaktivator; Ii, unveränderliche Kette; GFP, grün fluoreszierendes Protein; LCL, lymphoblastoide EBV-trasformierte B-Zellline, MTS, melanosomales Transportsignal; MAM, meprin/A5/PTPRμ Motiv; E, Effektorzelle; T, Zielzelle; TCR, T-Zellrezeptor.
MATERIALIEN UND VERFAHREN
Zelllinien. Die Krankengeschichte des Patienten (pt) 15392 (HLA-A·0301, B·40012, B·1402, C·0602, C·8002, DRB1·0102, DRB1·1001) und die in vitro Stabilisierung der Melanomzelllinie Me15392 sind bereits beschrieben worden (16). Durch Zelloberflächenanalyse wurde gezeigt, dass Me15392 Zellen für Klasse I HLA positiv sind und konstitutiv DR, DP, aber nicht DQ Klasse II HLA exprimieren. LCL15392 und LCL3700 sind EBV-trasformierte B-Zelllinien, die aus periphären einkernigen Blutzellen (PBMCs) von pt15392 bzw. von einem gesunden Spender erhalten wurden. LCL3700 teilt mit pt15392 nur das DRB1·1001. 293-EBNA Zellen (wt293) (Invitrogen, CA 9200, USA) und Klasse II Transaktivator⁺ 293-EBNA Zellen (CIITA⁺293) wurden in DMEM Medium (Euroclone, Europa, TQ4 5ND Devon, UK) mit 10% FCS gehalten. CIITA⁺293 Zellen wurden erhalten, indem wt293 Zellen mit CIITA-codierendem retroviralem Vektor transduziert wurden. CIITA⁺293 Zellen wurden unter Verwendung von L243, einem mAb, welcher für HLA-DR Allele spezifisch ist, immunoselektiert.
Erzeugung von tumorspezifischen T-Zellklonen. Tumor-infiltrierende T-Lymphozyten (TIS), die aus einer, die 1991 chirurgisch von pt15392 entfernten metastatischen Läsion eines Lymphknotens gewonnen wurden, wurden durch Dichtegradient-Zentrifugierung isoliert. T-Zellen wurden zweimal in vitro mit bestrahlten autologen Tumorzellen in einem RPMI Medium, welches mit 300 IU/ml rekombinanten menschlichen IL-2 (EuroCetus, Amsterdam, Niederlande) und 10% vereinigtem menschlichen Ab Serum ergänzt wurde, stimuliert. Nach 3 Wochen in in vitro Kultur wurden T-Zellen geklont, indem die Verdünnung begrenzt wurde und die Klone wurden am Tag 15 hinsichtlich Wachstum gerscreent. Die Spezifizität der wachsenden T-Zellklone wurde in einer ⁵¹Cr-Freisetzungsuntersuchung analysiert; 140 unabhängige Klone zeigten eine TCR-vermittelte lytische Aktivität gegen den autologen Tumor. 40 Klone zeigten eine HLA-DR-eingeschränkte Erkennung des autologen Tumors und wurden zur weiteren Analyse ausgewählt. Um die Klonalität zu bestätigen und um die Klone mit identischer TCR-Spezifität einzustufen, wurde das TCR-Repertoire jedes Klons durch revers transkribierende (RT) PCR unter Verwendung einer Palette von TCR AV und TCRBV spezifischen Primern, wie zuvor beschrieben, klassifiziert (17).
Cytokinfreisetzungsuntersuchung. Lymphozyten wurden in 96 Well-Platten mit U-förmigem Boden mit 10⁴/Well Melanomzellen angeimpft (5 × 10³ in 50 μL) oder mit 5 × 10³ autologen LCL, welche 2 h bei 37°C mit unterschiedlichen Dosen von Peptiden gepulst wurde, in einem Endvolumen von 0,2 ml RPMI 1640 ergänzt mit 10% von vereinigtem menschlichen Serum (PHS). Nach Inkubation über Nacht bei 37°C wurden die Überstände gesammelt und der Cytokininhalt mittels ELISA (Endogen, Woburn, MA 01801, USA) bestimmt.
Cytotoxizitätsbestimmung. Die Sensitivität von Zielzellen gegenüber Lysis wurde durch eine Standard-⁵¹Cr-Freisetzungscytotoxizitätsuntersuchung an unterschiedlichen Effektoren bestimmt: Ziel (E:T) Verhältnis. Die ⁵¹Cr-Freisetzungsuntersuchung wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt (16).
HLA-DRB1·0102- und DRB1·1001-Klonen. cDNA-Klone, welche die HLA-DRB1·0102- und DRB1·1001-Ketten von pt15392 kodieren, wurden durch RT-PCR erhalten, ausgehend von Poly(A)⁺ RNA, die aus 15392LCL präsentiert wurde. Eine Amplifizierung wurde mittels der Primer durchgeführt, die spezifisch für konservierte 5' und 3' Bereiche von DRβ 1 Ketten (vorwärts 5'-CGCGGATCCAGCATGGTGTGTCTG-3'; rückwärts 5'-GGAATTCCTCAGCTCAGGAATCCTGTT-3') sind und die PCR-Produkte wurden in den pcDNA3.1/V5-His TOPO Vektor (Invitrogen) geklont.
Herstellung und Screening der Tumor-abgeleiteten cDNA Bibliothek. Poly(A)⁺RNA, die aus Me15392 Zellen unter Verwendung des FASTRACK-Kits (Invitrogen) isoliert wurde, wurde mittels des Superscript Choise Systems (Life-Technologies) unter Verwendung eines oligo(dT)-Primers [5'-pGACTAGTTCTAGATCGCGAGCGGCCGCCC(T)₁₅-3'], der eine XbaI Schnittstelle enthält (unterstrichen), in cDNA konvertiert. Die cDNA wurde an EcoRI-BstxI Adaptoren (Stratagene) ligiert, mit XbaI verdaut, und in die XbaI und BstxI Schnittstellen des Polylinkers eingefügt, der sich am 3' Ende des unveränderlichen Ketten cDNA Inserts (Ii, Aminosäuren 1–80) im Expressionvektor pEAK8.5/Ii befindet, so dass eine Ii/Tumor-abgeleitete Verschmelzungs-cDNA-Bibliothek erzeugt wird. E. Coli DH5α Zellen wurden durch Elektroporation mit den rekombinanten Plasmiden transformiert und mittels Ampicillin (0,1 g/Liter) selektiert. Die Bibliothek wurde in 1400 Pools von jeweils ungefähr 100 cDNA rekombinanten Klonen aufgeteilt; die Pools wurden über Nacht in LB Medium plus Ampicillin (0,1 g/Liter) wachsen gelassen, und Plasmid-DNA wurde mittels des QIAprep 96 Plasmid-Kits (Qiagen) extrahiert.
CIITA⁺293-Zellen, die in 96 Mikrowellplatten mit flachem Boden angeimpft wurden (5 × 10⁴ Zellen/Well), wurden mit 150 ng eines Pools der cDNA-Bibliotheken und 150 ng des Plasmids, das entweder HLA-DRB1 oder HLA-DRB10 enthält, unter Verwendung von lipofectAMINE (Invitrogen) cotransfiziert. Nach 24 h wurden zu jeder Mikrokultur 1 × 10⁴ Zellen/Well CD4⁺T Klone TB515 hinzugefügt; 24 h später wurden 100 μl Überstands gesammelt und die INF-γ-Produktion wurde mittels ELISA-Test gemessen.
Herstellung und Sequenzierung von Minigenen. cDNA #11 Sequenzierung wurde mittel Primern durchgeführt, die in die Bereiche des pEAK8.5/Ii-Vektors, welche an das Insert angrenzen (vorwärts 5'-ACCTCGATTAGTTCTCGAGCTT-3', rückwärts 5'-ATTAGGACAAGGCTGGTGGGCACT-3') kartieren. Die nicht-konservative Punkt-Mutation (g→a) wurde entweder durch Sequenzierung beider DNA-Stränge der amplifizierten Produkte von revers-traskribierter Me15392 Poly(A)⁺RNA (Vorwärtsprimer F2 5'-GTGCTCCTATCAGTGCTTAT-3', Rückwärtsprimer R2 5'-GCGTACGCACTGGGTTTT-3') oder von Me15392 genomischer DNA (Vorwärtsprimer 5'-CTGCACCCACACCGAACCAAGAGAGAA-3', Rückwärtsprimer 5'-CGCCTGGAAATAGATGTTGTATCCTTT-3') bestätigt.
Mini-Gene wurden aus cDNA #11 als PCR-Amplifizierungsprodukte unterschiedlicher Länge dargestellt. Alle Amplikone wurden unter Verwendung des gleichgerichteten Primers F2 erhalten, der mit vier unterschiedlichen Antisense-Primern verbunden ist: EPR1 5'-CCGATTGTCACCCACAGTGAA-3', EPR2 5'-GGGCAGGCTCAGGTA-3', EPR3 5'-CTCGGGGGGAGTTCT-3', und EPR2WT 5'-GGGCAGGCTCAGGTAGGTTTCCCG-3'. Der letzte wurde für die Herstellung des EP2wt-Minigens verwendet, welches das Wildtyp-Nucleotid enthält (im EPR2WT Primer unterstrichen). PCR-Produkte wurden in den pcDNA3.1/V5-His TOPO Vektor kloniert.
Das Ii-EP2wt Verschmelzungsminigene wurde durch Herausschneiden des EP2wt Minigens aus dem TOPO Vektor mittels AscI und XbaI Enzymen erreicht, gefolgt vom Klonieren des Inserts in die AscI und XbaI Schnittstellen des pEAK8.5/Ii Vektors. Diese Reaktion führte zu einem im Leserahmen befindlichen Verschmelzungs- bzw. Fusionskonstrukt.
Northern Blot und RT-PCR Analyse der R-PTPK Expression. Poly(A)⁺RNAs aus Me15392, allogenen Melanomen und PBL-Linien wurden wie oben beschrieben isoliert. Gesamt-RNA wurde unter Verwendung des RNAqueous^TM 4PCR Kits (Ambion, Austin, TX, 78744, USA) isoliert. Für Northern Blot-Experimente wurden 10 μg jeder RNA-Probe einer Elektrophorese in einem 1% Formaldehyd-Agarose-Gel unterworfen und auf eine Nylonmembran (Hybond-N+, Amersham Biosciences, Inc. Piscataway, NJ 08855-1327, USA) überführt. Die Sonden wurden mit [alpha-³²P] CTP mittels des random priming Verfahrens (Amersham Biosciences) markiert und Vorhybridisierung und Hybridisierung wurden entsprechend den Hybond-N+ Richtlinien durchgeführt. Membranen wurden viermal mit reihenweise verdünnten Lösungen von SSC gewaschen (von 0,03 M bis 0,0015 M). Sonden A und C wurden durch PCR-Amplifizierung von Me15392 Poly(A)⁺RNA mit spezifischen Primern erhalten. Sonde A, die für den 5'-Bereich des Gens spezifisch ist (Gases 241–1110 des Gens), wurde mit Primern vorwärts F1 (5'-GGCGCTGCCTGCTTTTGT-3') und rückwärts R1 (5'-GGAGGAGCAATGGGTCTT-3') synthetisiert. Sonde C, die für den Bereich spezifisch ist, welcher die zwei intrazellulären Phosphatasedomänen kodiert (Basis 2925–4547 des Gens), wurde mittels Primern vorwärts F3 (5'-CTTGGGATGTAGCTAAAAAAGATCAAAATA-3') und rückwärts STOP (5'-CCAACTAAGATGATTCCAGGTACTCCAA-3') abgeleitet. Alle Amplifikationsprodukte wurden sequenziert, bevor sie als Sonden verwendet wurden. DNA Klon #11 (Basis 2084–2751 des Gens) wurde als Sonde B verwendet.
Die RT-PCR-Analysen des PTPRK-Expressionsprofils in normalen und in Tumorzelllinien wurden mit dem Vorwärtsprimer F3 und mit dem Rückwärtsprimer R8 (5'-CACCCTCTCTTTCAGCCAT-3') unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: 2' 94°C, 34 Zyklen bestehend aus 1' 94°C, 2' 54°C, 3' 72°C, und schließlich 10' 72°C. Die Bedingungen wurden eingestellt, um eine lineare amplifizierung der DNA zu erreichen. Die amplifizierten DNAs wurden auf Agarose-Gele gegeben, mit Ethidium-Bromid gefärbt und mit einer bestimmten Software (Image Master-VDL-CS, Amersham Pharmacia Biosciences) analysiert. Die Standardabweichungen betrugen ≤ 5% bei dreifachen Experimenten. Das Niveau der Expression jeder Probe wurde für RNA-Vollständigkeit normalisiert, indem das Niveau der Expression des β-Actin-Gens (Reaktionsbedingungen: 4' 94°C, 21 Zyklen bestehend aus 1' 94°C, 2' 68°C, 1' 72°C, und schließlich 10' 72°C, entsprechend der linearen DNA-Amplifizierung) berücksichtigt wurde.
Peptidsynthese. Peptide wurden durch herkömmlichen Festphasenpeptidsynthese unter Verwendung von Fmoc für vorübergehenden NH₂-Endgruppenschutz synthetisiert und durch Massenspektrometrie charakterisiert. Alle benutzten Peptide waren > 95% rein (Neosystem, Straßburg, Frankreich). Peptide wurden bei 5 mg/ml in DMSO gelöst, bei –20°C gelagert, und direkt vor Gebrauch mit einem RPMI Medium verdünnt, welches mit 10% menschlichem Serum versetzt ist.
Epitopewiederherstellunguntersuchung. Um die Peptiderkennung zu analysieren wurden 5 × 10³ Zellen LCL15392 oder LCL3700 in 96 Mikrowellplatten in 100 μl RPMI 1640-10% PHS angeimpft und dann mit unterschiedlichen Konzentrationen des relevanten Peptids gepulst. Die Peptidbeladung wurde für 2 h bei 37°C fortgesetzt, bevor Effektorzellen zugesetzt wurden, um ein abschließendes E:T Verhältnis von 1:1 zu erhalten. Die Überstände wurden nach 18 h gesammelt und der IFN-γ-Gehalt wurde mittels ELISA (Mabtech AB, Stockholm, Schweden) bestimmt. Konkurrenzversuche wurden durch Inkubieren von 5 × 10³ LCL15392 oder 5 × 10³ LCL3700 mit verschiedenen Konzentrationen der Konkurrenzpeptide für 15 Minuten vor dem Hinzufügen von 100 nM des PYYFAAELPPRNLPEP Peptids durchgeführt. Nach 1 Stunde zusätzlichen Inkubierens bei 37°C, wurde der T-Zellklon wurde im abschließenden Verhältnis von 1:1 hinzugefügt.
Erzeugung von PTPRK-spezifischen T-Zellen aus pt15392 PBMCs. PBMCs aus pt15392, welche innerhalb von 12 Monaten nach der Operation während der krankheitsfreien Periode der Nachsorge erhalten wurden, wurden in vitro mit PYYFAAELPPRNLPEP Peptid, wie zuvor beschrieben (15) stimuliert. Kurzgesagt, PBMCs (2 × 10⁶/Well) wurden wöchentlich mit autologen Peptid-gepulsten Monocyten stimuliert. Am Ende jeder Stimulation wurde die Peptid-spezifische Reaktivität durch Elispot-Untersuchung überwacht.
IFNγ-Elispot Probe. 96-Well-Nitrozelluloseplatten (Millititer, Millipore, Bredford, MA) wurde über Nacht mit 50 μl/Well von 8 μg/ml anti-Mensch IFN-γ mAb (Mabtech) beschichtet. Die Wells wurden dann mit Iscove's modifiziertem DMEM (BioWhittaker) und 10% menschlichem Ab-Serum für 2 h bei 37°C gewaschen und blockiert. T Zellen (2 × 10³ oder 2 × 10⁴) wurden mit 1,5 × 10⁴ Peptid-gepulsten autologen LCL-Zellen gemischt und dann in die 96 vorbeschichteten Wells geimpft. T-Zellen wurden mit dem Medium allein, oder mit Mitogen der asiatischen Kermesbeere, welches als negative bzw. positive Kontrolle diente, inkubiert. Nach 24 h Inkubieren bei 37°C und 5% CO₂ wurde dann entsprechend den Herstelleranweisungen Elispot durchgeführt. Kurzgesagt, die Platten wurden sechsmal mit PBS + 0.05% Tween-20 gewaschen. Vertiefungen wurden für 2 h bei 37°C mit 50 μl/Well von biotinyliertem Maus anti-Mensch IFN-γ mAb (Mabtech) bei einer Konzentration von 2,5 μg/ml inkubiert. Nach viermaligem Waschen mit PBS, wurden 100 μl Streptavidinalkalische Phosphatase (150 μg/ml) 1/1000 verdünnt, für 2 h bei Zimmertemperatur hinzugefügt. Nach einem anderen Waschenschritt mit PBS wurden jedem Well für 10–20 Min. 100 μl/Well von BCIP/NBT Substrat (BioRad, Ca, 94547, USA) hinzugefügt. Die Farbentwicklung wurde durch Waschen unter laufendem Leitungswasser angehalten. Nach Trocknen bei Zimmertemperatur wurden IFNγ-sekretierende T-Zellen, mit dem automatisierten Bildanalyse-System Elispot Reader gezählt (AID, Strassberg, Deutschland). Jedes Experiment wurde dreimal durchgeführt.
ERGEBNISSE
Tumor-spezifische CD4⁺T Zellenklone. 40 tumorspezifische CD4⁺T-Zellklone (15392CD4⁺T) wurden erhalten, indem die Verdünnung begrenzt wurde, TIL aus einer LN Metastase von pt15392 isoliert wurden, und sie in vitro für zwei Wochen mit dem autologen Tumor stimuliert wurden. TCR Analyse mittels RT-PCR zeigte, dass alle Klone in 5 unterschiedliche Teilmengen entsprechend der TCRAV und TCRBV Kombination (Tabelle) gruppiert werden können. Funktionelle Studien wurden an einem einzelnen T-Zellklon durchgeführt, der für jede Teilmenge repräsentativ ist. Für alle Klone wurde gefunden, dass sie in Antwort auf Tumor-Stimulation identische funktionelle Aktivität zeigen. Die Daten, die in Tabelle 1 angeführt werden, wurden mit Klon TB515 erhalten und sind für alle untersuchten T-Zellenklone repräsentativ. Nach Stimulation mit dem autologen Melanom zeigten alle Klone eine HLA-DR eingeschränkte lytische Aktivität gegenüber Me15392 Zellen, da die Lysis, welche durch eine ⁵¹Cr-Freisetzungsuntersuchung erfasst wurde, in Anwesenheit von L243, einem mAb, welcher auf einen monomorphen bestimmenden Faktor von HLA-DR gerichtet ist, stark inhibiert war (1A). Außerdem setzten die tumorspezifischen CD4⁺T-Zellklone nach Tumor-Stimulation auch einen Cytokincocktail frei, der zum Th1 Profil kompatibel ist, einschließlich INF-γ, GM-CSF, TNF-α und IL-2, aber nicht IL-4 und TGFβ (1B).
Mutiertes PTPRK Gen kodiert das TB515 Epitop. Wegen seiner in vitro Wachtumskapazität wurde TB515 weiterhin ausgewählt und verwendet, um das melanomspezifische Antigen molekular zu charakterisieren. Der genetische Ansatz, der zu diesem Zweck gewählt wurde, wurde als Optimierung kürzlich veröffentlichter Verfahren entwickelt, die für die Identifizierung der Tumorantigene (18–20) verwendet wurden. Die 293-EBNA1-Zellen, welche stabil mit CIITA cDNA (CIITA⁺293) transfiziert wurden (21), wurden als Empfänger für die cDNA Tumorbibliothek verwendet. FACS Analyse mit anti- HLA-DR Ab zeigte eine bedeutende Zunahme der Expression des Klasse II HLA bei CIITA⁺293-Zellen (nicht gezeigt) auf. Um die Einführung der Tumor-abgeleiteten Proteine in die Klasse II HLA Verarbeitungsbahnen zu erzwingen, und so möglicherweise die Empfindlichkeit unseres Screening-Verfahrens zu erhöhen, konstruierten wir eine chimere unveränderliche Kette (Ii)/Tumor cDNA Bibliothek (22). Die in Pools unterteilte cDNA Bibliothek wurde dann in CIITA⁺293-Zellen zusammen mit 100 ng des Plasmids trannsfiziert, das DRB1·0102 oder DRB1·1001 Allele enthält, die vom gleichen Patienten kloniert wurden.
Das Screening von Transfektanten führte zur Isolierung eines positiven cDNA Klons (cDNA #11), der durch TB515-T-Zellen erkannt wurde, wenn er in CIITA⁺293 mit DRB1·1001 (CIITA⁺-DRB10⁺293) co-transfiziert wurde, aber nicht wenn er mit dem Allel DRB1·0102 (CIITA⁺-DRB1⁺293) co-transfiziert wurde (2A). Es trat keine Erkennung auf, wenn cDNA #11 und DRB1·1001 in 293 transfiziert wurden, welches nicht durch CIITA (wt293) modifiziert wurde, was wieder die Notwendigkeit einer aktiven Klasse 11-HLA Verarbeitungsmaschinerie für die Aktivierung von TB515 zeigt.
DNA-Sequenzanalyse zeigte, dass cDNA #11 homolog zu einem Teilbereich des rezeptorartigen Tyrosin-Phosphatase-Kappa Proteins (PTPRK, GenBank NM_002844) ist, einer Tyrosinphosphatase des Typs II (PTPs), welche eine der fünf Unterfamilien von transmembranen rezeptorartigen PTPs ist (23). Die Tumor-abgeleitete cDNA #11 erstreckt sich von 2084 bp bis 2751 bp der veröffentlichten NM_002844 PTPRK cDNA-Sequenz, welche die Region umfasst, die für die vierte am weitesten am C-Ende liegende extrazellulare Fibronectin III-artige Domäne, die vollständige Transmembrandomäne und die allererste intrazellulare Sequenz kodiert. Der Klon zeigte eine nicht-konservative g→a Mutation bei Nucleotid 2249 in der vierten Fibronectin III-artigen Domäne des Gens (NM_002844), was zu einem Glycin-zu-Arginin Austausch (G→R) im entsprechenden Protein führte (die GenBank Zugangsnummer für die Sequenz von PTPRK cDNA, abgeleitet von Me15392, ist AF533875).
Um zu bestätigen, dass dieser Aminosäure-Austausch nicht eine einzelne Nucleotidpolymorphie erklärt, sondern eine somatische Mutation darstellt, die im Tumor-Gewebe auftritt, wurde der Bereich, welcher die Mutation umfasst, amplifiziert und sequenziert, entweder beginnend von genomischer DNA oder cDNA, die sowohl aus PBL, als auch aus LCL von pt15392 erhalten wurde. Keine der analysierten Proben zeigte den g→a Übergang und es wurde nur die Wildtypsequenz gefunden (Daten nicht gezeigt). Außerdem wurden DNA und cDNA, die von 10 zusätzlichen Melanomzelllinien abgeleitet sind, ähnlich analysiert, aber keine von ihnen zeigte irgendeine Mutation an Nucleotid 2249.
Unveränderliche Kettensequenz ist für die HLA-Klasse II Präsentation des R-PTPK abgeleiteten Epitops nicht notwendig. Die Sequenzanalyse des rekombinanten Plasmids, welches den cDNA Klon #11 enthält, zeigte, dass die Ii-Kettentranslation in Bezug auf den Rahmen, der der entsprechenden der korrekten Translation des PTPRK Proteins entspricht, verschoben wurde. Folglich postulierten wir die Existenz eines zusätzlichen offenen Leserahmens im rekombinanten Plasmid, der durch ein zusätzliches internes ATG geregelt wird. Durch das Analysieren der Sequenz von cDNA #11 fanden wir eine Kozak-artige Sequenz ((g/a)nnatgg) deren ATG (Position 2165 in der GenBank NM_002844 Sequenz) sich im Rahmen mit dem authentischen ersten Start-Methionin des PTPRK Gens befand. Um die autarke Translationskapazität dieses inneren ATG-Codons zu überprüfen, wurde cDNA #11 aus dem pEAK8.5/Ii Vektor herausgeschnitten und in den Expressionvektor pcDNA3.1 eingefügt, welcher kein Ii enthält. Das neue rekombinante Plasmid wurde dann bezüglich der Kapazität untersucht, die TB515 Aktivierung auszulösen, wenn es in CIITA⁺293 Zellen zusammen mit dem DRB1·1001 transfiziert wird (2B). Wie erwartet, induziert die cDNA #11, welche in Abwesenheit der Ii-Kette kloniert wurde, INF-γ-Freisetzung durch den TB515-Klon in einer spezifischen DRB1·1001-eingeschränkten Weise. Die Erkennung war so wirksam wie die von cDNA #11 im pEAK8.5/Ii Vektor oder Me15392 Tumor (2B), was zeigt, dass in Abwesenheit des Ii-Startcodon, cDNA #11 von seinem eigenen internen ATG translatiert werden konnte, und dass außerdem cDNA #11 an sich auf einem HLA-Klasse II Weg natürlich verarbeitet und präsentiert werden konnte, ohne Notwendigkeit für eine Ii-Kette-vermittelte intrazelluläre Umlenkung.
Expression-Muster von R-PTPK mRNA. Um mehr Information über die PTPRK-spezifischen Transskripte im Me15392 zu erhalten, wurde eine Northern Blot-Analyse durchgeführt (3). Um die gesamte PTPRK mRNA zu erfassen, wurde Hybrisierung mit einem äquimolaren Gemisch von drei spezifischen Sonden durchgeführt, die in unterschiedlichen Bereichen des PTPRK Gens kartieren. Die überprüften Proben schlossen auch PBL Poly(A)⁺RNA als Negativkontrolle der PTPRK Expression mit ein und die transfomierte epidermale Zelllinie A431 als Positivekontrolle des Transskripts voller Länge, da diese Zelllinie dafür bekannt ist, ein hohes Niveau von PTPRK Gen-Expression zu haben (24). Melanocyten konnten nicht analysiert werden, da aus den in vitro gewachsenen Zellen nicht genügend mRNA erhaltenen wurde. Wie erwartet, wurde keine wesentliche Hybridisierungsbande in PBL beobachtet, was vorhergehende Daten (24) bestätigt, während sowohl A431 als auch Me15392 Poly(A)⁺RNA ein eher kompliziertes Muster erzeugten (3A). Obgleich zusätzliche spezifische Banden um 1800 bp und 1000 bp klar nachweisbar waren, zeigten beide Proben ein intensives Signal bei ungefähr 5600 bp entsprechend dem Transskript in voller Länge. Zusammengenommen deuten diese Resultate zusammen zeigen, dass Me15392 ein komplettes PTPRK Protein exprimieren kann, während die biologische Bedeutung der unvollständigen mRNA Transskripte noch zu untersuchen bleibt.
Die Expression von PTPRK mRNA in anderen Tumor- und in Nichttumorzellen wurde mittels RT-PCR untersucht. RT-PCR Amplifizierungen wurden an der Gesamt-RNA mittels des Primerpaars F3/Rδ durchgeführt, welches in der intrazellularen Phosphatase Domäne kartiert, welche am weitesten N-wärts liegt (Länge des amplifizierten Produkts 650 bp). Die Primern waren entworfen, um hochspezifisch für das PTPRK Gen zu sein. Ihre Spezifität wurde experimentell bestätigt, und die Amplifizierungsprodukte, die aus den unterschiedlichen Zelllinien erhalten wurden, wurden sequenziert und zeigten, dass sie nur mit PTPRK korrespondierten, während keine Sequenzen anderer R-PTP oder PTP Gene, sogar solcher mit hoher Homologie zu PTPRK, gefunden wurden. Die Reaktionsbedingungen wurden eingestellt, um ein lineare DNA-Amplifizierung zu erreichen, und eine vergleichbare Menge mRNA wurde aus jeder Zelllinie verwendet, wie durch β-Actin-Amplifizierung gezeigt. Während ese in den Melanocyten (FM2093 Zelllinie) klar nachweisbar war, wurde PTPRK in 10 untersuchten Melanomzelllinien anders exprimiert, von denen 5 nur eine kaum nachweisbares Bande zeigten, die mit jener vergleichbar ist, die aus PBL erhalten wurde, das in der Northern Blot-Analyse negativ war (3A). Einige repräsentative Beispiele werden in 3B gezeigt.
Identifikation von PTPRK-abgeleitetetem Peptid, welches das Epitope für TB515 wiederherstellt. Um die Bedeutung der G→R Mutation für die T-Zell-Erkennung zu beurteilen, wurde eine Wildtypversion (nicht mutiert) von cDNA #11 durch PCR-Reaktion synthetisiert und mit cDNA DRB1·1001 in CIITA⁺293-Zellen cotransfiziert. Es wurde keine Erkennung der Wildtypsequenz durch die tumorspezifischen 15392CD-Klone beobachtet (Daten nicht gezeigt), was eine direkte Rolle der mutierten Aminosäure bei der Epitopbildung nahe legt. Um den epitopkodierenden Bereich von cDNA #11 weiter einzugrenzen, wurde eine Reihe von Mini-Genen durch PCR Reaktionen von cDNA #11 unter Verwendung eines identischen Vorwärtsprimers (F2) synthetisiert, der mit unterschiedlichen verschachtelten Rückwärtsprimern (reverse primer) verbunden ist, die jenseits der Mutation kartieren (4). Die Minigene, die alle das ATG-Startcodon für cDNA #11 enthielten, wurden in den Expressionvektor pcDNA3/TOPO (Invitrogen) kloniert, dann in CIITA⁺293 tranfiziert, die jeweils entweder DRB1·0102 oder DRB1·1001 exprimieren und schließlich bezüglich TB515-Erkennung ausgewertet. Das Minigene EP2 war das kürzeste Konstrukt, das erkannt wurde. Wie erwartet, wurde die Wildtypversion des EP2 Minigens (EP2WT), welches mittels des Rückwärtsprimers EPR2WT erhalten wurde, welcher das Wildtyp-Nucleotid (a/g Fehlordnung) trägt, nicht durch TB515 Lymphozyten erkannt, wenn dieses in den Expressionvektor mit oder ohne die unveränderliche Kette kloniert wurde.
Diese Transfizierunsversuche grenzten den möglichen immunogenen Aminosäurebereich auf ein 26 Amionosäuren-langes Peptid ein, das die Mutation enthielt und in 4 gezeigt ist. Um das TB515 Epitope zu identifizieren, wurden mehrere hexadecamerüberlappende Peptide synthetisiert, die den identifizierten 26 Aminosäurenbereich durchspannten. Die Peptide wurden in unterschiedlichen Dosen bezüglich ihrer Fähigkeit ausgewertet, autologe LCL Zellen in vitro für die Erkennung des Anti-Melanom-TB515-Klons zu sensibilisieren. Unter den untersuchten Hexadecamerpeptiden war PYYFAAELPPRNLPEP (PTPRK_(667-682)), welches sich von Aminosäure 667 bis 682 des Proteins erstreckt und die Mutation enthält (5, in fett), jenes, welches die stärkste INF-γ-Freisetzung durch den Klon TB515 verursachte. In der Tat zeigten Titrierversuche, dass dieses Peptid durch TB515 Zellen bei einer Konzentration so niedrig wie 10 nM erkannt werden kann, seine Halbmaximum-Wirkung bei 100 nM erreichte (5A). Die Substitution des mutierten Arginin-Restes mit dem Wildtypglycin im immunogenen Peptid (5A) hob die stimulierende Fähigkeit komplett auf, was definitiv die Bedeutung der Mutation für T-Zell-vermittelte Erkennung zeigt. Weitere Versuche mit den Peptiden, die nach und nach entweder am 5'- oder 3'-Ende einen Aminosäure-Rest verlieren (5B und 5C) waren darauf gerichtet, sowohl den minimalen Epitopkern, als auch mögliche Ankeraminosäuren zu identifizieren. Insbesondere die Auslassung oder der Ersatz mit nicht relevanten Aminosäuren von Y₆₆₉ (5B) oder L₆₇₉ und N₆₇₈ (5C) beeinflusste stark die Fähigkeit des PTPRK_(667-682) Peptids, den Klon TB515 zu stimulieren, was eine Rolle dieser Aminosäuren in Position 3, 11 und 12 bei der Bildung des HLA-DR10/Peptid/TCR-Komplexes nahe legt. Das Wildtyppeptid PYYFAAELPPGNLPEP und das PTPRK_(667-682), in dem das Y₆₆₉ durch ein G ersetzt ist, waren beide in der Lage, das HLA-DR10 zu binden, da sie in einer Konkurrenzuntersuchung wirksam die Erkennung des PTPRK_(667-682) Peptids durch Klon TB515 inhibierten (5D). Die andere 4 T-Lymphozytenklone, welche so beschrieben wurden, dass sie unterschiedliche TCR haben, waren in der Tat gegen das gleiche Epitop gerichtet, sie erkannten das Wildtyppeptid nicht und sie alle zeigten eine ähnliche Affinität für das mutierte Peptid, wie das, welches für TB515 beobachtet wurde (Daten nicht gezeigt). Außerdem wurde das PTPRK_(667-682) Peptid, welches eine Substitution am Rest Y₆₆₉ trägt, wirksam durch den Klon TB48 erkannt, was bestätigte, dass Y₆₆₉, obgleich es wesentlich für die TB515-vermittelte Erkennung ist, die HLA-DR10 Bindefähigkeit des PTPRK_(667-682)-Peptids nicht entscheidend beeinflusste (6).

Pt15392 entwickelte systemische Immunität gegen das PTPRK-abgeleitete, HLA-DR10 präsentierte Epitop. Um festzustellen, ob pt15392 auch eine systemische, Epitop-spezifische T-Zellimmunität entwickelte, wurden PBMCs, die 12 Monate nach der operativen Resektion der Lymphknotenmetastase erhalten wurden, in vitro mit PYYFAAELPPRNLPEP Peptid bei 1 μM kultiviert. Nach 3 Wochen der in vitro Stimulation mit Peptid-gepulsten autologen Monocyten, zeigten die kultivierten T-Zellen eine Peptid-spezifische Reaktivität, wie durch eine Elispot-Untersuchung festgestellt wurde, was die Anwesenheit von Peptid-spezifischen T-Zellen im peripheren Blut zeigt (7). Diese Zellen waren auch in der Lage, den autologen Tumor auf eine HLA-DR eingeschränkte Weise zu erkennen. Andererseits war keine spezifische Reaktivität in PBMCs nachweisbar, die von DRB1·1001 positiven gesunden Spender erhalten wurden. Tabelle Funktionelle Charakterisierung und TCR-Expression von tumorspezifischen CD4⁺T-Klonen.

			Erkennung des autologen Tumors
^aUntersatz	^bKlon	^cTCRAV/TCRBV	^dLysis (%)	^eIFN-γ-Freisetzung (pg/ml)
T1	TB 515	13/21	50 (10)	1000	(200)
T2	TB 426	3/13	74 (35)	1200	(300)
T3	TB 48	3/21	35 (15)	1100	(200)
T4	TB 674	13/19	12 (5)	800	(100)
T5	TB 89	17/21	41 (10)	1060	(200)

^aVierzig Anti-Melanom 15392CD4⁺T-Zellklone durch begrenzte Verdünnung von 15392CD4⁺TIL erhalten, welche mit dem autologen Melanom in vitro zwei Wochen lang stimuliert wurden. Die 15392CD4⁺T-Klone wurden in 5 einzelne Untersätze (T1–T5) gruppiert, welche unterschiedliches TCRAV und TCRBV exprimieren.
^bFür jeden Untersatz ist ein tumorspezifischer Klon bezeichnet, der in vitro weiter kultiviert und expandiert wurde.
^cDie Analyse von TCR wurde mittels RT-PCR, unter Verwendung einer Palette von TCR Vα und Vβ Primern, durchgeführt (siehe Materialien und Verfahren).
^dDie Fähigkeit der bezeichneten Klone, den autologen Tumor zu lysieren, wurde in einer 5 h ⁵¹Cr-Freisetzungsuntersuchung bei einem E:T-Verhältnis von 30:1 untersucht. Die Daten werden als % der Lyse angegeben. Zahlen in Klammern beziehen sich auf % der Lyse, welche in Gegenwart des monoklonalen anti-HLA-DR L343 mAb, verwendet bei 10 μg/ml Endkonzentration, erreicht wurde.
^eEine Cytokin-Freisetzungsuntersuchung wurde durchgeführt, um die Fähigkeit der bezeichneten T-Zellklone zu bestimmen, den autologen Tumor zu erkennen (siehe Materialien und Verfahren für Details). Die Menge der IFN-γ-Freisetzung nach Tumorstimulation in Abwesenheit oder in Anwesenheit (Werte in Klammern) von L343, welches bei 10 μg/ml Endkonzentration verwendet wurde, ist in pg/ml ausgedrückt.

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SEQUENZLISTE

Claims

PTPRK_Gly677→Arg immunogenes Peptid von SEQ ID N. 1.
Monoklonaler oder polyklonaler Antikörper oder ein aktives Fragment davon, welcher bzw. welches selektiv an das Peptid gemäß Anspruch 1 bindet.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül, welches das Peptid gemäß Anspruch 1 codiert.
Expressionsvektor, der das Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 3 trägt.
Wirtszelle, die den Vektor gemäß Anspruch 4 enthält.
Isolierter CD4+ T-Lymphozyt, der in der Lage ist das Peptid SEQ ID N. 1, welches mit einem HLA-Klasse II Molekül assoziiert ist, selektiv zu erkennen und zu binden.
T-Lymphozyt gemäß Anspruch 6, der selektiv einen Peptid/HLA-DRβ1·1001-Komplex erkennt und bindet.
Antigenpräsentierende Zellen, die das Peptid SEQ ID N. 1 tragen, das an ein HLA-DRβ1·1001-Molekül gebunden ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die das Peptid SEQ ID N. 1 oder ein Nukleinsäuremolekül welches es codiert in Mischung mit pharmazeutisch akzeptablen Hilfsstoffen enthält.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 9, in Form eines Impfstoffs.
Verwendung des Peptids SEQ ID N. 1, von Nukleinsäuremolekülen, die es codieren, oder von APCs (antigenpräsentierende Zellen) gemäß Anspruch 8 oder T-Lymphozyten gemäß den Ansprüchen 6–7, zur Herstellung eines Medikaments zur präventiven oder therapeutischen Behandlung von Krebs.
Verwendung gemäß Anspruch 11 zur präventiven oder therapeutischen Behandlung von Melanomen, die PTPRK_Gly677→Arg exprimieren.
Verwendung des Peptids SEQ N. 1 oder eines Nucleinsäuremoleküls, welches diese codiert, zur Herstellung einer diagnostischen Zusammensetzung.
Verwendung gemäß Anspruch 13, wobei die diagnostische Zusammensetzung bei der Charakterisierung von Melanomen verwendet wird, die PTPRK_Gly677→Arg exprimieren.