JP3399943B2

JP3399943B2 - 癌胎児性抗原を発現する組換えウイルスとその使用方法

Info

Publication number: JP3399943B2
Application number: JP51202592A
Authority: JP
Inventors: スクロム，ジェフリー; カンター，ジュディス
Original assignee: US Government
Current assignee: US Government
Priority date: 1991-05-06
Filing date: 1992-05-06
Publication date: 2003-04-28
Anticipated expiration: 2018-04-28
Also published as: CA2102623A1; DK0584266T3; ATE248924T1; JPH06508025A; AU2006092A; EP0584266A4; EP0584266B1; EP0584266A1; DE69233186T2; WO1992019266A1; AU674492B2; US5698530A; ES2206446T3; CA2102623C; DE69233186D1

Description

【発明の詳細な説明】発明の背景発明の技術分野本発明は一般に組換えウイルスに関する。詳しくは本
発明は癌胎児性抗原が挿入された組換えワクシニアウイ
ルスなどのウイルスのベクターおよび活性免疫応答を誘
発するその使用方法に関する。

背景技術の情報癌胎児性抗原（CEA）は、多数の原発性および転移性
の結腸直腸腫瘍を含む大部分の胃腸癌で発現され，およ
び非常に低濃度ではあるがいくつかの正常な内胚葉で誘
導される組織にもみとめられる高度にグリコシル化され
た180,000ダルトンのタンパク質である。

CEAは1965年にはじめて報告されたがその遺伝子は単
離されていなかった。そしてその配列は1987年になって
決定された（Oikawaら、Biochem.Biophys.Res.Comm.,14
2巻、511〜518頁、1987年参照）。CEAは腫瘍関連の抗原
の中で最も広く研究されているものの一つである。CEA
は原発性腫瘍の切除を行った後に手術後患者を監視する
のに臨床上利用されてきた。さらに、抗CEAモノクロー
ナル抗体（MAb）は、原発性結腸腫瘍の診断画像化およ
び転移性疾患のimmunolocalizationに利用して成功して
きた（例えばSikorskaら、Cancer Det.Prev.,12巻、321
〜355頁、1988年;C.W.Vogel編集“Immunoconjugates:An
tibody Conjugates in Radioimaging and Therapy of C
ancer"259〜280頁、米国、ニューヨーク:Oxford Univer
sity Press,1987年のGoldenbergらの論文“Cancer diag
nosis and therapy with radiolabeled antibodies";Ma
chら、Immunol.Today,2巻、239〜249頁、1981年参
照）。

CEAは、ヒト内でごく弱い免疫原性であると一般に考
えられているが（正常なヒトまたは癌患者においてCEA
に対する体液性もしくは細胞性の免疫が存在するという
証拠は見出されていない）、本発明は、生体内で例えば
腫瘍の免疫治療時に抗CEA応答を誘発する、CEAの強力な
免疫原との同時表示（co−presentation）に関する。

ワクシニアウイルスは高度に免疫原性で体液性応答と
細胞性応答の両方を刺激し、腫瘍抗原を、主要細胞組織
適合性複合体抗原とともに提供することもできる。さら
に組換えワクシニアウイルスを生体内で使用すること
は、その安全性、効力、および価格から有利である。こ
のウイルスの毒力は、このウイルスの異なる株を使うこ
とによって減らすことができ；このウイルスのチミジン
キナーゼ（TK）遺伝子またはその一部を欠失させると高
度に減弱されたワクシニアウイルスが得られ；そのウイ
ルスは長期間にあたって安定なので多数のヒトに容易に
投与することができ；ワクシニアでベクター化したワク
チン（vaccinia−vectored vaccine）の開発費用は他の
多くのワクチン開発方法より少なく；および組換えワク
シニアウイルスは、これと同時表示された抗原の免疫原
性を低下させることなく、ワクシニアウイルスに予め暴
露された個体に使用できる。

組換えワクシニアウイルス構造体は、従来、Ｂ型肝
炎、単純疱疹ウイルス、パラインフルエンザ３型、およ
びラッサ熱ウイルスを含む各種の感染疾患に対して製造
され有効に利用されてきた（Mossら、Nature,311巻、67
〜69頁、1984年;Wachsmanら、Biosci.Rep.,8巻、323〜3
34頁、1988年;spriggsら、J.Virol.,62巻、1293〜1296
頁、1988年;Fisher−Hochら、Proc.Nat.Acad.Sci.USA,8
6巻、317〜321頁、1989年それぞれを参照）。腫瘍対抗
防護（tumor challenge protection）も、同様に組換え
ワクシニアウイルスを用いて動物モデルで示されている
（Latheら、Nature（London）,326巻、878〜880頁、198
7年;Bernardsら、Proc.Nat.Acad.Sci.USA,84巻、6854〜
6858頁、1987年;Estinら、Proc.Nat.Acad.Sci.USA,85
巻、1052〜1056頁、1988年参照）。

本発明は、組換えCEAワクシニアウイルスを使用する
ことからなる、胃腸癌などのCEAを発現する癌を含む、C
EAタンパク質を発現する癌の治療方法を提供するもので
ある。“癌を治療すること”とは、CEAに対する免疫応
答を誘発する組換えCEA/ワクシニアウイルスを患者に投
与する（免疫化または予防接種）ことによって、CEAを
発現する癌細胞に対して免疫系を刺激することであると
定義する。

発明の要約本発明は、ヒト腫瘍関連抗原CEAを発現する組換えウ
イルスおよびその使用法に関する。本発明にしたがって
製造されるウイルス構造体は抗CEAモノクローナル抗体
によって認識されるタンパク質産物（CEA）を発現す
る。さらに本発明の組換えウイルスは、生体内で使用す
ると、CEAに対して体液性免疫応答および／または細胞
性応答を誘発する。

本発明の好ましい実施態様は、相同的組換えによっ
て、ワクシニアウイルスのゲノムに、2.4キロベース（k
b）のCEAのSma I制限エンドヌクレアーゼフラグメント
を挿入することによって構築されたRV−CEAと呼ばれる
組換えCEAワクシニアウイルスで構成されている。なお
上記のフラグメントは、CEAに対する完全なコーディン
グ配列、すなわち51と31の非翻訳領域の両方の部分を含
有する2,106個のヌクレオチドのコーディング領域を含
有している。得られたウイルスは、感染した細胞の表面
上にCEAを発現する。

この発明の他の態様として、本願に開示された一般原
理にしたがって製造されたRV−CEA構造体または他のワ
クシニアウイルス−CEA構造体は、CEAを発現するヒトの
癌を治療する際の治療剤として役立つと考えられる。

図面の簡単な説明図１はRSC 11−CEAプラスミド構造体の概略図であ
る。異種遺伝子セグメントを挿入するSma I制限部位
は、ウイルスプロモーターをクローン化遺伝子とつなぐ
ワクシニアp7.5プロモーターと並んでいる。β−ガラク
トシダーゼをコードされるイー・コリ（E.coli）LacZ遺
伝子はワクシニアウイルスp11プロモーターの調節下に
ある。LacZ遺伝子とSma Iクローニング部はともに右（T
K−Ｒ）と左（TK−Ｌ）のワクシニアチミジンキナーゼ
（TK）遺伝子配列のセグメント内に含まれている。これ
らのウイルス配列は、組換えプラスミドの野性型ワクシ
ニアTK遺伝子への挿入を導く、ワクシニアTKは非必須ウ
イルス遺伝子であるが、RSC 11クローニングプラスミド
と相同的組換えを行うとTK欠失ウイルスが得られる（図
1A）。挿入遺伝子セグメントは、５′非翻訳領域の95個
の塩基対、３′非翻訳領域の264個の塩基対、およびコ
ーディング配列の2,106個の塩基対を含有するCEAのcDNA
クローンである。P₁とP₂はPCR DNA増幅に用いられるプ
ライマーである。そのcDNAはPSC−11 Sma Iクローニン
グ部位に平滑末端連結を行った（図1B）。得られたキメ
ラ構造体はRSC 11−CEAと呼称されるが、Bam H1による
制限エンドヌクレアーゼマッピングによって配向させ
た。

図２は組換えワクシニアCEAで誘発されたプラークを
示す。これらの組織培養プレートは、（Ａ）野性型ウイ
ルスすなわちＶ−WR、または（Ｂ）組換えワクシニア−
CEAウイルスすなわちRv−CEAを感染させたHuTK 143B細
胞の集密単層を示す。そのウイルス感染は25μl/mlのBU
DRおよび300μg/mlのＸ−Galを補充した培地で伝播させ
た。組換えウイルスはこれらの条件下で明確な青色のプ
ラークを生成する。

図３は組換えワクシニア−CEAウイルスのサザーンブ
ロット分析の結果を示す。Hind IIIで消化したＶ−WRと
Rv−CEAは、（Ａ）放射能標識を付けたワクシニアウイ
ルスDNAプローブまたは（Ｂ）放射能標識を付けたβ−
ガラクトシダーゼDNAプローブとハイブリッドを形成し
た。サザーンブロット（Ａ）は、Rv−CEA構造体中に、
5.1キロベース（kb）のHind III jフラグメントが欠如
していることを示している、サザーンブロット（Ｂ）
は、ワクシニアHind III jフラグメント中に、組換えプ
ラスミド構造体を示すβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含
有する9.2キロベース（kb）のHind IIIフラグメントが
存在していることを示している。

図４は直接プラークハイブリッド形成による組換えウ
イルスの検出を示す。（Ａ）Ｖ−WR,（Ｂ）Rv−CEA,ま
たは（Ｃ）組換えワクシニア−β−ガラクトシダーゼウ
イルスを細胞単層からナイロン膜に転移させて放射能標
識をつけたCEAプローブとハイブリッドを形成させた。

図５は組換えワクシニア−CEAのポリメラーゼ連鎖反
応（PCR）分析の結果である。ウイルスのプラークを小
ようじで取出し、CEA遺伝子の５′−および３′−末端
で構築したプライマーを用いてPCR分析に付した。PCR反
応生成物の一部を電気泳動に付し、ナイロン膜にブロッ
トし、次いで放射能標識を付けたCEAプローブとハイブ
リッドを形成させた。レーン１はCEA−陽性の対照；レ
ーン２〜９は個々の組換えワクシニア（Rv−CEA）ウイ
ルスの単離株；レーン10は野生型（Ｖ−WR）を示す。

図６は免疫蛍光染色法で抗−CEA Mab COL−１を用い
る細胞中のCEAの免疫検定の結果、およびワクシニアウ
イルスを感染させた細胞単層の対応する光学顕微鏡写真
を示す。パネル（Ａ）は組換えワクシニア（Rv−CEA）
を感染させたHuTK−143B細胞の光学顕微鏡写真である。
パネル（Ｂ）は、組換えワクシニア（Rv−CEA）を感染
させてMab COL−１で処理したHuTK−143B細胞を免疫蛍
光染色したものを示す。パネル（Ｃ）は野生型（Ｖ−W
R）を感染させたHuTK143B細胞の光学顕微鏡写真であ
る。パネル（Ｄ）は、野生型（Ｖ−WR）を感染させてMa
b COL−１で処理した細胞を免疫蛍光染色したものを示
す。パネル（Ｅ）は組換えワクシニア（Rv−CEA）を感
染させたHuTK143B細胞の光学顕微鏡写真である。パネル
（Ｆ）は組換えワクシニア（Rv−CEA）を感染させてMab
B72.3で処理したHuTK143B細胞を免疫蛍光染色したもの
を示す。

図７は野生型ウイルスおよび組換えCEA−ワクシニア
ウイルスで免疫化したマウスの抗−CEA抗体応答を比較
している。８週齢のC57/BL6マウス10頭づつのグループ
を、ワクシニアウイルス（Ｖ−WR）またはその組換え誘
導体（Rv−CEA）１×10⁸pfuを含有する粗製溶液100μｌ
の腹腔内注射を３回14日間隔で行って免疫化した。血清
試料を、一次免疫化を行ってから２週間後と、三次免疫
化を行ってから１週間後に収集した。抗−CEA抗体を酵
素結合イムノソルベント検定法（ELISA法）で定量し
た。

図８はヒトCEAを形質同入されてそれを発現するマウ
ス腺癌細胞系の増殖に対する、組換えCEA−ワクシニア
構造体の投与の効果を示す。10頭のC57/B16雌マウスか
らなる群に、CEAを発現するマウス結腸癌MCA38腫瘍細胞
２×10⁵を皮下注射した。７日後に、これらマウスに、
尾部の乱切法によって、野生型（Ｖ−WR）ワクシニアま
たは組換え（Rv−CEA）ワクシニア１×10¹⁰pfuの10μｌ
を投与し、次いで14日間づつ間隔をおいて２回追加の接
種を行った。皮下の腫瘍を一週間毎に、２方向の寸法を
側定し；式：幅^２×長さ÷２によってその容積を計算し
た。パネル（Ａ）は、野生型ワクシニア（Ｖ−WR）ウイ
ルスを接種された10頭の個々のマウスの腫瘍の増殖を示
す。パネル（Ｂ）は、ヒトCEAを含有する組換えワクシ
ニア（Rv−CEA）ウイルスを接種された10頭の個々のマ
ウスの腫瘍の増殖を示す。

図９は、組換えCEAワクシニア構造体を用いて３回免
疫化した後のヒトCEAを形質導入されてヒトCEAを発現す
るマウス腺癌細胞系の皮下増殖の阻害を示す。10頭のC5
7/B16雌マウスからなる群を、尾部の乱切法にて、粗製
野生型ワクシニア（Ｖ−WR）または組換えワクシニア
（Rv−CEA）の10μｌで免疫化した。各免疫化は14日間
隔で行った。予防接種を−30日、−16日、−２日目に行
った。最後の免疫化を行ってから２日目に、ヒトCEAを
発現するMCA38結腸癌細胞２×10⁵を皮下に移植した。パ
ネル（Ａ）は野生型（Ｖ−WR）ウイルスで免疫化された
10頭の個々の動物の腫瘍の増殖を示す。パネル（Ｂ）は
ヒトCEAを含有する組換えワクシニア（Rv−CEA）ウイル
スで免疫化した10頭の動物の腫瘍の増殖を示す。

図10は、ヒトCEAを発現するマウス腺癌細胞系の増殖
に対する、組換えCEAワクシニア構造体と組合わせたシ
クロホスファミド投与の効果を示す。C57/BL6雌マウス
に、腫腫を移植する２日前に、腹腔内注射までシクロホ
スファミド（100mg/kg）を投与した。ヒトCEAを発現す
るMCA38腺癌細胞２×10⁵を皮下注射で移植し、２日後
に、尾部乱切法で、野生型ワクシニア（Ｖ−WR）または
組換えワクシニア（Rv−CEA）の１×10¹⁰pfuの10μｌを
投与し、続いて14日間づつ間隔をおいて２回追加の接種
を行った。皮下の腫瘍を１週間毎に２方向の寸法を測定
し、容積を計算した。パネル（Ａ）は、シクロホスファ
ミドを投与されかつ野生型ワクシニア（Ｖ−WR）ウイル
スを接種された10匹の個々のマウスの腫瘍の増殖を示
す。パネル（Ｂ）は、ヒトCEAを含有する組換えワクシ
ニア（Rv−CEA）ウイルスを接種した10頭の個々のマウ
スの腫瘍の増殖を示す。矢印はワクシニア接種の日を示
す。

図11は、ヒトCEAを発現するマウス腺癌細胞系の増殖
に対する、組換えヒトインターロイキン−２（rh IL−
２）および組換えCEAワクシニア構造体の投与の効果を
示す。５頭づつのマウスからなる群にヒトCEAを発現す
る２×10⁵のMCA38マウス腺癌細胞を移植した。組換えヒ
トインターロイキン−２（rh IL−２）は、１日に２回
づつ腹腔内注射（25,000単位／注射）で、腫瘍移植後＋
1,＋2,＋3,＋４日後に投与した。野生型ワクシニア（Ｖ
−WR）ウイルスまたは組換えワクシニア（Rv−CEA）ウ
イルスの１×10¹⁰pfuの10μｌを、尾部乱切法によって
腫瘍移植＋２日後に投与した。２回の追加の免疫化を14
日間の間隔をおいて行った。矢印は免疫化の日を示し、
星印は組換えヒトインターロイキン−２（rh IL−２）
を注射した日を示す。パネル（Ａ）は組換えヒトインタ
ーロイキン−２（rh IL−２）だけを投与された動物の
腫瘍の増殖を示す。パネル（Ｂ）は、rh IL−２と野生
型ワクシニアウイルス（Ｖ−WR）を42日間にわたって投
与された動物の腫瘍の増殖を示す。パネル（Ｃ）はrh I
L−２と組換えワクシニア（Rv−CEA）ウイルスを投与さ
れた動物の腫瘍の増殖を示す。

図12は、移植された、ヒトCEAを発現するマウス腺癌
細胞系の増殖に対する、組換えCEAワクシニア構造体の
事前の予防接種の効果を示す。10頭づつの群のマウス
に、尾部乱切法で、Ｖ−NYC（パネルＡとＣ）またはrV
（NYC）−CEA（パネルＢとＤ）の10⁷pfuの10μｌを予防
接種した。３回の予防接種を14日間隔で行った。最後の
予防接種を行ってから７日後（０日）に、２×10⁵の腫
瘍細胞を、皮下接種によって移植した。パネルＡとＢ
は、非CEA発現性細胞系NC38の増殖速度を示し、パネル
ＣとＤはCEA発現性腫瘍すなわちMC−38−CEA−２の増殖
速度を示す。二方向の測定を一週間毎に行った。

図13は、CEAを形質導入されたかまたは導入されなか
ったMC−38マウス結腸腺癌を有するマウスのrV（NYC）
−CEAによる治療を示す。10頭づつのマウスの群に、２
×10⁵のMC−38細胞（パネルＡとＢ）またはCEAを形質導
入されたMC−38−CEA−２細胞（パネルＣとＤ）を皮下
に注射した（０日）。７日後、動物に尾部乱切法で、Ｖ
−NYC（パネルＡとＣ）またはrV（NYC）−CEA（パネル
ＢとＤ）の10⁷pfuの10μｌをワクチン注射した。２回の
追加の予防接種を14日間間隔をおいて、21日目と35日目
に行った。腫瘍を２方向について一週間毎に測定した。

図14は、サルに組換えワクシニアウイルスを接種した
際の抗体応答を示す。動物に、１日目、42日目、84日目
に（矢印）、Ｖ−NYC（白記号）またはrV（NYC）−CEA
（黒記号）を予防接種した。抗CEA抗体を、異なる時点
でELISA法によって定量した。

図15は、rV−CEAで誘発されたサルの抗血清によるヒ
トPBMCのADCC活性の特異性を示す。（Ａ）rV−CEAを２
回接種したサルから得た血清を、CEAタンパク質を発現
するマウス腫瘍細胞に対する活性についてADCC検定法で
試験した。ヒトPBMCを添加する前に、標的細胞（１×10
⁴）は、免疫剤血清の1:50希釈液（白記号）または２回
目の免疫化後21日目に得られた血清（黒記号）とともに
37℃にて１時間、前インキュベーションを行った。血清
は、CEAでトランスフェクトされたマウス結腸癌細胞系
（四角記号）または形質導入されなかった対照の腫瘍細
胞（円形記号）に対するADCC活性について試験した。
（Ｂ）はヒトエフェクター細胞を18時間IL−２（100U/m
l）で前処理したことを除いて（Ａ）に同じである。血
清は、CEAでトランスフェクトされたマウス結腸癌細胞
系に対するADCC活性について試験した。

特定の実施態様の詳細な説明本発明は、癌胎児性抗原（CEA）が挿入されているワ
クシニアウイルスなどのウイルスのベクターを含有する
組換えウイルスであって、そのウイルスに感染した細胞
の表面にCEAまたはその抗原性フラグメントを発現し、
かつCEAおよびCEAを発現する細胞に対して生体内で免疫
応答を誘発する組換えウイルスに関する。ワクシニアウ
イルスは、好ましくは、CEAもしくはその免疫原性フラ
グメントが挿入もしくは組換えられているＶ−WRもしく
はNYCの株のウイルスであり、または他の弱毒ヒトワク
シニアウイルス株を用いることができる。免疫原として
用いる組換えワクシニア製剤の製造については例えば米
国特許第4,722,848号と同第5,017,487号およびPCT特許
願公開第WO87/022038号に記載されている。なおこれら
の文献は本願に援用するものである。このワクシニアウ
イルスは、CEAの発現を増大するプロモーター、例えば
プラスミドPMJ601の合成の後期プロモーターを含有して
いる。（Davison,A.J.およびMoss,B.,Nucl.Acids Res.,
18巻、4285〜4286頁、1990年）。当業者にとって明らか
なように他のウイルスベクターも使用することができ
る。これらのウイルスとしては例えば、CEAまたはその
所望の免疫原性部分をコードするDNAが挿入されている
バキュロウイルス（例えばヨーロッパ特許第228036号に
報告されている）、ヒトアデノウイルス、SV40、鶏痘ま
たはウシ乳頭腫ウイルスがある。本発明に用いられる他
のベクターとしては、サルモネラ（Salmonella）属の細
菌〔例えばサルモネラ・ティフィ（Salmonella typh
i）〕およびBCG（Bacille Calmette Guerin）（Stover
ら、Nature,351巻、456〜460頁、1991年に製造されてい
る。なおこの文献は本願に援用するものとする）のベク
ターがある。

さらにCEAは単一もしくは多数の免疫優性のＴ細胞エ
ピトープを含有していてもよい。Rv−CEAからなるCEA/
ワクシニアウイルスは、ATCCに受託番号第VR2323号で寄
託されている。CEAの配列はOikawaら、Biochem.Biophy
s.Res.Comm.,142巻、511〜518頁、1987年に報告されて
おり、ヒトCEAをコードするcDNAクローンの特性決定結
果はZimmermanら、Proc.Natl.Acad.Sci.,84巻、2960〜2
964頁、1987年に記載されている。なおこれらの文献は
本願に援用するものとする。本発明に用いるために、こ
れらの配列は、CEAの配列の全体または抗原性部分から
誘導することができる。ヌクレオチドまたはアミノ酸配
列は変えてもよく、または同定された抗原性部分は当該
技術分野の当業者にとって周知の技術にしたがって本発
明の組換えワクチン製剤に挿入される。

他の実施態様において、本発明は上記の組換えウイル
スおよび医薬として許容される希釈剤、担体もしくは賦
形剤からなる医薬組成物に関する。本発明の医薬組成物
は、投与の経路によって選択された量の組換えCEA/ワク
シニアウイルスを含有している。好ましい投与経路とし
ては、静脈内、腹腔内、皮膚すりこみ、経口、皮下また
は皮膚内の経路がある。当該技術分野の当業者は、特定
の治療方法において投与すべき量は容易に決定できるこ
とが分かるであろう。適切な量は、10⁵pfu〜10⁹pfuの範
囲に入ると考えられる。

他の実施態様について、本発明は、癌の細胞がCEAを
発現する癌にかかっている患者に上記組換えウイルスを
投与することからなる該患者を治療する方法に関する。
さらに具体的に述べると、その癌の細胞は、胃腸、乳
房、すい臓、膀胱、卵巣、肺、または前立腺の癌細胞、
またはCEAエピトープを発現する上皮由来の癌である。
一つの好ましい実施態様において、上記の方法にはさら
に上記組換えウイルスとともに、生体応答調節剤を投与
することが含まれる。好ましくは、生体応答調節剤は、
インターロイキン−２（IL−２）、インターロイキン−
６（IL−６）、インターフェロン、腫瘍壊死因子（TN
F）およびシクロホスファミドからなる群から選択さ
れ、その製造もしくは入手性は当該技術分野の当業者に
は公知である。例えば組換えヒトIL−２の製造は米国特
許第4,738,927号および同第4,992,367号に詳細に記載さ
れており、およびTNFの発現は米国特許第4,650,674号に
詳細に記載されている。なおこれらの各文献は本願に援
用するものとする。上記の方法にはさらに組換えウイル
スとアジュバントを投与することを含まれる。当該技術
分野の当業者であれば、特定の処理法で投与すべき量は
容易に決定できることは分かるであろう。適切なアジュ
バントとしては、限定はないが、無機のゲル、例えば水
酸化アルミニウム、ミョウバン、リゾレシチンのような
表面活性物質、プルロニックポリオール類、ポリアニオ
ン類、ペプチド類、オイルエマルション類がある。

別の実施態様において、本発明は、癌細胞の定着と増
殖を防止するために、CEAに対する哺乳類の免疫系を刺
激する方法であって、前記刺激を行うのに充分な量の前
記組換えウイルスを哺乳類に投与することからなる方法
を提供するものである。ワクシニアウイルスとしてはNY
C株のウイルス、または弱毒ヒトワクシニアウイルス株
で組換えたウイルスでもよい。１つの好ましい実施態様
において、前記の方法はさらに、組換えウイルスととも
に生体応答調節剤を投与する方法が含まれる（なお好ま
しくは、生体応答調節剤は、インターロイキン−２（IL
−２）、インターロイキン−６（IL−６）、インターフ
ェロン、腫瘍壊死因子（TNF）、およびシクロホスファ
ミドからなる群から選択される）。また上記の方法に
は、組換えウイルスをアジュバントとともに投与する方
法が含まれる。当該技術分野の当業者であれば、特定の
治療法について投与すべき量は容易に決定できることは
分かるであろう。好ましい投与経路は上記のとおりであ
る。

本発明は下記の実施例でさらに詳細に説明するがこれ
らの実施例は本発明を限定するものではない。

実施例１組換えワクシニアウイルス−CEAの構築組換えワクシニアウイルスはMackettらが報告したの
とほぼ同様にして構築した（D.M.Glover編集DNA Clonin
g:A Practical Approach,191−211頁、Oxford Press,19
85年の“The construction and characterization of v
accinia virus recombinants expressing foreign gene
s"）。具体的に述べると、ヒトCEA cDNAのクローンをヒ
ト結腸腫瘍細胞ライブラリーから単離した。GEO細胞由
来のポリＡ＋DNA（Laboratory of Tumor Immunology an
d Biology,NCI）を単離し、cDNAを逆転写で合成し、次
いでDNAポリメラーゼによって二本鎖にした。制限酵素H
ind IIIとBam H1の部位を含有するリンカーをcDNAに連
結し、定方向クローン化ベクタ・λorf−８に挿入した
（Mcissnerら、PNAS,84巻、4171〜4175頁、1987年に記
載された方法にしたがって行った）。CEAを含有する組
換えプラークは核酸ハイブリッド形成法を用いて検出し
た。陽性のプラークを精製して配列を決定した。2.8キ
ロベース（kb）のクローンが、ポリＡ゜尾部を含む５′
非翻訳領域の100個のヌクレオチドを越えて、CEAの全コ
ーディング領域（2,106個のヌクレオチド）を含有する
ことが分かった。2.4キロベース（kb）のSma Iフラグメ
ントを上記のクローンから単離し、供与プラスミドpSC
−11のSma I制限部位に平滑末端連結を行った。プラス
ミド挿入断片の配向は、Bam H1エンドヌクレアーゼ消化
と分析によって測定した。生成したプラスミドの構造体
をPSC11−CEAと命名した（図１）。

ウイルスキメラウイルスのHind III Jフラグメント中
に非必須TK遺伝子を有するワクシニアウイルスと、PSC1
1−CEAとの相同的組換え（Mackettらの上記文献;PNAS,7
9巻、7415〜7419頁、1982年参照）。組換えウイルス中
に、β−ガラクトシダーゼをコードするPSC11−CEA Lac
Z遺伝子が存在するので選択方法が提供される。

組換えウイルスrV−CEAを次のようにして構築した。
ほゞ集密したCV−１細胞、アフリカグリーンサル腎臓細
胞（ATCC No.CCL70）の60mm組織培養皿を、Ｖ−WRの約
0.20プラーク形成単位／細胞（pfu/細胞）に約２時間37
℃で感染させた。感染を進行させながら、pSC11−CEA D
NAの沈澱を、1mlのトランスフェクション緩衝液〔0.14M
NaCl,5mM KCl,1mM Na₂HPO₄,0.1％デキストロースおよ
び20mM HEPES（４〔２−ヒドロキシエチル〕−１−ピペ
ラジン−エタンスルホン酸）〕、7.0〜7.1に調節したp
H,5μｇのキメラpSC11−CEAプラスミドDNA、および担体
としての１μｇのワクシニアウイルスDNAを用いて製造
した。この溶液を混合し、約50μｌの2.5M CaCl₂を添加
し、その混合物をゆっくり攪拌し、次いでDNAを沈澱さ
せながら、室温で約20分間貯蔵した。

感染後、ウイルス接種物を吸引してCV−１単一層を取
出し、１×リン酸緩衝食塩水（PBS）で２回すすいだ。
上記のDNA沈澱物をCV−１単層に滴下して加え、その細
胞上に室温で約30分静置し、次に５％ウシ胎児血清（FC
S）を補充した新しい培地（ダルベッユの培地;Gibco/BR
L）5mlを添加し、細胞を37℃で約３時間インキュベート
した。次に培地を皿から吸引し、５％FCSを補充した新
しい培地5mlで置換し、細胞を37℃で再びインキュベー
トした。なおこのインキュベーションの時間は約48時間
であった。

インキュベーションに続いて細胞を培地にスクレープ
（scrape）し遠心分離で集めた。得られた細胞のペレッ
トを、MEM（最小必須培地;Gibco/BRL）0.5mlに再懸濁さ
せた。細胞を３サイクルの凍結−解凍に付し、続いて、
450ワットの水浴ソニケーターで約１分間音波処理する
ことによって、細胞から子孫ウイルスを放出させた。

子孫ウイルスと野生型Ｖ−WR対照を、HuTK^- 143B細
胞、すなわち欠損チミジンキナーゼ遺伝子を有するヒト
骨肉腫細胞系の密集単層上に、２μg/mlの５−ブロモデ
オキシウリジン（BuDR;Boehringer Mannheim Biochemic
alsから入手した）および300μg/mlの５−ブロモ−４−
クロロ−３−インドイル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ
（Ｘ−Gal;Gibco/BRL）の存在下でプレートした。組換
えウイルスのクローンは、青色のプラークの生成で立証
されるHuTK^- 143B細胞上での増殖で選択した。（図2B）次にプラークを単離し、先に述べたのと類似の選択条
件を用いてプラークを５ラウンド精製することによって
子孫ウイルスを精製した。精製ウイルス単離株の高力価
の溶液を、標準の方法にしたがって組織培養フラスコ中
で連続継代によって製造した（Mackettらの1982年の前
記文献参照）。一般に１×10⁸pfu/ml〜１×10⁹pfu/mlの
力価が得られた。ウイルス株は−70℃で貯蔵した。

実施例２試験組換えワクシニアウイルス−CEA DNAを抽出し、その
ウイルスゲノムをHind III制限エンドヌクレアーゼ消化
とサザーンブロッティングで分析した。この考察を行う
ために、好ましい組換えワクシニアウイルス−CEA単離
株のrV−CEAのみを参照する。

組換えウイルスDNAと野生型の対照ウイルスDNAの試料
を得るために、HuTK^- 143B細胞のほゞ集密状態の単層
を、先に述べたのとほゞ同様にして、約30pfu/細胞のＶ
−WRまたはrV−CEAを感染させた。感染は、最大の細胞
変性効果がみとめられるまで約24時間進行させ、次に細
胞を培地中にスクレープし、遠心分離でペレット化し、
次いで約50μｌの１×PBS中に再懸濁させた。

各試料に、300μｌの低塩緩衝液〔pH8.0に緩衝された
20mMトリス−HCl（トリス（ヒドロキシメチル）アミノ
メタン）、10mMのEDTA（エチレンジアミン四酢酸）、お
よび0.75％のSDS（ドデシル硫酸ナトリウム）およびBoe
hringer Mannheim Biochemicalsから入手したプロティ
ナーゼＫ（10mg/ml）の20μｌ〕を添加して混合した。
得られた混合物を、振盪しながら37℃で一夜インキュベ
ートし、次いでフェノール／クロロホルムの混合物で２
回抽出し次にクロロホルムだけで２回抽出した。酢酸ナ
トリウムpH5.0を0.3Nになるまで添加し、２倍容積のエ
タノールを添加してDNAを沈澱させた。そのDNAを遠心分
離によって集めて、70％エタノールで２回洗浄し、乾燥
し次いで下記のようにして分析した。

実施例３制限エンドヌクレアーゼによる分析Ｖ−WRとrV−CEAのDNAを、メーカーの指示（Gibco/ER
L）の指示にしたがいHind IIIエンドヌクレアーゼで消
化し、0.6％アガロースゲル上45ボルトで一夜電気泳動
させた。そのDNAをBiotranナイロン膜（ICN）に転移さ
せて、P³²−dCTPで標識をつけたワクシニアウイルスDNA
プローブとハイブリッドを形成させた。ワクシニアウイ
ルスのDNAは上記の所定の方法で単離した。20A₂₆₀単位
の精製野生型ワクシニアウイルス（約50μｇ）を、50mM
トリス−HCl;pH7〜８〔トリス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタン〕中に入れ最終容積を1.2mlにした。この溶
液に、0.1mlの10％SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）、0.
2mlの60％スクロース、0.4mlのプロテイナーゼＫ（10mg
/ml;Boehringer Mannheim Biochemicals社）を添加し、
37℃で４時間インキュベートした。この溶液を、50mMト
リス−HCl pH7〜８と平衡化させたフェノールの等容積
で２回抽出し、次いでフェノール／クロロホルム（1:
1）で一回抽出した。1/10の容積の1M酢酸ナトリウム（p
H7.0）と、2.5倍の容積のエタノールとを加え、DNAを約
20℃で一夜沈澱させた。DNAを遠心分離で集め、上澄み
液を吸引し、ペレットを95％エタノールで洗浄し、風乾
させた。乾燥したペレットを水100μｌに再懸濁させそ
の濃度を260nm波長光の吸光度で測定した。このDNA 25
μｇに、メーカーの指示にしたがってGibco/BRL Random
Primers DNA Labelling Systemを用いて、P³²−dCTPで
標識をつけた。そのフィルターを、40％ホルムアミド
（Clonetech）と５×デンハート（0.1％Ficoll400,（Si
gma社）;0.1％ポリビニルピロリジン（Sigma社）と0.1
％BSA（ウシ血清アルブミン、Boehringer Mannheim Bio
chemicals）;3×SSC（0.45M NaCl,0.045Mクエン酸ナト
リウム）、2.5％硫酸デキストラン（Sigma社）および0.
1mg/ml変性サケ***DNA（Lofstrand Laboratories）中
で37℃にて一夜、前インキュベートした。変性ワクシニ
アウイルスdCTPで標識をつけたプローブ１×10⁶cpm/ml
を添加し、攪拌しながら37℃で一夜ハイブリッド形成を
行った。フィルターを、２×SSCと0.1％SDS中で室温に
て15分間づつ２回洗浄し、次に0.1×SSC,0.1％SDS中65
℃で15分間づつ２回洗浄した。そのブロットをＸ線フィ
ルムに４時間暴露し、現像し、野生型Hind III Jフラグ
メントに対応する5.1キロベース（kb）の存在について
分析した。

Ｖ−WR DNAはHind III Jフラグメントに対応する5.1
キロベース（kb）のバンドを含む一般的なワクシニアウ
イルスの制限パターン（MaCarronら、Virol.,86巻、88
〜101頁、1978年）を示した。それに対して、rV−CEA D
NAは、キメラプラスミド構造体をウイルスTK遺伝子に挿
入したため5.1Hind IIIのバンドを示さなかった。

図3Aに示すように、野生型Ｖ−WR DNAの5.1キロベー
ス（kb）のHind III Jフラグメントはワクシニアウイル
スDNAプローブとハイブリッドを形成した。rV−CEA DNA
中上記の大きさの範囲には対応するバンドはみとめられ
なかった。したがって、rV−CEA DNAには明らかに5.1キ
ロベース（kb）のHind III Jフラグメントが欠除してい
る。

組換えＪフラグメントの大きさを測定するため、Hind
IIIで消化したＶ−WR,rV−CEAおよびヒトゲノムDNAを
含有するサザーンブロットを、P³²−dCTPで標識をつけ
てプローブで、イー・コリのβ−ガラクトシダーゼ遺伝
子とハイブリッドを形成させた。ポリメラーゼ連鎖反応
（PCR）は、β−ガラクトシダーゼ遺伝子の１キロベー
ス（kb）のフラグメントを結合した特定の20個の塩基か
らなる２株のオリゴマー（５′GGGAAAACCCTGGCGTTACC
3′と５′TCGAATCAGCAACGGCTTGC3′）をプライマーとし
て用いて行った。これはVSC 8からPCRさせた（PCR′
ｄ）が、その１キロベース（kb）のバンドは0.8％アガ
ロースゲルから切断され、メーカーの指示にしたがって
Gibco/BRL Random Rrimers Labeling Systemを使って標
識を付け、配列はShapiraら、Gene,25巻、71〜82頁、19
83年から得た。

図3Bに示すように、β−ガラクトシダーゼ遺伝子は、
RV−CEAウイルスDNAブロット中の9.2kbの明確なバンド
で明らかなように組換えウイルス中に存在している。こ
の結果は、組換えHind III Jフラグメントの考えられる
大きさと一致している。β−ガラクトシダーゼ遺伝子は
野性型ワクシニアのゲノム中には存在せずヒトゲノムDN
A中に存在する。

実施例４プラークハイブリッド形成分析組換えワクシニアウイルスゲノム中のCEA遺伝子の存
在は、DNAハイブリッド形成とポリメラーゼ連鎖反応（P
CR）分析で測定した。

ハイブリッド形成の試験では、60nm組織培養皿内で増
殖させたHuTK^- 143B細胞のほゞ集密した単層に、負の対
照として約10pfu/細胞のrV−CEA,V−WRを感染させ、お
よび組換えワクシニア−β−ガラクトシダーゼウイルス
（VSC 8,Bernard Moss博士、NIAID、米国、メリーラン
ド州、ベセズダから入手）を正の対照として感染させ
た。VSC 8は、ワクシニアTK遺伝子に挿入されたイー・
コリLacZ遺伝子を含有する組換えワクシニアウイルスで
ある（Chakrabartiら、Mol.Cell.Biol.,5巻、3403〜340
9頁、1985年）。感染させた細胞を37℃で約24時間イン
キューベートし、インキュベーションに続いてウイルス
DNAは、ナイロン膜を細胞単層の上に約10分間直接当て
ることによって該膜に直接転移させた。DNAの転移が完
了した後、膜をプレートから取外し、変性し、中和し、
次いで２×SSC（0.3M NaCl,0.03Mクエン酸ナトリウム）
中に数分間浸漬した。次にDNAは、転移ランプ（Foto Dy
ne社、米国、ウィスコンシン州、ニューベルリン）を用
い、約２分間紫外（UV）線に暴露することによって、膜
に架橋させた。UVへの暴露に続いて、膜はP³²−dCTPで
標識を付けたCEAプローブとハイブリッドを形成させ、
Ｘ線フィルムに一夜暴露した。そのCEAプローブは、Vec
tor pGEM 7（John Shively博士、米国、カリフォルニア
州、デュアート、シティ・オブ・ホープ）から切取った
560個の塩基対のPST Iフラグメントであった。このフラ
グメント25ngに、メーカーの指示にしたがってGibco/BR
LのRandom Primers Labeling Systemを用いてdCTP³²で
標識を付けた。このプローブを先に述べたのと同様にし
てブロットとハイブリッドを形成させた。

図４に示すように、rV−CEAプラーク（図4B）はCEAプ
ローブと良好にハイブリッドを形成したが、Ｖ−WR（図
4A）とVSC 8プラーク（図4C）はハイブリッドを形成し
なかった。

実施例５ポリメラーゼ連鎖反応の分析 PCRを試験するために、HuTK^- 143B細胞のほぼ密集し
た単層を60mmの組織培養皿中で増殖させ、約10pfu/細胞
のrV−CEAまたはＶ−WRを感染させ、次いで37℃で約24
時間インキュベートした。感染に続いて、単層をアガロ
ースの重層で覆って、ウイルスプラークの位置を皿上に
固定した。次に個々のプラークを、小ようじにする転移
によって単離し、カルシウムもしくはマグネシウムなし
の１×PBS約1ml中にいれ、約10分間沸騰させ次いで氷冷
させた。

標準のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を、Cetus Corp.
が供給する増幅キットを用いメーカーの指示にしたがっ
て実施した。この試験を行うために、全CEA cDNAセグメ
ントを認識するオリゴヌクレオチドのプライマーをPCR
反応を開始するために構築した。すなわち、プライマー
をCEA遺伝子の５′と３′の末端から構築した（図1AのP
₁とP₂参照）。野生型ワクシニアウイルスのプラークは
負の対照として使用した。

ウイルスの増幅を30サイクル行ってから、各プラーク
の単離物の試料を１％アガロースゲル上で電気泳動を行
わせ、ナイロン膜に転移させ、次いで前記のようにして
放射能標識をつけたCEAプローブとハイブリッドを形成
させた。結果を図５に示す。組換え単離物の全部とCEA
の正の対照（レーン１−９）はCEA遺伝子プローブとハ
イブリッドを形成したが、一方野生型ワクシニアウイル
スのDNA（レーン10）はハイブリッド形成を全く示さな
かった。

実施例６タンパク質発現の分析 CEAタンパク質の発現と位置は、MAb COL−１すなわち
CEAに対して特異的でかつ反応性のマウスモノクローナ
ル抗体を用いて、Ｖ−WRとrV−CEAを感染させた細胞の
免疫蛍光染色を行うことによって測定した（Muranoら、
Cancer Res.,45巻、5769〜5780頁、1985年）。CEAタン
パク質の発現を試験するため、HuTK^- 143B細胞のほゞ集
密した単層に、Ｖ−WRもしくはrV−CEAの30pfu/細胞を
接種し、約５時間37℃でインキュベートした。ウイルス
接種物を細胞から吸引し、単層を１×PBSで３回洗浄し
た。次に細胞を、新しく調製した、２％パラホルムアル
デヒドPBS溶液を用いて室温で約30分間固定した。固定
した後、細胞は最少必須培地（MEM;Gibco/BRL）で３回
洗浄し、次いでPBS中１％BSAで約30分間“ブロック（bl
ock）”した。

上記処理に続いて、固定しブロックした細胞は、１μ
g/mlのMAb COL−１またはMAb B72.3（Laboratory of Tu
mor Immunology and Biology and Biology,NCI）すなわ
ちCEAと反応しない負の対照のマウス抗体を添加して処
理し、室温で約１時間振盪した。次に細胞を１×PBSで
５回洗浄し、次いで蛍光抱合ヤギ抗マウス第二抗体（Ki
rkegaard and Perry Laboratories,Inc.）を1:100の希
釈率で添加した。約30分後に、細胞を１×PBSで５回洗
浄し、次いでCEAの発現と細胞位置を免疫蛍光顕微鏡で
測定した。免疫蛍光染色は初期ウイルス感染してから５
時間以内が最高であった。ウイルスとともにさらにイン
キュベートして感染した細胞を細胞溶解させて膜タンパ
ク質を分解させた。

図6Aと6Bに示すように、組換えワクシニア（rV−CE
A）を感染させた細胞は、蛍光によって、Mab COL−１で
ステイン（stain）している明確な細胞表面を示し、感
染細胞の細胞膜中にCEAを発現する組換えワクシニア（r
V−CEA）ウイルスはCEAの通常の細胞位置と一致した。
それに対して、野生型ワクシニア（Ｖ−WR）ウイルスを
感染させた細胞は、COL−１での免疫蛍光ステイニング
を示すことができなかった（図6Cと6D）。イソタイプ−
整合（matched）負対照抗体B72.3での免疫蛍光ステイニ
ングは、組換えワクシニア（rV−CEA）ウイルスを感染
させた細胞に画像を誘発できなかった（図6Eと6F）。

実施例７ ELISA分析８週齢のC57/BL6雌マウス（Frederick Cancer Resear
ch Facility）の試験試料当り10頭づつに、約１×10⁸pf
uの野生型（Ｖ−WR）または組換えワクシニア（rV−CE
A）を含有する粗製溶液100μｌを、腹腔内（IP）注射で
14日間隔で３回接種した。一次注射を行ってから約２週
間後と三次注射を行ってから１週間後に、各マウスから
血液を抜出し血清を分離した。下記の表１と図７に示す
ように、マウスは、接種してから約14日間以内でCEAに
対する抗体力価を示し、および続く免疫化で増強された
応答を示した。

抗−CEAと抗ワクシニアウイルスの抗体は、酵素結合
イムノソルベント検定法（ELISA）によって次のように
して血清中で定量した。

野性型（Ｖ−WR）抗原（すなわち約１×10⁷のウイル
ス粒子）を含有する0.1M炭酸ナトリウム緩衝液（pH9.
6）100μｌで、96ウェル微量滴定プレートを一夜コート
した。次にこのプレートを、0.1％グルタルアルデヒド
を含有するトリス緩衝食塩水（TBS）中の１％BSAでブロ
ックし、PBSで３回洗い、次いで先に得られたマウス血
清とともに室温で約１時間インキュベートした。

ワクシニア抗原Ｖ−WRに結合したマウス血清抗体を、
Gibco/BRLから入手したImmuno Select Kitを用いて検出
した。このキットによって、固体支持体に固定化された
抗原に対するポリクローナルまたはモノクローナルのウ
サギもしくはマウスの一次抗体を検出できる。ビオチニ
ル化された二次抗体（ヤギ抗マウス）をストレプタピデ
ン−アルカリホスファターゼ接合体に結合させ、この予
め製造した複合体を、一次抗体に続いてELISAプレート
に添加する。そのプレートをトリスで緩衝した食塩（TB
S）で洗浄し、得られたアルカリホスファターゼ複合体
は色素原pNPP（リン酸ｐ−ニトロフェニル）を用いて検
出する。この反応は水酸化ナトリウムを添加することに
よって停止させ、試料の405nm波長光の吸光度をELISA読
取装置（Bio−Tek Microplate Reader,Model EL 310）
で読取った。ウサギのポリクローナル抗ワクシニア抗体
（米国、メリーランド州ベセズダ、NIALDのMark Buller
博士提供）を抗ワクシニアのプレートで正の対照として
使用した。

試験抗原としてCEAを用いて同様の手順にしたがって
行った。96ウェルの微量滴定プレートを100μｌ（250n
g）の精製CEAタンパク質（International Enzyme社、米
国、カリフォルニア州、サン・ディエゴ）でコートし37
℃で一夜保管した。次にプレートを１％BSA含有TBSでブ
ロックした。正の対照の抗体としてMab COL−１を使用
したこと以外は前述のELISA法を実施した。

これらの試験の結果をまとめ、A405の読取り値対Mab
COL−１の添加量の関係を示す標準曲線を作成した。次
に、各試験試料中に存在するCEA特異的抗体の量は、適
切な希釈で得られた直線部分のA405読取り値からMabの
当量で計算し、そして抗ワクシニア抗体の産生量は抗CE
A抗体の産生量と相関関係があった。この試験の結果を
図７に要約した。

ELISA試験においては、マウスのワクシニアウイルス
自体に対する生体内応答も抗ワクシニア抗体について検
定することによって測定してマウスがワクシニアウイル
スで適正に免疫化されていたことを保証した。表１はワ
クシニアウイルスに対する抗体応答を示し、明らかに、
マウスがウイルスの適正な接種物を受けたことを示して
いる。

この生体内試験の場合、マウスの対照グループは２週
間間隔で１×10⁸pfu/mlの野生型ワクシニア（Ｖ−WR）
を受けた。これらのマウスは、組換えウイルス（rV−CE
A）で処理した動物と比べた場合、ワクシニアウイルス
に対して類似の抗体応答を行った。対照の動物はCEAに
対する抗体応答をしなかった（表１、図７）。予防接種
を行ったマウスは、免疫化に続く42日間の観察期間に毒
性の徴候を全く示さなかった。

これらのデータは、組換えワクシニア（rV−CEA）ウ
イルスを接種すると、免疫系がヒトCEAを認識し、かつ
抗原に対する体液性免疫応答をマウントする（mount）
ことができるようになることを示唆している。

実施例８治療試験 Frederic Cancer Research Facilityから入手した４
〜５週齢の雌C57/BL6マウスに、ヒトCEA遺伝子を予め形
質導入したMCA38マウス腺癌細胞２×10⁵を皮下注射によ
って接種した。これらの細胞はCOL−１エピトープを含
有するヒトCEA遺伝子を発現することが分かった。１グ
ループ当り10頭づつの動物に、腫瘍を移植してから７日
後に、野生型のＶ−WRまたは組換えワクシニアのrV−CE
Aの１×10¹⁰pfuを含有する粗製溶液10μｌを、尾部乱切
法で接種した。第二および第三の免疫化を14日間隔で行
った。動物は腫瘍の存在について一週間毎に検査した。
腫瘍はキャリペで２方向の寸法を測定、その容積を式：
幅^２×長さ÷２を用いて計算した。

図８は、野生型ワクシニアウイルス（Ｖ−WR、図8A）
または組換えワクシニアウイルス（rV−CEA、図8B）を
投与された10頭の個々のマウスの７日間かけて定着させ
た皮下腫瘍の増殖の結果を示す。ヒトCEAを含有する組
換えワクシニアウイルスを受けた動物は42日間の経過を
通じて腫瘍増殖の劇的な減少を経験した。さらに組換え
ワクシニア（rV−CEA）を受けた動物のうちの２頭は腫
瘍を全く発現しなかった。これらの腫瘍なしの動物は、
次いで２×10⁵のMCA38CEA−形質導入細胞を再度移植し
た。90日後、これらの動物は腫瘍なしのまゝであった。
これに対して、野性型（Ｖ−WR）ウイルスを投与された
動物は、急速に増殖する腫瘍を発現した。ワクシニア構
造体を受けなかった動物も腫瘍を発現し、その増殖速度
は野性型ワクシニア（Ｖ−WR）を投与された動物と類似
していた。

実施例９防止試験 Frederic Cancer Research Facilityから入手した５
〜６週齢の雌C57/BL6マウスに、１×10¹⁰pfuのウイルス
を含有する粗製溶液10μｌを、14日間隔で３回接種し
た。１グループ当り10頭づつの動物に、野生型ワクシニ
ア（Ｖ−WR）ウイルスまたは組換えワクシニア（rV−CE
A）ウイルスを投与した。最後の免疫化を行ってから２
日後、ヒトCEA遺伝子を形質導入された２×10⁵のMCA38
マウス腺癌細胞をマウスに皮下移植した。動物は腫瘍の
存在について１週間毎に検査した。腫瘍はキャリパによ
って２方向の寸法を測定し、容積を式：幅^２×長さ÷２
を用いて計算した。

図９は、野生型ワクシニアウイルス（Ｖ−WR、図9A）
または組換えワクシニアウイルス（rV−CEA、図9B）を
３回投与した後の10頭の個々のマウスの皮下腫瘍の増殖
の結果を示す。組換えワクシニア（rV−CEA）で免疫化
を行うと、腫瘍の増殖が劇的に減少するのみならず腫瘍
増殖の開始が７〜10日間遅れた。これに対して、野生型
ウイルス（Ｖ−WR）を投与された動物は観察期間の56日
を通じて急速に腫瘍が増殖した。

実施例10 ワクシニアとシクロホスファミドによる治療 Frederic Cancer Research Facilityから入手した４
〜５週齢の雌C57/BL6マウスを、腹腔内注射によってシ
クロホスファミド（100mg/kg）で処理した。この注射を
してから２日後、ヒトCEA遺伝子で形質導入されたMCA38
マウス腺癌細胞２×10⁵を皮下注射で移植した。10頭の
動物からなるグループに、野性型ウイルスのＶ−WRまた
は組換えワクシニアウイルスrV−CEAの１×10¹⁰pfuを含
有する粗製溶液10μｌを、腫瘍移植して２日後に、尾部
乱切法によって接種した。第二と第三の接種は14日間の
間隔で行った。動物は腫瘍の存在について１週間毎に検
査した。腫瘍はキャリパで２方向の寸法を測定し、式：
幅^２×長さ÷２を用いて容積を計算した。

シクロホスファミドは、癌を有する動物またはヒトの
免疫応答を和らげると考えられるアルキル化剤である。
サプレッサーＴ細胞は、リンパ球の他の分集団に作用し
ない濃度で上記医薬に対して感受性であることは公知で
ある。したがってこの医薬は、恐らく、腫瘍細胞に対す
る宿主細胞の免疫認識と免疫応答を促進することができ
るであろう。予防接種を行う前に投与されるシクロホス
ファミドによる宿主の免疫系の免疫調節によって、免疫
化に対する抗腫瘍応答を増大することができることを本
願発明者らは実証する。

図10は、シクロホスファミドとワクシニアによる免疫
化を与えられた動物中のMCA38ヒトCEAを発現する腫瘍の
増殖の結果を示す。10頭の個々の動物には、腫瘍を移植
した後、野性型ワクシニア（Ｖ−WR;図10A）または組換
え体（rV−CEA;図10B）による免疫化を３回行った。シ
クロホスファミドと組換えワクシニア（rV−CEA）を受
けている動物は49日間にわたって腫瘍の大きさが劇的に
減少していることを示した。２頭の動物は腫瘍を発現し
なかった。これらの動物には、CEAを発現するMCA38マウ
ス腺癌細胞２×10⁵を再度移植したが再移植後120日目で
も腫瘍を発現しなかった。それに対して、野生型（Ｖ−
WR）ワクシニアとシクロホスファミドを投与された動物
は腫瘍の増殖を停止させることができなかった。ワクシ
ニアを受けなかったがシクロホスファミドを受けた動物
は腫瘍の増殖を阻害できなかった。

実施例11 ワクシニアとヒト組換えインターロイキン−２による治
療 Frederick Cancer Research Facilityから入手した４
〜５週齢の雌C57/BL6のマウスに、ヒトCEAを発現するMC
A38マウス腺癌細胞２×10⁵を皮下注射で接種した。腫瘍
を移植後、＋1,＋2,＋３および＋４日目に25,000単位の
精製組換えヒトインターロイキン−２（rh IL−2;Cetus
Corp.）,3.6×10⁶単位/mgを、１日に２回マウスに腹腔
内注射で投与した。また＋２日目に、動物に、野生型
（Ｖ−WR）または組換えワクシニア（rV−CEA）のウイ
ルスの１×10¹⁰pfuの10μｌを尾部乱切法によって投与
した。次の２回の免疫化は14日間の間隔で行った。動物
は腫瘍の存在について１週間毎に検査した。腫瘍はキャ
リパで２方向の寸法を測定し、容積を式：幅^２×長さ÷
２を用いて計算した。

両者のマウス腫瘍モデルと転移性癌に冒されているヒ
トの治療とにおける抗腫瘍効果は、個々の組換えサイト
カイン類の高い投与量を使って、時々達成されている。
例えばRosenbergら（N.Eng.J.Med.,131巻、1485〜1492
頁、1985年）は、マウスとヒトにおいて、高投与量のイ
ンターロイキン−２だけを用いるかまたは養子細胞治療
を組合わせて腫瘍の退縮を達成した。インターロイキン
−２は活性化ヘルパーＴリンパ球によって放出されるタ
ンパク質である。抗原でトリガーされるＴリンパ球と、
悪性になることが多い細胞障害性Ｔ細胞との膨脹のため
にインターロイキン−２は必須である。インターロイキ
ン２（IL−２）で膨脹される細胞障害性Ｔ細胞は、生体
内で抗腫瘍活性を保持することが分かっている。

またインターロイキン２はナチュラルキラー（NK）細
胞の増殖を促進し、かつナチュラルキラー細胞障害性を
生体内で増大する。組換え体の予防接種を行う前に、組
換えヒトインターロイキン−２（rh IL−２）で宿主の
免疫系を免疫調節すると、抗腫瘍応答が増大されること
が実証された。

図11は、ヒトCEAを発現するMCA38マウス腺癌細胞の増
殖に対する、組換えヒトインターロイキン−２（rh IL
−２）および組換えワクシニアウイルス（rV−CEA）の
投与の効果を示す。５頭づつの動物からなる群に、組換
えヒトインターロイキン−２（rh IL−２）だけの投与
（図11A）、または組換えヒトインターロイキン−２の
投与およびこれに続く野生型ワクシニアウイルス（Ｖ−
WR;図11B）もしくは組換えワクシニア（rV−CEA;図11
C）での、腫瘍移植してから２日後の尾部乱切法による
免疫化を行った。組換えヒトインターロイキン−２（rh
IL−２）と組換えワクシニアウイルス（rV−CEA）を受
けた動物は42日間の過程にわたって腫瘍の増殖の劇的減
少を示した。それに対して、組換えヒトインターロイキ
ン−２（rh IL−２）と野生型（Ｖ−WR）ウイルス、ま
たは組換えヒトインターロイキン−２（rh IL−２）だ
けを投与された動物は、急速に増殖する腫瘍を発現し
た。

実施例12 ワクシニアのニューヨークシティ株を用いる組換えワク
シニア−CEAの構築と試験組換えCEA−ワクシニアウイルスを、ATCC（No.VR−32
5;ロックビル）から入手したワクシニアウイルスをニュ
ーヨーク市衛生局株を用いて製造した。上記実施例１に
記載されているヒトCEA遺伝子を含有するpSC−11プラス
ミドの相同的組換えによって、rV（NYC）−CEAと命名さ
れた組換えウイルスを製造した。pSC−11プラスミドは
ワクシニアウイルスの後期プロモーターｐ−11の制御下
にあるイー・コリLacZ遺伝子を含有していた。このプラ
スミドを使用することによって、組換えウイルス粒子を
得る選択法が得られる。rV（NYC）−CEAの発現は、MAb
COL−１を用いるウエスターンブロット分析法で検出し
た。ウイルスは、遠心分離で直接ペレット化したHela細
胞の攪拌培養で増殖させ、次にMackettら、J.Virol.,49
巻、857〜864頁、1984年に記載の方法にしたがい、20〜
40％のスクロースの勾配液で精製した。なおこの文献は
本願に援用するものとする。

rV（NYC）−CEAおよびrV（WR）−CEAの組換え構造体
によって発現されたCEA産物の分子量は抗CEA MAb COL−
１を用いウェスターンブロット分析法で測定した。精製
ヒトCEAの18キロダルトンの産物と、株化されたヒト結
腸癌細胞系GEOの抽出物中に検出されたCEAとを対照に使
用した。Ｖ−NYC,rV（NYC）−CEA,V−WRおよびrV（WR）
−CEAを感染させた細胞の抽出物を膜に移し、COL−１に
ついて分析した。rV（NYC）−CEAを感染させた細胞は90
キロダルトンの産物を発現したが、野性型Ｖ−NYCまた
はＶ−NRを感染させた細胞はCEAの存在を全く示さなか
った。一方rV（WR）−CEAを感染させた細胞を90キロダ
ルトンと180キロダルトンの産物を発現したがこれらの
産物はCOL−１と反応した。発現産物が変化する理由は
現在分かっていないが、rV（NYC）−CEAまたはrV（WR）
−CEAを感染させたBS−Ｃ−１をノーザンブロット分析
法で分析したところ2.4〜2.5kbのmRNA種が検出された
が、このことは全CEA転写物がこれらの細胞中に存在し
ていることを示している。

より二層変性されたrV（NYC）−CEAの構造体を、動物
モデル中に腫瘍移植体が定着するのを防止するために使
用した。形質導入されたヒトCEA遺伝子を有するMC−38
結腸癌細胞およびもっていない該細胞を、抗腫瘍作用が
CEAに対して特異的であるか否かを決定するために用い
た。また野生型Ｖ−NYCは、発生した防御免疫応答がNYC
ワクシニア株に挿入されたヒトCEA遺伝子の結果である
ことを確認するための対照免疫原として用いた。

12A図と12B図に示すように、野生型、またはCEA挿入
断片なしの組換えワクシニア構造体はいずれも、移植さ
れたCEA非導入腫瘍細胞の増殖に対して保護を与えなか
った。各グループ中の10頭のマウス全部から、腫瘍がほ
ゞ同じ速度で迅速に増殖した。CEA非導入およびCEA導入
のMC−38腫瘍は、ワクシニアの接種を全く受けていない
対照動物中で類似の速度で増殖し、および野生型のワク
シニア（Ｖ−NYC）の接種を受けたマウス中で増殖する
腫瘍と同じ速度で増殖した。

図12Cと12Dは、CEA導入結腸癌細胞の移植を阻害する
際のＶ−NYC対rV（NYC）−CEAの効力を比較している。
図12Cに示すように、野生型Ｖ−NYCを接種したマウスに
おいては、移植された腫瘍の8/10が迅速に増殖し、最終
的には10個の腫瘍がすべて増殖した。これに対して、rV
（NYC）−CEA構造体を接種した10種のマウスには腫瘍が
全く増殖しなかった。さらにrV（NYC）−CEAで免疫化し
たこれらのマウスは、その最初の腫瘍移植に続く120日
間は腫瘍が全くなかった。また120日目に１×10⁶のCEA
形質導入腫瘍細胞を移植したがやはり続く120日間の観
察期間を通じて腫瘍はなかった。rV（NYC）−CEAまたは
Ｖ−NYCの投与による毒性は全くみとめられなかった。

rV（NYC）−CEA構造体を予防接種すると、腫瘍の治療
に有効であることが分かった。すなわち定着した腫瘍の
増殖を阻害することが分かった。組換えワクシニアウイ
ルスによる治療を行う７日前に、腫瘍を動物に移植し
た。図13Aと13Bに示すように、MC−38癌細胞（非CEA形
質導入）の増殖速度は、Ｖ−NYCまたはrV（NYC）−CEA
の構造体が処理に用いられていても類似していた。また
CEA形質導入MC−38細胞を有するマウスも野生型Ｖ−NYC
で処理された場合は類似の腫瘍増殖速度示した（図13
C）。しかしこれに対して、腫瘍を有するマウスでrV（N
YC）−CEA構造体で処理された10頭はすべて腫瘍の増殖
が大きく低下した（図13D）。さらにこのグループの３
頭の動物は４ヶ月間腫瘍を発現しなかったが、CEA形質
導入MC−38細胞１×10⁶を再び移植したがその後の120日
間の観察期間を通じて腫瘍なしのままであった。非CEA
形質導入MC−38腫瘍を反対側の側部に同時に移植したと
ころその部位で増殖した。rV（NYC）−CEAの投与による
毒性は、処理された動物に全くみとめられなかった。

rV（NYC）−CEAワクシニアワクチンによってもたらさ
れた免疫応答の性質を試験した。表２に見られるよう
に、CEAに対する血清の力価は、rV（NYC）−CEAを投与
されたマウスの場合1:700〜1:5,250（平均1:2,255）で
あったが、Ｖ−NYCを接種された14頭のマウス全部と前
接種された（pre−inoculation）24頭のマウス全部の血
清の力価は1:20以下（平均≦1:82）であった。前接種グ
ループと、いずれかのワクシニア構造体を接種されたグ
ループとの全血清はすべて、力価が1:750の一頭のマウ
スを除いて、オボアルブミンに対する反応性が負もしく
は弱い陽性であった。rV（NYC）−CEAを接種した後の抗
体力価の増大の動力学も監視した。rV（NYC）−CEAの第
１回の接種の後、抗CEA力価はゆるやかに上昇し、第２
回と３回の接種を行った後大きく増大した。

rV（NYC）−CEAと野生型rV−NYCを接種されたマウス
の体液性応答。C57BL16マウスに、精製されたrV（NYC）
−CEAまたはＶ−NYCの10⁷pfuを尾部乱切法で３回接種し
た。免疫化前に（preと呼称する）、1:50で開始し５倍
希釈の血清を採取し、免疫化後35日目に、精製CEAと対
照抗原のオボアルブミンに対する反応性についてELISA
法で試験した。個々の血清の力価は、光学濃度（A490）
0.5における希釈ファクターとして測定した。

rV（NYC）−CEA構造体に対する細胞仲介免疫応答は遅
延型過敏症（DTH）：リンパ球増殖および細胞毒性に関
する検定法を用いて測定した。DTH反応は、rV（NYC）−
CEAまたはＶ−NYCを２回もしくは３回、尾部乱切法で接
種されたマウス（14日間隔で10⁷pfuの10μｌを接種）に
ついて測定した。最後のワクシニア接種を終って６日
後、一方の肉趾に、イラディエートされた（irradiate
d）非形質導入MC−38細胞（PBS中５×10⁵MC−38細胞の2
0μｌ）を、他方の内趾にイラディエートされたCEA−形
質導入MC−38細胞（PBS中５×10⁵のMC−38−CEA−２細
胞）を注射した。肉趾の厚さを接種してから48時間後に
測定した。

対照のPBS溶液を注射したマウスには内趾間に差異は
ほとんど見られないか又は全くみとめられなかったの
で、ベースライン値を決定するのに用いた。マウスにＶ
−NYC構造体を２回接種したときに同様の負の結果が得
られた。rV（NYC）−CEAを２回注射された10頭のマウス
のうち２頭は、CEA形質導入腫瘍細胞を注射された内趾
にいくらか異なる膨張を示した。Ｖ−NYC構造体を３回
注射されたマウスは、CEA形質導入腫瘍に対してDTH応答
をほとんど示さないかまたは全く示さなかったが、rV
（NYC）−CEA構造体を３回注射されたマウスの大部分
（14/20）は、CEA−形質導入腫瘍細胞に対して異なるDT
H反応性を示した。rV（NYC）−CEA構造体とＶ−NYC構造
体の３回の注射後のDTHの試験結果の差は統計的に有意
な差であった。（ｐ＜0.001,スチューデント検定法）。
したがって、これらの試験結果は、rV（NYC）−CEAの３
回の投与が、ヒトCEA形質導入腫瘍細胞に対しDTH反応を
もたらす２回の投与より明らかに優れている（ｐ値＜0.
001対＜0.01）ことを示した。

rV（NYC）−CEAのワクチン注射の結果起こるリンパ球
増殖応答を評価するため、第３と最後のワクシニアを接
種後28日目に未免疫化マウスまたは免疫化マウスから単
離した脾臓Ｔ細胞を、各種の刺激に対する応答における
増殖で示される機能応答能と抗原特異性について試験し
た（表３）。試験したＴリンパ球の３グループの中の、
rV（NYC）−CEAで免疫化されたマウスのグループだけが
可溶性CEAに応答した。CEAに対する抗原特異性はオボア
ルブミンすなわち関連のない可溶性抗原を用いて示した
が、オボアルブミンはこれらのマウス由来のリンパ球を
刺激しなかった。CEAに加えて、rV（NYC）−CEAマウス
由来のリンパ球は、生体外でのリコールチャレンジ（re
call challenge）のUV不活性化ワクシニアウイルスに対
して応答した。さらにＶ−NYCを受けているが免疫化さ
れていないマウス由来のリンパ球はUV不活性化ワクシニ
アウイルスに対する反応性を示した。したがってこのこ
とは、Ｖ−NYCグループの、このウイルス抗原に対する
特異性および未機能応答能を確証している。最後に、リ
ンパ球の３グループ全部が、機能Ｔ細胞適応能の一般的
尺度としてのConAに対して強く応答した。したがってrV
（NYC）−CEAで免疫化されているがＶ−NYCで免疫化さ
れていないと、CEAに対するＴ細胞の応答性を誘発し
た。このことは生体内の抗腫瘍作用と関連がある。

動物中のワクチン誘発抗CEA細胞障害性応答の存在を
評価するため、第２回のワクシニア接種後５日目に、Ｖ
−NYCまたはrV（NYC）−CEAで免疫化されたマウスから
脾臓Ｔリンパ球を直接単離した。というのはCTLの誘発
が追加免疫化後（boost）すぐに最大になるからであ
る。表４にその結果を示したが、rV（NYC）−CEAで免疫
化され、Ｖ−NYCでは免疫化されていないマウス由来の
リンパ球は、同族体の抗原を有するMC−38−CEA−２腫
瘍細胞の溶解を仲介した。これに対して、両エフェクタ
ーグループを有する類似のインキュベーション条件下、
溶菌活性のバックグランドレベルだけが、MC−38、すな
わちCEA−陰性腫瘍標的に対して検出できた。ConAの存
在下（ConAは抗原特異的認識を妨げかつレクチン依存性
細胞障害性を促進する）、両方のエフェクターのグルー
プは効率的にMC−38を溶解した。このことはＶ−NYCを
受けているマウス由来のリンパ球は溶解活性があり、腫
瘍細胞系は溶解作用に対して本質的に抵抗性ではないこ
とを確証している。

実施例13 霊長類内でのrV（NYC）−CEAワクチンの免疫原性と安全
性 rV（NYC）−CEAワクチンによって霊長類内にもたらさ
れる免疫応答を測定しおよびこのワクチンの安全性を評
価するために試験を行った。

12頭の５〜７年齢の成熟アカゲザル〔マカカ・ムラタ
ー（Macaca mulatta）〕を使用した。これらのサルは、
rV（NYC）−CEAまたはＶ−NYCの１×10⁸もしくは５×10
⁸プラーク形成単位（pfu）を含有する精製ウイルス10μ
ｌまたは50μｌを用い、皮膚乱切法で６週間間隔にて３
回または４回免疫化した。４頭の動物が１×10⁸pfuのrV
（NYC）−CEAを受け、４頭の動物が５×10⁸pfuのrV（NY
C）−CEAを受け、および４頭の動物が５×10⁸pfuのＶ−
NYCを受けた。免疫化の方法は表５に詳細に記載してあ
る。

安全性：ワクチンによってもたらされる外傷の面積を
各接種後続いて24時間分析した。一般にはじめの２回の
接種後の方が第３もしくは第４の接種後と比べて腫れが
大きい。しかし各免疫後の外傷の期間はほゞ同じであっ
た。ワクチン注射に続く局所リンパ節の腫れはいくつか
のサルでは第１回の免疫化後の方が第２、第３または第
４の免疫化の場合より大きかった。一般に、rV（NYC）
−CEAワクチンまたはＶ−NYCワクチンの使用によってパ
ラメータに差はみとめられなかった。

野生型ワクシニアウイルスを受けているサルは、体
温、体重、局所のリンパ節症、および巨脾腫と肝腫の存
在については組換えワクシニアウイルスを受けているサ
ルと同等であった。ゆるやかな体温上昇はワクチン注射
後すべての動物に見られた。ゆるやかな局所リンパ節症
が免疫化後に続く数週間にわたってみとめられたが、ど
の動物にも、体重減少、肝腫または巨脾腫の徴候は全く
なく、対照と組換えワクシニア投与の動物間に差は全く
みとめられなかった。動物は、全血球計算、鑑別血球計
算、肝臓の化学的性質（血清アルブミン、ビリルビン、
SGOT,SGPTおよびγ−グルタミルトランスペプチダー
ゼ）および腎臓の化学的性質（血液尿素窒素および血清
クレアチニンのレベル）について試験したが、これらに
ついてはすべて試験期間を通じて全動物について正常の
まゝであるか、または組換えワクチンの注射と野生型ワ
クチンの注射を行った動物との間に有意差は全くみとめ
られなかった。

サル（とヒト）の顆粒球を、非特異的交差反応性抗原
（NCA）とCEAの発現について評価した。CEA遺伝子は免
疫グロブリン遺伝子のスーパーファミリーに属すること
が報告されており、正常なヒト顆粒球に見られるNCAの
ようないくつかの正常な成人組織に発現するタンパク質
といくらかの相同性を共有していることが報告されてい
る。CEAはヒトの顆粒球で発現することは今まで報告さ
れていない。NCAに対する免疫交差反応性を誘発する可
能性は鑑別血球計算およびELISA法によって評価した。
鑑別血球計算ではワクチン注射を行った動物のいずれに
ついても全く差がなく、かつ抗NCA応答はrV（NYC）−CE
Aのワクチン注射によって誘発されなかった。サルの顆
粒球の表面NCAの発現は、モノクローナル抗体のB6.2
（これがヒトNCAと反応することはすでに報告されてい
る:Horan Handら、Int.J.Biol.Markers,7巻、１〜15
頁、1992年）およびB1.1（NCAとCEAが共有しているエピ
トープと反応することはすでに報告されている;Kuroki
ら、Int.J.Cancer,44巻、208〜218頁、1989年）を用い
てフローサイトメトリー（flow cytometry）で測定し
た。両抗体はサルの顆粒球の表面上のNCAに対して有意
な表面反応性を示した。動物を、CEAを発現する組換え
ワクシニアウイルスで免疫化してもNCAエピトープに対
して明らかな免疫応答を誘発しなかった。

免疫原性：免疫化したサルを、rV（NYC）−CEAによっ
て誘発される体液性免疫応答と細胞性免疫応答の両方に
ついて試験した。

各サルからの血清を、CEA,NCAおよび対照抗原として
のオボアルブミン（OVA）に対する免疫反応性についてE
LISA法で分析した。抗−CEA抗体は、精製CEA,NCA（Koro
kiら、Cancer Res.,211巻、713〜720頁、1981年の方法
にしたがって正常なヒトの肺の過塩素酸による粗製抽出
物から精製）、またはPBS中のオボアルブミン（Sigma
社、米国、セント・ルイス）の100ngでコートした微量
滴定プレートを使ってELISA法で定量した。プレートはP
BS中５％のBSAでブロックし、乾燥し使用するまで−20
℃で貯蔵した。そしてプレートは種々の希釈率のサル血
清および標準対照としてのMabCOL−１とともに37℃で１
時間インキュベートした。プレートを洗浄し、抗体は、
西洋ワサビペルオキシダーゼを接合したヤギ抗ヒトIgG
F₂特異的抗血清（1:8000;South−ern Biotechnology,In
c.,米国、アラバマ州、バーミンガム）で検出し、続い
て、0.015％過酸化水素と2.8mMのＯ−フェニレンジアミ
ン二塩酸を含有する0.17リン酸−クエン酸緩衝液pH5.0
の100μｌとともに10分間インキュベートした。4N硫酸2
5μｌを添加して反応を停止させ、Bio−Tekの微小プレ
ートELISA読取り器を用いて490nmで吸光度を読取った。

結果を表６に示したが、免疫前の血清はすべて３種の
全抗原に対して陰性であった。一次の免疫化後28日目に
おいて、８頭のrV（NYC）−CEAを接種されたサルのなか
の２頭に、CEAに対する強い抗体力価（1:1,000血清希釈
より大きい）が観察された。49日目すなわち第１回の追
加免疫化後１週間目に1:2500の血清希釈以上に大きい抗
体力価がrV（NYC）−CEAを受けている８頭のすべてのサ
ルにみとめられたがＶ−NYCを受けているサルのどれに
もみとめられなかった。63日目にも類似の結果がみとめ
られた。91日目（第２回の追加免疫化後７日目）には、
rV（NYC）−CEAを受けて試験された７頭のすべてのサル
に1:1,000血清希釈以上に大きい抗体力価がみとめら
れ、そのうち四頭の力価は1:5,800以上に大きかった。r
V（NYC）−CEAを受けている８頭のサルのうちの１頭は9
1日目にNCAに対する免疫応答が1:1250であることがみと
められたが、OVAに対する反応性もいくらかこのサルに
みとめられた。別の２頭のサル、すなわちＶ−NYCを受
けている一頭とrV（NYC）−CEAを受けている一頭も91日
目にNCAに対する抗体力価をいくらか示したがOVAに対し
ても同じ力価がみとめられた。このことは潜在的な非特
異的反応性があることを示唆している。したがって、rV
（NYC）−CEAは、アカゲザル中のCEAに発現されたエピ
トープに対して強い応答を誘発したが、NCA特異的エピ
トープに対してはほとんどまたは全く応答しなかったよ
うである。抗CEA応答の時間の経過による力価を図14に
示す。

rV−CEAの最初のワクチン注射をした後35日目の１頭
のサル由来の血清試料を、CEA,NCAおよびオボアルブミ
ンに対する反応性についてウエスターンブロット法で分
析した。精製CEAを認識するがオボアルブミンまたは精
製NCAは認識しない抗血清がブロット中に見出された。
同じサル由来の免疫前の血清はCEA,NCAまたはオボアル
ブミンを検出しなかった。CEAとNCAをそれぞれ認識する
モノクローナル抗体COL−１とB6.2を陽性の対照として
使用した。

rV（NYC）−CEAワクチンによって誘発された免疫グロ
ブリンの生物活性を、エフェクターとしてヒト末梢血液
単核細胞を用い、標的としてヒトCEA形質導入マウス腫
瘍細胞系を用いる抗体依存性細胞障害検定法で分析し
た。非CEA形質導入細胞は対照として用いた。図15Aに示
すように、CEAを発現する腫瘍細胞の特異的溶解（1ysi
s）は、rV（NYC）−CEAで免疫化されたサル由来の血清
を使ったときにみとめられたが、標的として非形質導入
腫瘍細胞を用いたときには溶解は全くみとめられなかっ
た。免疫前の血清またはＶ−NYCを接種されたサル由来
の血清には溶解は全くみられなかった。図15Bに示すよ
うに、rV（NYC）−CEAで免疫化されたサル由来の血清の
ADCC活性は、IL−２で活性化されたヒト末梢血液単核細
胞を使って増大された。

rV（NYC）−CEAで誘発された細胞免疫応答を、遅延型
過敏症（DTH）応答とリンパ球増殖検定法で評価した。D
TH応答は最後の免疫化後７日目に皮膚試験を行って評価
した。精製CEA（Vitro Diagnostics社、米国、コロラド
州、リトルトン）とオボアルブミン（Sigma社、ミズー
リ州、セント・ルイス）の100μｇを含有するPBS 0.1mg
を皮内注射した。陽性の対照として、UV不活性化ワクシ
ニアウイルス１×10⁷pfu（10分間254nm）を注射した。
腫れと紅斑を48時間後に測定し、次いで陽性応答のパン
チ生検試料を採取し、その反応のDTH性を組織病理学的
試験によって確認した。その試験結果は、免疫原として
rV（NYC）−CEAを受けている７頭のサル全部と、免疫原
として対照のＶ−NYCを受けている５頭のうち４頭と
は、不活性化Ｖ−NYCワクシニアウイルスの注射に対し
て陽性のDTHで応答した。一方これら12頭のサルのどれ
も、オボアルブミン対照の抗原接種に対して応答しなか
った。Ｖ−NYCを接種されたサルのどれも接種抗原（Cha
llenge antigen）としてのCEAに応答しなかったが、rV
（NYC）−CEAで免疫化された８頭のサルの中の７頭がCE
A抗原の注射に対してDTH反応で応答した。これらの試験
結果は図16に示す。

リンパ球増殖検定法を行うため、免疫化サルから、そ
れらの最後の免疫化を行ってから６箇月後または12箇月
後にPBMCを単離した。PBMCはLymphocyte Separation Me
diumを用いヘパリン処理を行った血液から単離し、PBMC
は、10％の熱不活性化ウシ胎仔血清を補充したRPMI1640
の0.2ml中２×10⁵の細胞を平底96ウエルプレート（Cost
ar社、米国、マサチューセッツ州、ケンブリッジ）の１
ウエル当りにプレートし、適切な抗原とともに６日間ま
たはコンカナバリンＡ（ConA;Sigma社）とともに３日間
培養した。細胞は、インキュベーションの最後の18〜24
時間に、１μCi/ウエルの〔³H〕−チミジン（New Engla
nd Nuclear社）とともにインキュベートして標識をつ
け、PHD細胞ハーベスター（Cambridge Technology社、
米国、マサチューセッツ州、ケンブリッジ）で収穫し
た。取込まれた放射能を液体シンチレーション分光法
（Beckman LS 3801）で測定し、３個のウエルから得た
試験結果を平均し、平均値±SEMとして報告した。

試験結果を表７に示すが、すべてのサルはrV（NYC）
−CEAまたはＶ−NYCを受けているにかかわらず良好に応
答したことを示した。Ｖ−NYCで免疫化されたサルから
は、オボアルブミンに比べてCEAに対して特異的なリン
パ球応答はほとんどないか全くなかった。しかしCEA対
オボアルブミンに対する鑑別応答は、rV（NYC）−CEAで
免疫化された３頭のサルに、最後の免疫化を行ってから
12箇月目にもみられた。したがってこれらの試験結果と
DTHの結果は、rV（NYC）−CEAワクチンの、CEAに対する
特異的細胞応答を誘発する性能を示している。

先に挙げた刊行物はすべて、その全体を本願に援用す
るものとする。

上記発明は、明白に理解するために詳細に説明した
が、当該技術分野の当業者であれば、上記の開示事項を
呼んで、形態と細部の種々の変更は、本発明の真の適用
範囲と後述の特許請求の範囲から逸脱することなく実施
できることが分かるであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＡ６１Ｐ 35/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＡＣ１２Ｎ 7/00 Ａ６１Ｋ 37/66 Ｇ (56)参考文献特開昭63−119681（ＪＰ，Ａ) Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ｓｃｉ．ＵＳＡ（1982）Ｖｏｌ．79，ｐ. 7415−7419 Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（1987）Ｖｏｌ. 142，Ｎｏ．２，ｐ．511−518 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12N 7/00 A61K 38/00 - 39/00 A61K 45/00 A61P 35/00 ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】癌胎児性抗原（CEA）遺伝子が挿入された
ワクシニアウイルスからなる組換えウイルスであって；このウイルスに感染した細胞の表面にCEAを発現し、か
つCEAおよびCEAを発現する細胞に対して特異的な生体内
免疫応答を誘発する組換えウイルス。
【請求項２】前記ワクシニアウイルスがＶ−WR株のウイ
ルスである請求の範囲第１項記載の組換えウイルス。
【請求項３】前記ワクシニアウイルスがNYC株のウイル
スである請求の範囲第１項記載の組換えウイルス。
【請求項４】前記ワクシニアウイルスが他の弱毒ヒトワ
クシニアウイルス株で組換えられている請求の範囲第１
項記載の組換えウイルス。
【請求項５】前記CEAが単一または多数の免疫優性Ｔ細
胞エピトープからなる請求の範囲第１項記載の組換えウ
イルス。
【請求項６】rV−CEAで構成されている組換え癌胎児性
抗原／ワクシニアウイルス（ATCC受託番号VR2323）。
【請求項７】前記ワクシニアウイルスがCEAの発現を増
大するプロモーターを含有している請求の範囲第１項記
載の組換えウイルス。
【請求項８】請求の範囲第１項〜第７項のいずれか１項
記載の組換えウイルスを含んで成る、癌の細胞がCEAを
発現する癌にかかっている患者の治療のための医薬組成
物。
【請求項９】前記癌細胞が胃腸、***、すい臓、膀胱、
卵巣、肺または前立腺の癌細胞である請求の範囲第８項
記載の医薬組成物。
【請求項１０】前記癌細胞が、CEAエピトープを発現す
る上皮誘導癌細胞からなる請求の範囲第８項記載の医薬
組成物。
【請求項１１】生体応答調節剤と共に投与するための請
求の範囲第８項記載の医薬組成物。
【請求項１２】前記生体応答調節剤がインターロイキン
−２（IL−２）、インターロイキン−６（IL−６）、イ
ンターフェロン、腫瘍壊死因子（TNF）およびシクロホ
スファミドからなる群から選択される請求の範囲第11項
記載の医薬組成物。
【請求項１３】アジュバントと共に投与するための請求
の範囲第８項記載の医薬組成物。
【請求項１４】癌細胞の定着と増殖を防止するために、
CEAに対する哺乳類の免疫系を刺激するための、請求項
１〜７のいずれか１項記載の組換えウイルスを含んで成
る医薬組成物。
【請求項１５】前記ワクシニアウイルスがNYC株のウイ
ルスである請求の範囲第14項記載の医薬組成物。
【請求項１６】前記ワクシニアウイルスが、弱毒ヒトワ
クシニアウイルス株で組換えられている請求の範囲第14
項記載の医薬組成物。
【請求項１７】生体応答調節剤と共に投与される請求の
範囲第14項〜第16項のいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項１８】前記生体応答調節剤が、インターロイキ
ン−２（IL−２）、インターロイキン−６（IL−６）、
インターフェロン、腫瘍壊死因子（TNF）およびシクロ
ホスファミドからなる群から選択される請求の範囲第17
項記載の医薬組成物。
【請求項１９】アジュバントと共に投与される請求の範
囲第14項記載の医薬組成物。