DE69826285T2

DE69826285T2 - Verwendung von vitamin d verbindungen zur vorbeugung von transplantatabstossung

Info

Publication number: DE69826285T2
Application number: DE69826285T
Authority: DE
Inventors: F. Hector Deluca; T. Margherita CANTORNA; A. Debra HULLETT; W. Hans SOLLINGER; Jean Humpal-Winter; E. Colleen HAYES
Original assignee: Wisconsin Alumni Research Foundation
Current assignee: Wisconsin Alumni Research Foundation
Priority date: 1997-06-06
Filing date: 1998-06-04
Publication date: 2005-10-20
Anticipated expiration: 2018-06-05
Also published as: CA2292734A1; US6071897A; WO1998055127A1; EP0998290B1; EP0998290A1; JP2002510304A; DK0998290T3; DE69826285D1; AU7817298A; ES2229502T3

Description

1,25-(OH)₂D₃ und Analoge
Die 1α-hydroxylierten Metaboliten von Vitamin D (von besonderer Bedeutung sind 1α,25-Dihydroxyvitamin D₃ und 1α,25-Dihydroxyvitamin D₂) sind als hochgradig wirksame Regulatoren der Calcium-Homöostase bei Tieren und Menschen bekannt. In jüngerer Zeit wurde auch ihre Aktivität bei der zellulären Differenzierung festgestellt. Infolgedessen wurden zahlreiche Strukturanaloge dieser Metaboliten, z. B. Verbindungen mit verschiedenen Seitenkettenstrukturen, verschiedenen Hydroxylierungsmustern oder verschiedener Stereochemie, hergesellt und getestet. Wichtige Beispiele für derartige Analoge sind 1α-Hydroxyvitamin D₃, 1α-Hydroxyvitamin D₂, verschiedene, an den Seitenketten fluorierte Derivate von 1α,25-Dihydroxyvitamin D₃ und Analoge mit homologen Seitenketten. Mehrere dieser bekannten Verbindungen weisen in vivo oder in vitro eine hochgradige Aktivität auf und besitzen vorteilhafte Aktivitätsprofile, so dass sie bei der Behandlung verschiedener Krankheiten, wie renale Osteodystrophie, Vitamin D-resistente Rachitis, Osteoporose, Psoriasis, multiple Sklerose und bestimmte maligne Erkrankungen, eingesetzt werden oder dafür vorgeschlagen worden sind.
1,25-(OH)₂D₃ als Immunomodulator
Der erste Hinweis, dass Vitamin D möglicherweise eine immunitätsmodulierende Wirkung aufweist, bestand in der Entdeckung, dass periphere Blutmonozyten und aktivierte T-Lymphozyten 1,25-Dihydroxyvitamin D₂-Rezeptoren aufweisen (Übersicht bei S. C. Manolagas, et al., Mol. and Cell. Endocrin., Bd. 43 (1985), S. 113–122). Trotz zahlreicher Untersuchungen bleibt die immunomodulatorische Aktivität von 1,25-Dihydroxyvitamin D₃ weitgehend undefiniert und häufig umstritten (Übersicht bei S. C. Manolagas et al., a. a. O. (1985); W. F. C. Rigby, Today, Bd. 9 (1988), S. 54–57; und J. M. Lemire et al., J. Nutr., Bd. 125 (1995), S. 17045–17085).
Die Wirkung von 1,25-Dihydroxyvitamin D₃ auf. humane periphere mononukleare Blutzellen (PBMC) wurde in vitro eingehend untersucht. Diese in vitro-Experimente zeigten, dass das Hormon die mitogenstimulierte Proliferation von PBMC (J. M. Lemire et al., J. Clin. Invest., Bd. 74 (1984), S. 657–661; W. F. C. Rigby et al., J. Clin. Invest., Bd. 74 (1984), S. 1451–1455) durch Verringerung der IL-2-Bildung (J. M. Lemire et al., J. Immunol., Bd. 134 (1985), S. 3032; S. Iho et al., Immunol. Let., Bd. 11 (1985), S. 331–336; S. C. Manolagas et al., J. Clin. Endocrinol. Met., Bd. 63 (1986), S. 394) auf dem Niveau der Gentranskription (2. Alroy et al., Mol. Cell. Biol., Bd. 15 (1995), S. 5789–5799) hemmt. Im Gegensatz dazu berichteten Bhalla et al. (A. K. Bhalla et al., J. Immunol., Bd. 133 (1984), S. 1748–1754), dass das Hormon nicht die mitogenstimulierte Mäuse-Milz- und -Thymus-Zellproliferation hemmt, obgleich es die antigenstimulierte Proliferation dieser Zellen hemmt. Lacey et al. (D. L. Lacey et al., J. Immunol., Bd. 138 (1987), S. 1680–1686) berichteten, dass das Hormon tatsächlich die mitogeninduzierte Proliferation von klonierten Mäuse T-Zellen stimuliert. Es gab keine Untersuchungen, die direkt auf die Wirkung des Hormons auf die in vivo-T-Lymphozyten-Differenzierung und -Funktion abgestellt waren.
Über unterschiedliche Ergebnisse bezüglich der in vitro-T-Lymphozyten-IFN-γ-Synthese wurde berichtet. Rigby et al. (W. F. C. Rigby et al., J. Clin. Invest., Bd. 79 (1987), S. 1659–1664) und Reichel et al. (H. Reichel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 84 (1987), S. 3387–3389) zeigten, dass 1,25-Dihydroxyvitamin D₃ die IFN-γ-Synthese in mitogenstimuliertem PBMC verringert. Jedoch berichteten Muller et al., (K. Muller et al., Immunol. Let., Bd. 35 (1993), S. 177–182), dass das Hormon in humanen T-Zelllinien keinen Einfluss auf die IFN-γ-Synthese ausübt. Das Hormon hemmt die zytotoxische T-Lymphozyten-Entwicklung, jedoch nicht die zytotoxische Funktion (F. Merino et al., Cell. Immunol., Bd. 118 (1989), S. 328–336).
Es gibt eine Kontroverse über die in vitro Wirkung von 1,25-Dihydroxyvitamin D₃ auf Monozyten/Makrophagen-Zellen. 1,25-Dihydroxyvitamin D₃ verstärkt eine Differenzierung von myeloiden Leukämiezellen zum Makrophagen-Phänotyp (S. C. Manolagas et al., a. a. O. (1985)). Es erhöht auch die Bildung von M-CSF, TNF-α und Prostaglandin E₂ durch Monozyten-Makrophagen, vermindert aber die IL-12-Synthese (J. M. Lemire et al., FASEB J., Bd. 8 (1994), A745 (abs)). Das Hormon verringert die Makrophagen-Costimulationswirkung bezüglich der T-Zellproliferation (W. F. C. Rigby und M. G. Waugh, Arthritis Rheum., Bd. 35 (1992), S. 110–119). Über unterschiedliche Ergebnisse wurde bezüglich der Einflüsse von 1,25-Dihydroxyvitamin D₃ auf die IL-1-Synthese berichtet. Das Hormon verringert gemäß einigen Berichten die IL-1-Synthese (S. Iho et al., a. a. O. (1985); C. S. Tsoukas, et al., J. Clin. Endocrionol. Metab., Bd. 69 (1989), S. 127–133) und erhöht gemäß anderen Berichten die IL-1- Synthese (E. P. Amento, J. Clin. Invest., Bd. 73 (1987), S. 731–739; A. K. Bhalla et al., Immunol., Bd. 72 (1991), S. 61–64; D. L. Fagan et al., Mol. Endocrinol., Bd. 5 (1991), S. 179–186). Gleichermaßen berichteten einige Autoren, dass 1,25-Dihydroxyvitamin D₃ die in vitro-Expression von Klasse II-Protein verstärkt (P. A. Morel et al., J. Immunol., Bd. 136 (1986), S. 2181–2186), während andere Autoren berichteten, dass es die Expression von Klasse II-Protein verringert (E. P. Amento, a. a. O. (1987); M. N. Carrington et al., J. Immunol., Bd. 140 (1988), S. 4013–4018; W. F. C. Rigby et al., Blood, Bd. 76 (1990), S. 189–197). Insgesamt lassen diese Befunde keine klare und übereinstimmende Beurteilung darüber zu, wie 1,25-Dihydroxyvitamin D₃ die Makrophagenfunktion modifiziert. Es gibt keine Untersuchungen, die sich direkt mit der Wirkung des Hormons auf die in vivo-Differenzierung und Funktion von Monozyten/Makrophagen befassen.
Es gibt auch eine Kontroverse über die Wirkung von 1,25-Dihydroxyvitamin D₃ auf B-Lymphozyten (Übersicht bei W. F. C. Rigby, a. a. O. (1988)). Lemire et al. (J. M. Lemire et al., a. a. O. (1984)) berichteten, dass das Hormon die mitogenstimulierte IgG- und IgM-Synthese durch humane periphere mononukleare Blutzellen hemmt. Es wurden unterdrückende und verstärkende Wirkungen von 1,25-Dihydroxyvitamin D₃ auf die mitogenstimulierte B-Zellproliferation und auf die in vitro-Antikörpersynthese gezeigt. Es wurde berichtet, dass 1,25-Dihydroxyvitamin D₃ in vivo die Antikörpersynthese bei einigen Untersuchungen verstärkt (J. Abe et al., Endocrinology, Bd. 124 (1989), S. 2645–2647; T. K. Ross et al., Vitamins Hormones, Bd. 49 (1994), S. 281–326; R. A. Daynes et al., Infec. Immun., Bd. 64 (1996), S. 1100–1109), während es bei anderen Untersuchungen eine Hemmwirkung ausübt (J. M. Lemire et al., a. a. O. (1995)).
Lemire et al., Transplantation, Bd. 54 (1992), S. 762–763, beschrieben eine Verlängerung der Überlebenszeit von murinen Herzallotransplantaten von 7 auf 16 Tage durch das Vitamin D₃-Analoge 1,25-Dihydroxy-delta-16-cholecalciferol. Die wirksame Dosis dieses Analogen verursachte eine schwere Hyperkalzämie. Weitere Analoge zeigten eine gewisse Veränderung, bewirkten aber ebenfalls eine Hyperkalzämie.
Johnsson et al., Transplant. Proc., Bd. 28 (1996), S. 888–891 beschrieben eine Verlängerung der Überlebenszeit von 3 auf 14 Tage durch Verabreichung des Vitamin D-Analogen MC 1288 bei Wistar/Kyoto-Ratten-Herz-Allotransplantaten. Diese Autoren schlossen, dass das Analoge am besten in Kombination mit Cyclosporin wirkte. Das Analoge erhöhte die Überlebenszeit von 8–11 Tagen, rief aber ebenfalls eine Hyperkalzämie hervor.
Eine Behandlung mit 1,25-Dihydroxyvitamin D₃ (1,25-(OH)₂D₃) wurde von anderen Autoren auf ihre Fähigkeit zur Verlängerung der experimentellen Überlebenszeit bei Herztransplantationen getestet. Lemire et al. (a. a. O.) (1992)) verwendeten das murine Herztransplantatmodell und zeigten, dass 1,25-(OH)₂D₃ die Transplantatüberlebenszeit nicht verlängerte. In einem Übersichtsartikel zitiert Bouillon (Bouillon et al., Endocrine Review, Bd. 16 (2) (1995), S. 200–257) ein Experiment an der Ratte, bei dem eine kurze Verlängerung von Herztransplantaten bei Behandlung mit 1,25-(OH)₂D₃ erzielt wurde (6 Tage bei der Kontrolle gegenüber 10 Tage bei Behandlung). Die Dosis an 1,25-(OH)₂D₃, die für diese minimale Transplantatverlängerung erforderlich war, betrug 500 ng/kg/Tag bei intraperitonealer Verabreichung. Insgesamt lässt sich aus diesen Experimenten der Schluss ziehen, dass unmodifiziertes 1,25-(OH)₂D₃ allein die Transplantatüberlebenszeit insgesamt nicht verlängert.
Kurze Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Mäßigung der Transplantatabstoßung bei einem Transplantatempfänger durch orale Verabreichung einer Menge einer Vitamin D-Verbindung, vorzugsweise von 1,25-(OH)₂D₃ oder Analogen davon, die die Akzeptanz von Allotransplantaten induziert. Das Verfahren umfasst die Auswahl eines Patienten und die Verabreichung einer ausreichenden Menge des Vitamin D-Analogen an den Patienten, so dass die Abstoßung des transplantierten Organs gemäßigt wird.
In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung wird die Anfälligkeit gegenüber opportunistischen Infektionen nicht erhöht und die Knochenentmineralisierung verhindert.
In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform des Verfahrens handelt es sich bei der verabreichten Verbindung um ein 1α,25-Dihydroxyvitamin D₃ (1,25-(OH)₂D₃), 19-nor-1,25-Dihydroxyvitamin D₂ (19-nor-1,25-(OH)₂D₃), 24-homo-22-Dehydro-22E-1α,25-dihydroxyvitamin D₃ (24-homo-22-Dehydro-22E-1,25-(OH)₂D₃), 1,25-Dihydroxy-24(E)-dehydro-24-homovitamin D₃ (1,25-(OH)₂-24-homo D₃) oder 19-nor-1,25-Dihydroxy-21-epivitamin D₃ (19-nor-1,25-(OH)₂-21-epi-D₃). In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Verbindung um 1,25-(OH)₂D₃.
Eine bevorzugte Dosis der Vitamin D-Verbindung für die vorliegende Erfindung stellt die maximale Dosis dar, die ein Patient verträgt und die keine ernsthafte Hyperkalzämie entwickelt.
Wenn es sich bei der Vitamin D-Verbindung nicht um eine α-Hydroxyverbindung handelt, liegt eine besonders vorteilhafte Tagesdosis der Vitamin D-Verbindung im Bereich von 10,0 bis 100 μg pro Tag pro Patient mit 72,6 kg (160 lb). Wenn es sich bei der Vitamin D-Verbindung um eine 1α-Hydroxyverbindung handelt, liegt die bevorzugte Dosis im Bereich von 0,25 bis 50 μg pro Tag pro Patient mit 72,6 kg (160 lb). Wenn der Patient Calcium in einer Menge von mehr als 800 mg/Tag einnimmt, werden Dosen von 1,25-(OH)₂D₃ von mehr als 0,75 μg pro Tag pro Patient mit 72,6 kg (160 lb) nicht bevorzugt. Wenn der Patient auf eine Diät mit geringem Calciumgehalt gesetzt ist und/oder die Dosis spät am Abend einnimmt, sind höhere Dosen von 1,25-(OH)₂D₃ möglich und bevorzugt. Bei dieser Ausführungsform der Erfindung kann 1,25-(OH)₂D₃ in einer hohen Dosis von 1,5 μg pro Tag pro Patient mit 72,6 kg (160 lb) verabreicht werden. Eine bevorzugte Dosis beträgt 0,5 bis 1,0 μg pro Tag pro Patient mit 72,6 kg (160 lb).
Es stellt einen Vorteil der vorliegenden Erfindung dar, dass das Verfahren zu einer Mäßigung der Transplantatabstoßung führt.
Gemäß einem weiteren Vorteil der vorliegenden Erfindung wird durch das Verfahren die Transplantatüberlebenszeit erhöht.
Gemäß einem weiteren Vorteil der vorliegenden Erfindung bewirkt das Verfahren eine Mäßigung der Transplantatabstoßung ohne Erhöhung der Gefahr einer opportunistischen Infektion.
Gemäß einem weiteren Vorteil der vorliegenden Erfindung erhöht das Verfahren die Transplantatüberlebenszeit ohne Erhöhung der Gefahr einer opportunistischen Infektion und ohne Knochenentmineralisierung beim Patienten.
Gemäß einem weiteren Vorteil der vorliegenden Erfindung mäßigt das Verfahren die Transplantatabstoßung ohne Knochenentmineralisierung beim Patienten.
Weitere Vorteile und Merkmale der vorliegenden Erfindung ergeben sich beim Studium der Beschreibung, der Ansprüche und der Zeichnung.
Kurze Beschreibung der verschiedenen Darstellungen der Zeichnung
1 ist ein Diagramm zur Darstellung der Operationserfolgsrate für Isotransplantate, eine Allotransplantatkontrolle und Allotransplantate bei mit 1,25-(OH)₂D₃ behandelten Empfängern.
2 ist ein Diagramm zur Darstellung des Transplantationserfolgs im Anschluss an eine Behandlung von Transplantatempfängern mit 1,25-(OH)₂D₃ und Cyclosporin.
3 ist ein Diagramm zur Darstellung der Erfolgsrate für Lewis-Lewis-Isotransplantate, ACI-Lewis-Allotransplantate und ACI-Lewis-Allotransplantate bei mit 1,25-(OH)₂D₃ behandelten Patienten.
4 ist ein Diagramm zur Darstellung der Mortalität im Anschluss an eine systemische C. albicans-Infektion.
5 ist ein Diagramm zur Darstellung der Mortalität im Anschluss an eine okulare HSV-Infektion.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung einer Vitamin D-Verbindung, vorzugsweise von 1,25-(OH)₂D₃ oder von Analogen davon bei der Herstellung eines Arzneimittels zur oralen Verabreichung an humane Transplantationspatienten in einer Menge, die eine Verringerung von Abstoßungssymptomen bewirkt. Ein Transplantationspatient wird ausgewählt und erhält eine Verabreichung des Vitamin D-Analogen in einer Menge, die ausreicht, dass die Abstoßungssymptome beseitigt oder gemäßigt werden. Unter "gemäßigt" verstehen wir, dass die Überlebensdauer durch die verabreichte Verbindung in signifikanter Weise verlängert wird.
Unsere Ergebnisse zeigen, dass Behandlungen mit 1,25-(OH)₂D₃ die Transplantationsüberlebenszeit im Vergleich zu einem unbehandelten Empfänger verlängern können. Jedoch werden immunosuppressive Mittel nicht in Form eines einzelnen Verabreichungsmodus gegeben. Vielmehr werden in den meisten Transplantationszentren 3-fache oder 4-fache Aufrechterhaltungstherapien angewandt. Somit würde 1,25-(OH)₂D₃ (oder ein Analoges davon) typischerweise als Bestandteil einer Aufrechterhaltungstherapie gegeben, wobei eine der Verbindungen in der Menge vermindert oder abgesetzt würde (vermutlich Prednison). Um die Wirksamkeit zu überwachen, ist die Behandlung mit 1,25-(OH)₂D₃ mit einer Standardtherapie in Bezug auf die Anzahl von akuten, durch Biopsie nachgewiesenen Abstoßungsepisoden während der ersten 6 Monate und in Bezug auf eine verminderte oder nicht erhöhte Toxizität zu vergleichen. Vorzugsweise ist der Patient auf eine verminderte akute Abstoßung bei verringerten oder gar keinen opportunistischen Infektionen und einem vermindertem Knochenverlust zu überwachen.
Unter einer "signifikant verlängerten" Überlebenszeit verstehen wir, dass die Vergleiche zeigen, dass die Organüberlebensrate um mindestens 10%, vorzugsweise 20% und ganz besonders 30% höher ist.
Wir haben festgestellt, dass 1,25-(OH)₂D₃ nicht als bloßes Immunosuppressivum wirkt, sondern als selektives Modulationsmittel von Immunreaktionen, was eine entsprechende Widerstandsfähigkeit gegen Infektionen ermöglicht, während für eine Toleranz von beliebigen Transplantaten mit unterschiedlicher Histokompatibilität gesorgt wird.
Ferner haben wir festgestellt, dass die Analogen von 1,25-(OH)₂D₃ im Gegensatz zu anderen Arzneistoffen, die dazu verwendet werden, ein Überleben von Transplantaten zu ermöglichen, keine Knochenentmineralisierung verursachen, sondern die Knochen des Transplantatempfängers verbessern.
In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei der verabreichten Verbindung um 1α,25-Dihydroxyvitamin D₃ (1,25-(OH)₂D₃), 19-nor-1,25-Dihydroxyvitamin D₂ (19-nor-1,25-(OH)₂D₃), 24-homo-22-Dehydro-22E-1α,25-dihydroxyvitamin D₃ (24-homo-22-Dehydro-22E-1,25-(OH)₂D₃), 1,25-Dihydroxy-24(E)-dehydro-24-homovitamin D₃ (1,25-(OH)₂-24-homo D₃) oder 19-nor-1,25-Dihydroxy-21-epivitamin D₃ (19-nor-1,25-(OH)₂-21-epi-D₃).
Bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung weist die Vitamin D-Verbindung die folgende Formel auf
wobei X¹ und X² jeweils unabhängig voneinander aus der Gruppe Wasserstoff und Acyl ausgewählt sind; wobei Y¹ und Y² H bedeuten können oder einer dieser Reste O = Aryl oder O = Alkyl bedeuten kann und eine β- oder α-Konfiguration aufweisen kann; Z¹ = Z² = H oder Z¹ und Z² zusammen CH₂ bedeuten; und wobei R eine Alkyl-, Hydroxyalkyl- oder Fluoralkylgruppe bedeutet oder R die folgende Seitenkette bedeuten kann
wobei (a) eine S- oder R-Konfiguration aufweisen kann, R¹ Wasserstoff, Hydroxy oder O-Acyl bedeutet, R² und R³ jeweils unabhängig voneinander Alkyl, Hydroxyalkyl oder Fluoralkyl bedeuten oder zusammen die Gruppe -(CH₂)_m- bedeuten, wobei m einen Wert von 2 bis 5 hat, R⁴ Wasserstoff, Hydroxy, Fluor, O-Acyl, Alkyl, Hydroxyalkyl oder Fluoralkyl bedeutet, wobei dann, wenn R⁵ Hydroxy oder Fluor bedeutet, R⁴ Wasserstoff oder Alkyl bedeuten muss, R⁵ Wasserstoff, Hydroxy, Fluor, Alkyl, Hydroxyalkyl oder Fluoralkyl bedeutet oder R⁴ und R⁵ zusammen doppelt gebundenen Sauerstoff bedeuten, R⁶ und R⁷ zusammen eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung bilden, R⁸ H oder CH₃ bedeutet, und wobei n einen Wert von 1 bis 5 hat und wobei der Kohlenstoff an einer beliebigen der Positionen 20, 22 oder 23 in der Seitenkette durch ein O-, S- oder N-Atom ersetzt sein kann.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Verbindung werden R² und R³ unter Alkyl, Hydroxyalkyl und Fluoralkyl ausgewählt.
Man kann eine in Frage kommende Vitamin D-Verbindung bezüglich ihrer Eignung für die vorliegende Erfindung bewerten. Vorzugsweise wird die in Frage kommende Verbindung zunächst einem anfänglichen Mäusemodell-Screeningvorgang unterzogen, wie er beispielsweise in den nachstehenden Beispielen für 1,25-(OH)₂D₃ beschrieben ist. Eine erfolgreiche Verbindung führt zu einer Verringerung von Symptomen der Transplantatabstoßung bei Mäusen, vorzugsweise in einem Ausmaß, wie er in den Beispielen für 1,25-(OH)₂D₃ dargelegt ist. Jedoch wird eine erfolgreiche Verbindung allgemein als eine Verbindung beschrieben, die die Überlebenszeit des Transplantats um mindestens 10% und vorzugsweise 20% verlängert.
Vorzugsweise soll die Verbindung auch eine signifikante Verringerung von opportunistischen Infektionen und von Knochenentmineralisierungen im Vergleich zu mit Cyclosporin A behandelten Transplantatempfängern ergeben. Die nachstehenden Beispiele beschreiben experimentelle Modelle für die Messung von opportunistischen Infektionen und von Knochenentmineralisierung. Für diese Verbindungen lässt sich sodann ein erfolgreiches Verhalten bei humanen Patienten vorhersagen.
Die nachstehenden Beispiele belegen, dass mit Vitamin D-Verbindungen behandelte Tiere gegenüber opportunistischen Infektionen nicht anfälliger sind als Kontrolltiere.
Die Beispiele belegen ferner, dass mit Vitamin D-Analogen behandelte Tiere keine verminderten Werte für die gesamte Knochenasche und die prozentuale Knochenasche zeigen. Tatsächlich bewirken Behandlungen mit Vitamin D-Analogen eine Zunahme der Werte für die gesamte und prozentuale Knochenasche.
Eine bevorzugte Dosis der Vitamin D-Verbindung für die vorliegende Erfindung stellt die maximale Dosis dar, die ein Patient verträgt und bei der er keine ernsthafte Hyperkalzämie entwickelt.
Wenn es sich bei der Vitamin D-Verbindung nicht um eine 1α-Hydroxyverbindung handelt, liegt eine besonders vorteilhafte Tagesdosis der Vitamin D-Verbindung im Bereich von 10,0 bis 100 μg pro Tag pro Patient mit 72,6 kg (160 lb).
Wenn es sich bei der Vitamin D-Verbindung um eine 1α-Hydroxyverbindung handelt, liegt die bevorzugte Dosis im Bereich von 0,5 bis 50 μg pro Tag pro Patient mit 72,6 kg (160 lb). Wenn der Patient Calcium in normaler Menge aufnimmt, werden Dosen der 1α-Hydroxyverbindung, wie 1,25-(OH)₂D₃, von mehr als 0,75 μg pro Tag pro Patient mit 72,6 kg (160 lb) nicht bevorzugt. Wenn der Patient auf eine Diät mit geringem Calciumgehalt gesetzt ist und/oder die Dosis spät am Abend einnimmt, sind höhere Dosen von 1,25-(OH)₂D₃ möglich und bevorzugt. Bei dieser Ausführungsform der Erfindung kann die Menge des verabreichten 1,25-(OH)₂D₃ einen hohen Wert von 1,5 μg pro Tag pro Patient mit 72,6 kg (160 lb) aufweisen. Eine bevorzugte Dosis liegt im Bereich von 0,5 bis 1,5 μg pro Tag pro Patient mit 72,6 kg (160 lb).
1,25-Dihydroxyvitamin D₃ (1,25-(OH)₂D₃) wird derzeit in einer Menge von 0,5 μg/Tag pro Patienten mit 72,6 kg (160 lb) verabreicht, üblicherweise in zwei Viertelmikrogramm-Kapseln am Morgen und am Abend, um eine Behandlung von Osteoporose oder renaler Osteodystrophie vorzunehmen. In Ländern, wo die diätetische Calciummenge in der Größenordnung von 800 mg/Tag oder sogar im Bereich bis zu 1 000 mg/Tag liegt, können höhere Dosen an 1,25-(OH)₂D₃ nicht angewandt werden, da derartige Dosen zu einer Erhöhung von Calcium im Urin und im Plasma führen, woraus sich die Gefahr einer Hyperkalzämie und einer daraus resultierenden Beeinträchtigung der Niere sowie eine Calcifizierung des Herzens, der Lunge, der Aorta und anderen Weichgeweben ergibt.
Daher liegt die maximale bevorzugte Dosis von 1,25-(OH)₂D₃ offensichtlich bei 0,5 μg/Tag. Jedoch können höhere Dosen unter Umständen, bei denen das diätetische Calcium im Bereich von 600 mg/Tag liegt, angewandt werden. Andere, weniger aktive 1α-Hydroxyvitamin D-Verbindungen können in sicherer Weise in höheren Dosen verabreicht werden. Beispielsweise erfolgt in Japan die Behandlung von Osteoporose mit 1,25-(OH)₂D₃ in einer Dosis von 0,5 bis 0,75 μg/Tag. Entsprechendes gilt für andere Länder mit geringer Calciumaufnahme, wie Italien, wo eine Dosis von 1,25-(OH)₂D₃ von 1 mg/Tag mit Erfolg eingesetzt wurde (A. Caniggia et al., Metabolism, Bd. 39 (1990), S. 43–49).
Wir nehmen an, dass zur Erhöhung des Transplantationserfolgs eine höhere Dosis an 1,25-(OH)₂D₃ besonders hilfreich ist. Die Calciumaufnahme kann auf etwa 400 bis 500 mg/Tag verringert werden, indem man lediglich Milchprodukte und Calciumergänzungen in der Nahrung weglässt. Ferner kann die Dosis von 1,25-(OH)₂D₃ am Abend vor dem Zubettgehen, d. h. um 22 Uhr, verabreicht werden. Aufgrund des Zeitpunkts des Auftretens dieser Verbindung im Kreislauf ergibt sich für die Calciumresorption ein Minimum, was höhere Dosen an 1,25-(OH)₂D₃ ermöglicht.
Nachstehend wird ein bevorzugtes Behandlungsschema angegeben: vor dem Transplantationsvorgang wird die Calciumaufnahme des Patienten auf etwa 500 mg/Tag verringert, indem sämtliche Calciumergänzungen weggelassen werden und auch die Aufnahme von Milchprodukten verringert wird, wodurch sich eine diätetische Calciumaufnahme von 500 mg ergibt. Die Behandlung mit Vitamin D soll mindestens 5 Tage vor dem Transplantationsvorgang beginnen. Wenn unter diesen Umständen das 1,25-(OH)₂D₃ um 22 Uhr verabreicht wird, kann die Dosis an 1,25-(OH)₂D₃ in sicherer Weise auf bis zu 1 μg oder vielleicht auf 2,0 μg/Tag erhöht werden.
Die bevorzugte Verabreichungsart für 1α-Hydroxyverbindungen besteht in einer Verabreichung unter regulären diätetischen Umständen in einer Dosis von 0,5 bis 0,75 μg/Tag der Verbindung. Ein bevorzugtes Verfahren besteht in der Verabreichung von 0,75–1 μg/Tag um 22 Uhr oder vor dem Zubettgehen. Ein besonders bevorzugtes Verfahren besteht darin, sowohl die diätetische Calciumaufnahme auf 400 bis 500 μg/Tag zu verringern und um 22 Uhr 0,75 bis 1,5 μg/Tag zu verabreichen.
Eine bevorzugte Behandlungsweise mit Nicht-1α-Hydroxyverbindungen besteht in der Verabreichung unter regulären diätetischen Umständen. In diesem Fall kann die Dosis auf bis zu 100 μg/Tag pro Patient mit 72,6 kg (160 lb) erhöht werden.
Unter "Transplantatabstoßung" verstehen wir Krankheitssymptome, die durch einen Verlust an Organfunktionen gekennzeichnet sind. So wird eine Nierenabstoßung durch eine Erhöhung der Creatininkonzentration im Blut und mittels einer Biopsie festgestellt. Eine Herzabstoßung wird durch eine endomyokardiale Biopsie festgestellt, während eine Pankreasabstoßung durch Biopsie und erhöhte Blutglucosewerte festgestellt wird. Eine Leberabstoßung wird durch Messung von aus der Leber stammenden Transaminasen, durch Messung der Bilirubinkonzentration im Blut und durch Biopsie festgestellt. Eine Darmabstoßung wird durch Biopsie festgestellt, während eine Lungenabstoßung durch Messung der Sauerstoffsättigung im Blut festgestellt wird.
Die vorliegende Erfindung eignet sich für sämtliche Organtransplantationen, vorzugsweise für Herz, Leber, Niere, Pankreas, Lunge und Darm. Bei Hauttransplantaten handelt es sich aufgrund der besonderen immunologischen Aspekte nicht um Organtransplantate entsprechend der erfindungsgemäßen Definition.
Beispiele
A. Verringerung von opportunistischen Infektionen nach einer Transplantation
1. Allgemeines
Wir verglichen eine Behandlung mit 1,25-(OH)₂D₃ und mit Cyclosporin A in Bezug auf die Möglichkeit zur Verhinderung von Herz-Transplantatabstoßungen. Da Cyclosporin A den hauptsächlich eingesetzten Arzneistoff gegen Abstoßungen darstellt, wird es als Vergleichsstandard für die Bewertung neuer Transplantationsarzneistoffe verwendet (B. M. Jubak und C. D. Colt, "Handbook of Kidney Transplantation", Infection Complications of Kidney Transplantation and their Management, G. M. Danovitch Hrsg., S. 187–213).
Ferner bestimmten wir, ob identische Dosen an 1,25-(OH)₂D₃ und Cyclosporin A die Fähigkeit des Wirts, Infektionen mit Candida albicans und Herpes simplex-Viren (HSV) zu überstehen, verminderte. Somit wurden C. albicans und HSV als Pathogene zur Messung der Widerstandsfähigkeit des Wirts verwendet, da Transplantationspatienten, die mit breit wirkenden, immunosuppressiven Arzneistoffen (wie Cyclosporin A) behandelt werden, häufig fungale und virale Infektionen entwickeln. C. albicans-Infektionen gehören zu den häufigsten Infektionen bei immunosupprimierten Individuen (B. M. Jubak und C. D. Colt, a. a. O.). Gleichermaßen tragen Mitglieder der Herpesviridae-Familie von Viren zu einem großen Teil der Morbidität und Mortalität von immunosupprimierten Individuen bei (B. M. Jubak und C. D. Colt, a. a. O.). Zu Mitgliedern dieser Familie von Viren gehören HSV, Zytomegalovirus (CMV) und Epstein-Barr-Virus (EB). Sämtliche humanen Herpes-Viren werden häufig im Anschluss an eine immunosuppressive Therapie auf Organtransplantationen reaktiviert (D. O. White und F. J. Fenner, Medical Virology Third Edition, Kapitel 16, S. 401).
2. Materialien und Methoden
Tiere: B10.A(4R)-Mäuse-Brutpaare wurden von Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) bezogen und in der Biochemie-Tieranlage gezüchtet. Geschlechtslos gemachte neugeborene B10.A(4R)-Mäuse im Alter von 12 bis 24 Stunden wurden als Spender von Herztransplantaten herangezogen. Männliche C57BL/10-Mäuse (Allotransplantat) (Sprague Dawley, Indianapolis, IN) und männliche B10.A(4R)-Mäuse (Isotransplantat) wurden als Empfänger verwendet. Der Spenderstamm ist mit dem Empfänger an einem Klasse I-Locus und an zwei Klasse II-Loci unverträglich (B10.A(4R)-H-2 K^kA_β ^kA_α ^k, C57BL10-H-2K^bA_β ^bA_α ^b).
Behandlungen: Experimentelle Diäten (S. Yang et al., Arch. Biochem. Biophys., Bd. 303 (1993), S. 98–106), die kein Vitamin D enthielten, wurden zubereitet und für die Versuchsdauer gemäß den Angaben von S. Yang et al., (1993), a. a. O., alle 2 bis 3 Tage ersetzt. Gruppen von 9–10 Empfängern wurden mit der experimentellen Diät allein, der experimentellen Diät plus eine intraperitoneale Injektion von Cyclosporin A (25 mg/kg/Tag) oder der experimentellen Diät, die 50 ng 1,25-(OH)₂D₃ pro Maus pro Tag ergab, gefüttert. Mit den Diäten wurde 1 Woche vor der Transplantation oder Infektion begonnen. Die Dosis von Cyclosporin A beruhte auf den Berichten von anderen Autoren (G. Babany et al., J. Pharmac. Exp. Therap., Bd. 244 (1987), S. 259). Eine Dosis von 2,5 mg/kg/Tag war zu nieder, um bei unseren Experimenten das Überleben des Transplantats zu verlängern. Eine Dosis von 25 mg/kg/Tag erwies sich als wirksam. Die experimentellen Diäten enthielten normale Mengen an Calcium (0,47%).
Transplantationen: Es wurde das Verfahren von Babany et al. (G. Babany et al., (1987), a. a. O.) herangezogen. Empfängermäuse wurden mit Etomidat (28 mg/kg intraperitoneal) betäubt. Das Spenderherz wurde sorgfältig herausgeschnitten und ohne Entfernung des Atriums in zwei Teile aufgeteilt. Die Ohren der Empfänger wurden mit 70%igem Alkohol gereinigt. Ein Schlitz von 2 mm wurde angebracht, um eine Tasche zu bilden, in die das Spenderherz eingesetzt wurde. Anschließend wurden überschüssige Flüssigkeit und etwaige Luft sorgfältig entfernt. Ein 16 gauge-Kunststoff-Angiokatheter wurde zum Einsetzen des halben Herzens in die Ohrtasche verwendet.
Bewertung der Transplantat-Lebensfähigkeit: Die Herztransplantate wurden täglich mit mikrochirurgischen Vergrößerungsgläsern (3 ×) von einem technischen Assistenten, der über die Behandlung nicht Bescheid wusste, betrachtet. Die Mäuse wurden für diese Beobachtungen nicht betäubt. Besonders sorgfältig wurden bei der Bewertung das Einsetzen und Nachlassen einer Kontraktionsaktivität berücksichtigt, um eine falsche Bewertung eines Transplantats zu vermeiden. Nach 4 aufeinanderfolgenden Tagen, an denen keine Kontraktionen beobachtet wurden, wurden die Tiere getötet, gewogen und einer Blutentnahme für die Analyse von Calcium im Serum unterzogen.
Datenanalyse: Die Erfolgsrate für jede Gruppe von Mäusen wurde als Verhältnis der Gesamtzahl der Empfänger mit kontrahierenden Herztransplantaten zur Gesamtzahl in der Gruppe angegeben.
Candida albicans-Infektionen: Gruppen von 5–6 männlichen C57BL10-Mäusen erhielten eine intravenöse Injektion von 5 × 10⁶ C. albicans B311 (Typ A, Dr. Edward Balish, University of Wisconsin, Madison). Eine systemische Candidose erfolgt bei immunosupprimierten Patienten im Anschluss an eine Dissemination von C. albicans aus dem Ernährungstrakt (W. Krause et al., Lancet, Bd. 1 (1981), S. 598). Ein Todesfall aufgrund von systemischer Candidose stellt das Ergebnis einer überhandnehmenden Niereninfektion dar, die zu einem Nierenversagen führt (M. T. Cantorna und E. Balish, J. Infect. Dis., Bd. 164 (1991), S. 936).
Virale Herpes simplex (HSV-1)-Infektionen: Weibliche Balb/c-Mäuse wurden durch Inhalation von 3–5% Halothan betäubt. Die Hornhaut wurde 3-mal vertikal und 3-mal horizontal mit einer 27 gauge-Nadel geritzt. Auf jedes Auge wurde ein Tropfen von 3,5 μl einer Virussuspension des HSV-1-Stammes DRG4A1 (Dr. Curtis Brandy, University of Wisconsin, Madison) mit einem Gehalt an 1 × 10⁶ plaquebildenden Einheiten/Maus aufgebracht (R. L. Kintner und C. R. Brandt, Curr. Eye Res., Bd. 14 (1994), S. 145). Der Tropfen wurde 30 Sekunden belassen. Nach dem Schließen des Auges wurde überschüssiges Medium mit einem Wattebausch entfernt. Das Virus verursacht eine lokale Infektion, die sich dann, wenn sie vom Immunsystem nicht beherrscht wird, verteilt und eine virale Enzephalitis herbeiführt und zum Tod führt.
3. Ergebnisse
1 beschreibt die Erfolgsrate für Isotransplantate und Allotransplantate. Bei sämtlichen Transplantaten setzte innerhalb von 8 Tagen nach dem chirurgischen Eingriff eine Kontraktion ein. Keines der Isotransplantate wurde abgestoßen, während sämtliche Kontroll-Allotransplantate am 15. Tag nach der Transplantation abgestoßen waren. Gemäß 1 führt eine Behandlung mit 1,25-(OH)₂D₃ zu einer signifikanten Verlängerung der Transplantatüberlebenszeit. Die mit 1,25-(OH)₂D₃ behandelten Mäuse zeigten keinerlei Transplantatabstoßungen bis zum 18. Tag nach der Transplantation. 40% der mit 1,25-(OH)₂D₃ behandelten Mäuse wiesen Transplantate auf, die bis zum 34. Tag überlebten. 20% der Transplantate überlebten 50 Tage oder mehr nach der Transplantation. Die Serum-Calciumwerte lagen bei beiden Gruppen im Normalbereich (Kontrollgruppe –8,5 ± 0,6 mg %; Behandlung mit 1,25-(OH)₂D₃: –9,3 ± 0.6 mg %).
2 beschreibt die Verlängerung der Transplantatüberlebenszeit im Anschluss an eine Behandlung mit 1,25-(OH)₂D₃ oder Cyclosporin. Unbehandelte Kontrollempfänger (•) behielten ihre Transplantate für durchschnittlich 9,8 Tage; Kochsalzlösung-Kontrollen für 11,6 Tage (Daten nicht aufgeführt); 2,5 mg/kg Cyclosporin (Daten nicht aufgeführt) für 11,3 Tage; und 50 ng 1,25-(OH)₂D₃ (o) für 52,2 Tage. Eine hohe Dosis von Cyclosporin von 25 mg/kg (
) ergab 34,0 Tage und eine Dosis von 200 ng 19 nor-1,25-(OH)₂D₂ (∇) 58,6 Tage. Von Bedeutung ist, dass 12% der mit 1,25-(OH)₂D₃ behandelten Mäuse und 22% der mit 19 nor-1,25-(OH)₂D₂ behandelten Mäuse ihre Transplantate mehr als 100 Tage nach der Transplantation behielten, während es bei sämtlichen mit Cyclosporin behandelten Mäusen bis zum 50. Tag zu einer Abstoßung kam. Wir schließen daraus, dass 1,25-(OH)₂D₃ und Analoge im Vergleich zu Cyclosporin sich besser in Bezug auf eine Verhinderung von Transplantatabstoßungen und eine Aufrechterhaltung der Transplantate verhalten.
In 4 ist die Mortalität im Anschluss an systemische C. albicans-Infektionen in Form eines Diagramms dargestellt. Männliche C57BL10-Mäuse wurden systemisch mit C. albicans infiziert. Es handelte sich um die gleichen Mäuse, die bei den vorstehenden Experimenten als Transplantatempfänger verwendet wurden. Die Behandlung mit Cyclosporin erhöhte die Anfälligkeit dieser Mäuse gegenüber einer Infektion mit C. albicans im Vergleich zu den Kontrollen und zu den mit 1,25-(OH)₂D₃ behandelten Tieren. 40% der mit Cyclosporin behandelten Mäuse starben 9 Tage nach der Infektion, während keines der Kontrolltiere oder der mit 1,25-(OH)₂D₃ behandelten Tiere starb. 3 Wochen nach der Infektion waren nur noch 20% der mit Cyclosporin behandelten Tiere am Leben, während 80% der Kontrolltiere und 100% der mit 1,25-(OH)₂D₃ behandelten Tiere am Leben waren. Wir schließen daraus, dass eine Behandlung mit 1,25-(OH)₂D₃ keinen Einfluss auf die Anfälligkeit von Mäusen gegenüber einer Infektion durch C. albicans ausübt.
In 5 ist die Mortalität im Anschluss an eine streuende okulare HSV-Infektion in Form eines Diagramms dargestellt. Wir verwendeten weibliche Balb/c-Mäuse genau nach den Angaben unserer Mitarbeiter (R. L. Kintner und C. R. Brandt, (1994), a. a. O.). Eine Behandlung mit Cyclosporin A erhöhte die Anfälligkeit dieser Mäuse gegenüber einer HSV-Infektion im Vergleich zu den Kontrollen und zu den mit 1,25-(OH)₂D₃ behandelten Tieren. 100% der mit Cyclosporin behandelten Mäuse waren 10 Tage nach der Infektion eingegangen. Umgekehrt kam es bei nur 30% der Kontrolltiere und bei nur 36% der mit 1,25-(OH)₂D₃ behandelten Mäuse zu einer Streuung der viralen Infektion und zu einer letalen Wirkung. Wir schlossen daraus, dass eine Behandlung mit 1,25-(OH)₂D₃ keinen Einfluss auf die Anfälligkeit von Mäusen auf HSV-Infektionen ausübt.
B. Transplantatabstoßungen bei erwachsenen Ratten (nicht Gegenstand der Erfindung)
Um die Fähigkeit von 1,25-(OH)₂D₃, die Transplantat-Überlebenszeit zu verlängern, zu testen, untersuchten wir die Fähigkeit von 1,25-(OH)₂D₃, die Überlebenszeit einer erwachsenen Lewis-Ratte, der ein erwachsenes ACI-Herz transplantiert worden war, zu verlängern. Das Modell stellt ein direkt vaskularisiertes Modell dar und wird als zwingender angesehen. Die Kombination von ACI-LEWIS wird als hochgradig reaktionsfähig und als besonders schwierig für Transplantationen angesehen. Diese beiden Stämme von Ratten sind genetisch nicht verwandt, so dass Transplantate rasch abgestoßen werden sollten. Das Überleben eines Transplantats bei diesem Modell erfordert stark "immunosuppressive" Arzneistoffe.
Tiere: Männliche Inzucht-ACI- und Lewis-Raten wurden als Spender und Empfänger herangezogen. Sämtliche Tiere wurden von der Fa. Harlan Sprague-Dawley, Inc. (Indianapolis, IN) bezogen. Die Tiere wurden gemäß den NIH-Richtlinien gehalten. Sämtliche Verfahren waren vom University of Wisconsin Research Animals Resources Committee gebilligt.
Verfahrensweise: Spender und Empfänger wurden mit einer einzigen Injektion von Chloralhydrat (0,5 ml/100 g einer 7,5%igen Lösung, ip) betäubt. Nach Heparinisierung wurde das Spenderherz mit einer kalten, heparinisierten UW-Lösung perfundiert und entnommen. Die Spenderherzen wurden gemäß dem Verfahren von Ono und Lindsey gemäß früheren Angaben transplantiert (Y. Fujina et al., Transplant, Bd. 57 (1994), S. 41).
Behandlung: Eine Lösung von 1,25-(OH)₂D₃ in Ethanol wurde zu einer experimentellen Diät ohne Gehalt an Vitamin D gemäß den vorstehenden Angaben gegeben. Die Empfänger wurden 1 Woche vor der Transplantation auf eine experimentelle Diät mit 1,25-(OH)₂D₃ (500 ng/Ratte/Tag) gesetzt und bis zum Abstoßungszeitpunkt bei dieser Diät belassen. Ferner erhielten die Ratten für die ersten 4 Tage nach der Operation eine intraperitoneale Injektion von 1,25-(OH)₂D₃ (500 ng/Ratte). Die Empfänger wurden bis zum Abstoßungszeitpunkt bei der Diät belassen.
Ergebnisse: 3 zeigt, dass die Erfolgsrate für die Transplantationseingriffe 100% betrug, wie durch die Lewis-Lewis-Isotransplantate (♦) gezeigt ist. Lewis-Ratten mit Kontrollbehandlung behielten ihre Transplantate für durchschnittlich 6,6 Tage (O). Eine Behandlung mit 1,25-(OH)₂D₃ verlängerte die Transplantatüberlebenszeit auf einen Mittelwert von 22,6 Tagen (•). Wir schlossen, dass 1,25-(OH)₂D₃ die Überlebenszeit von erwachsenen Transplantaten in genetisch nicht-verwandten Empfängern verlängerte.
C. Bewertung des Knochenverlustes bei Transplantatempfängern
1. Allgemeines
Wir gewannen Oberschenkelknochen von sämtlichen transplantierten Mäusen, um festzustellen, ob unsere Behandlungen zu einem Knochenverlust führten. Eine ernste Nebenwirkung zahlreicher immunosuppressiver Therapien bei Transplantationspatienten besteht in einem Knochenverlust, spröden Knochen und Osteopenie (V. A. Brener et al., Transplantation, Bd. 59 (1995), S. 1393; B. A. Julian, et al., New Engl. J. Med., Bd. 325 (1991), S. 544).
2. Materialien und Methoden
Tiere: B10.A(4R)-Mäuse-Brutpaare wurden von der Fa. Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) bezogen und in der Biochemie-Tieranlage gezüchtet. Geschlechtslos gemachte neugeborene B10.A(4R)-Mäuse im Alter von 12 bis 24 Stunden wurden als Spender für Herztransplantate verwendet.
Männliche C57BL/10-Mäuse (Allotransplantat) (Sprague Dawley, Indianapolis, IN) und männliche B10.A(4R)-Mäuse (Isotransplantat) wurden als Empfänger verwendet. Der Spenderstamm ist mit dem Empfängerstamm an einem Klasse I-Locus und einem Klasse II-Locus unverträglich (B10.A(4R)-H-2 K^kA^k, C57BL10-H-2 K^bA^b).
Behandlungen: Experimentelle Diäten (S. Yang et al., (1993), a. a. O.), die kein Vitamin D enthielten, wurden hergestellt und für die Versuchsdauer alle 2 bis 3 Tage ausgetauscht. Gruppen von 9–10 Empfängern erhielten die experimentelle Diät allein, die experimentelle Diät plus eine intraperitoneale Injektion von Cyclosporin A (25 mg/kg/Tag) oder die experimentelle Diät, die 50 ng 1,25-(OH)₂D₃ pro Maus pro Tag ergab. Mit der Fütterung dieser Diäten wurde 1 Woche vor der Transplantation oder Infektion begonnen. Die gewählte Dosis von Cyclosporin A beruhte auf den Berichten von anderen Autoren (G. Babany et al., (1987), a. a. O.). Eine Dosis von 2,5 mg/kg/Tag war zu nieder, um bei unseren Experimenten das Überleben des Transplantats zu verlängern. Die experimentellen Diäten enthielten normale Mengen an Calcium (0,6%).
Transplantationen: Es wurde das Verfahren von Babany et al. (G. Babany et al., (1987), a. a. O.) herangezogen. Empfängermäuse wurden mit Etomidat (28 mg/kg intraperitoneal) betäubt. Das Spenderherz wurde sorgfältig herausgeschnitten und ohne Entfernung des Atriums in zwei Teile aufgeteilt. Die Ohren der Empfänger wurden mit Alkohol gereinigt. Ein Schlitz von 2 mm wurde angebracht, um eine Tasche zu bilden, in die das Spenderherz eingesetzt wurde. Anschließend wurden überschüssige Flüssigkeit und etwaige Luft sorgfältig entfernt. Ein 16 gauge-Kunststoff-Angiokatheter wurde zum Einsetzen des halben Herzens in die Ohrtasche verwendet.
Bewertung der Transplantat-Lebensfähigkeit: Die Herztransplantate wurden täglich mit mikrochirurgischen Vergrößerungsgläsern (3 ×) von einem technischen Assistenten, der über die Behandlung nicht Bescheid wusste, betrachtet. Die Mäuse wurden für diese Beobachtungen nicht betäubt. Besonders sorgfältig wurden bei der Bewertung das Einsetzen und Nachlassen einer Kontraktionsaktivität berücksichtigt, um eine falsche Bewertung eines Transplantats zu vermeiden. Nach 4 aufeinanderfolgenden Tagen, an denen keine Kontraktionen beobachtet wurden, wurden die Tiere getötet, gewogen und einer Blutentnahme für die Analyse von Calcium im Serum unterzogen.
Datenanalyse: Die Erfolgsrate für jede Gruppe von Mäusen wurde als Verhältnis der Gesamtzahl der Empfänger mit kontrahierenden Herztransplantaten zur Gesamtzahl in der Gruppe angegeben.
Messung der Knochenasche: Oberschenkelknochen wurden von den transplantieren Mäusen entnommen, nachdem sämtliche Mäuse die Spenderherzen abgestoßen hatten und durch Ersticken mit CO₂ getötet worden waren. Die Mäuse waren 4 bis 8 Wochen mit Cyclosporin oder 1,25-(OH)₂D₃ behandelt worden. Die Oberschenkelknochen wurden entnommen, von anhaftendem Gewebe befreit, zur Identifizierung markiert und 24 Stunden in 100% Ethanol getaucht. Die Flüssigkeitsniveaus wurden in periodischen Abständen eingestellt, um die Proben vollständig eingetaucht zu halten. Sodann wurden die Oberschenkelknochen entfernt und weitere 24 Stunden in Chloroform getaucht. Anschließend wurden die Oberschenkelknochen in austarierte Schmelztiegel gebracht und 12 oder mehr Stunden bei 100°C getrocknet. Sodann wurden die Schmelztiegel und die Oberschenkelknochen in einem Exsikkator getrocknet, gewogen und 24 Stunden in einem Muffelofen bei 600°C verascht. Nach Abkühlen des Ofens und der Proben wurden die Proben erneut 12 Stunden in einen Ofen von 100°C gestellt und sodann getrocknet. Anschließend wurden die veraschten Oberschenkelknochen gewogen.
In Tabelle 1 sind die Befunde zusammengestellt. Cyclosporin in niedriger Dosis (2,5 mg) verursachte eine geringfügige Abnahme des gesamten Knochenaschegehalts. Die hohe Dosis (25 mg) von Cyclosporin, die für eine Verlängerung der Überlebenszeit des Transplantats erforderlich war, verringerte in signifikanter Weise den Gesamtaschewert des Knochens. Andererseits verursachten Behandlungen mit 1,25-(OH)₂D₃ nicht nur keine Verringerung des Aschegehalts des Knochens, sondern erhöhten sowohl den gesamten als auch den prozentualen Aschegehalt des Knochens. Wir ziehen daraus den Schluss, dass eine Behandlung mit Cyclosporin, die die Transplantatabstoßung verzögert (25 mg/kg), einen Knochenverlust herbeiführt, während eine Behandlung mit 1,25-(OH)₂D₃, die die Überlebenszeit des Transplantats verlängert (50 ng/Tag) tatsächlich den gesamten und den prozentualen Aschegehalt des Knochens erhöht.
Tabelle 1

Claims

Verwendung einer Vitamin D-Verbindung bei der Herstellung eines Arzneimittels zur oralen Verabreichung zur Mäßigung der Transplantatabstoßung bei einem Transplantatempfänger ohne Verschlechterung der Anfälligkeit des Empfängers gegenüber opportunistischen Infektionen.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Menge der verabreichten Vitamin D-Verbindung 10 bis 100 μg pro Tag pro Patient mit 72,6 kg (160 lb) beträgt.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei es sich bei der Vitamin D-Verbindung um eine Verbindung der folgenden Formel handelt
wobei X¹ und X² jeweils unabhängig voneinander Wasserstoff oder Acyl bedeuten; wobei Y¹ und Y² H bedeuten können oder eins O = Aryl oder O = Alkyl bedeuten kann und die β- oder α-Konfiguration aufweisen kann; Z¹ = Z² = H oder Z¹ und Z² zusammen CH₂ bedeuten; und wobei R eine Alkyl-, Hydroxyalkyl- oder Fluoralkylgruppe bedeutet oder R eine der folgenden Seitenketten bedeuten kann:
wobei (a) eine S- oder R-Konfiguration aufweisen kann, R¹ Wasserstoff, Hydroxy oder O-Acyl bedeutet, R² und R³ jeweils unabhängig voneinander Alkyl, Hydroxyalkyl oder Fluoralkyl bedeuten oder zusammen die Gruppe -(CH₂)_m- bedeuten, wobei m einen Wert von 2 bis 5 hat, R⁴ Wasserstoff, Hydroxy, Fluor, O-Acyl, Alkyl, Hydroxyalkyl oder Fluoralkyl bedeutet, wobei dann, wenn R⁵ Hydroxy oder Fluor bedeutet, R⁴ Wasserstoff oder Alkyl bedeuten muss, R⁵ Wasserstoff, Hydroxy, Fluor, Alkyl, Hydroxyalkyl oder Fluoralkyl bedeutet oder R⁴ und R⁵ zusammen doppelt gebundenen Sauerstoff bedeuten, R⁶ und R⁷ zusammen eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung bilden, R⁸ H oder CH₃ bedeutet, und wobei n einen Wert von 1 bis 5 hat und wobei der Kohlenstoff an einer beliebigen der Positionen 20, 22 oder 23 in der Seitenkette durch ein O-, S- oder N-Atom ersetzt sein kann.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei es sich bei der Infektion um C. albicans oder HSV handelt.
Verwendung einer Vitamin D-Verbindung bei der Herstellung eines Arzneimittels zur oralen Verabreichung zur Mäßigung der Transplantatabstoßung bei einem Transplantatempfänger, wobei der Empfänger keine Knochendemineralisierung erleidet.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei es sich bei den Vitamin D-Verbindungen um 1α-Hydroxyverbindungen handelt.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei es sich bei der Verbindung um 1,25-(OH)₂D₃ handelt.
Verwendung nach Anspruch 3 oder 5, wobei die Menge der verabreichten Vitamin D-Verbindung 0,5 bis 50 μg pro Tag pro Patient mit 72,6 kg (160 lb) beträgt.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 3 bei der Herstellung eines Arzneimittels zur oralen Verabreichung zur Mäßigung der Transplantatabstoßung bei einem Transplantatempfänger, wobei die gesamte Knochenmasse des Empfängers nach der Transplantation nicht abnimmt.
Verwendung nach Anspruch 5 oder 9, wobei die Knochenmasse des Empfängers zunimmt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 3, 4, 9 oder 10, wobei es sich bei der Verbindung um 1,25-Dihydroxyvitamin D₃, 19-Nor-1,25-dihydroxyvitamin D₂, 19-Nor-21-epi-1,25-dihydroxyvitamin D₃, 1,25-Dihydroxy-24-homo-22-dehydro-22E-vitamin D₃ oder 19-Nor-1,25-dihydroxy-24-homo-22-dehydro-22E-vitamin D₃ handelt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 9 bis 11, wobei die Menge der verabreichten Verbindung 0,5 bis 10 μg pro Tag pro Patient mit 72,6 kg (160 lb) beträgt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die Menge der verabreichten Verbindung 0,5 bis 1,5 μg pro Tag pro Patient mit 72,6 kg (160 lb) beträgt.
Verwendung nach Anspruch 13, wobei die Menge der verabreichten Verbindung 0,5 bis 0,75 μg pro Tag pro Patient mit 72,6 kg (160 lb) beträgt.
Verwendung nach Anspruch 3 oder 9, wobei der Patient auf eine Diät mit niedrigem Calciumgehalt gesetzt ist.
Verwendung nach Anspruch 3 oder 9, wobei die Verabreichung nachts erfolgt.
Verwendung nach Anspruch 3 oder 9, wobei die Dosis oral verabreicht wird und der Patient auf eine Diät mit niedrigem Calciumgehalt gesetzt ist und wobei die Dosis der Vitamin D-Verbindung 0,5 bis 3,0 μg/Tag beträgt.
Verwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Transplantat-Überlebenszeit um mindestens 10% relativ zu einem unbehandelten Empfänger verlängert wird.
Verwendung nach Anspruch 18, wobei die Transplantat-Überlebenszeit um mindestens 20% relativ zu einem unbehandelten Empfänger verlängert wird.
Verwendung nach Anspruch 19, wobei die Transplantat-Überlebenszeit um mindestens 30% relativ zu einem unbehandelten Empfänger verlängert wird.
Verwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der Transplantatempfänger ein Organ erhalten hat, bei dem es sich um Herz, Leber, Niere, Pankreas, Lunge oder Darm handelt.
Verwendung nach Anspruch 21, wobei der Transplantatempfänger ein Herz erhalten hat.