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FACHGEBIET
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Extrakte von Geweihen des Cervus
nippon enthaltendes Arzneimittel mit wachstumsstimulierenden Aktivitäten auf
hämopoetische
Stammzellen und Megakaryozyten. Insbesondere betrifft die vorliegende
Erfindung ein Arzneimittel mit wachstumsstimulierenden Aktivitäten auf
hämopoetische
Stammzellen und Megakaryozyten, die als Wirkbestandteil Chloroformextrakte
vom Geweih des Cervus nippon (hier nachstehend als „Extrakt
CN-C" bezeichnet) enthalten,
die durch Extrahieren des Geweihs von Cervus nippon mit Hexan und
weiteres Extrahieren des Rückstands
des Hexanextrakts mit Chloroform und gegebenenfalls Fraktionieren
und Reinigen des Chloroformextrakts des Geweihs von Cervus nippon
durch Silicagelsäulenchromatografie
und Hochleistungsdünnschichtchromatografie
(HPTLC) erhalten werden.
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STAND DER
TECHNIK
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In
der traditionellen orientalischen Medizin in Korea wurde Hirschgeweih
zusammen mit Ginseng wegen ihrer verschiedenen anerkannten medizinischen
Wirkungen weit verbreitet verwendet. Die Hirschspezies, von welchen
die Geweihe geerntet werden, gehört
zu Cornu cervi parvum und schließen Cervus nippon Temminick
var manturicus Swinhoe und Cervus elephus L ein. Die Geweihe werden
geerntet, bevor sie verhornt und getrocknet werden, und nicht-verhornte
Testahülsen
werden zusammen mit anderen Kräuterarzneimitteln zur
Verwendung in Wasser gekocht.
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Es
wurde zugestimmt, dass das Geweih von Cervus nippon zahlreiche medizinische
Wirkungen, z.B. stärkende,
wachstums- und entwicklungsunterstützende Wirkungen, Unterstützen der
hämopoetischen
Funktion, Behandeln von Nervenzusammenbruch, Nützlichkeit für Herzinsuffizienz,
allgemeines Verbessern der Funktion der fünf inneren Organen und sechs
Innereien (Dong-euibogam, eine klassische medizinische Literatur
in Korea) aufweisen. Andere die Wirkungen von Hirschgeweihen betreffende
Literaturen in der traditionellen Medizin berichten ebenfalls über eine
stärkende,
nahrhafte Wirkung, leistungsfähige
allgemeine systemische Wirkungen, einschließlich Verbesserung der Herzfunktion,
Ermüdungserholungswirkungen,
Verbessern der systemischen Widerstandsfähigkeit gegen verschiedene
Erkrankungen.
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Zahlreiche
frühere
Untersuchungen wurden durchgeführt,
um den (die) Wirkbestandteil(e) für die „mysteriösen", allgemein nützlichen medizinischen Wirkungen
von Hirschgeweihen zu identifizieren. Viele Substanzen wurden angeblich
als Geweih von Cervus nippon identifiziert, und es wurde beansprucht,
dass es sich hierbei zumindest teilweise um den Wirkstoff handelt.
Dabei handelt sich es um Folgendes: Bestimmte freie Aminosäuren, Spurenmetallelemente,
Hexose, Pentose, Hexosamin, Uronsäure, Sialinsäure, Säuremukopolysaccharide
wie Hyaluronsäure,
Chondroitin-A, verschiedene Fettsäuren und Prostaglandine. Des
Weiteren wurde berichtet, dass Glycolipid, Phospholipid, Cholesterinhypoxanthin,
Cholest-5-en-3-β,7α-diol, Cholesterinester,
Polyamin vom Geweih von Cervus nippon isoliert wurden. Andere berichteten über die
Gegenwart eines Estron- und Estradiolrezeptors. Diese Berichte zeigen
jedoch nicht speziell die biologischen Wirkungen von bestimmten
chemischen Bestandteilen des Geweihs von Cervus nippon. Auch wurden
sie in keinem dieser Berichte zur potentiellen Arzneimittelherstellung
in vitro chemisch identifiziert und synthetisiert.
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Die
Chemotherapie und Radiotherapie von bösartigen, neoplastischen Erkrankungen
führt nicht
nur zur Zerstörung
der Krebszellen, was ein gewünschtes
Ergebnis ist, sondern auch von normalen Zellen, die zu bewahren
und zu schützen
sind. Insbesondere reagieren hämopoetische
Zellen, die Blutzellen sowie die erste Abwehrlinie gegen Infektionen
bereitstellen, für
diese Behandlungen sehr empfind lich. Deshalb kann eine Knochenmarkssuppression
und Immunsuppression durch eine starke Chemotherapie eher zum Tod
von Patienten führen,
als die eigentliche bösartige
Erkrankung, und diese toxischen Wirkungen waren die beschränkenden Faktoren
für eine
aggressivere Antikrebsbehandlung. Es besteht ein starker Bedarf
nach Arzneimitteln, die zum Schützen
und/oder Wiederherstellen von hämopoetischen
Systemen und Immunsystemen während
der zytotoxischen Antikrebschemotherapie und -radiotherapie verwendet
werden können.
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Jegliche
das Wachstum und die Differenzierung von hämopoetischen Stammzellen stimulierende
Arzneimittel würden
für einen
derartigen Zweck verwendet werden. Derartige Arzneimittel können bei
anderen Krankheitszuständen,
wo hämopoetische
Stammzellen abnormal supprimiert oder nicht-funktionell sind, wie bei
aplastischer Anämie,
zyklischer Neutropänie,
kongentialem Immundefizitsyndrom, Anämie durch chronisches Nierenversagen,
Infektionen auf Grund einer Knochenmarkssuppression und verminderter
Immunität bei
der älteren
Bevölkerung
verwendet werden.
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Es
gab eine beträchtliche
Entwicklung beim Verständnis
der Myelopoese und der verschiedenen Faktoren, die etliche Schritte
in der Hämopoese
beeinflussen. Beispiele für
die Wachstumsfaktoren, die schon entwickelt und auf dem Markt sind,
schließen
den Granulozytmakrophagenkolonien stimulierenden Faktor (GM-CSF), den Granulozytkolonien
stimulierenden Faktor (G-CSF) und Erythropoetin (EPO) ein. Bei allen
davon handelt es sich jedoch um eine Zytokinart, die nur in injizierbarer
Form wirksam ist, sie weisen einige unerwünschte Nebenwirkungen auf,
ihre Wirkung ist sehr kurzlebig, und sie sind immer noch sehr teuer.
Es besteht starker Bedarf nach einem weniger teueren und vorzugsweise
bei oraler Verabreichung wirksamen Arzneimittel.
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Die
Erfinder experimentierten an interessanten klinischen Fällen von
unerklärter
schneller Wiederherstellung von supprimiertem Knochenmark nach einer
Krebschemotherapie. Schließlich
wurde vorgeschlagen, dass der unerklärte Schutz des Knochenmarks
oder die schnelle Wiederherstellung nach einer Suppression mit der
Tatsache in Verbindung stehen könnte,
das die Patienten Hirschgeweihextrakte zu sich nahmen, da es in
Korea nicht unüblich
ist, dass viele Patienten die traditionell orientierte Medizin mit
der vom Arzt verabreichten Behandlungen kombinieren.
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OFFENBARUNG
DER ERFINDUNG
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Die
Erfinder untersuchten deshalb die Möglichkeit, dass bestimmte Wirkstoffe
in Geweihen von Cervus nippon vorliegen und untersuchten die Knochenmarkstammzellen
stimulierenden Wirkungen dieser Geweihextrakte. Als Ergebnis identifizierten
wir, dass Chloroformextrakte des Geweihs von Cervus nippon (hier
nachstehend als „Extrakt
CN-C" bezeichnet)
tatsächlich
wachstumsstimulierende Wirkungen auf hämopoetische Stammzellen und
Megakaryozyten aufweisen.
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Die
Erfinder erkannten, dass diese gereinigten Wirkverbindungen von
dem Extrakt CN-C oder deren Derivate die biologischen Wirkungen
des Stimulierens von hämopoetischen
Stammzellen, Megakaryozyten, Monozyten und Lymphozyten aufweisen,
und dass diese Verbindungen nicht nur nach parenteraler Verabreichung
wirksam sind, sondern auch bei oraler Verabreichung einzigartig
wirksam sind.
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Es
ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Arzneimittel mit
Wachstumsstimulierenden Aktivitäten
auf hämopoetische
Stammzellen und Megakaryozyten bereitzustellen, dass Extrakte von
Geweihen von Cervus nippon als Wirkbestandteil umfasst.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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1 zeigt
das Extraktionsverfahren für
das Geweih von Cervus nippon.
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2 zeigt
die Fraktionierung des Chloroformextrakts (CN-C) des Geweihs von
Cervus nippon.
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3 zeigt
die Hochleistungsdünnschichtchromatografie
(HPTLC) von Fraktionen, die in jedem Schritt der Extraktion und
Reinigung des Geweihs von Cervus nippon erhalten werden.
- a: CN-C-2-E-a-Mi von 2,
- b: CN-C von 2,
- c: CN-C-2 von 2,
- d: CN-C-2-E von 2,
- e: CN-C-2-E-a von 2,
- f: CN-C-2-E-a-Mi von 2
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4 ist
ein Fotomikrogramm des Querschnitts (× 100) der Milz einer Kontrollmaus.
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5 ist
ein Fotomikrogramm des Querschnitts (× 100) der Milz der mit GM-CSF (100U) behandelten Maus.
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6 ist
ein Fotomikrogramm des Querschnitts (× 100) der Milz der mit dem
Wasserextrakt vom Geweih von Cervus nippon behandelten Maus.
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BESTER DURCHFÜHRUNGSMODUS
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Bereitstellung eines neuen Verfahrens
zur Extraktion des Geweihs von Cervus nippon, die Isolierung und
Reinigung der Wirkverbindungen, die wachstumsstimulierende Wirkungen
auf die hämopoetischen
Stammzellen und Megakaryozyten aufweisen.
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Bei
der Hämopoese
handelt es sich um eine Reihe von Entwicklungsprozessen, in welchen
Knochenmarkstammzellen (pluripotente Stammzellen) (HSC), die sich sowohl
selbst erneuern als auch Nachkommen erzeugen können, mit dem Potenzial der
Differenzierung in verschiedene Blutzellenstämme (rote Zellen, Granulozyten,
Megakaryozyten und Lymphozyten), involviert sind. Im Blutzellensystem
werden alternde Zellen kontinuierlich durch die Nachkommen einer
sehr kleinen Anzahl an undifferenzierten Stammzellen ersetzt, die die
Fähigkeit
der Selbsterneuerung und Differenzierung aufweisen. Diese Stammzellen
differenzieren sich in eine Zellpopulation mit spezifischen funktionellen
Rollen und behalten diese bei. Die im Knochenmark erzeugten Blutzellen
werden nach einer bestimmten Zeitdauer im umgebenden Gewebe zerstört, und
ein derartiger Prozess wird während
des Lebens eines Tiers und eines Mensches kontinuierlich wiederholt.
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HSCs
weisen zwei wichtige Eigenschaften auf: ein Selbsterneuerungsvermögen zum
Erzeugen derselben Zellen wie sie selbst und das Vermögen, in
allen Systemen von lymphatischen und hämopoetischen Zellen differenziert
zu werden. Eine Untersuchung von hämopoetischen Zellen wurde durch
die erste Entdeckung initiiert, dass eine Knochenmarkssuppression
in quantitativer Weise durch Einbringen von normalen Knochenmarkzellen
in Tiere nach der Einwirkung einer nicht tödlichen Strahlungsdosis wieder
gewonnen werden kann. Ihr Vermögen
des Initiierens und Bewahrens einer langfristigen Hämopoese
ist die Basis für
eine erfolgreiche Knochenmarktransplantation (BMT) Eine Fließzytometrie
wird eingeführt,
und monoklonale Antikörper
für das
hämopoetische
Stammzellenmarkergen und Differenzierungsantigen werden entwickelt,
die Selektion von HSCs wurde möglich
und die Biologie und Entwicklung von hämopoetischen Zellen wurden
besser verständlich.
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Erfindungsgemäß können biologisch
wirksame Bestanteile im Geweih von Cervus nippon extrahiert werden.
Die vorliegende Erfindung schließt das Verfahren zu ihrer Extraktion
und Fraktionierung ein.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein Arzneimittel mit wachstumsstimulierenden
Aktivitäten
auf hämopoetische
Stammzellen und Megakaryozyten bereit, das als Wirkstoff Chloroformextrakte
vom Geweih von Cervus nippon enthält, die durch Extrahieren des
Geweihs von Cervus nippon mit Hexan und weiteres Extrahieren des
Rückstands
des Hexanextrakts mit Chloroform und gegebenenfalls Fraktionieren
und Reinigen des Chloroformsextrakts des Geweihs von Cervus nippon
durch Silicagelsäulenchromatografie
und Hochleistungsdünnschichtchromatografie
(HPTLC) erhalten werden.
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Zuerst
werden die Chloroformextrakte des Geweihs von Cervus nippon durch
Extrahieren des Geweihs von Cervus nippon mit Hexan und weiteres
Extrahieren des Rückstands
des Hexanextrakts mit Chloroform erhalten. Das Extraktionsverfahren
ist in 1 dargestellt. Die in diesem Extraktionsverfahren
verwendete Hexan- und Chloroformmenge ist die Menge, die zum Imprägnieren
des Geweihs von Cervus nippon ausreichend ist. Im Allgemeinen werden
Hexan und Chloroform im Verhältnis
von 4-5 Liter in Bezug auf 1 kg Geweih von Cervus nippon verwendet.
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Das
Extrakt CN-C, ein Chloroformextrakt des Geweihs von Cervus nippon,
das aus einem derartigen Extraktionsverfahren erhalten wird, wird
fraktioniert und durch eine Silicagelsäulenchromatografie- und Hochleistungsdünnschichtchromatografie-(HPTLC)-Reihe
gereinigt. Die anschließenden
Schritte des Extrakts CN-C,
des Chloroformextrakts des Geweihs von Cervus nippon schließen ein:
- a) den Schritt des Unterziehens des Extrakts
CN-C einer Silicagelsäulenchromatografie
unter Verwendung von Chloroform/Methanol als Eluent und Unterziehen
der erhaltenen Fraktion einer HPTLC unter Erhalt von sieben Extrakten,
CN-C-1 bis CN-C-7 gemäß dem Wert
von Rf,
- b) den Schritt des Unterziehens des aus den Extrakten von Schritt
a) ausgewählten
Extrakts CN-C-2 einer Silicagelsäulenchromatografie
unter Verwendung von Hexan/Ethylacetat (10:1, V/V) als Eluent und
Unterziehen der erhaltenen Fraktion einer HPTLC unter Erhalt von
6 Extrakten, CN-C-2-A
bis CN-C-2-F gemäß dem Wert
von Rf,
- c) den Schritt des Unterziehens des aus den Extrakten von Schritt
b) ausgewählten
Extrakts CN-C-2-E einer Silicagelsäulenchromatografie unter Verwendung
von Hexan/Ethylacetat/Essigsäure
(20:1:0,5, V/V) als Eluent und Unterziehen der erhaltenen Fraktion
einer HPTLC unter Erhalt von zwei Extrakten, CN-C-2-E-a und CN-C-2-E-b
gemäß dem Wert
von Rf, und
- d) den Schritt des Lösens
des aus den Extrakten von Schritt c) ausgewählten Extrakts CN-C-2-E-a in
Methanol unter Erhalt einer methanollöslichen Fraktion CN-C-2-E-a-Ms
und methanolunlöslichen
Fraktion CN-C-2-E-a-Mi
(Entwicklungslösungsmittel
von CN-C-2-E-a-Ms und -Mi: Hexan/Ethylacetat/Essigsäure = 20:1:0,5,
V/V). Die Fraktionierung und Reinigung des Chloroformextrakts CN-C
des Geweihs von Cervus nippon sind kurz in 2 dargestellt.
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Die
aus einer Reihe an wie vorstehend dargelegten Reinigungsverfahren
erhaltenen Extrakte CN-C-2, CN-C-2-E und CN-C-2-E-a und die methanolunlösliche Fraktion
CN-C-2-E-a-Mi weisen, wie durch die anschließenden Versuche nachgewiesen,
wachstumsstimulierende Aktivitäten
auf hämopoetische
Stammzellen und Megakaryozyten auf. Deshalb kann das Extrakt CN-C
als biologischer Wirkbestandteil in der Zusammensetzung der vorliegenden
Erfindung verwendet werden.
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Die
erfindungsgemäßen wachstumsstimulierenden
Faktoren von hämopoetischen
Stammzellen können
wirksam in der klinischen Medizin z.B. für Erkrankungen, die eine Verbesserung
der verminderten Immunität
und Blutzellfunktion durch Erleichtern des Wachstums von hämopoetischen
Zellen, insbesondere Erkrankungen in Verbindung mit durch Chemotherapie
und Strahlungstherapie supprimiertem Knochenmark, z.B. bösartigen
Tumoren, bösartigen
hämologischen
Erkrankungen, aplastischer Anämie,
periodischer (zyklischer) Leukoperriaimmundefiziterkrankung, Immunzellen
und hämopoetischen
Zellen, Anämie
durch das End stadium einer Nierenerkrankung, Infektionen aufgrund
von Leukopänie
und schlechtem Knochenmarkvorrat bei der älteren Bevölkerung erfordern.
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Die
vorliegende Erfindung ist eine Möglichkeit
zur Herstellung von Arzneimitteln, die die hämopoetischen Stammzellen und
Megakaryozyten stimulieren. Die vorliegende Erfindung stellt ein
Arzneimittel bereit, das eine das Wachstum der hämopoetischen Stammzellen und
Megakaryozyten stimulierende Substanz, die aus den Chloroformextrakten
der Geweihe von Cervus nippon isoliert wurde, oder eine Verbindung
der Formel (I) als Wirkbestandteil enthält. Wird die Zusammensetzung
der vorliegenden Erfindung für
einen klinischen Zweck verabreicht, kann sie zu einem auf dem pharmazeutischen
Gebiet herkömmlichen
Präparat,
z.B. einem Präparat
zur oralen Verabreichung oder einem injizierbaren Präparat formuliert
werden. Das sterile injizierbare Präparat, z.B. eine Wasser- oder Ölsuspension,
kann unter Verwendung eines Dispersionsmittels, eines Netzmittels
oder eines Suspensionsmittels gemäß einem bekannten Verfahren
hergestellt werden. Das pharmazeutisch verträgliche Lösungsmittel, das verwendet
werden kann, schließt
Wasser, Ringer-Lösung
und isotropische NaCl-Lösung
ein. Das sterile Öl
kann als herkömmliches
Lösungsmittel
oder Suspensionsmedium verwendet werden. Jedes beliebige nicht stimulierende Öl, einschließlich Mono-
oder Diglycerid kann für
einen derartigen Zweck verwendet werden. Auch kann eine Fettsäure wie Ölsäure im injizierbaren
Präparat
verwendet werden.
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Das
feste Präparat
zur oralen Verabreichung kann in Form einer Kapsel, Tablette, Pille,
eines Pulvers und Granulats, vorliegen, insbesondere sind Kapseln
und Tabletten nützlich.
Es ist bevorzugt, dass die Tablette und die Pille durch ein Einkapselungsmittel
hergestellt werden. Das feste Präparat
kann durch Mischen einer Polymermehrfachzuckerfraktion mit einem
oder mehreren inaktiven Verdünnungsmittel
wie Saccharose, Lactose und Stärke
und einem Schmiermittel wie Magnesiumstearat, einem Springmittel,
einem Bindemittel und dergleichen hergestellt werden.
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Die
Dosierung des Arzneimittels der vorliegenden Erfindung für ein menschliches
Wesen kann je nach Art des Extrakts, der Fraktion oder der Verbindung,
die als Wirkstoff zu verwenden sind, Körpergewicht, Ernährung, Geschlecht
und Gesundheitszustand des Patienten; Zeit und Verabreichungsverfahren;
Ausscheidungsmenge, Mischen des Arzneimittels und einem anderen
und Zustand des Patienten geeignet bestimmt werden.
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Die
vorliegende Erfindung ist spezieller durch die folgenden Beispiele
erklärt.
Jedoch sollte es klar sein, dass die vorliegende Erfindung auf diese
Beispiele in keinster Weise beschränkt ist.
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Beispiel 1
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1,75
kg Geweih von Cervus nippon (Cervus nippon Temminick var. Mantchuricus
Swinhoe) wird fein zerbrochen und dann in ein Becherglas eingebracht.
Hexan (etwa 7 l) wird in einer zum Eintauchen des Geweihs von Cervus
nippon ausreichenden Menge zugesetzt, dies für eine Dauer von 2 Stunden
bei 80 °C
erwärmt
und dann zweimal extrahiert und filtriert (dieses Filtrat wird als
Extrakt 1 bezeichnet). Das Extrakt 1 wurde unter reduziertem Druck
destilliert und getrocknet, um Extrakt CN-H (24,6 g) zu erhalten.
Das Extrakt 1 wurde isoliert, und Chloroform (etwa 7 l) wurde dem
Rückstand
zugesetzt, dies bei 70 °C
für eine
Dauer von 2 Stunden erwärmt
und zweimal extrahiert und isoliert (diese Lösung wird als Extrakt 2 bezeichnet).
Das Extrakt 2 wurde unter reduziertem Druck destilliert, um ein
Chloroformextrakt des Geweihs von Cervus nippon, Extrakt CN-C (14
g), zu erhalten. Das Extrakt 2 wurde weiter isoliert, und Ethanol
(etwa 6 l) wurde dem Rückstand zugesetzt,
dies für
eine Dauer von 1 Tag bei 90 °C
erwärmt
und dreimal extrahiert und filtriert. Das Extrakt 3 wurde unter
reduziertem Druck destilliert, um Extrakt CN-E (91 g) zu erhalten.
Die Hämopoese
der so hergestellten Extrakte CN-H, CN-C und CN-E wurde bewertet.
Als Ergebnis wurde das Extrakt CN-C, von welchem angenommen wurde,
dass es auf hämopoetische
Stammzel len wachstumsstimulierende Wirkungen aufweist, für den anschließenden Reinigungsschritt
verwendet.
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Beispiel 2
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650
ml eines Lösungsgemischs
aus Chloroform/Methanol (500:1, V/V) wurden zu 350 g eines pulverförmigen Silicagels
zugesetzt, man ließ dies
quellen, und es wurde in eine offene Säule (Bettvolumen = 600 ~ 650
ml) gefüllt.
14 g des in Beispiel 1 erhaltenen Extrakts CN-C wurden in einer
Mindestmenge (die Mindestmenge zum Lösen der Extrakte) Chloroform/Methanol
(500:1, V/V) gelöst
und einer Silicagelsäulenchromatografie
unterzogen. Das Chloroform/Methanol (500:1, V/V) als Eluent wurde
der Säule
zugesetzt. 50 ml der Eluentfraktion (Hohlraumvolumen: 200 ml) wurden
aufgefangen. Dies wurde mit HPTLC (Entwicklungslösungsmittel: Chloroform/Methanol
= 300:1, V/V) entwickelt, mit Iod sichtbar gemacht und gemäß dem Rf-Wert isoliert. Die Rf-Werte
betrugen 0,89, 0,63, 0,42, 0,32, 0,18, 0,08 bzw. 0,02. Die so hergestellten
sieben Hauptfraktionen wurden isoliert. Jede der isolierten Fraktionen
wurde unter reduziertem Druck destilliert und getrocknet, um die Extrakte
CN-C-1 bis CN-C-7 zu erhalten. Die Hämopoese dieser so hergestellten
Extrakte wurde wie in den anschließenden Versuchen 1 bis 5 offenbart
bewertet. Als Ergebnis wurde das Extrakt CN-C-2, von welchem angenommen
wurde, dass auf hämopoetische
Stammzellen wachstumsstimulierende Wirkungen aufweist, für den anschließenden Reinigungsschritt
verwendet.
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Beispiel 3
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Die
Fraktion CN-C-2 (380 mg) mit ausgezeichneter Hämopoese unter den in Beispiel
2 gereinigten Fraktionen wurde verwendet. 50 ml eines Lösungsgemischs
aus Hexan/Ethylacetat (50:1, V/V) wurden zu 20 g eines pulverförmigen Silicagels
zugesetzt, man ließ es
quellen, und es wurde in eine offene Säule (Bettvolumen = 100 ml)
gefüllt.
380 g des Extrakts CN-C wurden in einer Mindestmenge Chloroform/Methanol
(50:1, V/V) gelöst
und einer Silicagelsäulenchromatografie
unterzogen. Das Chloroform/Methanol (500:1, V/V) als Eluent wurde
in derselben Weise wie in Beispiel 2 zugesetzt, und dann wurden
15 ml der Eluentfraktion aufgefangen. Diese Fraktion wurde mit HPTLC
(Entwicklungslösungsmittel:
Chloroform/Methanol = 50:1, V/V) entwickelt, mit Iod sichtbar gemacht
und in sechs Teilen gemäß dem Rf-Wert isoliert. Die verwendeten Rf-Werte betrugen 0,76, 0,62, 0,43, 0,38,
0,32 bzw. 0,11. Die so hergestellten Fraktionen wurden isoliert.
Jede der isolierten Fraktionen wurde unter reduziertem Druck destilliert
und getrocknet, um die Extrakte CN-C-2-A bis CN-C-2-F zu erhalten.
Die Hämopoese
dieser sechs Extrakte wurde wie in den Versuchen 1 bis 5 offenbart bewertet.
Als Ergebnis wurde das Extrakt CN-C-2-E, von welchem angenommen
wurde, dass es auf hämopoetische
Stammzellen wachstumsstimulierende Wirkungen aufweist, für den anschließenden Reinigungsschritt verwendet.
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Beispiel 4
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Die
Fraktion CN-C-2-E (70 mg) mit ausgezeichneter Hämopoese unter den in Beispiel
3 gereinigten Fraktionen wurde verwendet. 10 ml eines Lösungsgemischs
aus Hexan/Ethylacetat/Essigsäure
(20:1:0,5, V/V) wurden zu 3,5 g eines pulverförmigen Silicagels zugesetzt,
man ließ dies
quellen, und es wurde in eine Säule gefüllt (Bettvolumen
= 24 ml). 70 g des Extrakts CN-C-2-E wurden in einer Mindestmenge
Hexan/Ethylacetat/Essigsäure
(20:1:0,5, V/V) gelöst
und dann einer Silicagelsäulenchromatografie
unterzogen. Der Eluent wurde in derselben Weise wie in Beispiel
3 zugesetzt, und dann wurden 10 ml Eluentfraktion aufgefangen. Diese
Fraktion wurde mit HPTLC (Entwicklungslösungsmittel: Hexan/Ethylacetat/Essigsäure = 20:1:0,5,
V/V) entwickelt, mit Iod sichtbar gemacht und dann gemäß dem Rf-Wert in zwei Teile aufgeteilt. Die verwendeten Rf-Werte lauteten 0,34 bzw. 0,16. Diese beiden
Extrakte wurden als CN-C-2-E-a und CN-C-2-E-b ausgedrückt. Die Hämopoese der so hergestellten
Extrakte wurde wie in den Versuchen 1 bis 5 offenbart bewertet.
Als Ergebnis wurde das Extrakt CN-C-2-E-a, von welchem angenommen wurde,
dass es auf die hämopoetische Stamm zellen
wachstumsstimulierende Wirkungen aufweist, im anschließenden Reinigungsschritt
verwendet.
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Beispiel 5
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Der
erste Teil, Extrakt CN-C-2-E-a (62 mg) unter den in Beispiel 4 aufgeteilten
Teilen wurde verwendet. Diesem Extrakt CN-C-2-E-a wurden 5 ml Methanol
zugesetzt, was dann in einen methanollöslichen Teil (Extrakt CN-C-2-E-a-Ms;
Rf = 0,22) und einen methanolunlöslichen
Teil (Extrakt CN-C-2-E-a-Mi; Rf = 0,24)
isoliert wurde, um 20 mg Extrakt CN-C-2-E-a-Ms und 40 mg Extrakt
CN-C-2-E-a-Mi zu
erhalten. Die HPTLC-Ergebnisse der jeweiligen in den Beispielen
1 bis 5 erhaltenen Wirkbestandteile sind in 3 dargestellt.
Es ist aus 3 ersichtlich, dass die Bande
in Extrakt CN-C im Reinigungsverlauf dieselbe blieb. Deshalb ist
ersichtlich, dass die Wirkteile im Reinigungsverlauf nicht entartet
wurden oder verschwanden. Zuerst wurde die Bande, die auf Grund
des anderen Teils versteckt war, tief entwickelt, als die Reinigung
weiter verlief.
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Versuch 1
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Koloniebildende Einheit
im Kultur(CFUc)-Test
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Das
Vermögen
von Knochenmarkstammzellen des Bildens von Kolonien in einer in-vitro-Kultur
wurde in einem einschichtigen Methylzellulosekultursystem bewertet.
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1-1. Abtrennung von Knochenmarkzellen
der Maus
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Eine
6 bis 8 Wochen alte weibliche C57B1/6-Mäuse, die unter spezifischem
pathogenfreien (SPF) Bedingungen gezüchtet wurden, wurden verwendet.
Das Knochenmark der Maus wurde durch Waschen mit Nährmedium
RPMI 1640 (Gibco Nr. 430-1800) vom Oberschenkelknochen und Schienbein
abgetrennt. Das abge trennte Knochenmark wurde zum Erhalt von monoklonalen
Antikörpern
filtriert, dreimal mit Medium RPMI 1640 gewaschen, wonach die Anzahl
an Zellen gezählt
wurde. Die Stammzellen-reiche Fraktion wurde durch diskontinuierliche
Percol-Gradient-Zentrifugation präpariert. Die Zelle mit der
Grenzfläche
zwischen der Lösungsdichte
von 1,063 und 1.075 wurde gesammelt.
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1-2. Präparation
der Probe
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Alle
Extraktproben des Geweihs von Cervus nippon wurden in Dimethylsulfoxid
(DMSO) auf eine Konzentration von 100 mg/ml gelöst. Diese Lösung wurde als Stammlösung und
zur Bewertung der Hämopoese verwendet.
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1-3. Analyse von CFU-C
(koloniebildende Einheit in Kultur)
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Die
im Verfahren von Punkt 1-1 aufgefangenen Zellen wurden mit 1,2 × 104 Zellen/Mulde auf eine 1,1%ige Methylzelluloseplatte
aufgestrichen, was in einem CO2-Inkubator
bei 37°C
gezüchtet
wurde. Nach einwöchiger
Züchtung
wurde die Kolonieanzahl gezählt.
Die Extrakte CN-C, CN-C-2, CN-C-2-E, CN-C-2-E-a und CN-C-2-E-a-Mi
des Geweihs von Cervus nippon wurden getrennt, den Stammzellen zugesetzt
und mit einer nur mit 1%igem PBS behandelten Kontrolle verglichen.
Das Ergebnis der koloniebildenden Wirksamkeit ist in Tabelle 2 dargestellt.
Die koloniebildende Wirksamkeit (CFE) wurde gemäß der folgenden Gleichung erhalten. CFE = (Gesamtanzahl an Kolonien in der Probe)/(Gesamtanzahl
an Kolonien in der Kontrollgruppe)
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Wie
aus dem Ergebnis aus Tabelle 2 ersichtlich, zeigt das Chloroformextrakt
des Geweihs von Cervus nippon oder eine jeweilige daraus gereinigte
Fraktion gemäß der vorliegenden
Erfindung eine ausgezeichnete koloniebildende Wirksamkeit, und es
kann folglich daraus geschlossen werden, dass sie stimulierende
Wirkungen auf hämopoetische
Stammzellen aufweisen.
