DE69738352T2

DE69738352T2 - Einkettige Anti-P53-Antikörperfragmente und Verwendungen

Info

Publication number: DE69738352T2
Application number: DE69738352T
Authority: DE
Inventors: Laurent Bracco; Laurent Debussche
Original assignee: Aventis Pharma SA
Current assignee: Aventis Pharma SA
Priority date: 1996-10-29
Filing date: 1997-10-27
Publication date: 2008-11-13
Anticipated expiration: 2017-10-28
Also published as: NO326452B1; DE69738352D1; SI0941252T1; ATE380198T1; ZA979738B; HU226330B1; KR100874789B1; AU745530B2; CZ145599A3; SK55899A3; IL129476A; JP4371178B2; AU4952097A; DK0941252T3; CA2268865C; WO1998018825A1; JP2001502553A; ES2297853T3; BR9712575A; CA2268865A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Wiederherstellung einer p53-abhängigen Transaktivierungsaktivität in Zellen, die ein mutiertes p53-Protein aufweisen, in denen seine Funktion als Transkriptionsfaktor fehlt oder verringert ist. Insbesondere basiert das erfindungsgemäße Verfahren auf der Verwendung einkettiger Antikörper, die in der Lage sind, spezifisch an das mutierte p53-Protein zu binden. Sie betrifft auch neue Moleküle, die p53-Proteine spezifisch und wirksam binden können und die es außerdem gestatten, eine p53-Aktivität in Tumorzellen wiederherzustellen, sowie die Nukleinsäuren, die für diese Moleküle codieren, und die Vektoren, die sie enthalten. Dieses Verfahren und die erfindungsgemäßen Moleküle sind in vitro oder ex vivo dazu verwendbar, den Wirkmechanismus von p53 und seinen mutierten Formen zu untersuchen oder die p53-Proteine zu reinigen. Sie bieten auch In-vivo-Verwendungen, insbesondere bei therapeutischen Ansätzen zur Wiederherstellung der p53 Aktivität in pathologischen Zusammenhängen, wie insbesondere bei Krebserkrankungen.
Das Wildtyp-p53-Protein ist an der Regulation des Zellzyklus und an der Aufrechterhaltung der Integrität des Genoms der Zelle beteiligt. Dieses Protein, dessen Hauptfunktion die eines Aktivators der Transkription bestimmter Gene ist, kann aufgrund eines bisher noch nicht gut definierten Prozesses die Zelle in der G1-Phase des Zellzyklus blockieren, wenn Mutationen im Verlauf der Replikation des Genoms auftreten, und eine gewisse Anzahl an DNA-Reparaturprozessen einleiten. Außerdem kann dieses Protein im Falle einer schlechten Funktion dieser Reparaturprozesse oder im Falle des Auftretens von Mutationsereignissen, die zu zahlreich sind, als dass sie behoben werden könnten, das als Apoptose bezeichnete Phänomen des programmierten Zelltodes verursachen. Auf diese Weise wirkt das p53-Protein als Tumorsuppressor, indem es die Zellen beseitigt, die anomal differenziert sind oder deren Genom beschädigt worden ist.
Diese hauptsächliche Funktion von p53 hängt von seiner Transkriptionsfaktorfunktion oder, anders gesagt, von seiner doppelten Fähigkeit ab, spezifische Sequenzen auf Ebene der genomischen DNA zu erkennen und die allgemeine Transkriptionsmaschinerie zu rekrutieren.
Das p53-Protein umfasst 393 Aminosäuren, die 5 funktionelle Domänen definieren:

– die Transkriptionsaktivatordomäne, die aus den Aminosäuren 1 bis 73 besteht und bestimmte Faktoren der allgemeinen Transkriptionsmaschinerie binden kann, wie das Protein TBP. Diese Domäne ist auch die Stelle einer gewissen Anzahl an posttranslationalen Modifikationen. Sie ist auch die Stelle für zahlreiche Wechselwirkungen des p53-Proteins mit vielen anderen Proteinen und insbesondere mit dem zellulären Protein mdm2 oder dem EBNA5-Protein des Epstein-Barr-Virus (EBV), die in der Lage sind, die Funktion des Wildtyp-Proteins zu blockieren. Außerdem besitzt diese Domäne so genannte PEST-Aminosäuresequenzen für die Empfänglichkeit für proteolytischen Abbau.
– die DNA-Bindungsdomäne, die sich zwischen den Aminosäuren 73 und 315 befindet. Die Konformation dieser zentralen Domäne von p53 reguliert die Erkennung von DNA-Sequenzen, die für das p53-Protein spezifisch sind. Diese Domäne ist die Stelle von zwei Typen von Veränderungen, welche die Funktion des Wildtyp-Proteins beeinflussen: (i) die Wechselwirkung mit Proteinen, welche die Funktion von p53 blockieren, wie das "große T"-Antigen des SV40-Virus oder die viralen E6-Proteine der Viren HPV16 und HPV18, die seinen Abbau durch das Ubiquitin-System hervorrufen können. Diese letztere Wechselwirkung kann nur in Anwesenheit des zellulären Proteins E6ap (Enzym E3 der Ubiquitinierungskaskade) erfolgen. (ii) Punkt-Mutationen, welche die Funktion von p53 beeinflussen und fast vollständig in dieser Region lokalisiert sind.
– das Kernlokalisationssignal, das aus den Aminosäuren 315 bis 325 besteht und für die richtige Sortierung des Proteins in das Kompartiment, in dem es seine Hauptfunktion ausübt, unerlässlich ist.
– die Oligomerisierungsdomäne, die aus den Aminosäuren 325 bis 355 besteht. Diese Region 325 bis 355 bildet eine Struktur des Typs: β-Faltblatt-(326–334)-Turn-(335–336)-α-Helix-(337–355). Die in dieser Region lokalisierten Funktionensveränderungen sind im Wesentlichen auf eine Wechselwirkung des Wildtyp-Proteins mit den verschiedenen mutierten Formen zurückzuführen, die zu variablen Wirkungen auf die Funktion des Wildtyp-Proteins führen können.
– die Regulationsdomäne, die aus den Aminosäuren 365 bis 393 besteht und die Stelle für eine bestimmte Anzahl an posttranslationalen Modifikationen (Glycosylierungen, Phosphorylierungen, RNA-Anlagerung usw.) ist, welche die Funktion des p53-Proteins in positiver oder negativer Weise modulieren. Diese Domäne spielt eine äußerst wichtige Rolle bei der Modulation der Aktivität des Wildtyp-Proteins.

Die Funktionsweise des p53-Proteins kann auf mehrerlei Weise gestört werden.

– Blockierung seiner Funktion durch eine bestimmten Anzahl an Faktoren, wie zum Beispiel das "große T"-Antigen des SV40-Virus, das EBNA5-Protein des Epstein-Barr-Virus oder das zelluläre Protein mdm2.
– Destabilisierung des Proteins durch Erhöhung seiner Empfindlichkeit gegenüber Proteolyse, insbesondere durch Wechselwirkung mit dem Protein E6 der menschlichen Papillomviren HPV16 und HPV18, welche den Eintritt des p53-Protein in den Ubiquitinierungszyklus begünstigen. In diesem Fall kann die Wechselwirkung zwischen diesen zwei Proteinen nur durch vorherige Anlagerung eines zellulären Proteins, des E6ap-Proteins, dessen Bindungsstelle wenig bekannt ist, erfolgen.
– Punkt-Mutationen auf Ebene des p53-Gens.
– Deletion von einem oder beiden p53-Allelen.

Die letzten beiden Typen der Modifikation findet man bei etwa 50% der unterschiedlichen Krebsarten. In dieser Hinsicht betreffen die Mutationen des p53-Gens, die in Krebszellen angetroffen wurden, einen sehr großen Teil des Gens, das für dieses Protein codiert, und ergeben variable Modifikationen der Funktionsweise dieses Proteins. Es soll jedoch darauf hingewiesen werden, dass diese Mutationen in ihrer großen Mehrzahl im zentralen Abschnitt des p53-Proteins lokalisiert sind, von dem bekannt ist, dass es sich um die Kontaktregion mit den genomischen Sequenzen handelt, die für das p53-Protein spezifisch sind. Dies erklärt, warum ein hauptsächliches Merkmal von einem Großteil der Mutanten des p53-Proteins ist, dass sie nicht mehr an die DNA-Sequenzen binden können, die das Wildtyp-Protein erkennt, und infolgedessen nicht mehr ihre Rolle als Transkriptionsfaktor ausüben können. Außerdem scheinen bestimmte Mutanten neue Funktionen erworben zu haben, wie die Aktivierung bestimmter Gene auf transkriptioneller Ebene.
Derzeit wird die Gesamtheit dieser Modifikationen in drei Kategorien eingeteilt:

– die so genannten schwachen Mutanten, deren Produkt ein nicht-funktionelles Protein ist, das im Fall einer Mutation in nur einem der zwei Allele keine Wirkung auf die Funktionsweise des Wildtyp-Proteins hat, das von dem anderen Allel codiert wird. Die hauptsächlichen Vertreter für diese Kategorie sind die Mutanten H273 und W248, wobei letztere für das Li-Fraumeni-Syndrom der familiären Hypersensitivität für Krebsleiden spezifisch ist.
– die dominant-negativen Mutanten, deren Produkt ein nicht-funktionelles Protein ist, das im Fall einer Mutation von nur einem der zwei Allele und durch Wechselwirkung mit dem Wildtyp-Protein die Funktionsweise dieses Proteins durch Bildung inaktiver gemischter Oligomere blockieren kann, die nicht mehr an die DNA-Sequenzen binden können, die für das Wildtyp Protein spezifisch sind. Der hauptsächliche Vertreter dieser Kategorie ist die Mutante G281.
– die dominant-onkogenen Mutanten, deren Produkt ein Protein ist, das einerseits wie die Mutanten der vorhergehenden Kategorie die Funktion des Wildtyp-Proteins blockieren kann und andererseits durch schlecht verstandene Mechanismen die Tumorentwicklung fördern kann, was somit einen Funktionsgewinn darstellt. Der hauptsächliche Vertreter dieser Kategorie ist die Mutante H175.

Angesichts seiner Antitumor- und apoptotischen Eigenschaften und seiner Implikation bei vielen Pathologien des hyperproliferativen Typs hat man das Wildtyp-p53-Gen bei gen- und zelltherapeutischen Ansätzen verwendet. Es ist insbesondere vorgeschlagen worden, bestimmte hyperproliferative Pathologien und insbesondere Krebserkrankungen mittels In-vivo-Verabreichung des Wildtyp-p53-Gens durch Widerherstellung der Funktionen von p53 zu behandeln. Die Verabreichung kann vorzugsweise durch virale, insbesondere adenovirale ( WO94/24297 ) oder retrovirale ( WO94/06910 ), Vektoren durchgeführt werden. So wurde demonstriert, dass durch das Einbringen einer Nukleinsäure, die für das Wildtyp-p53-Protein codiert, eine normale Regulation des Zellwachstums teilweise wiederhergestellt werden kann (Roth et al., Nature Medicine 2 (1996) 985). Alternative Strategien, die auf dem Einsatz chimerer Moleküle basieren, die Eigenschaften des p53-Typs besitzen, sind ebenfalls entwickelt worden ( PCT/FR96/01111 ).
Ein anderer Ansatz zur Wiederherstellung der Funktionen des Wildtyp-p53-Proteins basiert auf einer Reversion der endogenen mutierten Proteine in Richtung zu einem Wildtyp-Phänotyp, d. h. welcher die Tumorsuppressor- und die apoptotischen Eigenschaften des Wildtyp-p53 aufweist. Dieser Ansatz ergibt sich aus dem Nachweis, dass die Funktionsverluste von p53-Mutanten auf eine Konformationsänderung des Proteins zurückzuführen sind, die durch die Mutation(en) verursacht wird. In dieser Hinsicht zeigt die Anmeldung WO94/12202 , dass ein bestimmter monoklonaler Antikörper, der als pAb421 bezeichnet wird und gegen das Protein p53 gerichtet ist, bei einer bestimmten Klasse von Mutanten, die häufig bei menschlichen Krebserkrankungen angetroffen wird, die Funktion der In-vitro-Bindung an DNA wiederherstellen kann. Die Verwendung dieses Typs der Verbindung weist jedoch bedeutende Nachteile auf, die insbesondere mit der benötigten erhöhten Menge an Antikörper (und somit mit den damit einhergehenden Problemen der Produktion/Reinigung) und mit ihrem schwachen Eindringvermögen in die Zellen zusammenhängen.
Die vorliegende Anmeldung beschreibt einen leistungsfähigeren Ansatz zur Wiederherstellung der Wildtypeigenschaften einer Mutante des p53-Proteins. Die vorliegende Anmeldung beschreibt insbesondere die Konstruktion von Liganden, die für das p53-Protein besonders spezifisch sind und die vorteilhafte Eigenschaften für die Wiederherstellung der Wildtyp-p53-Funktionen haben. Genauer gesagt, beschreibt die vorliegende Anmeldung die Konstruktion einkettiger Antikörper (ScFv), die für das Protein p53 spezifisch sind, und insbesondere das Molekül 11D3. Die vorliegende Anmeldung zeigt außerdem, dass die ScFv p53 erkennen können, innerhalb einer Tumorzelle effizient exprimiert werden können und einen Teil der Transaktivierungsfunktion einer bestimmten Klasse von p53-Mutanten reaktivieren können.
Verglichen mit den Verfahren des Standes der Technik liefert dieses Molekül bedeutende Vorteile und insbesondere die Möglichkeit, dass es in situ in einer Tumorzelle in großen Mengen exprimiert werden kann. Die nachstehend dargestellten Ergebnisse sind umso unerwarteter, als zwischen einem herkömmlichen Antikörper und einem ScFv häufig Verluste in der Affinität beobachtet wurden. Außerdem hat die Anmelderin gezeigt, dass es möglich ist, ScFv in den richtigen intrazellulären Kompartimenten zu exprimieren, wodurch eine optimale biologische Aktivität erhalten werden kann.
Das Dokument WO96/30512 betrifft ein konditionelles Expressionssystem, das bispezifische chimere Moleküle nutzt, die (A) eine erste Domäne enthalten, die in der Lage ist, selektiv eine definierte DNA-Sequenz zu binden, und (B) eine zweite Detektor-Domäne, die spezifisch einen Transaktivator oder einen Transaktivator-Komplex binden kann, wobei diese zweite Domäne ein gegen p53 gerichtetes ScFv sein kann. Die Wiederherstellung der Transaktivatorfunktionen des p53-Proteins mit einer Konstruktion, die nur ein ScFv oder eine Sequenz, die für ein ScFv codiert, und kein Element A enthält, ist in diesem Dokument nicht beschrieben.
Das Dokument Cancer Research, Bd. 55, 15. Aug. 1995, S. 3490–3494, lehrt, dass der monoklonale Antikörper mAb PA421 die Transkriptionsaktivierungsfunktion bestimmter mutierter Formen von p53 wiederherstellen kann, jedoch liefert dieses Dokument keinerlei Information über die Eigenschaften möglicher ScFv-Derivate dieses monoklonalen Antikörpers.
Eine erste Aufgabe der Erfindung liegt folglich in einem Verfahren zur Wiederherstellung einer p53-abhängigen Transaktivierungsaktivität in Zellen, die ein mutiertes p53-Protein aufweisen, umfassend das Einbringen eines einkettigen Antikörpers, der das mutierte p53-Protein spezifisch binden kann, in die besagte Zelle. Vorteilhafterweise umfasst das erfindungsgemäße Verfahren das Einbringen einer Nukleinsäure, die eine Sequenz umfasst, die für den einkettigen Antikörper codiert, unter der Kontrolle eines in der Zelle funktionellen Promotors in die Zelle. Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung eines einkettigen Antikörpers, der ein mutiertes p53-Protein spezifisch binden kann, zur Modifikation der Konformation des besagten Proteins. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung eines einkettigen Antikörpers, der spezifisch ein mutiertes p53-Protein binden kann, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die zur Behandlung hyperproliferativer Störungen bestimmt ist, an denen ein mutiertes p53-Protein beteiligt ist, sowie die Verwendung einer Nukleinsäure, die für einen einkettigen Antikörper codiert, der spezifisch an ein mutiertes p53-Protein binden kann, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die für die Behandlung hyperproliferativer Störungen bestimmt ist, an denen ein mutiertes p53-Protein beteiligt ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren basiert folglich teilweise auf der Konstruktion, der Vektorisierung und dem Einbringen von einkettigen Antikörpern, die ein mutiertes p53-Protein spezifisch binden können, in Zellen. Die einkettigen Antikörper (ScFv) bestehen im Wesentlichen aus einer VH-Region, die über einen Arm mit einer VL-Region verbunden ist. Der Konstruktion von ScFv und die Nukleinsäuresequenzen, die für solche modifizierten Antikörper codieren, sind zum Beispiel im Patent US4,946,778 oder in den Anmeldungen WO 94/02610 und WO 94/29446 beschrieben.
Die vorliegende Anmeldung beschreibt insbesondere die Herstellung einer Bank von Hybridomen, die gegen p53 gerichtete Antikörper produziert, und die Konstruktion der entsprechendem ScFv ausgehend von dieser Bank. Sie beschreibt auch die Klonierung der entsprechenden Nukleinsäuren in Expressionsvektoren und ihren Transfer in Zellen. Sie zeigt auch, dass dieser Transfer eine wirksame Widerherstellung der DNA-Bindungsaktivität von p53-Mutanten sowie ihrer Transaktivatoraktivität in vivo ermöglicht.
Genauer gesagt, setzt das erfindungsgemäße Verfahren ScFv ein, die in der Lage sind, spezifisch an ein Epitop in der C-terminalen Region von p53 zu binden, das die Oligomerisierungsdomäne und die Regulationsdomäne trägt. In dieser Hinsicht beschreibt die vorliegende Anmeldung auch einen Test, mit dem ScFv mit dieser Eigenschaft mithilfe der ELISA-Technik selektiert werden können.
Noch stärker bevorzugt, sind die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt ScFv in der Lage, spezifisch an ein Epitop in der C-terminalen Region von p53 zwischen den Resten 320–393 zu binden. In dieser Hinsicht beschreibt die Anmeldung als bestimmtes Beispiel die Konstruktion und Expression des ScFv ScFv421 der Sequenz SEQ ID NR: 1 und von 11D3 der Sequenz SEQ ID NR: 2.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist allgemein auf mutierte p53-Proteine anwendbar, welche die Fähigkeit, an DNA zu binden, ganz oder teilweise verloren haben, und das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht es, diese Fähigkeit wiederherzustellen. Genauer gesagt, ist das erfindungsgemäße Verfahren auf die mutierten p53-Proteine anwendbar, welche die Transkriptionsfaktorfunktion von p53 ganz oder teilweise verloren haben, und es ermöglicht die Wiederherstellung dieser Funktion. Der Grad der Wiederherstellung kann vollständig oder teilweise sein. Vorteilhafterweise ist er ausreichend, dass die Mutante eine Tumorsuppressorfunktion durch Blockierung des Zellzyklus und/oder durch Induktion der Apoptose ausüben kann. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht es folglich, eine Tumorsuppressoraktivität in den Zellen, die endogene mutierte p53-Proteine aufweisen und denen diese Aktivität fehlt, zumindest teilweise wiederherzustellen. Vorteilhafterweise handelt es sich um mutierte Proteine, die in Tumorzellen vorliegen. Wie vorstehend angegeben, wurden verschiedene mutierte Formen des p53-Proteins in Tumorzellen nachgewiesen. Man kann beispielsweise die Proteine p53H273, p53W248 und p53G281 nennen. Die nachstehend gegebenen Beispiele zeigen insbesondere, dass durch das erfindungsgemäße Verfahren die Konformation und die biologischen Eigenschaften dieser Mutanten in vitro und in vivo modifiziert werden können. Insbesondere zeigen diese Beispiele, dass die ScFv 421 und 11D3 in der Lage sind, bei den Mutanten 273 und 248 die Fähigkeit zur spezifischen Bindung an DNA wiederherzustellen und die p53-abhängige Transaktivierung zu induzieren.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann in vitro, ex vivo oder in vivo durchgeführt werden. In vitro oder ex vivo lässt sich mit dem erfindungsgemäßen Verfahren und den erfindungsgemäßen Molekülen zum Beispiel der Wirkmechanismus von p53 und seinen mutierten Formen untersuchen. Außerdem können die erfindungsgemäßen Moleküle zum Nachweis oder zur Reinigung von p53-Proteinen verwendet werden, zum Beispiel durch Koppeln an einen Träger, In-Kontakt-Bringen mit einer Lösung, die p53-Proteine enthält, gegebenenfalls gefolgt von Sichtbarmachen der gebildeten Komplexe oder von Elution. In vivo können sie es, insbesondere bei Menschen, ermögichen, in pathologischen Kontexten, wie hyperproliferativen Störungen, bei denen ein Mangel an p53-Aktivität beobachtet wird, diese Funktion wiederherzustellen. In dieser Hinsicht kann es in Verbindung mit anderen vorstehend erwähnten Ansätzen (Einbringen eines Wildtyp-p53-Gens) oder auch in Verbindung mit einer Chemotherapie ( WO96/22101 ) eingesetzt werden. Ebenfalls in vivo können das erfindungsgemäße Verfahren und die erfindungsgemäßen Moleküle beim Tier eingesetzt werden, zum Beispiel um die Expressionsspiegel der ScFv zu bestimmen und die Möglichkeit eines humantherapeutischen Ansatzes zu untersuchen.
Vorteilhafterweise ist die Zelle, die ein mutiertes p53-Protein aufweist, eine Säuger-Tumorzelle. In dieser Hinsicht kann man ganz besonders die Zellen von (insbesondere nicht-kleinzelligem) Lungen-, Colon-, Leber-, Gehirn-, Kopf- und Halskrebserkrankungen und, allgemeiner gesagt, jeden Krebs nennen, bei dem eine mutierte Form des p53-Proteins beobachtet wird. Vorteilhafterweise handelt es sich um eine menschliche Tumorzelle, in der eine p53H273-, p53W248- und/oder p53G281-Mutante beobachtet wird (Lunge, Colon, Gehirn, Kopf und Hals, Leber). Die Anwendbarkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens auf eine bestimmte Zelle kann mit der folgenden Methodik leicht festgestellt werden: Die Zelle wird zuallererst hinsichtlich der Anwesenheit eines mutierten p53-Proteins charakterisiert. Dieses Protein wird anschließend charakterisiert, um die Art der Mutation zu bestimmen. Wenn es sich um eine bekannte und insbesondere um eine vorstehend verzeichnete Mutation handelt, kann die Zelle als empfänglich für eine Behandlung durch das erfindungsgemäße Verfahren betrachtet werden. Wenn es sich um eine nicht aufgeführte Mutation handelt, sind verschiedene Ansätze möglich. Zuerst kann das mutierte Protein isoliert (oder künstlich synthetisiert) und in vitro und in vivo auf sein Verhalten in Anwesenheit von ScFv getestet werden, wie in den Beispielen beschrieben. Dies gestattet eine Identifikation des ScFv, der für die Wiederherstellung der mangelhaften Funktionen dieses Proteins geeignet ist. Ein anderer Ansatz besteht in dem direkten Testen der ScFv an einer Kultur von Zellen zur Bestimmung der biologischen Wirksamkeit der ScFv.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der ScFv vorteilhafterweise in vitro, ex vivo oder in vivo in die Zelle in Form eines Vektors eingeführt, der eine Nukleinsäure, die für diesen ScFv codiert, unter der Kontrolle eines Promotors trägt, der in dieser Zelle funktionell ist.
Der Promotor wird vorteilhafterweise aus den Promotoren ausgewählt, die in Säugerzellen, vorzugsweise menschlichen Zellen, funktionell sind. Vorzugsweise handelt es sich um einen Promotor, der die Expression einer Nukleinsäure in einer hyperproliferativen Zelle (Krebs, Restenose usw.) ermöglicht. In dieser Hinsicht können verschiedene Promotoren verwendet werden. Es kann sich zum Beispiel um den eigenen Promotor des p53-Gens handeln. Es kann sich auch um Regionen unterschiedlichen Ursprungs handeln (die für die Expression anderer Proteine verantwortlich oder sogar synthetisch sind). Es kann sich somit um jeden Promotor oder jede abgeleitete Sequenz handeln, welche die Transkription eines Gens auf spezifische oder unspezifische, induzierbare oder nicht-induzierbare, starke oder schwache Weise stimuliert oder unterdrückt. Man kann insbesondere die Promotorsequenzen eukaryotischer oder viraler Gene nennen. Es kann sich zum Beispiel um Promotorsequenzen handeln, die aus dem Genom der Zielzelle stammen. Unter den eukaryotischen Promotoren kann man insbesondere die ubiquitären Promotoren (Promotor der HPRT-, PGK-, α-Aktin-, Tubulin-Gene usw.), Promotoren der Intermediärfilamente (Promotor der GFAP-, Desmin-, Vimentin-, Neurofilament-, Keratin-Gene usw.), Promotoren therapeutischer Gene (zum Beispiel der Promotor der MDR-, CFTR-, Faktor VIII-, ApoAI-Gene usw.), gewebespezifische Promotoren (Promotor des Gens für Pyruvatkinase, Villin, für das intestinale fettsäurebindene Protein, für α-Aktin aus glatter Muskulatur usw.) oder auch Promotoren, die auf einen Stimulus reagieren (Steroidhormonrezeptor, Retinsäurerezeptor usw.) nennen. Ebenso kann es sich um Promotorsequenzen handeln, die aus dem Genom eines Virus stammen, wie zum Beispiel die Promotoren der Adenovirus-Gene E1A und MLP, des frühen CMV-Promotors oder auch des LTR-Promotors von RSV usw. Außerdem können diese Promotorregionen durch Hinzufügung von Aktivierungs-, Regulationssequenzen oder von Sequenzen, die eine gewebespezifische oder mehrheitliche Expression ermöglichen, modifiziert werden.
Wie vorstehend angegeben, beschreibt die vorliegende Anmeldung auch neue Moleküle, die besonders vorteilhafte Eigenschaften der Bindung an und der Reversion mutierter p53-Proteine besitzen. Die Erfindung beschreibt, genauer gesagt, die Konstruktion, Vektorisierung und den Transfer spezifischer ScFv (11D3 und 421) in Zellen. Die Nukleinsäuresequenz und die Peptidsequenz dieser ScFv sind in SEQ ID NR: 1 und 2 angegeben. Die folgenden Beispiele zeigen die besonders vorteilhafte Fähigkeit dieser Moleküle, (i) spezifisch an mutierte p53-Proteine in der C-terminalen Region zu binden, (ii) diesen mutierten Proteinen die Fähigkeit zur Bindung an DNA zu verleihen und (iii) diesen Proteinen die Fähigkeit zur Aktivierung der Transkription zu verleihen. Die Beispiele zeigen außerdem, dass diese Moleküle in Tumorzellen korrekt exprimiert werden, was ihre vorteilhafte Verwendung im Zusammenhang mit hyperproliferativen Störungen ermöglicht. Außerdem können die Eigenschaften der erfindungsgemäßen ScFv auch verbessert werden. Insbesondere ist bekannt, dass die Affinität von ScFv durch die CDR-Regionen (in der Sequenz unterstrichen) beeinflusst wird und durch routinemäßige Mutagenese-/-Selektionsexperimente verbessert werden kann. So wurde die Mutagenese an Antikörpern zum Beispiel von Marks et al. (Bio/Technologie, 10, 779–783, 1992) und von Winter G. und Milstein C. (Nature, 349, 293–299, 1991) beschrieben. Die in diesen Bezugsstellen beschriebenen Technologien können auf die Herstellung von Varianten der erfindungsgemäßen ScFv mit einer modifizierten Affinität angewendet werden. Die Selektion kann anschließend unter den in den Beispielen beschriebenen Bedingungen durchgeführt werden.
Gegenstand der Erfindung ist folglich außerdem das Molekül 11D3, dessen Peptidsequenz in SEQ ID NR: 2 dargestellt ist, sowie jede Variante, die eine Modifikation in den CDR-Regionen aufweist, welche die Fähigkeit zur Bindung an p53-Proteine beibehält. Die Modifikation kann aus einer Deletion, einer Substitution oder einer Insertion von einer oder mehreren Resten in den CDR-Regionen bestehen. Vorteilhafterweise erstreckt sich die Modifikation auf weniger als 10 Reste.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch jede Nukleinsäure, die für ScFv 11D3 oder eine Variante, wie oben definiert, codiert.
Die erfindungsgemäße Nukleinsäure kann eine Ribonukleinsäure (RNA) oder eine Desoxyribonukleinsäure (DNA) sein. Vorteilhafterweise handelt es sich um eine komplementäre DNA (cDNA). Sie kann menschlichen, tierischen, viralen, synthetischen oder halbsynthe tischen Ursprungs sein. Sie kann auf unterschiedliche Weisen und insbesondere durch chemische Synthese unter Verwendung der in der Anmeldung dargestellten Sequenzen und zum Beispiel eines Nukleinsäuresynthesegerätes erhalten werden. Sie kann auch durch Screening von Banken mithilfe spezifischer Sonden, insbesondere den in der Anmeldung beschriebenen, erhalten werden. Sie kann auch durch gemischte Techniken, einschließlich chemischer Modifikation (Elongation, Deletion, Substitution usw.) der mittels Screening aus den Banken erhaltenen Sequenzen erhalten werden. Allgemein gesagt, können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren gemäß jeder Technik hergestellt werden, die dem Fachmann bekannt ist (siehe insbesondere die in den Patenten US4,946,778 und WO94/02610 beschriebenen Technologien). Eine herkömmliche Strategie zur Konstruktion von Nukleinsäuren, die für ein ScFv codieren, ist Folgende: Die für die VH- und VL-Regionen codierenden cDNAs werden aus dem Hybridom erhalten, das den gewählten Anti-p53-Antikörper produziert. Dazu werden die Gesamt-RNAs des Hybridoms extrahiert und einer reversen Transkriptionsreaktion unter Verwendung zufallsgemäßer Hexamere als Primer unterworfen. Durch die Verwendung dieses Primertyps kann man die Verwendung immunoglobulinspezifischer Primer vermeiden. Die erhaltenen cDNA-Klone sind von einer ausreichenden Länge zur Klonierung der V-Regionen. Wenn sie einen zu kleinen Anteil der vorhandenen Gesamt-cDNAs darstellen, kann eine vorherige Amplifikationsreaktion durchgeführt werden, um ausreichend DNA für die Klonierung zu produzieren. Dazu werden die cDNAs, die für die VH- und VL-Regionen codieren, getrennt amplifiziert. Die eingesetzten Primer sind Oligonukleotide, die an die gegenüberliegenden Enden der variablen Regionen jeder Kette (H und L) hybridisieren. Das Amplifikationsprodukt unter Verwendung von Primern, die für die schweren Ketten spezifisch sind, und das Amplifikationsprodukt unter Verwendung von Primern, die für die leichten Ketten spezifisch sind, werden anschließend gereinigt. Nach der Reinigung werden die cDNAs, die für die VH- und VL-Regionen des Antikörpers codieren, mithilfe eines Nukleotid-Arms (L) zu einer einzigen Kette verbunden. Der Nukleotid-Arm wurde derart konstruiert, dass eines der Enden an das 3'-Ende der cDNA, die für die VH-Region codiert, und das andere Ende an das 5'-Ende der cDNA, die für die VL-Region codiert, bindet. Die Sequenz des Arms codiert für das Peptid (G4S)3. Die zusammengebaute Sequenz von ungefähr 700 bp enthält in Form eines NcoI/NotI-Fragments die Abfolge VH-L-VL, deren Sequenzen zum Beispiel in den SEQ ID NR: 1 und 2 dargestellt sind.
Vorzugsweise ist die erfindungsgemäße Nukleinsäure ein cDNA oder eine RNA.
Die erfindungsgemäße Nukleinsäure wird vorteilhafterweise ausgewählt aus:

(a) der gesamten oder einem Teil der Sequenz SEQ ID NR: 2 oder ihrem komplementären Strang,
(b) jeder Sequenz, die mit den Sequenzen (a) hybridisiert und für einen ScFv codiert, der spezifisch, vorzugsweise in der C-terminalen Region, an das p53-Protein binden kann,
(c) den Varianten von (a) und (b), die sich durch die Degeneration des genetischen Codes ergeben.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch jede Expressionskassette, die eine Nukleinsäure, wie vorstehend definiert, einem Promotor, der ihre Expression ermöglicht, und ein Transkriptionsterminationssignal umfasst.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die Säure vorteilhafterweise in die Zellen mithilfe eines Verabreichungsvektors eingeführt, welcher (i) die Effizienz des Eindringens in die Zelle, (ii) die Zielsteuerung und/oder (iii) die extra- und die intrazelluläre Stabilität verbessern kann.
Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Nukleinsäure in einen Vektor eingebracht, der chemischen (Liposom, Nanopartikel, Peptidkomplex, kationische Lipide oder Polymere usw.), viralen (Retrovirus, Adenovirus, Herpesvirus, AAV, Vacciniavirus usw.) Ursprungs sein oder von einem Plasmid abstammen kann.
Die Verwendung viraler Vektoren basiert auf den natürlichen Transfektionseigenschaften der Viren. Es ist somit möglich, zum Beispiel Adenoviren, Herpesviren, Retroviren und adenoassoziierte Viren zu verwenden. Diese Vektoren haben sich als besonders leistungsfähig auf der Ebene der Transfektion erwiesen. Insbesondere macht sie die Fähigkeit der Adenoviren und der Retroviren zur Infektion von Tumorzellen zu den Vektoren der Wahl im Umfang der Erfindung. In dieser Hinsicht wird bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung die Nukleinsäure in Form eines retroviralen Vektors eingeführt, d. h. in Form eines defektiven rekombinanten Retrovirus, dessen Genom eine Nukleinsäure umfasst, die für ein ScFv codiert, wie vorstehend definiert. Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Nukleinsäure in Form eines adenoviralen Vektors eingeführt, d. h. in Form eines defektiven rekombinanten Adenovirus, dessen Genom eine Nukleinsäure umfasst, die für ein ScFv codiert, wie vorstehend definiert.
Der erfindungsgemäße Vektor kann auch ein nicht-virales Mittel sein, das den Transfer und die Expression von Nukleinsäuren in eukaryotischen Zellen fördern kann. Synthetische oder natürliche chemische oder biochemische Vektoren stellen eine interessante Alternative zu den natürlichen Viren dar, insbesondere aus Gründen der Bequemlichkeit, der Sicherheit und auch aufgrund des Fehlens einer theoretischen Grenze im Hinblick auf die Größe der zu transfizierenden DNA. Diese synthetischen Vektoren haben zwei hauptsächliche Funktionen, nämlich das Komprimieren der zu transfizierenden Nukleinsäure und das Fördern ihrer Bindung an die Zelle sowie ihrer Passage über die Plasmamembran und gegebenenfalls die zwei Kernmembranen. Um der polyanionischen Natur von Nukleinsäuren entgegenzuwirken, besitzen nicht-virale Vektoren sämtlich polykationische Ladungen. Bei einem besonderen erfindungsgemäßen Verfahren ist der Vektor ein chemischer oder biochemischer Vektor.
Die Erfindung betrifft auch jede Zusammensetzung, die mindestens eine Nukleinsäure, wie oben definiert, umfasst.
Sie betrifft auch jede Zusammensetzung, die mindestens einen Vektor, wie oben definiert, umfasst.
Sie betrifft auch jede Zusammensetzung, die mindestens ein ScFv, wie oben definiert, umfasst.
Sie betrifft auch Zusammensetzungen, die eine Nukleinsäure oder einen Vektor, wie oben definiert, und eine Nukleinsäure oder einen Vektor, die für das Wildtyp-p53 codieren, umfassen, für eine kombinierte gleichzeitige Verwendung oder eine kombinierte Verwendung in einem zeitlichen Abstand.
Aufgrund ihrer antiproliferativen Eigenschaften sind die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen ganz besonders zur Behandlung hyperproliferativer Störungen, wie insbesondere Krebserkrankungen und Restenose, geeignet. Die vorliegende Erfindung stellt somit ein besonders wirksames Verfahren zur Zerstörung von Zellen, insbesondere hyperproliferativer Zellen, bereit.
Sie kann in vitro oder ex vivo eingesetzt werden. In diesem Fall besteht sie im Wesentlichen aus dem Inkubieren der Zellen in Anwesenheit von einer oder mehreren Nukleinsäuren (oder einem Vektor oder einer Kassette oder direkt dem ScFv). Dosen von 0,01 bis 1000 μg Vektor pro 10⁶ Zellen oder eine MOI von 0,1 bis 1000 können für einen viralen Vektor eingesetzt werden.
In vivo besteht sie aus dem Verabreichen einer aktiven Menge eines erfindungsgemäßen Vektors (oder einer Kassette) an den Organismus, vorzugsweise direkt an der zu behandelnden Stelle (insbesondere dem Tumor). In dieser Hinsicht betrifft die Erfindung auch ein Verfahren zur Zerstörung hyperproliferativer Zellen, welches das In-Kontakt-Bringen dieser Zellen oder eines Teils von ihnen mit einer Nukleinsäure, wie vorstehend definiert, umfasst. Für eine In-vivo-Verwendung kann die Nukleinsäure oder der Vektor, die/der bei der vorliegenden Erfindung verwendet wird, im Hinblick auf Verabreichungen auf topischem, oralem, parenteralem, intranasalem, intravenösem, intramuskulärem, subkutanem, intraokularem, transdermalem Weg usw. formuliert werden. Vorzugsweise wird die Nukleinsäure oder der Vektor in einer injizierbaren Form verwendet. Sie/er kann somit mit jedem pharmazeutisch annehmbaren Vehikel für eine injizierbare Formulierung, insbesondere für eine direkte Injektion an der behandelten Stelle, gemischt werden. Es kann sich insbesondere um sterile, isotonische Lösungen oder trockene, insbesondere lyophilisierte, Zusammensetzungen handeln, die je nachdem durch Zugabe von sterilisiertem Wasser oder physiologischem Serum die Bildung injizierbarer Lösungen gestatten. Eine direkte Injektion der Nukleinsäure in den Tumor des Patienten ist interessant, weil sie es ermöglicht, die therapeutische Wirkung an den betroffenen Geweben zu konzentrieren. Die verwendeten Nukleinsäuredosen können in Abhängigkeit von verschiedenen Parametern und insbesondere in Abhängigkeit von dem Gen, dem Vektor, der verwendeten Verabreichungsart, der betreffenden Pathologie oder auch der gewünschten Dauer der Behandlung eingestellt werden. Vorteilhafterweise betragen die in vivo verabreichten Dosen zwischen 10⁶ und 10¹⁰ pfu für einen viralen Vektor, wie ein Adenovirus. Außerdem können auch wiederholte Verabreichungen in Betracht gezogen werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren und die erfindungsgemäßen Moleküle können ebenfalls in vivo zur Untersuchung der Wirkmechanismen von p53 und zur Bestimmung des Potenzials der ScFv an Tiermodellen verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung wird vorteilhafterweise in vivo zur Zerstörung von in der Hyperproliferation (d. h. in der anomalen Proliferation) befindlichen Zellen verwendet. Sie kann somit zur Zerstörung von Tumorzellen oder glatten Muskelzellen der Gefäßwand (Restenose) angewendet werden. Sie ist ganz besonders zur Behandlung von Krebserkrankungen geeignet, bei denen eine Mutante von p53 beobachtet wird. Als Beispiel kann man Colon-Adenokarzinome, Krebserkrankungen der Schilddrüse, Lungenkarzinome, myeloische Leukämien, Kolorektalkrebserkrankungen, Brustkrebserkrankungen, Lungenkrebserkrankungen, Darmkrebserkrankungen, Ösophaguskrebserkrankungen, B-Lymphome, Ovarkrebserkrankungen, Blasenkrebserkrankungen, Glioblastome, Hepatokarzinome, Knochen-, Haut- oder Pankreaskrebserkrankungen oder auch Nieren- und Prostatakrebserkrankungen, Ösophaguskrebserkrankungen, Kehlkopf-, Kopf- und Halskrebserkrankungen, anogenitale HPV-positive Krebserkrankungen, EBV-positive Krebserkrankungen des Nasopharynx, Krebserkrankungen, bei denen das zelluläre Protein mdm2 überexprimiert wird, usw. nennen.
Die vorliegende Erfindung wird in den folgenden Beispielen detaillierter beschrieben, die als veranschaulichend und nicht als beschränkend angesehen werden sollten.
Figurlegenden
1: Strategie des Antikörper-Screening.
2: Nachweis der Fähigkeit der Antikörper, die Wanderung von p53 auf einem Gel zu verzögern.
3: Nachweis der Fähigkeit der Antikörper, die Wanderung von p53H273 auf einem Gel zu verzögern.
4: Nachweis der Verbindung der ScFv mit Wildtyp-p53 mittels ELISA. Ausgefüllte Kreise: IgG 11D3 (1 μg/ml Ausgangskonz.); leere Kreise: IgG 421 (1 μg/ml Ausgangskonz.); Quadrate: biotinyliertes polyklonales Serum (1 μg/ml Ausgangskonz.); ausgefüllte Dreiecke: ScFv 11D3-myc (zu Beginn auf ½ verdünnt); leere Dreiecke: ScFv 421 myc (zu Beginn auf ½ verdünnt); Rauten: irrelevanter ScFv (anti-CD3, zu Beginn auf ½ verdünnt).
5: Nachweis der durch die ScFv verursachten Gelverzögerungen.
6: Wiederherstellung der DNA-Bindungsaktivität bei Mutanten von p53.
7: Expression von ScFv421 in H1299-Zellen.
8: Wiederherstellung der Transkriptionsaktivität der Mutante H273 in der Zelllinie H358.
9: Wiederherstellung der Transkriptionsaktivität der Mutante H273, die in der HT29-Zelllinie endogen ist.
Beispiele
BEISPIEL 1: Gewinnung und Screening des Antikörpers 11D3
Dieses Beispiel beschreibt die Präparation, Gewinnung und Selektion monoklonaler Antikörper, die spezifisch gegen das p53-Protein gerichtet und in der Lage sind, die DNA-Bindungsfunktion der mutierten Formen von p53 zu aktivieren.
1.1. Gewinnung von zur Immunisierung von Mäusen verwendeten Proteinen und Screening der Hybridome
Das Wildtyp-p53-Protein und verschiedene p53-Proteine, p53 H273, p53 W248 und p53 G281, die Mutationen des Wildtyp-p53 entsprechen, die häufig in Tumorzellen gefunden werden, wurden in Spodopterafrugiperda-Sf9-Insektzellen, die mit einem rekombinanten Baculovirus infiziert waren, produziert und mittels Affinität an einem Agarosegel, an das der polyklonale Antikörper PAb421 gekoppelt worden war, gereinigt (Leveillard et al., EMBO J. 15, 1615–1623 (1996)). Die Proteine, die den Fragmenten 1–320 und 73–320 des Wildtyp-p53-Proteins entsprechen, wurden ebenfalls in Spodoptera-frugiperda-Sf9-Insektzellen produziert, die mit einem rekombinanten Baculovirus gemäß den von der Firma Invitrogen zur Verfügung gestellten Anleitungen infiziert worden waren. Die in das Transferplasmid pBlueBacIII inserierten komplementären DNAs wurden durch herkömmliche DNA-Rekombinationstechniken erzeugt, wie zum Beispiel von Sambrook et al. (Sambrook, Fritsch & Maniatis: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Auflage, 1989, Hrsg. Cold Spring Harbor Laboratory) beschrieben.
1.2. Gewinnung und Screening der Hybridome
Die Mäuse wurden mit einem äquimolaren Gemisch der drei vorstehend beschriebenen mutierten p53-Proteine immunisiert, und die Hybridome wurden erhalten, indem nach den von Harlow und Lane (Harlow & Lane: Antibodies, a laboratory manual, 1988, Hrsg. Cold Spring Harbor Laboratory) beschriebenen Verfahrensprotokollen vorgegangen wurde. Die Selektion von Hybridomen, welche die monoklonalen Antikörper produzierten, die gegen die vorstehend beschriebenen mutierten p53-Proteine gerichtet waren, erfolgte durch das Einfangen des im Hybridom-Kulturmedium produzierten Antikörpers in den Vertiefungen von PVC-Platten mit 96 Vertiefungen, in denen zuvor eine Menge von 1 Mikrogramm des äquimolaren Gemischs der vorstehend beschriebenen drei mutierten p53-Proteine immobilisiert worden war, indem nach den von Harlow und Lane (Harlow & Lane: Antibodies, a laboratory manual, 1988, Hrsg. Cold Spring Harbor Laboratory) beschriebenen Verfahrensprotokollen vorgegangen wurde. Dieses erste Screening ermöglichte die Selektion von 317 positiven Hybridomen. Nach zweiwöchiger Amplifikation der Hybridome wurden die Überstände der amplifizierten Hybridome zunächst erneut durch das vorstehend erwähnte Verfahren (Verfahren 1) zum Einfangen von Antikörpern untersucht und dann unter Verwendung dreier Screening-Verfahren klassifiziert, deren Prinzip identisch mit dem hier vorstehend erwähnten war, ausgenommen dass die Art der immobilisierten Proteine anders war: in den Vertiefungen wurde entweder (Verfahren 2) das gereinigte Wildtyp-p53-Protein oder (Verfahren 3) ein Proteinextrakt aus Sf9-Zellen, die das Fragment 1–320 des Wildtyp-p53 produzierten, oder (Verfahren 4) ein Proteinextrakt aus Sf9-Zellen, die das Fragment 73–393 des Wildtyp-p53 produzierten, immobilisiert. Die Proteinextrakte wurden durch Lyse der Sf9-Zellen mittels Einfrieren/Auftauen in einem Phosphatpuffer und anschließende Ultrazentrifugation des Zelldebris erhalten. Von den 317 amplifizierten Hybridomüberständen reagierten 162 nicht mehr im Verfahren 1. Die restlichen 155 waren immer noch positiv im Verfahren 2, wobei 33 von diesen (Gruppe A) in den Verfahren 3 und 4 negativ waren, 115 (Gruppe B) im Verfahren 3 positiv und im Verfahren 4 negativ waren und schließlich 7 (Gruppe C) in diesen beiden Verfahren positiv waren. Die Überstände der Gruppe B entsprechen Überständen, die einen Antikörper enthalten, dessen Epitop in den ersten 73 Aminosäuren von p53 liegt. 77 Überstände dieser Gruppe erwiesen sich als negativ im Verfahren 2, wenn sie mit dem Peptid (1 mg/ml) inkubiert wurden, das der Sequenz der ersten 40 Aminosäuren von p53 entsprach. Eine Isotypisierung der Antikörper der Gruppe A, der 38 Antikörper der Gruppe B, die nach der Eliminierung der 77 vorstehend Erwähnten verblieben, und derjenigen der Gruppe C ermöglichte uns, die IgM zu entfernen. Diese Ergebnisse sind in 1 zusammengefasst.
Anschließend wurden 42 Antikörper auf ihre Fähigkeit untersucht, einen Supershift an einem p53/DNA-Komplex zu verursachen. Nach der Reinigung auf Protein A/Sepharose, wurden die Antikörper quantifiziert. Gelverzögerungsexperimente wurden durchgeführt, indem 30 ng gereinigtes Wildtyp-p53-Protein mit einer 32P-markierten DNA-Sonde inkubiert wurden, die eine spezifische Bindungssequenz für p53 darstellte. Dann wurden 300 ng der verschiedenen Antikörper zugegeben. Die Komplexe wurden auf einem Acrylamidgel überprüft.
Die Ergebnisse der 2 zeigen, dass 27 dieser Antikörper in der Lage waren, einen Supershift zu verursachen. Unter diesen 27 wurden 19 untersucht, wobei die Mutante His273 anstelle des Wildtyp-p53-Proteins im gleichen Gelverzögerungesxperiment eingesetzt wurde (3). Diese 19 Antikörper ergaben sämtlich positive Ergebnisse. Der Antikörper Nr. 26 zeigte eine ausgeprägtere Verzögerung als die anderen. Dieser Antikörper wurde als 11D3 bezeichnet und in den folgenden Experimenten verwendet.
BEISPIEL 2: Gewinnung der ScFv 421 und D3M
Die ScFv wurden aus den Hybridomen durch molekularbiologische Standardtechniken auf Basis von PCR mithilfe degenerierter Primer, die für die VH- und VL-Regionen spezifisch waren, erhalten. Der von dem Antikörper 11D3 abgeleitete ScFv wurde als D3M bezeichnet. Seine Sequenz ist in SEQ ID NR: 2 dargestellt. Die Sequenz von ScFv421 ist in SEQ ID NR: 1 dargestellt.
BEISPIEL 3: Konstruktion von Expressionsvektoren für ScFv
Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion von Vektoren, die für den In-vitro- oder In-vivo-Transfer der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren verwendet werden können.
3.1. Konstruktion von Plasmidvektoren
Zur Konstruktion von Plasmidvektoren wurden 2 Vektortypen verwendet.

– Der in DNA Cloning, A practical approach, Bd. 2, D.M. Glover (Hrsg.) IRL Press, Oxford, Washington DC, 1985 beschriebene Vektor pSV2. Dieser Vektor ist ein eukaryotischer Expressionsvektor. Die für die ScFv codierenden Nukleinsäuren wurden in diesen Vektor in Form von HpaI/EcoRV-Fragmenten eingesetzt. So werden sie unter die Kontrolle des Promotors des SV40-Virus-Enhancers gestellt. Alle im Beispiel 2 beschriebenen Konstruktionen wurden für den Test in unterschiedlichen In-vitro- und In-vivo-Untersuchungssystemen in diesen Vektor eingeführt.
– Der Vektor pCDNA3 (Invitrogen). Es handelt sich ebenfalls um einen eukaryotischen Expressionsvektor. Die Nukleinsäuren, die für die erfindungsgemäßen ScFv codieren, werden in diesem Vektor somit unter die Kontrolle des frühen CMV-Promotors gestellt. Alle im Beispiel 2 beschriebenen Konstruktionen wurden in diesen Vektor in Form eines HindIII/NotI-Fragments eingeführt.

3.2. Konstruktion viraler Vektoren
Gemäß einer besonderen Ausführungsform betrifft die Erfindung die Konstruktion und Verwendung viraler Vektoren, die den Transfer und die In-vivo-Überexpression der Nukleinsäuren, wie vorstehend definiert, ermöglichen.
Dabei handelt es sich, genauer gesagt, um Adenoviren, wobei unterschiedliche Serotypen charakterisiert wurden, deren Struktur und Eigenschaften ein wenig variieren. Unter diesen Serotypen ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung die Verwendung der menschlichen Adenoviren des Typs 2 oder 5 (Ad 2 oder Ad 5) oder der Adenoviren tierischen Ursprungs bevorzugt (siehe die Anmeldung WO94/26914 ). Unter den aus Tieren stammenden Adenoviren, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, kann man die aus Hund, Rind, Maus (Beispiel: Mav1, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), Schaf, Schwein, Vogel oder Affe (Beispiel: SAV) stammenden Adenoviren nennen. Vorzugsweise ist das Adenovirus tierischen Ursprungs ein Hunde-Adenovirus, vorzugsweise ein Adenovirus CAV2 [zum Beispiel Stamm Manhattan oder A26/61 (ATCC VR-800)]. Vorzugsweise verwendet man im Rahmen der Erfindung Adenoviren aus Mensch oder Hund oder gemischten Ursprungs.
Vorzugsweise umfassen die erfindungsgemäßen defektiven Adenoviren die ITR, eine Sequenz, welche die Einkapselung einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure ermöglicht. Noch stärker bevorzugt ist im Genom der erfindungsgemäßen Adenoviren mindestens die Region E1 nicht-funktionell. Das betreffende virale Gen kann durch jede dem Fachmann bekannte Technik und insbesondere durch vollständige Suppression, Substitution, teilweise Deletion oder Hinzufügung von einer oder mehreren Basen in de(m/n) betreffenden Gen(en) nicht-funktionell gemacht werden. Derartige Modifi kationen können in vitro (an der isolierten DNA) oder in situ, zum Beispiel mithilfe gentechnologischer Techniken, oder auch durch Behandlung mit mutagenen Mitteln erhalten werden. Andere Regionen können ebenfalls modifiziert werden, insbesondere die Region E3 ( WO95/02697 ), E2 ( WO94/28938 ), E4 ( WO94/28152 , WO94/12649 , WO95/02697 , WO96/22378 ) und L5 ( WO95/02697 ). Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Adenovirus eine Deletion in den Regionen E1 und E4. Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst es eine Deletion in der Region E1, in die die Region E4 und die erfindungsgemäße Nukleinsäure eingesetzt werden ( WO96/13596 ). In den erfindungsgemäßen Viren erstreckt sich die Deletion in der E1-Region vorzugsweise von den Nukleotiden 455 bis 3329 in der Sequenz des Adenovirus Ad5.
Die erfindungsgemäßen defektiven rekombinanten Adenoviren können durch jede dem Fachmann bekannte Technik hergestellt werden (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573 ; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). Insbesondere können sie durch homologe Rekombination zwischen einem Adenovirus und einem Plasmid, das unter anderem die interessierende DNA-Sequenz trägt, hergestellt werden. Die homologe Rekombination findet nach Co-Transfektion der Adenoviren und des Plasmids in eine geeignete Zelllinie statt. Die verwendete Zelllinie sollte vorzugsweise (i) durch die besagten Elemente transformierbar sein und (ii) die Sequenzen, die den defektiven Teil des Genoms des Adenovirus komplementieren können, vorzugsweise in integrierter Form tragen, um Rekombinationsrisiken zu vermeiden. Als Beispiel für eine Linie kann man die menschliche embryonale Nierenzelllinie 293 nennen (Graham et al. J. Gen. Virol. 36 (1977) 59), die, genauer gesagt, integriert in ihr Genom den linken Teil des Genoms eines Ad5-Adenovirus (12%) enthält, oder Zelllinien, welche die E1- und E4-Funktionen komplementieren können, wie insbesondere die in den Anmeldungen Nr. WO94/26914 , WO95/02697 und WO96/22378 beschriebenen.
Anschließend werden die Adenoviren, die sich vermehrt haben, gewonnen und mittels molekularbiologischer Standardtechniken gereinigt, wie in den Beispielen veranschaulicht.
Bei den adenoassoziierten Viren (AAV) handelt es sich um verhältnismäßig kleine DNA-Viren, die sich in stabiler und stellenspezifischer Weise in das Genom der Zellen integrieren, die sie infizieren. Sie sind in der Lage, ein breites Spektrum an Zellen zu infizieren, ohne eine Wirkung auf das Wachstum, die Morphologie oder die Differenzierung der Zellen zu verursachen. Außerdem scheinen sie nicht an Pathologien beim Menschen beteiligt zu sein. Das Genom der AAV wurde kloniert, sequenziert und charakterisiert. Es umfasst ungefähr 4700 Basen und enthält an jedem Ende eine umgekehrte Wiederholungsregion (ITR) von etwa 145 Basen, die als Replikationsursprung für das Virus dient. Der Rest des Genoms wird in 2 wesentliche Regionen unterteilt, welche die Einkapselungsfunktionen enthalten: den linken Teil des Genoms, welcher das rep-Gen enthält, das an der Virusreplikation und der Expression viraler Gene beteiligt ist; den rechten Teil des Genoms, welcher das cap-Gen enthält, das für die Kapsidproteine des Virus codiert.
Die Verwendung von Vektoren, die von AAV abgeleitet sind, zum In-vitro- und In-vivo-Transfer von Genen ist in der Literatur beschrieben (siehe insbesondere WO 91/18088 ; WO 93/09239 ; US 4,797,368 , US 5,139,941 , EP 488 528 ). Diese Anmeldungen beschreiben verschiedene, von AAV abgeleitete Konstruktionen, in denen die Gene rep und/oder cap deletiert und durch ein interessierendes Gen ersetzt sind, und ihre Verwendung für den In-vitro- (in Zellen in Kultur) oder In-vivo-Transfer (direkt in einen Organismus) des interessierenden Gens. Die erfindungsgemäßen defektiven rekombinanten AAV hergestellt werden, indem in eine Zelllinie, die mit einem menschlichen Hilfsvirus (zum Beispiel einem Adenovirus) infiziert ist, ein Plasmid, das eine erfindungsgemäße interessierende Nukleinsequenz, flankiert von zwei umgekehrten Wiederholungsregionen (ITR) von AAV, enthält, und ein Plasmid, welches die Einkapselungsgene (die Gene rep und cap) des AAV trägt, cotransfiziert werden. Eine verwendbare Zelllinie ist zum Beispiel die Linie 293. Die produzierten rekombinanten AAV werden dann durch herkömmliche Techniken gereinigt.
Hinsichtlich der Herpesviren und Retroviren ist die Konstruktion rekombinanter Vektoren in der Literatur reichlich beschrieben: siehe insbesondere Breakfield et al., New Biologist 3 (1991) 203; EP 453242 , EP 178220 , Bernstein et al., Genet. Eng. 7 (1985) 235; McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689 usw. Die Retroviren sind, genauer gesagt, integrative Viren, die selektiv in der Teilung befindliche Zellen infizieren. Sie stellen folglich interessante Vektoren für Krebsanwendungen dar. Das Genom der Retroviren umfasst im Wesentlichen zwei LTRs, eine Einkapselungssequenz und drei codierende Regionen (gag, pol und env). In rekombinanten Vektoren, die von Retroviren stammen, sind die gag-, pol- und env-Gene im Allgemeinen ganz oder teilweise deletiert und durch eine heterologe Nukleinsäuresequenz von Interesse ersetzt. Diese Vektoren können ausgehend von verschiedenen Retrovirus-Typen hergestellt werden, wie insbesondere MoMuLV ("murine moloney leukemia virus"; auch als MoMLV bezeichnet), MSV ("murine moloney sarcoma virus"), HaSV ("harvey sarcoma virus"); SNV ("spleen necrosis virus"); RSV ("Rous sarcoma virus") oder auch das Friend-Virus.
Zur Konstruktion erfindungsgemäßer rekombinanter Retroviren, die eine erfindungsgemäße Nukleinsäure enthalten, wird ein Plasmid, das insbesondere die LTRs, die Einkapselungssequenz und die besagte Nukleinsäure enthält, konstruiert und dann zur Transfektion einer so genannten Einkapselungszelllinie verwendet, welche die auf dem Plasmid fehlenden retroviralen Funktionen in trans beisteuern kann. Im Allgemeinen können die Einkapselungszelllinien folglich die gag-, pol- und env-Gene exprimieren. Derartige Einkapselungszelllinien sind im Stand der Technik beschrieben, insbesondere die Linie PA317 ( US 4,861,719 ); die Linie PsiCRIP ( WO90/02806 ) und die Linie GP+envAm-12 ( WO89/07150 ). Außerdem können die rekombinanten Retroviren Modifikationen an den LTRs, um die Transkriptionsaktivität zu unterdrücken, sowie vergrößerte Einkapselungssequenzen, die einen Teil des gag-Gens enthalten, beinhalten (Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1639). Die produzierten rekombinanten Retroviren werden dann mit herkömmlichen Techniken gereinigt.
Zur Ausführung der vorliegenden Erfindung ist es ganz besonders vorteilhaft, wenn ein defektives rekombinantes Adenovirus oder Retrovirus verwendet wird. Diese Vektoren besitzen tatsächlich besonders interessante Eigenschaften für den Transfer von Genen in Tumorzellen.
3.3. Chemische Vektoren
Unter den entwickelten synthetischen Vektoren werden im Rahmen der Erfindung vorzugsweise kationische Polymere des Typs Polylysin, (LKLK)n, (LKKL)n ( WO95/21931 ), Polyethylenimin ( WO96/02655 ) und DEAE-Dextran oder auch kationische Lipide oder Lipofectants verwendet. Sie besitzen die Eigenschaft, DNA zu kondensieren und ihre Anlagerung an die Zellmembran zu fördern. Von diesen Letzteren kann man die Lipopolyamine (Lipofectamin, Transfectam, WO95/18863 und WO96/17823 ), verschiedene kationische oder neutrale Lipide (DOTMA, DOGS, DOPE usw.) sowie aus dem Kern stammende Peptide ( WO96/25508 ) nennen. Außerdem ist das Konzept der durch einen Rezeptor vermittelten gerichteten Transfektion entwickelt worden, wobei das Prinzip der Kondensation von DNA aufgrund des kationischen Polymers genutzt und gleichzeitig die Bindung des Komplexes aufgrund einer chemischen Kopplung zwischen dem kationischen Polymer und dem Liganden eines Membranrezeptors, der auf der Oberfläche des Zelltyps vorliegt, den man verändern möchte, an die Membran gesteuert wird. So ist das Ansteuern des Transferrin-, des Insulinrezeptors oder des Rezeptors. der Asialoglykoproteine von Hepatozyten beschrieben worden. Die Herstellung einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung unter Verwendung eines derartigen chemischen Vektors wird mit jeder dem Fachmann bekannten Technik durchgeführt, im Allgemeinen durch einfaches In-Kontakt-Bringen der verschiedenen Komponenten.
BEISPIEL 4: Die ScFv erkennen p53
Die Bindung der ScFv an p53 wurde in einem ELISA-Test bestätigt.
Ein myc-Tag wurde an die ScFv fusioniert, um ihren Nachweis zu ermöglichen. Die ScFv 421 und 11D3 (D3M) und ein Kontroll-ScFv (anti-CD3) wurden aus den Periplasmen von Bakterien produziert, welche diese verschiedenen ScFv exprimieren.
Mit gereinigtem p53 beschichtete ELISA-Platten werden mit verschiedenen Verdünnungen an 11D3-IgG, 421-IgG, biotinyliertem polyklonalem Anti-p53-Serum, 11D3-ScFv, 421-ScFv und Anti-CD3-ScFv inkubiert.
Die beiden IgGs werden dann mit einem sekundären anti-IgG-Antikörper sichtbar gemacht, der an alkalische Phosphatase gekoppelt ist. Das biotinylierte Serum wird mit Extravidin, das mit alkalischer Phosphatase gekoppelt ist, sichtbar gemacht. Die ScFv werden mit dem Anti-myc-Antikörper 9E10 und dann mit einem Anti-IgG-Antikörper, der an alkalische Phosphatase gekoppelt ist, sichtbar gemacht. Ein kolorimetrischer Nachweis der alkalischen Phosphataseaktivität ist in 4 dargestellt, die zeigt, dass die zwei gereinigten IgGs, das polyklonale Serum und die ScFv 421 und 11D3 p53 erkennen, während das anti-CD3-ScFv inaktiv ist.
BEISPIEL 5: Die ScFv können einen Supershift von Wild-Typ-p53 verursachen
Die Fähigkeit der ScFv, die DNA-Bindungsfunktion von Wildtyp-p53 zu aktivieren, wurde durch Gelverzögerungsexperimente untersucht.
Ein DNA-Duplex, der eine spezifische Bindungsstelle für p53 darstellt, wurde mit 32P markiert und dann mit dem gereinigten Wildtyp-p53 und verschiedenen gereinigten Antikörpern oder ScFv inkubiert, die in den bakteriellen Periplasmen produziert worden waren. Die Komplexe werden durch Acrylamidgelelektrophorese aufgetrennt.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in 5 dargestellt.
Der DNA/p53-Komplex wird auf der "Basal" linie beobachtet. Die Antikörper HR231, pAb421 und 11D3 können eine zusätzliche Verzögerung (Supershift) verursachen und die Menge an DNA/p53-Komplex erhöhen.
Die ScFv 421 und D3M können ebenfalls einen Supershift induzieren, während ein Anti-ras-Kontroll-ScFv (Y28) keine Wirkung hat. Der ScFv 421 induziert im Gegensatz zu dem ScFv D3M eine Zunahme der Menge des p53/DNA-Komplexes.
BEISPIEL 6: Die ScFv können bei einer p53-Mutante eine DNA-Bindungsfunktion wiederherstellen
Analog wurden die ScFv hinsichtlich ihrer Fähigkeit, die DNA-Bindungsfunktion der inaktiven Mutante Trp248 wiederherzustellen, untersucht. Die erhaltenen Ergebnisse sind in 6 dargestellt.
Sie zeigen, dass die zwei ScFv das Auftreten einer verzögerten Bande verursachen, die einem p53/DNA-Komplex entspricht.
BEISPIEL 7: Die ScFv werden in Tumorzellen korrekt exprimiert
Die Expression der ScFv wurde durch transiente Transfektion von Expressionsvektoren (SV40-Promotor) in H1299-Tumorzellen bestätigt. Genauer gesagt, wurden die Nukleinsäuren in Form eines Plasmidvektors des pSV2-Typs (Beispiel 3) und in Gegenwart eines kationischen Lipids, Lipofectamin, verabreicht.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in 7 dargestellt. Mittels Western-Blot an einem Gesamtextrakt wird eine Hauptbande beobachtet, die bei etwa 30 kD wandert, was der erwarteten Größe entspricht und bestätigt, dass die Moleküle in den Tumorzellen in signifikanten Spiegeln exprimiert werden.
BEISPIEL 8: Die ScFv können die Transaktivierungsfunktion von His273-Mutanten teilweise wiederherstellen
Die Funktionsfähigkeit dieser ScFv innerhalb von Tumorzellen auf die mangelhafte Transaktivierungsfunktion der mutierten Formen von p53 wurde folgendermaßen gemessen:
Transiente Transfektionen wurden in den Linien H358 oder H1299 (in beiden Zelllinien ist p53 deletiert) oder in der Linie HT29 (welche die p53-Mutante His273 enthält) durchgeführt. Durch dies Transfektionen wurden Expressionsvektoren für Wildtyp-p53 oder die Mutanten H273 oder His175, für die zwei ScFv und ein Reporterplasmid eingebracht, welches das Gen für CAT (Chloramphenicolacetyltransferase) unter der Kontrolle eines p53-abhängigen Promotors enthielt. Die 48 Std. nach der Transfektion gemessene CAT-Aktivität spiegelt die Transaktivierungsfunktion von p53 wider.
Die Ergebnisse der 8 zeigen, dass in der Linie H358 die zwei ScFv in der Lage sind, die transkriptionelle Aktivität der His273-Mutante auf signifikante Weise zu reaktivieren, identische Ergebnisse wurden in der Linie H1299 erhalten.
Ebenso können die zwei ScFv in der Linie HT29 die transkriptionelle Aktivität der endogenen His273-Mutante erhöhen (9). SEQUENZEN

Claims

Verwendung eines einkettigen Antikörpers, der spezifisch an ein Epitop in der C-terminalen Region von p53 zwischen den Resten 320–393 binden kann, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, bestimmt zur Behandlung von Krebserkrankungen, bei denen ein mutiertes p53-Protein beteiligt ist.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der einkettige Antikörper aus ScFv421 der Sequenz SEQ ID NR: 1 und 11D3 der Sequenz SEQ ID NR: 2 ausgewählt ist.
Verwendung einer Nukleinsäure, die für einen einkettigen Antikörper codiert, der spezifisch an einen Epitop in der C-terminalen Region von p53 zwischen den Resten 320–393 binden kann, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, bestimmt zur Behandlung von Krebserkrankungen, bei denen ein mutiertes p53-Protein beteiligt ist.
Verwendung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure für einen einkettigen Antikörper codiert, der aus ScFv421 der Sequenz SEQ ID NR: 1 und 11D3 der Sequenz SEQ ID NR: 2 ausgewählt ist.
Verwendung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure Teil eines Vektors ist.
Verwendung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor ein viraler Vektor ist.
Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor ein defektives rekombinantes Adenovirus ist.
Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor ein defektives rekombinantes Retrovirus ist.
Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor ein defektives rekombinantes AAV ist.
Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor ein defektives rekombinantes HSV ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Krebserkrankung ein Lungen-, Enddarm-, Kopf-Hals-, Leber-, Hirnkrebs ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das mutierte p53-Protein aus den Proteinen p53H273, p53W248 und p53G281 ausgewählt ist.
Das Molekül 11D3, wie in der Sequenz SEQ ID NR: 2 dargestellt.
Nukleinsäure, die für ein Molekül nach Anspruch 13 codiert.
Nukleinsäure nach Anspruch 14, gekennzeichnet durch die Sequenz SEQ ID NR: 2.
Zusammensetzung, umfassend eine Nukleinsäure nach Anspruch 15.
Zusammensetzung, umfassend ein Molekül nach Anspruch 13.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine Nukleinsäure nach Anspruch 14 und ein pharmazeutisch annehmbares Vehikel zur Behandlung von Krebserkrankungen.