SK286978B6 - Použitie jednoreťazcovej protilátky schopnej špecificky viazať epitop prítomný v C-koncovej oblasti proteínu p53 medzi zvyškami 320-393 a nukleovej kyseliny kódujúcej takúto protilátku na prípravu farmaceutickej kompozície na liečbu rakovín - Google Patents

Abstract

Je opísané použitie jednoreťazcových protilátok proti proteínu p53 schopných exprimovať sa v nádorových bunkách, schopných opraviť funkciu väzbovej DNA in vitro a funkciu transkripčného aktivátora in vivo. Ďalej sú opísané nukleové kyseliny kódujúce tieto molekuly, vektory, ktoré ich obsahujú, a ich použitie.

Description

Oblasť techniky

Predložený vynález sa týka spôsobu obnovy p53-závislej transaktivačnej aktivity v bunkách, ktoré majú mutovaný proteín p53 zbavený funkcie transkripčného faktora alebo so zníženou funkciou transkripčného faktora. Postup podľa vynálezu sa týka použitia jednoreťazcových protilátok schopných špecificky viazať mutovaný proteín p53. Týka sa tiež nových molekúl schopných špecificky a účinne viazať proteíny p53 a umožňujúcich, okrem iného, obnovu aktivity p53 v nádorových bunkách, ako aj nukleových kyselín kódujúcich tieto molekuly, a vektorov, ktoré ich obsahujú. Táto metóda a molekuly podľa vynálezu sú použiteľné in vitro alebo ex vivo na štúdium mechanizmu účinku p53 a jeho mutovaných foriem alebo na purifikáciu proteínov p53. Predstavujú tiež použitie in vivo, konkrétne v terapeutických prístupoch na obnovenie aktivity p53 v súvislostiach s patológiami, predovšetkým s rakovinami.

Doterajší stav techniky

Divý proteín p53 pôsobí pri regulácii bunkového cyklu a pri udržovaní neporušenosti genómu bunky. Tento proteín, ktorého základná funkcia je byť aktivátorom transkripcie určitých génov, je schopný, procesom ešte nie dobre definovaným, blokovať bunku vo fáze G1 bunkového cyklu v čase objavenia sa mutácií v priebehu replikácie genómu a spustiť určitý počet mechanizmov opravy DNA. V prípade zlej funkcie týchto opravných procesov alebo v prípade objavenia sa tak veľkého počtu mutácií, že ich nie je možné opraviť, je tento proteín schopný indukovať fenomén programovanej bunkovej smrti, nazvanej apoptóza. Týmto spôsobom proteín p53 pôsobí ako supresor nádoru tým, že eliminuje abnormálne diferencované bunky alebo bunky, ktorých genóm bol poškodený.

Táto základná funkcia p53 závisí od jeho funkcie transkripčného faktora, čo znamená inými slovami, od jeho dvojakej schopnosti rozpoznávať špecifické sekvencie na úrovni genómovej DNA a spustiť systém transkripcie.

Proteín p53 obsahuje 393 aminokyselín, ktoré tvoria 5 funkčných oblasti:

- Oblasť aktivátora transkripcie tvorenú aminokyselinami 1 až 73, ktorá je schopná viazať určité faktory základného systému transkripcie, ako je proteín TPB. Táto oblasť je tiež miestom určitého počtu posttranslačných modifikácií. Je tiež miestom početných interakcií proteínu p53 s množstvom iných proteínov, najmä s bunkovým proteínom mdm2 alebo proteínom EBNA5 vírusu Epstein-Barrovej (EBV), schopných blokovať funkciu divého proteínu. Táto oblasť je tvorená sekvenciami aminokyselín, označených ako PEST, citlivých na proteolytickú degradáciu.

- DNA väzbovú oblasť, ktorá je lokalizovaná medzi aminokyselinami 73 a 315. Konformácia tejto centrálnej oblasti p53 riadi rozpoznanie sekvencií DNA špecifických pre proteín p53. Táto oblasť je miestom dvoch typov poškodení narúšajúcich funkciu divého proteínu:

(i) Interakcia s proteínmi blokujúcimi funkciu p53, ako je napríklad antigén „veľké T“ vírusu SV40 alebo vírusové proteíny E6 vírusu HPV16 a HPV18 schopnými vyvolať jeho degradáciu ubikvitínovým systémom. Posledná menovaná interakcia sa môže vytvoriť iba v prítomnosti bunkového proteínu E6ap (enzým E3 ubikvitínovej kaskády).

(ii) Bodové mutácie narúšajúce funkciu p53, ktoré takmer všetky ležia v tejto oblasti.

- Signálnu oblasť jadrovej lokalizácie tvorenú aminokyselinami 315 až 325 nevyhnutnú pre správne vyslanie proteínu do kompartmentu, kde proteín bude vykonávať svoju základnú funkciu.

- Oblasť oligomerizácie tvorenú aminokyselinami 325 až 355. Táto oblasť 325 až 355 tvorí štruktúru typu: β skladaný list (326-334)- slučka (335-336) - a helix (337-355). Zmeny funkcií umiestnených v tejto oblasti sú spôsobené najmä interakciou divého proteínu s rôznymi mutovanými formami, ktoré môžu viesť k rôznym vplyvom na funkciu divého proteínu.

- Regulačnú oblasť tvorenú aminokyselinami 365 až 393, ktorá je miestom určitého počtu posttranslačných modifikácií (glykozylácia, fosforylácia, väzba RNA ...), ktoré pozitívne alebo negatívne modulujú funkciu proteínu p53. Táto oblasť má veľmi dôležitú úlohu v modulácii aktivity divého proteínu.

Funkcie proteínu p53 sa môže porušiť rôznymi spôsobmi.

- Blokovaním jeho funkcie určitým počtom faktorov, ako je napríklad antigén „veľké T“ vírusu SV40, proteín EBNA5 vírusu Epstein-Barrovej alebo bunkový proteín mdm2.

- Destabilizáciou proteínu zvýšením jeho citlivosti na proteolýzu, najmä interakciou s proteínom E6 ľudského papilomavírusu HPV16 a HPV 18, ktorý podporuje vstup p53 do ubikvitínového cyklu. V tom prípade interakcia medzi týmito dvoma proteínmi sa môže uskutočniť iba po predchádzajúcej väzbe bunkového proteínu, proteínu E6ap, ktorého väzbové miesto nie je dostatočne známe.

- Bodovými mutáciami na úrovni génu p53.

- Deléciou jednej alebo oboch alel p53.

Tieto dve naposledy uvedené modifikácie sú pozorované v 50 % rôznych typov rakoviny. Z tohto hľadiska mutácie génu proteínu p53 v rakovinových bunkách zasahujú veľmi veľkú časť génu, ktorý kóduje tento proteín a ich následkom sú rôzne modifikácie funkcií tohto proteínu. Môže sa s určitosťou poznamenať, že tieto mutácie sú z veľkej časti lokalizované v centrálnej časti proteínu p53, čo je oblasť viažuca sa s genómovými sekvenciami špecifickými pre proteín p53. To vysvetľuje, prečo základnou vlastnosťou väčšiny mutantov proteínu p53 je ich neschopnosť viazať sa na sekvencie DNA, ktoré rozpoznáva divý proteín, a neschopnosť ďalej vykonávať svoju úlohu transkripčného faktora. Inak sa zdá, že určité mutanty získali nové funkcie, ako je aktivácia určitých génov na transkripčnej úrovni.

Tieto modifikácie sú rozdelené do troch skupín:

- Takzvané slabé mutanty, ktorých produkt je nefunkčný proteín, ktorý v prípade mutácie jednej z dvoch alel nemá vplyv na funkciu divého proteínu kódovaného druhou alelou. Hlavnými zástupcami tejto skupiny sú mutanty H273 a W248, z ktorých naposledy menovaný je špecifický pre vrodený Li-Fraumeni syndróm hypersenzibility proti rakovinovým vplyvom.

- Dominantne negatívne mutanty, ktoré produkujú nefunkčný proteín, ktorý v prípade mutácie jednej z dvoch alel je schopný interakciou s divým proteínom blokovať funkciu tohto proteínu tvorbou neaktívnych zmesových oligomérov, ktOTé sa nemôžu viac viazať na DNA sekvencie špecifické pre divý proteín. Hlavný zástupca tejto skupiny je mutant G281.

- Dominantne onkogénne mutanty, ktorých produkt je proteín, ktorý je schopný čiastočne blokovať funkciu divého proteínu ako mutanty predchádzajúcej skupiny a okrem toho podporovať nedostatočne známymi mechanizmami vývoj tumoru, čo je prejav získania funkcie. Hlavný zástupca tejto skupiny je mutant H175.

Po zhodnotení jeho antitumorových a apoptických vlastností a jeho účasti v množstve patológií hyperprolifetívneho typu bol gén divého p53 použitý v metódach génovej a bunkovej terapie. Konkrétne sa navrhol na liečenie rôznych hyperproliferatívnych patológií, konkrétne rakovín, in vivo podávaním génu divého proteínu p53, opravením funkcií p53. Podávanie sa môže uskutočniť predovšetkým pomocou vírusových vektorov, konkrétne adenovírusových (WO94/24297) alebo retrovírusových (W094/06910). Pozorovalo sa, že vloženie nukleovej kyseliny kódujúcej divý proteín p53 umožňuje čiastočne opraviť normálnu reguláciu bunkového rastu (Roth a kol., Náture Medicíne 2 (1996) 985). Tiež sa vyvinuli alternatívne postupy založené na použití chimérických molekúl, ktoré majú vlastnosti typu p53 (PCT/FR96/01111, WO 97/04094 A).

Iný prístup na opravenie funkcií divého proteínu p53 je založený na reverzii mutovaných endogénnych proteínov k divému fenotypu, čiže reverzia na proteíny, ktoré majú vlastnosti supresora tumoru a apoptické vlastnosti divého p53. Tento prístup vyplýva z poznatku, že straty funkčnosti mutantov p53 sú spôsobené konformačnou zmenou proteínu indukovanou mutáciou či mutáciami. Z tohto hľadiska prihláška vynálezu WO94/12202 ukazuje, že monoklonálna protilátka, označená ako pAb421, namierená proti proteínu p53, je schopná opraviť určitej triede mutantov často prítomných v ľudských rakovinách funkciu viazania DNA in vitro. Použitie tohto typu kompozícií má zatiaľ nevýhody, spojené predovšetkým s veľkým množstvom potrebných protilátok (a teda spojené s problémami produkcie/purifikácie) a s ich slabou intracelulámou penetráciou.

Podstata vynálezu

Predložený vynález opisuje výhodnejší spôsob opravy divých vlastností mutanta proteínu p53. Predložený vynález opisuje konkrétne konštrukciu ligandov špecifických pre proteín p53, ktoré majú výhodné vlastnosti na obnovu funkcií divého proteínu p53. Predložený vynález konkrétne opisuje konštrukciu j ednoreťazcových protilátok (ScFv) špecifických pre proteín p53, konkrétne molekuly 11D3. Predložený vynález ukazuje okrem iného, že ScFv sú schopné rozpoznať p53, sú schopné byť účinne exprimované v tumorovej bunke a sú schopné reaktivovať časť transaktivačnej funkcie určitej triedy mutantov proteínu p53.

Vzhľadom na metódy vedľajších odborov táto molekula má významné výhody, konkrétne, že môže byť exprimovaná in situ v tumorovej bunke vo významnom množstve. Výsledky, ktoré sú uvedené ďalej, sú tým skôr neočakávané, že strata afinity sa často pozorovala medzi klasickou protilátkou a ScFv. Okrem toho predkladateľ ukázal, že je možné exprimovať ScFv vo vhodných intracelulámych kompartmentoch, čo umožňuje získať optimálnu biologickú aktivitu.

Prvý predmet vynálezu spočíva teda v metóde na obnovenie transaktivačnej p53-závislej aktivity mutovaného proteínu p53 prítomného v bunke, zahrnujúce vloženie jednoreťazcovej protilátky schopnej špecificky viazať mutovaný proteín p53 do uvedenej bunky. Postup podľa vynálezu výhodne zahrnuje vloženie nukleovej kyseliny obsahujúcej sekvenciu kódujúcu uvedenú jednoreťazcovú protilátku do bunky pod riadením promótora funkčného v bunke. Iné hľadisko vynálezu sa týka použitia jednoreťazcovej protilátky schopnej špecificky viazať mutovaný proteín p53 na modifikáciu konformácie uvedeného proteínu. Predložený vynález sa tiež týka použitia jednoreťazcových protilátok schopných špecificky viazať mutovaný proteín p53 na prípravu farmaceutickej kompozície určenej na liečenie hyperproliferatívnych porúch, v ktorých je zahrnutý

SK 286978 Β6 mutovaný proteín p53, rovnako ako použitie nukleovej kyseliny kódujúcej jednoreťazcovú protilátku schopnú špecificky viazať mutovaný proteín P53 na prípravu farmaceutickej kompozície určenej na liečenie hyperproliferatívnych chorôb, v ktorých je zahrnutý mutovaný proteín p53.

Postup podľa vynálezu sa teda týka konštrukcie, vektorizácie a vloženia jednoreťazcovej protilátky schopnej špecificky viazať mutovaný proteín p53 do buniek. Jednoreťazcové protilátky (ScFv) sú tvorené konkrétne oblasťou VH ramena spojenou s oblasťou VL. Konštrukcia ScFv a sekvencie nukleových kyselín kódujúcich takéto modifikované protilátky boli opísané v US4,946,778 alebo v W094/02610, WO94/29446 zahrnutých do literatúry.

Predložený vynález opisuje konkrétne tvorbu banky hybridómov produkujúcich protilátky cielené proti p53 a konštrukciu zodpovedajúce ScFv z tejto banky. Opisuje tiež klonovanie zodpovedajúcich nukleových kyselín v expresných vektoroch a ich prenos do buniek. Ukazuje tiež, že tento prenos umožňuje in vivo účinne opraviť DNA väzbovú aktivitu mutantných p53 rovnako ako ich transaktivačnú aktivitu.

Postup podľa vynálezu uvádza ScFv schopné špecificky viazať epitop prítomný v oblasti C-konca proteínu p53, ktorý obsahuje oblasť oligomerizácie a oblasť regulácie. Z tohto hľadiska predložený vynález opisuje tiež test umožňujúci selekciu ScFv majúcich tieto vlastnosti technikou ELISA.

ScFv použité v postupe podľa vynálezu sú schopné špecificky viazať epitop prítomný v oblasti C-konca proteínu p53 nachádzajúceho sa medzi zvyškami 320-393. Z tohto hľadiska predložený vynález opisuje príklad konštrukcie a expresie ScFv ScFv421 sekvencie SEQ IDNO.: 1 a 11D3 sekvencie SEQ ID NO.: 2.

Postup podľa vynálezu je všeobecne aplikovateľný na mutované proteíny p53, ktoré stratili čiastočne alebo úplne schopnosť viazať DNA a postup podľa vynálezu umožňuje opraviť túto schopnosť. Postup podľa vynálezu je aplikovateľný na mutované proteíny p53, ktoré stratili čiastočne alebo úplne funkciu transkripčného faktora proteínu p53 a umožňuje opraviť túto funkciu. Stupeň obnovy môže byť úplný alebo čiastočný. Výhodne je postačujúci, aby mohol mutant vykonávať funkciu supresora tumoru blokovaním bunkového cyklu a/alebo indukciu apoptózy. Postup podľa vynálezu umožňuje teda opraviť aspoň čiastočne aktivitu supresora tumoru v bunkách majúcich mutované endogénne proteíny p53 zbavené tejto aktivity. Výhodne ide o mutované proteíny v nádorových bunkách. Ako už bolo uvedené, v nádorovej bunke boli dokázané rôzne mutované formy proteínu p53. Napríklad sa môžu uviesť proteíny p53H273, p53W248 a p53G281. Ďalej uvedené príklady ukazujú konkrétne, že postup podľa vynálezu umožňuje modifikovať konformáciu a biologické vlastnosti týchto mutantov in vitro a in vivo. Tieto príklady konkrétne ukazujú, že ScFv421 a 11D3 sú schopné opraviť mutantom 273 a 248 ich schopnosť špecificky viazať DNA a indukovať p53-závislú transaktiváciu.

Postup podľa vynálezu sa môže uskutočniť in vitro, ex vivo alebo in vivo. V postupe in vitro alebo ex vivo molekuly podľa vynálezu môžu umožniť napríklad štúdiu mechanizmu účinku proteínu p53 a jeho mutovaných foriem. Okrem toho molekuly podľa vynálezu sa môžu použiť na detekciu alebo purifikáciu proteínov p53, napríklad väzbou na nosič, uvedením do kontaktu s roztokom obsahujúcim proteíny p53, prípadne následným objavením vytvorených komplexov alebo elúciou. V prípade in vivo, konkrétne u človeka, môžu tieto molekuly umožniť opravu tejto funkcie v patologických súvislostiach takých, ako sú hyperproliferatívne choroby, v ktorých sa pozoruje nedostatok aktivity proteínu p53. Z tohto hľadiska sa postup môže použiť v spojení s ďalšími prístupmi uvedenými ďalej (vloženie génu divého proteínu p53) alebo tiež v spojení s chemoterapiou (WO96/22101). V prípade in vivo sú postup a molekuly podľa vynálezu vždy použiteľné pri zvieratách, napríklad na určenie úrovne expresie ScFv a na určenie možnosti prístupu pre ľudskú terapiu.

Bunka, ktorá obsahuje mutovaný proteín p53, je výhodne cicavčia nádorová bunka. Z tohto hľadiska sa môžu uviesť konkrétne bunky rakoviny pľúc (konkrétne nemalých buniek), tračníka, pečene, mozgu, hlavy a krku. Všeobecnejšie sa môže uviesť každá rakovina, v ktorej je pozorovaná mutovaná forma proteínu p53. Výhodne ide o ľudské nádorové bunky, v ktorých sú pozorované mutanty p53H273, p53W248 a/alebo p53G281 (pľúca, tračník, mozog, hlava a krk, pečeň). Aplikovateľnosť postupu podľa vynálezu na jednotlivú bunku sa môže ľahko určiť podľa nasledovnej metodiky: Najprv sa určí, či je v bunke prítomný mutovaný proteín p53. Potom sa určí povaha mutácie tohto proteínu. Ak ide o známu mutáciu, konkrétne o mutáciu uvedenú ďalej, bunka sa môže považovať za vhodnú na opracovanie postupom podľa vynálezu. Ak ide o mutáciu, ktorá nie je uvedená, sú možné iné prístupy. Mutovaný proteín sa môže najskôr izolovať (alebo umelo syntetizovať) a testovať tak, ako je opísané v príkladoch na svoje správanie in vitro alebo in vivo v prítomnosti ScFv. To umožňuje identifikovať ScFv vhodnú na opravu nedostatočných funkcií tohto proteínu. Iný prístup spočíva v priamom testovaní ScFv na bunkovej kultúre na určenie biologického účinku ScFv.

Na použitie postupu podľa vynálezu je ScFv výhodne vložená do bunky in vitro, ex vivo alebo in vivo vo forme vektora nesúceho nukleovú kyselinu kódujúcu uvedenú ScFv pod riadením promótora funkčného v uvedenej bunke.

Promótor je výhodne vybratý z promótorov funkčných v cicavčích bunkách, prednostne v ľudských. Výhodnejšie ide o promótor umožňujúci expresiu nukleovej kyseliny v hyperproliferatívnej bunke (rakovinovej, restenóznej atď.). Z tohto hľadiska sa môžu použiť rôzne promótory. Môže ísť napríklad o vlastný promótor génu proteínu p53. Môže ísť tiež o sekvencie rôzneho pôvodu (sekvencie zodpovedné za expresiu iných gé

SK 286978 Β6 nov alebo tiež syntetické sekvencie). Môže ísť tiež o každý promótor alebo odvodenú sekvenciu stimulujúcu alebo potláčajúcu transkripciu génu špecifickým alebo nešpecifickým spôsobom, indukovateľne alebo neidukovateľne, silno alebo slabo. Môžu sa konkrétne uviesť promótorové sekvencie eukaryotických alebo vírusových génov. Napríklad môže ísť o promótorové sekvencie pochádzajúce z genómu cieľovej bunky. Z eukaryotických promótorov sa môžu použiť konkrétne ubikvitínové promótory (promótor génov HPRT, PGK, a-aktínu, tubulínu, DHFR atď.), promótory intermediámych filamentov (promótor génov GFAP, dezmínu, vimentínu, neurofilamentov, keratínu atď.), promótory terapeutických génov (napríklad promótory génov MDR, SFTR, faktora VIII, ApoAI atď.), tkanivovo špecifické promótory (promótor génu pyruvát-kinázy, vilínu, črevného väzbového proteín mastných kyselín, α-aktínu hladkého svalstva atď.), promótory buniek špecifického typu bunkového delenia, ako sú rakovinové bunky alebo tiež promótory odpovedajúce na stimuly (receptor steroidných hormónov, receptor kyseliny retinovej atď.). Rovnako môže ísť o sekvencie promótorov pochádzajúcich z genómu vírusov, ako sú napríklad promótory génov E1A a MLP adenovírusov, raný promótor CMV alebo tiež promótor LTR RSV atď. Okrem toho tieto oblasti promótorov sa môžu modifikovať adíciou aktivačných sekvencii, regulačných sekvencii alebo sekvencii umožňujúcich tkanivovo špecifickú alebo majoritnú expresiu.

Ako už bolo uvedené, predložený vynález sa týka tiež nových zvlášť výhodných molekúl, ktoré majú schopnosť viazať a revertovať mutované proteíny p53. Predložený vynález presnejšie opisuje konštrukciu, vektorizáciu a prenos ScFv (11D3, 421) do buniek. Nukleová a peptidová sekvencia týchto ScFv je označená SEQ ID NO.: 1 a SEQ ID NO.: 2. Príklady, ktoré nasledujú, dokazujú zvlášť výhodnú schopnosť molekúl (i) špecificky viazať mutované proteíny p53 v oblasti C-konca, (ii) vrátiť týmto proteínom schopnosť viazať DNA a (iii) vrátiť týmto proteínom schopnosť aktivovať transkripciu. Príklady okrem iného ukazujú, že tieto molekuly sú správne exprimované v nádorových bunkách, čo umožňuje ich výhodné použitie v súvislosti s hyperproliferatívnymi chorobami. Vlastnosti ScFv podľa vynálezu môžu byť zlepšené. Konkrétne je známe, že afinita ScFv je ovplyvnená oblasťami CDR (podčiarknuté na sekvencii) a môže sa zvýšiť rutinným zásahom mutagenézou/selekciou. Mutagenéza protilátok bola napríklad opísaná Marksom a kol. (Bio/Technology 10, 779-783, 1992) a Winterom G. a Milsteinom C. (Náture 349, 293-299, 1991). Techniky opísané v odkazoch sa môžu použiť na prípravu variantov ScFv majúcich afinitu modifikovanú podľa vynálezu. Potom sa môže uskutočniť selekcia za podmienok opísaných v príkladoch.

Predložený vynález sa týka teda molekuly 11D3, ktorej peptidová sekvencia je vyjadrená SEQ ID NO.: 2, rovnako ako každej varianty s modifikáciou v oblastiach CDR zachovávajúcou si schopnosť viazať proteín p53. Modifikácia sa môže uskutočniť deléciou, substitúciou alebo inzerciou jedného alebo viac zvyškov v oblastiach CDR. Modifikácia sa výhodne týka menej ako 10 zvyškov.

Predmetom predloženého vynálezu je tiež každá nukleová kyselina kódujúca ScFv 11D3 alebo taký variant, ako je už opísaný.

Nukleová kyselina podľa vynálezu môže byť ribonukleová kyselina (RNA) alebo deoxyribonukleová kyselina (DNA). Výhodne ide o komplemetámu DNA (cDNA). Môže byť pôvodu ľudského, zvieracieho, vírusového, syntetického alebo semisyntetického. Môže sa získať rôznymi spôsobmi, konkrétne chemickou syntézou s použitím sekvencii uvedených v prihláške vynálezu napríklad s použitím syntetizátora nukleových kyselín. Môže sa tiež získať triedením bánk prostredníctvom takých špecifických sond, ktoré sú opísané v predloženom vynáleze. Môžu sa tiež získať zmesovými technikami, zahrnujúcimi chemickú modifikáciu (elongáciu, deléciu, substitúciu atď.), sekvencii vybraných z banky. Všeobecne sa nukleové kyseliny podľa vynálezu môžu pripraviť podľa všetkým odborníkom známych techník (pozri konkrétne technológie opísané v US4,946,778 a W094/02610 zahrnutých v prítomných odkazoch). Klasický postup konštrukcie nukleových kyselín kódujúcich ScFv je nasledovný: cDNA kódujúce oblasti VH a VL sa získajú z hybridómu produkujúceho vybranú protilátku anti-p53. Preto sa extrahuje celková RNA z hybridómu a uskutoční sa s ňou reverzná transkripcia s použitím náhodných hexamérov ako primérov. Použitie tohto typu priméru umožňuje vyhnúť sa použitiu primérov špecifických pre imunoglobulíny. Získané klony cDNA majú dostatočnú dĺžku na klonovanie oblasti V. Ak predstavujú veľmi slabú frakciu celkovej cDNA, môže sa najprv uskutočniť amplifikácia, aby sa získalo dostatočné množstvo DNA na klonovanie. Preto sa cDNA kódujúce oblasti VH a VL amplifikujú oddelene. Použité priméry sú oligonukleotidy hybridizujúce na úrovni opačných koncov variabilných oblastí každého reťazca (H a L). Produkt amplifikácie používajúcej priméry špecifické pre ťažké reťazce a produkt amplifikácie používajúcej priméry pre ľahké reťazce sa potom purifikujú. Po purifikácii sa cDNA kódujúce oblasti VH a VL protilátky zložia do jedného reťazca pomocou nukleotidového ramena (L). Nukleotidové rameno sa skonštruovalo takým spôsobom, že jeden z koncov sa viaže na 3’ koniec cDNA kódujúcej oblasť VH a druhý na 5’ koniec cDNA kódujúcej oblasť VL. Sekvencia ramena kóduje peptid (G4S)3. Spojená sekvencia, okolo 700 bp, obsahuje vo forme fragmentu Ncol-NotI spojenie VH-L-VL, ktorých sekvencie sú uvedené napríklad v SEQ ID NO.: 1 a SEQ ID NO.: 2.

Nukleová kyselina podľa vynálezu je prednostne cDNA alebo RNA.

Nukleová kyselina podľa vynálezu je výhodne vybratá z:

a) celku alebo časti sekvencie SEQ ID NO.: 2 alebo jeho komplemetámeho vlákna,

b) každej sekvencie hybridizujúcej so sekvenciami (a) a kódujúcej ScFv schopnú špecificky viazať proteín p53 prednostne na úrovni oblasti C-konca,

c) variantov (a) alebo (b) vyplývajúcich s degenerácie genetického kódu.

Predložený vynález sa týka tiež každej expresnej kazety obsahujúcej takú nukleovú kyselinu, ako je už definovaná, promótor umožňujúci expresiu a signál terminácie transkripcie.

V postupe podľa vynálezu kyselina je výhodne vložená do buniek prostredníctvom vektora, ktorý umožňuje zvýšiť (i) účinok penetrácie buniek, (ii) cielenie a/alebo (iii) extra a intracelulámu stabilitu.

V spôsobe uskutočnenia konkrétne uprednostňovanom predloženým vynálezom je nukleová kyselina vložená do vektora, ktorý môže byť chemického pôvodu (lipozóm, nanočastica, peptidový komplex, lipidy alebo katiónové polyméry atď.), vírusového pôvodu (retrovirus, adenovírus, herpes vírus, AAV, vírus kiahní atď.) alebo plazmidového pôvodu.

Použitie vírusových vektorov vyplýva z prirodzených vlastností transfekcie vírusu. Tiež sa môže použiť adenovírus, herpes vírus, retrovirus a adeno-asociovaný vírus. Tieto vektory sa javia predovšetkým účinné pri transfekcii. Konkrétne ide o schopnosť adenovírusov a retrovírusov infikovať nádorové bunky, keď tvoria vektory vybraté v rámci predloženého vynálezu. Z tohto hľadiska v uprednostňovanom spôsobe uskutočnenia predloženého vynálezu je nukleová kyselina vložená vo forme retrovírusového vektora, konkrétne defektného rekombinantného retrovírusu, ktorého genóm obsahuje nukleovú kyselinu kódujúcu taký ScFv, ako je definované. V inom uprednostňovanom spôsobe uskutočnenia predloženého vynálezu nukleová kyselina je vložená vo forme adenovírusového vektora, konkrétne defektného rekombinantného adenovírusu, ktorého genóm obsahuje nukleovú kyselinu kódujúcu taký ScFv, ako je už definované.

Vektor podľa predloženého vynálezu môže byť tiež nevírusový činiteľ schopný sprostredkovať prenos a expresiu nukleových kyselín do eukaryotickej bunky. Chemické alebo biochemické vektory predstavujú zaujímavú alternatívu k prírodným vírusom, predovšetkým z dôvodu pohodlnosti, bezpečnosti a tiež neprítomností teoretického limitu týkajúce sa veľkosti prenášanej DNA. Tieto syntetické vektory majú dve základné funkcie: skompaktniť nukleovú kyselinu na transfekciu a podporiť jej bunkovú fixáciu rovnako ako jej prechod cez plazmatickú membránu, prípadne cez dve jadrové membrány. Na potlačenie polyaniónovej povahy nukleových kyselín nevírusové vektory majú všetky náboje polykatiónové. V uprednostňovanom spôsobe uskutočnenia predloženého vynálezu je vektor chemický alebo biochemický.

Predložený vynález sa týka tiež každej kompozície obsahujúcej aspoň jednu takú nukleovú kyselinu, ako je už definované.

Týka sa tiež každej kompozície obsahujúcej aspoň jeden taký vektor, ktorý je už definovaný.

Týka sa tiež každej kompozície obsahujúcej aspoň jednu takú ScFv, ktorá je už definovaná.

Týka sa tiež kompozícií obsahujúcich takú nukleovú kyselinu alebo vektor, ako sú už definované a nukleovú kyselinu alebo vektor kódujúci divý p53 pre súčasné kombinované použitie na použitie rozložené v čase.

Z dôvodov ich antiproliferatívnych vlastností farmaceutické kompozície podľa vynálezu sú všetky prispôsobené na liečenie takých hyperproliferatívnych chorôb, ako je konkrétne rakovina a restenóza. Predložený vynález predkladá tiež metódu osobitne účinnú na deštrukciu buniek, konkrétne hyperproliferatívnych buniek.

Môže sa použiť in vitro alebo ex vivo. V tom prípade spočíva konkrétne v inkubácii buniek v prítomnosti jednej alebo viacerých nukleových kyselín (alebo vektora, kazety alebo priamo ScFv). Môžu sa použiť dávky od 0,01 do 1 000 pg vektora na 10⁶ buniek alebo MOI od 0,1 až 1 000 pre vírusový vektor.

In vivo spočíva v podávaní aktívneho množstva vektora (alebo kazety) podľa vynálezu organizmu prednostne priamo na úrovni miesta ošetrenia (konkrétne nádoru). Z toho hľadiska je predmetom vynálezu deštrukcia hyperproliferatívnych buniek zahrnujúca skontaktovanie uvedených buniek alebo ich častí s takou nukleovou kyselinou, ako je už definovaná. Na použitie in vivo nukleová kyselina alebo vektor použité v predloženom vynáleze sa môže formulovať z pohľadu podávania topického, orálneho, parenterálneho, intranazálneho, intravenózneho, intramuskulámeho, podkožného, intraokulámeho, transdermálneho podávania atď. Nukleová kyselina alebo vektor sa používa najmä v injikovateľnej forme. Môže byť zmiešaný s každým farmaceutickým nosičom vhodným pre injikovateľnú formuláciu, konkrétne na injekciu priamo do miesta ošetrenia. Môže ísť konkrétne o sterilné izotonické roztoky alebo suché kompozície, konkrétne lyofilizované, ktoré po pridaní sterilnej vody alebo fyziologického séra, podľa potreby, umožňujú vytvorenie injikovateľnej formy. Priama injekcia nukleovej kyseliny do nádoru pacienta je zaujímavá, pretože umožňuje sústrediť terapeutický účinok priamo do poškodeného tkaniva. Dávky nukleovej kyseliny použité na injekciu sa môžu prispôsobiť rôznym parametrom, konkrétne funkcii génu, vektora, použitého spôsobu podávania, patológii alebo tiež dĺžke liečenia. Výhodne podávané dávky in vivo sú medzi 10⁶ až 10¹⁰ pfu/ml pre taký vírusový vektor, ako je adenovírus. Môže sa tiež použiť opakované podávanie.

V prípade in vivo sa môžu postup a molekuly podľa vynálezu použiť na štúdium mechanizmu účinku p53 a na určenie potenciálu ScFv na zvieracích modeloch.

Predložený vynález sa výhodne používa in vivo na deštrukciu buniek v hyperproliferácii (t. j. v nenormálnej proliferácii). Je tiež použiteľný na deštrukciu nádorových buniek alebo buniek hladkého svalstva vaskulámej steny (restenóza). Je prispôsobený najmä na liečenie rakovín, v ktorých je pozorovaný mutant p53. Napríklad sa môžu uviesť adenokarcinómy tračnika, rakoviny štítnej žľazy, karcinómy pľúc, myeloidné leukémie, rakoviny hrubého čreva, rakoviny prsníka, rakoviny pľúc, rakoviny žalúdka, rakoviny pažeráka, lymfómy B, rakoviny vaječníkov, rakoviny močového mechúra, glioblastómy, hepatokarcinómy, rakoviny kostí, kože, pankreasu alebo tiež rakoviny obličiek, prostaty, rakoviny pažeráka, rakoviny hrtanu, hlavy a krku, HPV pozitívne rakoviny genitálií, rakoviny nosohltanu EBV pozitívne, rakoviny, v ktorých je nadmerne exprimovaný bunkový proteín mdm2 atď.

Nasledovné obrázky a príklady bližšie ilustrujú vynález, pričom však v akomkoľvek smere neobmedzujú jeho rozsah.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázok 1: Stratégia výberu protilátky.

Obrázok 2: Dôkaz schopnosti protilátok indukovať oneskorenie p53 na géli.

Obrázok 3: Dôkaz schopnosti protilátok indukovať oneskorenie p53H273 na géli.

Obrázok 4: Dôkaz väzby ScFv s divým p53 metódou ELISA. Plné kolieska: IgG 11D3 (na začiatku 1 pg/ml); prázdne kolieska: IgG 421 (na začiatku 1 pg/ml); štvorčeky: polyklonálne biotinylované sérum (na začiatku 1 pg/ml); plné trojuholníky: ScFv llD3-myc (1/2); prázdne trojuholníky: (1/2); kosoštvorce: ScFv (anti-CD3,1/2).

Obrázok 5: Dôkaz oneskorenia na géli vyvolaného ScFv.

Obrázok 6: Obnovenie DNA väzbovej aktivity mutantov p53.

Obrázok 7: Expresia ScFv v bunkách H1299.

Obrázok 8: Obnova transkripčnej aktivity mutanta H273 v línii H358.

Obrázok 9: Obnova transkripčnej aktivity endogénneho mutanta H273 v línii HT29.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1: Získanie a triedenie protilátok 11D3

Tento príklad opisuje prípravu, získanie a selekciu monoklonálnych protilátok špecificky riadených proti proteínu p53 schopných aktivovať DNA väzbovú funkciu mutovaných foriem p53.

1.1 Získanie proteínov použitých pomocou imunízácie myší a triedenia hybridómov

Divý proteín p53 a rôzne proteíny P53H273, p53W248, p53G281 zodpovedajúce mutáciám divého p53 často sa vyskytujúcim v nádorových bunkách sa produkovali v hmyzích bunkách Spodoptera frugiperda Sf9 infikovaných rekombinantným bakulovírusom a purifikovali sa afinitne na agarózovom géli, na ktorom bola naviazaná polyklonálna protilátka pAb421 (Leveillard a kol., EMBO J. 15, 1615-1623 (1996)). Proteíny zodpovedajúce fragmentom 1-320 a 73-320 divého proteínu p53 sa produkovali tiež v hmyzích bunkách Spodoptera frugiperda Sf9 infikovaných rekombinantným bakulovírusom pri dodržaní podmienok daných firmou Invitrogen. Komplementárne DNA vložené do plazmidu na prenos pBlueBacIII sa vytvorili klasickými technikami rekombinantnej DNA opísanými napríklad v práci Sambrook a kol. (Sanibrook, Fritsch & Maniatis: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, druhé vydanie, 1989, Ed. Cold Spring Harbor Laboratory).

Získavanie a triedenie hybridómov

Myši sa imunizovali ekvimolámou zmesou troch už opísaných mutovaných proteínov p53 a hybridómy sa získali pri dodržaní postupu opísaného v práci Harlow at Lane (Harlow and Lane: Antibodies, A Laboratory Manual, 1988, Ed. Cold Spring Harbor Laboratory). Výber hybridómov produkujúcich monoklonálne protilátky cielené proti už opísaným mutovaným proteínom p53 sa uskutočnil metódou väzby protilátok produkovaných v kultivačnom médiu hybridómu v mikrotitračných platničkách z PVC s 96 jamkami, v ktorých sa dopredu imobilizoval 1 mikrogram ekvimolámej zmesi troch už opísaných mutovaných proteínov p53 pri dodržaní protokolu opísaného v práci Harlow at Lane (Harlow and Lane: Antibodies, A Laboratory Manual, 1988, Ed. Cold Spring Harbor Laboratory). Toto prvé triedenie umožnilo vybrať 317 pozitívnych hybridómov. Po dvoch týždňoch amplifikácie hybridómov sa supematanty amplifikovaných hybridómov v prvej etape znova preverili už uvedenou metódou väzby protilátok (metóda 1), potom sa triedili pomocou troch triediacich metód s rovnakým princípom ako uvedená metóda, s výnimkou toho, že imobilizované proteíny boli iné: v jamkách bol imobilizovaný buď purifikovaný divý proteín p53 (metóda 2), alebo proteínový extrakt buniek Sf9 produkujúcich fragment 1-320 divého p53 (metóda 3), alebo proteínový extrakt buniek Sf9 pro dukujúcich fragment 73-393 divého p53 (metóda 4). Proteínové extrakty sa získali lýzou zmrazením/rozmrazením buniek Sf9 vo fosfátovom pufri a potom odstredením rozbitých bunkových častí. Z 317 supematantov amplifikovaných hybridómov 162 nereagovalo v metóde 1. Zvyšných 155 bolo pozitívnych v metóde 2, z nich 33 (skupina A) bolo negatívnych v metódach 3 a 4, 115 (skupina B) bolo pozitívnych v metóde 3 a negatívnych v metóde 4, a nakoniec 7 (skupina C) bolo pozitívnych v dvoch metódach. Supematanty skupiny B zodpovedajúce supematantom, ktoré obsahujú protilátky, ktorých epitop sa nachádza v prvých 63 aminokyselinách proteínu p53. 77 supematantov tejto skupiny sa ukázalo ako negatívnych v metóde 2, keď sa predinkubovali s peptidom (1 mg/ml) zodpovedajúcim sekvencií prvých 40 aminokyselín proteínu p53. Určenie izotypov protilátok skupiny A, 38 protilátok skupiny B, ktoré zostali po eliminácii 77 už uvedených protilátok a protilátky skupiny C, nám umožnilo vylúčiť IgM. Tieto výsledky sú uvedené na obrázku 1.

Potom sa testovalo 42 protilátok na ich schopnosť indukovať super posun na komplexe p53/DNA. Po purifikácii na proteín A/Sepharose sa protilátky kvantifikovali. Retardačné pokusy na géli sa uskutočnili inkubáciou 30 ng purifikovaného proteínu p53 divého typu s DNA sondou značenou ³²P predstavujúcou sekvenciu špecificky sa viažucu na proteín p53. Potom sa pridalo 300 ng rôznych protilátok. Komplexy sa rozdelili na akrylamidovom géli.

Výsledky uvedené na obrázku 2 ukazujú, že 27 z týchto protilátok bolo schopných indukovať superposun. 19 protilátok z týchto 27 sa testovalo v rovnakom pokuse na géli s tým rozdielom, že divý typ proteínu p53 bol nahradený mutantom His237 (obrázok 3). Všetkých týchto 19 protilátok dalo pozitívny výsledok. Protilátky No. 29 spôsobujú výraznejšiu retardáciu ako ostatné. Tieto protilátky sa označili ako 11D3 a použili sa v nasledujúcich pokusoch.

Príklad 2: Získanie ScFv421 a D3M

ScFv sa získali z hybridómov klasickými technikami molekulovej biológie založenými na PCR pomocou degenerovaných primárov špecifických pre oblasti VH a VL. ScFv odvodená z protilátky 11D3 sa označil ako D3M. Jej sekvencia je uvedená v SEQ ID NO.: 2. Sekvencia ScFv421 je uvedená v SEQ ID NO.: 1.

Príklad 3: Konštrukcie expresného vektora ScFv

Tento príklad opisuje konštrukciu vektorov použiteľných na prenos nukleových kyselín predloženého vynálezu in vitro a in vivo.

3.1 Konštrukcie plazmidových vektorov

Na konštrukciu plazmidových vektorov sa použili 2 typy vektorov.

- Vektor pSV2 opísaný v DNA Cloning, A practical Approach Vol. 2, D.M. Glover (Ed.) IRL Press, Oxford, Washington DC, 1985. Tento vektor je eukaryotický expresný vektor. Nukleové kyseliny kódujúce ScFv sa vložili do tohto vektora vo forme fragmentov Hpal-EcoRV. Umiestnili sa tak pod kontrolu promótora zosilňovača („enhancera“) transkripcie vírusu SV40. Všetky konštrukcie opísané v príklade 2 sa vložili do tohto vektora, aby sa testovali v rôznych systémoch in vitro a in vivo.

- Vektor pCDNA3 (Invitrogen). Je to tiež eukaryotický expresný vektor. Nukleové kyseliny kódujúce ScFv podľa predloženého vynálezu sú umiestnené v tomto vektore pod riadením skorého promótora CMV. Všetky konštrukcie opísané v príklade 2 sa vložili do tohto vektora vo forme fragmentu HindlII/Notl.

3.2 Konštrukcia vírusových vektorov

Podľa charakteristického spôsobu uskutočnenia predložený vynález spočíva v konštrukcii a použití vírusových vektorov umožňujúcich prenos a expresiu in vivo takých nukleových kyselín, ktoré sú už definované.

Ide predovšetkým o adenovirusy, rôzne sérotypy, ktorých štruktúra a vlastnosti sa trošku líšia a ktoré boli charakterizované. Z týchto sérotypov sa v rámci predloženého vynálezu uprednostňuje použitie ľudských adenovirusov typu 2 alebo 5 (Ad2 alebo Ad5) alebo adenovirusov zvieracieho pôvodu (pozri prihláška vynálezu WO94/26914). Z adenovirusov zvieracieho pôvodu, ktoré sú použiteľné v rámci predloženého vynálezu, sa môžu uviesť adenovirusy psieho, hovädzieho, myšacieho pôvodu (napríklad: Mavl, Beard a kol., Virology 74 (1990) 81), ovčieho, prasacieho, vtáčieho alebo tiež opičieho pôvodu (napríklad: SAV). Z adenovirusov zvieracieho pôvodu sú konkrétne uprednostňované adenovirusy psie, konkrétne adenovírus CAV2 (napríklad: kmeň manhattan alebo A26/61 (ATCC VR-800)). V rámci predloženého vynálezu sa konkrétne používa adenovírus pôvodu ľudského, psieho alebo zmiešaného.

Defektne adenovirusy podľa predloženého vynálezu výhodne obsahujú ITR, sekvenciu umožňujúcu enkapsidáciu a nukleovú kyselinu podľa vynálezu. Ešte výhodnejšie v genóme adenovírusu podľa vynálezu je minimálne oblasť El nefunkčná. Uvažovaný vírusový gén môže byť zbavený funkčnosti všetkým odborníkom známymi technikami, konkrétne úplnou supresiou, substitúciou, čiastočnou deléciou alebo adíciou jednej alebo viacerých báz v uvažovanom alebo uvažovaných génoch. Tieto modifikácie sa môžu získať in vitro (na izolovanej DNA) alebo in situ napríklad prostredníctvom techník genetickej povahy alebo tiež pôsobením mutagénnych činidiel. Môžu sa modifikovať tiež iné oblasti genómu, konkrétne oblasť E3 (WO95/02697),

E2 (WO94/28938), E4 (WO94/28152, WO94/12649, WO95/02697, WO96/22378) a L5 (WO95/02697). Podľa uprednostňovaného spôsobu uskutočnenia adenovírus podľa predloženého vynálezu obsahuje deléciu v oblastiach E1 a E4. Podľa iného spôsobu realizácie obsahuje deléciu v oblasti El, v ktorej sú vložené oblasť E4 a sekvencie nukleových kyselín podľa vynálezu (pozri FR94/13355). Vo vírusoch podľa vynálezu delécia v oblasti El siaha výhodne od nukleotidu 455 po 3329 v sekvencii adenovírusu Ad5.

Rekombinantné defektné adenovírusy podľa vynálezu môžu byť pripravené všetkými odborníkom známymi technikami (Levrero a kol., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573, Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). Môžu byť pripravené konkrétne homoligickou rekombináciou medzi adenovírusom a plazmidom, ktorý nesie okrem iného želanú sekvenciu DNA. Homologická rekombinácia nastane po spoločnej transfekcii uvedených adenovírusov a plazmidov do vhodnej bunkovej línie. Použitá bunková línia musí prednostne (i) byť transformovateľná uvedenými elementmi a (ii) obsahovať sekvencie schopné komplementovať časť genómu defektného adenovírusu prednostne v integrovanej forme, aby sa zabránilo nebezpečenstvu rekombinácie. Ako príklad bunkových línií sa môže uviesť ľudská obličková embryonálna línia 293 (Graham a kol., J. gen. Virol. 36 (1977) 59), ktorá obsahuje konkrétne včlenenú do svojho genómu ľavú časť genómu adenovírusu Ad5 (12 %) alebo sa môžu uviesť línie schopné komplementovať funkcie El a E4 konkrétne opísané v prihláškach vynálezu WO94/26914, WO95/02697 a WO96/22378.

Adenovírusy, ktoré sa namnožili, sa získali a purifikovali klasickými technikami molekulovej biológie, ako je uvedené v príkladoch.

Čo sa týka adeno-asociovaných vírusov (AAV), sú to relatívne malé DNA vírusy, ktoré sa stabilne a stereošpecificky integrujú do genómu infikovaných buniek. Tieto vírusy sú schopné infikovať široké spektrum buniek bez toho, aby ovplyvnili rast, morfológiu alebo diferenciáciu buniek. Nezdá sa, že sú zahrnuté do patológií u ľudí. Genóm AAV vírusov sa klonoval, sekvenoval a charakterizoval. Obsahuje okolo 4 700 báz a obsahuje na každom konci obrátené repetície (ITR) so 145 bázami, ktoré sú počiatkom replikácie pre vírus. Zvyšok genómu je rozdelený na dve oblasti nesúce konkrétne funkcie enkapsidácie: ľavú časť genómu, ktorá obsahuje gén rep zahrnutý do replikácie vírusu a expresie vírusových génov, pravú časť genómu, ktorá obsahuje gén cap kódujúci kapsidové proteíny vírusu.

Použitie vektorov odvodených z AAV na prenos génov in vitro a in vivo sa opísalo v literatúre (pozri konkrétne WO91/18088, WO93/09239, US 4,797,368, US 5,139,941, EP 488 528). Tieto prihlášky vynálezov opisujú rôzne konštrukty odvodené z AAV, v ktorých gén rep a/alebo cap sú deletované a nahradené génom záujmu a opisujú ich použitie na prenos in vitro (na bunkovej kultúre) alebo in vivo (priamo v organizme) uvedeného génu záujmu. Defektný rekombinantný AAV podľa vynálezu sa môže pripraviť spoločnou transfekciou do bunkovej línie infikovanej pomocným ľudským vírusom (napríklad adenovírusom) plazmidu, ktorý obsahuje želanú nukleotidovú sekvenciu podľa vynálezu ohraničenú dvoma oblasťami obrátených repetícií (ITR) AAV a plazmidu, ktorý nesie gény enkapsidácie (gény rep a cap) AAV. Použiteľná bunková línia je napríklad línia 293. Získané rekombinantné AAV sa potom purifikujú klasickými technikami.

Čo sa týka herpes vírusov a retrovírusov, konštrukcia rekombinantných vektorov bola široko opísaná v literatúre: pozri konkrétne Breakfield a kol., New Biologist 3 (1991) 203, EP 453242, EP 178220, Bemstein a kol., Genet. Eng. 7 (19853) 235, McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689 atď. Retrovírusy sú konkrétne integratívne vírusy, selektívne infikujúce bunky pri bunkovom delení. Tvoria tak vektory záujmu pre rakovinové aplikácie. Genóm retrovírusu obsahuje konkrétne dve LTR, sekvenciu enkapsidácie a tri kódujúce oblasti (gag, pol. env). V rekombinantných vektoroch odvodených z retrovírusov, gény gag, pol a env sú všeobecne deletované, úplne alebo čiastočne, a nahradené želanou sekvenciou heterologickej nukleovej kyseliny. Tieto vektory sa môžu odvodiť z rôznych typov retrovírusov takých ako je konkrétne MoMuLV („murine moloney leukémia virus“, tiež označovaný ako MoMLV), MSV („murine moloney sarcoma vírus“), HaSV („harvey sarcoma virus“), SNV („spleen necrosis virus“), RSV (,,rous sarcoma virus“) alebo tiež Friendov vírus.

Aby sa vytvorili rekombinantné retrovírusy podľa vynálezu obsahujúce nukleovú kyselinu podľa vynálezu, vytvoril sa plazmid obsahujúci LTR, sekvenciu enkapsidácie a spomínanú nukleovú kyselinu a použil sa na transfekciu bunkovej línie, nazvanej enkapsidačná, schopnej vniesť do trans retrovírusové funkcie chýbajúce v plazmide. Všeobecne, enkapsidačné línie sú schopné exprimovať gény gag, pol a env. Takéto enkapsidačné línie boli už opísané, konkrétne línie PA317 (US 4,861,719), línia PsiCRIP (W090/02806) a línia GP+envAm-12 (W089/07150). Rekombinantné retrovírusy môžu mať modifikácie v LTR na potlačenie transkripčnej aktivity, ako aj v rozsiahlych enkapsidačných sekvanicách obsahujúcich časť génu gag (Bender a kol., J. Virol. 61 (1987) 1639). Produkované rekombinantné retrovírusy sa potom purifikujú klasickými technikami.

Na použitie predloženého vynálezu je mimoriadne výhodné použiť rekombinantný defektný adenovírus alebo retrovírus. Tieto vektory majú vlastnosti zaujímavé predovšetkým na prenos génov do nádorových buniek.

3.3 Chemické vektory

Z vyvinutých syntetických vektorov sa v rámci predloženého vynálezu prednostne používajú katiónové polyméry polylyzínového typu, (LKLKjn, (LKKLjn, polyetylénimín a DEAE-dextrán alebo tiež katiónové lipidy alebo lipofektanty. Tieto vektory majú schopnosť kondenzovať DNA a podporujú jej viazanie na bunkovú membránu. Z týchto naposledy menovaných vektorov sa môžu uviesť lipopolyamíny (lipofektamín, transfektam atď.), rôzne katiónové lipidy alebo neutrálne lipidy (DOTMA, DOGS, DOPE atď.), rovnako ako peptidy jadrového pôvodu. Okrem toho bol vyvinutý koncept cielenej transfekcie, sprostredkovanej pomocou receptora, ktorý využíva princíp kondenzácie DNA vďaka katiónovému polyméru s riadením fixácie komplexu k membráne vďaka chemickej väzbe medzi katiónovým polymérom a ligandom membránového receptora prítomného na povrchu bunky, ktorá sa má štepiť. Bolo opísané cielenie na receptor transferinu, inzulínu a receptor asialoglykoproteínov hepatocytov. Príprava farmaceutickej kompozície podľa predloženého vynálezu využívajúca spomínaný chemický vektor sa uskutočňuje podľa všetkým odborníkom známych techník, všeobecne jednoduchým uvedením rôznych zložiek do kontaktu.

Príklad 4: ScFv rozpoznáva p53

Spojenie ScFv sa overilo ELISA testom.

tag myc sa fuzoval s molekulami ScFv, aby sa umožnila ich detekcia. ScFv421,11D3 (D3M) a ScFv kontrola (anti-CD3) sa izolovali z periplazmy baktérií exprimujúcich tieto rôzne ScFv.

Plame ELISA pokryté purifikovaným p53 sa inkubovali s rôznymi riedeniami IgG 11D3, IgG 421, polyklonálnymbiotinylovanýmanti-p53 sérom, ScFv 11D3, ScFv 421 a ScFv anti-CD3.

Dva IgG sa potom detegujú sekundárnymi protilátkami anti-IgG spojenými s alkalickou fosfatázou. Biotinylované sérum sa deteguje extravidínom spojeným s alkalickou fosfatázou. ScFv sú detegované protilátkou 9E10 anti-myc, potom protilátkou anti-IgG spojenou s alkalickou fosfatázou. Kolorimetrické stanovenie aktivity alkalickej fosfatázy je znázornené na obrázku 4, ktorý naznačuje, že dve purifikované IgG, polyklonálne sérum a ScFv 421 a 11D3 rozpoznávajú p53, zatiaľ čo ScFv anti-CD3 je neaktívna.

Príklad 5: ScFv sú schopné indukovať superposun divého p53

Schopnosť ScFv aktivovať DNA väzbovú funkciu divého proteínu p53 sa testovala pokusmi retardácie na géli.

Duplex DNA predstavujúci miesto špecifickej väzby proteínu p53 sa označil s ³²P , potom inkuboval s purifikovaným divým p53 a rôznymi purifikovanými protilátkami alebo ScFv produkovanými v bakteriálnej periplazme. Komplexy sa rozdelili elektroforézou na akrylamidovom géli.

Získané výsledky sú uvedené na obrázku 5.

Komplex DNA/p53 sa pozoroval v línii „Basal“. Protilátky HR231, pAb421 a 11D3 sú schopné indukovať dostatočnú retardáciu (superposun) a zvýšiť množstvo komplexu DNA/p53.

ScFv 421 a D3M sú tiež schopné indukovať superposun, zatiaľ čo kontrolná ScFv anti-ras (Y28) ho neindukuje. ScFv 421 na rozdiel od ScFv D3M indukuje zvýšenie množstva komplexu p53/DNA.

Príklad 6: ScFv sú schopné opraviť funkciu DNA väzbovú funkciu mutantu proteínu p53.

Analogicky sa testovali ScFv na svoju schopnosť opraviť DNA väzbovú funkciu inaktívneho mutanta Trp248. Získané výsledky sú uvedené na obrázku 6.

Výsledky ukazujú, že dva ScFv indukujú objavenie sa retardovaného pásu zodpovedajúceho komplexu p53/DNA.

Príklad 7: ScFv sú správne exprimované v nádorových bunkách

Expresia ScFv sa overila prechodnou transfekciou expresného vektora (promótor SV40) do nádorových buniek H1299. Nukleové kyseliny sa podávali vo forme plazmidového vektora typu pSV2 (príklad 3) v prítomnosti katiónového lipidu, lipofektamínu.

Získané výsledky sú uvedené na obrázku 7. Westem prenosom celkového extraktu vznikne majoritný pás, ktorý migruje v oblasti okolo 30 kD, čo zodpovedá očakávanej veľkosti a potvrdzuje, že v nádorových bunkách sa exprimujú významné hladiny molekúl.

Príklad 8: ScFv sú schopné čiastočne opraviť transaktivačnú funkciu mutantov His273

Účinok týchto ScFv v nádorových bunkách na nedostatočnú transaktivačnú funkciu mutovaných foriem proteínu p53 sa meral nasledovným spôsobom:

Prechodné transfekcie sa uskutočnili v líniách H358 alebo H1299 (v oboch je deletovaný p53) alebo v línii HT29 (obsahujúcej mutantný p53 His 273). Tieto transfekcie vnášajú do buniek expresné vektory pre p53 divého typu alebo mutantov H273 alebo Hisl75, pre dva ScFv a reportérový plazmid obsahujúci gén CAT (chloramfenikolacetyltransferáza) pod riadením p53-závislého promótora. Aktivita CAT meraná 48 hodín po transfekcii je odrazom transaktivačnej funkcie proteínu p53.

Výsledky uvedené na obrázku 8 naznačujú, že v línii H358 sú dve ScFv schopné znova aktivovať významným spôsobom transkripčnú aktivitu mutanta His273. Uvedené výsledky sa získali v línii H1299.

Rovnako aj v línii HT29 sú dve ScFv schopné zvýšiť transkripčnú aktivitu endogénneho mutanta His273 (obrázok 9).

Zoznam sekvencii:

SEQ ID NO.l: Nukleotidová a peptidová sekvencia 421

1/1

CAG GTG	CAG	CTG	CAG	CAG	TCT	GGG	GCA	GAG
gin val	gin	leu	gin	gin	ser	gly	ala	glu
31/11
CTC GTG	AGG	TCA	GGG	GCC	TCA	GTC	AAG	TTG
leu val	arg	ser	gly	ala	ser	val	lys	leu
61/21
TCC TGC	ACA	GCT	TCT	GGC	TTC	AAC	ATT	AAA
ser cys	thr	ala	ser	gly phe	asn	ile	lys
91/31
GAC TAC	TAT	ATG	CAC	TGG	GTG	AAG	CAG	AGG
asp tyr	tyr	met	hys	trp	val	lys	gin	arg
121/41
CCT GAA	CAG	GGC	CTG	GAG	TGG	ATT	GGA	TGG
pro glu	gin	gly	leu	glu	trp	ile	giy	trp
151/51
ATT GAT	CCT	GAG	AAT	GGT	GAT	ACT	GAA	TAT
ile asp	pro	glu	asp	giy	asp	thr	glu	tyr
181/61
GCC CCG	AAG	TTC	CAG	GGC	AAG	GCC	ACT	ATG
ala pro	lys	phe	gin	gly	lys	ala	thr	met
211/71
ACT GCA	GAC	ACA	TCC	TCC	AAT	ACA	GCC	TAC
thr ala	asp	thr	ser	ser	asn	thr	ala	tyr
241/81
CTG CAG	CTC	AGC	AGC	CTG	GCA	TCT	GAG	GAC
leu gin	leu	ser	ser	leu	ala	ser	glu	asp
271/91
ACT GCC	GTC	TAT	TAT	TGT	AAT	TTT	TAC	GGG
thr ala	val	tyr	tyr	cys	asn	phe	tyr	giy

301/101 u

GAT GCT	TTG	GAC TAT TGG GGC CAA GGG ACC
asp ala 331/111	leu	asp	tyr	trp	gly gin	giy	thr
ACG GTC	ACC	GTC	TCC	TCA	GGT	GGA	GGC	GGT
thr val 361/121	thr	val	ser	ser	gly gly	gly gly
TCA GGC	GGA	GGT	GGC	TCT	GGC	GGT	GGC	GGA
ser gly 391/131	gly	gly	giy	ser	giy giy	gly	giy
TCG GAT	GTT	TTG	ATG	ACC	CAA	ACT	CCA	CTC
ser asp 421/141	val	leu	met	thr	gin	thr	pro	leu
ACT TTG	TCG	GTT	ACC	ATT	GGA	CAA	CCA	GCC
thr leu 451/151	ser	val	thr	ile	giy	gin	pro	ala
TCC ATC	TCT	TGC	AAG	TCA	AGT	CAG	AGC	CTC
ser Íle 481/161	ser	cys	lys	ser	ser	gin	ser	leu
TTG GAT	AGT	GAT	GGA	AAG	ACA	TAT	TTG	AAT
leu asp 511/171	ser	asp	giy	lys	thr	tyr	leu	asn
TGG TTG	TTA	CAG	AGG	CCA	GGC	CAG	TCT	CCA
trp leu 541/181	leu	gin	arg	pro	gly	gin	ser	pro
AAG CGC	CTA	ATC	TAT	CTG	GTG	TCT	AAA	CTG
lys arg 571/191	leu	ile	tyr	leu	val	ser	lys	leu
GAC TCT	GGA	GTC	CCT	GAC	AGG	TTC	ACT	GGC
asp ser 601/201	gly	val	pro	asp	arg	phe	thr	giy
AGT GGA	TCA	GGG	ACA	GAT	TTC	ACA	CTG	AAA
ser gly 631/211	ser	giy	thr	asp	phe	thr	leu	Lys
ATC AAC	AGA	GTG	GAG	GCT	GAG	GAT	TTG	GGA
íle asn	arg	val	glu	ala	glu	asp	leu	giy

661/221

GTT	TAT	TAT	TGC	TGG	CAA	GGT	ACA	CAT	TCT
val	tyr	tyr	cys	trp	gin	gly	thr	his	ser
691/231
CCG	CTC	ACG	TTC	AGT	GCT	GGC	ACC	AAG	CTG
pro	leu	thr	phe	gly	ala	gly	thr	lys	leu

721/241

GAA ATC AAA glu ile lys

SEQ ID NO.2: Nukleotidová sekvencia D3M

1/1

CAG GTC	AAG	CTG	CAG	GAG	TCA	GGG	GCA	GAA
gin val	lys	leu	gin	glu	ser	gly	ala	glu
31/11
CTT GTG	AGG	TCA	GGC-	GCC	TCA	GTC	AAT	TTG
leu val	arg	ser	gly	ala	ser	val	asn	leu
61/21
TCC TGC	ACA	GCT	TCT	GGC	TTC	AAC	ATT	AAA
ser cys	thr	ala	ser	gly	phe	asn	ile	lys
91/31
GAC TAC	TAT	ATG	CAC	TGG	GTG	AAA	CAG	AGG
asp tyr	tyr	met	his	trp	val	lys	gin	arg
121/41
CCT GAA	GAG	GGC	CTG	GAG	TGG	ATT	GGA	TAT
pro glu	glu	gly	leu	glu	trp	ile	giy	tyr
151/51
ATT GAT	CCT	GAG	AGT	GGT	GAA	ACT	GAA	TAT
ile asp	pro	glu	ser	gly glu	thr	glu tyr
181/61
GCC CCG	AAC	TTC	CAG	GGC	AAG	GCC	ACT	GTG
ala pro	asn	phe	.Sln		lys	ala	thr	val

211/71

ACT GCA GAC ACA TCC TCC AAC ACA GCC TAC

thr ala	asp	thr	ser	ser	asn	thr	ala	tyr
241/81
CTG CAC	CTC	AGC	AGC	CTG	ACA	TCT	GAG	GAC
leu his	leu	ser	ser	leu	thr	ser	glu	asp
271/91
ACA ACC	GTC	TAT	TAC	TGT	AAT	GCA	GTC	ATC
thr thr	val	tyr	tyr	cys	asn	ala	val	ile
301/101
TAC TAT	GAA	TAC	GAC	GGC	TAT	GCT	TTG	GAC
tvr tyr	glu	tyr	asp	gly tyr	ala	leu	asp
331/111
TAC TGG	GGC	CAA	GGG	ACC	ACG	GTC	ACC	GTC
tyr trp 361/121	giy	gin	giy	thr	thr	val	thr	val
TCC TCA	GGT	GGA	GGC	GGT	TCA	GGC	TGÄ	GGT
ser ser	gly	giy	giy	giy	ser	giy	giy	gly
391/131
GGC TCT	GGC	GGT	GGC	GGA	TCG	GAC	ATT	GAG
gly ser 421/141	gly	giy	giy	giy	ser	asp	ile	glu
CTC ACC	CAG	TCT	CCA	TCT	TCC	CTG	GCT	GTG
leu thr	gin	ser	pro	ser	ser	leu	ala	val
451/151
TCA GCA	GGA	GAG	AAG	GTC	GCT	ATG	AGC	TGC
ser ala	gly	glu	lys	val	ala	met	ser	cys
481/161
AAA TCC	AGT	CAG	AGT	CTG	TTC	AAC	AGT	AGA
lvs ser	ser	gin	ser	leu	phe	asn	ser	arg
511/171
ACC CGA	AAG	AAT	TAC	TTG	GCT	TGG	ΦΑΤ	CAG
thr arg 541/181	lys	asn	tyr	leu	ala	trp	tyr	gin
CAG AAA	CCA	GGG	CAG	TCT	CCT	AAA	GTG	CTG
gin lys	pro gly gin	ser	pro	lys	val	leu

571/191

ATC TAC TGG GCA TCC ACT AGG GAA TCT GGA ile tyr trp ala ser thr arg glu ser gly 601/201

GTC CCT	GAT	CGC	TTC	ACA	GGC	AGT	GAA	TGT
val pro	asp	arg	phe	thr	gly	ser	gly	ser
631/211
GGG ACA	GAT	TTC	ACT	CTC	ACC	ATC	AGC	AGT
gly thr	asp	phe	thr	leu	thr	ile	ser	ser
661/221
GTG CAG	GCT	GAA	GAC	CTG	GCA	GTT	TAT	TAC
val gin	ala	glu	asp	leu	ala	val	tyr	tyr
691/231

TGC AAG CAA TCT TAT AAT CTA CCG ACG TTC cys lys gin ser tyr asn leu pro thr phe

721/241

GGC GGG GGC ACC AAG CTG GAA ATC AAA gly gly gly thr lys leu glu ile lys

Claims (5)

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Použitie jednoreťazcovej protilátky schopnej špecificky viazať epitop prítomný vC-koncovej oblasti proteínu p53 medzi zvyškami 320 - 393 na prípravu farmaceutickej kompozície, ktorá je určená na liečbu rakovín, v ktorých je zahrnutý mutovaný proteín p53.

2.

5. Použitie podľa nároku 4, vyznačujúce sa tým, že nukleová kyselina je časťou vektora.

6. Použitie podľa nároku 5, vyznačujúce sa tým, že vektor je vírusový vektor.

7. Použitie podľa nároku 6, vyznačujúce sa tým, že vektor je defektný rekombinantný adenovírus.

8. Použitie podľa nároku 6, vyznačujúce sa tým, že vektor je defektný rekombinantný retrovírus.

9. Použitie podľa nároku 6, vyznačujúce sa tým, že vektor je defektný rekombinantný AAV.

10. Použitie podľa nároku 6, vyznačujúce sa tým, že vektor je defektný rekombinantný HSV.

11. Použitie podľa jedného z nárokov lažlO, vyznačujúce sa tým, že rakovinou je rakovina pľúc, hrubého čreva, hlavy a krku, pečene alebo mozgu.

12. Použitie podľa niektorého z nárokov 1 a 3, v y z n a č u j ú c e sa tým, že mutovaný proteín p53 je vybratý z proteínov p53H273, p53W248 a p53G281.

13. Molekula 11D3 reprezentovaná v sekvencii SEQ ID No. 2.

14. Nukleová kyselina kódujúca molekulu podľa nároku 13.

15. Nukleová kyselina podľa nároku 14, vyznačujúca sa sekvenciou SEQ ID NO. 2.

16. Kompozícia obsahujúca nukleovú kyselinu podľa nároku 15.

17. Kompozícia obsahujúca molekulu podľa nároku 13.

2. Použitie podľa nároku 1, v y z n a č u j ú c e sa tým, že jednoreťazcová protilátka je vybraná zo ScFv421 so sekvenciou SEQ ID NO. 1 a 11D3 so sekvenciou SEQ ID NO. 2.

3. Použitie nukleovej kyseliny kódujúcej jednoreťazcovú protilátku schopnú špecificky viazať epitop prítomný v C-koncovej oblasti proteínu p53 medzi zvyškami 320 - 393 na prípravu farmaceutickej kompozície, ktorá je určená na liečbu rakovín, v ktorých je zahrnutý mutovaný proteín p53.

4. Použitie podľa nároku 3, vyznačujúce sa tým, že nukleová kyselina kódujúca jednoreťazcovú protilátku je vybraná zo ScFv421 so sekvenciou SEQ ID NO. 1 a 11D3 so sekvenciou SEQ ID NO.

5 18. Farmaceutická kompozícia obsahujúca nukleovú kyselinu podľa nároku 14 a farmaceutický prijateľný nosič na liečenie rakovín.