NO326452B1 - Anvendelse av et enkeltkjede-antistoff eller en nukleinsyre som koder for dette for fremstilling av en farmasoytisk sammensetning for behandling av cancer hvor et mutert p53 protein er involvert, samt 11D3 molekylet og nukleinsyren som koder for dette og sammensetninger omfattende disse. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår anvendelse av et enkeltkjede-antistoff eller en nukleinsyre som koder for dette for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning for behandling av cancere hvor et mutert p53 protein er involvert, samt 11D3 molekylet og nukleinsyren som koder for dette og sammensetninger omfattende disse.

De nye molekylene i stand til spesifikt og effektivt å binde p53-proteinene og tillater videre å restaurere en p5 3-aktivitet i tumorceller. Molekylene ifølge oppfinnelsen er anvendelige in vitro eller ex vivo for å studere virkningsmekanismen av p53 og dens muterte former eller for å rense p53-proteiner. De oppviser videre anvendelser in vivo, særlig i terapeutiske tilnærmelser for restaurering av p53-aktiviteten ved patologiske kontekster som særlig cancere.

Vill-p53-proteinet intervenerer reguleringen av den cellulære cyklus og ved opprett-holdelsen av integriteten av cellens genom. Dette protein hvis prinsipale funksjon er å være en aktivator for transkripsjonen av visse gener, er, ved en ennu ikke kjent prosess, tilbøyelig til å blokkere cellen i Gl-fase av den cellulære cyklus under opptreden av mutasjoner under replikasjonen av genomet, og å utløse et antall DNA-reparasjonsprosesser. Når det i tillegg ved dårlig funksjonering av disse reparasjonsprosesser eller ved opptredenen av et for stort antall mutasjonshendelser til at disse skal kunne korrigeres, er dette proteinet i stand til å indusere fenomenet programmert celledød, kalt apoptose. På denne måte virker p53-proteinet som en tumorsuppressor, idet det eliminerer celler som anormalt er differensiert eller hvis genom er skadet.

Denne prinsipale funksjon til p53 avhenger av dens funksjon som transkripsjonsfaktor, sagt på en måte at den dobbelte evne til å gjenkjenne spesifikke sekvenser i det genomiske DNA og å rekruttere det generelle transkripsjonsmaskineri.

Protein p53 omfatter 393 aminosyrer som definerer 5 funksjonelle domener:

- Aktivatordomenet for transkripsjonen, bestående av aminosyrene 1 til 73, som er i stand til å binde visse faktorer av det generelle transkripsjonsmaskineri som protein TBP. Dette domenet er også sete for et antall post-translasjonelle modifikasjoner. Det er likeledes sete for tallrike interaksjoner mellom protein p53 og tallrike andre proteiner og særlig med det cellulære protein mdm2 eller proteinet EBNA5 fra Epstein-Barr-virusen (EBV), i stand til å blokkere funksjonen av villproteinet. Videre har dette domenet aminosyresekvenser kalt PEST med tilbøyelighet til proteolytisk nedbrytning. - Bindingsdomenet for DNA, lokalisert mellom aminosyrene 73 og 315. Konformasjonen av dette sentrale domenet av p53 regulerer gjenkjennelsen av spesifikke DNA-sekvenser av protein p53. Dette domenet er setet for to typer endringer som påvirker funksjonen til villproteinet: (i) Interaksjon med proteiner som blokkerer funksjonen av p53 som antigenet "stor T" av virusen SV40 eller virale proteiner E6 av virusen HPV16 og HPV18, som er i stand til å fremprosere dets nedbrytning via det ubikitine system. Denne sistnevnte interaksjon kan kun skje i nærvær av det cellulære protein E6ap (enzym E3 av ubikitineringskaskaden). (ii) Punktmutasjoner som påvirker funksjonen av p53 og i området der kvasitotali-teten er lokalisert. - Det nukleære lokaliseirngssignal bestående av aminosyrene 315 til 325, uunnværlige for god adressering av proteinet i det rom der det skal utøve sin prinsipale funksjon. - Oligomeriseirngsdomenet bestående av aminosyrene 325 til 355. Dette området 325 til 355 danner en struktur av typen; B-plate (326-334)-hårnål (335-336)-a-heliks (337-355). Endringer av funksjonene som er lokalisert i dette området skyldes i det vesentlige interaksjon av villproteinet med forskjellige mutante former som kan føre til variable effekter når det gjelder villproteinets funksjon. - Reguleringsdomenet bestående av aminosyrene 365 til 393, er setet for et visst antall post-translasjonelle modifikasjoner (glykosyleringer, fosforyleringer, RNA-fiksering, ) som modulerer funksjonen til proteinet p53 på positiv eller negativ måte. Dette domenet spiller en ekstremt viktig rolle ved moduleringen av aktiviteten til villproteinet.

Funksjonen til protein p53 kan forstyrres på forskjellige måter:

- Blokkering av dets funksjon ved et antall faktorer som for eksempel antigenet "stor T" av virusen SV40, proteinet EBNA5 av Epstein-Barr-virusen eller det cellulære protein mdm2. - Destabilisering av proteinet ved økning av dets tendens til proteolyse, særlig ved interaksjon med proteinet E6 av det humane papillomvirus HPV16 og HPV18, som favoriserer inntredenen av p53 i ubikitinileirngssyklusen. I dette tilfellet kan inter-aksjonen mellom de to proteiner kun skje ved forutgående fiksering av et cellulært protein, proteinet E6ap, hvis fikseringssete er lite kjent.

- Punktmutasjoner i genet av p53.

- Delesjon av en eller de to alleler av p53.

De to siste typer modifikasjoner gjenfinnes i ca. 50% av forskjellige typer cancer. I denne forbindelse berører mutasjonene av genet til p53 i de cancerøse celler en stor del av genet som koder for dette protein og har som resultat variable modifikasjoner av funksjonen av dette protein. Man kan imidlertid merke seg at mutasjonene for en stor majoritets vedkommende er lokalisert i den sentrale del av proteinet p53 om hvilken man vet at den er området for kontakt med spesifikke, genomiske sekvenser av proteinet p53. Dette forklarer hvorfor flesteparten av mutantene av proteinet p53 har det prinsipale karakteristikum at det ikke lenger kan feste seg til DNA-sekvensene som gjenkjenner villproteinet og derved ikke lenger kan utøve sin rolle som transkripsjonsfaktor. Videre synes visse mutanter å ha ervervet nye funksjoner som aktivering av visse gener på det transkripsjonene nivå.

Man grupperer i dag disse modifikasjoner i tre kategorier:

- Mutanter kalt små, der proteinet er et ikke-funksjonelt protein som, hår det gjelder mutasjon på en av de to alleler, ikke påvirker funksjonen av villproteinet som kodes av det andre allel. De hovedsakelige representanter for denne kategori er mutantene H273 og W248 der den sistnevnte er spesifikk for familiesyndromet av Li-Frameni hva angår hypersensibilitet for cancerøse affeksjoner. - Dominant negative mutanter der produktet er ucke-funksjonelt protein som, ved mutasjon på en av de to alleler og ved interaksjon med villproteinet, er i stand til å blokkere funksjonen av dette ved dannelse av ikke-aktive, blandede oligomerer som ikke lenger kan feste seg til DNA-sekvenser som er spesifikke for villproteinet. Den prinsipale representant for denne kategori er mutanten G281. - Dominante-onkogene mutanter hvis produkt er et protein som er i stand til på den ene side å blokkere funksjonen av villproteinet som mutantene av den foregående kategori og som på den annen side ved lite kjente mekanismer å favorisere tumor-utvikling, således oppvise en funksjonsgevinst. Hovedrepresentanten for denne kategori er mutanten H175.

Tatt i betraktning de anti-tumorale og apoptotiske egenskaper og implikasjonen i tallrike patologier av hyperproliferativ type, har villgenet p53 vært benyttet ved gen- og celle-terapianvendelser. Det har særlig vært foreslått for å behandle visse hyperproliferative patologier og særlig cancere ved administrering in vivo av villgenet p53 for restaurering av funksjonene til p53. Administreringen kan gjennomføres fortrinnsvis ved hjelp av virale vektorer og særlig adenovirale (WO 94/24297) eller retrovirale (WO 94/06910) vektorer. Det har således vært vist at innføringen av en nukleinsyre som koder for villproteinet p53 tillater partielt å restaurere en normal regulering av den cellulære vekst (Roth et al., "Nature Medicine", 2 (1996) 985). Alternative strategier basert på anvendelsen av kimere molekyler med egenskaper av typen p53, er også utviklet (PCT/FR96/01111).

En annen tilnærmelse for å restaurere funksjonene av villproteinet p53 er basert på reversjon av de endogene, muterte proteiner mot en vill-fenotype, det vil si som oppviser tumorsuppressor- og de apoptotiske egenskaper av vill-p53. Denne anvendelse er basert på påvisningen av at funksjonstapet for mutantene av p53 skyldes en konforma-sjonell endring av proteinet, indusert av mutasjonen(e). I denne forbindelse viser WO 94/12202 at et spesielt, monoklonalt antistoff, kalt pAb421, rettet mot proteinet p53, er i stand til å restaurere en spesiell klasse mutanter som hyppig er representert i humane cancere, bindingsfunksjonen av DNA in vitro. Anvendelsen av denne type forbindelse oppviser imidlertid betydelige mangler, særlig forbundet med den nødvendige høye mengde antistoff (og derved med de tilhørende problemer ved produksjon og rensing) og deres lave intracellulære penetrering.

Foreliggende oppfinnelse beskriver tilnærmelser for å oppnå høyere ytelse for å restaurere villegenskapene for en mutant av proteinet p53. Foreliggende oppfinnelse beskriver særlig konstruksjonen av ligander som er spesielt spesifikke for proteinet p53 med egenskaper som er fordelaktige ved restaurering av vill-p53-funksjonene.

Foreliggende oppfinnelse angår således anvendelse av et enkeltkjede-antistoff, som er i stand til å spesifikt binde en epitop som er tilstede i det C-terminale området av p53 mellom restene 320-393, for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning som er. ment for behandling av cancere hvor et mutert p53 protein er involvert.

I en foretrukket utførelsesform er enkeltkjede-antistoffer valgt blant ScFv421 med sekvens SEQ ID nr. 1 og 11D3 med SEQ ID nr. 2.

Oppfinnelsen angår videre anvendelse av en nukleinsyre, som koder for et enkeltkjede-antistoff som er i stand til å spesifikt binde en epitop som er tilstede i det C-terminale området av p53 mellom restene 320-393, for fremstilling av én farmasøytisk sammensetning som er ment for behandling av cancere hvor et mutert p53 protein er involvert.

I en foretrukket utførelsesform koder nukleinsyren for et enkeltkjede-antistoff valgt blant ScFv421 med sekvens SEQ ID nr. 1 og 11D3 med SEQ ID nr. 2.

I forhold til den kjente teknikks metoder oppviser dette molekyl betydelige fordeler og særlig mulighetene for å kunne uttrykkes in situ i en tumorcelle, i store mengder. Resultatene som vises nedenfor er desto mer uventede fordi med affinitetstap hyppig har vært observert mellom et klassisk antistoff og et ScFv. Videre har man i forbindelse med foreliggende oppfinnelse kunnet vise at det er mulig å uttrykke ScFv'er i egnede, intracellulære rom, noe som tillater å oppnå en optimal, biologisk aktivitet.

Oppfinnelsen beskriver konstruksjon, vektorisering og innføring i celler av et enkeltkjede-antistoff i stand til spesifikt å binde et mutert p5 3-protein. Enkeltkjede-antistoffene (ScFv) består i det vesentlige av et VH-område bundet til et VL-område via en arm. Konstruksjonen av ScFv og nukleinsyresekvenser som koder for slike modifiserte antistoffer er for eksempel beskrevet i US 4 946 778A eller i WO 94/02610 eller WO 94/29446, hvor til det vises når det gjelder detaljer.

Den viser likeledes at denne overføring in vivo tillater effektivt å restaurere bindingsaktiviteten for DNA av mutanter av p53 samt deres transaktivatoraktivitet.

Oppfinnelsen kan generelt anvendes på mutert p53-proteiner som helt eller delvis hiar mistet sin evne til å binde DNA og oppfinnelsens fremgangsmåte tillater å restaurere denne evne. Mere spesielt kan oppfinnelsens fremgangsmåte anvendes på muterte p53-proteiner som helt eller delvis har mistet funksjonen til den transkripsjonene faktor av p53 og den tillater å restaurere denne funksjon. Restaureirngsnivået kan være totalt eller partielt. Fortrinnsvis er det tilstrekkelig å tillate mutanten å utøve en tumorsuppressor-funksjon ved blokkering av den cellulære cyklus og/eller ved induksjon av apoptose. Ved oppfinnelsen tillates således i det minste partiell restaurering av en tumor-suppressoraktivitet i celler som oppviser endogene, muterte p53-proteiner, berøvet for denne aktivitet. Fortrinnsvis dreier det seg om muterte proteiner som er til stede i tumorceller. Som antydet ovenfor er forskjellige muterte former av proteinet p53 påvist i tumorale celler. Man kan for eksempel nevne proteinene p53H273, p53W248 og p53G281. Eksemplene nedenfor viser særlig at oppfinnelsens fremgangsmåte tillater å modifisere konformasjonen og de biologiske egenskaper for disse mutanter in vitro og in vivo. Særlig viser eksemplene at ScFv'ene 421 og 11D3 er i stand til å gi mutantene 273 og 248 tilbake deres evne til spesifikt å binde DNA og å indusere p53-avhengig transaktivering.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan gjennomføres in vitro, ex vivo eller in vivo. In vitro eller ex vivo kan fremgangsmåten og molekylene ifølge oppfinnelsen tillate for eksempel å studere virkningsmekanismen for p53 og dennes muterte former. Videre kan molekylene ifølge oppfinnelsen benyttes for detektering eller rensing av p53-proteiner, for eksempel ved kobling til en bærer, kontakt med en oppløsning inneholdende p53-proteinene eventuelt fulgt av en oppnåelse av de dannede komplekser eller en eluering. In vivo og særlig i mennesker kan man ved patologiske kontekster som hyperproliferative mangler der en aktivitetsdefekt for p53 er observert, restaurerer denne funksjon. I denne forbindelse kan oppfinnelsen benyttes i forbindelse med andre metoder som nevnt nedenfor (innføring av et vill-p53-gen) eller likeledes i forbindelse med en kjemoterapi (WO 96/22101). Fremdeles in vivo er fremgangsmåten og molekylene ifølge oppfinnelsen anvendbare i dyr, for eksempel for å bestemme ekspresjonsnivået for ScFv, og for å bedømme mulighetene for en mulig human terapi.

Fortrinnsvis er cellen som oppviser et mutert p53-protein en pattedyr tumorcelle. I denne forbindelse kan man mer spesielt nevne lungecancerceller (særlig ingen med små celler), videre cancer i colon, lever, hjerne, ansikt eller hals, og mer generelt enhver cancer der en mutert form av protein p53 er observert. Fortrinnsvis dreier det seg om en human tumorcelle der en mutant p53H273, p53W248 og/eller p53G281 er observert (lunge, colon, hjerne, ansikt og hals, lever). Anvendeligheten av disse for en spesiell celle kan lett bestemmes i henhold til følgende metodologi: Cellene karakteriseres ved nærværet av et mutert p53-protein. Dette protein blir så karakterisert for å bestemme arten av mutasjonen. Hvis det dreier seg om en kjent mutasjon og særlig det ovenfor nevnte repertoar, kan cellen ansees som tilgjengelig for behandling. Hvis det dreier seg om en ikke-repertoarisk mutasjon, er forskjellige tilnærmelser mulig. Det muterte protein-kan isoleres (eller syntetiseres kunstig) og testes som beskrevet i eksemplene med henblikk på oppførselen in vitro og in vivo i nærvær av ScFv. Dette tillater å identifisere den egnede ScFv for å restaurere de defektive funksjoner hos proteinet. En annen tilnærmelse ligger i direkte å teste ScFv'ene på en kultur av cellene for derved å bestemme ScFv'ets biologiske effektivitet.

For å gjennomføre oppfinnelsens fremgangsmåte blir den angjeldende ScFv med fordel innført i cellen in vitro, ex vivo eller in vivo i form av en vektor som bærer en nukleinsyre som koder for nevnte ScFv under kontroll av en funksjonell promoter i cellen.

Promoteren velges fortrinnsvis blant promotere som er funksjonelle i pattedyrceller og fortrinnsvis humane celler. Mer spesielt dreier det seg om en promoter som tillater ekspresjon av en nukleinsyre i en hyperproliferativ celle (cancerøs, restenose, og så videre). I denne forbindelse kan forskjellige promotere benyttes. Det kan for eksempel dreie seg om den egentlige promoter av genet p53. Det kan likeledes dreie seg om områder av forskjellig opprinnelse (ansvarlig for ekspresjonen av andre proteiner, eller også syntetiske). Det kan således dreie seg om en hvilken som helst promoter eller avledet sekvens som svakt eller sterkt stimulerer eller reprimerer transkripsjonen av et gen på eventuell spesifikk og eventuelt induserbar måte. Man kan særlig nevne promotersekvenser av eukaryote eller virale gener. For eksempel kan det dreie seg om promotersekvenser som stammer fra genomet av målcellen. Blant de eukaryote promotere kan man særlig benytte ubikitære promotere (promoteren for genet HPRT, PGK, a-actin, tubulin, og så videre), promotere for intermediære filamenter (promoter for genene GFAP, desamin, vimentin, neurofilamenter, keratin, og så videre), promotere for terapeutiske gener (for eksempel promoteren av genene MDR, CFTR, faktor VIII, ApoAI, og så videre), vevspesifikke promotere (promoteren for genet pyruvatkinase, villin, det intestinale bindingsprotein for fettsyrer, a-actin av glattmuskelen, og så videre) eller også promotere som responderer på en stimulus (reseptoren for steroide hormoner, reseptoren for retinonsyre, og så videre). Videre kan det dreie seg om promotersekvenser som stammer fra genomet av en virus, for eksempel promotrene av genene El A og MLP av adeno virus, den tidlige promoter av CM V eller også promoteren av LTR av RSV, og så videre. Videre kan promoterområdene være modifisert ved addisjon av sekvenser for aktivering, regulering eller som tillater en vevspesifikk eller majoritær ekspresjon.

Som antydet tidligere beskriver foreliggende oppfinnelse også nye molekyler med spesielt fordelaktige egenskaper for binding og reversering av muterte p53-proteiner. Oppfinnelsen beskriver mer spesielt konstruering, vektorisering og overføring i celler av spesielle ScFv (11D3,421). Nuklein- og peptidsekvensen for disse ScFv er angitt som SEQ ID nr. 1 og 2. Eksemplene nedenfor viser den spesielt fordelaktige kapasitet for disse molekyler (i) med henblikk på spesifikt å binde seg til muterte p53-proteiner i det C-terminale området,

(ii) å gi disse muterte proteiner evnen til å binde DNA og

(iii) å gi disse proteiner evnen til å aktivere transkripsjonen.

Eksemplene viser videre at molekylene eksprimere korrekt i tumorcellene, noe som tillater deres fordelaktige anvendelse innenfor konteksten av hyperproliferative til-stander. Videre kan egenskapene for ScFv ifølge oppfinnelsen forbedres. Særlig er det kjent at affiniteten for ScFv influeres av CDR-områdene (understreket i sekvensen) og kan forbedres ved rutineforsøk med mutagenese/seleksjon. Således er for eksempel mutagenesen på antistoffene beskrevet av Marks et al. ("Bio/Technology", 10, 779-783, 1992) og av G. Winter og C. Milstein ("Nature", 349,293-299,1991). De teknologier som er beskrevet i disse referanser kan anvendes for fremstilling av varianter av ScFv med en modifisert affinitet. Seleksjonen kan derefter gjennomføres de betingelser som er beskrevet i eksemplene.

Foreliggende oppfinnelse angår videre molekylet 11D3 hvis peptidsekvens er gitt som SEQ ID nr. 2.

Foreliggende oppfinnelse angår videre en hvilken som helst nukleinsyre som koder for ScFvl 1D3.1 en utførelsesform er nukleinsyren representert ved SEQ ID nr. 2.

Nukleinsyrene ifølge oppfinnelsen kan være en ribonukleinsyre (RNA) eller desoksy-ribonukleinsyre (DNA). Fortrinnsvis er det en komplementær DNA (cDNA). Den kan være av human, animalsk, viral, syntetisk eller semisyntetisk opprinnelse. Den kan oppnås på forskjellige måter og særlig ved kjemisk syntese under anvendelse av sekvenser som vist og for eksempel en nukleinsyresyntetisør. Den kan likeledes oppnås ved avsøking av banker ved hjelp av spesifikke sonder, særlig som beskrevet nedenfor. Den kan likeledes oppnås ved blandede teknikker inkludert kjemisk modifikasjon (for-lengelse, delesjon, substitusjon, og så videre) av sekvensene som er søkt ut fra bankene. Rent generelt kan nukleinsyrene ifølge oppfinnelsen fremstilles i henhold til en hvilken som helst teknikk som er kjent for fagmannen, det skal særlig vises til de teknologier som er beskrevet i US 4 946 778 samt WO 94/02610. En klassisk strategi for konstruksjon av nukleinsyrer som koder for en ScFv er som følger: Den angjeldende cDNA som koder områdene VH og VL oppnås fra hybridomen som produserer det valgte antistoff anti-p53. For dette formål blir den totale RNA fra hybridomen ekstrahert og underkastet en invers transkripsjonsreaksjon under anvendelse av vilkårlige heksamerer som sonder. Anvendelsen av denne type sonde tillater å unngå anvendelsen av sonder som er spesifikke for immunoglobuliner. De oppnådde cDNA-kloner har en lengde som er tilstrekkelig for å klone V-områdene. Når de representerer en kun liten del av de totalt tilstedeværende cDNA, kan en forutgående forsterkningsreaksjon gjennomføres for å produsere tilstrekkelig DNA for kloning. For dette blir cDNA'er som koder for områdene VH og VL forsterket separat. De benyttede sonder er oligonukleotider som hybriderer ved endene motsatt de variable områder av hver kjede (H og L). Forsterk-ningsproduktet som anvender de spesifikke sonder for de tunge kjeder og forsterk-ningsproduktet som anvender de spesifikke sonder for de lette kjeder, blir derefter renset. Efter rensing blir cDNA'ene som koder for områdene VH og VL av antistoffet satt sammen til en enkelt kjede ved hjelp av en nukleotidisk arm (L). Den nukleotidiske arm er konstruert slik at en av endene binder seg til 3'-enden av cDNA'en som koder for VH-området og den andre til 5'-enden av cDNA'en som koder for VL-området. Sekvensen for armen koder for peptidet (G4S)3. Den sammensatte sekvens på ca. 700 pb inneholder, i form av et Ncol-Notl-fragment, oppkjedingen VH-L-VL der sekvensene er vist ved for eksempel SEQ ID nr. 1 og 2.

Fortrinnsvis er nukleinsyren ifølge oppfinnelsen en cDNA eller en RNA.

Nukleinsyren ifølge oppfinnelsen kan være inneholdt i enhver ekspresjonskassett også omfattende en promoter som tillater dens ekspresjon og et termineringssighal for transkripsjonen.

Nukleinsyren innføres fortrinnsvis i cellene ved hjelp av en administreringsvektor som tillater å forbedre

(i) effektiviteten ved den cellulære penetrering,

(ii) søkingen og/eller

(iii) den ekstra- og intracellulære stabilitet.

Fortrinnsvis blir nukleinsyren innarbeidet i en vektor som kan være av kjemisk opprinnelse (liposom, nanopartikkel, komplekst peptid, lipider eller kationiske polymerer, og så videre), viral opprinnelse (retrovirus, adenovirus, herpes-virus, AAV, vaksinevirus, og så videre) eller plasmidisk opprinnelse.

Anvendelsen av virale vektorer er basert på deres naturlige egenskaper for transfeksjon av virusene. Det er således mulig for eksempel å benytte adenoviruser, herpes-viruser, retroviruser og adeno-assosierte vimser. Disse vektorer har vist seg særlig velegnet når det gjelder transfeksjon.

Særlig gjør adenovirusenes og retrovirusenes evne til å infektere tumorale celler disse vektorer til valget innenfor rammen av oppfinnelsen. I denne forbindelse og i en foretrukket utførelsesform blir nukleinsyren innført i form av en retroviral vektor, det vil si en defektiv, rekombinant retrovirus hvis genom omfatter en nukleinsyre som koder for ScFv som definert ovenfor. I en annen foretrukket utførelsesform blir nukleinsyren innført i form av adenoviral vektor, det vil si en defektiv, rekombinant adenovirus, hvis genom omfatter en nukleinsyre som koder for en ScFv som definert ovenfor. Vektoren kan også være en defekt rekombinant AAV eller HS V.

Vektoren kan likeledes være et ikke-viralt middel som er i stand til å fremme overføring og/eller ekspresjon av nukleinsyrer i eukaryotiske celler. De kjemiske eller biokjemiske, syntetiske eller naturlige vektorer representerer et interessant alternativ til naturlige vimser og særlig av hensiktsmessighets- og sikkerhetsgrunner og likeledes ved fravær av den teoretiske grense når det gjelder størrelsen av det DNA som skal transfekteres. Disse syntetiske vektorer har to prinsipale funksjoner, nemlig å kompaktere nukleinsyren som skal transfekteres og å fremme dens cellulære fiksering samt å sikre den gjennomgang gjennom det plasmidiske membran og eventuelt gjennom de to nukleære membraner. For å bøte den polyanioniske art av disse nukleinsyrer har de ikke-virale vektorer alle polykationiske ladninger. I en spesiell utførelsesform av oppfinnelsen er vektoren en kjemisk eller biokjemisk vektor.

Oppfinnelsen angår likeledes en sammensetning omfattende nukleinsyren som definert ifølge oppfinnelsen.

Oppfinnelsen angår likeledes en sammensetning som omfatter 11D3 molekylet ifølge oppfinnelsen.

Oppfinnelsen angår likeledes en farmasøytisk sammensetning, omfattende en nukleinsyre ifølge oppfinnelsen og en farmasøytisk akseptabel bærer, for behandling av cancere.

På grunn av antiproliferative egenskaper er de farmasøytiske preparater ifølge oppfinnelsen alle særlig tilpasset for behandling av hyperproliferative mangler som særlig cancere og restenose.

Basert på foreliggende oppfinnelse er det utviklet en særlig effektiv metode for destruering av celler og særlig hyperproliferative celler. Den kan benyttes in vitro eller ex vivo. I dette tilfellet består den særlig i å inkubere cellene i nærvær av en eller flere nukleinsyrer (eller en vektor, eller kassett, eller direkte ScFv). Det kan benyttes doser på 0,01 til 100 ug vektor pr. IO<6> celler, eller en MOI på 0,1 til 1000 for en viral vektor.

In vivo omfatter den å administrere til organismen en aktiv mengde av en vektor (eller en kassett), fortrinnsvis direkte i det setet som skal behandles (særlig tumor). Videre kan hyperproliferative celler destrueres ved å bringe cellene eller en del derav i kontakt med en nukleinsyre som definert ovenfor. For en in vivo-anvendelse kan nukleinsyren eller vektoren som benyttes formuleres med henblikk på administrering ad topisk, oral, parenteral, intranasal, intravenøs, intramuskulær, subkutan, intraokulær eller transder-mal vei eller på annen måte. Fortrinnsvis blir nukleinsyren eller vektorer benyttet i injiserbar form. Den kan således blandes med en hvilken som helst farmasøytisk akseptabel bærer for en injiserbar formulering, særlig for en injeksjon direkte i setet som skal behandles. Det kan særlig dreie seg om sterile, isotone oppløsninger eller tørkede preparater og særlig lyofiliserte slike som ved tilsetning enten av sterilisert vann og fysiologiske serum tillater konstituering av injiserbare materialer. En direkte injeksjon av nukleinsyren i pasientens tumor er interessant fordi dette tillater å konsentrere den terapeutiske effekt i de påvirkede vev. Nukleinsyredosene som benyttes kan til-passes som funksjon av forskjellige parametere og særlig som funksjon av gen, vektor, benyttet administreirngsmåte, angjeldende patologi og også tilsiktet behandlings-varighet. Fortrinnsvis administreres dosene in vivo i mengder på mellom IO<6> og 10<10 >pfu for en viral vektor som en adenovirus. Videre kan det gjennomføres repeterte administreringer.

Molekylene og anvendelsene ifølge oppfinnelsen kan benyttes til å studere virkningsmekanismen for p53 og for å bestemme potensialet av ScFv på dyremodeller.

Foreliggende oppfinnelse benyttes med fordel in vivo for destruering av celler under hyperproliferering (det vil si anormal proliferering). Den er i stand til å destruere tumorceller eller glattmuskelceller av den vaskulære vegg (restenose). Oppfinnelsen er meget spesielt egnet for behandling av cancere, der det observeres en mutant av p53. Som et eksempel kan man nevne colon-adenokarsinomer, thyroid-cancere, lungekarsinomer, myeloide leukemier, colorektale cancere, nyrecancere, lungecancere, gastriske cancere, oesofagcancere, B-lymfomer, ovariecancere, blaerecancere, glioblastomer, hepatokarsi-nomer, cancere i knokler og hud, pankreas eller også nyre- og prostatacancere, oesofage cancere, strupecancere, cancere i ansikt eller hals, ano-genitale cancere, HPV-positive, nasofarynks EBV-positive cancere, cancere der det cellulære mdm2-protein er overeksprimert, og så videre.

Foreliggende oppfinnelse skal beskrives i større detalj under henvisning til eksemplene nedenfor og under samtidig henvisning til de vedlagte figurer, der:

Figur 1 viser strategien for screening av antistoffer,

figur 2 påviser antistoffenes evne til å indusere en tilbakeholdelse av p53 på gelen,

figur 3 påviser antistoffenes evnet il å indusere en tilbakeholdelse av p53H273 på

gelen,

figur 4 påviser ved ELISA assosiasjonen av ScFv med vill-p53. Fylte sirkler: IgG

11D3 (1 ug/ml ved start); tomme sirkler: IgG 421 (1 ug/ml ved start);

kvadrater: biotinylert polyklonalt serum (1 ug/ml ved start); fylte triangler: ScFv HD3-myc (ved halvparten av start); tomme triangler: ScFv 421-myc

(ved halvparten av start); innrammede kryss: irrelevant ScFv (anti-CD3, ved halvparten av start),

figur 5 påviser forsinkelser på gel indusert ved ScFv'er,

figur 6 viser restaureringen av aktiviteten av bindingen av DNA til p53-mutanter,

figur 7 viser ekspresjonen av ScFcv421 i H1299-celler,

figur 8 viser restaureringen av den transkripsjonene aktivitet av mutanten H273 i

linjen H358, og

figur 9 viser restaureringen av den transkripsjonelle aktivitet av den endogene mutant H273 i linje HT29.

EKSEMPLER

Eksempel 1: Oppnåelse og screening av antistoff 11D3

Dette eksempel beskriver fremstilling, oppnåelse og seleksjon av monoklonalt antistoff rettet spesifikt mot proteinet p53, i stand til å aktivere bindingsfunksjonen til DNA av de muterte former av p53.

1. 1. Oppnåelse av proteiner som ben<y>ttes for immunisering av mus og screening av

hvbridomer.

Villproteinet p53 og forskjellige proteiner p53H273, p53W248, p53G281 som tilsvarer mutasjoner av vill-p53 som hyppig gjenfinnes i tumorale celler fremstilles i celler av insekter Spodoptera frugiperda Sf9, infektert med en rekombinant baculovirus og renset ved affinitet på en agarosegel på hvilken det er koblet polyklonalt antistoff PAb421 (Leveillard et al., "EMBO J.", 15,1615-1623 (1996)). Proteinene som tilsvarer fragment 1 til 320 og 73 til 320 av villproteinet p53 fremstilles likeledes i celler av insektene Spodoptera frugiperda Sf9, infektert med en rekombinant baculovirus i henhold til de instruksjoner som gies av firma Invitrogen. De komplementære DNA'er som skytes inn i overføringsplasmidet pBlueBacIII genereres ved klassiske teknikker for rekombinant DNA som for eksempel beskrevet av Sambrook et al. (Sambrook, Fritsch & Maniatis: "Molecular cloning, a laboratory manual", 2. utgave, 1989, Ed. Cold Spring Harbor Laboratory).

1. 2. Oppnåelse og screenin<g> av hvbridomer.

Musene immuniseres med en ekvimolar blanding av de tre ovenfor beskrevne mutante proteiner av p53 og hybridomene oppnås ved å følge operatoriske protokoller som beskrevet av Harlow & Lane i "Antibodies, a laboratory manual", 1988, Ed. Cold Spring Harbor Laboratory. Seleksjonen av hybridomene som produserer de mono-klonale antistoffer rettet mot de mutante proteiner av p53 som beskrevet ovenfor reali-seres ved metoden med innfanging av antistoffer produsert i kulturmediet for hybridomene i brønner på 96 brønners plater av PVC i hvilke det på forhånd er immobilisert en mengde på 1 mikrogram av den ekvimolare mengde av de tre mutante proteiner av p53 som beskrevet ovenfor i henhold til den operatoriske protokoll som beskrevet av Harlow & Lane i "Antibodies, a laboratory manual", 1988, Ed. Cold Spring Harbor Laboratory. Denne første screening tillater å selektere 317 positive hybridomer. Efter 2 ukers dyrkning av hybridomene blir supernatantene fra de dyrkede hybridomer i et første trinn reevaluert ved metoden (metode 1) for innfanging av antistoffene som nevnt ovenfor og deretter klassifisert under anvendelse av tre identiske screeningsmetoder som i prinsippet er identiske med den som er nevnt ovenfor bortsett fra at arten av de immobiliserte proteiner er forskjellig: i brønnene immobiliseres enten (metode 2) det rensede villprotein p53, eller (metode 3) en proteinekstrakt av Sf9-celler som produserer fragmentet 1 til 320 av vill-p53, eller (metode 4) en proteinekstrakt av celler Sf9 som produserer fragmentet 73 til 393 av vill-p53. Proteinekstraktene oppnås ved lysering med fryse/tine-sykluser i en fosfatbuffer av Sf9-celler og etterfølgende ultrasentrifu-gering av cellerester. Av de 317 hybridomsupernatanter responderer 162 ikke i metode 1. De resterende 155 er alle positive i metode 2 og blant disse er 33 (gruppe A) negative i metodene 3 og 4,115 (gruppe B) er positive i metode 3 og negative i metode 4 og til slutt er 7 (gruppe C) positive i de to metoder. Supernatantene fra gruppe B tilsvarer supernatanter inneholdende et antistoff hvis epitop befinner seg i de 73 første aminosyrer av p53. 77 supernatanter av denne gruppe viser seg negative i metode 2 når de preinkuberes med peptidet (1 mg/ml) som tilsvarer sekvensen av de første 40 aminosyrer av p53. En isotyping av antistoffene fra gruppe A, de 38 antistoffer fra gruppe B som var tilbake etter eliminering av de 77 som er nevnt ovenfor og de i gruppe C, har tillatt å eliminere IgN<T>ene. Disse resultater er rekapitulert i figur 1. 42 antistoffer blir deretter testet med henblikk på deres evne til å indusere et superskift på et p53/DNA-kompleks. Etter rensing på protein A/Sepharose blir antistoffene kvanti-fiserte. Forsøk med tilbakeholding på gel gjennomføres ved inkubering av 30 ng p53-protein av renset villtype med en P-merket DNA-probe viser en spesifikk fiksenngs-sekvens for p53. 300 ng av forskjellige antistoffer tilsettes deretter. Produktene oppløses på akrylamidgel.

Resultatene i figur 2 viser at 27 av disse antistoffer er i stand til å indusere et superskift. 19 blant de 27 har vært testet ved å substituere mutanten His273 for villproteinet p53 i den samme geltilbakeholdelsesprøve (figur 3). Disse 19 antistoffer ga alle positive resultater. Antistoff nr. 26 viste en mer utpreget tilbakeholding enn de andre. Dette antistoff kalles 11D3 og benyttes ved resten av forsøkene.

Eksempel 2: Oppnåelse av ScFv'ene 421 og D3M

ScFv'ene oppnås fra hybridomer ved klassiske teknikker innen molekylærbiologien basert på PCR ved hjelp av prober som er spesifikk degenerert i områdene VH og VL. Den ScFv som er avledet fra antistoffene 11D3 kalles D3M. Sekvensen er vist som SEQ ID nr. 2. Sekvensen av ScFv421 er vist som SEQ ID nr. 1.

Eksempel 3: Konstruksjon av ekspresjonsvektorer for ScFv

Dette eksempel beskriver konstruksjonen av vektorer som kan benyttes for overføring av nukleinsyrene ifølge oppfinnelsen in vitro eller in vivo.

3. 1. Konstruksjon av plasmidiske vektorer.

For konstruksjonen av plasmidiske vektorer benyttes det to typer vektorer.

Vektoren pSV2, beskrevet i "DNA-Cloning, A practical approach", vol. 2, D.M. Glover (Ed.), IRL Press, Oxford, Washington DC, 1985. Denne vektor er en eukaryotisk ekspresjonsvektor. Nukleinsyrene som koder for ScFv'ene skytes inn i denne vektor i form av Hpal-EcoRV-fragmenter. De anbringes så under kontroll av enhancer-promoteren av SV40-virusen. Alle konstruksjonene som er beskrevet i eksempel 2 innføres i denne vektor for utprøving i de forskjellige systémer for evaluering in vitro og in vivo.

Vektoren pCDNA3 (Invitrogen). Det dreier seg likeledes om en eukaryot ekspresjonsvektor. Nukleinsyrene som koder for ScFv'ene ifølge oppfinnelsen blir så plassert i denne vektor under kontroll av den tidlige promoter av CMV. Alle konstruksjonene som beskrevet i eksempel 2 innføres i denne vektor i form av et HindTfl/Notl-fragment.

3. 2. Konstruksjon av virale vektorer

I henhold til en spesiell utførelsesform ligger oppfinnelsen i konstruksjon og anvendelse av virale vektorer som tillater overføring og ekspresjon in vivo av nukleinsyrer som beskrevet ovenfor.

Når det særlig dreier seg om adenoviruser, er forskjellige serotyper, hvis struktur og egenskaper varierer noe, karakterisert. Blant disse serotyper foretrekker man innenfor rammen av oppfinnelsen å benytte de humane adenoviruser av type 2 eller 5 (Ad2 eller Ad5) eller adenoviruser av animalsk opprinnelse (se WO 94/26914). Blant adenoviruser av animalsk opprinnelse som kan benyttes innenfor rammen av oppfinnelsen kan man nevne adenoviruser av canine, bovin, murin (eksempel: Mavl, se Beard et al. i "Virology", 75 (1990) 81), ovin, porcin, aviær eller også simien (for eksempel: SAV) opprinnelse. Fortrinnsvis er adenovirusen av animalsk opprinnelse en canine-adenovirus og aller helst en adenovirus CAV2 (for eksempel stamme manhattan eller A26/61

(ATCC VR-800)). Fortrinnsvis benytter man innenfor rammen av oppfinnelsen adenoviruser av human eller av canine opprinnelse eller av blandet opprinnelse.

Fortrinnsvis omfatter de defektive adenoviruser ITR'ene, en sekvens som tillater enkapsidering og en nukleinsyre ifølge oppfinnelsen. Aller helst er, i genomet til adenovirus, i det minste området £1 ikke funksjonelt. Det angjeldende virale gen kan gjøres ildce-funksjonelt ved en hvilken som helst teknikk som er kjent for fagmannen og særlig ved total suppressjon, substitusjon, partiell delesjon eller addisjon av en eller flere baser i det eller de angjeldende gener. Slike modifikasjoner kan oppnås in vitro (på den isolerte DNA) eller in situ, for eksempel ved genteknologi, eller også ved behandling med mutagene midler. Andre områder kan likeledes modifiseres og særlig området E3 (WO 95/02697), E2 (WO 94/28938), E4 (WO 94/28152, WO 94/12649, WO 95/02697, WO 96/22378) og L5 (WO 95/02697). I henhold til en foretrukket utførelses-form omfatter adenovirusen en delesjon i områdene El og E4.1 henhold til en annen foretrukket utførelsesform omfatter den en delesjon i området El i hvilket det er skutt inn området E4 og nukleinsyren ifølge oppfinnelsen (WO 96/13596). I virusen løper delesjonen i området El fortrinnsvis fra nukleotidene 455 til 3329 i sekvensen av adenovirusen Ad5.

De defektive, rekombinante adenoviruser kan fremstilles ved en hvilken som helst teknikk som er kjent for fagmannen (Levrero et al., "Gene", 101 (1991), 195; EP 185 573; Graham, "EMBO J", 3 (1984) 2917). Særlig kan de fremstilles ved homolog rekombinasjon mellom en adenovirus og et plasmid som blant annet bærer DNA-sekvensen av interesse. Den homologe rekombinasjon skjer efter kotransfeksjon av adenovirusen og plasmidet i en egnet cellelinje. Cellelinjen som benyttes må fortrinnsvis (i) være transformerbar med elementene og (ii) omfatte sekvensene som er i stand til å komplementere delen av genomet av den defektive adenovirus, fortrinnsvis i integrert form for å unngå risiki for rekombinasjon. Som eksempel på linje kan man nevne den humane embryo-nyrelinje 293 (Graham et al., "J. Gen. Virol.", 36 (1977) 59) som særlig, integrert i sitt genom, inneholder den venstre del av genomet av en adenovirus Ad5 (12%) eller linjer som er i stand til å komplementere funksjonene El og E4 som særlig beskrevet i WO 94/26914, WO 95/02697 og WO 96/22378.

Til slutt blir de multipliserte adenoviruser gjenvunnet og renset i henhold til klassiske teknikker i molekylærbiologien som vist i eksemplene.

Når det gjelder de adeno-assosierte viruser (AAV), dreier det seg om vimser med rela-tivt redusert størrelse som integrerer seg i genomet til cellene de infekterer på stabil og setespesifikk måte. De er i stand til å infektere et stort spektrum celler uten å indusere virkning på vekst, morfologi eller celledifferensiering. De synes heller ikke å være implisert i patologier hos mennesker. Genomet av AAVer er klonet, sekvensert og karakterisert. Det omfatter ca. 4700 baser og inneholder ved hver ende et inverst repetert område (ITR) på ca. 145 baser og som tjener som replikasjonsopprinnelse for virusen. Resten av genomet er delt i to områder som i det vesentlige bærer enkapsi-deringsfunksjonene: den venstre del av genomet som inneholder genet rep som er implisert i den virale replikasjon og ekspresjonen av virale gener; og den høyre del av genomet som inneholder genet cap som koder for kapsidproteinene av virusen.

Anvendelsen av vektorer som er avledet fra AAVer for overføring av gener in vitro og in vivo er beskrevet i litteraturen (se særlig WO 91/18088; WO 93/09239; US 4 797 368, US 5 139 941, EP 488 528). Disse dokumenter beskriver forskjellige konstruksjoner avledet fra AAVer, i hvilke genene rep og/eller cap er deletert og erstattet med et gen av interesse, samt deres anvendelse for overføring in vitro (på celler i kultur) eller in vivo (direkte i en organisme) av genet av interesse. De defektive, rekombinante AAVer kan fremstilles ved kotransfeksjdn i en cellelinje infektert med en human hjelpevirus (for eksempel en adenovirus), et plasmid inneholdende en nukleinsekvens av interesse ifølge oppfinnelsen flankert av de to inverse, repeterte områder (ITR) av AAV, og et plasmid som bærer enkapsideirngsgenene (genene rep og cap) av AAV. En brukbar cellelinje er for eksempel linje 293. De fremstilte, rekombinante AV V er blir deretter renset ved klassiske teknikker.

Hva angår herpesviruser og retroviruser, er konstruksjonen av rekombinante vektorer i stor grad beskrevet i litteraturen, se særlig Breakfield et al., "New Biologist", 3 (1991) 203; EP 453242, EP 178220, Bernstein et al., "Genet. Eng.", 7 (1985) 235; McCormick, "BioTechnology", 3 (1985) 689, og så videre. Særlig er retrovirusene integrerende viruser som selektivt infekterer celler under deling. De utgjør således vektorer av interesse for canceranvendelse. Genomet av retrovirusene omfatter i det vesentlige to LTR'er, en enkapsideirngssekvens og tre kodende områder (gag, pol og env). I de rekombinante vektorer som er avledet fra retrovirusene er genene gag, pol og env generelt deletert helt eller delvis og erstattet med en heterolog nukleinsyresekvens av interesse. Disse vektorer kan oppnås fra forskjellige typer retroviruser som særlig MoMuLV ("murine moloney leukemia virus"; også kalt MoMLV), MSV ("murine moloney sarcoma virus"), HaSV ("harvey sarcoma virus"), SNV ("spleen necrosis virus"), RSV ("rous sarcoma virus") eller også Friends-virus.

For å konstruere de rekombinante retroviruser omfattende en nukleinsyre ifølge oppfinnelsen blir et plasmid omfattende særlig LTR'ene, enkapsideringssekvensen og nukleinsyren konstruert og derefter benyttet for å transfektere en cellelinje, kalt enkapsidering, i stand til i trans å tilveiebringe de defektive, retrovirale funksjoner i plasmidet. Generelt er således enkapsideirngslinjene i stand til å uttrykke genene gag, pol og env. Slike enkapsideringslinjer er beskrevet i den teknikken og særlig linjen PA317 (US 4 861 719); linjen PsiCRTP (WO 90/02806) samt linjen GP+envAm-12 (WO 89/07150). Videre kan de rekombinante retroviruser omfatte modifikasjoner i LTR'ene for å supprimere transkripsjonen aktivitet samt de tilsiktede enkapsideringssekvenser omfattende en del av genet gag (Bender et al., "J. Virol.", 61 (1987) 1639). De fremstilte, rekombinante retroviruser blir derefter renset ved klassiske teknikker.

For gjennomføring av oppfinnelsen er det spesielt fordelaktig å anvende en defektiv, rekombinant adenovirus eller retrovirus. Slike vektorer har spesielt interessante egenskaper for overføring av gener til tumorceller.

3. 3. Kjemiske vektorer

Blant de utviklede, syntetiske vektorer foretrekker man innenfor rammen av oppfinnelsen å benytte kationiske polymerer av typen polylysin (LKLK)n, (LKKL)n (WO 95/21931), polyetylenimin (WO 96/02655) og DEAE-dekstran eller også kationiske lipider eller lipofektanter. De har evnen til å kondensere DNA og å fremme dennes assosiasjon med cellemembranen. Blant disse sistnevnte kan man nevne lipopoly-aminene (lipofektamin, transfektam, WO 95/18863, WO 96/17823), forskjellige kationiske eller nøytrale lipider (DOTMA, DOGS, DOPE, og så videre) samt peptider av nukleær opprinnelse (WO 96/25508). Videre er konseptet med tilsiktet transfeksjon utviklet, mediert med en reseptor som trekker fordel av prinsippet med kondensering av DNA takket være den kationiske polymer, mens man hele tiden styrer fikseringen av komplekset til membranet takket være en kjemisk kobling mellom den kationiske polymer og liganden av en membranær reseptor, til stede på overflaten av den celletype man ønsker å pode. Screening av reseptoren for transferrifi, insulin eller reseptoren for asialoglykoproteiner fra heptocytter er beskrevet. Fremstillingen av en sammensetning preparat ifølge oppfinnelsen som benytter en slik kjemisk vektor gjennomføres i henhold til en hvilken som helst teknikk kjent for fagmannen, generelt ved enkel kontakt mellom de forskjellige komponenter.

Eksempel 4: ScFVer som gjenkjenner p53

Assosiasjonen av ScFv'ene med p53 er verifisert i en ELISA-test.

En myc-merkelapp er fusjonert til ScFv'er for å tillate deres detektering. ScFv'ene 421, 11D3 (D3M) og en kontroll-ScFv (anti-CD3) er fremstilt fra periplasmaer av bakterier som uttrykker de forskjellige ScFv'er.

ELISA-plater belagt ved hjelp av renset p53 inkuberes med forskjellige fortynninger av IgG 11D3, IgG 421, et biotinylert, polyklonal serum anti-p53, ScFv 11D3, ScFv 421 og ScFv anti-CD3.

De to IgG'er blir derefter fremkalt av et sekundært antistoff anti-IgG koblet til alkalisk fosfatase. Biotinylert serum fremstilles ved ekstravidin koblet til alkalisk fosfatase. ScFv'er fremkalles ved antistoff 9E10 anti-myc og så med et anti-IgG-antistoff koblet til alkalisk fosfatase. En kolorimetrisk bestemmelse av den alkaliske fosfatase-aktivitet er vist i figur 4 og antyder at de to rensede IgG'er, det polyklonale serum og ScFv'ene 421 og 11D3 som gjenkjenner p53 samt ScFv anti-CD3, er inaktive.

Eksempel 5: ScFv'ene er i stand til å indusere et superskift på vill-p53

Evnen for ScFv'ene til å aktivere DNA-bindingsfunksjonen av vill-p53 testet ved retar-deringsforsøk på gel.

En dupleks-DNA som representerer et spesifikt fikseringssete for p53 merkes med <32>P og inkuberes så med renset vill-p53 og forskjellige rensede antistoffer eller ScFv'er som fremstilt i bakterielle periplasmaer. Kompleksene oppløses ved elektroforese på akrylamidgel.

De oppnådde resultater er vist i figur 5.

Komplekset DNA/p53 er observert i linjen "Basal". Antistoffene HR231, pAb421 og 11D3 er i stand til å indusere en supplementær retardasjon (superskift) og å øke kompleksmengden DNA/p53.

ScFv'ene 421 og D3M er likeledes i stand til å indusere et superskift, mens et anti-ras (Y28) kontroll-ScFv er taust. ScFv421 induserer i motsetning til ScFv D3M en økning av mengden av komplekset p53/DNA.

Eksempel 6: ScFv'ene er i stand til å restaurere en DNA-bindingsfunksjon til en

mutant av p53

På analog ble ScFv'ene testet med henblikk på evnen til å restaurere DNA-bindingsfunksjonen for den inaktive mutant Trp248. De oppnådde resultater er vist i figur 6.

Disse viser at de to ScFv'er induserer opptredenen av et retardert bånd tilsvarende et komplekst p53/DNA.

Eksempel 7: ScFv'ene uttrykkes korrekt i tumorceller

Ekspresjonen av ScFv'ene er verifisert ved transitorisk transfeksjon av ekspresjonsvektorer (promoter av SV40) i tumor-H1299-celler. Mer spesielt administreres nukleinsyrene i form av en plasmidisk vektor av typen pSV2 (eksempel 3) i nærvær av et kationisk lipid, lipofektamin.

De oppnådde resultater er vist i figur 7. Med Western-blott på et totalekstrakt observeres et hovedbånd som migrerer mot 30 kD og som tilsvarer den ventede størrelse, og bekrefter at molekylene uttrykkes i signifikante mengder i tumorceller.

Eksempel 8: ScFVene er i stand til partielt å restaurere den transaktiv funksjon

av mutantene His273

Funksjonaliteten for disse ScFv'er i tumorceller på den defektive, transaktive funksjon av muterte former av p53 er målt på følgende måte: De transitoriske transfeksjoner gjennomføres i H358- eller H1299-linjer (begge to deletert for p53) eller i linjen HT29 (omfattende p53-mutanten His273). Disse transfeksjoner innfører ekspresjonsvektorer for p53 av villtype eller mutantene H273 eller Hisl75, for de to ScFv'er og et rapportørplasmid omfattende genet CAT (kloramferii-kolacetyltransferase) under kontroll av en promoter avhengig av p53. CAT-aktiviteten målt 48 timer efter transfeksjon reflekterer den transaktive funksjon av p53.

Resultatene i figur 8 antyder at i linjen H358 er de to ScFv'er i stand til å reaktivere på signifikant måte den transkripsjonene aktivitet av mutanten His273. Identiske resultater oppnås i linje H1299.

På samme måte er i linje HT29 de to ScFv'er i stand til å øke den transkripsjonene aktivitet av den endogene mutant His273 (figur 9).

Claims (18)

1. Anvendelse av et enkeltkjede-antistoff, som er i stand til å spesifikt binde en epitop som er tilstede i det C-terminale området av p53 mellom restene 320-393, for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning som er ment for behandling av cancere hvor et mutert p53 protein er involvert.

2. Anvendelse ifølge krav 1, hvor enkeltkjede-antistoffer er valgt blant ScFv421 med sekvens SEQ ID nr. 1 og 11D3 med SEQ ID nr. 2.

3. Anvendelse av en nukleinsyre, som koder for et enkeltkjede-antistoff som er i stand til å spesifikt binde en epitop som er tilstede i det C-terminale området av p53 mellom restene 320-393, for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning som er ment for behandling av cancere hvor et mutert p53 protein er involvert.

4. Anvendelse ifølge krav 3, hvor nukleinsyren koder for et enkeltkjede-antistoff valgt blant ScFv421 med sekvens SEQ ID nr. 1 og 11D3 med SEQ ID nr. 2.

5. Anvendelse ifølge krav 4, hvor nukelirisyren er en del av en vektor.

6- Anvendelse ifølge krav 5, hvor vektoren er en viral vektor.

7. Anvendelse ifølge krav 6, hvor vektoren er et defekt rekombinant adenovirus.

8. Anvendelse ifølge krav 6, hvor vektoren er et defekt rekombinant retrovirus.

9. Anvendelse ifølge krav 6, hvor vektoren er en defekt rekombinant AAV.

10. Anvendelse ifølge krav 6, hvor vektoren er et defekt rekombinant HSV.

11. Anvendelse ifølge ett av kravene 1-10, hvor nevnte cancere er lunge cancer, tarm cancer, hode og nakke cancer, lever cancer eller hjerne cancer.

12. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 1 eller 3, hvor nevnte muterte p53 protein er valgt blant proteinene p53H273, p53W248 og p53G281.

13. 11D3 molekylet, karakterisert ved at det er representert ved SEQ ID nr. 2.

14. Nukleinsyremolekyl, karakterisert ved at det koder for proteinet ifølge krav 13.

15. Nukleinsyre ifølge krav 14, karakterisert ved at den er representert ved SEQ ID nr. 2.

16. Sammensetning, karakterisert ved at den omfatter en nukleinsyre ifølge krav 15.

17. Sammensetning, karakterisert ved at den omfatter et molekyl ifølge krav 13.

18. Farmasøytisk sammensetning, omfattende en nukleinsyre ifølge krav 14 og en farmasøytisk akseptabel bærer, for behandling av cancere.