HU226330B1 - Anti-p53 single-chain antibody fragments and their uses to produce pharmaceutical compositions - Google Patents

Description

A találmány tárgya mutáns p53 fehérjéhez specifikusan kötődő egyláncú antitestek alkalmazása mutáns p53 proteinnel rendelkező, p53 proteinnel nem rendelkező vagy lecsökkent transzkripciós faktor funkciójú p53 proteinnel rendelkező sejtekben a p53-függő transzaktiválási aktivitás visszaállítására szolgáló gyógyszerkészítmények előállítására. Részletesebben a találmány egyláncú antitestek alkalmazásán alapul, melyek képesek specifikusan a mutáns p53 proteinhez kötődni. A találmány tárgyát képezik olyan új molekulák is, melyek képesek specifikusan és hatékonyan kötődni a p53 proteinekhez, lehetővé téve tumoros sejtekben a p53-aktivitás visszaállítását, valamint az ezeket a molekulákat kódoló nukleinsavak és az ezeket tartalmazó vektorok. A találmány szerinti eljárás és molekulák in vitro vagy ex vivő alkalmazhatók a p53 és mutáns formái hatásmechanizmusának vizsgálatára vagy p53 proteinek tisztítására. In vivő alkalmazási lehetőséggel is rendelkeznek, többek között a p53-aktivitás visszaállításának terápiás megközelítésében patológiás körülmények között, többek között rákok esetében.

A vad p53 protein a sejtciklus szabályozásában és a sejtgenom integritásának fenntartásában vesz részt. A fehérje, melynek fő funkciója bizonyos gének transzkripciójának aktiválása, képes egy még nem teljesen jól ismert folyamat során a sejtciklus G1 fázisában lévő sejteket gátolni a genomreplikáció folyamán fellépő mutációk megjelenése során, és bizonyos számú DNS-javító folyamatot beindítani. Ezenkívül a javítási folyamat hibás működése esetén vagy a javításhoz túl sok mutációs esemény megjelenése esetén a fehérje képes az apoptózisnak nevezett programozott sejthalál jelenségét beindítani. Ezen a módon a p53 úgy hat, mint tumorszuppresszor, eltávolítva az abnormálisán differenciálódott vagy sérült genommal rendelkező sejteket.

A p53 e fő funkciója transzkripciós faktor funkciójától függ, másképpen szólva attól a kettős képességétől, hogy képes felismerni a genomiális DNS területén specifikus szekvenciákat, és képes az általános transzkripciós gépezetet megkötni.

A p53 fehérje 393 aminosavból áll, melyek 5 funkcionális domént határoznak meg:

- a transzkripciós aktivátor dómén, amely az 1-73. aminosavakból áll, és képes az általános transzkripciós gépezet bizonyos faktoraihoz, például a TBP fehérjéhez kötődni. Ez a dómén bizonyos poszttranszlációs módosítások székhelye is. Ezenkívül székhelye a p53 protein számos kölcsönhatásának számos más fehérjével, többek között az mdm2 sejtproteinnel, vagy az Epstein-Barr-vírus (EBV) EBNA5 fehérjéjével, melyek képesek gátolni a vad fehérje működését. Ezenfelül ebben a doménben találhatók a proteolitikus lebontásra képes úgynevezett PEST aminosavszekvenciák.

- a DNS-kötő dómén, amely a 73. és 315. aminosavak között helyezkedik el. A p53 e központi doménjének konformációja szabályozza a specifikus DNS-szekvenciák felismerését a p53-ban.

A dómén a székhelye két típusú megváltozásnak, amelyek a vad fehérje működését befolyásolják:

(i) a p53 működését gátló fehérjékkel történő kölcsönhatás, például az SV40 vírus „nagy T antigénje, vagy a HPV16 és HPV18 vírusok E6 vírusfehérjéi, melyek képesek az ubiquitinrendszeren keresztül lebomlását kiváltani. Ez utóbbi kölcsönhatás csak az E6ap sejtfehérje (az ubiquitinilációs kaszkád E3 enzimje) jelenlétében valósulhat meg, (ii) pontmutációk, melyek a p53 működésére vannak hatással, és melyeknek legnagyobb része ebben a régióban helyezkedik el,

- a nukleáris lokalizációs szignál, amely a 315-325. aminosavakból áll, és amely elengedhetetlen ahhoz, hogy a fehérje a megfelelő sejtalkotórészbe kerüljön, ahol majd működését kifejti,

- az oligomerizációs dómén, amely a 325-355. aminosavakból áll. Ez a 325-355. terület egy 6-redő(326-334.)-könyök(335-336.)-a-hélix(337—355.) típusú szerkezetet alkot. Az ezen a területen elhelyezkedő funkciók megváltozása alapvetően a vad fehérjének a különböző mutáns formákkal való kölcsönhatásának köszönhető, melyek különböző hatásokhoz vezethetnek a vad fehérje működésében,

- a regulációs dómén, amely a 365-393. aminosavakból áll, és amely számos poszttranszlációs modifikáció székhelye (glikozilálás, foszforilálás, RNS-kötés...), melyek a p53 fehérje működését pozitívan vagy negatívan szabályozzák. A dómén különösen fontos szerepet játszik a vad fehérje működésének szabályozásában.

A p53 működése különböző módokon zavarható meg:

- bizonyos faktorok gátolják működését, például az SV40 vírus „nagy T” antigénje, az Epstein-Barrvírus EBNA5 fehérjéje, vagy az mdm2 sejtprotein,

- a fehérje destabilizálható proteolízisre való érzékenységének megnövelésével, többek között a HPV16 és HPV18 humán papillomavírusok E6 fehérjéjével történő kölcsönhatás révén, ami a p53 ubiquitinilációs ciklusba való belépésének kedvez. Ebben az esetben a két fehérje közötti kölcsönhatás csak egy sejtprotein, az E6ap előzetes kötődése esetén valósulhat meg, melynek kötőhelye még kevéssé ismert,

- a p53 gén pontmutációi,

- a p53 egyik vagy mindkét alléljának deléciója.

A modifikációk két utóbbi típusa a különböző típusú rákok körülbelül 50%-ában megtalálható. Ebben a tekintetben a p53 gén rákos sejtekben megtalálható mutációi a fehérjét kódoló gén nagyon nagy részét érintik, és eredményük a fehérje működésének különböző megváltoztatása. Mégis megjegyezhetjük, hogy ezek a mutációk többségükben a p53 központi részén helyezkednek el, melyről tudjuk, hogy a p53 fehérje azon területe, amely a specifikus genomiális szekvenciákkal való kapcsolódásért felelős. Ez megmagyarázza, hogy a p53 mutánsok többségének miért fő jellemzője, hogy

HU 226 330 Β1 nem képes a vad fehérjét felismerő DNS-szekvenciákon kötődni, és így nem képes transzkripciós faktor szerepét kifejteni. Másrészt bizonyos mutációk, úgy tűnik, új funkciókra tettek szert, például bizonyos gének aktiválása transzkripciós szinten.

A módosításokat jelenleg három csoportba soroljuk:

- az úgynevezett gyenge mutációk, melyek terméke működésképtelen fehérje, amely egyetlen alléi mutációja esetében nincs hatással a másik alléi által kódolt vad fehérje működésére. A csoport főbb képviselői a H273 és a W248 mutánsok, ez utóbbi a rákok kialakulására fokozott érzékenységet okozó Li-Fraumeni-szindróma családi formájára specifikus,

- a domináns-negatív mutációk, melyek terméke működésképtelen fehérje, amely egyetlen alléi mutációja esetében a vad fehérjével történő kölcsönhatás révén képes gátolni ez utóbbi működését, kevert, inaktív oligomerek kialakulása útján, melyek nem képesek a vad fehérjére specifikus DNS-szekvenciákon kötődni. A csoport fő képviselője a G281 mutáns,

- az onkogén-domináns mutációk, melyek terméke olyan fehérje, amely képes egyrészt gátolni a vad fehérje működését, mint az előző csoport mutánsai, másrészt a még kevéssé ismert tumorkiaiakulási folyamatoknak kedvez, így új funkciót kialakítva. A csoport fő képviselője a H175 mutáns.

Tumorellenes és apoptotikus tulajdonságait, valamint számos hiperproliferatív típusú betegségben való részvételét figyelembe véve a vad p53 gént gén- és sejtterápiás megközelítésekben már alkalmazták. Részletesen javasolták, hogy bizonyos hiperproliferatív betegségeket, többek között rákokat, a vad p53 gén in vivő beadásával kezeljenek, így helyreállítva a p53-funkciókat. A beadást előnyösen vírusvektorokkal valósíthatják meg, többek között adenovírusokkal [WO 94/24297] vagy retrovírusokkal [WO 94/06910], (gy kimutatták, hogy a vad p53 fehérjét kódoló nukleinsav beadása lehetővé tette a sejtnövekedés normális szabályozottságának részleges helyreállítását [Roth et al., Natúré Medicine 2, 985 (1996)]. Kifejlesztettek alternatív stratégiákat is, melyek p53 típusú tulajdonságokkal rendelkező kiméra molekulák alkalmazásán alapulnak [PCT/FR96/01111}.

A vad p53 fehérje funkcióinak helyreállítására egy másik megközelítés azon alapul, hogy az endogén mutáns fehérjéket visszaalakítják a vad fenotípusra, azaz amely rendelkezik a vad p53 tumorszuppresszor és apoptotikus tulajdonságaival. Ez a megközelítés abból ered, hogy kimutatták, hogy a p53 mutánsok funkcióvesztése a fehérje mutáció(k) által kiváltott konformációs változásának eredménye. Ebben a tekintetben a WO 94/12202 és WO 96/30212 számon közzétett szabadalmi bejelentésben kimutatták, hogy egy pAb421nek nevezett p53 elleni monoklonális antitest képes helyreállítani egy adott, a humán tumorokban gyakran előforduló mutánsosztály esetében in vitro a DNS-kötő funkciót. A vegyülettípus alkalmazása azonban jelentős hátrányokkal rendelkezik, amelyek többek között a magas szükséges antitestmennyiséggel (és így a kapcsolódó termelés/tisztítás problémáival) és gyenge intracelluláris behatolóképességükkel kapcsolatosak.

A jelen bejelentés egy hatékonyabb megközelítést ismertet egy p53 mutáns vad tulajdonságainak helyreállítására. A bejelentés részletesen a p53 fehérjére különösen specifikus ligandumok kialakítását írja le, melyek előnyös tulajdonságokkal rendelkeznek a vad p53 funkcióinak helyreállítása terén. Részletesebben a bejelentésben egyláncú antitestek (ScFv), többek között a 11D3 molekula kialakítását írjuk le, melyek a p53 fehérjére specifikusak. A bejelentésben kimutattuk többek között, hogy az ScFv-k képesek felismerni a p53-at, hatékonyan kifejezhetők egy tumoros sejtben, és képesek a p53 mutánsok egy osztályának transzaktivátor funkcióját részben újra aktiválni.

A technika állásának eljárásaihoz viszonyítva ez a molekula jelentős előnyökkel rendelkezik, többek között azzal, hogy in situ jelentős mennyiségben kifejezhető egy tumoros sejtben. A későbbiekben bemutatott eredmények annál váratlanabbak, mivel egy klasszikus antitest és az ScFv között gyakran figyelték meg az affinitás elvesztését. Ezenkívül a bejelentésben kimutattuk, hogy az ScFv-k a megfelelő intracelluláris sejtalkotórészekben fejezhetők ki, ami lehetővé teszi, hogy optimális biológiai aktivitást kapjunk.

A találmány egy eljárást ismertet mutáns p53 fehérjével rendelkező sejtekben a p53-függő transzaktiváló aktivitás helyreállítására, amely abból áll, hogy az említett sejtbe a mutáns p53 fehérjéhez specifikusan kötődni képes egyláncú antitestet vezetünk be. Előnyösen a találmány szerinti eljárás magában foglalja a sejtbe egy olyan nukleinsav bevezetését, amely az említett egyláncú antitestet kódoló szekvenciát tartalmaz egy, a sejtben működőképes promoter irányítása alatt. A találmány egy másik aspektusa egy mutáns p53 fehéréhez specifikusan kötődni képes egyláncú antitest alkalmazása az említett fehérje konformációjának megváltoztatására. A találmány tárgya egy, a p53 fehérje C-terminális területén a 320-393. maradékok között levő epitóphoz specifikusan kötődni képes egyláncú antitest alkalmazása olyan rákok kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására, amelyekben egy mutáns p53 fehérjének szerepe van. A találmány tárgya továbbá egy, a p53 fehérje C-terminális területén a 320-393. maradékok közötti epitóphoz specifikusan kötődni képes egyláncú antitestet kódoló nukleinsav alkalmazása olyan rákok kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására, amelyekben egy mutáns p53 fehérjének szerepe van.

A találmány szerinti alkalmazás tehát részben egy mutáns p53 fehérjéhez specifikusan kötődni képes egyláncú antitest kialakításán, vektorba építésén és sejtekbe történő bevezetésén alapul. Az egyláncú antitestek (ScFv) alapvetően egy VH régióból állnak, ami egy karon keresztül egy VL régióhoz kapcsolódik. Az ScFv és az ilyen módosított antitesteket kódoló nukleinsavszekvenciák kialakítását például az US 4 946 778 számú szabadalmi iratban, vagy a WO 94/02610, WO 94/29446 szá3

HU 226 330 Β1 mon közzétett szabadalmi bejelentésekben ismertetik, melyeket referenciaként építünk be a jelen bejelentésbe.

A bejelentésben részletesebben egy olyan hibridóma bank kialakítását ismertetjük, amely p53 elleni antitesteket termel, és a bankból kiindulva a megfelelő ScFv kialakítását. Leírjuk a megfelelő nukleinsavak klónozását is expressziós vektorokba, és átvitelüket sejtekbe. Bemutatjuk, hogy ez az átvitel lehetővé teszi, hogy in vivő hatékonyan állítsuk helyre a p53 mutánsok DNS-kötő, valamint transzaktivátor aktivitását.

Részletesebben a találmány olyan ScFv-ket használ fel, melyek képesek specifikusan kötődni egy, a p53 C-terminális területén lévő epitóphoz, amely az oligomerizációs domént és a regulációs domént hordozza. Ebben a tekintetben a bejelentés egy vizsgálatot is ismertet, amely lehetővé teszi, hogy ELISA technikával szelektáljuk azokat az ScFv-ket, melyek ezzel a tulajdonsággal rendelkeznek.

A találmány szerint alkalmazott ScFv-k képesek specifikusan kötődni egy, a p53 C-terminális területén a 320-393. maradékok között lévő epitóphoz. Ebben a tekintetben a bejelentésben példaképpen az 1. számú szekvenciával rendelkező ScFv421 és a 2. számú szekvenciával rendelkező 11D3 ScFv kialakítását és expresszióját írjuk le.

A találmány szerinti eljárás általában alkalmazható a DNS-kötő képességüket részben vagy teljesen elvesztett p53 mutáns fehérjék esetében, és lehetővé teszi, hogy ezt a képességet helyreállítsuk. Még részletesebben a találmány szerinti eljárás a p53 transzkripciós faktor funkcióját részben vagy teljesen elvesztett mutáns p53 fehérjék esetében alkalmazható, és lehetővé teszi ennek a funkciónak a helyreállítását. A helyreállítás lehet részleges vagy teljes. Előnyösen elegendő, ha a mutáns képes lesz tumorszuppresszor funkcióját kifejteni a sejtciklus gátlásával és/vagy az apoptózis kiváltásával. A találmány szerinti eljárás tehát lehetővé teszi, hogy legalább részlegesen helyreállítsunk ilyen aktivitással nem rendelkező endogén mutáns p53 fehérjével rendelkező sejtekben egy tumorszuppresszoraktivitást. Előnyösen olyan mutáns fehérjékről van szó, melyek tumoros sejtekben vannak jelen. Amint korábban jeleztük, a p53 fehérje különböző mutáns formáit mutatták ki tumoros sejtekben. Például a p53H273, p53W248 és a p53G281 fehérjéket említhetjük meg. A később bemutatott példák azt mutatják, hogy a találmány szerinti eljárás lehetővé teszi, hogy ezeknek a mutánsoknak a konformációját és biológiai tulajdonságait megváltoztassuk in vitro és in vivő. Részletesen a példák azt mutatják, hogy az ScFv421 és a 11D3 képesek a 273 és 248 mutánsok esetében a specifikus DNS-kötő képesség helyreállítására és a p53-függő transzaktiválás kiváltására.

A találmány szerinti eljárást alkalmazhatjuk in vitro, ex vivő vagy in vivő. In vitro vagy ex vivő a találmány szerinti eljárás és molekulák például lehetővé tehetik, hogy a p53 és mutáns formái hatásmechanizmusát tanulmányozzuk. Ezenkívül a találmány szerinti molekulákat alkalmazhatjuk a p53 fehérje detektálására vagy tisztítására, például egy hordozón való kapcsolással, egy p53 fehérjét tartalmazó oldattal való érintkeztetéssel, amit adott esetben a kialakult komplex láthatóvá tétele vagy eluálás követ. In vivő, többek között embernél, lehetővé tehetik, hogy olyan patológiás körülmények között, mint a hiperproliferatív rendellenességek, melyekben p53-aktivitás hiánya figyelhető meg, ezt a funkciót helyreállítsuk. Ebben a tekintetben más a korábbiakban említett megközelítéssel (egy vad p53 gén bevezetése) vagy kemoterápiával kombinációban [WO 96/22101] is alkalmazható. Szintén in vivő, a találmány szerinti eljárás és molekulák alkalmazhatók állatoknál például az ScFv-kifejeződés szintjének meghatározására és humán terápiás megközelítés lehetőségének felmérésére.

Előnyösen a mutáns p53 fehérjével rendelkező sejt egy tumoros emlőssejt. Ebben a tekintetben különösen a tüdőráksejteket (többek között a nem kissejtes tüdőráksejteket), a vastagbélráksejteket, a májráksejteket, az agytumorsejteket, a fej- és nyaki tumorsejteket említhetjük meg, és általánosabban bármely rák sejtjeit, amelyben a p53 fehérje mutáns formáját megfigyelték. Előnyösen humán tumoros sejtről van szó, amelyben p53H273, p53W248 és/vagy p53G281 mutánst figyeltek meg (tüdő, vastagbél, agy, fej és nyaki, máj). A találmány szerinti eljárás alkalmazhatósága egy adott sejt esetében könnyen meghatározható a következő eljárás szerint: a sejtet először jellemezni kell abból a szempontból, hogy van-e jelen mutáns p53 fehérje. A fehérjét ezután jellemezni kell, hogy meghatározzuk a mutáció természetét. Amennyiben egy ismert mutációról van szó, többek között a fentebb említettekről, a sejtet úgy tekinthetjük, mint amely kezelhető a találmány szerinti eljárással. Amennyiben egy nem említett mutációról van szó, különböző megközelítések lehetségesek. A mutáns fehérjét először izolálhatjuk (vagy mesterségesen szintetizálhatjuk), és vizsgálhatjuk a példákban leírt módon arra vonatkozóan, hogy miként viselkedik ScFv jelenlétében in vitro és in vivő. Ez lehetővé teszi, hogy azonosítsuk a fehérje hiányzó funkcióinak visszaállításához megfelelő ScFv-t. Egy másik megközelítés szerint közvetlenül az ScFv-ket vizsgáljuk egy sejttenyészeten, hogy meghatározzuk az ScFv-k biológiai hatékonyságát.

A találmány szerinti eljárás megvalósításához az ScFv-t előnyösen a sejtbe in vitro, ex vivő vagy in vivő egy vektor formájában vezetjük be, amely hordozza az említett ScFv-t kódoló nukleinsavat az említett sejtben működőképes promoter irányítása alatt.

A promotert előnyösen emlős-, még előnyösebben humán sejtekben működőképes promoterek közül választjuk. Még előnyösebben egy nukleinsav expresszióját egy hiperproliferatív (rákos, resztenózisos stb.) sejtben lehetővé tevő promoterről van szó. Ebben a tekintetben különböző promotereket alkalmazhatunk. Például szó lehet a p53 gén saját promoteréről. De szó lehet eltérő eredetű (más fehéijék expressziójáért felelős vagy szintetikus) területekről is. Bármely olyan promoterről vagy származék szekvenciáról szó lehet, amely egy gén transzkripcióját specifikus vagy nemspecifikus, indukálható vagy nem indukálható, erős

HU 226 330 Β1 vagy gyenge módon elősegíti vagy gátolja. Többek között eukarióta vagy virális gének promotereit említhetjük meg. Például a célsejt genomjából származó promoterszekvenciákról lehet szó. Az eukarióta promoterek közül különösen az általános promotereket (a HPRT, PGK, alfa-aktin, tubulin stb. gének promoterei), az intermedier filamentumok promotereit (a GFAP, dezmin, vimentin, neurofilamentumok, keratin stb. gének promoterei), terápiás gének promotereit (például az MDR, CFTR, Vili. faktor, ApoAI stb. gének promoterei), szövetspecifikus promotereket (a piruvát kináz, viliin, zsírsavkötő bélprotein, simaizomsejtek alfa-aktinja stb. gének promoterei) vagy egy ingerre válaszoló promotereket (szteroidhormonok receptorai, retinsavreceptor stb.) használhatjuk. Éppúgy szó lehet egy vírus genomjából származó promoterszekvenciákról, amilyenek például az adenovírusok E1A és MLP génjeinek promoterei, a CMV korai promotere vagy az RSV LTRének promotere stb. Azonkívül a promoterrégiókat aktivációs, regulációs vagy szövetspecifikus vagy nagymértékű expressziót lehetővé tevő szekvenciák hozzáadásával módosíthatjuk is.

Amint a korábbiakban jeleztük, a bejelentésben olyan különösen előnyös új molekulákat is ismertetünk, melyek a mutáns p53 fehérjéket kötő és helyreállító tulajdonságokkal rendelkeznek, a találmányban részletesebben adott ScFv-k (11D3, 421) kialakítását, hordozóhoz kapcsolását és sejtekbe történő átvitelét ismertetjük. Az ScFv-k nukleinsav- és peptidszekvenciáit az

1. és 2. számú szekvencián adtuk meg. A következő példák azt mutatják be, hogy a molekulák különösen előnyös módon képesek (i) a mutáns p53 fehérjékhez azok C-terminális részén kötődni, (ii) visszaállítani ezen molekulák DNS-kötő képességét, és (iii) visszaállítani ezen molekulák transzkripciós aktivátor képességét. A példákban bemutatjuk ezenkívül, hogy a molekulák helyesen fejeződnek ki tumoros sejtekben, ami előnyösen lehetővé teszi hiperproliferatív rendellenességek esetében alkalmazásukat. Másrészt a találmány szerinti ScFv-k tulajdonságai javíthatók is. Többek között ismert, hogy az ScFv-k affinitása befolyásolható a CDR régiókon keresztül (a szekvencián aláhúzva), és szokásos mutagenezis/szelekciós kísérletekkel javítható. így antitestek mutagenizálását ismertette Marks és munkatársai [Bio/Technology 10, 779-783 (1992)] és Winter G. és Milstein C. [Natúré 349, 293-299 (1991)]. Az ezeken a helyeken ismertetett eljárások alkalmazhatók a találmány szerinti módosított affinitással rendelkező ScFv-variánsok előállítására is. A szelekciót ezután a példákban ismertetett körülmények között végezhetjük.

A találmány tárgya tehát a 11D3 ScFv molekula, melynek peptidszekvenciáját a 2. számú szekvencián mutatjuk be, valamint ennek minden olyan variánsa, amely a CDR régiókban módosítással rendelkezik, de megőrzi p53 fehérje kötő képességét. A módosítás állhat delécióból, szubsztitúcióból, vagy egy vagy több maradéknak a CDR régiókba történő beépítéséből. Előnyösen a módosítást kevesebb mint 10 maradék hordozza.

A találmány tárgya bármely nukleinsav is, amely a

11D3 ScFv-t vagy annak egy, a korábbiakban definiált változatát kódolja.

A találmány szerinti nukleinsav lehet ribonukleinsav (RNS) vagy dezoxiribonukleinsav (DNS). Előnyösen egy komplementer DNS-ről (cDNS) van szó. Ez lehet humán, állati, vírus-, szintetikus vagy félig szintetikus eredetű. Különbözőképpen kaphatjuk meg, többek között kémiai szintézissel, a bejelentésben bemutatott szekvenciákat, és például egy nukleinsavszintetizátort felhasználva. Megkaphatjuk bankok specifikus szondákkal történő szűrésével is, többek között amilyeneket a bejelentésben írunk le. Kevert technikákkal is megkaphatjuk, amelyek a bankok szűrésével kapott szekvenciák kémiai módosításait (meghosszabbítás, deléció, szubsztitúció stb.) foglalják magukban. Általános módon a találmány szerinti nukleinsavakat bármely a szakember számára ismert eljárás szerint előállíthatjuk [lásd többek között az US 4 946 778 és a WO 94/02610 számú iratokban leírt eljárásokat, melyeket referenciaként építünk be a bejelentésbe]. Egy ScFv-t kódoló nukleinsav kialakításának klasszikus stratégiája a következő: A VH és VL régiókat kódoló cDNS-eket a választott anti-p53 antitestet termelő hibridómából kapjuk meg. Ehhez a hibridóma összRNS-ét kivonjuk, és reverz transzkripciónak vetjük alá primerként random hexamereket alkalmazva. Az ilyen primer alkalmazásával elkerülhetjük az immunglobulinokra specifikus primerek alkalmazását. A kapott cDNSklónok elegendő hosszúak a V régió klónozásához. Amennyiben ezek az összes jelen levő cDNS nagyon kicsi frakcióját alkotják, előzetes amplifikációs reakciót végezhetünk a klónozáshoz elegendő DNS termelésére. Ehhez a VH és VL régiókat kódoló cDNS-eket külön-külön amplifikáljuk. Az alkalmazott primerek mindkét lánc (H és L) esetében a variábilis régió ellentétes végeivel hibridizálódó oligonukleotidok. A nehéz lánc specifikus és a könnyű lánc specifikus primerekkel végzett amplifikáció termékeit ezután tisztítottuk. Tisztítás után az antitest VH és VL régióit kódoló cDNS-eket egyetlen lánccá egyesítettük egy nukleotidkar segítségével (L). A nukleotidkart úgy alkotjuk meg, hogy egyik vége a VH régiót kódoló cDNS 3'-végéhez kapcsolódik, másik vége a VL régiót kódoló cNDS 5’-végéhez. A kar szekvenciája a (G4S)3 peptidet kódolta. A körülbelül 700 bp egyesített szekvencia egy Ncol-Notl fragmentum formájában tartalmazza a VH-L-VL láncolatot, melynek szekvenciáit például az 1. és a 2. számú szekvencián mutatjuk be.

A találmány szerinti nukleinsav előnyösen egy cDNS vagy egy RNS.

A találmány szerinti nukleinsavat előnyösen a következők közül választjuk:

(a) a 2. számú szekvencia vagy annak része, vagy komplementer lánca, (b) bármely az (a) szekvenciákkal hibridizáló szekvencia, amely a p53 fehérjéhez, előnyösen annak C-terminális részéhez specifikusan kapcsolódni képes ScFv-t kódol, (c) az (a) vagy (b) szekvenciák genetikai kód degeneráltságából következő változatai.

HU 226 330 Β1

A találmány tárgya minden expressziós kazetta is, amely egy korábbiakban definiált nukleinsavat, egy expresszióját lehetővé tevő promotert és egy transzkripciós végjelet tartalmaz.

A találmány szerinti eljárásban a nukleinsavat előnyösen egy vektor segítségével adjuk be a sejtekbe, amely lehetővé teszi, hogy (i) a sejtbe való behatolást, (ii) a célzást, és/vagy (iii) az extra- és intracelluláris stabilitást javítsuk.

A találmány egy különösen előnyös megvalósítási módja szerint a nukleinsav egy vektorba van beépítve, amely lehet kémiai (liposzóma, nanopartikulum, peptidkomplex, kationos lipid vagy polimer stb.), virális (retrovírus, adenovírus, herpeszvírus, AAV, vakciniavírus stb.) vagy plazmideredetű.

A virális vektorok alkalmazása a vírusok természetes transzfekciós tulajdonságain alapul. Igy alkalmazhatjuk az adenovírusokat, a herpeszvírusokat, a retrovírusokat és az adenoasszociált vírusokat. Ezek a vektorok különösen hatékonynak bizonyultak transzfekciós téren. Részletesen az adenovírusok és a retrovírusok, mivel képesek tumoros sejteket fertőzni, a találmány keretein belül előnyös vektorok. Ebben a tekintetben a találmány egy előnyös megvalósítási módjában a nukleinsavat egy retrovírusvektor formájában vezetjük be, azaz egy hiányos rekombináns retrovírus formájában, melynek genomja tartalmaz egy korábbiakban definiált ScFv-t kódoló nukleinsavat. A találmány egy másik előnyös megvalósítási módjában a nukleinsavat egy adenovírusvektor formájában vezetjük be, azaz egy hiányos rekombináns adenovírus formájában, melynek genomja tartalmaz egy korábbiakban definiált ScFv-t kódoló nukleinsavat.

A találmány szerinti vektor lehet egy nem virális vektor is, amely képes nukleinsavak eukarióta sejtekbe történő átvitelét elősegíteni. A kémiai vagy biokémiai, természetes vagy szintetikus vektorok előnyös alternatívát képeznek a természetes vírusokkal szemben, különösen kényelmi és biztonsági okokból, valamint mivel nincs elméleti korlátja a transzfektálandó DNS méretének. A szintetikus vektoroknak két fő funkciójuk van, a transzfektálandó nukleinsav tömörítése, és sejten való kötődésének, valamint a plazmamembránon, és adott esetben a két magmembránon történő áthaladásának elősegítése. A nukleinsavak polianionos jellegének kiküszöbölésére a nem virális vektorok mind polikationos töltésűek. Egy különleges találmány szerinti eljárásban a vektor egy kémiai vagy biokémiai vektor.

A találmány tárgyát képezi minden készítmény, amely legalább egy, a korábbiakban definiált nukleinsavat tartalmaz.

A találmány tárgya minden olyan készítmény is, amely legalább egy, a korábbiakban definiált vektort tartalmaz.

A találmány tárgyát képezi minden olyan készítmény is, amely legalább egy, a korábbiakban definiált ScFv-t tartalmaz.

A találmány tárgyát képezik azok a készítmények is, melyek egy korábbiakban definiált nukleinsavat vagy vektort, és egy vad p53 fehérjét kódoló nukleinsavat vagy vektort tartalmaznak, egyidejű vagy időben eltolt kombinált alkalmazás céljából.

Antiproliferatív tulajdonságuk miatt a találmány szerinti gyógyszerkészítmények különösen megfelelőek hiperproliferatív rendellenességek, többek között rákok és resztenózis kezelésére. A találmány így egy különösen hatékony eljárást nyújt sejtek, többek között hiperproliferatív sejtek elpusztítására.

A találmányt in vitro vagy ex vivő alkalmazhatjuk. Ebben az esetben a találmány alapvetően abból áll, hogy a sejteket egy vagy több nukleinsav (vagy vektor, vagy kazetta, vagy közvetlenül az ScFv) jelenlétében inkubáljuk. Az alkalmazott dózis 0,01-1000 pg vektor lehet 10⁶ sejtre, vagy 0,1-1000 MOI virális vektor esetében.

In vivő a találmány abból áll, hogy a szervezetbe a találmány szerinti vektor (vagy kazetta) hatékony mennyiségét adjuk be, előnyösen közvetlenül a kezelendő helyre (például tumorba). Ebben a tekintetben a találmány tárgya egy eljárás is hiperproliferatív sejtek elpusztítására, amely magában foglalja az említett sejtek vagy egy részük érintkeztetését egy korábbiakban definiált nukleinsawal. In vivő alkalmazás esetében a találmány szerint alkalmazott nukleinsavat vagy vektort helyi, orális, parenterális, intranazális, Intravénás, intramuszkuláris, szubkután, intraokuláris, transzdermikus stb. beadás céljából formulázhatjuk. Előnyösen a nukleinsavat vagy vektort injektálható formában alkalmazzuk. így bármely gyógyszerészetileg az injektálható formulázás, többek között a kezelendő helyre történő közvetlen injektálás céljából elfogadható hordozóval elegyíthetjük. Különösen steril, izotóniás sóoldatokról lehet szó, vagy szárított, például liofilizált készítményekről, melyek az adott esettől függően steril víz vagy fiziológiás szérum hozzáadásával injektálható oldatok előállítását teszik lehetővé. A nukleinsav közvetlenül a beteg tumorjába történő injektálása előnyös, mivel lehetővé teszi, hogy a terápiás hatást az érintett szövetekre koncentráljuk. Az alkalmazott nukleinsavdózisok különböző paraméterek, például a gén, a vektor, az alkalmazott beadási mód, az illető betegség vagy a kívánt kezelési időtartam függvényében választhatók meg. Előnyösen az in vivő beadott dózis 10® és 10¹° pfu közötti virális vektor, például adenovírus esetében. Másrészt ismételt beadás is elképzelhető.

Szintén in vivő, a találmány szerinti eljárás és molekulák alkalmazhatók állatmodelleken a p53 hatásmechanizmusának vizsgálatára is, és az ScFv-k hatékonyságának meghatározására.

A találmányt előnyösen in vivő alkalmazzuk hiperproliferatív (azaz abnormálisán osztódó) sejtek elpusztítására. így tumoros sejtek vagy az érfal simaizomsejtjeinek (resztenózis) elpusztítására alkalmazható. Különösen alkalmas olyan rákok kezelésére, melyekben a p53 egy mutáns formáját figyelték meg. Példaképpen említhetjük a vastagbél-adenokarcinómákat, a pajzsmirigyrákokat, a tüdőrákokat, a mieloid leukémiát, a vastag- és végbélrákot, az emlőrákot, a tüdőrákot, a gyomorrákot, a nyelőcsőrákokat, a B-limfomákat, a petefészekrákokat, a húgyhólyagrákokat, a hepatokarcinó6

HU 226 330 Β1 mákat, a csontrákokat, a bőr-, a hasnyálmirigyrákokat, vagy a vese- és prosztatarákokat, a nyelőcsőrákokat, a gégerákokat, a fej- és nyakrákokat, a HPV pozitív anogenitális rákokat, az EBV pozitív orr-garat rákokat, és azokat a rákokat, melyekben az mdm2 sejtfehérje túlzott mértékben fejeződik ki stb.

A találmányt részletesebben ismertetjük a következő példákban, amelyek azonban nem korlátozzák a találmány oltalmi körét, csupán illusztrációként szolgálnak.

Az ábrák ismertetése

1. ábra: Az antitestek szűrésének stratégiája,

2. ábra: Annak a kimutatása, hogy az antitestek képesek retardációt kiváltani p53 gélen.

3. ábra: Annak a kimutatása, hogy az antitestek képesek retardációt kiváltani p53H273 gélen.

4. ábra: Az ScFv-k vad p53-mal történő kapcsolódásának kimutatása ELISA-val. Tele körök: IgG 11D3 (kezdőérték 1 pg/ml); üres körök: IgG 421 (kezdőérték 1 pg/ml); négyzetek: biotinezett poliklonális szérum (kezdőérték 1 pg/ml); tele háromszögek: ScFv 11D3-myc (kezdőérték 1/2-nél); üres háromszögek: ScFv 421-myc (kezdőérték 1/2-nél); rombuszok: semleges ScFv (antiCD3, kezdőérték 1/2-nél).

5. ábra: ScFv-k által kiváltott gélretardáció kimutatása.

6. ábra: A p53 mutánsok DNS-kötő aktivitásának helyreállítása.

7. ábra: Az ScFv421 kifejezése H1299 sejtekben.

8. ábra: A H273 mutáns transzkripciós aktivitásának helyreállítása H358 sejtvonalban.

9. ábra: Az endogén H273 mutáns transzkripciós aktivitásának helyreállítása HT29 sejtvonalban.

Példák

1. példa

11D3 antitestek előállítása és szűrése

A példa specifikus p53 elleni monoklonális antitestek előállítását, kinyerését és szelekcióját ismerteti, melyek képesek a mutáns p53-formák DNS-kötő funkcióját aktiválni.

1.1. Egerek immunizálásakor alkalmazott fehérjék kinyerése és a hibridómák szűrése A vad p53 fehérjét és tumoros sejtekben gyakran előforduló, a vad p53 mutációinak megfelelő p53 H273, p53 W248, p53 G281 fehérjéket termeltünk rekombináns bakulovírussal fertőzött Spodoptera frugipedra Sf9 rovarsejtekben, és a fehérjéket tisztítottuk agarózgélre kapcsolt PAb421 poliklonális antitesttel, affinitáskromatográfiával [Leveillard et al., EMBO J. 15, 1615-1623 (1996)]. A vad p53 fehérje 1-320. és 73-321. fragmentumainak megfelelő fehérjéket szintén termeltettük rekombináns bakulovírussal fertőzött Spodoptera frugipedra Sf9 rovarsejtekben, az Invitrogen előírásait követve. A BlueBaclll transzfer plazmidba beépített komplementer DNS-eket a klasszikus rekombináns DNS technikákkal állítottuk elő, amelyeket például Sambrook és munkatársai írtak le [Sambrook, Fritsch & Maniatis: Molecular cloning, a laboratory manual, 2^nd edition, Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, (1989)].

1.2. A hibridómák előállítása és szűrése

Egereket immunizáltunk a három korábban leírt p53 mutáns fehérje ekvimoláris mennyiségét tartalmazó eleggyel, és a hibridómákat a Harlow és Lane által leírt eljárást követve kaptuk meg [Harlow & Lane: Antibodies, a laboratory manual, Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)]. A korábban leírt p53 mutánsok elleni monoklonális antitesteket termelő hibridómák szelekcióját a hibridómák tápközegébe termelt antitestek megkötésével végeztük 96 lyukas PVC-tenyésztőlemezen, amelynek lyukaiba előzőleg a korábban leírt három p53 mutáns fehérje ekvimoláris mennyiségeit tartalmazó elegyből 1 mikrogrammot immobilizáltunk a Harlow és Lane által leírt eljárást követve [Harlow & Lane: Antibodies, a laboratory manual, Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)]. Ez az első szűrés lehetővé tette 317 pozitív hibridóma kiválasztását. Kéthetes hibridómaamplifikálás után a felszaporított hibridómák felülúszóját először a korábban említett antitestmegkötési módszerrel (1. módszer) újra értékeltük, majd három azonos szűrési módszer alkalmazásával osztályoztuk a korábban említett elv alapján, azzal a kivétellel, hogy az immobilizált fehérjék különbözők voltak: a lyukakba vagy a tisztított p53 fehérjét immobilizáltuk (2. módszer), vagy a vad p53 1-320. fragmentumát termelő Sf9 sejtek fehérjekivonatát (3. módszer), vagy a vad p53 73-393. fragmentumát termelő Sf9 sejtek fehérjekivonatát (4. módszer). A fehérjekivonatokat Sf9 sejtek fagyasztás/olvasztási ciklusok útján foszfátpufferben végzett lízisével, majd a sejttörmelék centrifugálásával kaptuk. A 317 amplifikált hibridóma felülúszóiból 162 nem adott választ az újra elvégzett 1. módszer esetében. A 155 fennmaradó hibridóma mindegyike pozitív volt a 2. módszerrel, ezek közül 33 (A csoport) negatív volt a 3. és 4. módszer esetében, és 115 (B csoport) pozitív a 3. módszerben, de negatív a 4. módszerben, és végül 7 (C csoport) pozitív volt mindkét utóbbi módszer esetében. A B csoport felülúszói olyan felülúszónak felelnek meg, amely olyan antitesteket tartalmaz, melyek epitópja a p53 első 73 aminosavában helyezkedik el. Az e csoportba tartozó 77 felülúszó negatívnak bizonyult a

2. módszerben, amikor előzőleg a p53 első 40 aminosavát tartalmazó szekvenciának megfelelő peptiddel inkubáltuk (1 mg/ml). Az A csoport antitestjeit, a B csoportból a fentebb említett 77 eltávolítása után megmaradó 38 antitestet és a C csoport antitestjeit izotipizáltuk, ami lehetővé tette az IgM-ek eltávolítását. Az eredményeket röviden összefoglaljuk az 1. ábrán.

Ezután 42 antitestet teszteltünk arra vonatkozóan, hogy képesek-e egy p53/DNS komplexen szupershiftet kiváltani. A fehérje/Sepharose oszlopon történt tisztítás után az antitestek mennyiségét meghatároztuk. Gélretardációs kísérleteket végeztünk, 30 ng tisztított vad típusú p53 fehérjét inkubálva a p53 specifikus kötőhe7

HU 226 330 Β1 lyének megfelelő 32P-jelölt DNS-szondával. Ezután a különböző antitestekből 300 ng-ot adtunk hozzá. A komplexeket akrilamidgélen választottuk el.

A 2. ábrán bemutatott eredmények azt mutatják, hogy 27 antitest volt képes szupershiftet kiváltani. Ezek közül 19-et vizsgáltunk úgy, hogy a vad p53 fehérjét a His273 mutánssal helyettesítettük ugyanolyan gélretardációs kísérletekben. A 26. számú antitest erőteljesebb késést mutatott, mint a többi. Ezt az antitestet 11D3-nak neveztük, és a következő kísérletekben használtuk fel.

2. példa

A 421 és a D3M ScFv-k előállítása

Az ScFv-ket hibridómákból kaptuk, a molekuláris biológia klasszikus módszereit alkalmazva, PCR-en alapuló technikákkal, a VH és VL régiókra specifikus degenerált primerek segítségével. A 11D3 antitestből származó ScFv-ét D3M-mel jelöltük. Szekvenciáját a 2. számú szekvencián mutatjuk be. Az ScFv421 szekvenciáját az 1. számú szekvencián mutatjuk be.

3. példa

ScFv expressziós vektorok kialakítása

A példa a találmány szerinti nukleinsavak in vitro vagy in vivő átvitelére alkalmas vektorok kialakítását ismerteti.

3.1. Plazmidvektorok kialakítása

A plazmidvektorok kialakításához két vektortípust alkalmaztunk.

- A DNA Cloning, A practical approach, vol. 2., D, M. Glover (Ed), IRL Press, Oxford, Washington DC (1985) helyen leírt pSV2 vektor. Ez a vektor egy eukarióta expressziós vektor. Az ScFv-ket kódoló nukleinsavakat a vektorba egy HpalEcoRV fragmentum formájában építettük be. így az SV40 vírus enhancer promoterének irányítása alá kerültek. A 2. példában leírt mindegyik szerkezetet beépítettük ebbe a vektorba, hogy különböző in vitro és in vivő rendszerekben vizsgáljuk azokat.

- A pCDNA3 vektor (Invitrogen). Szintén egy eukarióta expressziós vektorról van szó. A találmány szerinti ScFv-ket kódoló nukleinsavak ebben a vektorban a CMV korai promoterének irányítása alá kerültek, A 2, példában leírt mindegyik szerkezetet beépítettük ebbe a vektorba, egy HindlllNotl fragmentum formájában.

3.2. Virális vektorok kialakítása

Egy különleges megvalósítási mód szerint a találmány tárgya a korábbiakban definiált nukleinsavak in vivő átvitelét és expresszióját lehetővé tevő virális vektorok kialakítása és alkalmazása.

Részletesebben az adenovírusokról szólva különböző szerotípusokat jellemeztek, melyek szerkezete és tulajdonságai kissé eltérnek. Ezek közül a találmány keretein belül a humán 2 vagy 5 típusú adenovírusokat (Ad2 vagy Ad5), vagy az állati eredetű adenovírusokat [lásd a WO 94/26914 számon közzétett bejelentést] alkalmazhatjuk. A találmány keretein belül alkalmazható állati eredetű adenovírusok közül a kutya-, szarvasmarha-, egér- (például Mav1) [Beard et al., Virology 75, 81 (1990)], juh-, sertés-, madár- vagy majom- (például SAV) eredetű adenovírusokat említhetjük meg. Az állati eredetű adenovírus előnyösen kutyaadenovírus, még előnyösebben a CAV2 adenovírus (például manhattan vagy A26/61 törzs, ATCC VR-800). A találmány keretein belül előnyösen humán vagy kutya- vagy kevert eredetű adenovírusokat alkalmazunk.

A találmány szerinti hiányos adenovírusok előnyösen az ITR-eket, egy részecskeképződést lehetővé tevő szekvenciát és egy találmány szerinti nukleinsavat tartalmaznak. Előnyösebben a találmány szerinti adenovírus genomjában legalább az E1 régió működésképtelen. Az érintett virális gént működésképtelenné tehetjük bármely szakember számára ismert technikával, például teljes szuppresszióval, szubsztitúcióval, részleges delécióval, vagy egy vagy több bázisnak az érintett génbe vagy génekbe történő beépítésével. Az ilyen módosításokat in vitro (az izolált DNS-en) vagy in situ kaphatjuk, például a géntechnológia módszereivel, vagy mutagén ágensekkel végzett kezeléssel. Más területeket is módosíthatunk, például az E3 [WO 95/02697], E2 [WO 94/28938], E4 [WO 94/28152, WO 94/12649, WO 95/02697, WO 96/22378] és L5 régiót [WO 95/02697], Egy előnyös megvalósítási mód szerint a találmány szerinti adenovírus egy deléciót tartalmaz az E1 és E4 régiókban. Egy másik megvalósítási mód szerint az E1 régióban tartalmaz egy deléciót, ahova az E4 régió és a találmány szerinti nukleinsavszekvenciák be vannak építve [WO 96/13596]. A találmány szerinti vírusokban az E1 régióban lévő deléció előnyösen az Ad5 adenovírus szekvenciáján a 455-3329. nukleotidokig terjed ki.

A találmány szerinti hiányos rekombináns adenovírusokat bármely a szakember számára ismert eljárással előállíthatjuk [Levrero et al., Gene 101, 195 (1991), EP 185 573, Graham, EMBO J. 3, 2917 (1984)]. Részletesen, egy adenovírus és egy többek között a kívánt DNS-szekvenciát hordozó plazmid közötti homológ rekombinációval állíthatók elő. A homológ rekombináció az említett adenovírusnak és plazmidnak egy megfelelő sejtvonalba történő kotranszfekciója után valósul meg. Az alkalmazott sejtvonal előnyösen (i) transzformálható kell legyen az említett elemekkel, és (ii) hordoznia kell a hiányos adenovírus genomjának hiányzó részét komplementálni képes szekvenciákat, előnyösen beépített formában, hogy a rekombináció veszélyét elkerüljük. A sejtvonalra példaképpen említhetjük a 293 humán embrionális vesesejtvonalat [Graham et al., J. Gén. Virol. 36, 59 (1977)], amely például az Ad5 adenovírus genomjának bal részét tartalmazza (12%) genomjába beépített módon, vagy az E1 és E4 funkciókat komplementéin! képes sejtvonalakat, melyeket például a WO 94/26914, WO 95/02697 és WO 96/22378 számon közzétett bejelentésekben írnak le.

Végül a felszaporított adenovírusokat a molekuláris biológia klasszikus módszerei szerint összegyűjtjük és tisztítjuk, amint azt a példákban bemutatjuk.

Ami az adenoasszociált vírusokat (AAV) illeti, viszonylag kis méretű DNS-vírusokról van szó, melyek a fertőzött sejt genomjába stabil és helyspecifikus módon

HU 226 330 Β1 beépülnek. Sejtek széles spektrumát képesek fertőzni anélkül, hogy a sejtek növekedésére, morfológiájára vagy differenciálódására hatással lennének. Másrészt úgy tűnik, nem vesznek részt emberi betegségek kialakításában. Az AAV-k genomját klónozták, szekvenálták és jellemezték. Körülbelül 4700 bázist tartalmaz, és mindkét végén egy körülbelül 145 bázisos inverz ismétlődő régió (ITR) található, amely a vírus replikációs origójaként szolgál. A genom fennmaradó része két alapvető területre osztható, amelyek a részecskeképződésért felelős funkciókat hordozzák: a genom bal része, amely a virális replikációban és a vírusgének expressziójában szerepet játszó rep gént tartalmazza, és a genom jobb része, amely a vírus-burokproteineket kódoló cap gént tartalmazza.

Az AAV-eredetű vektorok alkalmazását gének in vitro és in vivő átvitelére már leírták az irodalomban [lásd például WO 91/18088, WO 93/09239, US 4,797,368, US 5,139,941, EP 488 528]. Ezek az Íratok különböző AAV-eredetű konstrukciókat írnak le, melyekben a rep és/vagy cap gének deletáltak, és azokat egy kívánt gén helyettesíti, valamint a konstrukciók alkalmazását az említett kívánt gén in vitro (sejttenyészetben) vagy in vivő (közvetlenül egy szervezetben) átvitelére. A találmány szerinti hiányos rekombináns AAV-ket egy humán helpervírussal (például egy adenovírussal) fertőzött sejtvonalnak egy, a találmány szerinti kívánt nukleinsavszekvenciát az AAV két inverz ismétlődő területe (ITR) között tartalmazó plazmiddal, és egy, a részecskeképződésért felelős géneket (rep és cap gének) hordozó plazmiddal való kotranszfekciójával állíthatjuk elő. Egy alkalmas sejtvonal például a 293 sejtvonal. A termelt rekombináns AAV-ket azután a klasszikus eljárásokkal tisztítjuk.

Ami a herpesz- és retrovírusokat illeti, rekombináns vektor konstrukciókat nagy számban ismertet az irodalom [lásd például Breakfield et al., New Biologist 3, 203 (1991), EP 453 242, EP 178 220, Bernstein et al., Génét. Eng. 7, 235 (1985), McCormick, BioTechnology 3, 689 (1985) stb.]. Részletesen a retrovírusok integratív vírusok, melyek szelektíven az osztódó sejteket fertőzik. Ezek tehát a rákos alkalmazásokhoz megfelelő vektorok. A retrovírusok genomja alapvetően két LTR-t, egy részecskeképződésért felelős szekvenciát és három kódolóterületet (gag, pol, env) tartalmaz. A retrovíruseredetű rekombináns vektorokban a gag, pol és env géneket általában teljesen vagy részben deletálják, és egy kívánt heterológ nukleinsavszekvenciával helyettesítik. A vektorokat különböző típusú retrovírusokból kiindulva hozhatjuk létre, például a MoMuLV („murine moloney leukémia vírus, melyet MomLV-nek is neveznek), az MSV („murine moloney sarcoma vírus”), a HaSV („harvey sarcoma vírus”), az SNV („spleen necrosis vírus), az RSV („rous sarcoma vírus”) vagy a Friend-vírus.

A találmány szerinti rekombináns retrovírusok előállításához, melyek egy találmány szerinti nukleinsavszekvenciát tartalmaznak, általában egy olyan plazmidot szerkesztünk, amely többek között az LTR-eket, a részecskeképződésért felelős szekvenciát és az említett szekvenciát tartalmazza, majd ezt alkalmazzuk egy úgynevezett részecskeképző sejtvonal transzfektálására, amely képes transz-helyzetben szolgáltatni a plazmidból hiányzó retrovirális funkciókat. A részecskeképző sejtvonal tehát általában a gag, pol és env géneket képes kifejezni. Ilyen részecskeképző sejtvonalakat az irodalomban leírtak, például a PA317 sejtvonal [US 4,861,719], a PsiCRIP sejtvonal [WO 90/02806] és a GP+envAm-12 sejtvonal [WO 89/07150]. Másrészről a rekombináns retrovírusok tartalmazhatnak módosításokat az LTR-ek szintjén a transzkripciós aktivitás megszüntetésére, valamint tartalmazhatnak meghosszabbított részecskeképző szekvenciákat, amelyek a gag gén egy részét is tartalmazzák [Bender et al., J. Virol. 61, 1639 (1987)]. A termelt retrovírusokat azután a klasszikus technikákkal tisztítjuk.

A találmány megvalósításához különösen előnyös, ha hiányos rekombináns adenovírust vagy retrovírust alkalmazunk. Ezek a vektorok különösen előnyös tulajdonságokkal rendelkeznek gének tumoros sejtekbe történő átvitele szempontjából.

3.3. Kémiai hordozók

A kifejlesztett szintetikus hordozók közül a polilizin típusú kationos polimerek, (LKLK)_n, (LKKL)_n [WO 95/21931], poli(etilén-imin) [WO 96/02655] és a DEAE dextrán, vagy a kationos lipidek vagy lipofektánsok alkalmazását részesítjük előnyben a találmány keretein belül. Rendelkeznek azzal a képességgel, hogy elősegítik a DNS tömörítését és a sejtmembránhoz kötődését. Az utóbbiak közül a lipopoliaminokat (lipofektamin, transzfektam) [WO 96/17823] és a különböző kationos vagy semleges lipideket (DOTMA, DOGS, DOPE stb.), valamint a nukleáris eredetű peptideket [WO 96/25508] említhetjük meg. Azonkívül a közelmúltban kifejlesztették a célzott, receptor által közvetített transzfekció elméletét, amely szerint a DNS kationos polimereknek köszönhetően összetömörödik, miközben a kationos polimer és a megcélzott sejttípus felszínén jelen levő membránreceptor liganduma közötti kémiai kötésnek köszönhetően a membránhoz kötődik. Igy a transzferrin-, inzulinreceptor vagy a hepatociták aszialoglikoproteinjeinek receptorának megcélzását írták le. Egy ilyen kémiai hordozót alkalmazó találmány szerinti készítmény előállítását bármely a szakember számára ismert eljárással, általában egyszerűen a különböző összetevők érintkeztetésével végezhetjük.

4. példa

Az ScFv-k felismerik a p53-at

AZ ScFv-k kapcsolódását a p53-hoz ELISA teszttel igazoltuk.

Egy myc tagot fuzionáltattunk az ScFv-kkel, hogy detektálásukat lehetővé tegyük. Az ScFv421-et, HD3-at (D3M) és egy kontroll ScFv-t (anti-CD3) az azokat termelő baktériumok periplazmatikus teréből kivontunk.

Tisztított p53-mal bevont ELISA lemezeket inkubáltunk 11D3 IgG, 421 IgG, biotinezett poliklonális antip53 szérum, 11D3 ScFv, ScFv421 és anti-CD3 ScFv különböző hígításaival.

Ezután a két IgG-t egy második, alkalikus foszfatázzal kapcsolt anti-IgG antitesttel mutattuk ki. A biotine9

HU 226 330 Β1 zett szérumot 9E10 anti-myc antitesttel, majd alkalikus foszfatázzal kapcsolt anti-IgG antitesttel mutattuk ki. Az alkalikus foszfatáz aktivitást kolorimetriásan mértük, ezt a 4. ábrán mutatjuk be, ami azt jelzi, hogy a két tisztított IgG, a poliklonális szérum és a 421 és 11D3 ScFv-k felismerik a p53-at, míg az anti-CD3 ScFv inaktív.

5. példa

Az ScFv-k képesek szupershiftet kiváltani a vad p53-nál

Az ScFv-k azon tulajdonságát, hogy képesek aktiválni a vad p53 DNS-kötő funkcióját, gélretardációs vizsgálatokkal teszteltük.

Egy specifikus p53 kötőhellyel rendelkező kétszálú DNS-t 32P-tal jelöltünk, majd tisztított vad p53-mal, és különböző tisztított antitesttel vagy bakteriális periplazmába termelődött ScFv-vel inkubáltuk. A komplexeket akrilamidgél-elektroforézissel választottuk el.

A kapott eredményeket az 5. ábrán mutatjuk be.

A DNS/p53 komplex az „Alap” sávnál figyelhető meg. A HR231, pAb421 és 11D3 antitestek képesek késést kiváltani (szupershift), és megnövelni a DNS/p53 komplex mennyiségét.

A 421 és D3M ScFv-k szintén képesek szupershiftet kiváltani, míg egy anti-ras kontroll ScFv (Y28) csendes maradt. Az ScFv421 a D3M ScFv-vel ellentétben kiváltja a p53/DNS komplex mennyiségének növekedését is.

6. példa

Az ScFv-k képesek egy p53 mutáns DNS-kötő funkcióját helyreállítani

Ezzel analóg módon vizsgáltuk az ScFv-ket arra vonatkozóan is, hogy képesek-e helyreállítani az inaktív Trp248 mutáns DNS-kötő funkcióját. A kapott eredményeket a 6. ábrán mutatjuk be.

Ezek azt mutatják, hogy a két ScFv kiváltja a p53/DNS komplexnek megfelelő retardált sáv megjelenését.

7. példa

Az ScFv-k helyesen fejeződnek ki tumoros sejtekben

Az ScFv-k expresszióját egy expressziós vektor 5 (SV40 promoter) H1299 tumoros sejtekbe történő átmeneti transzfekciójával igazoltuk. Részletesebben a nukleinsavakat pSV2 típusú plazmidvektor formájában adtuk be (3. példa), egy kationos lipid, a lipofektamin jelenlétében.

A kapott eredményeket a 7. ábrán mutatjuk be. Összkivonattal végzett Western-blottal egy fő sávot figyeltünk meg, amely 30 kD körül futott, amely a várt méretnek felel meg, és alátámasztja, hogy a molekulák tumoros sejtekben jelentős mértékben kifejeződnek.

8. példa

Az ScFv-k képesek részlegesen helyreállítani a His273 mutánsok transzaktivátor funkcióját Az ScFv-k működőképességét tumoros sejtekben a p53 mutáns formáinak hiányos transzaktivátor funkcióján a következő módon mértük:

Átmeneti transzfekciót végeztünk H358 vagy H1299 sejtvonalakban (mindkettő p53 deletált), vagy a HT29 sejtvonalban (hordozza a His273 p53 mutánst).

A transzfekciók a vad típusú p53-at, vagy a H273 vagy His175 mutánst, a két ScFv-t kifejező vektorokat, és egy riporterplazmidot kifejező vektorokat vezettek be, amely utóbbi a CAT (kloramfenikol acetil-transzferáz) gént tartalmazta egy p53-függő promoter irányítása alatt. A 48 órával a transzfekció után mért CAT-aktivitás a p53 transzaktivátor funkcióját tükrözi.

A 8. ábra eredményei azt jelzik, hogy a H358 sejtvonalban a két ScFv képes szignifikánsan újra aktiválni a His273 mutáns transzkripciós aktivitását, és azonos 35 eredményeket figyeltünk meg a H1299 sejtvonalban is.

Ezenfelül a HT29 sejtvonalban a két ScFv képes volt megnövelni a His273 mutáns endogén transzkripciós aktivitását is (9. ábra).

SZEKVENCIAJEGYZÉK

1. számú szekvencia:

Az ScFv421 nukleotid- és peptidszekvenciája

1/1

31/11

CAG GTG

CAG

CTG

CAG

CAG

TCT

GGG

GCA

GAG

CTT GTG

AGG

TCA

GGG

GCC

TCA

GTC

AAG

TTG

gin val

gin

leu

gin

gin

ser

giy

ala

glu

leu val

arg

ser

giy

ala

ser

val

lys

leu

61/21

91/31

TCC TGC

ACA

GCT

TCT

GGC

TTC

AAC

ATT

AAA

GAC TAC

TAT

ATG

CAC

TGG

GTG

AAG

CAG

AGG

ser cys

thr

ala

ser

gly

phe

asn

ile

lys

asp tyr

tyr

met

his

trp

val

lys

gin

arg

121/41

151/51

CCT GAA

CAG

GGC

CTG

GAG

TGG

ATT

GGA

TGG

ATT GAT

CCT

GAG

AAT

GGT

GAT

ACT

GAA

TAT

pro glu

gin

giy

leu

glu

trp

ile

giy

trp

ile asp

pro

glu

asn

giy

asp

thr

glu

tyr

181/61

211/71

GCC CCG

AAG

TTC

CAG

GGC

AAG

GCC

ACT

ATG

ACT GCA

GAC

ACA

TCC

TCC

AAT

ACA

GCC

TAC

ala pro

lys

phe

gin

giy

lys

ala

thr

met

thr ala

asp

thr

ser

ser

asn

thr

ala

tyr

241/81

271/91

CTG CAG

CTC

AGC

AGC

CTG

GCA

TCT

GAG

GAC

ACT GCC

GTC

TAT

TAT

TGT

AAT

TTT

TAC

GGG

leu gin

leu

ser

ser

leu

ala

ser

glu

asp

thr ala

val

tyr

tyr

cys

asn

~ihe tyr gly

301/101

331/111

GAT GCT

TTG

GAC

TAT

TGG

GGC

CAA

GGG

ACC

ACG GTC

ACC

GTC

TCC

TCA

GGT

GGA

GGC

GGT

asp ala

leu

asp

tyr

trp

gly

gin

giy

thr

thr val

thr

val

ser

ser

gly

giy giy gly

HU 226 330 Β1

361/121 391/131

TCA

GGC

GGA GGT

GGC

TCT

GGC

GGT

GGC GGA TCG GAT

GTT

TTG ATG ACC

CAA

ACT

CCA

CTC

ser gly 421/141

gly

gly

gly

ser

gly

gly

giy

giy

ser asp 451/151

val

leu

met

thr

gin

thr

pro

leu

ACT

TTG

TCG

GTT

ACC

ATT

GGA

CAA

CCA

GCC

TCC ATC

TCT

TGC

AAG

TCA

AGT

CAG

AGC

CTC

thr leu 481/161

ser

val

thr

ile

giy

gin

pro

ala

ser ile 511/171

ser

cys

lys

ser

ser

gin

ser

leu

TTG

GAT

AGT

GAT

GGA

AAG

ACA

TAT

TTG

AAT

TGG TTG

TTA

CAG

AGG

CCA

GGC

CAG

TCT

CCA

leu asp 541/181

ser

asp

giy

lys

thr

tyr

leu

asn

trp leu 571/191

leu

gin

arg

pro

giy

gin

ser

pro

AAG

CGC

CTA

ATC

TAT

CTG

GTG

TCT

AAA

CTG

GAC TCT

GGA

GTC

CCT

GAC

AGG

TTC

ACT

GGC

lys arg 601/201

leu

ile

tyr

leu

val

ser

lys

leu

asp ser 631/211

gly

val

pro

asp

arg

phe

thr

gly

AGT

GGA

TCA

GGG

ACA

GAT

TTC

ACA

CTG

AAA

ATC AAC

AGA

GTG

GAG

GCT

GAG

GAT

TTG

GGA

ser gly 661/221

ser

giy

thr

asp

phe

thr

leu

lys

ile asn 691/231

arg

val

glu

ala

glu

asp

leu

giy

GTT

TAT

TAT

TGC

TGG

CAA

GGT

ACA

CAT

TCT

CCG CTC

ACG

TTC

GGT

GCT

GGC

ACC

AAG

CTG

val

tyr

tyr

cys

trp

gin

giy

thr

his

ser

pro leu

thr

phe

gly

ala

gly

thr

lys

leu

721/241

GAA ATC AAA glu ile lys

2. számú szekvencia:

A D3M 11D3 ScFv nukleotid- és peptidszekvenciája

1/1	31/11
CAG GTC	AAG CTG CAG GAG TCA GGG GCA GAA CTT GTG AGG TCA GGG GCC TCA GTC AAT TTG
gin val	lys leu gin glu ser gly ala glu leu val arg ser gly ala ser val asn leu
61/21	91/31
TCC TGC	ACA GCT TCT GGC TTC AAC ATT MA GAC TAC TAT ATG CAC TGG CTG AAA CAG AGG
ser cys	thr ala ser gly phe asn ile lys asp tvr tvr met his trp val lys gin arg
121/41	151/51
CCT GAA	GAG GGC CTG GAG TGG ATT GGA TAT ATT GAT CCT GAG AGT GGT GAA ACT GAA TAT
pro glu	glu gly leu glu trp ile gly tyr ile asp pro glu ser gly glu thr glu tvr
181/61	211/71
GCC CCG	AAC TTC CAG GGC AAG GCC ACT GTG ACT GCA GAC ACA TCC TCC AAC ACA GCC TAC
ala pro	asn phe gin gly lys ala thr val thr ala asp thr ser ser asn thr ala tyr
241/81	271/91
CTG CAC	CTG AGC AGC CTG ACA TCT GAG GAC ACA ACC GTC TAT TAC TCT AAT GCA CTC ATC
leu his	leu ser ser leu thr ser glu asp thr thr val tyr tyr cys asn ala val ile
301/101	331/111
TAC TAT	GAA TAC GAC GGC TAT GCT TTG GAC TAC TGG GGC CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC
tvr tvr	glu tvr asp glv tvr ala leu asp tvr trp gly gin glv thr thr val thr val
361/121	391/131
TCC TCA	GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC TCT GGC GGT GGC GGA TCG GAC ATT GAG
ser ser	gly gly gly gly ser gly gly gly gly ser gly gly gly gly ser asp ile glu
421/141	451/151
CTC ACC	CAG TCT CCA TCT TCC CTG GCT GTG TCA GCA GGA GAG AAG GTC GCT ATG AGC TGC
leu thr	gin ser pro ser ser leu ala val ser ala gly glu lys val ala met ser cys
481/161	511/171
AAA TCC	ACT CAG ACT CTG TTC AAC ACT AGA ACC CGA AAG AAT TAC TTG GCT TGG TAT CAG
lvs ser	ser gin ser leu phe asn ser arg thr arg lvs asn tvr leu ala trp tvr gin
541/181	571/191
CAG AAA	CCA GGG CAG TCT CCT AAA GTG CTG ATC TAC TGG GCA TCC ACT AGG GAA TCT GGA
gin lys	pro gly gin ser pro lys val leu ile tyr trp ala ser thr arg glu ser qly
601/201	631/211
CTC CCT	GAT CGC TTC ACA GGC ACT GGA TCT GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC ACT
val pro	asp arg phe thr gly ser gly ser gly thr asp phe thr leu thr ile ser ser
661/221	691/231
GTG CAG	GCT GAA GAC CTG GCA GTT TAT TAC TGC AAG CAA TCT TAT AAT CTA CCG ACG TTC
val gin	ala glu asp leu ala val tyr tyr cys lys gin ser tvr asn leu pro thr phe
721/241
GGC GGG	GGC ACC AAG CTG GAA ATC AAA
giy giy	gly thr lys leu glu ile lys

Claims (18)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Egy egyláncú antitest alkalmazása, amely képes specifikusan kötődni a p53 C-terminális területén a 320-393. maradékok között levő epitóphoz, olyan rákok kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására, amelyekben egy mutáns p53 fehérje részt vesz.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy az egyláncú antitest az 1. számú szekvenciával rendelkező ScFv421 vagy a 2. számú szekvenciával rendelkező 11D3.
3. 3. Egy nukleinsav alkalmazása, amely egy, a p53 C-terminális területén a 320-393. maradékok között jelen levő epitóphoz specifikusan kötődni képes egyláncú antitestet kódol, olyan rákok kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására, amelyekben egy mutáns p53 fehérje részt vesz.
4. 4. A 3. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a nukleinsav az 1. számú szekvenciával rendelkező ScFv421 egyláncú antitestet vagy a 2. számú szekvenciával rendelkező 11D3 egyláncú antitestet kódolja.
5. 5. A 4. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a nukleinsav egy vektor része.
6. 6. Az 5. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a vektor egy virális vektor.
7. 7. A 6. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a vektor egy hiányos rekombináns adenovírus.
8. 8. A 6. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a vektor egy hiányos rekombináns retrovírus.
9. 9. A 6. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a vektor egy hiányos rekombináns AAV.
10. 10. A 6. igénypont szerinti alkalmazása, azzal jellemezve, hogy a vektor egy hiányos rekombináns HSV.
11. 11. Az 1-10. igénypontok egyike szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a rák tüdőrák, vastagbélrák, fej- és nyakrák, májrák vagy agytumor.
12. 12. Az 1-3. igénypontok egyike szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a mutáns p53 fehérje p53H273, p53W248 vagy p53G281 fehérje.
13. 13. A 2. számú szekvenciában bemutatott 11D3 molekula.
14. 14. Nukleinsav, amely egy 13. igénypont szerinti molekulát kódol.
15. 15. A 14. igénypont szerinti nukleinsav, amely a 2. számú szekvenciával jellemzett.
16. 16. Készítmény, amely egy 15. igénypont szerinti nukleinsavat tartalmaz.
17. 17. Készítmény, amely egy 13. igénypont szerinti molekulát tartalmaz.
18. 18. Gyógyszerkészítmény rák kezelésére, amely egy 14. igénypont szerinti nukleinsavat és egy gyógyszerészetileg elfogadható hordozót tartalmaz.