DE69636365T2 - Peptide und zusammensetzungen, die die apoptose modulieren. - Google Patents

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft im allgemeinen das Gebiet der Zellphysiologie und im speziellen den programmierten Zelltod bzw. die Apoptose. Die neuen Peptide und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sind nützlich zur Modulation von Apoptose in Zellen.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Es ist bekannt, dass das Phänomen des programmierten Zelltods bzw. der "Apoptose" beim normalen Verlauf einer Vielzahl von Entwicklungsprozessen, einschließlich der Reifung des Immun- und Nervensystems, eine wichtige Rolle spielt (Ellis, R. E., et al., Annu. Rev.Cell. Biol. 7: 663-698 (1991); Oppenheim, R. W., Annu. Rev. Neurosci. 14: 53-501 (1991): Cohen, J. J., et al. Annu. Rev. Immunol. 10: 267-293 (1992); Raff, M. C., Nature 356: 397-400 (1992)). In diesem Zusammenhang aktivieren im Normalfall eine Reihe von physiologischen Signalen den programmierten Zelltod; es können jedoch auch nicht physiologische Insulte, so wie Bestrahlung und Exposition gegenüber Wirkstoffen, welche DNA schädigen, die Apoptose auslösen (Eastman, A., Cancer Cells 2: 275-280 (1990); Dive, C., et al., Br. J Cancer 64: 192-196 (1991); Lennon, S. V., et al., Cell Prolif. 24: 203-214 (1991)).
  • Zusätzlich zu ihrer Rolle bei der Entwicklung stellt die Apoptose ebenfalls eine wichtige Schutzfunktion der Zelle gegen die Tumorgenese dar (Williams, G. T., Cell 65: 1097-1098 (1991); Lane, D. P., Nature 362: 786-787 (1993)). Unter gewissen Bedingungen sterben Zellen durch Apoptose als Antwort auf hohe oder deregulierte Expression von Onkogenen (Askew, D., et al., Oncogene 6: 1915-1922 (1991); Evan, G. I., et al., Cell 69:119-128 (1992); Rao, L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7742-7746 (1992); Smeyne, R. J., et al., Nature 363: 166-169 (1993); Tanaka, S., et al., Cell 77: 829-839 (1994); Wu, X., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3602-3606 (1994)). Die Suppression des apoptotischen Programms, mittels einer Reihe von genetischen Läsionen, kann zur Entwicklung und zum Fortschreiten der Malignität beitragen. Dies wird durch die häufige Mutation des p53-Tumorsuppressorgens in humanen Tumoren gut veranschaulicht (Levine, A. J., et al., Nature 351: 453-456 (1991)).
  • Wildtyp-p53 ist erforderlich für die effiziente Induktion der Apoptose nach einer Schädigung der DNA (Clarke, A. R., et al., Nature 362: 849-852 (1993); Lowe, S. W., et al., Cell 74: 957-967 (1993); Lowe, S. W., et al., Nature 362: 847-849 (1993)) und für den durch konstitutive Expression spezifischer Onkogene induzierten Zelltod (Debbas, M., et al., Genes & Dev. 7: 546-554 (1993); Hermeking, H., et al., Science 265: 2091-2093 (1994); Tanaka, S., et al., Cell 77: 829-839 (1994); Wu, X., et al., Natl. Acad. Sci. USA 91: 3602-3606 (1994)). Die Zytotoxizität vieler im allgemeinen verwendeter chemotherapeutischer Agenzien wird durch Wildtyp-p53 vermittelt (Lowe, S. W., et al., Cell 74:957-967 (1993); Fisher, D. E., Cell 78: 539-542 (1994)). Daher kann der Verlust der p53-Funktion zum klinisch signifikanten Problem der wirkstoffresistenten Tumorzellen, welche nach Chemotherapie-Regimen auftreten, beitragen.
  • Das Expressionsprodukt des bcl-2-Onkogens fungiert als ein potenter Suppressor des apoptotischen Zelltods (McDonnell, T. J., et al., Cell 57: 79-88 (1989); Hockenbery, D., et al., Nature 348: 334-336 (1990)). Konstitutive Bcl-2-Expression kann die durch diverse Stimuli, einschließend Entzug des Wachstumsfaktors, Onkogenexpression, DNA-Schädigung und oxidativen Stress, ausgelöste Apoptose unterdrücken (Vaux, D. L., et al., Nature 335: 440442 (1988); Sentman, C. L., et al., Cell 67: 879-888 (1991); Strasser, A., et al., Cell 67: 889-899 (1991); Fanidi, A., et al., Nature 359: 554-556 (1992); Hockenbery, D. M., et al., Cell 75:241-251 (1993)). Zudem gibt es die speziesübergreifende Konservierung der Bcl-2-Funktion. Beispielsweise scheint das ced-9-Gen des Nematoden C. elegans ein strukturelles und funktionelles Homolog von bcl-2 zu sein (Hengartner, M. O., et al., Cell 76:665-676 (1994)) und bcl-2 kann ced-9-Mutationen in transgenen Tieren komplementieren (Vaux, D. L., et al., Science 258: 1955-1957 (1991)). Diese Beobachtungen legen nahe, dass Bcl-2 eng mit einem evolutionär konservierten Zelltodprogramm verbunden ist.
  • Es ist bekannt, dass bcl-2 ein Mitglied einer Familie von verwandten Genen ist, von denen zumindest einige ebenfalls die Apoptose modulieren. Von diesen weist bcl-x den höchsten Grad der Homologie mit bcl-2 auf und es wird differentiell gespleißt in eine lange Form, genannt bcl-xL, und eine kürzere Form, bcl-xS, welche eine interne Deletion beherbergt (Boise, L. H., et al., Cell 74: 597-608 (1993)). Bcl-xL funktioniert, indem es die Apoptose unterdrückt, wohingegen die deletierte Form, Bcl-xS, den durch Bcl-2-Expression bereitgestellten Schutz gegen Zelltod inhibiert. Ein zweites Bcl-2-Homolog, Bax, bildet Heterodimere mit Bcl-2 (Oltvai, Z. N., et al., Cell 74: 609-619 (1993)) und es wurde gezeigt, dass es Bcl-2 entgegenwirkt und die Apoptose beschleunigt. Die Mutationsanalyse von Bcl-2 wies darauf hin, dass die Wechselwirkung mit Bax für Bcl-2 erforderlich ist, damit es als ein Inhibitor des Zelltods funktioniert (Yin, X. -M., et al., Nature 369: 321-323 (1994)). Chittenden, T., et al (1995), Nature 374: 733-736 beschreibt die Expression eines mit bcl-2 verwandten Gens, das als bak bezeichnet wird. Ektopische Bak-Expression beschleunigt den Tod einer IL-3-abhängigen Zelllinie beim Entzug von Cytokin und steht dem von Bcl-2 gebotenen Schutz gegen die Apoptose entgegen. Zusätzlich ist die erzwungene Expression von Bak ausreichend, um die Apoptose von Fibroblasten, denen das Serum entzogen wurde, zu induzieren und somit die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, dass Bak den Zelltodmechanismus direkt aktiviert oder selbst ein Bestandteil davon ist.
  • Die bekannten mit Bcl-2 verwandten Gene, sofern analysiert, weisen individuelle Expressionsmuster auf und können daher in verschiedenen Geweben funktionieren. Wenngleich die Bcl-2-Expression zur Aufrechterhaltung des reifen Immunsystems erforderlich zu sein scheint, ist es wünschenswert, andere Gene zu identifizieren, welche den apoptotischen Zelltod in anderen Abstammungslinien steuern können. Darüber hinaus kann die Identifizierung von bestimmten Regionen oder Domänen der von solchen Genen kodierten Proteine eine Basis zum Verständnis ihrer strukturellen und funktionellen Merkmale bereit stellen und die Entwicklung von wertvollen diagnostischen und therapeutischen Methoden gestatten. Beispielsweise wäre die Identifizierung von Agenzien, welche dazu in der Lage sind, die Apoptose in Tumorzellen (in welchen der Verlust der Funktion des p53-Tumorsuppressorgens mit Tumorgenese und klinisch signifikanter Wirkstoffresistenz in Verbindung gebracht werden kann) wieder herzustellen oder zu induzieren, von beträchtlichem therapeutischen Nutzen, insbesondere in Fällen, in denen eine solche Wiederherstellung oder Induzierung unabhängig von der p53-Funktion war. In ähnlicher Weise wäre die Entwicklung von Agenzien, welche dazu in der Lage sind, der antiapoptotischen Funktion von Onkogenen, so wie bcl-2, dessen Aktivierung mit der Tumorgenese (z. B. Lymphom) und der Resistenz gegen chemotherapeutische Wirkstoffe in Verbindung gebracht wird, entgegenzuwirken, von großem potentiellen Nutzen.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Proteindomäne, welche von allgemeiner Signifikanz für die Vorgänge in Molekülen ist, welche den multiplen Zelltod regulieren, und welche als in einer kurzen Untersequenz im zentralen Abschnitt des Bak-Moleküls liegend identifiziert und kartiert wurde. Diese bisher unerkannte Proteindomäne, welche der Erfinder die "GD-Domäne" benannt hat, ist essentiell sowohl für die Wechselwirkung von Bak mit Bcl-xL als auch für die zelltötende Funktion von Bak. Gekürzte, die GD-Domäne umfassende Bak-Spezies sind an sich ausreichend, um an Bcl-xL zu binden und Zellen in Transfektionsassays zu töten.
  • Die GD-Domäne wurde in zwei anderen Bcl-2 bindenden Proteinen identifiziert, welche die Apoptose induzieren: Bax und Bip 1a. Ebenso wie bei Bak, vermindert eine Mutation der homologen GD-Domänen-Elemente in Bax und Bip 1a die zelltötende Funktion und die Proteinbindungsfunktion. Folglich ist die GD-Domäne verantwortlich für die Vermittlung von eine Schlüsselrolle spielenden Protein/Protein-Wechselwirkungen, welche für die Vorgänge in Molekülen, welche den multiplen Zelltod regulieren, von Bedeutung sind. Also betrifft die vorliegende Erfindung in einem Aspekt ein isoliertes Peptid, bestehend aus einem gekürzten Protein ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Bak, Bax und Bip 1a oder Mutanten davon, gekennzeichnet dadurch, dass das Peptid die GD-Domäne umfasst und zelltötende Aktivität sowie Bcl-xL-Bindung aufweist, wobei die GD-Domäne von Bak QLAIIGDDIN ist, die GD-Domäne von Bax CLKRIGDELD ist und die GD-Domäne von Bip 1a RLACIGDEMD ist. Solche Peptide sind nützlich zur Induzierung oder Modulation des apoptotischen Zustands einer Zelle. Chemische Verbindungen, welche die Funktion der GD-Domäne stören, finden Verwendung als die Apoptose modulierende Agenzien. Dem entsprechend betrifft die vorliegende Erfindung in einem weiteren Aspekt Agenzien, welche dazu in der Lage sind, die Funktion der GD-Domäne zur Verwendung bei der Therapie von degenerativen Störungen zu modulieren (d.h. zu inhibieren oder zu verstärken). Solche Agenzien schließen ein: die aus den GD-Domänen-Peptiden sowie Mimetika, Fragmenten, funktionellen Äquivalenten und/oder Hybriden oder Mutanten davon ausgewählten Agenzien, ebenso wie Vektoren, welche cDNA enthalten, welche irgendein Element der zuvor genannten Auflistung kodiert. Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Identifizierung von Agenzien bereit, welche dazu in der Lage sind, die Funktion der GD-Domäne zu modulieren (z. B. Moleküle, welche die Apoptose modulieren).
  • In zusätzlichen Aspekten betrifft die vorliegende Erfindung Produkte und Verfahren, welche mit der Klonierung, der Herstellung und der Expression der von den obigen abgeleiteten Peptide der Erfindung, welche die GD-Domäne umfassen, zu tun haben; Antikörper mit Spezifität für besagtes Peptid sowie Nukleotidsequenzen, welche besagte Peptide kodieren. Die Peptide der vorliegenden Erfindung, welche die GD-Domäne umfassen, sind nützlich, um damit Antikörper hierfür herzustellen. Solche Antikörper sind nützlich zur Detektion und Isolation von Proteinen, welche die GD-Domäne umfassen, in biologischen Proben, einschließlich beispielsweise Zellen aus allen menschlichen Geweben, einschließlich Herzgewebe, Lungengewebe, Tumorzellen, Gehirngewebe, Plazenta, Leber, Skelettmuskel, Niere und Bauchspeicheldrüse, ebenso wie zur Modulation der apoptotischen Aktivität von Proteinen, welche die GD-Domäne umfassen, in und aus solchen biologischen Proben, und machen zusätzliche Aspekte der vorliegenden Erfindung aus.
  • In noch einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Expressionsvektoren enthaltend genetische Sequenzen, Wirte, die mit solchen Expressionsvektoren transformiert wurden und Verfahren zur Herstellung der rekombinanten GD-Domänen-Peptide der vorliegenden Erfindung bereit.
  • Die Agenzien der vorliegenden Erfindung können angewendet werden in Verfahren zur Induzierung oder Suppression von Apoptose in den Zellen und/oder Geweben von Individuen, welche an degenerativen Störungen leiden, welche gekennzeichnet sind durch unangemessene Zellproliferation bzw. unangemessenen Zelltod. Durch unangemessene Zellproliferation gekennzeichnete degenerative Störungen schließen z. B. ein: entzündliche Beschwerden, Krebs, einschließlich Lymphome so wie Prostatavergrößerung, genotypische Tumoren und dergleichen. Durch unangemessenen Zelltod gekennzeichnete degenerative Störungen schließen beispielsweise ein: Autoimmunkrankheiten, erworbenes Immundefizienzsyndrom (AIDS), Zelltod durch Bestrahlungstherapie oder Chemotherapie, neurodegenerative Krankheiten so wie Alzheimer und Parkinson und dergleichen.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung eines Antikörpers gegen ein GD-Domänen-Peptid ausgewählt aus einer der SEQ ID NRs: 1 bis 10, um eine cDNA-Expressionsbibliothek oder Klone zu screenen, welche DNA-Insertionen umfassen, welche immunkreuzreaktive Proteine zur Detektion der Anwesenheit der GD-Domänen-Peptide kodieren. Die Polynukleotide und Antikörper der vorliegenden Erfindung können zur Diagnose der degenerativen Störungen angewandt werden, welche mit einem Expressionslevel von die GD-Domäne umfassenden Proteinen assoziiert werden, der im Vergleich zum erwarteten Expressionslevel von solchen Proteinen in der normalen Zellpopulation erhöht oder vermindert ist.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von erfindungsgemäßen Peptiden zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von degenerativen Störungen gekennzeichnet durch unangemessene Zellteilung oder unangemessenen Zelltod.
  • Die Peptide der vorliegenden Erfindung können angewandt werden in Verfahren zur Modulation des apoptotischen Zustands einer Zelle durch Verabreichen besagter Peptide oder Mutanten davon an ein Individuum, welches an einer degenerativen Störung leidet, welche durch unangemessene Zellproliferation oder durch unangemessenen Zelltod gekennzeichnet ist, um die unangemessene Zellproliferation zu stabilisieren (d.h. die Apoptose zu induzieren) bzw. den unangemessenen Zelltod zu stabilisieren (d.h. die Apoptose zu unterdrücken) und/oder, in jedem der beiden Fälle, das normale Zellverhalten wieder herzustellen.
  • In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die überraschende Entdeckung, dass die Bak-GD-Domäne an der Homodimerisation und Heterodimerisation von Bak beteiligt und für diese ausreichend ist. Nicht einschränkende Beispiele für die Bak-GD-Domänen-Dimerisation schließen Bak (Homodimerisation), Bax (Heterodimerisation mit einem unterschiedlichen Killerprotein) und Bcl-xL (Heterodimerisation mit einem Überlebensprotein) ein. Es wurde des weiteren unerwarteterweise gefunden, dass die nicht essentiellen Bereiche des Bak-Proteins in diesem Aspekt die beiden Domänen der Carboxylterminalen Hälfte des Proteins einschließen, welche den höchsten Grad an Homologie zu anderen Mitgliedern der Bcl-2 Familie (Bcl-2-Homologiedomänen I und II) aufweisen. Folglich sind Peptide, welche die GD-Domäne umfassen, in der Lage, Wechselwirkungen nicht nur mit Bcl-xL, sondern auch mit Bak und Bax zu vermitteln.
  • Diese und weitere Gegenstände und Aspekte der vorliegenden Erfindung werden für den Fachmann anhand der nachfolgenden Beschreibung offensichtlich sein.
  • Beschreibung der Figuren
  • 1. Zelltötende Funktion von Bak in verschiedenen Zelllinien.
  • Die gezeigten Zelllinien wurden mit einem β-Galaktosidase-Markerplasmid in Kombination mit entweder einem mit Kontrollplasmid (Vektor) oder einem mit Plasmid exprimierendem HA-Epitop markierten Bak (HA-Bak) co-transfiziert. Die Zellen wurden 24 Stunden nach der Transfektion mit X-gal fixiert und gefärbt und die Anzahl blauer Zellen (β-Galaktosidasepositiv) wurden mittels mikroskopischer Untersuchung gezählt.
  • 2. Zusammenfassung der zelltötenden Aktivität von Bak-Deletionsmutanten und gekürzten Spezies.
  • Die Strukturen der verschiedenen Bak-Mutanten sind schematisch dargestellt. Der/die durch Deletion entfernte/n exakte/n Aminosäurebereich/e wird/werden durch die Zahlen an der linken Seite angezeigt. Die Endpunkte der Bak-Aminosäurereste, welche in den gekürzten Spezies verbleiben (unten: QVG und PEM), werden durch die an die schematischen Darstellungen ihrer jeweiligen Strukturen angrenzenden Zahlen angezeigt. Die Ratte-I-Zelltötungsaktivität wird wie folgt zusammengefasst: +, Zelltötungskapazität gleichwertig mit Wildtyp-Bak; -, keine zelltötende Aktivität; +/-, verminderte zelltötende Aktivität im Vergleich zu Wildtyp-Bak. nd bedeutet, dass das Experiment nicht durchgeführt wurde.
  • 3. Wechselwirkung von Bak mit Bcl-xL.
  • A). In vitro gemessene Bak/Bcl-xL-Wechselwirkungen. Mit 35S markiertes, in vitro translatiertes Bak (Spur 1) wurde mit entweder GST-Bcl-xL (Spur 2) oder mit GST (Spur 3) gemischt. Die Komplexe wurden auf Glutathion-Agarose-Beads gefangen und gebundenes, mit 35S markiertes Bak-Protein wurde mittels Elektrophorese auf SDS-Polyacrylamidgels detektiert, gefolgt von Autoradiographie. B). In transfizierten Zellen detektierte Bak/Bcl-xL-Wechselwirkungen. Plasmid exprimierende mit Epitop-Tags versehene Formen von Bak und Bcl-xL (HA-Bak und Flagtag-Bcl-xL) wurden in COS-Zellen co-transfiziert. HA-Bak wurde aus transfizierten Zelllysaten immunpräzipitiert (anti-HA-IP) und assoziiertes Bcl-xL wurde mittels Western-Blot-Analyse mit einem anti-Flag-Tag-Antikörper detektiert.
  • 4. Zusammenfassung der Bcl-xL bindenden Funktion von Bak-Deletionen und gekürzten Spezies.
  • Die Strukturen der verschiedenen Bak-Mutanten sind schematisch dargestellt, wie in 2 beschrieben. Die Fähigkeit der Bak-Mutanten und gekürzten Spezies, mit Bcl-xL zu interagieren, wird (auf der rechten Seite) wie folgt zusammengefasst: +, gleichwertig mit Wildtyp-Bak bezüglich der Fähigkeit, sowohl in vitro als auch in transfizierten COS-Zellen mit Bcl-xL zu interagieren; -, es wurde keine Interaktion mit Bcl-xL detektiert; –/+, Wechselwirkung im Vergleich zu Wildtyp-Bak stark vermindert und nur in vitro zu detektieren.
  • 5. Zur Bak-GD-Domäne homologe Bereiche sind in Bip 1a und Bax vorhanden.
  • Oben. Schematische Strukturen der Proteine mit den Positionen der GD-Domänen-Homologie (offene Kästchen), des hydrophoben Segments (schraffierte Kästchen) und der Bcl-2-Homologie-Domänen (gefüllte Kästchen).
  • Unten. Aminosäuresequenz der Regionen in Bip 1a und Bax, welche zur Bak-GD-Domäne homolog sind. Die hervorgehobenen Reste sind in wenigstens zwei der Proteine identisch, schattierte Reste bedeuten konservative Aminosäureveränderungen. Ebenfalls gezeigt (durchgezogenen Linien) sind die Aminosäurebereiche, welche in den gezeigten Bip 1a-, Bak- und Bax-Deletionsmutanten entfernt wurden.
  • 6. Zusammenfassung der zelltötenden- und Bcl-xL bindenden Aktivitäten der GD-Domänen-Deletionsmutanten.
  • Die Daten zur zelltötenden und Bcl-xL bindenden Funktion werden wie in 2 bzw. in 4 beschrieben zusammengefasst.
  • 7. Bak-GD-Domänen-Dimerisation.
  • Wechselwirkungen der Bak-GD-Domäne mit Bak und Bax wurden im wesentlichen wie für Bak, das an Bcl-xL bindet, gemessen. Ein die GD-Domäne (Reste 58-103) umfassender Abschnitt von Bak wurde mit GST fusioniert, um GST-PEM zu erzeugen. In vitro translatiertes, mit 35S markiertes Bcl-xL, Bak, Bax und Bip 1a wurden entweder mit GST alleine oder mit GST-PEM bakteriell exprimierten Fusionsproteinen inkubiert. Komplexe wurden mit Glutathion-Agarose-Beads gefangen, gewaschen und die gebundenen Proteine wurden mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Autoradiographie detektiert. Bcl-xL, Bak und Bax interagieren alle spezifisch mit GST-PEM, nicht jedoch mit GST alleine. Folglich ist die GD-Domäne in der Lage, eine Wechselwirkung mit nicht nur Bcl-xL, sondern auch mit Bak und Bax zu vermitteln.
  • 8. Die GD-Domäne in Bak, Bax und Bip 1a kodierende DNA-Sequenz.
  • Die GD-Domänenbereiche für Bax (1-4), Bax (5-7) und Bip 1a (8-10) kodierende DNA-Sequenzen sind zusammen mit ihren entsprechenden Aminosäuresequenzen gezeigt. Die Nukleotidzahlen über jeder Sequenz beziehen sich auf einen Start bei dem initiierenden ATG für jedes Protein. Die unterstrichene Zahl bezieht sich auf die Position der ersten und der letzten Aminosäure des gezeigten Peptids.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Sofern nicht anderweitig definiert, haben die hierin verwendeten technischen und wissenschaftlichen die vorliegende Erfindung betreffenden Fachbegriffe die Bedeutungen, wie sie vom durchschnittlichen Fachmann verstanden werden. Es wird hierin auf verschiedene dem Fachmann bekannte Methodologien Bezug genommen. Publikationen und anderes Material, das solche bekannten Methodologien, auf die Bezug genommen wird, darlegt, werden hierin in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme so einbezogen, als ob sie in vollem Umfang dargelegt würden. Standardgemäße Referenzarbeiten, welche die allgemeinen Prinzipien der rekombinanten DNA-Technologie darlegen, schließen ein: Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Planview, New York, USA (1989); McPherson, M. J., Ed., Directed Mutagenesis: A Practical Approach. IRL Press, Oxford, GB (1991); Jones, J., Amino Acid and Peptide Synthesis, Oxford Science Publications, Oxford, GB (1992); Austen, B. M. und Westwood, O. M. R., Protein Targeting and Secretion, IRL Press, Oxford, GB (1991). Zur Durchführung der vorliegenden Erfindung können jegliche geeigneten Materialien und/oder Verfahren, welche dem Fachmann bekannt sind, angewendet werden; bevorzugte Materialien und/oder Verfahren sind jedoch hierin beschrieben. Materialien, Reagenzien und dergleichen, auf welche in der folgenden Beschreibung sowie in den Beispielen Bezug genommen wird, sind aus kommerziellen Quellen erhältlich, sofern nicht anders angegeben.
  • Es wurde nunmehr eine zuvor unerkannte Domäne innerhalb des Bak-Moleküls identifiziert, welche sowohl notwendig als auch ausreichend für die bekannten biologischen Aktivitäten von Bak zu sein scheint. Diese Domäne, hierin bezeichnet als die "GD-Domäne", ist ausreichend, um eine zelltötende Funktion und eine physikalische Interaktion mit Bcl-xL zu vermitteln. Zur GD-Domäne von Bak homologe Sequenzen wurden ebenfalls in Bax und Bip 1a identifiziert und es wurde gezeigt, dass sie in ähnlicher Weise für zelltötende und Bcl-xL bindende Aktivitäten dieser Proteine benötigt werden. Diese Beobachtungen legen nahe, dass Bak, Bax und Bip 1a die Apoptose durch einen ähnlichen Mechanismus modulieren oder regulieren, welcher im jeweiligen Fall deren jeweilige GD-Domänen involviert. Wie der mit der vorliegenden Erfindung vertraute Fachmann erkennen wird, sind die GD-Domäne enthaltende Sequenzen nützlich bei der Modulation der Apoptose in Zellen. In ähnlicher Weise sind Verbindungen und Zusammensetzungen, welche dazu in der Lage sind, an die GD-Domäne zu binden, nützlich als Agenzien für die Modulation der apoptotischen Aktivität in Zellen.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "GD-Domäne" auf eine Proteindomäne, welche zuerst in Bak identifiziert wurde und von der hierin gezeigt wird, dass sie ausschlaggebend ist für die Interaktion von Bak mit Bcl-xL, für die zelltötende Funktion von Bak und für Peptide und/oder Moleküle, welche dazu in der Lage sind, ihre Struktur und/oder Funktion nachzuahmen. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die vorliegende Erfindung ein Peptid mit der folgenden Aminosäuresequenz:
    GDDINRRYDSEFQ [SEQ ID NR: 1],
    welche den Aminosäureresten 82 bis 94 von Bak entspricht. Funktionelle Äquivalente davon können ebenfalls nützlich sein. Mit "funktionelles Äquivalent" ist ein Peptid gemeint, welches eine biologische Aktivität oder ein immunologisches Merkmal aufweist, welche/s der/dem der GD-Domäne im wesentlichen ähnlich ist, und soll ebenfalls einschließen: "Fragmente", "Varianten", "Analoga", "Homologe" oder "chemische Derivate", welche eine solche Aktivität oder ein solches Merkmal aufweisen. Funktionelle Äquivalente der GD-Domäne dürfen dann keine identische Aminosäuresequenz gemeinsam haben und konservative oder nicht konservative Aminosäuresubstitutionen konventioneller oder unkonventioneller Aminosäuren sind möglich.
  • Wird hierin Bezug genommen auf "konservative" Aminosäuresubstitution, so soll dies die Austauschbarkeit von Aminosäureresten mit ähnlichen Seitenketten bezeichnen. Beispielsweise bilden Glycin, Alanin, Valin, Leucin und Isoleucin eine Gruppe von Aminosäuren mit aliphatischen Seitenketten; Serin und Threonin sind Aminosäuren mit aliphatischen Hydroxylseitenketten; Asparagin und Glutamin sind Aminosäuren mit amidhaltigen Seitenketten; Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan sind Aminosäuren mit aromatischen Seitenketten; Lysin, Arginin und Histidin sind Aminosäuren mit basischen Seitenketten; und Cystein und Methionin sind Aminosäuren mit schwefelhaltigen Seitenketten. Der Austausch einer Aminosäure aus einer gegebenen Gruppe durch eine andere Aminosäure aus der gleichen Gruppe würde als eine konservative Substitution betrachtet werden. Bevorzugte konservative Substitutionsgruppen schließen ein: Asparagin-Glutamin, Alanin-Valin, Lysin-Arginin, Phenylalanin-Tyrosin und Valin-Leucin-Isoleucin.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Peptid mit der folgenden Aminosäuresequenz bereitgestellt:
    PSSTMGQVGRQLAIIGDDINRRYDSEFQ [SEQ ID NR: 2],
    welche den Aminosäureresten 67 bis 94 von Bak entspricht, welche einzig für die zelltötende Funktion von Bak benötigt werden.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird ein Peptid mit der folgenden Aminosäuresequenz bereitgestellt:
    QVGRQLAIIGDDINRRYDSEFQTMLQHLQPT [SEQ ID NR: 3],
    welche den Aminosäureresten 73 bis 103 von Bak entspricht, welche für die zelltötende Funktion von Bak ausreichend sind.
  • Die vorliegenden Daten legen nahe, dass die biologische Aktivität der GD-Domäne und ihrer funktionellen Derivate durch die subzelluläre Lokalisation dieser Zusammensetzungen beeinflusst wird. Dem entsprechend werden in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die erfindungsgemäßen GD-Domänen-Peptide ein geeignetes hydrophobes Ende, welches die Aminosäuren 187 bis 211 von Bak umfassen kann, an ihr C-terminales Ende fusioniert haben. Andere geeignete Mittel, subzelluläre Lokalisation zu bewirken, einschließlich der Auswahl geeigneter hydrophober Enden, so wie die Aminosäuren 172 bis 192 von Bax, die Aminosäuren 213 bis 233 von Bcl-xL, die Aminosäuren 220 bis 240 von Bcl-2, und hydrophober Enden, welche durch Proteinlipidation, so wie Prenylierung und Acylierung (beispielsweise Myristylierung, Palmitylierung), eingebracht werden (Casey, T. J., Science, 268: 221-225 (1995)) können unter Verwendung bekannter Verfahren vom Fachmann angewendet werden.
  • Die hierin offenbarte GD-Domäne ist einzig an sowohl der zelltötenden als auch der Bcl-xL bindenden Aktivität von Bak beteiligt. Darüber hinaus wird hierin gezeigt, dass andere mit Bcl-2 interagierende Proteine mit funktionellen Eigenschaften, die denen von Bak ähnlich sind, Aminosäurebereiche mit Sequenzen enthalten, welche eine Homologie zu Sequenzen innerhalb der GD-Domäne von Bak aufweisen. Diese Proteine schließen Bax und Bip 1a ein, welche, wie Bak, mit Bcl-2 interagieren und beide dieser Proteine enthalten Aminosäurebereiche, welche eine Homologie zu Sequenzen innerhalb der GD-Domäne von Bak aufweisen. In Bax umfasst dieser Bereich die Aminosäuren 59 bis 73, welche eine Homologie zu den Aminosäuren 74 bis 88 innerhalb der GD-Domäne von Bak aufweisen. Das Protein Bip 1a enthält in ähnlicher Weise einen Aminosäurebereich umfassend die Aminosäuren 57 bis 71, welche eine Homologie zu den gleichen Sequenzen (Aminosäuren 74 bis 88) innerhalb der GD-Domäne von Bak aufweisen. Die Deletion der oben identifizierten GD-Domänenregionen von Bax und Bip 1a beeinträchtigten deren zelltötende Aktivität und verhinderten die Bindung an Bcl-xL. Bip 1a besitzt keine Sequenzen, welche zu den beiden in höchstem Maße konservierten Bereichen, benannt Domäne I und Domäne II (in der Literatur auch als "Bcl-2-Homologiedomänen" oder "BH-Domänen" I und II oder "BH1" und "BH2"), homolog sind. Es wurde angedeutet, dass diese beiden konservierten Bereiche, und insbesondere die Domäne I, an der Steuerung der Homo- und Heterodimerisation in Bcl-2, Bax und anderen Mitgliedern der Bcl-2-Familie beteiligt sind. Dem entsprechend stellt die GD-Domäne ein Schlüsselelement dar, welches an der biologischen Aktivität von Proteinen wie Bak, Bax und Bip 1a beteiligt ist, und welches die Mitglieder der Bcl-2-Familie, deren Aktivität von den BH-Domänen I und II unabhängig ist, nicht notwendigerweise gemeinsam haben. Dies legt die Vermutung nahe, dass die GD-Domäne eine individuelle Familie von Proteinen definiert, einschließend Bak, Bax und Bip 1a.
  • Dem entsprechend wird in einer zusätzlichen bevorzugten Ausführungsform ein Peptid bereitgestellt, das die folgenden Aminosäuren umfasst:
    LSECLKRIGDELDSN [SEQ ID NR: 4],
    was den Aminosäuren 59 bis 73 von Bax entspricht. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird ein Peptid bereitgestellt, welches die Aminosäuresequenz
    LKRIGDELD [SEQ ID NR: 5]
    umfasst, was den Aminosäuren 63 bis 71 von Bax entspricht. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird ein Peptid bereitgestellt, welches die Aminosäuresequenz
    QDASTKKLSECLKRIGDELDSNMELQ [SEQ ID NR: 6]
    umfasst, was den Aminosäuren 52 bis 77 von Bax entspricht. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird ein Peptid bereitgestellt, welches die Aminosäuresequenz
    LALRLACIGDEMDVS [SEQ ID NR: 7]
    umfasst, was den Aminosäuren 57 bis 71 von Bip 1a entspricht. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird ein Peptid bereitgestellt, welches die folgende Aminosäuresequenz umfasst:
    IGDEM [SEQ ID NR: 8],
    was den Aminosäuren 64 bis 68 von Bip 1a entspricht. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird ein Peptid bereitgestellt, welches die folgende Aminosäuresequenz umfasst:
    CMEGSDALALRLACIGDEMDVSLRAPRL [SEQ ID NR: 9],
    was den Aminosäuren 50 bis 77 von Bip 1a entspricht. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird ein Peptid bereitgestellt, welches die folgende Aminosäuresequenz umfasst:
    VGRQLAIIGDDINRR [SEQ ID NR: 10],
    was den Aminosäuren 74 bis 88 von Bak entspricht.
  • Ein überraschender Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Entdeckung, dass die GD-Domäne alleine ausreichend für die Homodimerisation von Bak sowie für die Heterodimerisation von Bak mit Bax und Bcl-xL ist, und dass die in höchstem Maße konservierten Bcl-2-Familiendomänen I und II für diese Dimerisation nicht erforderlich sind. Dies zeigt an, dass die GD-Domäne dazu in der Lage ist, die Funktion von Proteinen einschließlich Bak, Bax und Bcl-xL auf direktem Wege durch Dimerisation zu modulieren, und somit ebenfalls die Funktion anderer Proteine einschließlich Bcl-2 modulieren könnte.
  • Des weiteren hängt die funktionelle Bedeutung der GD-Domäne wahrscheinlich mit ihrer Fähigkeit zusammen, eine oder mehrere Protein/Protein-Interaktionen mit anderen Mitgliedern der Bcl-2-Familie oder mit bisher nicht identifiziertem/n zellulärem/n Protein/en zu vermitteln. Es ist möglich, dass Überlebensproteine wie Bcl-2 und Bcl-xL mittels ihrer GD-Domänen die Apoptose unterdrücken, indem sie Proteine binden und deaktivieren, welche den Zelltod aktiv unterstützen, so wie Bak, Bax und Bip 1a. Zur Untermauerung dieser Ansicht scheint die Interaktion mit Bax für Bcl-2 erforderlich zu sein, um die Apoptose zu unterdrücken (Yin, et al., Nature 369:321-323 (1994)). Eine zweite Möglichkeit ist, dass Bak, Bax und Bip 1a den Zelltod dadurch induzieren, dass sie Proteine einschließlich Bcl-2 und Bcl-xL, welche das Überleben der Zelle aktiv unterstützen, binden (über ihre GD-Domänen) und inaktivieren. Es ist ebenfalls möglich, dass Bak, Bax und Bip 1a eines oder mehrere zusätzliche zelluläre Proteine binden und dass diese Interaktion die Funktion des Zelltods vermittelt. Der Urheber der vorliegenden Erfindung möchte nicht an eine bestimmte Theorie gebunden sein, jedoch ist die GD-Domäne in Bak, Bax und Bip 1a ungeachtet ihrer Wirkungsweise(n) von zentraler Bedeutung für die Vermittlung dieser Protein/Protein-Interaktionen.
  • Agenzien, welche dazu in der Lage sind, die durch die GD-Domäne vermittelten Protein/Protein-Interaktionen zu modulieren, können Peptide einschließen umfassend die GD-Domäne ebenso wie Mutanten der GD-Domäne oder von die GD-Domäne umfassenden Proteinen. Eine „Mutante", wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz, welche sich von der des natürlich vorkommenden Peptids oder Proteins durch wenigstens eine Aminosäure unterscheidet. Mutanten können die gleiche biologische oder immunologische Aktivität aufweisen wie das natürlich vorkommende GD-Domänen-Peptid oder das natürlich vorkommende Protein. Die biologische oder immunologische Aktivität von Mutanten kann sich jedoch unterscheiden oder gänzlich fehlen. Beispielsweise kann einer GD-Domänen-Mutante die biologische Aktivität fehlen, welche natürlich vorkommendes GD-Domänen-Peptid charakterisiert, und sie kann dennoch als ein Antigen zur Erzeugung von Antikörpern gegen die GD-Domäne oder zur Detektion oder Aufreinigung von Antikörpern gegen die GD-Domäne oder als ein Agonist (kompetitiv oder nicht kompetitiv), Antagonist oder partieller Agonist der Funktion des natürlich vorkommenden GD-Domänen-Peptids nützlich sein.
  • Die Modulation der durch die GD-Domäne vermittelten Protein/Protein-Interaktion kann ebenfalls durch Agonisten oder Antagonisten der GD-Domänen-Peptide verursacht werden. Screening von Peptidbibliotheken, Verbindungsbibliotheken und anderen Informationsbanken zur Identifizierung von Agonisten oder Antagonisten der Funktion der Proteine, welche die GD-Domäne umfassen, erfolgt mit Hilfe von Assays zur Detektion der Fähigkeit von potentiellen Agonisten oder Antagonisten, die GD-Domänenbindung, z. B. die GD-Domänen-Homodimerisation oder -Heterodimerisation zu inhibieren oder zu verstärken.
  • Beispielsweise können Screening-Assays mit hohem Durchsatz verwendet werden, um Verbindungen zu identifizieren, welche die Proteinbindungsfunktion der GD-Domäne modulieren. Solche Screening-Assays ermöglichen die Identifizierung von Verbindungen, welche durch eine Beeinflussung der durch die GD-Domäne vermittelten Protein/Protein- Interaktionen die Apoptose beschleunigen oder inhibieren. Beispielsweise umfasst ein invitro-Screening für Verbindungen, welche die Bak-GD-Domänen-Interaktion mit GST-Bcl-xL unterbrechen, mit GST-Bcl-xL beschichtete Multiwellplatten, welche mit einer markierten GD-Domänen-Peptidsonde in der Anwesenheit von einer oder mehreren zu testenden Verbindungen inkubiert wird. Moleküle, welche die Interaktion spezifisch unterbrechen, könnten im Prinzip entweder an die GD-Domänen-"Liganden" oder an die bisher nicht definierte "Rezeptor"-Domäne in Bcl-xL binden. Jede dieser Klassen von Verbindungen würde als die Apoptose modulierendes Agens in Frage kommen.
  • Folglich kann das erfindungsgemäße Verfahren z. B. für ein Agens verwendet werden, welches dazu in der Lage ist, die Apoptose zu modulieren. Ein solches Screeningverfahren umfasst das Beschichten einer Multiwellplatte mit GST-Bcl-xL und die Inkubation der beschichteten Multiwellplatte mit einer markierten GD-Domänen-Peptidsonde in der Anwesenheit eines Agens, welches getestet werden soll, wobei die Unterbrechung der GD-Domänen-Interaktion mit GST-Bcl-xL darauf hinweist, dass besagtes Agens dazu in der Lage ist, die Apoptose zu modulieren. Durch dieses Verfahren identifizierte Agenzien werden ebenfalls in den Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen.
  • Geeignete Markierungen schließen eine detektierbare Markierung ein, so wie ein Enzym, ein radioaktives Isotop, eine fluoreszierende Verbindung, eine chemilumineszente Verbindung oder eine biolumineszente Verbindung. Dem durchschnittlichen Fachmann werden weitere geeignete Markierungen bekannt sein, oder er wird dazu in der Lage sein, diese unter Anwendung von Routineexperimenten zu ermitteln. Des weiteren erfolgt die Bindung dieser Markierungen an die Peptide unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten standardgemäßen Techniken.
  • Ein Hochgeschwindigkeitsscreening für Agenzien, welche direkt an die GD-Domäne binden, kann immobilisierte oder mit Tags versehene kombinatorische Bibliotheken verwenden. Agenzien, welche spezifisch an solche Bibliotheken binden, kommen dafür in Frage, hinsichtlich ihrer Fähigkeit getestet zu werden, Bak/Bcl-xL-Interaktionen zu blockieren. Wie zuvor bereits besprochen, können solche Agenzien dadurch als Suppressoren der Apoptose funktionieren, dass sie entweder die Bak-(und/oder Bax-/Bip 1a-) Funktion direkt inhibieren oder die effektive Aktivität von endogenem Bcl-2/Bcl-xL (oder von anderen Mitgliedern der Bcl-2-Familie) erhöhen. Solche Agenzien wären nützlich, um die anomale Apoptose bei degenerativen Störungen oder nachfolgenden ischämischen Schäden zu unterdrücken.
  • Gegen die GD-Domänen-Peptide der vorliegenden Erfindung gerichtete Antikörper können dazu verwendet werden, cDNA-Expressionsbibliotheken zur Identifizierung von Klonen zu screenen, welche cDNA-Insertionen enthalten, welche strukturell verwandte. immunkreuzreaktive Proteine kodieren, welche Mitglieder der GD-Domänen-Familie von Proteinen sein können. Das Screening von cDNA- und mRNA-Expressionsbibliotheken ist im Stand der Technik bekannt. In ähnlicher Weise werden gegen GD-Domänen-Peptide gerichtete Antikörper dazu verwendet, zu dieser Domäne verwandte immunkreuzreaktive Proteine zu identifizieren oder aufzureinigen oder die Menge an die GD-Domäne enthaltenden Proteinen in einer Zelle oder einer Zellpopulation zu detektieren oder zu bestimmen, z. B. in von einem Patienten erhaltenem Gewebe oder in Zellen, so wie Lymphozyten. Bekannte Verfahren für solche Messungen schließen die von PAGE gefolgte Immunpräzipitation von Zellextrakten, die in-situ-Detektion mittels immunhistochemischer Verfahren sowie ELISA-Verfahren ein, von denen alle im Stand der Technik wohl bekannt sind.
  • Die Modulation der Apoptose kann herbeigeführt werden mittels Verfahren, welche spezifische Antisense-Polynukleotide verwenden, welche komplementär zu allen oder zu einigen der Nukleotidsequenzen sind, welche die GD-Domäne umfassende hierin offenbarte Proteine kodieren. Solche komplementären Antisense-Polynukleotide können Nukleotidadditionen, -deletionen, -substitutionen und -transpositionen einschließen, unter der Voraussetzung, dass die spezifische Hybridisierung an die Targetsequenz weiterhin bestehen bleibt. Lösliche Antisense-RNA- oder -DNA-Oligonukleotide, welche dazu in der Lage sind, spezifisch an mRNA-Spezies zu hybridisieren, welche die Proteine und Peptide der vorliegenden Erfindung kodieren und welche die Transkription der mRNA-Spezies und/oder die Translation der kodierten Polypeptide verhindern, werden gemäß der vorliegenden Erfindung als komplementäre Antisense-Polynukleotide in Betracht gezogen. Die Produktion der die GD-Domäne enthaltenden Proteine wird durch die Antisense-Polynukleotide der vorliegenden Erfindung inhibiert und solche Antisense-Polynukleotide können die Apoptose, die Seneszenz und dergleichen inhibieren und/oder den transformierten Phänotyp von Zellen umkehren. Eine heterologe Expressionskassette kann verwendet werden, um Antisense-Polynukleotide in einer transfizierten oder transgenen Zelle zu produzieren. Antisense-Polynukleotide können ebenfalls in Form von löslichen Oligonukleotiden an die äußere Umgebung der Targetzelle verabreicht werden, so wie an das Kulturmedium von Zellen in vitro oder an das Interstitialfluid (z. B. über den Kreislauf) in vivo. Antisense-Polynukleotide und deren Verwendung sind dem Fachmann bekannt und sind z. B. beschrieben in Melton, D.A., Ed, Antisense RNA and DNA. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA (1988).
  • Die vorausgesagte biologische Aktivität von gemäß der vorliegenden Erfindung identifizierten Agenzien variiert in Abhängigkeit von den Annahmen, welche hinsichtlich des Mechanismus der Bak/Bcl-2-Funktion gemacht werden. Im Falle eines Agens, welches eng an die GD-Domäne bindet, würde z. B. vorausgesagt werden, dass es die Bak-(und vielleicht die Bax-/Bip 1a-) Funktion inhibiert. In der Annahme, dass Bak (und/oder Bax/Bip 1a) das aktive, den Zelltod regulierende Molekül ist, kann ein Agens, welches eng an die GD-Domäne bindet, die Bak-Funktion mittels eines dem Vorgang der Bcl-2/Bcl-xL-Bindung ähnlichen Mechanismus inhibieren. Solche Agenzien würden "Bcl-2/Bcl-xL"-Mimetika umfassen und könnten daher unter Bedingungen, unter welchen Bcl-2 einen erwiesenen positiven Effekt (z. B. Schutz von Neuronen gegen Schäden oder Zytokinverlust) aufweist, anti-apoptotische Aktivität zeigen. Agenzien in dieser Klasse könnten Verwendung finden bei der Behandlung von Krankheiten, welche durch exzessiven oder unangemessenen Zelltod gekennzeichnet sind, z. B. neurodegenerative Krankheiten und aus Ischämie resultierende Schäden.
  • Wenn die Bcl-2/Bcl-xL-Bindung das Überleben einer Zelle aktiv fördert und wenn die Repression von Bak lediglich aufgrund seiner Bindung und der Inaktivierung dieser Überlebensproteine stattfindet, so würde ein Agens, welches diese Bindung verhindert, die Aktivität von anwesendem Bcl-2/Bcl-xL in einer Zelle durch Abschwächung der Repression durch Bak (und/oder durch Bax/Bip1a) wirksam steigern. Dies würde ebenfalls das Überleben der Zelle fördern, jedoch nur in Zellen, welche endogenes Bcl-2/Bcl-xL exprimieren. Agenzien, welche an Bcl-xL binden und dadurch dessen Interaktion mit Bak (und/oder mit Bax/Bip1a) verhindern, könnten die den Zelltod unterdrückende Aktivität von Bcl-xL (und/oder von Bcl-2) inhibieren. Solche Agenzien würden "GD-Domänen-Mimetika" umfassen und würden den Zelltod in einer der Wirkung von Bak ähnlichen Art und Weise fördern. GD-Domänen-Mimetika wären bei der therapeutischen Behandlung von Krebs und Viruskrankheiten nützlich.
  • Peptidomimetika von GD-Domänen-Peptid werden ebenfalls durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt und können als Wirkstoffe zur Modulation der Apoptose durch beispielsweise Blockierung der Funktion von die GD-Domäne umfassenden oder in die GD-Domänenvermittelte Dimerisation eingreifenden Proteinen agieren. Es gilt in der pharmazeutischen Industrie als allgemein bekannt, dass Peptidomimetika Wirkstoffe einschließen, welche nicht aus Peptiden bestehen und welche zu denen der nachgeahmten Peptide analoge Eigenschaften aufweisen. Die Prinzipien und Praktiken zum Design von Peptidomimetika sind im Stand der Technik bekannt und sind z. B. beschrieben in Fauchere J., Adv. Drug Res. 15: 29 (1986); und Evans et al., J. Med. Chem. 30: 1229 (1987). Peptidomimetika, welche strukturelle Ähnlichkeit zu therapeutisch nützlichen Peptiden aufweisen, können verwendet werden, um eine gleichwertige therapeutische oder prophylaktische Wirkung zu erzielen. Typischerweise weisen solche Peptidomimetika eine oder mehrere Peptidkopplungen auf, welche gegebenenfalls durch eine Kopplung ersetzt wird/werden, welche wünschenswerte Eigenschaften, so wie Resistenz gegen die chemische Zersetzung in vivo, umsetzen kann. Solche Kopplungen können -CH2NH-, -CH2S-, -CH2CH2-, -CH=CH-, -COCH2-, -CH(OH)CH2- sowie -CH2SO- einschließen. Peptidomimetika können verbesserte pharmakologische Eigenschaften (biologische Halbwertszeit, Absorptionsraten und dergleichen), unterschiedliche Spezifität, erhöhte Stabilität, Wirtschaftlichkeit in der Herstellung, verminderte Antigenität und dergleichen aufweisen, was ihre Verwendung als Therapeutika besonders wünschenswert macht.
  • Wie hierin besprochen, scheint es sich bei der GD-Domäne um einen Bereich von Motiven zu handeln, welche an der Dimerisation beteiligt sind, und diese Aktivität kann mit der Regulierung der Apoptose durch die GD-Domäne enthaltende Proteine in Verbindung stehen. Bak weist eine C-terminale hydrophobe Region auf, welche membranüberspannend zu sein scheint. Folglich kann die subzelluläre Lokalisation von die GD-Domäne enthaltenden Proteinen eine Rolle bei der Regulierung des programmierten Zelltods in vivo spielen. Es ist damit möglich, die vorliegende Erfindung zur Detektion oder zur Bestimmung von die GD-Domäne umfassenden Proteinen mittels immunchemischer oder anderer Techniken angesichts deren antigener Eigenschaften zu verwenden, z. B. in Fraktionen aus Gewebe/Organexzisionen. Die Immunisierung von Tieren mit Peptiden, welche die GD-Domäne alleine oder in Verbindung mit Adjuvanzien enthalten, mittels bekannter Verfahren kann für die GD-Domäne spezifische Antikörper erzeugen. Mittels gebräuchlicher Verfahren gewonnenes Antiserum kann zu diesem Zweck verwendet werden. Es kann z. B. ein Säuger, so wie ein Kaninchen, mit einem die GD-Domäne enthaltenden Peptid immunisiert werden, wodurch die Bildung von polyklonalen Antikörpern gegen eben diese Peptide induziert wird. Unter Verwendung bekannter Verfahren können ebenfalls monoklonale Antikörper erzeugt werden. Solche Antikörper können gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um die Präsenz und Menge von die GD-Domäne umfassenden Peptiden zu detektieren.
  • Die GD-Domänen-Peptide der vorliegenden Erfindung können zur Detektion von Bak, Bcl-xL, Bip 1a und anderen Proteinen mittels standardgemäßer Assays, einschließlich Radioimmunassays und Enzymimmunassays, verwendet werden.
  • Der Fachmann wird erkennen, dass die exakte chemische Struktur von die GD-Domäne enthaltenden Peptiden in Abhängigkeit von einer Reihe von Faktoren variieren wird. Ein bestimmtes Protein kann z. B. in Form eines sauren oder basischen Salzes gewonnen werden oder auch in neutraler Form, da in dem Molekül ionisierbare Carboxyl- und Aminogruppen vorzufinden sind. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird dann jede beliebige Form der die GD-Domäne enthaltenden Peptide, welche die therapeutische oder diagnostische Aktivität der natürlich vorkommenden Peptide beibehält, als im Rahmen der vorliegenden Erfindung liegend angesehen.
  • Die GD-Domänen-Peptide und andere Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können mittels im Stand der Technik bekannter rekombinanter DNA-Techniken hergestellt werden. Beispielsweise können Nukleotidsequenzen, welche die GD-Domänen-Peptide der vorliegenden Erfindung kodieren, in einen geeigneten DNA-Vektor, so wie ein Plasmid, eingebracht werden und der Vektor kann dazu verwendet werden, einen geeigneten Wirt zu transformieren. Das rekombinante GD-Domänen-Peptid wird in dem Wirt mittels Expression hergestellt. Bei dem transformierten Wirt kann es sich um eine prokaryote oder eine eukaryote Zelle handeln. Für diesen Zweck bevorzugte Nukleotidsequenzen, welche die GD-Domänen von Bak, Bax und Bip 1a kodieren, sind in 8 dargestellt.
  • Bei den Polynukleotiden, welche die GD-Domäne umfassende Peptide kodieren, kann es sich um genomische oder cDNA handeln, welche mittels bekannter Verfahren, einschließlich Hybridisierungs-Screeningverfahren, aus Klonierungsbibliotheken isoliert wird. Alternativ dazu können mittels bekannter chemischer Syntheseverfahren zur Synthese von Oligonukleotiden synthetische Polynukleotidsequenzen konstruiert werden. Solche synthetischen Verfahren sind z. B. beschrieben in Blackburn, G.M. und Gait, M.J., Ed., Nucleic Acids in Chemistry and Biology, IRL Press, Oxford, England (1990), und es wird offensichtlich sein, dass ebenfalls im Handel erhältliche Oligonukleotidsynthetisierer gemäß den Angaben des Herstellers verwendet werden können. Ein solcher Hersteller ist Applied Bio Systems.
  • Es kann eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung von Primern, welche auf den hierin offenbarten Nukleotidsequenzdaten basieren, verwendet werden, um DNA-Fragmente aus mRNA-Pools, cDNA-Klonierungsbibliotheken oder genomischer DNA zu amplifizieren. Verfahren zur Nukleotidamplifikation mittels PCR sind im Stand der Technik bekannt und sind z. B. beschrieben in Erlich, H.A., Ed., PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, Stockton Press, New York, New York, USA (1989); US Patent Nr. 4,683,202; US Patent Nr. 4,800,159; sowie US Patent Nr. 4,683,195. Es können verschiedene Nukleotiddeletionen, -additionen und -substitutionen in die Polynukleotide der vorliegenden Erfindung integriert werden, wie der Fachmann erkennen wird. Der Fachmann wird ebenso erkennen, dass eine Veränderung in der Nukleotidsequenz, welche die GD-Domänen-Peptide kodiert, auftreten kann als Folge von z. B. allelen Polymorphismen, kleineren Sequenzierungsfehlern und dergleichen. Die die GD-Domänen-Peptide der vorliegenden Erfindung kodierenden Polynukleotide können kurze Oligonukleotide einschließen, welche z. B. als Hybridisierungssonden und PCR-Primer nützlich sind. Die Polynukleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung können ebenfalls einen Abschnitt eines größeren Polynukleotids umfassen und sie können mittels Polynukleotidverknüpfung mit einer oder mehreren Polynukleotidsequenzen, welche verschiedene Proteine kodieren, "in-frame" fusioniert werden. In diesem Fall kann das exprimierte Protein ein Fusionsprotein umfassen. Natürlich können die Polynukleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung in dem PCR-Verfahren dazu verwendet werden, die Präsenz von mRNA, welche die GD-Domänen-Peptide kodiert, bei der Diagnose einer Krankheit oder im Rahmen einer forensischen Analyse zu detektieren.
  • cDNAs, welche Proteine kodieren, die mit der GD-Domäne interagieren (oder die die GD-Domäne enthalten), können mittels Screening von cDNA-Expressionsbibliotheken unter Verwendung bekannter Verfahren identifiziert werden. Beispiele für solche Verfahren schließen ein: das Hefe-zwei-Hybrid-System (US Patent Nr. 5,283,173, Erfinder Fields und Song, erteilt am 01. Februar 1994; Chien, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 9578 (1991)) und das E. coli/BCCP-interaktive Screeningsystem (Guarente, L., Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 1639 (1993) und Germino, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 933-937 (1993)). Geeignete cDNA-Bibliotheken werden cDNA-Bibliotheken von Säugern, so wie Mensch, Maus oder Ratte, einschließen, welche aus RNA hergestellte cDNA enthalten können, sowie eine einzelne Zelle, ein einzelnes Gewebe oder einen einzelnen Organtypus oder ein Entwicklungsstadium, wie im Stand der Technik bekannt.
  • Eine Nukleotidsequenz, welche ein die GD-Domäne umfassendes Protein oder Peptid kodiert, kann gemäß gebräuchlichen Techniken in einen DNA-Vektor eingebracht werden, einschließlich stumpf oder versetzt endender Termini zur Ligation, Restriktionsenzymverdau zur Bereitstellung geeigneter Termini, geeignetes Auffüllen mit kohäsiven Enden, Behandlung mit alkalischer Phosphatase zur Vermeidung unerwünschter Verbindungen sowie Ligation mit geeigneten Ligasen. Techniken für solche Manipulationen sind z. B. offenbart in Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Planview, New York, USA (1989), und sind im Stand der Technik wohl bekannt.
  • Die Sequenz von Aminosäureresten in einem die GD-Domäne umfassenden Protein oder Peptid wird hierin entweder mittels der Verwendung von deren gemeinhin verwendeten, drei Buchstaben umfassenden Bezeichnungen oder von deren aus einem Buchstaben bestehenden Bezeichnungen designiert. Eine Auflistung dieser drei Buchstaben umfassenden sowie der aus einem Buchstaben bestehenden Bezeichnungen sind in Textbüchern wie Biochemistry, Zweite Auflage, Lehninger, A., Worth Publishers, New York, NY, USA (1975) zu finden. Wird die Aminosäuresequenz horizontal aufgelistet, so sollte der Aminoterminus am linken Ende stehen, wohingegen der Carboxyterminus am rechten Ende stehen sollte. Die Aminosäurereste in einem Peptid können durch Bindestriche abgetrennt werden. Solche Bindestriche sind lediglich dazu bestimmt, die Darstellung einer Sequenz zu vereinfachen.
  • Das rationale Design von GD-Domänen-Mimetika oder von die GD-Domäne bindenden Molekülen, basierend auf einer modellierten (oder experimentell bestimmten) Peptidstruktur, kann vom Fachmann unter Verwendung auf dem Gebiet des rationalen Wirkstoffdesigns bekannter Verfahren durchgeführt werden. Therapeutische oder prophylaktische Verfahren zur Behandlung von pathologischen Krankheitsbildern so wie Autoimmunkrankheiten, neurodegenerative Krankheiten, Krebs und dergleichen, können durchgeführt werden, indem eine wirksame Menge eines therapeutischen Agens, welches dazu in der Lage ist, die GD-Domänen-Homodimerisation oder -Heterodimerisation spezifisch zu inhibieren, verabreicht wird und dadurch die biologische Aktivität von die GD-Domäne enthaltenden Proteinen sowie der apoptotische Zustand in einem Patienten moduliert werden.
  • Es wird hierin gezeigt, dass gekürzte, die GD-Domäne enthaltende Bak-Moleküle, so wie QVG oder PEM, ebenso wie andere kleine Peptidderivate, welche eine "minimale" GD-Domäne bilden, die von Wildtyp-Bak gezeigte Protein bindende und zelltötende Funktion beibehalten. Diese Moleküle, oder deren peptidomimetische Derivate, können die Apoptose in Tumorzellen dadurch induzieren, dass sie das gleiche biologische Signal bereitstellen, welches durch hohe Bak-Expression produziert wird (von welchem gezeigt wurde, dass es in einem in-vitro-Assay Tumorzellen tötet). Solche Agenzien umfassen eine neuartige Klasse von chemotherapeutischen Wirkstoffen, von welchen man vorhersagen würde, dass sie unabhängig vom p53-Status funktionieren.
  • Resultiert die Interaktion mit Bak in der Suppression der anti-apoptotischen Funktion von Bcl-xL und/oder anderen Mitgliedern der Bcl-2-Familie, dann können GD-Domänen-Peptide oder Agenzien, welche die GD-Domänenstruktur nachahmen, als Inhibitoren der antiapoptotischen Funktion von Proteinen wie Bcl-2 wirken. Hohe Bcl-2-Expression wurde bereits mit der Resistenz von Tumorzellen gegen eine Reihe von chemotherapeutischen Wirkstoffen in Verbindung gebracht (Fisher, et al., Cancer Res. 53: 3321-3326 (1993); Miyashita und Reed, Blood 81: 151-157 (1993); Dole, et al., Cancer Res. 54: 3253-3259 (1994). Die Verabreichung von GD-Domänen-Mimetika kann die Funktion von Bcl-2 unterdrücken und die Empfindlichkeit der Tumorzellen gegenüber der Apoptose, welche durch traditionelle chemotherapeutische Agenzien induziert wird, wieder herstellen. Außerdem können Bak- oder GD-Domänen-Mimetika, welche Bcl-2 inhibieren, selbst selektiv toxisch gegenüber bestimmten Tumoren so wie Follikellymphomen sein, deren fortgesetztes Wachstum und Überleben von einer hohen Bcl-2-Aktivität abhängig sind.
  • Die GD-Domänen-Mimetika der vorliegenden Erfindung können auch bei der Bekämpfung von viralen Infektionen von Nutzen sein. Die Apoptose infizierter Zellen, einhergehend mit assoziierter DNA-Fragmentierung, stellt durch die Einschränkung viraler Titer und die Restriktion der viralen Vermehrung (Vaux, et al., Cell 76: 777-779 (1994)) eine bedeutende Verteidigungsmöglichkeit gegen die virale Pathogenese bereit. Aus diesem Grund haben Viren diverse Mechanismen zur Unterdrückung der Apoptose infizierter Wirtszellen entwickelt. Bestimmte virale Proteine, so wie das Epstein-Barr-Virus BHRF-1, das Afrikanische-Schweinefieber-Virus (ASFV) LHW5-HL und das Adenovirus E1B 19kD, scheinen strukturelle oder funktionelle Homologe von Bcl-2 zu sein. Ein zweites Epstein-Barr-Virusgen, LMP1, transaktiviert die Expression des zellulären bcl-2-Gens in latent infizierten Zellen (Henderson, et al., Cell 65: 1107-1115 (1991). In diesen Fällen kann das durch die virale Infektion ausgelöste apoptotische Signal durch die Wirkung eines viralen (oder zellulären) Bcl-2-Homologs unter Kontrolle gehalten werden. Ein Bak-GD-Domänen-Mimetikum, welches der anti-apoptotischen Funktion des viralen/zellulären Bcl-2-Homologs entgegenwirkt, würde dazu dienen, diese Blockade zu vermindern und die Apoptose in infizierten Zellen zu induzieren und folglich die virale Vermehrung zu inhibieren. Es wurde gezeigt, dass anti-apoptotische Proteine, welche von mindestens zwei nicht miteinander verwandten Viren (EBV BHRF1 und Adenovirus E1B 19kD) kodiert werden, mit Bak interagieren. Experimentelle Beweise untermauern die Folgerung, dass eine Unterbrechung der E1B 19kD/Bak-Interaktion (d.h. mittels Konkurrierens mit einem GD-Domänen-Mimetikum) die viralen Titer und die produktive Replikation reduzieren würde.
  • Dementsprechend heben Mutationen in E1B 19kD, welche die Interaktion mit Bak unterbrechen, die anti-apoptotische Funktion von E1B 19kD auf. Adenovirusstränge, welche defektive E1B 19kD-Proteine kodieren, ergeben aufgrund der Apoptose von infizierten Zellen eine wesentlich geringere Ausbeute an Virennachkommen in vitro (Pilder, et al., J. Virol. 52: 664-671 (1984); Subramanian, et al., J. Biol. Chem. 259: 11777-11783 (1984).
  • Ein weiterer Mechanismus, durch welchen Viren den Signaltransduktionsweg für die Apoptose blockieren, ist die Inaktivierung des p53-Tumorsuppressorproteins. Durch virale Infektion verursachte erzwungene Zellproliferation induziert ein apoptotisches Signal, welches die Funktion von p53 erfordert (siehe z. B. Wu und Levine, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3602-3606 (1994)). Typischerweise wird die Funktion von p53 während der Infektion durch physikalische Interaktion mit einem viralen Genprodukt außer Kraft gesetzt. Beispiele für Viren, welche p53 bindende Proteine kodieren, schließen ein: Adenoviren, Polyomaviren, Papillomaviren sowie das Cytomegalovirus (Levine, et. al., Nature 351: 453-456 (1991); Speir, et al., Science 265: 391-394 (1994). Infizierte Zellen werden darauf "geprimt", sich der Apoptose zu unterziehen, der Zelltod wird jedoch durch virale Inhibition der p53-Funktion verhindert oder verzögert. Es ist möglich, dass diese Blockade im Signaltransduktionsweg der Apoptose durch ein Agens, welches die Apoptose stromabwärts von p53 moduliert, vermindert oder umgangen werden könnte. Bak oder GD-Domänen-Mimetika induzieren die Apoptose unabhängig von p53 und stellen folglich einen Weg bereit, das Signal für den Zelltod, welches in infizierten Zellen unterdrückt wird, auszuführen oder wieder herzustellen.
  • Jegliche Art der Verabreichung, welche in der Zuführung des therapeutischen Agens durch die Zellmembran hindurch und in die gewünschte Zelle resultiert, kann angewandt werden, um die Peptide und Agenzien der vorliegenden Erfindung zuzuführen. Die Stelle der Verabreichung sowie die Zellen können vom durchschnittlichen Fachmann basierend auf der Kenntnis der speziellen behandelten Störung ausgewählt werden. Zusätzlich können die Dosierung, die Dosierungshäufigkeit sowie die Dauer und der Verlauf der Behandlung vom durchschnittlichen Fachmann in Abhängigkeit von der spezifischen behandelten degenerativen Störung bestimmt und optimiert werden. Die spezielle Art der Verabreichung kann ebenfalls einfach vom durchschnittlichen Fachmann ausgewählt werden und kann z. B. die orale, intravenöse, subkutane, intramuskuläre Verabreichung etc. einschließen, unter der Voraussetzung, dass das therapeutische Agens die Zellmembran durchdringt. Prinzipien der pharmazeutischen Dosierung und Wirkstoffzuführung sind bekannt und werden z. B. beschrieben in Ansel, H. C. und Popovich, N. G., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 5. Auflage, Lea & Febiger, Publisher, Philadelphia, PA, USA (1990). Es ist z. B. möglich, Liposome dazu zu verwenden, die Agenzien der vorliegenden Erfindung in spezifischer Weise zuzuführen. Solche Liposome können so hergestellt werden, dass sie zusätzliche bioaktive Verbindungen und dergleichen enthalten, so wie Wirkstoffe, Radioisotope, Antikörper, Lektine und Toxine, welche an der Targetstelle wirken würden.
  • Geeignete Agenzien der vorliegenden Erfindung schließen ein: GD-Domänen-Peptide und – Mimetika, Fragmente, funktionelle Äquivalente und/oder Hybriden oder Mutanten davon, ebenso wie Vektoren, welche cDNA enthalten, welche jedes beliebige Element der vorstehenden Auflistung kodiert. Solche Agenzien können allein oder in Kombination mit und/oder gleichzeitig mit anderen geeigneten Wirkstoffen und/oder Therapieverläufen verabreicht werden.
  • Die Agenzien der vorliegenden Erfindung sind geeignet zur Behandlung von degenerativen Störungen, einschließlich Störungen, welche durch unangemessene Zellproliferation oder unangemessenen Zelltod oder in manchen Fällen durch beides gekennzeichnet sind. Unangemessene Zellproliferation wird den statistisch signifikanten Anstieg der Anzahl von Zellen im Vergleich zur Proliferation dieses spezifischen Zelltyps in der normalen Population einschließen. Ebenfalls eingeschlossen sind Störungen, durch welche eine Zelle an einer unangemessenen Stelle präsent ist und/oder fortbesteht, z. B. die Präsenz von Fibroblasten im Lungengewebe nach einer akuten Lungenverletzung. Solche Zellen schließen z. B. Krebszellen ein, welche die Fähigkeit zur Invasion und Metastasenbildung aufweisen und in höchstem Maße anaplastisch sind. Solche Zellen schließen z. B. Tumorzellen ein, sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Der unangemessene Zelltod wird eine statistisch signifikante Abnahme der Anzahl von Zellen im Vergleich zur Präsenz dieses spezifischen Zelltyps in der normalen Population einschließen. Solch eine Unterrepräsentation kann aufgrund einer speziellen degenerativen Störung vorkommen, einschließlich z. B. AIDS (HIV), was zum unangemessenen Tod von T-Zellen führt, sowie aufgrund von Autoimmunkrankheiten, welche durch unangemessenen Zelltod gekennzeichnet sind. Autoimmunkrankheiten sind Störungen, welche durch eine gegen Eigenantigene gerichtete Immunantwort verursacht werden. Solche Krankheiten sind durch die Präsenz von Autoantikörpern oder durch die zellvermittelte Immunität gegen Autoantigene in Verbindung mit entzündlichen Läsionen gekennzeichnet, welche durch immunologisch kompetente Zellen oder Immunkomplexe in Geweben, welche die Autoantigene enthalten, verursacht werden. Solche Krankheiten schließen systemischen Lupus erythematodes (SLE) und chronischen Gelenkrheumatismus ein.
  • Standardgemäße Referenzwerke, welche die allgemeinen Prinzipien der Immunologie darlegen, schließen ein: Stites, D. P., und Terr, A. I., Basic and Clinical Immunology, 7. Auflage., Appleton & Lange, Publisher, Norwalk, CT, USA (1991); und Abbas, A. K., et al., Cellular and Molecular Immunology, W. B. Saunders Co., Publisher, Philadelphia, PA, USA (1991).
  • Die hierin offenbarten GD-Domänen-Peptide, -Mimetika, -Agenzien und dergleichen, ebenso wie Vektoren, welche Nukleotidsequenzen, welche die ersteren kodieren, oder deren entsprechende Antisense-Sequenzen umfassen, sowie Wirte, welche solche Vektoren umfassen, können bei der Herstellung von Medikamenten zur Behandlung von Krankheiten verwendet werden.
  • Zellen und nicht menschliche transgene Tiere mit einem oder mehreren funktionell beeinträchtigten Allelen, welche ein die GD-Domäne umfassendes Protein kodieren, können unter Verwendung von homologen Targetingkonstrukten aus genomischen Klonen von die GD-Domäne enthaltenden Proteinen erzeugt werden. Verfahren zu Herstellung homologer Targetingkonstrukte sind bekannt und werden z. B. beschrieben in Bradley, et al., Bio/Technology 10: 534 (1992); und Koh, et al., Science 256: 1210 (1992). Beispielsweise können "Knockout"-Mäuse, welche für ein inaktiviertes Alle 1 eines die GD-Domäne enthaltenden Proteins homozygot oder heterozygot sind, unter Verwendung von homologem Targeting erzeugt werden. Solche Mäuse sind nützlich als Forschungsobjekte für die Erforschung der Krankheit und für andere Verwendungen. Verfahren zur Erzeugung von chimeren Targetmäusen sind bekannt und z. B. beschrieben in Robertson, E. J., Ed., Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C., USA (1987), worin ebenfalls die Manipulation embryonaler Stammzellen beschrieben ist. Außerdem können Transgene zur Expression von die GD-Domäne umfassenden Polypeptiden in großen Mengen oder unter der Kontrolle ausgewählter Transkriptionskontrollsequenzen unter Verwendung der cDNA oder des genomischen Gens eines die GD-Domäne umfassenden Proteins konstruiert werden. Derart konstruierte Transgene können mittels bekannter Verfahren in Zellen und in transgene nicht menschliche Tiere eingeführt werden. Solche transgenen Zellen und nicht menschlichen Tiere können als Screens für Agenzien, welche die Apoptose modulieren, verwendet werden.
  • Die vorliegende Erfindung kann in bestimmten Aspekten gewürdigt werden unter Bezugnahme auf die nachfolgenden Beispiele, welche zum Zwecke der Veranschaulichung dienen und nicht als einschränkend verstanden werden sollen.
  • BEISPIELE
  • a. Verfahren
  • i. Plasmide und DNA-Manipulationen
  • Alle rekombinanten DNA-Verfahren wurden unter Verwendung von Standardmethoden durchgeführt. Deletionen in der bak-cDNA wurden mittels PCR-Mutagenese eingeführt und gekürzte Bak-Spezies wurden mittels PCR konstruiert (White, B. A., Ed., "PCR Protocols: Current Methods and Applications," in, Methods in Molecular Biology, Humana Press, Totowa, CT, USA (1993). Die Mutationen wurden durch DNA-Sequenzanalyse bestätigt. Alle Bak-Derivate wurden am Aminoterminus mit Influenzavirus-Hemagglutinin-Epitop markiert und von dem in pcDNA-1/Amp, pRcCMV und pcDNA-3 (Invitrogen, Inc.) vorhandenen CMV-Enhancer exprimiert.
  • ii. Transientes Transfektionsassay
  • Das Verfahren des transienten Transfektionsassays ist ähnlich dem zuvor beschriebenen Verfahren zur Detektion von durch IL-1β-konvertierendes-Enzym induzierter Apoptose (Miura, et al., Cell 75: 653-660 (1993); Kumar, et al., Genes Dev. 8: 1613-1626 (1994); Wang, et al., Cell 78: 739-750 (1994). Einen Tag vor der Transfektion wurden Ratte-I-Zellen in 24-Well-Schalen zu 3,5 × 104 Zellen/Well plattiert. Am folgenden Tag wurden die Zellen mit einem β-Galaktosidase kodierenden Markerplasmid (0,16 μg) in Kombination mit einem Bak kodierenden Expressionsplasmid (0,42 μg) mittels des Lipofectamin-Verfahrens (Gibco/BRL) transfiziert. 24 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen fixiert und mit X-Gal gefärbt, um Expression von β-Galaktosidase in Zellen, welche Plasmid-DNA erhalten hatten, zu detektieren (Miura, et al., supra). Die Anzahl an blauen Zellen wurde mittels mikroskopischer Untersuchung gezählt und in entweder lebend (flache blaue Zellen) oder tot (runde blaue Zellen) aufgeteilt. Die zelltötende Aktivität von Bak in diesem Assay zeigt sich durch einen starken Rückgang der Anzahl von blauen Zellen, welche relativ zur Co-Transfektion des β-gal-Plasmids mit einem Kontrollexpressionsvektor (d.h. ohne bak-cDNA-Insertion) erhalten wurden.
  • Die Interpretation, dass der Verlust von blauen Zellen die zelltötende Funktion von Bak reflektiert, wird von einer Reihe von Beobachtungen gestützt:
    • 1. Ratte-I-Zellen werden durch verstärkte Bak-Expression in stabilen Transfektionsassays schnell getötet;
    • 2. Die bak-cDNA beherbergenden Kontrollexpressionsplasmide in Antisense-Orientierung oder verschiedene nicht verwandte cDNAs eliminieren β-gal-positive Zellen nicht. Außerdem weisen bestimmte Bak-Mutanten (d.h. ΔGD) eine in hohem Maße verminderte Fähigkeit auf, blaue Zellen in diesem Assay zu eliminieren;
    • 3. IL-1β-konvertierendes Enzym, von welchem zuvor gezeigt wurde, dass es die Apoptose in Ratte-I-Zellen induziert (Miura, et al., supra; Kumar, et al., supra; Wang, et al., supra), eliminiert auch blaue Zellen in diesem Assay, wenn es von dem gleichen Vektor exprimiert wird.
    • 4. Die Anzahl an blauen Zellen kann teilweise mittels Co-Transfektion von Bak mit Bcl-xL wieder hergestellt werden. Folglich können Bak exprimierende Zellen bis zu einem gewissen Grad durch die anti-apoptotischen Funktion von Bcl-xL bewahrt werden und die Bak-Expression per se eliminiert die β-Galaktosidase-Aktivität nicht.
  • iii. Detektion von Protein/Protein-Interaktionen in vitro.
  • GST und GST-Bcl-xL wurden in E. coli exprimiert und durch Affinitätschromatographie unter Verwendung von Glutathion-Agarose aufgereinigt (Smith und Johnson, Gene 67: 31-40 (1988)). Mit 35S-Methionin markierte Proteine wurden in vitro unter Verwendung eines gekoppelten Transkriptions-/Translationssystems in Kaninchen-Retikulozyt-Lysaten exprimiert, wie vom Hersteller (Promega) beschrieben. Mit 35S-met markierte Proteine wurden vorgereinigt durch Vermischen mit 20 ml mit BSA gewaschenen GSH-Agarose-Beads (50% dünnflüssige Masse) bei 4°C für 1 Stunde in 0,1 ml 10 mM Hepes-Puffer pH 7,2 enthaltend 0,25% NP-40, 142,5 mM NaCl, 5 mM MgCl2 und 1 mM EGTA (NP-40 Lysispuffer). Die Beads wurden mittels Zentrifugierung entfernt und die Überstände wurden mit GST oder GST-Bcl-xL (Endkonzentration 1 mM) bei 4°C für 1 Stunde inkubiert. Die GST-Fusionsproteine sowie jegliche interagierende Proteine wurden mittels Inkubation für 1 Stunde mit einer zusätzlichen Menge von 20 ml GSH-Agarose-Beads gewonnen. Die Beads wurden zweimal mit NP-40 Lysispuffer gewaschen, gefolgt von zweimaligem Waschen mit NP-40 Lysispuffer ohne NP-40. Die Proteine wurden mittels Inkubation in SDS-PAGE-Probenpuffer bei 100°C für 5 min von den Beads eluiert und auf 4 bis 20% SDS-Polyacrylamidgels geladen. Nach der Elektrophorese wurden die Gels fixiert und in einer die Fluorographie verstärkenden Lösung (Amplify; Amersham) inkubiert. Die Gels wurden getrocknet und bei –70°C einer Autoradiographie unterzogen.
  • iv. Detektion von Protein/Protein-Interaktionen in transfizierten Zellen
  • COS-Zellen wurden gezüchtet in Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium (Life Technologies, Inc.), ergänzt mit 10% bovinem Kälberserum, 2% L-Glutamin und 1% Pen/Strep (Life Technologies, Inc.). Die Zellen wurden zu 2,0 × 105 Zellen/35 mm-Well gesät und 24 Stunden später unter Verwendung von Lipofectamin gemäß den Angaben des Herstellers (Life Technologies, Inc.) mit Expressionsplasmiden transfiziert. Bak (und Bak-Mutanten) wurde/n als Fusionsprotein/e mit dem HA-Epitop-Tag an seinem/n Aminoterminus/i exprimiert. Bcl-xL wurde ebenfalls mit einem aminoterminalen Epitop-Tag (Flag; Kodak) exprimiert. 24 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen und lysiert in NP- 40 Lysispuffer, ebenfalls enthaltend 1 mM PMSF, 1 mM Pepstatin und 1 mg/ml Leupeptin. Die Lysate wurden mit anti-HA-Antikörper (12CA5, Boehringer Mannheim) für 1 Stunde und mit 20 ml mit BSA gewaschenen Protein-A-Agarose-Beads (50% dünnflüssige Masse) für eine weitere Stunde inkubiert. Die Beads wurden zweimal mit NP-40 Lysispuffer gewaschen, gefolgt von zweimal Waschen mit NP-40 Lysispuffer ohne NP-40. Die Proteine wurden durch Inkubation in SDS-PAGE-Probenpuffer bei 100°C für 5 min eluiert und auf 4 bis 20% SDS-Polyacrylamidgels geladen. Nach der Elektrophorese wurden die Proteine auf Immobilon-P-Membranen (Millipore) transferiert und die Membranen wurden mittels Inkubation für 1 Stunde mit einer 1% Milchlösung in PBS blockiert. Primärer Antikörper (1 mg/ml 12CA5, Boehringer Mannheim; 1:500DAKO-Bcl-2, 124, DAKO; 10 mg/ml Anti-FLAG M2, Kodak) wurde mit den Membranen für 1 Stunde inkubiert, gefolgt von Inkubation mit sekundärem Antikörper (0,8 mg/ml HRP-konjugiertes Ziege-anti-Maus-IgG; Jackson Laboratory) für eine weitere Stunde. Die Detektion erfolgte mittels verstärkter Chemilumineszenz (ECL; Amersham) gemäß den Angaben des Herstellers unter Verwendung von X-OMAT AR-Film (Kodak).
  • b. Ergebnisse
  • i. Detektion der zelltötenden Funktion von Bak in multiplen Zelllinien.
  • Erzwungene bak-Expression induziert die Apoptose in stabilen Ratte-I-Zelllinien, welche mit einem induzierbaren bak-Expressionsplasmid transfiziert sind. Um die zelltötende Funktion einer großen Anzahl von bak-Mutanten schneller beurteilen zu können, wurde ein transientes Transfektionsassay verwendet. Ratte-I-Zellen wurden mit einem Markerplasmid, welches β-Galaktosidase kodiert, in Kombination mit einem Expressionsplasmid, welches Bak kodiert, oder mit verschiedenen Kontrollplasmiden transfiziert. Die zelltötende Aktivität von Bak in diesem Assay wurde durch eine weitgehende Reduktion der Anzahl von blauen (β-gal exprimierenden) Zellen gezeigt, welche im Verhältnis zur Co-Transfektion des β-gal-Plasmids mit einem Kontrollexpressionsvektor erhalten wurden (1). Die Eliminierung der blauen Zellen zeigte an, dass transfizierte Zellen von bak getötet wurden, noch bevor sie detektierbare Mengen an β-Galaktosidase exprimierten.
  • Die zelltötende Aktivität von Bak wurde in verschiedenen zusätzlichen Zelllinien bewertet. Um zu bestimmen, ob Bak Wildtyp-p53 benötigt, um die Apoptose zu induzieren, wurde ein transientes Transfektionsexperiment in transformierten Fibroblasten, welche von einer p53-/-"Knockout"-Maus abgeleitet waren, durchgeführt. Diesen Zellen fehlt funktionelles p53 und sie sind in hohem Maße beeinträchtigt hinsichtlich ihrer Fähigkeit, sich als Antwort auf g-Bestrahlung und DNA-zerstörende chemotherapeutische Wirkstoffe der Apoptose zu unterziehen (Lowe, et al., Cell 74: 957-967 (1993); Lowe, et al., Nature 362: 847-849 (1993)). Die Co-Transfektion von Bak mit β-gal reduzierte die Anzahl der blauen Zellen in beträchtlichem Maße (1), was anzeigte, dass Bak Wildtyp-p53 zur Ausübung seiner zelltötenden Funktion nicht benötigt. In ähnlicher Weise zeigten transiente Transfektionsexperimente, welche in den Hela-(Cervixkarzinom) und BT549 (Brustkarzinom)-Zelllinien durchgeführt wurden, dass Bak in diesem Zusammenhang menschliche Tumorzellen töten kann (1), was anzeigt, dass seine Aktivität nicht auf Nagerfibroblasten beschränkt ist.
  • ii. Identifizierung von für die zelltötende Funktion erforderlichen Bak-Domänen
  • Es wurde eine Mutationsanalyse von Bak durchgeführt, um Regionen des Moleküls zu identifizieren, welche notwendig und/oder ausreichend sind, um die Apoptose zu induzieren. Eine das gesamte Bak-Protein überspannende Serie von Deletionsmutationen wurde mittels PCR-Mutagenese eingeführt und jede Mutante wurde hinsichtlich ihrer zelltötenden Aktivität in einem transienten Transfektionsassay mit Ratte-I-Zellen getestet. Diese Analyse zeigte, dass ein großer Teil des Bak-Moleküls verzichtbar für dessen durch dieses Assay detektierte zelltötende Funktion ist (2). Überraschenderweise schließen die nicht essentiellen Regionen des Bak-Proteins die zwei Domänen in der carboxylterminalen Hälfte des Proteins ein, welche den höchsten Grad an Homologie zu anderen Mitgliedern der Bcl-2-Familie aufweisen (Bcl-2-Homologiedomänen I und II).
  • Die Deletion des carboxylterminalen hydrophoben Abschnitts von Aminosäuren (Reste 191 bis 211) verminderte teilweise die zelltötende Funktion von Bak (Mutante ΔC), eliminierte sie jedoch nicht. Dieses hydrophobe Ende dient in Bak vermutlich als Membran-Ankersequenz. In der Tat zeigten Immunfluoreszenzstudien von ΔC in transient transfizierten COS-Zellen, dass die intrazelluläre Verteilung der ΔC- Mutante in Relation zu Wildtyp-Bak verändert wird (diffus zytoplasmatisch), welches sich hauptsächlich mitochondrial zeigt. Das carboxylterminale hydrophobe Ende ist für die zelltötende Funktion von Bak nicht erforderlich, kann aber indirekt dazu beitragen, indem es die geeignete subzelluläre Lokalisation des Proteins sicherstellt.
  • Ein von der ΔGD-Deletion (Reste 82 bis 94) umfasstes Segment des Bak-Proteins ist absolut erforderlich für die zelltötende Funktion, da diese Mutante in dem transienten Transfektionsassay keine zelltötende Aktivität aufweist. Genauer gesagt ergab die Co-Transfektion von β-gal mit Bak-ΔGD ebenso viele oder mehr blaue Zellen im Verhältnis zur Co-Transfektion von β-gal mit dem Kontrollvektorplasmid. Die Deletion von unmittelbar N-terrminal zu dieser Domäne benachbarten Resten (Aminosäuren 67 bis 81) reduzierte die zelltötende Aktivität, eliminierte sie jedoch nicht (Bak-Mutante ΔPS). Alle anderen getesteten Deletionsmutanten (mit der Ausnahme von ΔC, wie zuvor besprochen) waren unverändert hinsichtlich ihrer Fähigkeit, Zellen zu töten. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse an, dass ein co-lineares Segment (bezeichnet als die "GD-Domäne"), welches durch die Deletionsmutanten ΔGD und ΔPS (Reste 67 bis 94) definiert ist, einzig erforderlich ist für die zelltötende Funktion von Bak, welche in dem transienten Assay detektiert wurde.
  • Um zu bestimmen, ob die GD-Domäne ausreichend für die zelltötende Funktion ist, wurden zwei gekürzte Bak-Proteinderivate, PEM und QVG, entsprechend den Aminosäuren 58 bis 103 bzw. 73 bis 123, in dem transienten Transfektionsassay hinsichtlich ihrer Aktivität getestet. Bei Co-Transfektion mit β-gal reduzierte QVG die Anzahl der blauen Zellen signifikant, was anzeigte, dass es eine gewisse Fähigkeit beibehalten hatte, Ratte-I-Zellen zu töten. Während die Reduktion der Anzahl an blauen Zellen vermindert wurde im Verhältnis zu Bak mit vollständiger Länge, wiesen weder PEM noch QVG den carboxylterminalen Membrananker auf und es war wahrscheinlich, durch Analogie zu der Bak-ΔC-Mutante, dass sie aufgrund veränderter subzelluläre Lokalisation nicht die volle zelltötende Funktion zeigen würden. In der Tat verhielt sich QVG hinsichtlich seiner Aktivität ähnlich der Bak-ΔC-Mutante. In einem Versuch, die zelltötende Fähigkeit der gekürzten Bak-Spezies zu verbessern, wurde das hydrophobe Endelement (Aminosäuren 187 bis 211) an die C-Termini von sowohl PEM als auch von QVG fusioniert (PEM + C bzw. QVG + C). In jedem Fall verbesserte eine Befestigung des mutmaßlichen Membranankers die Fähigkeit der gekürzten Bak-Mutanten zur Eliminierung der blauen Zellen in dem Transfektionsassay und sie resultierte in einer mit Wildtyp-Bak vergleichbaren Aktivität (2). Folglich zeigen diese Ergebnisse an, dass eine sowohl PEM als auch QVG (Reste 73 bis 103) gemeinsame Domäne für die zelltötenden Funktion von Bak ausreichend ist.
  • iii. Identifizierung von Bak-Domänen, welche die Interaktion mit Bcl-xL vermitteln.
  • Physikalische Interaktion mit anderen Mitgliedern der Bcl-2-Familie, so wie Bcl-xL, kann sich als essentiell für Bak erweisen, um seine zelltötende Funktion auszuüben oder kann die Aktivität von Bak regulieren. Folglich wurden Domänen innerhalb von Bak untersucht, um zu bestimmen, welche davon erforderlich und/oder ausreichend für seine Bcl-xL bindende Aktivität sind. Die Interaktion von Bak mit Bcl-xL wurde sowohl mittels eines in-vitro-Proteinbindungsassays als auch mittels einer Co-Immunpräzipitation aus transfizierten Zellen gemessen. In vitro translatiertes, mit 35S markiertes Bak bindet an ein aufgereinigtes, bakteriell exprimiertes GST-Bcl-xL-Fusionsprotein und die Spezifität dieser in-vitro-Interaktion wurde anhand des Unvermögens von Bak gezeigt, aufgereinigtes GST alleine zu binden (3A). Eine spezifische Bak/Bcl-xL-Interaktion konnte ebenfalls detektiert werden mittels Co-Transfektion von mit Epitop-Tags versehenen Formen von Bak und Bcl-xL in COS-Zellen. Bak wurde aus transfizierten Zelllysaten immunpräzipitiert und assoziiertes Bcl-xL wurde mittels Western-Blot-Analyse von co-präzipitierten Proteinen detektiert (3B). In der Abwesenheit von co-exprimiertem Bak wurde Bcl-xL nicht in den Immunpräzipitaten detektiert, was zeigte, dass die Bindung spezifisch ist.
  • Die zuvor beschriebenen Bak-Deletionsmutanten wurden sowohl in vitro als auch in transfizierten COS-Zellen hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Bindung von Bcl-xL getestet; die Ergebnisse sind in 4 zusammengefasst. Die Deletion der Reste 82 bis 94 (ΔGD-Mutante) eliminierten die Fähigkeit von Bak, mit Bcl-xL zu interagieren, in vollem Umfang. Interaktion mit Bcl-xL wurde ebenfalls durch Deletion der angrenzenden Aminosäuren 67 bis 81 (ΔPS Bak-Mutante) vermindert. Alle anderen getesteten Deletionsmutanten, welche den gesamten offenen Leserahmen von Bak umfassen, behielten in diesen Assays die Fähigkeit bei, Bcl-xL zu binden. Diese Ergebnisse identifizieren die von den ΔGD- und ΔPS-Mutanten umfassten Bak-Sequenzen (maximal Aminosäuren 67 bis 94) als einzig wichtig bei der Vermittlung der Interaktion mit Bcl-xL. Die gleiche Bak-Region, die GD-Domäne, war erforderlich für die zelltötende Funktion von Bak.
  • Um zu bestimmen, ob die durch Deletionsanalyse definierte Bak-Region ausreichend für die Proteinbindungsfunktion ist, wurden zwei kleine gekürzte Bak-Spezies (PEM und QVG), welche die Aminosäuren 58 bis 103 bzw. 73 bis 123 umfassten, hinsichtlich ihrer Fähigkeit getestet, mit Bcl-xL zu interagieren. Sowohl PEM als auch QVG banden Bcl-xL, was anzeigte, dass die diesen beiden gekürzten Bak-Spezies gemeinsame Region (Aminosäuren 73 bis 103) ausreichend für die Vermittlung der Interaktion mit Bcl-xL war.
  • Zusammen mit der Analyse der zuvor beschriebenen Deletionsmutanten und gekürzten Spezies zeigen diese Ergebnisse, dass Bak-Aminosäuresequenzen, welche die Reste 73 bis 103 überspannen, sowohl erforderlich als auch ausreichend für die Interaktion mit Bcl-xL sind. Wie zuvor beschrieben, ist diese Region ebenfalls an der zelltötenden Funktion von Bak beteiligt, was anzeigt, dass die Protein bindende Funktion mit der zelltötenden Funktion verknüpft sein kann.
  • iv. Der GD-Domäne ähnliche funktionell signifikante Sequenzelemente sind in Bax und bip 1a vorhanden.
  • Die hierin beschriebene Mutationsanalyse von Bak zeigt, dass einzig die GD-Domäne sowohl an den zelltötenden als auch an den Bcl-xL bindenden Aktivitäten von Bak beteiligt ist. Zwei weitere mit Bcl-2 interagierende Proteine, Bax und Bip 1a, weisen funktionelle Eigenschaften auf, welche denen von Bak ähnlich sind. Sowohl Bax als auch Bip 1a eliminieren blaue Zellen, wenn sie in Ratte-I-Zellen mit β-gal co-transfiziert werden, was anzeigt, dass sie in diesem Zusammenhang ebenfalls die Apoptose induzieren. Bax und Bip 1a interagieren ebenfalls spezifisch mit Bcl-xL, sowohl in vitro als auch in transfizierten COS-Zellen. Diese funktionellen Ähnlichkeiten veranlassten die Untersuchung, ob die drei Proteine irgendwelche strukturellen Eigenschaften gemeinsam haben, welche zu ihren ähnlichen biologischen Funktionen beitragen. Genauer gesagt wurden Bax und Bip 1a angesichts der zuvor präsentierten Analyse untersucht, um zu bestimmen, ob sie Sequenzen enthalten, welche der GD-Domäne von Bak ähnlich und gleichfalls wichtig für deren biologischen Aktivitäten sind.
  • Bax weist eine weitreichende Homologie zu Mitgliedern der Bcl-2-Familie auf (einschließlich Bak), wobei das Zentrum des höchsten Grads der Sequenzhomologie um BH1 und BH2 herum angesiedelt ist (Oltvai, et al., Cell 74: 609-619 (1993)). Ein N-terminal zu BH1 gelegener Abschnitt von Aminosäuren (59 bis 73) in Bax weist Homologie zu Sequenzen (Reste 74 bis 88) innerhalb der GD-Domäne von Bak auf (5). Im Gegensatz zu Bax ist die primäre Sequenz von Bip 1a den bekannten Bcl-2-Verwandten nicht ähnlich und weist keine Sequenzen auf, welche homolog zu BH1 und BH2 sowie charakteristisch für die Bcl-2-Familie sind. Bip 1a enthält jedoch eine Region (Aminosäuren 57 bis 71), welche zum gleichen Element innerhalb der GD-Domäne in Bak und Bax homolog ist (5).
  • Innerhalb von Bax und Bip 1a gelegene GD-Domänen-Elemente wurden ausgewertet, um zu bestimmen, ob sie ebenfalls entscheidend für die zelltötenden und Protein bindenden Funktionen dieser Proteine sind. Es wurden kleine Deletionen, welche die konservierten GD-Domänen-Motive entfernten, in Bax und Bip 1a eingeführt und die Mutanten wurden dann hinsichtlich ihrer Fähigkeit analysiert, Ratte-I-Zellen zu töten und an Bcl-xL zu binden. Diese Analyse zeigte, dass die Bax ΔGD- und Bip 1a ΔGD-Mutanten, ebenso wie Bak ΔGD, eine verminderte Fähigkeit aufweisen, blaue Zellen zu eliminieren, wenn sie mit β-gal in Ratte-I-Zellen co-transfiziert werden (6). Außerdem weisen beide Mutanten nicht mehr die Fähigkeit auf, mit Bcl-xL, zu interagieren (6). Folglich ist die Funktion des GD-Domänen-Elements in Bak, Bax und Bip 1a konserviert und entscheidend für die biologischen Aktivitäten aller drei Proteine.
  • v. Die GD-Domäne ist ausreichend für die Bildung von Homo- und Heterodimeren.
  • Um zu beurteilen, ob die GD-Domäne andere Protein/Protein-Interaktionen vermittelt, welche für ihre biologische Aktivität von Bedeutung sein könnten, wurde ein Abschnitt von Bak (PEM), welcher die GD-Domäne umfasste (Reste 58 bis 103), an GST fusioniert, um GST-PEM zu erzeugen. In vitro translatiertes, mit 35S markiertes Bcl-xL, Bak, Bax und Bip 1a wurden entweder mit GST alleine oder mit bakteriell exprimiertem GST-PEM-Fusionsprotein inkubiert. Interaktionen der GD-Domäne mit Bak und Bax wurden, im wesentlichen wie hierin beschrieben, für Bak, welches and Bcl-xL bindet, gemessen. Die Komplexe wurden mit Glutathion-Agarose-Beads gefangen, gewaschen und gebundene Proteine wurden mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Autoradiographie detektiert.
  • Die Ergebnisse dieses Experiments sind in 6 gezeigt. Bcl-xL, Bak und Bax interagieren alle spezifisch mit GST-PEM, nicht jedoch mit GST alleine. Diese Ergebnisse zeigen, dass die GD-Domäne von Bak ausreichend ist, um an Bak (Homodimerisation), an Bax (Heterodimerisation mit einem unterschiedlichen Killerprotein) und an Bcl-xL (Heterodimerisation mit einem Überlebensprotein) zu binden. Folglich ist die GD-Domäne dazu in der Lage, Interaktionen nicht nur mit Bcl-xL, sondern auch mit Bak und Bax zu vermitteln. Sie interagiert nicht mit Bip 1a.
  • SEQUENZPROTOKOLL
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Claims (22)

  1. Isoliertes Peptid bestehend aus einem gekürzten Protein ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Bak, Bax und Bip 1a oder Mutanten davon, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid die GD-Domäne umfasst und eine zelltötende Aktivität und Bcl-xL-Bindung aufweist; wobei die Domäne von Bak QLAIIGDDIN, die GD-Domäne von Bax CLKRIGDELD und die GD-Domäne von Bip 1a RLACIGDEMD ist.
  2. Isoliertes und gereinigtes Peptid mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus GDDINRRYDSEFQ, [SEQ ID NR: 1] PSSTMGQVGRQLAIIGDDINRRYDSEFQ, [SEQ ID NR: 2] QVGRQLAIIGDDINRRYDSEFQTMLQHLQPT, [SEQ ID NR: 3] LSECLKRIGDELDSN, [SEQ ID NR: 4] LKRIGDELD, [SEQ ID NR: 5] QDASTKKLSECLKRIGDELDSNMELQ, [SEQ ID NR: 6] LALRLACIGDEMDVS, [SEQ ID NR: 7] IGDEM, [SEQ ID NR: 8] CMEGSDALALRLACIGDEMDVSLRAPRL, [SEQ ID NR: 9] und VGRQLAIIGDDINRR, [SEQ ID NR: 10].
  3. Isoliertes Polynukleotid bestehend aus einer Nukleotidsequenz, welche ein Peptid nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 kodiert, oder einer dazu komplementären Nukleotidsequenz.
  4. Polynukleotid wie beansprucht in Anspruch 3 mit einer Nukleotidsequenz ausgewählt aus SEQ ID NR: 15, SEQ ID NR: 17, SEQ ID NR: 19, SEQ ID NR: 21, SEQ ID NR: 23, SEQ ID NR: 25, SEQ ID NR: 27, SEQ ID NR: 29, SEQ ID NR: 31 oder SEQ ID NR: 33.
  5. Isoliertes rekombinantes DNA-Molekül im wesentlichen bestehend aus einer Nukleotidsequenz nach Anspruch 3 oder Anspruch 4.
  6. Vektor im wesentlichen bestehend aus einem rekombinanten DNA-Molekül nach Anspruch 5.
  7. Vektor umfassend ein rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 5, wobei der Vektor eine Antisense-RNA exprimiert.
  8. Wirtszelle, welche mit dem Vektor nach Anspruch 6 oder Anspruch 7 transformiert ist, wobei gegebenenfalls die Wirtszelle eine Säugerzelle ist.
  9. Verfahren zur Herstellung von isoliertem Peptid nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 umfassend a) Konstruktion eines Vektors nach Anspruch 6; b) Transformation einer geeigneten Wirtszelle mit dem Vektor aus Schritt a); c) Kultivieren der Wirtszelle unter Bedingungen, welche die Expression des Peptids durch die Wirtszelle gestatten; und d) Isolierung des von der Wirtzelle aus Schritt c) exprimierten Peptids; wobei isoliertes Peptid produziert wird, wobei gegebenenfalls die Wirtszelle eine Säugerzelle ist.
  10. Antikörper erzeugt gegen ein Peptid nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei der Antikörper bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem polyklonalen Antikörper und einem monoklonalen Antikörper.
  11. Antikörper wie in Anspruch 10 beansprucht, wobei der Antikörper nachweisbar markiert ist, wobei die nachweisbare Markierung bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: einer Radiomarkierung, einer Enzymmarkierung, einer Cofaktor-Markierung, einer Fluoreszenzmarkierung, einer paramagnetischen Markierung, einer chemilumineszenten Markierung und einer Metallmarkierung.
  12. Nachweisbar markierte Nukleotidsonde umfassend eine erste Nukleotidsequenz, welche im wesentlichen komplementär ist zu einer zweiten Nukleotidsequenz, welche ein Peptid nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 kodiert.
  13. Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend ein Peptid nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
  14. Verfahren zur Identifizierung eines Agens, welches in der Lage ist, GD-Domänenvermittelte Heterodimerisierung zu modulieren, umfassend: Durchführung eines Heterodimerisierungs-Assays einschließend ein erstes und ein zweites Protein oder Polypeptid, wobei die GD-Domäne durch eine der Sequenzen in SEQ ID NR: 2, 4, 6, 7, 9 und 10 gekennzeichnet ist und wobei das erste und das zweite Protein oder Polypeptid unterschiedlich sind, und ein Agens; Bestimmung, ob besagtes Agens die Heterodimerisierung des ersten Proteins oder Polypeptids an das zweite Protein oder Polypeptid inhibiert oder verstärkt; wobei, wenn die Inhibierung oder Verstärkung der Heterodimerisierung bestimmt ist, dies anzeigt, dass das Agens in der Lage ist, die GD-Domänen-vermittelte Heterodimerisierung zu modulieren.
  15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei das zweite Protein oder Polypeptid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Bak, Bcl-xL, Bax und Bip 1a.
  16. Verfahren zur Identifizierung eines Agens, welches in der Lage ist, die GD-Domänen-vermittelte Homodimerisierung zu modulieren, umfassend: Durchführung eines Homodimerisierungs-Assays einschließend ein erstes und ein zweites Protein oder Polypeptid, wobei die GD-Domäne durch eine der Sequenzen in SEQ ID NR: 2, 4, 6, 7, 9 und 10 gekennzeichnet ist und wobei das erste und das zweite Protein oder Polypeptid gleich sind, und ein Agens; Bestimmung, ob das Agens die Homodimerisierung des ersten Proteins oder Polypeptids an das zweite Protein oder Polypeptid inhibiert oder verstärkt; wobei, wenn die Inhibierung oder Verstärkung der Homoodimerisierung bestimmt ist, dies anzeigt, dass das Agens in der Lage ist, die GD-Domänen-vermittelte Homodimerisierung zu modulieren.
  17. Agens ausgewählt aus GD-Domänen-Peptiden und Mimetika, Fragmenten, funktionellen Äquivalenten und/oder Hybriden oder Mutanten davon, ebenso wie Vektoren enthaltend cDNA, welche eines der vorangegangenen kodieren, identifiziert durch das Verfahren nach Anspruch 14 oder Anspruch 16, zur Verwendung in der Therapie von degenerativen Störungen, wenn alleine oder in Kombination mit und/oder gleichzeitig mit anderen geeigneten Wirkstoffen verabreicht.
  18. Verwendung eines Antikörpers gegen ein GD-Domänen-Peptid ausgewählt aus einer der SEQ ID NRs: 1 bis 10, zum Screening einer cDNA-Expressionsbibliothek oder von Klonen umfassend DNA-Insertionen, welche immunokreuzreaktive Proteine kodieren.
  19. Agens nach Anspruch 17 umfassend ein Molekül, welches in der Lage ist, an ein anti-apoptotisches Protein ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Bcl-2 und Bcl-xL zu binden, wobei die Bindung den apoptotischen Zustand einer Zelle induziert oder moduliert.
  20. Peptid umfassend die GD-Domäne ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 3, Aminosäuren 58 bis 103 und Aminosäuren 73 bis 123 von Bak, im wesentlichen äquivalent zu denen des Wildtyp-Bak.
  21. Peptid wie in Anspruch 1, Anspruch 2 oder Anspruch 20 beansprucht zur Verwendung als Arzneimittel.
  22. Verwendung eines Peptids wie beansprucht in Anspruch 1, Anspruch 2 oder Anspruch 20 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von degenerativen Störungen gekennzeichnet durch unangebrachte Zellteilung oder unangebrachten Zelltod.
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