DE60009484T3

DE60009484T3 - Als ngf-antagonisten wirkende monoklonale antiköper und deren synthetische und biotechnologische derivate

Info

Publication number: DE60009484T3
Application number: DE60009484T
Authority: DE
Inventors: Michal NOVAK
Original assignee: Lay Line Genomics SpA
Current assignee: Lay Line Genomics SpA
Priority date: 1999-05-26
Filing date: 2000-05-26
Publication date: 2012-06-14
Anticipated expiration: 2020-05-27
Also published as: WO2000073344A2; ES2218163T3; PT1181318E; WO2000073344A9; ITRM990333A1; ATE263188T1; DK1181318T3; JP2003502029A; DK1181318T4; AU5101900A; IT1306704B1; JP2012040007A; EP1181318B1; JP4917226B2; DE60009484D1; CA2373274C; DE60009484T2; US8486401B2; EP1181318A2; US7601352B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft monoklonale Antikörper, deren synthetische und biotechnologische Derivate, die als NGF-Antagonisten bzw. NGF-antagonistische Moleküle wirken.
Die Erfindung betrifft ebenfalls diagnostische und therapeutische Verwendungen derartiger Moleküle und damit verbundene Zusammensetzungen.
Neutrophine sind eine Familie von Peptid-Wachstumsfaktoren (Barde, 1994), die mit dem ersten Mitglied der Familie, NGF (Nervenwachstumsfaktor, Levi-Montalicini, 1987), strukturell verwandt sind. Neutrophine modulieren die neuronale Differenzierung und das neuronale Überleben sowie die synaptische Übertragung sowohl von peripheren Neuronen als auch im Zentralnervensystem. Des Weiteren wirkt NGF auf verschiedene nicht-neuronale Gewebe und Zellen, wie beispielsweise Zellen des Immunsystems.
NGF wirkt über zwei Membranrezeptoren, die in den Zielzellen vorliegen, nämlich den p75-Rezeptor mit niedriger Affinität und das 140-kDa-Transmembranglycoprotein mit hoher Affinität, TrkA (Kaplan et al., 1991, Klein et al., 1991), das eine Tyrosinkinase-Aktivität aufweist. TrkA wird in Neuronen der Neuralleiste, in sympathischen Neuronen sowie in cholinergen Neuronen des basalen Vorderhirns und des Corpus striatum expremiert, wo es den entscheidenden Mediator der NGF-Wirkungen darstellt (Holtzman et al., 1992; Verge et al., 1992), TrkA wird ebenfalls in einigen nicht-neuronalen Geweben und Zellen, einschließich B-Lymphocyten (Torcia et al., 1996), expremiert.
Im Stand der Technik wird die potentielle Verwendung von NGF in der Behandlung von verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen, einschließlich der Alzheimerschen Erkrankung (Lindsay et al., 1994; Ebendal et al., 1991) und anderer Erkrankungen wie Diabetes mellitus und Lepra (Anand et al., 1996), vorgeschlagen. Erste klinische Tests verliefen jedoch enttäuschend, wobei sie durch Schwierigkeiten mit der Abgabe, durch die Pharmakokinetiken im Zentralnervensystem und durch negative agonistische Eigenschaften von NGF gegenüber anderen peripheren Zielen außerhalb des Zentralnervensystems kompliziert wurden, die zu massiven und unerwünschten Stimuli führten.
Daher besteht der Bedarf an der Entwicklung gegenüber der Wechselwirkung NGF-TrkA-Rezeptor selektiven antagonistischen Molekülen und pharmakologisch wirksamen Derivaten davon, die leicht abgegeben werden.
Des Weiteren war die NGF-Überproduktion in verschiedenen entzündlichen Zuständen mit dem Anstieg der Schmerzempfindlichkeit der primären afferenten Nocizeptoren verbunden, was somit zum Auftreten eines chronischen Schmerzzustandes beitrug. Die Population sensorischer Neuronen, die auf Gewebeschäden ansprechen (Nocizeptoren), ist besonders NGF-abhängig. Zieht man außerdem die Nachteile und Beschränkungen der zwei existierenden Klassen von Schmerzmitteln (nicht-steroide entzündungshemmende Arzneimittel und Opiate) in Betracht, stellt die Bereitstellung eines neuen davon verschiedenen Ziels wie NGF einen Fortschritt im Fachgebiet dar (Snider und McMahon, 1998). Des Weiteren stellt NGF, wie von Levine (Levine, 1998) vorgeschlagen, ein potentielles Ziel für die Gestaltung bzw. das Design neuer Therapien von Schmerzen, insbesondere diejenigen, die sich aus entzündlichen oder neuropathischen Zuständen ergeben, bei denen übliche Arzneimittel weniger wirksam sind, bereit. Schließlich zeigten neuere Untersuchungen eine direkte Beziehung zwischen dem Schmerz und dem TrkA-System, wobei in vier unabhängigen Fällen des Schmerzes vom Typ 4 mit chronischer Unempfindlichkeit und begleitender Anhidrose, das Vorliegen von Mutationen im TrkA-Gen und somit das Fehlen funktionaler NGF-Rezeptoren nachgewiesen wurde (Indo et al., 1996; Wood, 1996).
Demgemäß stellt das NGF-TrkA-System ein potentielles Ziel für das Design von Schmerztherapien, d. h. Behandlungen, die mit Hilfe effizienter TrkA-Antagonisten dazu befähigt ist, das neuropathische Schmerzsyndrom zu bekämpfen, bereit (Levine, 1998; Snider und McMahon, 1998).
Die anormale Expression der TrkA-Rezeptor-mRNA war auch mit neoplastischen Erkrankungen verbunden. Die Prognose von TrkA-expremierenden Tumoren, die „bildgebende” Diagnostik sowie die Therapie stellen Anwendungsgebiete für Antikörper mit hoher Affinität für TrkA dar. Tatsächlich stellen in diesen Tumoren TrkA-bindende Agentien wertvolle Werkzeuge der klinischen Diagnose, Prognose und therapeutischer Behandlungen dar (Kramer et al., 1997).
Rekombinante Antikörper (Vaughan et al., 1998) sind Ausgangsreagenzien der Wahl bei der Entwicklung kleiner Moleküle, die deren Wirksamkeit nachahmen (Le Sauteur et al., 1995).
Von Le Sauteur et al., 1996, und in der PCT-Anmeldung Nr. WO97/21732 wurde ein TrkA-agonistischer monoklonaler Antikörper beschrieben. Aufgrund der agonistischen Wirksamkeit des einzigen offenbarten Antikörpers (5C3) ist er für die Ziele der vorliegenden Erfindung und in allen Situationen ungeeignet, in denen die Hyperaktivierung des TrkA-Rezeptors vermieden werden muss. Die PCT-Anmeldung Nr. WO97/21732 offenbart die Verwendung des agonistischen Antikörpers 5C3 als „Bildgebungs”-Diagnostikum. Dieser Antikörper kann jedoch aufgrund seiner agonistischen Wirkung nicht in der obigen Anwendung verwendet werden, so lange die Rezeptoraktivierung nicht behindert wird.
Urfer et al. (JBC1998, 273(10); 5829–5840) offenbaren die Antikörper A1488, A1502 und A1503, aber nicht die chemische Charakterisierung solcher Antikörper. Darüber hinaus behandelt diese Druckschrift nicht die Funktion von TrkA.
Der Abstract der Society for Neuroscience, Vol. 22, 1996, Seite 1010, Abstract 402.11 (Hongo et al.) offenbart einen Antikörper Mab1503, der ein starker Inhibitor für die trkA-NGF-Bindung sein soll, wie bestimmt durch einen Kinase-induzierten Rezeptor-Aktivierungs-Bioassay (KIRK). KIRA-Assay liefert jedoch eigentlich nicht den Beweis für eine Liganz-Rezeptor-Bindung. Diesem Abstract kann nicht entnommen werden, dass Mab1503 ein funktioneller TrkA Antagonist ist.
EP-A-0 471 205 offenbart eine Reihe monoklonaler Antikörper, die trk Proto-Onkogene und/oder trk-verwandte Onkogen-Proteine binden, ihre Sequenz wird nicht beschrieben und sie werden zur Behandlung von Krebs verwendet.
WO 95/15180 bezieht sich auf ganze agonistische Antikörper. Die Druckschrift enthält eine isolierte Offenbarung betreffend die angeblichen Rezeptor-blockierenden Eigenschaften von monovalenten Antikörper-Fragmenten. Solche eine Schlußfolgerung wird von dem in der genannten Anmeldung gezeigten Nachweis nicht gestützt.
Hongo et al. (Hybridoma 1995, 14(3): 253–259) beschreiben die Entwicklung und Charakterisierung von neuen monoklonalen Mausantikörpern zu dem Latenz-assoziierten Peptid (LAP) von TGF-β1.
Clary et al. (Molecular Biol. of the Cell 1994, 5549–563) offenbaren eine Studie über die Auswirkungen eines polyklonalen Antiserums, entweder ganze Antikörper oder Fab Fragmente, auf den TrkA-Rezeptor. Bezüglich therapeutische Anwendung bezieht sich die Druckschrift nur auf die Auswirkung von NGF/trkA-Bindung an neuronale Entwicklung.
Daher besteht ein klarer Bedarf an der Entwicklung neuer Moleküle, die geeignet sind, mit der Bindung von NGF an TrkA zu interferieren, neue therapeutische Wirkungen bereitstellen und insbesondere einen TrkA-Antikörper bereitstellen, der als Antagonist wirkt, und dann idealerweise die Blockierung der Rezeptoraktivierung durch endogene Liganden (NGF) gewährleisten und keine Aktivierungsaktivität gegenüber dem Rezeptor aufweisen. Des Weiteren könnte der Antikörper vorteilhafterweise bei der Entwicklung von Reagenzien, d. h. synthetischen und rekombinanten Fragmenten, welche die NGF-TrkA-Wechselwirkung blockieren, verwendet werden.
Der Autor der vorliegenden Erfindung hat verschiedene monoklonale Antikörper isoliert, die zur Wechselwirkung mit dem NGF-Rezeptor, TrkA genannt, befähigt sind. Von diesen wirkt ein Antikörper, MNAC13 genannt, durch Inhibition der Bindung von NGF an TrkA als starker Antagonist von TrkA. Dieser Antikörper stellt ein sehr wirksames Mittel zur Verhinderung der funktionellen Aktivierung von TrkA durch NGF in einer Vielzahl von biologischen Systemen dar.
Der Antikörper wurde durch kongene Immunisierung von Balb/C-Mäusen mit einem humanen nativen TrkA-Rezeptor, der auf Balb/C-3T3-Zellen expremiert wird, erzeugt. Die Selektion basierte auf der Befähigung der Antikörper zur Inhibierung der Bindung von NGF an TrkA-expremierende Zellen. Dies führte zur Isolierung von zur Bindung an TrkA an dessen NGF-bindender Domäne befähigter Antikörper, die dadurch die Bindung von NGF verhindern. Der Antikörper MNAC13 verhindert in sehr wirksamer Weise die funktionelle Aktivierung von TrkA durch NGF in verschiedenen biologischen Systemen. Der Autor der vorliegenden Erfindung hat ebenfalls die Gene, welche die variablen Regionen des MNAC13-Antikörpers kodieren, kloniert, und mit Hilfe von rekombinanten DNA-Techniken derartige Regionen zu funktionellen Polypeptiden verminderter Größe (Einzelketten-Fv-Fragment, scFvMNAC13) zusammengesetzt, wobei bestätigt wurde, dass diese die Eigenschaften des parentalen Antikörpers beibehalten.
Ein agonistischer Antikörper bedeutet einen Antikörper, der zur Aktivierung des Rezeptorantigens in Abwesenheit des nativen Liganden des Rezeptors selbst befähigt ist.
Ein antagonistischer Antikörper bedeutet einen Antikörper, der gegen das aktive Zentrum des Antigenrezeptors gerichtet ist und dazu befähigt ist, die Aktivität des natürlichen Liganden, der bezüglich der Bindung zum Rezeptor selbst mit Letzterem konkurriert, zu inhibieren.
Synthetische und biotechnologische Derivate eines Antikörpers bedeuten jegliche veränderte bzw. (gen)technisch erzeugte, durch chemische oder rekombinante Techniken synthetisierte Fragmente, welche die funktionellen Eigenschaften des Antikörpers beibehalten.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung sind Antikörper wie definiert in Ansprüchen 1–3 und 20, Fragmente und Derivate der Antikörper wie definiert in Ansprüchen 4–5 und 21–24, Nukleinsäuren und ihre Verwendung wie definiert in Ansprüchen 6–9 und 25–26, ein nicht-humanes transgenes Tier wie definiert in Ansprüchen 10 und 27, ein rekombinanter Vektor wie definiert in Ansprüchen 11–12 und 28–29, eine pharmakologische Zusammensetzung wie definiert in Ansprüchen 13–16, 18, 30–33 und 35, konstruierte Zellen gemäß Ansprüchen 17 und 34, eine Zusammensetzung zur Verwendung in in vivo bildgebender Diagnostik gemäß Ansprüchen 19 und 36 und Verwendung eines monoklonalen Antikörpers, der an TrkA bindet, in der Herstellung einer pharmakologischen Zusammensetzung zur Behandlung von chronischem oder akutem Schmerz wie definiert in Anspruch 37.
Die Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung können vorteilhafterweise als Transgene verwendet werden, um nicht-humane transgene Tiere, vorzugsweise Mäuse, zu erhalten, in welchen der Antikörper induzierbar oder unter Kontrolle von Promotoren, welche die Expression im adulten Tier bestimmen bzw. steuern, expremiert wird. Diese Tiere können vorteilhafterweise dazu verwendet werden, Arzneimittel für humane Erkrankungen, bei denen die NGF/TrkA-Wechselwirkung inhibiert ist, und insbesondere neurodegenerative Erkrankungen, zu untersuchen und zu testen. Transgene nicht-humane Tiere können mit Hilfe von Standardtechniken, d. h. wie in Allen et al., 1987, beschrieben, erhalten werden.
Transgene Modelle (Smeyne et al., 1994), die auf der Repression des TrkA-Gens basieren, zeigen einen letalen Phänotyp innerhalb von 1–2 Wochen nach der Geburt und sind dann zur Untersuchung von TrkA im adulten und gealterten Nervensystem ungeeignet. Antikörper-expremierende transgene Tiere sind von Piccioli et al., 1991, 1995, offenbart.
Die vorliegende Erfindung wird nachstehend in Bezug auf beispielhafte, jedoch nicht einschränkende Ausführungsformen beschrieben. Es wird auf die folgenden Figuren Bezug genommen.
1 Inhibition der Bindung von ¹²⁵I-NGF an TrkA+-Balb/C-3T3-Zellen.
Hybridom-Überstände wurden vor der Zugabe von ¹²⁵I-NGF mit TrkA+-Balb/C-3T3-Zellen vorinkubiert. Das Histogramm stellt die Inhibition der spezifischen NGF-Zell-Bindung durch verschiedene Antikörper dar. Die spezifische Bindung wurde durch Subtraktion von der Gesamtbindung, die in Gegenwart eines Überschusses von unmarkiertem NGF erhalten wurde, bestimmt. Die gezeigten Werte sind der Durchschnitt von Dreifachbestimmungen.
2 MNAC13 erkennt die extrazelluläre Domäne des TrkA-Rezeptors.
Lösliche TrkA- und TrkB-Rezeptoren, die in Form von Immunoadhesinen erzeugt wurden, wurden als Festphasenantigene für einen ELISA-Test verwendet und mit 2 oder 20 ng/ml gereinigtem MNAC13-Antikörper inkubiert.
3 MNAC13 erkennt den TrkA-Rezeptor auf lebenden Zellen.
Balb/C-3T3- oder TrkA+-Balb/C-3T3-Zellen wurden mit dem MNAC13-Antikörper inkubiert und einer FACS-Analyse unterworfen.
4 MNAC13 markiert die TrkA-Rezeptoren auf Neuronen des basalen Vorderhirns der Ratte.
Koronale Schnitte des basalen Vorderhirns von P10-Ratten wurden in Gegenwart (A) oder in Abwesenheit (B) des MNAC13-Antikörpers inkubiert. Vergleichsbalken: 98 μm.
5 MNAC13 inhibiert die von NGF induzierte Differenzierung von PC12-Rattenzellen.
PC12-Zellen wurden in Serum-freies Medium überführt und in Gegenwart (A) oder in Abwesenheit (B, C und D) von 20 ng/mg NGF für etwa 4 Tage inkubiert. Der MNAC13-Antikörper (4 μg/ml) inhibiert vollständig das NGF-induzierte Überleben und die NGF-induzierte Differenzierung, während der Kontroll-Antikörper 9E10 dies nicht bewirkt (D).
6 Die Implantation von MNAC13-sekretierenden Zellen in das Rattenhirn vermindert deutlich die Anzahl cholinerger Neuronen im basalen Vorderhirn.
Der cholinerge Phänotyp von Neuronen im basalen Vorderhirn von P9-Ratten wurde durch die Immunreaktivität mit der Cholinacetyltransferase (ChAT) nach der intraventrikulären Implantation von MNAC13-Hibridom-(B)- von Kontroll-Myelom-(A)-Zellen am Tag P2 bestimmt. Es ist eine deutliche Verminderung der Anzahl ChAT-positiver Neuronen in den MNAC13-implantierten Ratten (B) festzustellen. Vergleichsbalken: 65 μm.
7 Rekombinante Formen von MNAC13-mAk binden TrkA.
Phagen mit scFvMNAC13 (A), löslichem scFvMNAC13 (B) und dem parentalen monoklonalen Antikörper MNAC13 (C) wurden in einem ELISA-Test unter Verwendung von TrkA-Immunadhesin als Festphasenantigen in Gegenwart ansteigender Konzentrationen des konkurrienden löslichen TrkA-Immunadhesins verwendet.
: 10-fache Verdünnung des Antikörpers in Bezug auf
.
8 Inhibition des NGF-induzierten Neuriten-Wachstums von PC12-Zellen durch den rekombinanten Antikörper ScFvMNAC13.
Periplasmatische Fraktionen, enthaltend den rekombinanten ScFvMNAC13 (B) oder ein ScFv-Kontrollfragment (Antifox-ScFv) wurden zusammen mit 10 ng/ml NGF zu PC12-Zellen, die für 7 Tage mit 50 ng/ml NGF induziert wurden und zum Beginn des Tests erneut ausplattiert wurden, gegeben. Der rekombinante ScFvMNAC13-Antikörper in B inhibiert das durch die Aktivierung von TrkA durch NGF gesteuerte wiederkehrende Wachstum von Neuriten in erneut ausplattiertem NGF-induzierten PC12-Zellen.
METHODEN Immunisierungsprotokoll
Es wurden Balb/C-3T3-transfizierte Zellen, die 10⁶ humane TrkA-Moleküle pro Zelle expremieren, in einem kongenen Immunisierungsprotokoll verwendet. Es wurden drei Gruppen weiblicher Balb/C-Mäuse mit 10⁶, 5 × 10⁵ bzw. 10⁶ lebenden Zellen pro Maus immunisiert. Nach 5 Injektionen in einem Abstand von zweiwöchigen Intervallen wurden Präfusionsseren hinsichtlich ihrer Befähigung zur Inhibition der Bindung von NGF an den TrkA-Rezeptor auf TrkA+-Balb/C-3T3-Zellen getestet. Die größte Inhibition der NGF-Bindung wurde bei Seren von Mäusen festgestellt, die mit 5 × 10⁵-Zellen injiziert wurden (Bindungsinhibition bei einer Verdünnung von 1:100).
Hybridom-Herstellung
Drei Tage nach einer Verstärkungsinjektion von TrkA+-Balb/C-3T3-Zellen wurden die Mäuse getötet, die Milzen entfernt und Splenocyten mit einem NSO-Myelom (10:1-Verhältnis) mit Polyethylenglycol (PEG 1500), wie beschrieben (Novak et al., 1991), fusioniert. Das Hybridom-Wachstum und die Selektion wurden gemäß Standardmethoden durchgeführt (Galfre und Milstein, 1981).
Inhibition der ¹²⁵I-Bindung an TrkA+-Balb/C-3T3-Zellen
2,5 S NGF wurden aus submandibulären Drüsen von Mäusen gereinigt und auf eine spezifische Aktivität von 10⁵ cpm/ng, wie beschrieben (Cattaneo et al., 1983), iodiert. 5 × 10⁴ TrkA+-Balb/C-3T3-Zellen wurden in jede Vertiefung von Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen in einem Volumen von 50 μl Kulturmedium (DMEM mit 10% FCS) ausplattiert. Es wurden Aliquote von 50 μl Hybridom-Überstand für 1 Stunde mit Zellen inkubiert, gefolgt von der Zugabe der ¹²⁵I-NGF-Lösung (5 × 10⁴ cpm/Vertiefung). Die Platten wurden wie beschrieben (Cattaneo et al., 1988) weiter verarbeitet. Die nicht-spezifische Bindung wurde parallel in Vertiefungen in Gegenwart eines Überschusses (5 μg/ml) von nicht-markiertem NGF bestimmt. In parallel verarbeiteten Vertiefungen wurde die Bindung in Gegenwart eines nicht-relevanten Hybridom-Überstands (Rab50) oder neutralisierendem Anti-NGF (mAk αD11, Cattaneo et al., 1988) durchgeführt.
ELISA
Lösliche TrkA- und TrkB-Rezeptoren wurden als Immunadhesine (Chamow und Ashkenazi, 1996) durch Verknüpfen der extrazellulären Domäne des humanen TrkA-Rezeptors mit dem FC-Anteil von IgG2, der aus einer Sequenz von 35 Aminosäuren besteht, gefolgt von CH2- und CH3-Domänen, erzeugt. Die für die TrkA- und TrkB-Immunadhesine (TrkA-IgG und TrkB-IgG) kodierenden Sequenzen wurden in Baculoviren (Autographa califonica Nukleärer Polyhedrosis Virus, AcNPV) für die Expression in Insektenzellen (Baculogold Transfektions-Kit, Pharmingen Ing.) kloniert, und die Proteine wurden durch Protein-A-Sepharose-Chromatographie aus Serum-freien Kulturmedium von High-Five-Insektenzellen gereinigt. Für den ELISA-Test wurden TrkA-IgG und TrkB-IgG bei 2 μg/ml inkubiert und dann mit 2 oder 20 ng/ml MNAC13 und Anti-Maus-IgG, die zuvor an Kamel-Immunoglobinen vorabsorbiert wurden, inkubiert.
Immunfluoreszenz-Analyse
Der monoklonale MNAC13-Antikörper wurde aus Serum-freien Hybrodom-Überständen durch Protein-A-Sepharose-Chromatographie gereinigt. Es wurden 5 × 10⁴ TrkA+-3T3-Balb/C-Zellen mit gereinigtem MNAC13-Antikörper inkubiert und mit einem Sortiergerät für aktivierte Zellen (FACS) analysiert. Für die Immunfluoreszenz wurden adhärente Zellen mit 3,7% Paraformaldehyd in PBS fixiert, mit gereinigtem MNAC13 inkubiert, gefolgt von einem FITC-markierten Anti-Maus-IgG und mittels konfokaler Mikroskopie (Olympus) analysiert.
NGF-Biotest mit PC12-Zellen
PC12-Rattenzellen (Greene und Tischler, 1976) wurden in RPMI mit 10% Hitzeinaktiviertem Pferde-Serum und 5% FCS kultiviert. Für den Biotest wurden die Zellen in Serum-freies Medium überführt und mit 20 ng/ml NGF für 4 bis 6 Tage in Gegenwart oder Abwesenheit von MNAC13-Antikörpern oder dessen einzelkettiger rekombinanter Fv-Version (scFvMNAC13) inkubiert. In einer anderen Ausführungsform wurden die Zellen mit 50 ng/ml NGF für 1 Woche inkubiert, und dann wurden sie mechanisch von den Neuriten entfernt, um sie in Gegenwart von 10 ng/ml NGF und unter Zugabe des geeigneten Antikörpers wieder auszuplattieren. Das Neuriten-Wachstum wurde 24–48 Stunden danach bewertet.
Intraventrikuläre Hybridom-Injektionen und Immunchemie
Intraventrikuläre Hybridom-Injektionen und die Analyse des cholinergen Phänotyps von Neuronen des basalen Vorderhirns wurden im Wesentlichen wie beschrieben (Molnar et al., 1997 und 1998) durchgeführt. Kurz erläutert wurden MNAC13-Hybridom-Zellen und Myelom-Kontrollzellen (P3X63Ag8) in Hank-Lösung (HBBS) bei 2 × 10⁵ Zellen/μl suspendiert und in den rechten lateralen Ventrikel von Wistar-Ratten, wie beschrieben (Molnar et al., 1998), injiziert. Die Injektion wurde am postnatalen Tag 2 (P2) durchgeführt, und die Tiere wurden zur Analyse am Tag P8 getötet. Nach Perfusion unter Anästhesie wurden die Hirne zur aChAT-Immunhistochemie, wie beschrieben (Molnar et al., 1997 und 1998), verarbeitet. Der Gehalt an MNAC13-Antikörpern im cerebrospinalen Fluid (CSF) wurde durch einen ELISA-Test unter Verwendung löslicher TrkA-Rezeptoren als Festphasen-Antigene bestimmt.
Für die Immunchemie mit MNAC13 wurden die Tiere mit Ether unter Perfusion mit PB (0,1 M, pH 7,4), gefolgt von 4% Paraformaldehyd/PB bei 4°C für 2 Stunden betäubt. Nach der Präparierung wurden die Hirne in 4% Paraformaldehyd/PB bei 4°C für 2 Stunden fixiert, in 25% Sucrose/PBS überführt, dann in Isopentan bei –20°C gefroren und mit einem Cryostaten geschnitten. Die koronalen Schnitte, enthaltend das basale Vorderhirn, wurden auf gelatinisierten Objektträgern gesammelt und bei –20°C bis zur Verarbeitung gelagert. Nach der Blockierung nicht-spezifischer Bindungsstellen in einer Lösung von 10% FCS/5% BSA in Tris HCl 0,1 M pH 7,4, 0,05% Triton-100, wurden die Schnitte über Nacht bei 4°C mit Anti-TrkA (6 μg/ml) in 10% FCS/2% BSA in Tris HCl 0,1 M, pH 7,4, 0,05% Triton X-100 inkubiert. Während der nächsten Tage wurden die Schnitte mit biotinylierten Anti-Maus-IgG für 2 Stunden bei Raumtemperatur und für 1 Stunde im ABC-Kit (Vector) inkubiert. De Reaktion wurde in 3,3'-Diaminobenzidin-HCl entwickelt. Nach der Dehydratation wurden die Schnitte in DPX gegossen.
Klonierung der variablen Regionen des mAk MNAC13.
Die Klonierung der variablen Regionen des mAk MNAC13 wurde ausgehend von Hybridom-mRNA mittels PCR der variablen Region durchgeführt. Die PCR der variablen Regionen wurde mit einem Satz für Maus-Immunoglobuline spezifischer Oligonukleotid-Primer (Krebber et al., 1997) durchgeführt. Die amplifizierten variablen VH- und VK-Regionen wurden mittels PCT zu einem scFv-Format zusammengefügt und in einen pDNA-Vektor (Bradbury et al., 1996) kloniert. Nach einer Fingerabdruck-Analyse mit der Restriktions-Endonuklease BstNI, welche eine eingeschränkte Diversität der resultierenden scFVs bestätigte, wurden Phagen-Partikel, welche die scFV-Fragmente zeigten, einem ELISA unter Verwendung von TrkA-IgG als Festphasen-Antigen unterworfen. Der Test wurde mit sekundären HRP-gekoppelten Anti-M13-Antikörpern entwickelt. Als positiv identifizierte Phagen wurden weiter getestet und schließlich zur Herstellung löslicher scFV-Fragmente in E. coli verwendet. Bakterielle Überstände wurden mittels ELISA gegen TrkA-IgG unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers gegen den SV5-Marker (Hanke et al., 1992), der im scFV-Fragment vorliegt, gefolgt von HRP-konjugierten Anti-Maus-IgGs getestet.
ERGEBNISSE
Herstellung und Charakterisierung eines monoklonalen Antikörpers, der die Bindung von NGF an TrkA inhibiert
Um Antikörper herzustellen, die dazu befähigt sind, die Neutrophin-Bindungsaktivität des TrkA-Rezeptors zu stören, wurde ein kongenes Immunisierungsprotokoll verwendet. Es wurden durch Transfektion mit dem humanen Proto-Onkogen trk hergestellte Balb/C-3T3-Zellen, welche den humanen TrkA-Rezeptor expremieren, für die Immunisierung von Balb/C-Mäusen verwendet. Es wurde festgestellt, dass die Anzahl der Zellen für die Induktion von Serum-Antikörpern, welche die Bindung von NGF an Zielzellen neutralisieren, kritisch war.
Die Hybridom-Überstände wurden hinsichtlich ihrer Befähigung zur Inhibition der Bindung von ¹²⁵I an 3T3-TrkA+-Zellen getestet. Von 1266 Vertiefungen, in welchen ein Hybridom-Wachstum auftrat, zeigten nur 4 eine NGF-neutralisierende Aktivität. Die entsprechenden Zellen wurden subkloniert, wodurch die Klone MNAC13, C30, C191 und C232 erhalten wurden. Die Befähigung der von diesen Klonen hergestellten Antikörper zur Inhibierung der Bindung von NGF an 3T3-TrkA+-Zellen ist in 1 gezeigt. Diese Anti-TrkA-Antikörper inhibieren die Bindung von NGF ebenso effizient bzw. wirksam wie der neutralisierende Anti-NGF-αD11-Antikörper (1). Während der Letztere im aktiven Zentrum von NGF bindet, bindet der Erstere den TrkA-Rezeptor sehr wahrscheinlich an der oder nahe der NGF-erkennenden Stelle. Der IgG-MNAC13-Antikörper wurde für weitere Untersuchungen ausgewählt.
Die Inhibition der NGF-Bindung erfolgt durch eine direkte Wechselwirkung der Antikörper mit dem extrazellulären Anteil des TrkA-Rezeptors, was durch verschiedene Bindungsstudien mit einer löslichen Form des humanen TrkA-Rezeptors, der als Immunadhesin erzeugt wurde (Charmow und Ashkenazi, 1996), in welchem der extrazelluläre Anteil des Rezeptors mit den FC-Domänen der Kamel-Immunoglobuline (siehe Methoden) fusioniert ist, gezeigt wurde. Die 2 zeigt, dass der MNAC13-Antikörper das TrkA-Immunadhesin in einem ELISA-Test bindet, während er nicht mit dem TrkB-Immunadhesin reagiert. Dies bestätigt, dass der MNAC13-Antikörper spezifisch an den extrazellulären Teil von TrkA bindet.
Die 3 zeigt das Ergebnis einer FACS-Analyse mit 3T3-TrkA+-Zellen, welche zeigt, dass der MNAC13-Antikörper mit dem auf der Membran von lebenden Zellen expremierten humanen Rezeptor wechselwirkt. Eine Immunfluoreszenzanalyse bestätigt dieses Ergebnis.
Die Spezies-Spezifität von MNAC13-Antikörpern wurde anhand seiner Befähigung zur Erkennung von TrkA-Rezeptoren auf Rattenneuronen getestet. Schnitte von Rattenhirnen wurden der basalen Vorderhirnregion entnommen (4), welche reich an TrkA-positiven Neuronen ist. Die mit dem MNAC13-Antikörper erhaltene intensive Färbung im basalen Vorderhirn (4A) zeigt, dass dieser Antikörper, der gegen den humanen TrkA-Rezeptor erhalten wurde, auch dessen Entsprechung aus der Ratte erkennt. Der Antikörper färbt Hirnregionen, wie die medialen habenulären Nuclei nicht, von denen bekannt ist, dass sie keine TrkA-positiven Neuronen enthalten (Holtzman et al., 1995).
Funktionelle Blockierung der TrkA-gesteuerten biologischen Wirkungen durch den MNAC13-Antikörper
Die Befähigung des MNAC13-Antikörpers zur Inhibierung der biologischen Aktivierung des TrkA-Rezeptors durch den NGF-Liganden in vivo wurde daher in PC12-Zellen sowohl in vitro (5) als auch in vivo (6) untersucht.
Die von NGF induzierte Differenzierung von PC12-Zellen (5B) wird vollständig durch Inkubation der Kulturen mit dem MNAC13-Antikörper (5C), verglichen mit der Inkubation mit einem nicht-relevanten Antikörper (5D), inhibiert.
Die cholinergen Neuronen des basalen Vorderhirns sind ein wohl bekanntes Ziel der Wirkung von NGF im Zentralnervensystem (Korsching, 1986; Holtzman et al., 1992). Die den MNAC13 sekretierenden Hybridom-Zellen wurden in den lateralen Ventrikeln von neonatalen Ratten zwei Tage nach der Geburt implantiert, und der cholinerge Phänotyp der Neuronen wurde eine Woche später (P9) durch Immunhistochemie mit Antikörpern gegen die Cholinacetyltransferase (ChAT) untersucht. Diese experimentelle Vorgehensweise wurde kürzlich verwendet, um die Wirkungen von implantierten Zellen, die den anti-NGF-monoklonalen Antikörper αD11 sekretieren, zu untersuchen (Berardi et al., 1994; Molnar et al., 1997 und 1998). Eine Woche nach der Implantation wurde ein Spiegel der Anti-TrkA-Antikörper im cerebrospinalen Fluid, bestimmt durch ELISA, von 1,4 ng/μl festgestellt. Die Ergebnisse in 6 zeigen, dass die Anzahl ChAT-positiver Zellen in den Hirnen, in denen der Anti-TrkA-Antikörper implantiert wurde, im Vergleich zu den Kontrollen (bei denen ein nicht-relevantes Myelom injiziert wurde) drastisch vermindert ist. Eine quantitative Bestimmung der Anzahl positiver ChAT-Neuronen zeigte, dass diese Anzahl um 70 im medialen Septum und um 77% im diagnonalen Band von Ratten, in denen der MNAC13-Antikörper implantiert wurde, im Vergleich zu den Kontrollen vermindert war. Eine Ausweitung dieser Untersuchung auf verschiedene postnatale Alter, um sie mit den Wirkungen zu vergleichen, die in der vorhergehenden Untersuchung erhalten wurden, bei denen Zellen implantiert wurden, die einen anti-NGF-neutralisierenden Antikörper sekretieren (Molnar et al., 1997, 1998), zeigte, dass die Entzugwirkungen des cholinergen Systems des basalen Vorderhirns, die mit dem Anti-TrkA-MNAC13-Antikörper erhalten wurden, sehr viel stärker waren.
Isolierung einer rekombinanten funktionellen Form des mAk MNAC13 mit einer deutlich verminderten Größe
Um den Bereich der Anwendungen auszudehnen, wurden die variablen Regionen dieses Antikörpers kloniert und in einen rekombinanten Antikörper geringerer Größe eingebaut.
Die Klonierung der variablen Regionen monoklonaler Antikörper aus dem korrespondierenden Hybridom kann kompliziert sein, was zur Klonierung artifizieller variabler Regionen führen kann. Daher verwendete der Autor die Technik nach Winter et al. (1994). Die variablen schweren (VH) und leichten (VL) Regionen des MNAC13-Antikörpers wurden durch PCR, ausgehend von einer von Hybridom-mRNA abgeleiteten cDNA, unter Verwendung von Maus-IgG-spezifischen Oligonukleotid-Primern bzw. -Startern amplifiziert. Die variablen Regionen wurden durch PCR zu Einzelketten-Fv (scFv) zusammengesetzt und in den pDNA-Vektor kloniert, um die Expression von auf der Oberfläche von filamentösen Phagen klonierten Antikörper-Fragmenten zu erlauben. ScFv-Fragmente stellen ein biotechnologisches Derivat des originären Antikörpers dar (Bird et al., 1988) und bestehen aus den variablen Regionen der leichten und schweren Kette, verbunden mit einem Verknüpfungs-Peptid, welches den C-Terminus der VL-Region mit dem N-Terminus der VH-Region verbindet. Die Nukleotid-Sequenz des ScMNAC13-spezifischen Fragments ist in der SEQ ID Nr. 1 gezeigt. Die Aminosäuresequenz ist in der SEQ ID Nr. 2 gezeigt, in welcher die VL-Region von AA. 23 bis AA. 134, die VH-Region von AA. 152 bis AA. 276 reicht.
Es sind in jeder Kette drei CDRs (die Komplementarität des Antikörpers bestimmende Regionen) vorhanden und insbesondere:
VL CDR1 AA. 46–55 von SEQ ID Nr. 2;
VL CDR2 AA. 71–77 von SEQ ID Nr. 2;
VL CDR3 AA. 110–1119 von SEQ ID Nr. 2;
VH CDR1 AA. 176–185 von SEQ ID Nr. 2;
VH CDR2 AA. 200–216 von SEQ ID Nr. 2;
VH CDR3 AA. 249–262 von SEQ ID Nr. 2.
Die Sequenz der leichten und schweren variablen Regionen des Antikörpers MNAC13 wurde mit denjenigen des Antikörpers, der in der Patentanmeldung PCT Nr. WO97/21732 beschrieben ist, wie in den Tabellen 1 und 2 gezeigt, verglichen. Tabelle 1 Gegenüberstellung der schweren Ketten von 5C3 und MNAC13
Tabelle 2 Gegenüberstellung der schweren Ketten von 5C3 und MNAC13
Die mittels PCR zusammengesetzten ScFV-Fragmente wurden auf den filamentösen Phagen als Fusion mit dem Phagenprotein p3 expremiert. Eine Minibibliothek von Phagenpartikeln wurde mit Hilfe eines ELISA-Tests auf Phagen unter Verwendung des TrkA-Immunadhesins als Festphasen-Antigen durchmustert. Dies führte zur Isolierung von positiven Phagen, welche auf ihrer Oberfläche die ScFv-Version des parentalen MNAC13-Antikörpers expremieren (scFvMNAC13). Die Bindungseigenschaften dieses Phagen sowie diejenigen des von diesem Phagen abgeleiteten löslichen scFv-Fragments wurden mit Hilfe eines Kompetitions-ELISA-Tests (7) charakterisiert. Das TrkA-Immunadhesin wurde an die feste Phase gekoppelt und mit MNAC13-expremierenden Phagenpartikeln (7A), mit löslichem ScFvMNAC13-Antikörper (7B) oder mit dem parentalen MNAC13-Antikörper (7C) in Gegenwart ansteigender Mengen des konkurrierenden löslichen TrkA-Immunadhesins inkubiert. Die Ergebnisse bestätigen, dass die ScFv-Version des monoklonalen Antikörpers sowohl auf dem Phagen als auch von E. coli sekretiert TrkA genauso wirksam wie der parentale monoklonale Antikörper bindet.
Die biologische Aktivität von cFVMNAC13 wurde auf PC12-Zellen getestet. Die Zellen wurden für eine Woche mit 50 ng/ml NGF inkubiert, wonach sie in Gegenwart von NGF und dem ScFVMNAC13-Antikörper-Fragment wieder ausplattiert wurden. Wie in der 8 gezeigt, inhibiert das ScFVMNAC13-Fragment drastisch die Extension von Neuriten aus PC12-Zellen, was bestätigt, dass im rekombinanten Einzelketten-Fv des MNAC13-Antikörpers die neutralisierenden Eigenschaften des parentalen Antikörpers erhalten bleiben. Die kleine Größe dieses Einzelpolypeptid-Antikörpers erweitert den Bereich der Anwendungen des Antikörpers der Erfindung, erleichtert seine Abgabe und die Expression innerhalb des Nervengewebes.
Nocizeptionstest
Der Antikörper MNAC13 wurde in einem Nocizeptionstest mittels des „Tests mit heißer Platte” zur Bestimmung der Schmerzempfindlichkeit verwendet. Das Experiment wurde gemäß McMahon et al. (1995) unter Verwendung des Antikörpers MNAC13 als Immunadhesin durchgeführt. Der Antikörper wurde subkutan in die hintere Pfote einer adulten Ratte über eine Zeitspanne von drei Wochen oder über eine osmotische Minipumpe infundiert. Die Nocizeptions-Sensititivät wurde über Intervalle unter Verwendung des Test mit heißer Platte (Eddy und Leimbach, 1953) bestimmt, welcher die Hyperalgesie-Situationen nach Entzündung oder teilweiser Beschädigung des Nervs simuliert. Der nociceptive Stimulus induziert in solchem Fall eine Antwort bzw. Reaktion (Lecken der Pfote und/oder Hüpfen), was eine integrierte Koordination erfordert, die höherwertiger ist als ein simpler Reflex. Gemäß dem Test wird das Tier auf einen Stift mit einer auf die gewünschte Temperatur (gewöhnlicherweise auf 56°) erhitzten Platte als Basis gesetzt. Die Latenzzeit zwischen zwei Reaktionen (Lecken der Pfote und Hüpfen) wird in Kontrolltieren (mit nicht-relevantem Antikörper behandelt) und in denjenigen gemessen, die mit dem Anti-TrkA-Antikörper behandelt wurden. Das Ergebnis des Experiments demonstrierte das Auftreten einer bemerkenswerten Hypoalgesie, wie es durch einen deutlichen Anstieg der Latenzzeit in der mit MNAC13-behandelten Gruppe gezeigt wird.
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SEQUENCE LISTING

Claims

Monoklonaler Antikörper sowie synthetische und biotechnologische Derivate davon, der/die in der Lage sind, den hochaffinen Tyrosinkinase-Rezeptor von NGF (Nervenwachstumsfaktor) namens TrkA zu erkennen und zu binden und als Antagonist für die Bindung von NGF an TrkA zu agieren, wobei die variable Region der leichten Kette im Wesentlichen die Sequenz von Aminosäure 23 bis Aminosäure 134 von SEQ ID NR. 2 aufweist.
Monoklonaler Antikörper sowie synthetische und biotechnologische Derivate davon, der/die in der Lage ist/sind, den hochaffinen Tyrosinkiinase-Rezeptor von NGF (Nervenwachstumsfaktor) namens TrkA zu erkennen und zu binden und als Antagonist für die Bindung von NGF an TrkA zu agieren, wobei die variable Region der schweren Kette im Wesentlichen die Sequenz von Aminosäure 152 bis Aminosäure 276 von SEQ ID NR. 2 aufweist.
Monoklonaler Antikörper sowie synthetische und biotechnologische Derivate davon nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die variable Region der leichten Kette im Wesentlichen die Sequenz von Aminosäure 23 bis Aminosäure 134 von SEQ ID NR. 2 aufweist und die variable Region der schweren Kette im Wesentlichen die Sequenz von Aminosäure 152 bis Aminosäure 276 von SEQ ID NR. 2 aufweist.
ScFv-Fragment eines monoklonalen Antikörpers, das in der Lage ist, den hochaffinen Tyrosinkinase-Rezeptor von NGF (Nervenwachstumsfaktor) namens TrkA zu erkennen und zu binden und als Antagonist für die Bindung von NGF an TrkA zu agieren, wobei das ScFv-Fragment im Wesentlichen die Sequenz von SEQ ID NR. 2 aufweist.
Synthetisches oder biotechnologisches Derivat eines monoklonalen Antikörpers, das in der Lage ist, den hochaffinen Tyrosinkinase-Rezeptor von NGF (Nervenwachstumsfaktor) namens TrkA zu erkennen und zu binden und als Antagonist für die Bindung von NGF an TrkA zu agieren, das mindestens eine Region umfasst, welche die Komplementarität des Antikörpers (CDR) bestimmt und in der Lage ist, als Antagonist für die Bindung von NGF an TrkA zu agieren, wobei die Region, welche die Komplementarität des Antikörpers (CDR) bestimmt und welche in der Lage ist, als Antagonist für die Bindung von NGF an TrkA zu agieren, innerhalb der variablen Region der schweren Kette von Aminosäure 152 bis Aminosäure 276 von SEQ ID NR. 2 liegt.
Nukleinsäure, die für den Antikörper oder Derivate davon nach einem der vorhergehenden Ansprüche codiert.
Nukleinsäure nach Anspruch 6, die für das ScFv-Fragment von SEQ ID NR. 2 codiert.
Nukleinsäure nach Anspruch 7, die im Wesentlichen die Sequenz von SEQ ID NR. 1 aufweist.
Verwendung der Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 6–8 für die Erzeugung nicht-humaner transgener Tiere, vorzugsweise von Mäusen, wobei der Antikörper oder das Derivat davon gemäß den Ansprüchen 1–5 auf induzierbare Weise oder unter der Kontrolle von Promotoren, welche die Expression im erwachsenen Tier bestimmen, exprimiert wird.
Nicht-humanes transgenes Tier, das mit einer Nukleinsäure nach Anspruch 6–8 transformiert wird, wobei die Nukleinsäure auf induzierbare Weise oder unter der Kontrolle von Promotoren, welche die Expression im erwachsenen Tier bestimmen, exprimiert wird.
Phage oder prokaryotischer rekombinanter Vektor, der die Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 6–8 umfasst und in der Lage ist, diese korrekt und wirksam zu exprimieren.
Rekombinanter eukaryotischer Vektor, der die Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 6–8 umfasst und in der Lage ist, diese korrekt und wirksam zu exprimieren.
Pharmakologische Zusammensetzung, die eine effektive Menge des Vektors nach Anspruch 12 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst, für die Gentherapie neurologischer Pathologien aus der folgenden Gruppe: chronischer Schmerz, akuter Schmerz, Neurome, TrkA-exprimierende neoplastische Tumore.
Pharmakologische Zusammensetzung, die eine effektive Menge des monoklonalen Antikörpers oder synthetischer oder biotechnologischer Derivate davon nach einem der Ansprüche 1–5, der/die in der Lage ist/sind, den hochaffinen Tyrosinkinase-Rezeptor von NGF (Nervenwachstutnsfaktor) namens TrkA zu erkennen und zu binden und als Antagonist der Bindung von NDF an TrkA zu agieren, sowie einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
Pharmakologische Zusammensetzung nach Anspruch 14 für die Behandlung neurologischer Pathologien aus der folgenden Gruppe: chronischer Schmerz, akuter Schmerz, Neurome, TrkA-exprimierende neoplastische Tumore.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die pharmazeutisch aktive Mengen von NGF und des Antikörpers oder der Derivate davon nach einem der Ansprüche 1–5 umfasst.
Eukaryotische manipulierte Zellen, die in der Lage sind, den Antikörper oder Derivate davon nach einem der Ansprüche 1–5 zu exprimieren.
Pharmakologische Zusammensetzung, die Zellen nach Anspruch 17 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst, zur Gentherapie neurologischer Pathologien aus der folgenden Gruppe: chronischer Schmerz, akuter Schmerz, Neurome, TrkA-exprimierende neoplastische Tumore.
Zusammensetzung, die eine effektive Menge des monoklonalen Antikörpers oder synthetischer oder biotechnologischer Derivate davon nach einem der Ansprüche 1–5, der/die in der Lage ist/sind, den hochaffinen Tyrosinkinase-Rezeptor von NGF (Nervenwachstumsfaktor) namens TrkA zu erkennen und zu binden und als Antagonist für die Bindung von NGF an TrkA zu agieren, sowie einen diagnostisch verträglichen Träger zur Verwendung in der „bildgebenden” In-vivo-Diagnostik umfasst.
Monoklonaler Antikörper sowie synthetische und biotechnologische Derivate davon, der/die in der Lage ist/sind, den hochaffinen Tyrosinkinase-Rezeptor von NGF (Nervenwachstumsfaktor) namens TrkA zu erkennen und zu binden und als Antagonist für die Bindung von NGF an TrkA zu agieren, und der/die die funktionale Aktivierung von TrkA durch NGF verhindert/verhindern, und gekennzeichnet durch mindestens eine CDR ausgewählt aus: CDRs der leichten Kette definiert durch Aminosäure 46–55 von SEQ ID NR. 2, Aminosäure 71–77 von SEQ ID NR. 2 und Aminosäure 110–119 von SEQ ID NR. 2 und CDRs der schweren Kette definiert durch Aminosäure 176–185 von SEQ ID NR. 2, Aminosäure 200–216 von SEQ ID NR. 2 und Aminosäure 249–262 von SEQ ID NR. 2.
ScFv-Fragment des monoklonalen Antikörpers nach Anspruch 20, das mindestens eine variable Region der leichten Kette oder der schweren Kette des Antikörpers wie in Anspruch 20 beschrieben umfasst.
ScFv-Fragment nach Anspruch 21, das die variable Region der leichten Kette und der schweren Kette des Antikörpers wie in Anspruch 20 beschrieben umfasst.
ScFv-Fragment nach Anspruch 22, das eine Linker-Sequenz zwischen der variablen Region der leichten Kette und der variablen Region der schweren Kette umfasst.
Synthetisches oder biotechnologisches Derivat nach Anspruch 20, das mindestens eine Region, welche die Komplementarität des Antikörpers (CDR) bestimmt, umfasst, und das in der Lage ist, als Antagonist für die Bindung von NGF als TrkA zu agieren.
Nukleinsäure, die für den Antikörper oder Derivate davon nach einem der Ansprüche 20–24 codiert.
Verwendung der Nukleinsäure nach Anspruch 25 für die Erzeugung nicht-humaner transgener Tiere, vorzugsweise von Mäusen, wobei der Antikörper oder das Derivat davon nach den Ansprüchen 20–24 auf induzierbare Weise oder unter der Kontrolle von Promotoren, welche die Expression beim erwachsenen Tier bestimmen, exprimiert wird.
Nicht-humanes transgenes Tier, das mit einer Nukleinsäure nach Anspruch 25 transformiert wird, wobei die Nukleinsäure auf induzierbare Weise oder unter der Kontrolle von Promotoren, welche die Expression beim erwachsenen Tier bestimmen, exprimiert wird.
Phage oder prokaryotischer rekombinanter Vektor, der die Nukleinsäure nach Anspruch 25 umfasst und in der Lage ist, diese korrekt und effektiv zu exprimieren.
Rekombinanter eukaryotischer Vektor, der die Nukleinsäure nach Anspruch 25 umfasst und in der Lage ist, diese korrekt und effektiv zu exprimieren.
Pharmakologische Zusammensetzung, die eine effektive Menge des Vektors nach Anspruch 29 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfassst, für die Gentherapie neurologischer Pathologien aus der folgenden Gruppe: chronischer Schmerz, akuter Schmerz, Neurome, TrkA-exprimierende neoplastische Tumore.
Pharmakologische Zusammensetzung, die eine effektive Menge des monoklonalen Antikörpers oder synthetischer oder biotechnologischer Derivate davon nach einem der Ansprüche 20–24, der/die in der Lage ist/sind, den hochaffinen Tyrosinkinase-Rezeptor von NGF (Nervenwachstumsfaktor) namens TrkA zu erkennen und zu binden und als Antagonist für die Bindung von NGF an TrkA zu agieren, sowie einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
Pharmakologische Zusammensetzung nach Anspruch 31 für die Behandlung neurologischer Pathologien aus der folgenden Gruppe: chronischer Schmerz, akuter Schmerz, Neurome, TrkA-exprimierende neoplastische Tumore.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die pharmazeutisch aktive Mengen von NGF und des Antikörpers oder der Derivate davon nach einem der Ansprüche 20–24 umfasst.
Eukaryotische manipulierte Zellen, die in der Lage sind, den Antikörper oder Derivate davon nach einem der Ansprüche 20–24 zu exprimieren.
Pharmakologische Zusammensetzung, die Zellen nach Anspruch 34 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst, zur Gentherapie neurologischer Pathologien aus der folgenden Gruppe: chronischer Schmerz, akuter Schmerz, Neurome, TrkA-exprimierende neoplastische Tumore.
Zusammensetzung, die eine effektive Menge des monoklonalen Antikörpers oder synthetischer oder biotechnologischer Derivate davon nach einem der Ansprüche 20–24, der/die in der Lage ist/sind, den hochaffinen Tyrosinkinase-Rezeptor von NGF (Nervenwachstumsfaktor) namens TrkA zu erkennen und zu binden und als Antagonist für die Bindung von NGF an TrkA zu agieren, sowie einen diagnostisch verträglichen Träger zur Verwendung in der ”bildgebenden” In-vivo-Diagnostik umfasst.
Verwendung eines monoklonalen Antikörpers sowie synthetischer und biotechnologischer Derivate davon, der/die in der Lage ist/sind, den hochaffinen Tyrosinkinase-Rezeptor von NGF (Nervenwachstumsfaktor) namens TrkA zu erkennen und zu binden und als Antagonist für die Bindung vn NGF an TrkA zu agieren, und der/die die funktionale Aktivierung von TrkA durch NGF verhindert/verhindern, in der Herstellung einer pharmakologischen Zusammensetzung zur Behandlung neurologischer Pathologien aus der folgenden Gruppe: chronischer Schmerz und akuter Schmerz.