DE69631335T2

DE69631335T2 - Antagonisten der onkogenen aktivität von mdm2, und ihre verwendung in der krebsbehandlung

Info

Publication number: DE69631335T2
Application number: DE69631335T
Authority: DE
Inventors: Bruno Tocque; Marie-Christine Dubs-Poterszman; Bohdan Wasylyk
Original assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Aventis Pharma SA
Current assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Aventis Pharma SA
Priority date: 1995-09-04
Filing date: 1996-09-02
Publication date: 2004-12-02
Anticipated expiration: 2016-09-03
Also published as: ES2210386T3; PT848720E; FR2738151A1; NO319160B1; US20030060432A1; SK28098A3; US20040209834A1; EP0848720B1; BR9610386A; NO980905D0; WO1997009343A2; CZ63098A3; AU6933496A; HU223597B1; SK287127B6; CA2228667C; CA2228667A1; AU722782B2; WO1997009343A3; JPH11511980A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Methode zur Behandlung der hyperproliferativen Erkrankungen (Krebserkrankungen, Restenosen usw...) sowie die entsprechenden pharmazeutischen Zusammensetzungen.
Es ist heutzutage gut nachgewiesen, dass eine große Mehrheit der Krebserkrankungen wenigstens teilweise durch genetische Anomalien verursacht wird, die sich entweder durch die Überexpression eines oder mehrerer Gene und/oder die Expression eines oder mehrerer mutierter oder anormaler Gene äußern. Beispielsweise erzeugt die Expression von Onkogenen in den meisten Fällen einen Krebs. Unter Onkogen versteht man ein Gen, das genetisch verändert ist und dessen Expressionsprodukt das normale biologische Funktionieren der Zellen stört und so einen neoplastischen Zustand hervorruft. Eine große Anzahl Onkogene wurde bis heute identifiziert und teilweise charakterisiert, wie insbesondere die Gene ras, myc, fos, erb, neu, raf, src, fms, jun und abl, deren mutierte Formen für eine Störung der Zellproliferation verantwortlich zu sein scheinen.
In einem normalen Zellkontext wird der Proliferation dieser Onkogene sehr wahrscheinlich wenigstens teilweise durch die Erzeugung von Tumorsuppressoren genannten Genen, wie p53 und Rb, entgegnet. Jedoch können bestimmte Phänomene diesen Mechanismus zellulärer Selbstregulation stören und dann die Entwicklung eines neoplastischen Zustands fördern. Eines dieser Ereignisse besteht in Mutationen an den Tumorsuppressorgenen. So ist die durch Deletion und/oder Mutation mutierte Form des Gens p53 in die Entwicklung der meisten menschlichen Krebserkrankungen einbezogen (Baker et coll., Science 244 (1989) 217) und inaktivierte Formen des Gens Rb sind bei verschiedenen Tumoren und insbesondere bei den Retinoblastomen oder bei den mesenchymalen Krebserkrankungen sowie den Osteosarkomen, beteiligt.
Das Protein p53 ist ein Zellkernphosphoprotein mit 53 kD, das in den meisten normalen Geweben exprimiert wird. Es ist beteiligt bei der Kontrolle des Zellzyklusses (Mercer et al. Critic. Rev. Eucar. Gene Express, 2, 251, 1992), der transkriptionellen Regulation (Fields et al., Sciences (1990) 249, 1046), der DNA Replikation (Wilcoq and Lane, (1991), Nature 349, 4290 und Bargonnetti et al., (1992) Cell 65 1083) und der Induktion der Apoptose (Shaw et al., (1992) P. N. A. S. USA 89, 4495). So löst jede Exposition von Zellen mit Mitteln, die beispiels weise deren DNA beschädigen können, eine zelluläre Signalkaskade aus, die zu einer posttranskriptionellen Modifikation des Proteins p53 und zur transkriptionellen Aktivierung einer bestimmten Anzahl Gene, wie gadd45 (growth arrest and DNA damage) (Kastan et coll. Cell, 71, 587–597, 1992), p21 WAF/CIP (EIDeiry et coll, Cancer Res., 54, 1169–1174, 1994) oder auch noch mdm2 (mouse double minute) (Barak et coll., EMBO J., 12, 461–468, 1993), durch p53 führt.
Aus dem Vorhergehenden geht klar hervor, dass die Aufklärung der verschiedenen biologischen Funktionen der Gesamtheit der insbesondere bei diesem zellulären Signalweg beteiligten Proteine, ihrer Funktionsarten und ihrer Merkmale von übergeordneter Bedeutung für das Verständnis der Krebsentstehung und der Entwicklung von wirksamen therapeutischen Methoden, die gegen den Krebs gerichtet sind, ist.
Die vorliegende Erfindung steht genau in diesem Zusammenhang, indem sie eine neue Funktion des Proteins Mdm2 anführt.
Das Protein Mdm2 ist ein Phosphoprotein mit einem Molekulargewicht von 90 kD, exprimiert aus dem Gen mdm-2 (murine double minute 2). Dieses Gen mdm2 wurde ursprünglich in einer spontanen Tumorzelle BALB/c 3T3 kloniert und es wurde festgestellt, dass seine Überexpression das Tumorpotential stark steigert (Cahilly-Snyder et coll. Somat. Cell. Mol. Genet., 13, 235–244, 1987; Fakharzadeh et coll, EMBO J. 10, 1565–1569, 1991). Ein Komplex Mdm2/p53 wurde in mehreren Zelllinien, die sowohl ein Wildtyp p53 als auch mutierte p53-Proteine enthielten, identifiziert (Martinez et coll., Genes Dev., 5, 151–159, 1991). Außerdem wurde gezeigt, dass Mdm2 die transkriptionelle Aktivität von p53 auf einen Promotor wie den der Muskel-Kreatinkinase inhibiert, was anzeigt, dass Mdm2 die Aktivität von p53 regulieren kann (Momand et coll., Cell, 69, 1237–1245, 1992; Oliner et coll. Nature, 362, 857–860, 1993). Die Schrift WO93/20238 beschreibt einen diagnostischen Test, der auf der Überexpression des Gens mdm2 basiert. Diese Schrift beschreibt auch das Prinzip der Verwendung von Verbindungen, die in die Bindung Mdm-2/p53 eingreifen können, um die Sequestrierung von p53 durch Mdm-2 zu verhüten.
Angesichts der Gesamtheit dieser Ergebnisse ist das Protein Mdm2 folglich heute im Wesentlichen als ein Modulator der Aktivitäten von p53 anerkannt. Indem es die Wildtyp- oder die mutierten p53-Proteine komplexiert, inhibiert es ihre transkriptionelle Aktivität und trägt auf diese Weise zur Deregulierung der Zellproliferation bei. Folglich besteht die Nutzung dieser Informationen auf einer therapeutischen Ebene hauptsächlich darin, Mittel zu suchen, um sich diesem Blockieren des Proteins p53 durch Mdm2 entgegenzustellen.
Unerwarteterweise hat der Anmelder gezeigt, dass dieses Protein Mdm2 einen eigenen onkogenen Charakter besitzt, das heißt, der völlig unterschiedlich zu demjenigen ist, der mit seiner mit dem Protein p53 komplexierten Form verbunden ist. Genauer entwickelt das Protein Mdm2 onkogene Eigenschaften ohne p53-Kontext. Um diese Entdeckung, nämlich dass die onkogenen Eigenschaften von Mdm-2 unabhängig von p53 sind und sich insbesondere nicht aus der Inhibierung der transaktivierenden Aktivität von Wildtyp p53 ergeben, zu stützen, haben wir gezeigt, dass eine Mutante von p53 (p53 (14–19); Lin et al., Genes Dev., 1994, 8, 1235–1246), die ihre transaktivierenden Eigenschaften behalten hat, die aber nicht mehr mit Mdm-2 interagiert, die onkogenen Eigenschaften von Mdm-2 nicht blockieren kann. Es wird ebenfalls gezeigt, dass Mdm-2 und insbesondere die Domäne 1–134 von Mdm-2 ein Anhalten des Zellzyklusses in G1, das durch die Überexpression von p107 ausgelöst wird, aufheben kann. Mdm-2 erweist sich also als ein wichtiger Regulator von Faktoren, die bei der Kontrolle des Zellzyklusses beteiligt und von p53 verschieden sind.
Die vorliegende Erfindung ergibt sich teilweise daraus, aufzuzeigen, dass die Proteinsequenz 1–134 der in SEQ ID NO: 1 identifizierten Sequenz des Proteins Mdm2 ausreichend ist, um das onkogene Potential besagten Proteins zum Ausdruck zu bringen.
Sie ergibt sich auch daraus, aufzuzeigen, dass es möglich ist, diesen onkogenen Charakter des Proteins Mdm2 zu beeinflussen, indem man Verbindungen verwendet, die mit ihm interagieren können. Die vorliegende Erfindung beschreibt auch besonders wirksame Systeme, die es ermöglichen, in vivo, direkt in den Tumoren, solche Verbindungen freizusetzen und so die Entwicklung der Krebs erkrankungen zu bekämpfen. Die vorliegende Erfindung bietet so einen neuen, besonders wirksamen Ansatz für die Behandlung der Tumoren insbesondere ohne p53-Kontext, wie die folgenden Krebserkrankungen: die Adenokarzinome des Dickdarms, die Schilddrüsenkrebserkrankungen, die Lungenkarzinome, die myeloischen Leukämien, die Kolorektalkrebserkrankungen, die Brustkrebserkrankungen, die Lungenkrebserkrankungen, die Magenkrebserkrankungen, die Speiseröhrenkrebserkrankungen, die B-Lymphome, die Eierstockkrebserkrankungen, die Blasenkrebserkrankungen, die Glioblastome usw....
Ein erster Gegenstand der Erfindung liegt folglich in der Verwendung einer Verbindung, die wenigstens teilweise die onkogene Aktivität des Proteins Mdm2 antagonisieren kann, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die für die Behandlung der Krebserkrankungen ohne p53-Kontext bestimmt ist.
Im Sinne der Erfindung versteht man unter Krebs ohne p53-Kontext einen Krebs, bei dem p53 durch jede Modifikation oder jeden Mechanismus, der von der Fixierung von Mdm-2 an p53 verschieden ist, seine Funktionen als Tumorsuppressorgen nicht ausüben könnte, wobei diese Fixierung p53 daran hindert, seine Rolle als Tumorsuppressor zu spielen, und den Zellen ermöglicht, sich einem durch p53 regulierten Wachstum zu entziehen. Man kann nicht erschöpfend unter diesen Modifikationen oder Mechanismen, die die tumorsuppressive Aktivität von p53 blockieren, beispielsweise genetische Veränderungen des Gens p53 (punktuelle Mutationen, Deletionen usw.), die Interaktion mit anderen Proteinen als Mdm-2, den sehr schnellen proteolytischen Abbau des Proteins p53, der gebunden ist an die Gegenwart des Proteins E6 der menschlichen Hochrisiko-Papillomviren, wie HPV-16 und HPV-18 usw. anführen.
Im Sinne der Erfindung kann die Inhibierung der onkogenen Aktivität des Proteins Mdm2 nach zwei Verfahren erzielt werden.
Sie wird vorzugsweise erreicht, indem man direkt im Bereich von dessen Domäne 1–134 eingreift. So hat jedes Protein, das sich an diese Domäne binden kann, eine antagonistische Rolle auf die onkogenen Eigenschaften von Mdm2.
Jedoch kann dieser inhibierende Effekt auch über die Interaktion einer Verbindung mit einer benachbarten Domäne erreicht werden, wie beispielsweise die Domäne 135–491 von mdm2, dargestellt in der Sequenz SEQ ID NO: 1, oder seiner C-terminalen Sequenz, dargestellt in der Sequenz SEQ ID NO: 1. Folglich betrifft die vorliegende Erfindung außerdem die Verwendung jeglicher Verbindung, die, obwohl sie nicht direkt mit dieser Domäne interagiert, dennoch deren onkogenen Charakter beeinflussen kann.
Gemäß einer besonderen Form betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung einer Verbindung, die sich im Bereich der Domäne 1–134 der in SEQ ID NO: 1 des Proteins Mdm2 dargestellten Sequenz binden kann, um eine pharmazeutische Zusammensetzung herzustellen, die für die Behandlung der Krebserkrankungen ohne p53-Kontext bestimmt ist.
Als Verbindung, die direkt im Bereich der Domäne 1–134 des Proteins Mdm2 interagieren kann, kann man spezieller die scFV anführen, die spezifisch gegen diese Domäne gerichtet sind.
Die ScFv sind Moleküle mit Bindungseigenschaften, die mit denen eines Antikörpers vergleichbar sind und die intrazellulär aktiv sind. Es handelt sich spezieller um Moleküle, die aus einem Peptid bestehen, das der Bindungsstelle der variablen Region der leichten Kette eines Antikörpers entspricht, durch einen Peptidlinker an ein Peptid gebunden, das der Bindungsstelle der variablen Region der schweren Kette eines Antikörpers entspricht. Es wurde vom Anmelder gezeigt, dass solche ScFv in vivo durch Gentransfer erzeugt werden konnten (vgl. Anmeldung WO 94/29446).
Es kann sich auch um Peptide oder um Proteine handeln, die bereits dafür bekannt sind, sich spezifisch mit der Domäne 1–134 von Mdm2 binden zu können, wie beispielsweise ganz oder teilweise die Bindungsdomäne des Proteins p53 mit der SEQ ID NO: 1 und spezieller ganz oder teilweise eines der Peptide 1–52, 1–41 und 6–41 der Sequenz von p53, dargestellt in SEQ ID NO: 2, (Oliner et al., Nature, 1993, 362, 857–860) oder einfacher ganz oder teilweise das Peptid 16–25, das genauer kartographiert ist, (Lane et al., Phil. Trans. R. Soc. London B., 1995, 347, 83–87) oder auch die Peptide 18–23 des menschlichen oder des murinen p53 oder auch abgeleitete Peptide, die denjenigen nahe sind, die zuvor angeführt wurden, in denen die für die Interaktion mit Mdm-2 entscheidenden Reste erhalten geblieben sind (Picksley et al., Oncogene, 1994, 9, 2523–2529).
Erfindungsgemäß können auch Verbindungen, die in der Lage sind, sich an Domänen, die der Domäne 1–134 von Mdm2, dargestellt in SEQ ID NO: 1, benachbart sind, zu binden, und die durch diese Bindung die onkogene Aktivität des Proteins Mdm2 beeinflussen, verwendet werden. Dazu kann man diejenigen anführen, die im Bereich der C-terminalen Domäne besagten Proteins interagieren, wie beispielsweise die Transkriptionsfaktoren TFII, TBP und TaF250, sowie die Proteine, die im Bereich der Domäne 135–491 von Mdm2, dargestellt in SEQ ID NO: 1, interagieren, wie beispielsweise die Proteine L5 (ribosomales Protein) und Rb (Retinoblastomprotein) und der Transkriptionsfaktor E2F (reguliert von Rb).
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft auch die Verwendung von scFV, die spezifisch gegen diese Domäne 1–134 der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz des Proteins Mdm2 gerichtet sind, um eine pharmazeutische Zusammensetzung herzustellen, die für die Behandlung der Krebserkrankungen bestimmt ist.
Im Sinne der Erfindung versteht es sich, dass die Gesamtheit der oben angeführten Interaktionen den onkogenen Charakter von Mdm2 konsequent beeinflussen. Außerdem können diese Proteine ganz oder teilweise verwendet werden, sofern ihr gegenüber einer der Domänen der Bindung mit dem Protein Mdm2 aktiver Teil verwendet wird und diese Interaktion zu einer Beeinflussung von dessen onkogenem Charakter führt.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung können diese Verbindungen so, wie sie sind, oder vorteilhafterweise in Form von Genkonstruktionen, die ihre in vivo-Expression ermöglichen, verwendet werden.
Eine besonders vorteilhafte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine Nukleinsequenz zu verwenden, die für eine Verbindung kodiert, die wenigstens teilweise die onkogene Aktivität des Proteins Mdm2 antagonisieren kann, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die für die Behandlung der Krebserkrankungen ohne p53-Kontext bestimmt ist.
Unter diesem Gesichtspunkt können die im Rahmen der Erfindung verwendeten Nukleinsäuren verschiedenen Typs sein. Es handelt sich bevorzugt um:

– Antisense-Nukleinsäuren,
– Oligoribonukleotide, die direkt eine der Domänen des Proteins Mdm2 fixieren und seine onkogene Aktivität inhibieren können (Oligonukleotidligand),
– Nukleinsäuren, die ganz oder teilweise für Peptide oder Proteine kodieren, die sich mit einer der Domänen von Mdm2 oligomerisieren und seine onkogene Aktivität inhibieren können,
– Nukleinsäuren, die für intrazelluläre Antikörper kodieren (beispielsweise variable Fragmente mit einzelner Kette, hervorgegangen aus einem Antikörper), die gegen die Domäne 1–134 der Sequenz SEQ ID NO: 1 des Proteins Mdm2 gerichtet sind.

Gemäß einer besonderen Form der vorliegenden Erfindung ist die Nukleinsäure eine Antisense-Nukleinsäure. Diese Antisense ist eine DNA, die für eine komplementäre RNA der Nukleinsäure, die für das Protein Mdm2 kodiert und seine Transkription und/oder seine Translation (Antisense-RNA) blockieren kann, oder ein Ribozym kodiert.
Kürzlich wurde ein neuer Typ von Nukleinsäuren aufgezeigt, die die Expression von Zielgenen regulieren können. Diese Nukleinsäuren hybridisieren nicht mit den zellulären mRNA, sondern direkt mit der Genom-DNA im Doppelstrang. Dieser neue Ansatz beruht darauf, zu zeigen, dass bestimmte Nukleinsäuren spezifisch in der großen Furche der DNA-Doppelhelix interagieren können, um lokal Tripelhelices zu bilden, die zu einer Inhibierung der Transkription von Zielgenen führen. Diese Nukleinsäuren erkennen selektiv die DNA-Doppelhelix im Bereich von Oligopurin-Oligopyrimidin-Sequenzen, das heißt im Bereich von Regionen, die eine Oligopurinsequenz auf einem Strang und eine Oligopyrimidinsequenz auf dem Komplementärstrang besitzen, und bilden dort lokal eine Tripelhelix Die Basen des dritten Strangs (das Oligonukleotid) bilden Wasserstoffbindungen (Hoogsteen- oder reversed Hoogsteen-Bindungen) mit den Purinen der Watson-Crick-Basenpaare. Solche Nukleinsäuren wurden insbesondere von Pr. Hélène in Anti-Cancer drug design 6 (1991) 569 beschrieben.
Die Antisense-Nukleinsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung können DNA-Sequenzen sein, die für Antisense-RNA oder für Ribozyme kodieren. Die so erzeugten Antisense-RNA können mit einer mRNA oder einer Zielgenom-DNA interagieren und mit dieser Doppel- oder Tripelhelices bilden. Es kann sich auch um Antisense-Sequenzen (Oligonukleotide), gegebenenfalls chemisch modifiziert, handeln, die direkt mit dem Zielgen oder der Ziel-RNA interagieren können.
Immer noch gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Nukleinsäure ein Antisense-Oligonukleotid, wie zuvor definiert, gegebenenfalls chemisch modifiziert. Es kann sich insbesondere um Oligonukleotide handeln, deren Phosphodiester-Gerüst chemisch modifiziert wurde, wie beispielsweise die Phosphonat-, Phosphotriester-, Phosphoramidat- und Phosphorothioat-Oligonukleotide, die beispielsweise in der Patentanmeldung WO94/08003 beschrieben sind. Es kann sich auch um alpha-Oligonukleotide oder um Oligonukleotide, die mit Mitteln wie acrylierenden Verbindungen verbunden sind, handeln.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung versteht man unter Oligonukleotidligand ein Oligoribonukleotid oder ein Oligodeoxyribonukleotid, das sich spezifisch an das Protein Mdm-2 fixieren kann, um seine onkogene Funktion zu inhibieren. Solche Nukleotide können beispielsweise durch Techniken der "in vitro-Evolution" aufgezeigt werden, wie beispielsweise die SELEX-Technik (Edgington, Bio/technology, 1992, 10, 137–140; Patente US 5,270,163 und WO 91/19813).
Allgemeiner können diese Nukleinsäuren menschlichen, tierischen, pflanzlichen, bakteriellen, viralen, synthetischen usw. Ursprungs sein. Sie können durch jede dem Fachmann bekannte Technik erhalten werden und insbesondere durch Genbanken-Screening, durch chemische Synthese oder auch durch gemischte Verfahren, die die chemische oder enzymatische Modifikation von Sequenzen, die durch Genbanken-Screening erhalten wurden, einschließen.
Wie weiter unten angegeben, können sie außerdem in Vektoren eingebaut sein, wie Plasmidvektoren, virale oder chemische Vektoren. Sie können auch so, wie sie sind, verabreicht werden, in Form von nackter DNA gemäß der in der Anmeldung WO 90/11092 beschriebenen Technik oder in komplexierter Form, beispielsweise mit DEAE-Dextran (Pagano et al., J. Viral. 1 (1967) 891), mit Zellkernproteinen (Kaneda et al., Science 243 (1989) 375), mit Lipiden oder kationischen Polymeren (Felgner et al., PNAS 84 (1987) 7413), in Form von Liposomen (Fraley et al., J. Biol. Chem. 255 (1980) 10431) usw.
Bevorzugt ist die im Rahmen der Erfindung verwendete Sequenz Teil eines Vektors. Die Verwendung eines solchen Vektors ermöglicht es nämlich, die Verabreichung der Nukleinsäure in den zu behandelnden Zellen zu verbessern und auch ihre Stabilität in besagten Zellen zu erhöhen, was es ermöglicht, eine dauerhafte therapeutische Wirkung zu erzielen. Zudem ist es möglich, mehrere Nukleinsäuresequenzen in dem gleichen Vektor einzuführen, was ebenfalls die Wirksamkeit der Behandlung erhöht.
Der verwendete Vektor kann verschiedenen Ursprungs sein, sofern er die tierischen Zellen, vorzugsweise die menschlichen Krebszellen transformieren kann. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung verwendet man einen viralen Vektor, der unter den Adenoviren, den Retroviren oder den adeno-assoziierten Viren (AAV) oder dem Herpesvirus ausgewählt sein kann.
Diesbezüglich hat die vorliegende Erfindung auch jeden viralen Vektor zum Gegenstand, der, insertiert in sein Genom, eine Nukleinsäure umfasst, die für eine Verbindung kodiert, die wenigstens teilweise den onkogenen Charakter des Proteins Mdm2 antagonisieren kann.
Spezieller betrifft sie jedes rekombinante Virus, das eine Nukleinsäurensequenz umfasst, die für eine Verbindung kodiert, die sich an das Protein Mdm2 binden kann, um sein onkogenes Potential zu beeinflussen. In diesem Zusammenhang kann die Nukleinsäurensequenz für eines der Peptide, Proteine oder Transkriptionsfaktoren, die zuvor identifiziert wurden, kodieren.
Stärker bevorzugt kodiert diese Nukleinsäurensequenz für ein scFv oder ein Peptid, das im Bereich der Domäne 1–134 (SEQ ID NO: 1) des Proteins Mdm2 interagieren kann.
Vorteilhafterweise sind die im Rahmen der Erfindung verwendeten Viren vorzugsweise defektiv, das heißt sie können sich in der infizierten Zelle nicht autonom replizieren. Allgemein ist das Genom der im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendeten defektiven Viren folglich wenigstens frei von den Sequenzen, die für die Replikation besagten Virus in der infizierten Zelle notwendig sind. Diese Regionen können entweder (ganz oder teilweise) eliminiert oder nicht funktionell gemacht oder durch andere Sequenzen und insbesondere durch die Sequenz substituiert sein, die für die Verbindung, die eine antagonistische Rolle auf die onkogenen Eigenschaften des Proteins Mdm2 besitzt, kodiert. Bevorzugt behält das defektive Virus gleichwohl die Sequenzen seines Genoms, die für die Verpackung der Viruspartikel notwendig sind.
Spezieller bei Adenoviren wurden verschiedene Serotypen, deren Struktur und Eigenschaften ein wenig variieren, charakterisiert. Unter diesen Serotypen verwendet man bevorzugt im Rahmen der vorliegenden Erfindung die menschlichen Adenoviren vom Typ 2 oder 5 (Ad 2 oder Ad 5) oder die Adenoviren tierischen Ursprungs (siehe Anmeldung FR 93 05954). Unter den Adenoviren tierischen Ursprungs, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, kann man die Adenoviren caninen, bovinen, murinen (Beispiel: Mav1, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovinen, porkinen, aviären oder auch simianen (Beispiel: SAV) Ursprungs anführen. Bevorzugt ist das Adenovirus tierischen Ursprungs ein canines Adenovirus, stärker bevorzugt ein Adenovirus CAV2 [Stamm manhattan oder A26/61 (ATCC VR-800) beispielsweise]. Vorzugsweise verwendet man im Rahmen der Erfindung Adenoviren menschlichen oder caninen Ursprungs oder gemischten Ursprungs.
Bevorzugt umfassen die defektiven Adenoviren der Erfindung die ITR, eine Sequenz, die die Verpackung ermöglicht, und die Sequenz, die für den Modulator der Calpaine kodiert. Noch stärker bevorzugt sind in dem Genom der Adenoviren der Erfindung das Gen E1 und wenigstens eines der Gene E2, E4, L1–L5 nicht funktionell. Das betrachtete virale Gen kann durch jede dem Fachmann bekannte Technik nicht funktionell gemacht werden und insbesondere durch vollständige Suppression, Substitution, partielle Deletion oder Addition einer oder mehrerer Basen in das oder die betrachteten Gene. Solche Modifikationen können in vitro (an der isolierten DNA) oder in situ, beispielsweise mittels der Verfahren der Gentechnik, oder auch durch Behandlung mittels mutagener Mittel erzielt werden.
Die erfindungsgemäßen defektiven rekombinanten Adenoviren können durch jede dem Fachmann bekannte Technik hergestellt werden (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573 ; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). Insbesondere können sie durch homologe Rekombination zwischen einem Adenovirus und einem Plasmid, das unter anderem die DNA-Sequenz trägt, die für den Inhibitor der ETS kodiert, hergestellt werden. Die homologe Rekombination geschieht nach Cotransfektion besagten Adenovirus und besagten Plasmids in einer geeigneten Zelllinie. Die verwendete Zelllinie muss vorzugsweise (i) durch besagte Elemente transformierbar sein und (ii) die Sequenzen umfassen, die den Teil des Genoms des defektiven Adenovirus komplementieren können, vorzugsweise in integrierter Form, um die Rekombinationsgefahren zu vermeiden. Als Beispiel für eine Linie kann man die humane Embryo-Nierenlinie 293 erwähnen (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59), die insbesondere, integriert in ihrem Genom, den linken Teil des Genoms eines Adenovirus Ad5 (12%) enthält. Strategien zur Konstruktion von Vektoren, die von den Adenoviren abgeleitet sind, wurden auch in den Anmeldungen Nr. FR 93 05954 und FR 93 08596 beschrieben.
Dann werden die Adenoviren, die sich vermehrt haben, gewonnen und gereinigt gemäß den herkömmlichen molekularbiologischen Verfahren, wie in den Beispielen veranschaulicht.
Bei den adeno-assoziierten Viren (AAV) handelt es sich um Viren mit einer DNA mit relativ geringer Größe, die sich in das Genom der Zellen, die sie befallen, stabil und ortsspezifisch integrieren. Sie können ein weites Spektrum an Zellen infizieren, ohne eine Wirkung auf das Zellwachstum, die -morphologie oder die -differenzierung zu induzieren. Außerdem scheinen sie nicht bei Pathologien beim Mensch beteiligt zu sein. Das Genom der AAV wurde kloniert, sequenziert und charakterisiert. Es umfasst etwa 4700 Basen und enthält an jedem Ende eine umgekehrte Wiederholungsregion (ITR) mit etwa 145 Basen, die als Replikationsursprung für das Virus dient. Der Rest des Genoms ist in 2 wesentliche Regionen aufgeteilt, die die Verpackungsfunktionen tragen: der linke Teil des Genoms, der das Gen rep enthält, das bei der Virusreplikation und der Expression der viralen Gene beteiligt ist; der rechte Teil des Genoms, der das Gen cap enthält, das für die Kapsidproteine des Virus kodiert.
Die Verwendung von Vektoren, die von den AAV abgeleitet sind, für den Transfer von Genen in vitro und in vivo wurde in der Literatur beschrieben (siehe insbesondere WO 91/18088; WO 93/09239; US 4,797,368 , US5,139,941, EP 488 528 ). Diese Anmeldungen beschreiben verschiedene, von den AAV abgeleitete Konstruktionen, in denen die Gene rep und/oder cap deletiert und durch ein interessierendes Gen ersetzt sind, und ihre Verwendung zum Transferieren in vitro (an Zellen in Kultur) oder in vivo (direkt in einen Organismus) besagten interessierenden Gens. Die erfindungsgemäßen defektiven rekombinanten AAV können durch Cotransfektion in einer durch ein menschliches Helfervirus (beispielsweise ein Adenovirus) infizierten Zelllinie eines Plasmids, das die Sequenz enthält, die für den Inhibitor der ETS kodiert, begrenzt von zwei umgekehrten Wiederholungsregionen (ITR) von AAV, und eines Plasmids, das die Verpackungsgene (Gene rep und cap) von AAV trägt, hergestellt werden. Die erzeugten rekombinanten AAV werden dann durch herkömmliche Verfahren gereinigt.
Bei den Herpesviren und den Retroviren wurde die Konstruktion von rekombinanten Vektoren in der Literatur ausführlich beschrieben: siehe insbesondere Breakfield et al., New Biologist 3 (1991) 203; EP 453242 , EP 178220 , Bernstein et al. Genet. Eng. 7 (1985) 235; McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689 usw. Insbesondere sind die Retroviren integrative Viren, die selektiv die sich teilenden Zellen infizieren. Sie stellen folglich interessante Vektoren für Krebsanwendungen dar. Das Genom der Retroviren umfasst im Wesentlichen zwei LTR, eine Verpackungssequenz und drei kodierende Regionen (gag, pol und env). In den von den Retroviren abgeleiteten rekombinanten Vektoren sind die Gene gag, pol und env im Allgemeinen ganz oder teilweise deletiert und durch eine interessierende heterologe Nukleinsäuresequenz ersetzt. Diese Vektoren können aus verschiedenen Typen von Retroviren, wie insbesondere MoMuLV ("murine moloney leukemia virus"; auch mit MoMLV bezeichnet), MSV ("murine moloney sarcoma virus"), HaSV ("harvey sarcoma virus"; SNV ("spleen necrosis virus"); RSV ("rous sarcoma virus") oder auch das Friend-Virus, hergestellt werden.
Um rekombinante Retroviren zu konstruieren, die eine interessierende Sequenz umfassen, wird im Allgemeinen ein Plasmid, das insbesondere die LTR, die Verpackungssequenz und besagte interessierende Sequenz umfasst, konstruiert, dann verwendet, um eine Verpackung genannte Zelllinie zu transfektieren, die die defizienten retroviralen Funktionen in trans in das Plasmid einbringen kann. Allgemein können die Verpackungslinien folglich die Gene gag, pol und env exprimieren. Solche Verpackungslinien wurden im Stand der Technik beschrieben und insbesondere die Linie PA317 ( US 4,861,719 ); die Linie PsiCRIP (WO 90/02806) und die Linie GP+envAm-12 (WO 89/07150). Außerdem können die rekombinanten Retroviren Modifikationen im Bereich der LTR, um die transkriptionelle Aktivität zu unterdrücken, sowie ausgedehnte Verpackungssequenzen umfassen, die einen Teil des Gens gag (Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1639) umfassen. Die erzeugten rekombinanten Retroviren werden dann durch herkömmliche Verfahren gereinigt.
Vorteilhafterweise wird in den Vektoren der Erfindung die Sequenz, die für die Verbindung kodiert, die antagonistische Eigenschaften auf den onkogenen Charakter von Mdm2 besitzt, unter die Kontrolle von Signalen gestellt, die ihre Expression in den Tumorzellen ermöglichen. Vorzugsweise handelt es sich um heterologe Expressionssignale, das heißt um Signale, die von denjenigen, die natürlicherweise für die Expression des Inhibitors verantwortlich sind, verschieden sind. Es kann sich insbesondere um Sequenzen, die für die Expression anderer Proteine verantwortlich sind, oder um synthetische Sequenzen handeln. Insbesondere kann es sich um Promotorsequenzen von eukaryotischen oder viralen Genen handeln. Beispielsweise kann es sich um Promotorsequenzen handeln, die aus dem Genom der Zelle, die man infizieren möchte, hervorgegangen sind. Desgleichen kann es sich um Promotorsequenzen handeln, die aus dem Genom eines Virus, einschließlich des verwendeten Virus, hervorgegangen sind. Diesbezüglich kann man beispielsweise die Promotoren E1A, MLP, CMV, LTR-RSV usw. anführen. Außerdem können diese Expressionssequenzen durch Addition von Aktivierungs-, Regulationssequenzen oder Sequenzen, die eine gewebespezifische Expression ermöglichen, modifiziert werden. Es kann nämlich besonders interessant sein, Expressionssignale zu verwenden, die spezifisch oder hauptsächlich in den Tumorzellen aktiv sind, so dass die DNA-Sequenz nur exprimiert wird und ihre Wirkung nur erzeugt, wenn das Virus tatsächlich eine Tumorzelle infiziert hat.
Bei einer besonderen Ausführungsform betrifft die Erfindung ein defektives rekombinantes Virus, das eine cDNA-Sequenz umfasst, die für eine Verbindung kodiert, die antagonistische Eigenschaften auf den onkogenen Charakter von Mdm2 besitzt, unter der Kontrolle eines viralen Promotors, der vorzugsweise unter LTR-RSV und dem Promotor CMV ausgewählt ist.
Immer noch in einer bevorzugten Form betrifft die Erfindung ein defektives rekombinantes Virus, das eine DNA-Sequenz umfasst, die für eine Verbindung kodiert, die antagonistische Eigenschaften auf den onkogenen Charakter von Mdm2 besitzt, unter der Kontrolle eines Promotors, der eine überwiegende Expression in den Tumorzellen ermöglicht.
Die Expression wird im Sinne der Erfindung als überwiegend betrachtet, wenn, selbst wenn eine Restexpression in andern Zelltypen beobachtet wird, die Expressionsniveaus in den Tumorzellen höher sind.
Die vorliegende Erfindung erstreckt sich auch auf die Verwendung einer Nukleinsequenz, die für intrazelluläre Antikörper oder auch scFV kodiert, die gegen die Domäne 1–134 der Sequenz des Proteins Mdm2, dargestellt in SEQ ID NO: 1, gerichtet sind, für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die allgemein für die Behandlung von Krebs bestimmt ist.
Sie betrifft auch jede pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Verbindung, die die onkogene Aktivität des Proteins Mdm2 inhibieren kann, oder eine Nukleinsäurensequenz, die für eine solche Verbindung kodiert, umfasst. Gemäß einer besonderen Ausführungsform der Erfindung umfasst diese Zusammensetzung ein oder mehrere defektive rekombinante Viren, wie zuvor beschrieben. Diese pharmazeutischen Zusammensetzungen können formuliert werden für Verabreichungen auf topischem, oralem, parenteralem, intranasalem, intravenösem, intramuskulärem, subkutanem, intraokulärem, transdermalen Weg usw. Vorzugsweise enthalten die pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung einen Träger, der für eine injizierbare Formulierung, insbesondere für eine direkte Injektion in den Tumor des Patienten pharmazeutisch annehmbar ist. Es kann sich insbesondere um isotonische sterile Lösungen, oder um trockene, insbesondere gefriergetrocknete Zusammensetzungen handeln, die durch Zugabe von sterilisiertem Wasser oder von physiologischem Serum, je nach Fall, die Bildung von injizierbaren Lösungen ermöglichen. Die direkte Injektion in den Tumor des Patienten ist vorteilhaft, weil sie es ermöglicht, die therapeutische Wirkung auf die befallenen Gewebe zu konzentrieren.
Die für die Injektion verwendeten Dosen an defektivem rekombinantem Virus können in Abhängigkeit von verschiedenen Parametern und insbesondere in Abhängigkeit von dem viralen Vektor, der verwendeten Verabreichungsweise, der betreffenden Erkrankung oder auch der angestrebten Behandlungsdauer angepasst werden. Allgemein werden die erfindungsgemäßen rekombinanten Adenoviren in Form von Dosen formuliert und verabreicht, die zwischen 10⁴ und 10¹⁴ pfu/ml und vorzugsweise 10⁶ bis 10¹⁰ pfu/ml liegen. Der Begriff pfu ("plaque forming unit") entspricht dem Infektionsvermögen einer Viruslösung und wird durch Infektion einer geeigneten Zellkultur bestimmt und misst, im Allgemeinen nach 48 Stunden, die Anzahl an Plaques infizierter Zellen. Die Verfahren zur Bestimmung des pfu-Titers einer Viruslösung sind in der Literatur gut dokumentiert. Bezüglich der Retroviren können die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen im Hinblick auf ihre Implantation direkt die produzierenden Zellen umfassen.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen sind besonders vorteilhaft zur Neutralisation der onkogenen Aktivität der Mdm2-Proteine und daher zur Modulation der Proliferation bestimmter Zelltypen.
Insbesondere sind diese pharmazeutischen Zusammensetzungen geeignet bei der Behandlung von Krebserkrankungen ohne p53, wie beispielsweise die folgenden Krebserkrankungen: die Adenokarzinome des Dickdarms, die Schilddrüsenkrebserkrankungen, die Lungenkarzinome, die myeloischen Leukämien, die Kolorektalkrebserkrankungen, die Brustkrebserkrankungen, die Lungenkrebserkrankungen, die Magenkrebserkrankungen die Speiseröhrenkrebserkrankungen, die B-Lymphome, die Eierstockkrebserkrankungen, die Blasenkrebserkrankungen, die Glioblastome usw.
Die vorliegende Erfindung wird vorteilhafterweise in vivo für die Zerstörung von Zellen in Hyperproliferation (d. h. in anormaler Proliferation) angewandt. Sie ist so anwendbar auf die Zerstörung der Tumorzellen oder der glatten Muskelzellen der Gefäßwand (Restenose).
Weitere Vorteile der vorliegenden Erfindung werden beim Lesen der folgenden Beispiele und Figuren, die als veranschaulichend und nicht beschränkend zu sehen sind, hervortreten.
1: Darstellung der Mdm-2-Proteine von A bis F.
2: Graph der Transfektion von Saos-2-Zellen mit Plasmiden, die verschiedene Mdm-2-Proteine exprimieren.
3: Schematische Darstellung der Inhibition der transformierenden Eigenschaften von Mdm2 durch verschiedene p53.
4: Wirkung einer Mdm2-Überexpression auf den Zellzyklus.
5: Wirkung einer Mdm2-Überexpression auf den Zellzyklus.
Allgemeine molekularbiologische Verfahren
Die herkömmlicherweise in der Molekularbiologie angewandten Verfahren, wie die präparativen Extraktionen von Plasmid-DNA, das Zentrifugieren von Plasmid-DNA in einem Cäsiumchloridgradienten, die Elektrophorese auf Agarose- oder Acrylamidgelen, die Reinigung von DNA-Fragmenten durch Elektroelution, die Extraktion von Proteinen mit Phenol oder mit Phenol-Chloroform, das Ausfällen von DNA in salzhaltigem Medium durch Ethanol oder Isopropanol, die Transformation in Escherichia coli usw... sind dem Fachmann gut bekannt und sind in der Literatur ausgiebig beschrieben [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y., 1982; Ausubel F. M. et al. (Hrsg.), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987].
Für die Ligationen können die DNA-Fragmente durch Elektrophorese in Agarose- oder Acrylamidgelen nach ihrer Größe getrennt, mit Phenol oder mit einem Phenol/Chloroform-Gemisch extrahiert, mit Ethanol ausgefällt, dann in Gegenwart von DNA-Ligase des Phagen T4 (Biolabs) gemäß den Empfehlungen der Lieferfirma inkubiert werden.
Das Auffüllen der überhängenden 5'-Enden kann durch das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I von E. coli (Biolabs) gemäß den Spezifikationen der Lieferfirma ausgeführt werden. Der Abbau der überhängenden 3'-Enden wird in Gegenwart von DNA-Polymerase des Phagen T4 (Biolabs), die gemäß den Empfehlungen des Herstellers verwendet wird, ausgeführt. Der Abbau der überhängenden 5'-Enden wird durch eine schonende Behandlung durch die S1-Nuklease durchgeführt.
Die gerichtete Mutagenese in vitro durch synthetische Oligodeoxynukleotide kann gemäß dem von Taylor et al. [Nucleic Acid Res. 13 (1985) 8749–8764] entwickelten Verfahren unter Verwendung des von Amersham vertriebenen Kits ausgeführt werden.
Die enzymatische Amplifikation von DNA-Fragmenten durch die Technik, die PCR [Polymerase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R. K. et al., Science 230 (1985) 1350–1354; Mullis K. B. und Faloona F. A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335–350] genannt wird, kann ausgeführt werden, indem man einen "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) gemäß den Spezifikationen des Herstellers verwendet. Die Amplifikation von Genom-DNA wird spezieller unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: 5 Minuten bei 100°C, 30 Zyklen von einer Minute bei 95°C, 2 Minuten bei 58°C, dann 3 Minuten bei 72°C mit geeigneten Sonden. Die Amplifikationsprodukte werden durch Gelelektrophorese analysiert.
Der Nachweis der Nukleotidsequenzen kann durch das Verfahren, das von Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463–5467] entwickelt wurde, unter Verwendung des von Amersham vertriebenen Kits ausgeführt werden.
Materialien und Verfahren
1. Verwendete Konstruktionen

– das Plasmid pBKCMV wird von Stratagene verkauft und enthält das Neomycin-Resistenzgen.
– die Plasmide pC53C1N3 und p53-4.2. N3, die für Wildtyp p53 beziehungsweise für p53 R273H kodieren, stammen von A. Levine (Hinds et al., Cell Growth and Diff. (1990), 1, 571).
– das Plasmid pBKp53 (R273H) enthält das menschliche Minigen p53. Es wurde aus pC53-4.2. N3 erhalten.
– das Plasmid pBKMdm2 wurde durch Klonieren in pBKCMV einer kodierenden Kassette erhalten, bestehend aus der nicht translierten Region des Endes der Sequenz, die für das β-Globin kodiert, gefolgt von der Sequenz, die für mdm2 kodiert.
– das Plasmid pGKhygro exprimiert das Hygromycin-Resistenzgen (Nature (1990) 348, 649–651).
– das Plasmid pCMVNeoBam, das die Expression des Neomycin-Resistenzgens ermöglicht (Hinds et al. (1990) Cell Growth and Diff., 1, 571–580).
– die Plasmide pCMVp107 und pCMVCD20, die die Expression des Proteins p107 und des Oberflächenmarkers CD20 ermöglichen (Zhu et al. (1993) Genes and Development, 7, 1111–1125).
– die Plasmide pCMVE2F-4 und pCMVE2F-5, die die Expression der Proteine E2F-4 und E2F-5 ermöglichen (Sardet et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sc., 92, 2403–2407).
– die Plasmide pLexA, pLexA(6–41), pLexA(16–25), die die Expression der Domäne der Fixierung an die DNA von LexA (aa1 bis 87), frei oder in Phase fusioniert mit p53 (6–41) oder p53 (16–25) ermöglichen. pLexA(6–41) und pLexA(16–25) wurden aus dem Plasmid pLexApolyll, konstruiert im LGME (Straßburg), erhalten.
– die eukaryotischen Expressionsplasmide von p107: p107(385–1068), p107(1–781) und p107(781–1068) (Zhu et al., EMBO J. 14 (1995) 1904),
– das Plasmid pSGK1HAp107 ermöglicht die Expression in vitro und in vivo von p107. p107 ist im Kontext einer Kozak-Sequenz und das HA-Epitop wird in Fusion mit dem C-terminalen Ende von p107 exprimiert.
– die Plasmide pBC-MDM2 und pBC-MDM2(1–134) wurden durch Klonieren von MDM2 und MDM2(1–134) in pBC erhalten (Chatton et al., Biotechniques 18 (1995) 142).
– die Plasmide pGex-MDM2 und pGex-MDM2(1–177) wurden durch Klonieren von MDM2 und MDM2(1–177) in pGex erhalten.

2. Verfahren
Die Expression von p53 wird durch Western Blotting am ganzen Zellextrakt mit einem monoklonalen D01-Antikörper bestimmt.
Die Expression von mRNA, die für das Protein Mdm2 kodiert, wird durch semiquantitative RT-PCR bestimmt.
Das Fehlen von Verunreinigung der DNA wird durch PCR nachgewiesen.
Beispiel 1: Aufzeigen der transformierenden Eigenschaften von mdm2
Saos-2-Zellen werden entweder mit einem Plasmid pBKMDM2, einem Kontrollplasmid pBKp53 (R273H) oder einem p53-negativen Kontrollplasmid pBKCMV transfektiert, dann auf ihre Resistenz gegenüber Geneticin 418(G418) selektioniert.
In einem ersten Versuch werden Klone individuell selektioniert und vermehrt, während in den 2 anderen Versuchen die nicht isolierten Klone in einem Softagar-Medium kultiviert werden.
Dazu werden 10⁴ Zellen in zweifacher Ausführung auf 0,375% Softagar geimpft. Nach 24 Stunden bestimmt man die Gesamtanzahl an Kolonien mit mehr als 50 Zellen sowie die Anzahl an Zellen pro Kolonie (Größe der Kolonien). Jeder angegebene Wert entspricht einem Mittelwert von vier zweifach durchgeführten Experimenten. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle I dargestellt. Die Klone im Versuch Nr. 1, die mdm2 entsprechen, sind unter M1 bis M6 angegeben, diejenigen von p53 (R273H) unter p53-1 bis p53-6 und diejenigen des Kontrollversuchs unter Co1 bis Co5.
Wie erwartet, exprimieren Co1 und Co4 kein transfektiertes mdm2 und Co1–3 kein Protein p53.
TABELLE I
Beispiel 2: Die N-terminale Region von Mdm-2 (1–134) SEQ ID NO: 1 ist notwendig und ausreichend zur Stimulierung des Wachstums der Saos-2-Zellen in Softagar
Saos-2-Zellen werden entweder mit Plasmiden pBKCMV, die gleichzeitig die neo-Resistenz und die mdm-2-Proteine A bis F, die in der 1 beschrieben sind, exprimieren, oder mit einem leeren Kontrollplasmid pBKCMV transfektiert, dann auf ihre Resistenz gegenüber G418 selektioniert. Die überlebenden Zellen werden vereinigt, amplifiziert, dann auf die Bildung von Kolonien in Softagar untersucht. Die Ergebnisse der 2 sind ausgedrückt in Anzahl an gebildeten Klonen in Softagar, bezogen auf diejenige mit vollständigem mdm-2 (A). Diese Ergebnisse sind aus zwei unabhängigen repräsentativen Transfektionsexperimenten hervorgegangen, worin zwischen 3 und 7 verschiedene Zellpools untersucht wurden, je nach Konstruktion. Sie zeigen klar, dass die N-terminale Domäne von mdm2 onkogene Eigenschaften besitzt. Die wirksamste Konstruktion entspricht dem vollständigen Protein.
Beispiel 3: Reversion der onkogenen Eigenschaften von Mdm-2 durch Wildtyp p53, p53-Mutanten und p53-Fragmente
Eine Charge von durch Mdm-2 transformierten Saos-2-Zellen wird mit dem Plasmid pGKhygro und entweder pC53C1N3 (p53) pC53-4.2N3 p53(R(273)H, p53 (1–52), pLexA(6–41), pLexA(16–25), pLexA, p53(L14Q,F19S), p53(L22Q,W23S) oder pCMVNeoBam cotransfektiert, dann auf die Resistenz gegenüber Hygromycin in Gegenwart von G418 selektioniert. 10 000 Zellen aus 3 bis 5 unabhängigen Pools resistenter Zellen werden in zweifacher Ausführung auf Softagar (0,375%) geimpft. Nach 25 Tagen Kultur werden die Kolonien mit wenigstens 50 Zellen gezählt. Die 3 zeigt die Ergebnisse eines repräsentativen Experiments und gibt eine schematische Darstellung der verschiedenen p53, die zum Inhibieren der transformierenden Eigenschaften von Mdm-2 untersucht wurden. Aus diesem Experiment geht hervor, dass nur die Konstruktionen, die die Expression von Proteinen ermöglichen, die sich an das Protein mdm-2 binden können, im vorliegenden Fall p53, p53 R273H, p53 (1–52), LexA(6–41), LexA(16–25), die onkogenen Eigenschaften von Mdm-2 inhibieren. Dagegen haben die Doppelmutanten, bei denen gezeigt ist, dass sie die Fähigkeit zur Bindung mit mdm-2 verloren haben (Lin et al., Gene Dev., 1994, 8, 1235–1246) keine inhibierende Wirkung. Die Tatsache, dass die Mutante p53(14–19), die die transaktivierenden Eigenschaften des Wildtyp p53 behalten hat, die Transformation durch Mdm-2 nicht inhibiert, bestätigt, dass die onkogenen Eigenschaften von Mdm-2 unabhängig von der Inhibition der transaktivierenden Eigenschaften von p53 durch Mdm-2 sind.
Beispiel 4: Mdm-2 inhibiert die von p107 ausgelöste Blockierung des Zellzyklusses in G1 in den Saos-2-Zellen
Saos-2-Zellen werden mit drei Typen von Plasmiden cotransfektiert, (i) einem Plasmid für die Expression von CD-20 (pCMVCD20, 2 μg, das für den Zelloberflächenmarker CD-20 kodiert), (ii) einem Plasmid (9 μg) zur Expression vom Typ CMV (Promotor des Cytomegalusvirus) ohne kodierende Sequenz oder kodierend für Mdm-2 (PBKCMVMdm2), für die Domäne 1–134 von Mdm-2 (PBKCMVMdm2(1–134)), E2F-4 oder E2F-5 (pCMVE2F-4, pCMVE2F-5), und (iii) einem Vektor zur Expression von p107 (pCMVp107, 9 μg). Die Zellen werden dann für die Analyse durch FACScan, wie von Zhu et al., Gene Dev., 1993, 7, 1111–1125 beschrieben, behandelt. Die Ergebnisse eines repräsentativen Experiments sind in der 4 dargestellt. Sie zeigen klar, dass in Abwesenheit von überexprimiertem p107 die Expression von Mdm-2 oder seiner Domäne 1–134 keine Wirkung auf den Zellzyklus hat. Dagegen kann die Expression von Mdm-2 und, mit einer Effizienz, seiner Domäne 1–134 das Anhalten des Zellzyklusses in G1, das ausgelöst wird von p107, aufheben. Dieses Beispiel zeigt klar, dass Mdm-2 nicht nur ein Inhibitor der transaktivierenden Aktivität von p53, sondern auch ein positiver Regulator des Zellzyklusses, der die Faktoren, die bei dessen Kontrolle beteiligt sind, inhibieren kann, ist.
In einem ähnlichen Experiment werden Saos-2-Zellen mit 1 μg p107(385–1068), 8 μg pCMVNeoBam, 1 μg pXJMDM2, 8 μg pXJ41 und 2 μg pCMVCD20 cotransfektiert. Die Ergebnisse eines repräsentativen Experiments sind in der 5 angegeben. Sie zeigen, dass die Expression von MDM2 die Blockade in G1, die von p107 und von der Deletionsmutante p107(385–1068), die mit MDM2 interagieren kann, ausgelöst wird, aufheben kann.
Beispiel 5: MDM2 interagiert in vitro und in vivo mit p107
Dieses Beispiel zeigt eine physikalische Interaktion zwischen MDM2 und p107 in vitro wie in vivo. Diese Ergebnisse werden mit der Aktivität von MDM2 hinsichtlich des Zellzyklusses korreliert (Beispiel 4).
5.1. In vitro
Mit S35 markiertes p107 wird in vitro mit Protein GST-MDM2 (Vektor pGex-MDM2) oder GST-MDM2(1–177) (Vektor pGex-MDM2(1–177)), immobilisiert auf Glutathion-Sepharose-Kugeln, in Kontakt gebracht. P107, gebunden an MDM2, wird nach Polyacrylamidgel durch Autoradiographie nachgewiesen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle II dargestellt.
5.2. In vivo
Cos-Zellen werden mit einem Plasmid pBC-MDM2 oder pBC-MDM2(1–134), die ein Fusionsprotein GST-MDM2 oder GST-MDM2(1–134) exprimieren, mit einem Expressionsplasmid von p107 oder von einer Mutante von p107 cotransfektiert. Die Proteinkomplexe GST-MDM2-p107, die aus Gesamtzellextrakten stammen, werden auf Glutathion-Sepharose-Kugeln isoliert und die p107-Proteine werden durch Western Blot mit einem polyklonalen Antikörper anti-p107 (Santa Cruz p107-C18) nachgewiesen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle II dargestellt.
Die Ergebnisse zeigen, dass es eine Protein-Protein-Interaktion zwischen MDM2 und p107 in vitro gibt, aber auch in der Zelle. Die Region von MDM2, die für die Zelltransformation notwendig ist (1–134), ist die Region, die mit p107 interagiert. Diese Region wurde als genauer in einem Teil der "pocket domain", Region "A" und "spacer" liegend lokalisiert.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verwendung einer Verbindung, die wenigstens teilweise die onkogene Aktivität des Proteins Mdm2 antagonisieren kann, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die für die Behandlung der Krebserkrankungen ohne p53-Kontext bestimmt ist.
Verwendung gemäß Anspruch 1 einer Verbindung, die sich im Bereich der Domäne 1–134 der Sequenz des Proteins Mdm2, die in SEQ ID NO: 1 dargestellt ist, binden kann.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung ein scFV ist, das gegen die Domäne 1–134 besagten Proteins Mdm2 gerichtet ist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung ganz oder teilweise dargestellt wird durch eines der Peptide 1–52, 1–41, 6–41, 16–25, 18–23 der Sequenz, die in SEQ ID NO: 2 dargestellt ist, oder von ihren Derivaten.
Verwendung gemäß Anspruch 1 einer Verbindung, die sich an eine benachbarte Domäne der Domäne 1–134, dargestellt in SEQ ID NO: 1, des Proteins Mdm2 binden kann und durch diese Bindung die onkogene Aktivität besagten Proteins beeinflusst.
Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung mit der C-terminalen Domäne des Proteins Mdm2 interagiert.
Verwendung gemäß Anspruch 1, 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einen Transkriptionsfaktor handelt, der ausgewählt ist unter TFII, TBP und TAF250.
Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung mit der Domäne 135–491 des Proteins Mdm2 interagiert.
Verwendung gemäß Anspruch 1, 5 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass es sich ganz oder teilweise um ein Protein handelt, das ausgewählt ist unter den Proteinen Rb, L5 und dem Transkriptionsfaktor E2F.
Verwendung eines scFV, das gegen die Domäne 1–134 des Proteins Mdm2 gerichtet ist, für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die für die Behandlung der Krebserkrankungen bestimmt ist.
Verwendung einer Nukleinsäure, die für eine Verbindung kodiert, die die onkogene Aktivität des Proteins Mdm2 antagonisieren kann, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die für die Behandlung der Krebserkrankungen ohne p53-Kontext bestimmt ist.
Verwendung gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass es sich handelt um: – Antisense-Nukleinsäuren, – Oligonukleotidliganden, die eine der Domänen des Proteins Mdm2 direkt fixieren und seine onkogene Aktivität inhibieren können, – Nukleinsäuren, die ganz oder teilweise für Peptide oder Proteine kodieren, die sich mit einer der Domänen von Mdm2 oligomerisieren und seine onkogene Aktivität inhibieren können, – Nukleinsäuren, die für intrazelluläre Antikörper kodieren, die gegen die Domäne 1–134 der Sequenz des Proteins Mdm2, dargestellt in SEQ ID NO: 1, gerichtet sind.
Verwendung gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Antisense-Nukleinsäure eine DNA ist, die für eine komplementäre RNA der Nukleinsäure, die für das Protein Mdm2 kodiert und seine Transkription und/oder seine Translation (Antisense-RNA) blockieren kann, oder ein Ribozym kodiert.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure in komplexierter Form mit DEAE-Dextran, mit Zellkernproteinen oder mit Lipiden oder kationischen Polymeren, in Form von Liposomen oder auch so, wie sie ist, verwendet wird.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure Teil eines Vektors ist.
Verwendung gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure Teil eines viralen Vektors ist, der ausgewählt ist unter den Adenoviren, den Retroviren und den adeno-assoziierten Viren.
Viraler Vektor, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäurensequenz für ein scFv kodiert, das im Bereich der Domäne 1–134 (SEQ ID NO: 1) des Proteins Mdm2 interagieren kann.
Viraler Vektor gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass er ausgewählt ist unter den Adenoviren, den Retroviren und den adeno-assoziierten Viren.
Viraler Vektor gemäß den Ansprüchen 18 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein Adenovirus oder ein Retrovirus handelt.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend einen Vektor, umfassend eine Nukleinsäure, die für ein scFv kodiert, das im Bereich der Domäne 1–134 (SEQ ID NO: 1) des Proteins Mdm2 interagieren kann.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor ein Plasmidvektor oder ein viraler Vektor ist, der ausgewählt ist unter den Adenoviren, den Retroviren oder den adeno-assoziierten Viren.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 21, formuliert in Hinblick auf eine intratumorale Verabreichung.
Verwendung einer Nukleinsequenz, die für intrazelluläre Antikörper kodiert, die gegen die Domäne 1–134 (SEQ-ID NO: 1) des Proteins Mdm2 gerichtet sind, für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die für die Behandlung von Krebs bestimmt ist.