DE69531678T3

DE69531678T3 - Rekombinatie viren,ihre herstellung und ihre verwendung in der gentherapie

Info

Publication number: DE69531678T3
Application number: DE69531678T
Authority: DE
Inventors: Patrick Benoit; Patrice Denefle; Michel Perricaudet; Michael R. Hayden; Marion Elizabeth Suzanne Lewis
Original assignee: Aventis Pharma SA
Current assignee: Aventis Pharma SA
Priority date: 1994-06-02
Filing date: 1995-05-22
Publication date: 2009-01-29
Anticipated expiration: 2015-05-23
Also published as: US20130210898A1; IL113978A0; CA2190394A1; CA2190394C; EP0763116B1; NO964894D0; FR2720756B1; JPH10500859A; DE69531678T2; MX9605988A; DE69531678D1; WO1995033840A1; FI964784A; EP0763116A1; ATE248920T1; EP0763116B2; NO964894L; IL113978A; ZA954386B; AU2620595A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft rekombinante Vektoren viralen Ursprungs, deren Herstellung und deren Verwendung, insbesondere zur Behandlung von und/oder Vorbeugung gegen Erkrankungen, die mit Dyslipoproteinämien in Zusammenhang stehen. Insbesondere betrifft sie rekombinante Viren, die eine DNA-Sequenz aufweisen, welche für eine Lipase codieren, die am Lipoproteinstoffwechsel beteiligt ist. Die Erfindung betrifft weiterhin die Herstellung dieser Vektoren sowie pharmazeutische Zusammensetzungen, in denen diese enthalten sind, und deren therapeutische Verwendung, insbesondere in der Gentherapie.
Dyslipoproteinämien sind Störungen im Stoffwechsel derjenigen Lipoproteine, die für den Transport von Lipiden wie etwa von Cholesterin und Triglyceriden im Blut und in den peripheren Flüssigkeiten verantwortlich sind. Sie führen zu schweren Erkrankungen, die mit zu hohen Cholesterin- beziehungsweise Triglyceridwerten in Zusammenhang stehen, wie etwa insbesondere zu Arteriosklerose. Arteriosklerose ist eine komplexe Krankheit mit mehreren Ursachen, die in histologischer Hinsicht derart definiert ist, dass die Wand von dicken Arterien (Aorta, Koronararterien, Halsschlagadern) Ablagerungen (lipidische oder fibrin-lipidische Plaques) aus Lipiden und anderen Blutderivaten aufweist. Diese Plaques, die je nach dem Voranschreiten des Prozesses mehr oder weniger verkalkt sind, können gemeinsam mit Läsionen auftreten und stehen mit dem gehäuften Auftreten von Fettablagerungen, die sich im Wesentlichen aus Cholesterinestern zusammensetzen, in den Arterien in Zusammenhang. Mit diesen Plaques geht eine Verdickung der Arterienwand einher, wobei es zu einer Hypertrophie der glatten Muskulatur sowie zum Auftreten von Schaumzellen und einer Ansammlung von fibrinhaltigem Gewebe kommt. Die Plaques ragen sehr deutlich aus der Arterienwand heraus, weshalb sie eine gefäßverengende Wirkung ausüben, die für Gefäßverschlüsse durch die Plaques selbst, durch Thromben oder Embolien verantwortlich sind, welche bei den am stärksten betroffenen Patienten auftreten können. Dyslipoproteinämien können somit zu sehr schweren Herz-Kreislauf-Erkrankungen wie etwa zum Infarkt, zum plötzlichen Tod, zur kardialen Dekompensation, zu Schlaganfällen usw. führen.
Gegenwärtig werden diese Krankheitsbilder, und insbesondere der erhöhte Cholesterinspiegel, im Wesentlichen mit Hilfe von Verbindungen behandelt, die entweder in die Biosynthese des Cholesterins eingreifen (Hydroxymethylglutaryl-Coenzym-A-Reductase, Stative) oder das Gallencholesterin abfangen und entfernen (Abfangmittel oder Austauschharze) oder aber die Lipolyse über einen Mechanismus beeinflussen, der auf molekularer Ebene noch aufzuklären ist (Fibrate). Somit sprechen sämtliche Hauptarzneimittelgruppen, die bei dieser Indikation eingesetzt werden (Abfangmittel, Fibrate oder Statine) lediglich den Aspekt der Vorbeugung gegen die Bildung von arterieller Plaque an, ohne jedoch die krankhaften Ablagerungen in den Arterien selbst zu behandeln. Die gegenwärtigen Ansätze zur Behandlung arterieller Plaque infolge einer akuten koronaren Herzkrankheit haben lediglich eine lindernde Wirkung, denn sie wirken nicht auf die Selbstregulation des Cholesterins und stellen chirurgische Eingriffe dar (koronarer Bypass, Angioplastie).
Die vorliegende Erfindung stellt eine neue therapeutische Herangehensweise in der Behandlung von Erkrankungen, die mit Dyslipoproteinämien in Zusammenhang stehen, dar. Mit Hinblick auf die Nachteile, die gemäß dem Stand der Technik bestehen, stellt sie eine vorteilhafte Lösung dar, indem die aufzeigt, dass es möglich ist, die Erkrankungen, welche mit Dyslipoproteinämien in Zusammenhang stehen, mittels einer Gentherapie zu behandeln, und zwar durch die Übertragung und die in-vivo-Expression eines Gens, das für eine Lipase codiert, die am Stoffwechsel der Lipoproteine beteiligt ist. Die Erfindung stellt somit ein einfaches Mittel bereit, welches es ermöglicht, diese Erkrankungen auf spezifische und wirkungsvolle Weise zu behandeln.
Die Gentherapie besteht darin, einen Mangel oder eine Anomalie (Mutation, fehlgeleitete Expression, usw.) zu korrigieren oder die Expression eines Proteins von therapeutischem Nutzwert zu gewährleisten, indem eine genetische Information in die Zelle oder das betroffene Organ eingeführt wird. Diese genetische Information kann entweder ex vivo in eine Zelle eingeführt werden, die dem Organ entnommen wurde, woraufhin die modifizierte Zelle wieder in den Organismus eingeführt wird, oder sie kann direkt in vivo in das geeignete Gewebe eingeführt werden. Für den zweiten Fall existieren verschiedenartige Techniken, unter anderem die unterschiedlichen Transfektionstechniken, bei denen Komplexe aus DNA und DEAE-Dextran (Pagano et al., J. Virol. 1 (1967) 891), aus DNA und Zellkernproteinen (Kaneda et al., Science 243 (1989) 375), aus DNA und Lipiden (Felgner et al., PNAS 84 (1987) 7413) sowie Liposome (Fraley et al., J. Biol. Chem. 255 (1980) 10431), etc. zum Einsatz kommen. In jüngerer Zeit wurde der Einsatz von Viren als Vektoren für die Übertragung von Genen als eine vielversprechende Alternative zu diesen physikalischen Transfektionstechniken beschrieben. Diesbezüglich sind verschiedenartige Viren auf ihre Fähigkeit zur Infektion bestimmter Zellpopulationen untersucht worden. Insbesondere handelt es sich um Retroviren (RSV, HMS, MMS usw.), um das HSV-Virus, um die adeno-assoziierten Viren und um die Adenoviren.
Die vorliegende Erfindung stellt einen neuen therapeutischen Ansatz zur Behandlung von Erkrankungen, die mit Dyslipoproteinämien in Zusammenhang stehen, dar, welcher darin besteht, Gene in vivo zu exprimieren, die für Lipasen codieren, welche am Stoffwechsel der Lipoproteine beteiligt sind. Auf besonders vorteilhafte Weise hat die Anmelderin jetzt gezeigt, dass es möglich ist, rekombinante Viren zu konstruieren, die eine DNA-Sequenz enthalten, welche für eine Lipase codiert, die am Stoffwechsel der Lipoproteine beteiligt ist, sowie diese rekombinanten Viren in vivo zu verabreichen, und dass es die Verabreichung ermöglicht, eine stabile und wirkungsvolle Expression einer biologisch in vivo aktiven Lipase zu erzielen, und zwar ohne zytopathologische Wirkungen.
Die vorliegende Erfindung beruht weiterhin auf dem Nachweis, dass die Adenoviren besonders wirkungsvolle Vektoren für die Übertragung und die Expression derartiger Gene darstellen. Insbesondere zeigt die vorliegende Erfindung, dass es die Verwendung rekombinanter Adenoviren als Vektoren ermöglicht, dass die Gene ausreichend stark exprimiert werden, um die angestrebte therapeutische Wirkung zu erzielen.
Die vorliegende Erfindung stellt somit eine neue Herangehensweise bei der Behandlung und Vorbeugung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen und neurologischen Erkrankungen, die mit Dyslipoproteinämien in Zusammenhang stehen, dar.
Eine erste Aufgabe der Erfindung besteht folglich darin, ein rekombinantes defektes Virus bereitzustellen, das eine Nukleinsäuresequenz enthält, die für eine Lipoproteinlipase (LPL) codiert, welche am Stoffwechsel der Lipoproteine beteiligt ist.
Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung eines solchen rekombinanten defekten Adenovirus für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die zur Behandlung von und/oder Vorbeugung gegen Herz-Kreislauf-Erkrankungen bestimmt ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung von Zellen, die durch ein Virus gemäß der obigen Beschreibung ex vivo genetisch verändert wurden, oder von Zellen, die derartige Viren produzieren, wobei die Zellen in den Organismus implantiert werden, wodurch eine lang andauernde und wirkungsvolle in vivo Freisetzung einer biologisch aktiven Lipase ermöglicht wird.
Die Lipoproteinlipase (LPL) ist ein Enzym, mittels dessen die Triglyceride, welche in den Lipoproteinen von sehr geringer Dichte (VLDL) oder in den Chylomikronen enthalten sind, hydrolysiert können. Das Apolipoprotein CII, welches sich auf der Oberfläche dieser Partikel befindet, kommt bei dieser Hydrolyse als Co-Faktor zu Einsatz. Natürlicherweise wird die LPL hauptsächlich von den Adipozyten in Form einer monomeren Vorläufersubstanz von 51 kDa synthetisiert, die anschließend glykosyliert wird (58 kDa). Im Blut ist die LPL in Form eines Dimers aktiv. Bis zu 80% des frisch synthetisierten LPL wird im lysomalen Kompartiment abgebaut, bevor es abgesondert werden kann. Nach der Absonderung wird die LPL von der lumenseitigen Fläche der Zellen des Gefäßendothels abgefangen, wo sie über Glycosaminglykane andockt. Sie hat eine sehr starke Affinität zum Heparin, aufgrund derer es möglich ist, die LPL von ihrer Andockstelle an die Oberfläche der Endothelzelle zu bringen. Mittels einer intravenösen Injektion von Heparin kann bei Patienten die Konzentration und die Aktivität von LPL gemessen werden. Die LPL wird bei Gefäßzellen, aber auch bei Leberzellen zum Abfangen von Lipoproteinen verwendet, wobei letztere verstärkt auf der Zelloberfläche zurückgehalten werden, wodurch das Abfangen oder die Modifizierung derselben begünstigt wird.
Die cDNA, welche für die menschliche LPL codiert, ist kloniert und sequenziert worden (Wion et al, Science 235 (1987) 1638–1641). Es gibt zwei gleichzeitig vorkommende Messengerformen mit 3350 und 3750 Basen, hauptsächlich im Fett- und Muskelgewebe, die aus der Verwendung zweier Polyadenylierungsstellen hervorgehen. Sie umfassen eine lange, nicht translatierte 3'-Sequenz und codieren für ein Präprotein von 475 aa, von welchem eine Leadersequenz von 27 aa abgespalten wird, um das ausgereifte monomere Protein mit 448 Resten zu bilden. Das Gen der LPL ist ebenfalls kloniert worden (Kirchgessner et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, 262: 9647–9651). Die Synthese, die Aufarbeitung und die Absonderung der LPL werden während der Entwicklung auf komplexe Weise gesteuert, und zwar als Antwort auf hormonale Stimuli. Ein erheblicher Teil dieser Steuerung erfolgt auf der Ebene der Transkription. (Übersichtsartikel in Auwerx et al., Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences, 1992, 29: 243–268).
Die vorliegende Erfindung zeigt, dass es möglich ist, eine DNA-Sequenz, die für die LPL codiert, in einen viralen Vektor einzufügen, und dass diese Vektoren es ermöglichen, eine ausgereifte, biologisch aktive (dimere) Form der LPL auf wirkungsvolle Weise zu exprimieren und abzusondern. Insbesondere zeigt die Erfindung, dass die in vivo-Expression der aktiven LPL erzielt werden kann, indem ein Adenovirus direkt verabreicht wird oder indem eine Zelle, die sie produziert oder genetisch durch ein Adenovirus verändert wurde, implantiert wird oder aber durch ein Retrovirus, welches eine solche DNA umfasst.
Die Vektoren der Erfindung können insbesondere dazu verwendet werden, Mangelerscheinungen an LPL, die auf Mutationen in dem LPL-Gen zurückzuführen sind, zu korrigieren. Derartige Mangelerscheinungen sind relativ häufig und können in bestimmten Populationen eine Prävalenz von 1:5000 bis 1:10000 erreichen (S. Santamarina-Fojo, 1992, Cur. Op. lipid., 3: 186–195). Diese Mangelerscheinungen ergeben sich durch eine ausgeprägte Mutation des Gens, welche dazu führt, dass keine LPL-Synthese stattfindet oder dass ein trunkiertes oder stark verändertes Protein synthetisiert wird. Es ist in der Tat gezeigt worden, dass bei bestimmten Kranken Mutationen des Typs Insertion, Deletion oder non-sens vorliegen (Übersichtsartikel in S. Santamarina-Fojo, 1992, Cur. Op. lipid., 3: 186–195). Sie können sich ebenfalls aus einem Fehler auf der Ebene der katabolen Stelle ergeben, welcher auf missense-Mutationen des Gens zurückzuführen sein kann. Sie können sich weiterhin aus Modifikationen sowohl auf der Ebene der Heparin-Bindungsstelle als auch auf der Ebene der katalytischen Stelle ergeben. Im heterozygoten Stadium können diese Mangelerscheinungen einen beträchtliche Teil der auf weitesten verbreiteten Hyperlipidämien ausmachen, zu denen die familienbedingten Hypertriglyceridämien, die kombinierten familienbedingten Hyperlipidämien und die postprandialen Hyperlipidämien zählen.
Die vorliegende Erfindung ist besonders vorteilhaft, denn sie ermöglicht es, in Organen, welche normalerweise nicht von der LPL-Expression betroffen sind, eine Expression dieses Proteins einzuleiten, die kontrolliert ist und keine schädlichen Wirkungen ausübt. Insbesondere wird eine uneingeschränkt vorteilhafte Freisetzung erzielt, indem Zellen, welche Vektoren der Erfindung produzieren oder welche ex vivo mit Vektoren der Erfindung infiziert wurden, implantiert werden.
Hinsichtlich der Lipaseaktivität, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung erzeugt wird, kann es sich um eine menschliche oder eine tierische Lipase handeln.
Bei der Nukleinsäuresequenz, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann es sich um eine cDNA, eine genomische DNA (gDNA) eine RNA (im Falle der Retroviren) oder aber um ein Hybridkonstrukt handeln, das beispielsweise aus einer cDNA, in welche ein oder mehrere Introns eingefügt wurden, besteht. Es kann sich auch um synthetische oder halbsynthetische Sequenzen handeln. Besonders vorteilhaft ist es, eine cDNA oder eine gDNA zu verwenden. Insbesondere ermöglicht die Verwendung einer gDNA eine bessere Expression in menschlichen Zellen. Um ihren Einbau in eine viralen Vektor gemäß der Erfindung zu ermöglichen, werden diese Sequenzen vorteilhafterweise modifiziert, beispielsweise durch eine gesteuerte Mutagenese, insbesondere zum Einfügen an den geeigneten Restriktionsstellen. Die Sequenzen, welche im Stand der Technik beschrieben sind, wurden in der Tat nicht für eine Verwendung gemäß der Erfindung konstruiert, und es kann sich als notwendig erweisen, diese im Vorfeld zu anzupassen, um ein hohes Expressionsniveau zu erreichen. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird es bevorzugt, eine Nukleinsäuresequenz zu verwenden, die für eine menschliche Lipase codiert. Darüber hinaus ist es möglich, ein Konstrukt zu verwenden, welches für ein Derivat dieser Lipasen codiert, insbesondere für ein Derivat der menschlichen LPL und LH. Die HL (hepatische Lipase) befindet sich an der Oberfläche von hepatischen Endothelzellen. Sie unterscheidet sich von der LPL dadurch, dass sie nicht auf die aktivierende Wirkung von apoC-II anspricht. Die HL ist an der Hydrolyse der Lipide des IDL sowie der Lipide des HDL2 beteiligt, wobei dies deren Umwandlung zu HDL3 nach sich zieht. Unter einem Derivat dieser Lipasen ist beispielsweise jedwede Sequenz zu verstehen, die durch Mutation, Entfernen und/oder Addition ausgehend von der nativen Sequenz entsteht und für ein Produkt codiert, das weiterhin die Lipaseaktivität aufweist. Diese Modifizierungen können mittels der Techniken durchgeführt werden, die dem Fachmann bekannt sind (siehe nachstehende Angaben zu den allgemeinen Techniken der Molekularbiologie). Die biologische Aktivität der auf diese Weise erhaltenen Derivate kann anschließend auf einfache Weise bestimmt werden, wie insbesondere in Beispiel 3 ausgeführt wird. Die Derivate im Sinne der Erfindung können ebenfalls durch Hybridisierung ausgehend von Nukleinsäurebanken erhalten werden, wobei die native Sequenz oder ein Fragment derselben als Sonde verwendet wird.
Bei diesen Derivaten handelt es sich insbesondere um Moleküle, die eine starke Affinität zu ihren jeweiligen Andockstellen aufweisen, sowie um Moleküle, die eine große Widerstandsfähigkeit gegenüber Proteasen aufweisen, oder um Moleküle, die eine bessere therapeutische Wirksamkeit oder geringere Nebenwirkungen oder möglicherweise neuartige biologische Eigenschaften aufweisen. Zu den Derivaten gehören ebenfalls diejenigen modifizierten DNA-Sequenzen, welche eine verbesserte in vivo Expression ermöglichen.
Von den bevorzugten Derivate wären insbesondere die natürlichen Varianten zu nennen sowie Moleküle, bei denen bestimmte N- oder O-Glycosylierungsstellen modifiziert oder entfernt wurden, sowie Moleküle, bei den ein oder mehrere Reste substituiert wurden, oder Moleküle, bei denen sämtliche Cysteinreste substituiert wurden (Muteine). Es wären weiterhin diejenigen Derivate zu nennen, die erhalten werden, indem Regionen, die kaum oder gar nicht an der Wechselwirkung mit den betreffenden Bindungsstellen beteiligt sind oder die eine unerwünschte Aktivität exprimieren, deletiert wurden, sowie diejenigen Derivate, die gegenüber der nativen Sequenz zusätzliche Reste aufweisen, wie beispielsweise ein Absonderungssignal und/oder ein Verbindungspeptid.
In einer ersten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein rekombinantes defektes Virus, das eine cDNA-Sequenz umfasst, die für eine Lipase codiert, welche am Stoffwechsel der Lipoproteine beteiligt ist. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der DNA-Sequenz um eine gDNA-Sequenz.
Die Vektoren der Erfindung können ausgehend von verschiedenartigen Viren hergestellt werden. Vorzugsweise kommen Vektoren zum Einsatz, die sich von Adenoviren, von adeno-assoziierten Viren (AAV) von Herpesviren (HSV) oder von Retroviren ableiten. Es besonders vorteilhaft, einen Adenovirus zu verwenden, und zwar für eine direkte Verabreichung oder für die ex vivo Modifizierung von Zellen, die dazu bestimmt sind, implantiert zu werden, oder aber einen Retrovirus, und zwar für die Implantation von produzierenden Zellen.
Die erfindungsgemäßen Viren sind defekt, das heißt sie sind unfähig, sich in der Zielzelle eigenständig zu vermehren. Im Allgemeinen fehlen im Genom der defekten Viren, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, also mindestens diejenigen Sequenzen, die zur Vermehrung des Virus in der infizierten Zelle erforderlich sind. Diese Regionen können entweder (vollständig oder teilweise) entfernt werden oder ihrer Funktionsfähigkeit beraubt werden oder durch andere Sequenzen und insbesondere durch die Nukleinsäuresequenz, welche für die Lipase codiert, ersetzt werden. Vorzugsweise behält das defekte Virus nichtsdestoweniger diejenigen Sequenzen seines Genoms, die zur Umhüllung der viralen Partikel mit einem Kapsid erforderlich sind.
Was insbesondere die Adenoviren betrifft, so sind verschiedene Serotypen beschrieben worden, deren Aufbau und Eigenschaften sich geringfügig unterscheiden. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden von diesen Serotypen vorzugsweise die menschlichen Adenoviren der Typen 2 oder 5 (Ad 2 oder Ad 5) oder aber Adenoviren tierischer Herkunft (siehe Anmeldung WO94/26914 ) verwendet. Von den Adenoviren tierischer Herkunft, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, wären die Adenoviren vom Hund, vom Rind, von der Maus (Beispiel: Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), vom Schaf, vom Schwein, von Vögeln oder auch von Affen (Beispiel: SAV) zu nennen. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Adenovirus tierischer Herkunft um ein Adenovirus des Hundes, insbesondere um ein CAV2-Adenovirus [Manhatten-Stamm oder A26/61 (ATCC VR-800) zum Beispiel]. Vorzugsweise kommen im Rahmen der Erfindung Adenoviren vom Menschen, vom Hund oder gemischter Herkunft zum Einsatz. Vorzugsweise umfassen die defekten Adenoviren der Erfindung die ITR, eine Sequenz, welche die Umhüllung mit einem Kapsid ermöglicht, sowie die Sequenz, welche für die Lipase codiert. Vorteilhafterweise wurde im Genom der Adenoviren der Erfindung mindestens die Region E1 ihrer Funktionsfähigkeit beraubt. Mit noch größerem Vorzug sind im Genom der Adenoviren der Erfindung das Gen E1 sowie mindestens eines der Gene E2, E4, L1–L5 funktionsunfähig. Das betreffende virale Gen kann mittels jeder beliebigen Technik, die dem Fachmann bekannt ist, seiner Funktionsfähigkeit beraubt werden, und insbesondere durch ein vollständiges Ausschalten, eine Substitution, eine teilweise Deletion oder das Hinzufügen einer oder mehrerer Basen in dem oder den betreffenden Gen(en). Derartige Modifizierungen können in vitro erzielt werden (an isolierter DNA) oder in situ, beispielsweise mit Hilfe von gentechnischen Verfahren, oder auch durch Behandlung mit mutagenen Mitteln. Es können auch andere Regionen modifiziert werden, und insbesondere die Regionen E3 ( WO95/02697 ), E2 ( WO94/28938 ), E4 ( WO94/28152 , WO94/12649 , WO95/02697 ) und L5 ( WO95/02697 ). Gemäß einer bevorzugten Durchführungsweise weist das erfindungsgemäße Adenovirus in den Regionen E1 und E4 eine Deletion auf, und die Sequenz, die für die LPL codiert, ist auf Höhe der inaktivierten Region E1 eingefügt. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform, weist es eine Deletion in der Region E1 auf, wobei auf dieser Höhe die Region E4 und die Sequenz, die für die LPL codiert, eingefügt sind (siehe FR94 13355 ).
Die rekombinanten defekten Adenoviren gemäß der Erfindung können mittels jeder beliebigen Technik, die dem Fachmann bekannt ist, hergestellt werden (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573 ; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). Insbesondere können sie durch homologe Rekombination zwischen einem Adenovirus und einem Plasmid, auf welchem sich unter anderem die DNA-Sequenz befindet, die für die Lipase codiert, hergestellt werden. Die homologe Rekombination erfolgt nach der Co-Transfektion des Adenovirus und des Plasmids in eine geeignete Zelllinie. Die verwendete Zelllinie muss vorzugsweise (i) durch die genannten Elemente transformierbar sein und (ii) diejenigen Sequenzen aufweisen, welche dazu befähigt sind, den Teil des Genoms des defekten Adenovirus zu ergänzen, und zwar vorzugsweise in integrierter Form, um die Risiken der Rekombinationen zu vermeiden. Als Beispiel für eine Zelllinie wäre die menschliche embryonale Nierenzelllinie 293 zu nennen (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59), bei welcher insbesondere das linke Teilstück des Genoms eines Adenovirus Ad5 (12%) in das Genom integriert ist, oder aber dies für Linien zutrifft, die dazu befähigt sind, die Funktionen E1 und E4 gemäß der Beschreibung insbesondere in den Anmeldungen Nr. WO 94/26914 und WO95/02697 zu ergänzen.
Anschließend werden die Adenoviren, die sich vermehrt haben, gewonnen und gemäß den herkömmlichen Techniken der Molekularbiologie aufgereinigt, wie in den Beispielen erläutert ist.
Was die adeno-assoziierten Viren (AAV) betrifft, so handelt es sich um Viren mit einer relativ kurzen DNA, welche sich auf stabile und stellenspezifische Art und Weise in das Genom der Zellen, die sie infizieren, integrieren. Sie sind dazu befähigt, ein breites Spektrum an Zellen zu infizieren, ohne dabei das Wachstum, die Beschaffenheit oder die Ausdifferenzierung der Zellen zu beeinflussen. Darüber hinaus scheinen sie nicht an Erkrankungen des Menschen beteiligt zu sein. Das Genom der AAV ist kloniert, sequenziert und charakterisiert worden. Es umfasst ungefähr 4700 Basen und enthält an jedem seiner Enden eine umgekehrte wiederholte Region (ITR) von ungefähr 145 Basen, welche dem Virus als Replikationsursprung dient. Der Rest des Genoms ist in 2 Hauptregionen aufgeteilt, auf denen sich die Funktionen zur Umhüllung mit dem Kapsid befinden: der linke Teil des Genom, welcher das Gen rep enthält, das an der viralen Replikation und an der Expression der viralen Gene beteiligt ist; der rechte Teil des Genoms, welcher das Gen cap enthält, das für die Proteine des Virus-Kapsids codiert.
Die Verwendung von Vektoren, die sich von AAV ableiten, zur in vitro und in vivo Übertragung von Genen ist in der Literatur beschrieben (siehe insbesondere WO 91/18088 ; WO 93/09239 ; US 4,797,368 , US5,139,941 , EP 488 528 ). Dieses Anmeldungen beschreiben verschiedenartige Konstrukte, die sich von AAV ableiten und in denen die Gene rep und/oder cap deletiert und durch ein Gen von Interesse ersetzt sind, sowie deren Verwendung zur Übertragung des Gens von Interesse, und zwar in vitro (auf Zellkulturen) oder in vivo (direkt auf einen Organismus). In diesen Schriftstücken werden jedoch weder die Verwendung eines rekombinanten AAV zur Übertragung und in vivo oder ex vivo Expression einer Lipase noch die Vorteile einer solchen Übertragung beschrieben oder angedeutet. Die rekombinanten defekten AAV gemäß der Erfindung können durch Co-Transfektion einerseits eines Plasmids, das eine Sequenz enthält, die für die Lipase codiert und von zwei umgekehrt wiederholten AAV-Regionen (ITR) eingerahmt ist, und andererseits eines Plasmids, das die AAV-Kapsid-Umhüllungsgene (die Gene rep und cap) enthält, in eine Zelllinie, die mit einem menschlichen Hilfsvirus (zum Beispiel einem Adenovirus) infiziert ist, hergestellt werden. Die hergestellten AAV werden anschließend mittels herkömmlicher Techniken aufgereinigt.
Was die Herpesviren und die Retroviren betrifft, so ist die Konstruktion rekombinanter Vektoren ausgiebig in der Literatur beschrieben worden: siehe insbesondere Breakfield et al., New Biologist 3 (1991) 203; EP 453242 , EP178220 , Bernstein et al. Genet. Eng. 7 (1985) 235; McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689 usw.
Insbesondere handelt es sich bei den Retroviren um integrationsfähige Viren, die sich teilende Zellen infizieren. Das Genom der Retroviren umfasst im Wesentlichen zwei LTR, eine Kapsid-Umhüllungssequenz sowie drei codierende Regionen (gag, pol und env). In den rekombinanten Vektoren, die sich von Retroviren ableiten, sind die Gene gag, pol und env im Allgemeinen vollständig oder teilweise deletiert und wurden durch eine heterologe Nukleinsäuresequenz von Interesse ersetzt. Diese Vektoren können ausgehend von verschiedenartigen Retroviren hergestellt werden, wie etwa insbesondere dem MoMuLV ("murine moloney leukemia virus"; manchmal auch als MoMLV bezeichnet), dem MSV "murine moloney sarcoma virus"), dem HaSV ("harvey sarcoma virus"); dem SNV ("spleen necrosis virus"); dem RSV ("rous sarcoma virus") oder auch dem Friend-Virus.
Um erfindungsgemäße rekombinante Retroviren zu konstruieren, die eine Sequenz aufweisen, welche für die LPL codiert, wird im Allgemeinen ein Plasmid konstruiert, das insbesondere die LTR, die Kapsid- Umhüllungssequenz und die codierende Sequenz aufweist, woraufhin es dazu verwendet wird, eine Zelllinie zu transfizieren, die als Kapsid-Umhüllungszelllinie bezeichnet wird und dazu befähigt ist, die fehlerhaften retroviralen Funktionen auf dem Plasmid in die trans-Form zu überführen. Im Allgemeinen sind die Kapsid-Umhüllungszelllinien also dazu befähigt, die Gene gag, pol und env zu exprimieren. Derartige Kapsid-Umhüllungszelllinien sind im Stand der Technik beschrieben, und zwar und insbesondere di Linie PA317 ( US4,861,719 ), die Linie PsiCRIP ( WO90/02806 ) und die Linie GP+envAm-12 ( WO89/07150 ). Darüber hinaus können die rekombinanten Retrovirus Modifizierungen an den LTR aufweisen, um die Transskriptionsaktivität aufzuheben, sowie ausgedehnte Kapsid-Umhüllungssequenzen, welche einen Teilbereich des Gens gag aufweisen (Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1639). Die hergestellten rekombinanten Retroviren werden anschließend mittels der herkömmlichen Techniken aufgereinigt.
Für die Durchführung der vorliegenden Erfindung ist es ganz besonders vorteilhaft, ein rekombinantes defektes Adenovirus zu verwenden. Die nachstehend aufgeführten Ergebnisse belegen in der Tat die besonders interessanten Eigenschaften der Adenoviren hinsichtlich der in vivo Expression eines Proteins mit Lipase-Aktivität. Die erfindungsgemäßen adenoviralen Vektoren sind besonders vorteilhaft für eine direkte in vivo Verabreichung einer aufgereinigten Suspension oder für die ex vivo Transformation von Zellen, insbesondere autologer Art, die dazu bestimmt sind, implantiert zu werden. Darüber hinaus weisen die erfindungsgemäßen adenoviralen Vektoren weitere wichtige Vorteile auf, wie etwa insbesondere ihre sehr hohe Infektionwirksamkeit, welche es ermöglicht, mit sehr geringen Volumina an Virussuspension eine Infektion zu erzielen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird erfindungsgemäß ein Adenovirus verwendet, das zusätzlich zu dem Gen, das für die Lipase codiert, ein Gen aufweist, das für ein Apolipoprotein codiert. Es handelt sich vorzugsweise um die hepatische Lipase und um ein Apolipoprotein, das aus apoA-I und apoA-IV gewählt ist. Die beiden Gene werden vorteilhafterweise in Form eines bicistronischen Konstrukts verwendet, welches gemäß der vorstehend beschriebenen Vorgehensweise in einen adenoviralen Vektor eingefügt wird, um ein Adenovirus, das ein einziges Gen aufweist, zu konstruieren. Vorteilhafterweise betrifft die Erfindung ein rekombinantes Adenovirus, das ein Gen aufweist, welches für die HL codiert, sowie ein Gen, welches für apoA-I codiert, wobei diese in die Region E1 eingefügt sind. Die Konstruktion von Adenoviren, die ein Gen aufweisen, welches für ein apo codiert, ist in der Anmeldung PCT/FR94/00422 beschrieben, die durch Literaturverweis in die vorliegende eingefügt ist.
Gemäß einer weiteren besonders vorteilhaften Durchführungsform der Erfindung wird eine Linie verwendet, die retrovirale Vektoren produziert, welche die Sequenz enthalten, die für die Lipase codiert, und zwar für eine in vivo Implantation. Bei den Linien, die zu diesem Zweck verwendet werden können, handelt es sich insbesondere um die Zellen PA317 ( US4,861,719 ), PsiCrip ( WO90/02806 ) und GP+envAm-12 ( US5,278,056 ), welche dahingehend modifiziert werden, dass sie die Produktion eines Retrovirus ermöglichen, der eine Nukleinsäuresequenz enthält, die für eine erfindungsgemäße Lipase codiert.
Vorteilhafterweise wird in den Vektoren der Erfindung die Sequenz, welche für die Lipase codiert, durch Signale gesteuert, die ihre Expression in den infizierten Zellen ermöglichen. Es kann sich um homologe Expressionssignale handeln oder auch um heterologe, das heißt um Signale, die sich von denjenigen, die natürlicherweise für die Expression der Lipase verantwortlich sind, unterscheiden. Es kann sich insbesondere um Sequenzen handeln, die für die Expression anderer Proteine verantwortlich sind, oder um synthetische Sequenzen. Insbesondere kann es sich um Sequenzen aus Eukaryoten- oder Virusgenen oder um abgeleitete Sequenzen handeln, welche die Transkription eines Gens anregen oder unterdrücken, und zwar auf spezifische oder unspezifische Weise und auf induzierbare oder nicht induzierbare Weise. Beispielsweise kann es sich um Promotorsequenzen handeln, die aus dem Genom der Zelle, die infiziert werden soll, oder aus dem Genom eines Virus stammen, und insbesondere um die Promotoren der Gene E1A, MLP von Adenoviren, um den Promotor CMV, LTR-CMV usw. Von den Eukaryoten-Promotoren wären weiterhin die ubiquitären Promotoren (HPRT, Vimentin, α-Actin, Tubulin usw.), die Promotoren der Intermediärfilamente (Desmin, Neurofilamente, Keratin, GFAP usw.), die Promotoren von therapeutischen Genen (des Typs MDR, CFTR, Faktor VIII usw.), die gewebespezifischen Promotoren (Pyruvatkinase, Villin, Promotor der intestinalen Fettsäurebindungsproteins, Promotor des α-Actins der Zellen der glatten Muskulatur, leberspezifische Promotoren; Apo AI, Apo AII, menschliches Albumin usw.) oder auch die Promotoren, die auf einen Stimulus ansprechen (Rezeptor der Steroidhormone, Rezeptor der Retinsäure usw.) zu nennen. Ferner können diese Expressionssequenzen durch Hinzufügen von Sequenzen zur Aktivierung, Regulierung usw. modifiziert werden. Wenn das eingefügte Gen keinerlei Expressionssequenzen aufweist, kann es weiterhin strangabwärts einer solchen Sequenz in das Genom des defekten Virus eingefügt werden.
In einer besonderen Ausführungsform betrifft die Erfindung ein rekombinantes defektes Virus, das eine Nukleinsäuresequenz umfasst, welche für eine Lipase codiert, die am Stoffwechsel der Lipoproteine beteiligt ist und von einem Promotor gesteuert wird, der aus dem LTR-RSV und dem frühen Promotor des CMV gewählt ist.
Mit noch größerem Vorzug umfasst die verwendete Nukleinsäuresequenz darüber hinaus Signale, welche eine Absonderung der Lipase durch die infizierten Zellen ermöglichen. Zu diesem Zwecke weist die Nukleinsäuresequenz im Allgemeinen, strangaufwärts der codierenden Sequenz, eine Signalsequenz auf, welche die synthetisierte Lipase in die Absonderungswege der infizierten Zelle lenkt. Bei dieser Signalsequenz kann es sich um die natürliche Signalsequenz der synthetisierten Lipase oder auch um jede andere funktionsfähige Signalsequenz in der infizierten Zelle oder um eine künstliche Signalsequenz handeln.
Wie vorstehend angegeben wurde, betrifft die vorliegende Erfindung weiterhin jedwede Verwendung eines Virus gemäß der obigen Beschreibung zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die dazu bestimmt ist, Erkrankungen, die mit Dyslipoproteinämien in Zusammenhang stehen, zu behandeln oder diesen vorzubeugen.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein oder mehrere rekombinante defekte Viren gemäß der obigen Beschreibung umfasst. Diese pharmazeutischen Zusammensetzungen können derart formuliert werden, dass sie auf topischem, oralem, parenteralem, intranasalem, intravenösem, intramuskulärem, subkutanem, intraokulärem, transdermalem usw. Wege verabreicht werden können. Vorzugsweise enthalten die pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung einen pharmazeutisch unbedenklichen Trägerstoff für eine Formulierung zur Injektion, insbesondere zur intravenösen Injektion, wie beispielsweise in die Pfortader des Patienten. Es kann sich insbesondere um sterile, isotonische Lösungen oder um trockene, insbesondere gefriergetrocknete Zusammensetzungen handeln, aus welchen gegebenenfalls durch Zusatz von sterilisiertem Wasser oder physiologischem Serum injizierbare Solvate zubereitet werden können. Die direkte Injektion in die Pfortader des Patienten ist vorteilhaft, da sie es ermöglicht, die Infektion gezielt an der Leber anzugreifen und auf diese Weise die therapeutische Wirkung auf dieses Organ zu konzentrieren.
Die Dosen an rekombinantem defektem Virus, die zur Injektion eingesetzt werden, können in Abhängigkeit verschiedener Parameter angepasst werden, und zwar insbesondere in Abhängigkeit vom viralen Vektor, vom angewendeten Verabreichungsweg, vom jeweiligen Krankheitsbild oder auch von der angestrebten Behandlungsdauer. Im Allgemeinen werden die erfindungsgemäßen rekombinanten Adenoviren in Form von Dosen formuliert und verabreicht, die zwischen 10⁴ und 10¹⁴ pfu/ml, vorzugsweise zwischen 10⁶ und 10¹⁰ pfu/ml, liegen. Der Begriff pfu ("plaque forming unit") entspricht dem Infektionsvermögen einer Viruslösung und wird bestimmt, indem eine geeignete Zellkultur infiziert wird, woraufhin, im Allgemeinen nach 48 Stunden, die Anzahl der Plaques mit infizierten Zellen gemessen wird. Die Techniken zur Bestimmung des pfu-Gehalts einer Viruslösung sind in der Literatur ausführlich beschrieben.
Was die Retroviren betrifft, so können die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen direkt die produzierenden Zellen enthalten, sodass diese implantiert werden können.
Diesbezüglich betrifft die Erfindung ferner jedwede Säugetierzelle, die mit einem oder mehreren rekombinanten defekten Viren gemäß der obigen Beschreibung infiziert ist. Insbesondere betrifft die Erfindung jedwede menschliche Zellpopulation, die mit diesen Viren infiziert ist. Es kann sich insbesondere um Fibroblasten, Myoblasten, Leberzellen, Keratinozyten, Endothelzellen, Gliazellen usw. handeln.
Die erfindungsgemäßen Zellen können aus primären Kulturen stammen. Diese können mittels jedweder Technik, die dem Fachmann bekannt ist, entnommen und anschließend unter Bedingungen, die ihre Vermehrung gestatten, angezüchtet werden. Wenn es sich insbesondere um Fibroblasten handelt, so können diese auf einfache Weise durch eine Biopsie erhalten werden, beispielsweise gemäß der Technik, die Ham [Methods Cell. Biol. 21a (1980) 255] beschrieben wurde. Diese Zellen können direkt zur Infektion mit den Viren eingesetzt werden, oder beispielsweise durch Einfrieren zwecks Erstellung autologer Banken konserviert werden, um später verwendet zu werden. Bei den erfindungsgemäßen Zellen kann es sich ferner um Sekundärkulturen handeln, die beispielsweise ausgehend von bereits erstellten Banken erhalten wurden (siehe beispielsweise EP 228458 , EP 289034 , EP 400047 , EP 456640 ).
Die angezüchteten Zellen werden anschließend mit den rekombinanten Viren infiziert, um ihnen die Fähigkeit zu verleihen, eine biologisch aktive Lipase zu produzieren. Die Infektion erfolgt in vitro gemäß den Techniken, die dem Fachmann bekannt sind. Insbesondere kann der Fachmann, je nach dem verwendeten Zelltyp und der angestrebten Anzahl von Viruskopien pro Zelle, die Multiplizität der Infektion und gegebenenfalls die Anzahl an Infektionszyklen anpassen. Es versteht sich, dass diese Schritte unter geeigneten Bedingungen hinsichtlich der Sterilität durchgeführt werden müssen, wenn die Zellen für eine in vivo Verabreichung bestimmt sind. Die Dosen an rekombinantem Virus, die für die Infektion der Zellen eingesetzt werden, können vom Fachmann gemäß dem angestrebten Ziel angepasst werden. Die vorstehend für eine in vivo Verabreichung beschriebenen Bedingungen können auf die in vitro Infektion angewendet werden. Für die Infektion mit Retroviren ist es ferner möglich, die Zellen, welche infiziert werden sollen, mit den Zellen, welche die erfindungsgemäßen rekombinanten Retroviren produzieren, gemeinsam in Kultur zu nehmen. Dadurch ist möglich, auf eine Aufreinigung der Retroviren zu verzichten.
Weiterhin betrifft die Erfindung ein Implantat, das Säuretierzellen, welche mit einem oder mehreren rekombinanten defekten Viren gemäß der obigen Beschreibung infiziert wurden, oder Zellen, welche rekombinante Viren produzieren, sowie eine extrazelluläre Matrix umfasst. Vorzugsweise umfassen die erfindungsgemäßen Implantate 10⁵ bis 10¹⁰ Zellen. Mit noch größerem Vorzug umfassen sie davon 10⁶ bis 10⁸.
In den Implantaten der Erfindung umfasst die extrazelluläre Matrix insbesondere eine gelbildende Verbindung und möglicherweise eine Trägervorrichtung, welche die Verankerung der Zellen ermöglicht.
Um die erfindungsgemäßen Implantate herzustellen, können verschiedenartige Gelbildner eingesetzt werden. Die Gelbildner werden dazu verwendet, die Zellen in einer Matrix von gelartiger Beschaffenheit einzuschließen und gegebenenfalls die Verankerung der Zellen auf der Trägervorrichtung zu begünstigen. Es also können verschiedenartige Zellhaftmittel als Gelbildner verwendet werden, wie etwa insbesondere Kollagen, Gelatine, Glycosaminglykane, Fibronektin, Lektine usw. Vorzugsweise wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung Kollagen verwendet. Es kann sich um Kollagen vom Menschen, vom Rind oder von der Maus handeln. Mit noch größerem Vorzug wird Kollagen des Typs I verwendet.
Wie vorstehend angegeben wurde, umfassen die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen vorteilhafterweise eine Trägervorrichtung, welche die Verankerung der Zellen ermöglicht. Der Begriff Verankerung bezeichnet jedwede Form von biologischer und/oder chemischer und/oder physikalischer Wechselwirkung, welche das Anhaften und/oder die Befestigung der Zellen auf dem Träger nach sich zieht. Ferner können die Zellen entweder den verwendeten Träger bedecken oder ins Innere dieses Trägers vordringen oder beides kann der Fall sein. Im Rahmen der Erfindung wird es bevorzugt, eine feststoffliche, ungiftige und/oder bioverträgliche Trägervorrichtung zu verwenden. Insbesondere können Polytetrafluorethylen(PTFE)-Fasern oder eine Trägervorrichtung biologischer Herkunft verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen Implantate können an verschiedenen Stellen des Organismus implantiert werden. Insbesondere kann die Implantation in der Bauchhöhle, in einem subkutanen Gewebe (suprapubischer Bereich, Becken- und Leistengruben usw.) in einem Organ, einem Muskel, einem Tumor, im zentralen Nervensystem oder auch in einer Schleimhaut erfolgen. Die erfindungsgemäßen Implantate sind besonders dahingehend von Vorteil, dass sie es ermöglichen, die Freisetzung der Lipase im Organismus zu steuern: sie wird zunächst durch die Multiplizität der Infektion und durch die Anzahl an implantierten Zellen bestimmt. Im Weiteren kann die Freisetzung entweder durch die Entnahme des Implantats gesteuert werden, wodurch die Behandlung endgültig beendet wird, oder durch die Verwendung regulierbarer Expressionssysteme, die es ermöglichen, die Expression der therapeutischen Gene zu induzieren oder zu unterdrücken.
Die vorliegende Erfindung stellt somit ein sehr wirkungsvolles Mittel bereit, das zur Behandlung von oder zur Vorbeugung gegen Erkrankungen, die mit Dyslipoproteinämien in Zusammenhang stehen, bestimmt ist, wobei es sich insbesondere um Fettleibigkeit und Hypertriglyceridämie oder, im Bereich der Herz- Kreislauf-Erkrankungen, um den Herzinfarkt, die Angina pectoris, den plötzlichen Tod, die kardiale Dekompensation und um Schlaganfälle handelt.
Darüber hinaus kann diese Behandlung sowohl den Menschen betreffen als auch ein beliebiges Tier wie etwa Schafe, Rinder, Haustiere (Hunde, Katzen usw.), Pferde, Fische usw.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele, die als erläuternd und nicht als einschränkend aufzufassen sind, ausführlicher beschrieben.
Legende der Figuren:
1: Struktur des Vektors pXL2418
2: Struktur des Vektors pXL2419
3: Struktur des Vektors pXL CMV-LPL
4: Struktur des Vektors pXL RSV-LPL
5: Struktur des Vektors pXL RSV-LPLc
Allgemeine Techniken der Molekularbiologie
Die herkömmlicherweise in der Molekularbiologie angewendeten Verfahren wie etwa die präparative Entnahme plasmidischer DNA, die Zentrifugation plasmidischer DNA mit Cäsiumchloridgradient, die Elektrophorese auf Agarose- oder Acrylamidgelen, die Aufreinigung von DNA-Fragmenten durch Elekroelution, die Proteinextraktion mit Phenol oder mit Phenol-Chloroform, die DNA-Fällung in salzhaltigem Milieu mittels Ethanol oder Isopropanol, die Transformation in Escherichia coli usw. sind dem Fachmann wohlbekannt und sind ausführlich in der Literatur beschrieben [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y., 1982; Ausubel F. M. et al. (Hrsg.), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987].
Die Plasmide des Typs pBR322, pUC und die Phagen der Reihe M13 wurden über den Handel bezogen (Bethesda Research Laboratories).
Für die Ligaturen können die DNA-Fragmente mittels Elektrophorese auf Agarose- oder Acrylamidgel nach ihrer Größe getrennt werden, woraufhin sie mit Phenol oder mit einer Phenol/Chloroform-Mischung extrahiert, mit Ethanol gefällt und anschließend in Gegenwart der DNA-Ligase des Phagen T4 (Biolabs) gemäß den Empfehlungen der Herstellers inkubiert werden.
Das Auffüllen der hervorstehenden 5'-Enden kann mittels des Kienow-Fragments der DNA-Polymerase von E. coli (Biolabs) gemäß den Spezifikationen des Herstellers durchgeführt werden. Das Entfernen der hervorstehenden 3'-Enden erfolgt in Gegenwart der DNA-Polymerase des Phagen T4 (Biolabs), welche gemäß den Empfehlungen des Herstellers verwendet wird. Das Entfernen der hervorstehenden 5'-Enden erfolgt durch eine schonende Behandlung mit der Nuklease S1.
Die gelenkte in vitro Mutagenese mittels synthetischer Oligodesoxynukleotide kann gemäß dem Verfahren, das von Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749–8764] entwickelt wurde, durchgeführt werden, und zwar unter Verwendung des Kits, das von Amersham vertrieben wird.
Die enzymatische Verstärkung von DNA-Fragmenten mit Hilfe des als PCR bezeichneten Verfahren [Polymerase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R. K. et al., Science 230 (1985) 1350–1354; Mullis K. B. und Faloona F. A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335–350] kann unter Einsatz eines "DNA thermal cycler"-Geräts (Perkin Elmer Cetus) gemäß den Spezifikationen des Herstellers durchgeführt werden.
Die Überprüfung der Nukleotidsequenzen kann mittels des Verfahrens, das von Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463–5467] entwickelt wurde, durchgeführt werden, und zwar unter Verwendung des Kits, das von Amersham vertrieben wird.
Beispiele
Beispiel 1. Konstruktion des Vektors pXL2418, der das Gen trägt, welches für die LPL codiert und vom frühen Promotor des Cytomegalovirus (CMV) gesteuert wird (1).
Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion eines Vektors, der eine cDNA-Sequenz, welche für die LPL codiert und von einem Promotor gesteuert wird, der aus dem frühen Promotor des Cytomegalovirus (CMV) besteht, umfasst sowie eine Region des Genoms des Adenovirus Ad5, welche die homologe Rekombination ermöglicht. Dieser Vektor wurde wie nachstehend beschrieben konstruiert.
1.1. Konstruktion des Vektors pXL2375:
Der Vektor pXL2375 enthält insbesondere eine Region des Genoms des Adenovirus Ad5 und eine DNA-Sequenz, die für das Apolipoprotein A1 codiert und vom Promotor CMV gesteuert wird. Insbesondere erstreckt sich der verwendete Promotor CMV bis zur 5'-Donor-Spleißstelle in Verbindung mit den am stärksten in Richtung 3' gelegenen 107 bp des synthetischen Introns, das von O'Gorman et al. (Science 251 (1991) 1351) beschrieben wurde. Die Konstruktion dieses Vektors ist ausführlich in der ebenfalls anhängigen Anmeldung FR 93 05125 beschrieben. Es versteht sich, dass der Fachmann ähnliche Konstruktionen erstellen kann.
1.2. Konstruktion einer cDNA-Sequenz, die für die LPL codiert.
Das Plasmid pHLPL 26-1, das von Wion et al. (Science 235 (1987) 1638–1641) beschrieben wurde, enthält eine unvollständige Sequenz der cDNA der LPL. Dieses Plasmid enthält die Basen 272 bis 1623 der cDNA der LPL, wobei die Basen in zwei EcoRI-Stellen eingerahmt sind und an die EcoRI-Stelle eines Plasmids pGEM1 (Promega) kloniert wurden.
Das EcoRI-Fragment von pHLPL 26-1, welches Teile der cDNA der LPL enthält, ist erneut an die EcoRI-Stelle eines Plasmids pMTL22 (Chambers et al, Gens, 1988, 68: 138–149) kloniert worden, wobei es derart ausgerichtet wurde, dass die 5'-Basen der cDNA auf der Seite der BgIII-Stelle von pMTL22 liegen. Das erhaltene Plasmid wurde als pXL2402 bezeichnet.
Anschließend wurden die RNA des menschlichen Fettgewebes gemäß der Technik von Chromczynski et Sacchin (Anal. Biochem. 162 (1987) 156–159) extrahiert. Ausgehend von dieser RNA-Zubereitung wurde eine Verstärkung mittels RT-PCR durchgeführt, um den fehlenden Teil des cDNA der LPL zu isolieren. Zu diesem Zwecke wurden die folgenden Primer verwendet:
Dieser Primer ermöglicht es, eine BgIII-Stelle sowie eine ClaI-Stelle strangaufwärts des ATG einzufügen.
Das PCR-Fragment von 260 pb, das nach 25 Verstärkungszyklen erhalten wurden, ist anschließend in das Plasmid pCR-II (Invitrogen) kloniert und zur Überprüfung sequenziert worden. Es ist anschließend an den Stellen BgIII-Stelle und NcoI in den Vektor pXL2402 eingefügt worden, wodurch eine vollständige cDNA wiedergestellt wird, der eine ClaI-Stelle vorangeht und der eine SalI-Stelle folgt. Das Plasmid, welches sich daraus ergibt, wurde als pXL2417 bezeichnet.
1.3. Konstruktion des Vektors pXL2418.
Die cDNA der LPL ist schließlich in das Plasmid pXL2375 eingefügt worden, und zwar zwischen den Stellen SalI und ClaI, nachdem es mittels derselben beiden Enzyme aus der cDNA des Apo A1 herausgeschnitten wurde. Das erhaltene Plasmid wurde als pXL2418 bezeichnet (1).
Beispiel 2. Konstruktion des Vektors pXL2419, der das Gen trägt, welches für die LPL codiert und vom Promotor des LTR des Rous-Sarkom-Virus (LTR-RSV) gesteuert wird (2).
Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion eines Vektors, der eine cDNA-Sequenz, welche für die LPL codiert und von einem Promotor gesteuert wird, der aus dem LTR des Rous-Sarkom-Virus (LTR-RSV) besteht, umfasst sowie eine Region des Genoms des Adenovirus Ad5, welche die homologe Rekombination ermöglicht. Dieser Vektor wurde wie nachstehend beschrieben konstruiert.
2.1. Konstruktion des Vektors pXL2244:
Der Vektor pXL2244 enthält insbesondere eine Region des Genoms des Adenovirus Ad5 und eine DNA-Sequenz, die für das Apolipoprotein A1 codiert und vom Promotor LTR-RSV gesteuert wird.
2.2. Konstruktion einer cDNA-Sequenz, die für die LPL codiert.
Bei der in diesem Beispiel verwendeten cDNA-Sequenz, die für die LPL codiert, handelt es sich um diejenige, die in Beispiel 1.2 beschrieben ist.
2.3. Konstruktion des Vektors pXL2419.
Die cDNA der LPL ist in das Plasmid pXL2244 eingefügt worden, und zwar zwischen den Stellen SalI und ClaI, nachdem es mittels derselben beiden Enzyme aus der cDNA des Apo A1 herausgeschnitten wurde. Das erhaltene Plasmid wurde als pXL2419 bezeichnet (2).
Beispiel 3: Konstruktion der Vektoren pXL RSV-LPL und pXL CMV-LPL
Der Vektor pRC-CMV LPL enthält ein cDNA-Fragment der LPL, welches sich von den Basen 1 bis 2388 der Sequenz erstreckt, die von Wion et al. beschrieben wurde und die an die HindIII und XbaI des Expressionsvektors pRC-CMV (Invitrogen). Die HindIII-Stelle ist zu einer ClaI-Stelle umgestaltet worden, indem das Oligonukleotid AGC TAC ATC GAT GT (SEQ ID Nr. 3) eingefügt wurde. Die cDNA der LPL und die Polyadenylierungsstelle des bovinen Wachstumshormons (ursprünglich in pRC-CMV enthalten) werden schließlich durch einen SphI-Schnitt, eine Behandlung mit der T4-Polymerase und einen ClaI-Schnitt aus dem pRCMV LPL extrahiert. Das auf diese Weise erhaltene Fragment wird in die Vektoren pXL2418 (Beispiel 1) und pXL2419 (Beispiel 2) kloniert, welche mit ClaI und EcoRV geschnitten wurden, wodurch die Vektoren pXL CMV-LPL (3) und pXL RSV-LPL (4) erhalten werden.
Beispiel 4: Konstruktion des Vektors pXL RSV-LPLc.
In diesem Beispiel wird die Konstruktion eines Vektors beschrieben, der verwendet werden kann, um rekombinante Viren zu erzeugen, die eine kurze cDNA enthalten, welche für die LPL codiert.
Eine kürzere cDNA (Basen 146 bis 1635 der Sequenz von Wion et al.) ist ausgehend von den RNA des menschlichen Fettgewebes kloniert worden. Es wurden die Primer ATC GGA TCC ATC GAT GCA GCT CCT CCA GAG GGA CGC (SEQ ID Nr. 4) und ATC TCT AGA GTC GAC ATG CCG TTC TTT GTT CTG TAG (SEQ ID Nr. 5) verwendet, welche bei 5' der cDNA eine BamHI-Stelle beziehungsweise eine ClaI-Stelle schaffen sowie bei 3' der cDNA der LPL eine XbaI-Stelle und eine SalI-Stelle.
Dieses PCR-Fragment wird in PCR II kloniert, und seine Sequenz wird vollständig überprüft. Die cDNA der LPL wird an den Stellen BamHI und XbaI wieder herausgetrennt und in einen Expressionsvektor pcDNA3 (Invitrogen) kloniert, um die Expression zu überprüfen, wobei das Plasmid pcDNA3-LPLc entsteht.
Das Fragment ClaI-SalI, welches die cDNA der LPL enthält, wird schließlich an denselben Stellen in das Plasmid pXL RSV-LPL (Beispiel 3) kloniert, um das Shuttle-Plasmid pXL RSV-LPLc (5) zu schaffen.
Beispiel 5: Funktionsfähigkeit der Vektoren der Erfindung: Nachweis einer LPL-Aktivität.
Die Fähigkeit der Vektoren der Erfindung, in Zellkultur eine biologisch aktive Form der LPL zu exprimieren, ist durch die transiente Transfektion von Zellen des Typs 293 oder CosI aufgezeigt werden. Zu diesem Zwecke wurden die Zellen (2·10⁶ Zellen pro Schale mit 10 cm Durchmesser) in Gegenwart von Transfectam transfiziert (8 μg an Vektor). Die Expression der Sequenz, die für die LPL codiert, sowie die Herstellung eines biologisch aktiven Proteins werden entweder mit Hilfe eines enzymatischen Immunassays (5.1.) anhand der Masse oder aber anhand der Lipase-Aktivität (5.2.) nachgewiesen.
5.1. Messung der LPL anhand der Masse
Eine ELISA-Platte des Typs Immulon I (Dynatech) wird mit bovinen monoklonalen anti-LPL-Antikörpern belegt, welche eine Kreuzreaktion mit der menschlichen LPL zeigen (20 μg/ml in PBS, 50 μl/Vertiefung). Die potentiellen Stellen, die in den Vertiefungen verbleiben, werden anschließend blockiert (gesättigt), indem in Gegenwart von 1%iger Gelatine 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert wird. Die zu messenden Proben werden anschließend 1 Stunde lang bei 37°C inkubiert.
Die Entwicklung erfolgt mit einem auf 10 μg/ml verdünnten anti-LPL-Serum, 100 μl/Vertiefung, und dann mit einem peroxidasemarkierten Antiserum. Die Peroxidase-Aktivität wird mit Hilfe eines TMB-Substrats (Kit von Kirkegaard und Perry Laboratories inc.) nachgewiesen, wobei die Absorption bei 490 nm abgelesen wird.
5.2. Messung der LPL-Aktivität
Die Lipase-Gesamtaktivität wird anhand eines Substrats gemessen, das aus der Emulsion von 0,3 mg an Triolein (Sigma), 75 nCi an Glycerin (55 mCi/mmol, Amersham), 18 mg an BSA (Fraktion V, Sigma), 25 μl an normalem menschlichen Plasma als ApoCII-Quelle besteht, wobei sich das Ganze in einem Endvolumen von 500 μl TRIS, 0,223 M, pH-Wert 8,5 befindet. Im Allgemeinen wird die Messung der Aktivität an 100 μl Überstand von transfizierten Zellen oder an 50 μl Postheparin-Plasma vorgenommen.
Nach einer Inkubationszeit von 1 Stunde bei 37°C wird die Reaktion durch Zugabe von 3,25 ml an Extraktionspuffer (Chloroform/Methanol/Heptan, 10:9:7, (v/v/v)) sowie 0,75 ml an Carbonat/Borat-Puffer mit pH 10,5 abgebrochen, und die organische Phase wird einem Zählverfahren unterzogen, um die Menge an freigesetzten Fettsäuren zu bestimmen.
Um die Aktivität zu bestimmen, die spezifisch mit der LPL in Verbindung steht, wird die hepatische Lipaseaktivität in Gegenwart einer Konzentration von 1 M an NaCl bestimmt (zur Hemmung der LPL) und anschließend von der Gesamtaktivität abgezogen. Es ist weiterhin möglich, die Aktivität der Lipoproteinlipase durch einen spezifischen monoklonalen Antikörper zu hemmen (Babirak et al., Atheriosclerosis, 1989, 9: 326–334).
Die Plasmide pXL RSV-LPL und pXL CMV-LPL sind durch Transfektion in die CosI-Zellen geprüft worden, wobei ein Vergleich mit dem Plasmid pRC CMV-LPL vorgenommen wurde. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 1 aufgeführt. Tabelle 1

Expressionsvektor Aktivität im Überstand Tag 2

pRC-CMV-LPL 24,5

pXL RSV-LPL 15,1

pXL CMV-LPL 22,9
Das Plasmid pcDNA-LPLc ist durch Transfektion in die Zellen 293 geprüft worden, wobei ein Vergleich mit einem Expressionsvektor pcDNA3, welcher die gleiche cDNA enthält wie der Vektor pRC-CMV-LPL, vorgenommen wurde. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 2 aufgeführt. Tabelle 2

Expressionsvektor Aktivität im Überstand Tag 1 Aktivität im Überstand Tag 2

pcDNA3-LPL 106,4 mU/ml 106,7 mU/ml

pcDNA3-LPLc 114 mU/ml 109,6 mU/ml
Beispiel 6. Konstruktion eines rekombinanten Adenovirus Ad-CMV.LPL, der eine Sequenz enthält, welche für die Lipase LPL codiert
Die Plasmide, die in den Beispielen 1 bis 4 hergestellt worden sind, werden linearisiert und zur Rekombination mit dem fehlerhaften adenoviralen Vektor in die helper-Zellen (Linie 293) co-transfiziert, wodurch die Funktion, für welche die Adenovirusregionen E1 (E1A und E11B) codieren, in die trans-Form überführt werden.
Insbesondere wird das Adenovirus Ad.CMV.LPL durch homologe Rekombination in vivo zwischen dem Adenovirus Ad.RSVβgal (Stratford-Perricaudet et al., J. Clin. Invest 90 (1992) 626) und dem Plasmid pXL2418 oder pXL CMV-LPL gemäß der folgenden Vorgehensweise erhalten: Das linearisierte Plasmid pXL2418 oder pXL CMV-LPL und das mittels ClaI linearisierte Adenovirus Ad.RSVβgal werden in die Linie 293 co-transfiziert, und zwar in Gegenwart von Calciumphosphat, um die homologe Rekombination zu ermöglichen. Die auf diese Weise geschaffenen rekombinanten Adenoviren werden durch Aufreinigung auf einer Platte selektiert. Nach der Isolierung wird das rekombinante Adenovirus in der Zelllinie 293 verstärkt, wodurch ein Kulturüberstand erhalten wird, der einen Gehalt von ungefähr 10¹⁰ pfu/ml an nicht-aufgereinigtem rekombinantem defektem Adenovirus aufweist.
Die viralen Partikel werden anschließend durch Zentrifugation mit Cäsiumchloridgradient gemäß bekannten Techniken aufgereinigt (siehe insbesondere Graham et al., Virology 52 (1973) 456). Das Adenovirus Ad-CMV.LPL kann bei –80°C in 20% Glycerin aufbewahrt werden.
Dieselbe Vorgehensweise wird bei dem Plasmid pXL2419 oder pXL RSV-LPL oder pXL RSV-LPLc erneut angewendet, wodurch das rekombinante Adenovirus Ad.RSV.LPL oder Ad.RSV.LPLc entsteht.
Beispiel 7 : in vivo Übertragung des Gens LPL durch ein rekombinantes Adenovirus.
In diesem Beispiel wird die in vivo Übertragung des Gens LPL mittels eines erfindungsgemäßen adenoviralen Vektors beschrieben.

Bei den injizierten Adenoviren handelt es sich um die Adenoviren Ad-CMV.LPL und Ad.LTR.LPL, die in Beispiel 5 hergestellt wurden und in aufgereinigter Form (3,5 10⁶ pfu/ml) in einer salzhaltigen Phosphatlösung (PBS) verwendet werden. Diese Virus werden der C57B1/6-Maus intravenös injiziert, wobei die Vene des Schwanzes, der retroorbitale Sinus oder die Pfortader verwendet werden. Die Expression einer aktiven Form der LPL wird unter den Bedingungen, die in Beispiel 5 beschrieben sind, nachgewiesen. LISTE DER SEQUENZEN

Schlüssel zu den Figuren Figuren

Texte source (français)	Zieltext (Deutsch)

Figure 1	Figur 1
promoteur CMV + intron	Promotor CMV + Intron
site de polyadenylation de SV40 + intron t	Polyadenylierungsstelle von SV40 + Intron t
Figure 2	Figur 2
promoteur LTR-RSV	Promotor LTR-RSV
site de polyadenylation de SV40 + intron t	Polyadenylierungsstelle von SV40 + Intron t
Figure 3 à 5	Figur 3 bis 5
ADNc de la LPL	cDNA der LPL
site de polyadenylation de bGH	Polyadenylierungsstelle von bGH

Claims

Rekombinantes defektes Virus, mit Ausnahme des Phagemids CDM8, welches eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die für einen Teil oder die Gesamtheit der Lipoproteinlipase (LPL) oder eines Derivats derselben codiert.
Virus, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA-Sequenz eine cDNA-Sequenz ist.
Virus nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA-Sequenz eine gDNA-Sequenz ist.
Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA-Sequenz für menschliche LPL kodiert.
Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA-Sequenz der Steuerung durch Signale unterstellt ist, die ihre Expression in den infizierten Zellen ermöglichen.
Virus nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Expressionssignale aus viralen Promotoren ausgewählt sind.
Virus nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Expressionssignale aus den Promotoren E1A, MLP, CMV und LTR-RSV ausgewählt sind.
Defektes rekombinantes Virus, umfassend eine für Lipoproteinlipase kodierende cDNA-Sequenz, die von einem Promotor gesteuert ist, der aus dem Promotor LTR-RSV und dem frühen CMV-Promotor ausgewählt ist.
Virus nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Sequenz umfasst, die das Hinleiten der Lipoproteinlipase in die Sekretionswege der infizierten Zelle ermöglicht.
Virus nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Sekretionssequenz die native Sequenz der Lipoproteinlipase ist.
Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass sein Genom keine Regionen umfasst, die für seine Replikation in der Zielzelle notwendig sind.
Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass sein Genom keine Regionen umfasst, die für seine Replikation in der Zielzelle notwendig sind.
Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein Adenovirus handelt.
Virus nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein humanes Adenovirus Typ Ad2 oder Ad5 oder um ein canines Adenovirus vom Typ CAV-2 handelt.
Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein adeno-assoziiertes Virus handelt.
Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein Retrovirus handelt.
Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein Herpesvirus (HSV) handelt.
Verwendung eines Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 16 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zum Zweck der Behandlung und/oder der Vorbeugung von Krankheiten, die mit Dyslipoproteinämien in Zusammenhang stehen.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein oder mehrere defekte rekombinante Viren nach einem der Ansprüche 1 bis 16.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass diese in injizierbarer Form vorliegt.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, dass diese zwischen 10⁴ und 10¹⁴ pfu/ml, vorzugsweise 10⁸ bis 10¹⁰ pfu/ml defekte rekombinante Adenoviren umfasst.
Isolierte Zelle eines Säugetiers, die mit einem oder mehreren defekten rekombinanten Viren nach einem der Ansprüche 1 bis 16 infiziert ist.
Zelle nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine menschliche Zelle handelt.
Implantat, umfassend Zellen nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass die extrazelluläre Matrix eine Gelierverbindung umfasst, die vorzugsweise aus Collagen, Gelatine, Glykosaminglykanen, Fibronektin und Lektinen ausgewählt ist.
Implantat, umfassend Zellen nach Anspruch 22, oder Implantat nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass die extrazelluläre Matrix zudem einen Träger umfasst, der die Verankerung der infizierten Zellen ermöglicht.
Implantat nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger vorzugsweise aus Polytetrafluorethylenfasern besteht.
Defektes rekombinantes Adenovirus nach Anspruch 12, ferner umfassend ein Gen, das für ein Apolipoprotein kodiert.