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Die
vorliegende Erfindung betrifft rekombinante Vektoren viralen Ursprungs,
deren Herstellung und deren Verwendung, insbesondere zur Behandlung
von und/oder Vorbeugung gegen Erkrankungen, die mit Dyslipoproteinämien in
Zusammenhang stehen. Insbesondere betrifft sie rekombinante Viren,
die eine DNA-Sequenz aufweisen, welche für eine Lipase codieren, die
am Lipoproteinstoffwechsel beteiligt ist. Die Erfindung betrifft
weiterhin die Herstellung dieser Vektoren sowie pharmazeutische
Zusammensetzungen, in denen diese enthalten sind, und deren therapeutische
Verwendung, insbesondere in der Gentherapie.
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Dyslipoproteinämien sind
Störungen
im Stoffwechsel derjenigen Lipoproteine, die für den Transport von Lipiden
wie etwa von Cholesterin und Triglyceriden im Blut und in den peripheren
Flüssigkeiten
verantwortlich sind. Sie führen
zu schweren Erkrankungen, die mit zu hohen Cholesterin- beziehungsweise
Triglyceridwerten in Zusammenhang stehen, wie etwa insbesondere
zu Arteriosklerose. Arteriosklerose ist eine komplexe Krankheit
mit mehreren Ursachen, die in histologischer Hinsicht derart definiert
ist, dass die Wand von dicken Arterien (Aorta, Koronararterien,
Halsschlagadern) Ablagerungen (lipidische oder fibrin-lipidische Plaques)
aus Lipiden und anderen Blutderivaten aufweist. Diese Plaques, die
je nach dem Voranschreiten des Prozesses mehr oder weniger verkalkt
sind, können
gemeinsam mit Läsionen
auftreten und stehen mit dem gehäuften
Auftreten von Fettablagerungen, die sich im Wesentlichen aus Cholesterinestern
zusammensetzen, in den Arterien in Zusammenhang. Mit diesen Plaques
geht eine Verdickung der Arterienwand einher, wobei es zu einer
Hypertrophie der glatten Muskulatur sowie zum Auftreten von Schaumzellen
und einer Ansammlung von fibrinhaltigem Gewebe kommt. Die Plaques
ragen sehr deutlich aus der Arterienwand heraus, weshalb sie eine
gefäßverengende
Wirkung ausüben,
die für
Gefäßverschlüsse durch
die Plaques selbst, durch Thromben oder Embolien verantwortlich
sind, welche bei den am stärksten
betroffenen Patienten auftreten können. Dyslipoproteinämien können somit
zu sehr schweren Herz-Kreislauf-Erkrankungen
wie etwa zum Infarkt, zum plötzlichen
Tod, zur kardialen Dekompensation, zu Schlaganfällen usw. führen.
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Gegenwärtig werden
diese Krankheitsbilder, und insbesondere der erhöhte Cholesterinspiegel, im Wesentlichen
mit Hilfe von Verbindungen behandelt, die entweder in die Biosynthese
des Cholesterins eingreifen (Hydroxymethylglutaryl-Coenzym-A-Reductase,
Stative) oder das Gallencholesterin abfangen und entfernen (Abfangmittel
oder Austauschharze) oder aber die Lipolyse über einen Mechanismus beeinflussen,
der auf molekularer Ebene noch aufzuklären ist (Fibrate). Somit sprechen
sämtliche
Hauptarzneimittelgruppen, die bei dieser Indikation eingesetzt werden
(Abfangmittel, Fibrate oder Statine) lediglich den Aspekt der Vorbeugung gegen
die Bildung von arterieller Plaque an, ohne jedoch die krankhaften
Ablagerungen in den Arterien selbst zu behandeln. Die gegenwärtigen Ansätze zur
Behandlung arterieller Plaque infolge einer akuten koronaren Herzkrankheit
haben lediglich eine lindernde Wirkung, denn sie wirken nicht auf
die Selbstregulation des Cholesterins und stellen chirurgische Eingriffe
dar (koronarer Bypass, Angioplastie).
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Die
vorliegende Erfindung stellt eine neue therapeutische Herangehensweise
in der Behandlung von Erkrankungen, die mit Dyslipoproteinämien in
Zusammenhang stehen, dar. Mit Hinblick auf die Nachteile, die gemäß dem Stand
der Technik bestehen, stellt sie eine vorteilhafte Lösung dar,
indem die aufzeigt, dass es möglich
ist, die Erkrankungen, welche mit Dyslipoproteinämien in Zusammenhang stehen,
mittels einer Gentherapie zu behandeln, und zwar durch die Übertragung
und die in-vivo-Expression eines Gens, das für eine Lipase codiert, die
am Stoffwechsel der Lipoproteine beteiligt ist. Die Erfindung stellt
somit ein einfaches Mittel bereit, welches es ermöglicht,
diese Erkrankungen auf spezifische und wirkungsvolle Weise zu behandeln.
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Die
Gentherapie besteht darin, einen Mangel oder eine Anomalie (Mutation,
fehlgeleitete Expression, usw.) zu korrigieren oder die Expression
eines Proteins von therapeutischem Nutzwert zu gewährleisten,
indem eine genetische Information in die Zelle oder das betroffene
Organ eingeführt
wird. Diese genetische Information kann entweder ex vivo in eine
Zelle eingeführt
werden, die dem Organ entnommen wurde, woraufhin die modifizierte
Zelle wieder in den Organismus eingeführt wird, oder sie kann direkt
in vivo in das geeignete Gewebe eingeführt werden. Für den zweiten
Fall existieren verschiedenartige Techniken, unter anderem die unterschiedlichen
Transfektionstechniken, bei denen Komplexe aus DNA und DEAE-Dextran
(Pagano et al., J. Virol. 1 (1967) 891), aus DNA und Zellkernproteinen
(Kaneda et al., Science 243 (1989) 375), aus DNA und Lipiden (Felgner
et al., PNAS 84 (1987) 7413) sowie Liposome (Fraley et al., J. Biol.
Chem. 255 (1980) 10431), etc. zum Einsatz kommen. In jüngerer Zeit
wurde der Einsatz von Viren als Vektoren für die Übertragung von Genen als eine
vielversprechende Alternative zu diesen physikalischen Transfektionstechniken
beschrieben. Diesbezüglich
sind verschiedenartige Viren auf ihre Fähigkeit zur Infektion bestimmter
Zellpopulationen untersucht worden. Insbesondere handelt es sich
um Retroviren (RSV, HMS, MMS usw.), um das HSV-Virus, um die adeno-assoziierten Viren
und um die Adenoviren.
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Die
vorliegende Erfindung stellt einen neuen therapeutischen Ansatz
zur Behandlung von Erkrankungen, die mit Dyslipoproteinämien in
Zusammenhang stehen, dar, welcher darin besteht, Gene in vivo zu
exprimieren, die für
Lipasen codieren, welche am Stoffwechsel der Lipoproteine beteiligt
sind. Auf besonders vorteilhafte Weise hat die Anmelderin jetzt
gezeigt, dass es möglich
ist, rekombinante Viren zu konstruieren, die eine DNA-Sequenz enthalten,
welche für
eine Lipase codiert, die am Stoffwechsel der Lipoproteine beteiligt ist,
sowie diese rekombinanten Viren in vivo zu verabreichen, und dass
es die Verabreichung ermöglicht,
eine stabile und wirkungsvolle Expression einer biologisch in vivo
aktiven Lipase zu erzielen, und zwar ohne zytopathologische Wirkungen.
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Die
vorliegende Erfindung beruht weiterhin auf dem Nachweis, dass die
Adenoviren besonders wirkungsvolle Vektoren für die Übertragung und die Expression
derartiger Gene darstellen. Insbesondere zeigt die vorliegende Erfindung,
dass es die Verwendung rekombinanter Adenoviren als Vektoren ermöglicht,
dass die Gene ausreichend stark exprimiert werden, um die angestrebte
therapeutische Wirkung zu erzielen.
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Die
vorliegende Erfindung stellt somit eine neue Herangehensweise bei
der Behandlung und Vorbeugung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen und
neurologischen Erkrankungen, die mit Dyslipoproteinämien in
Zusammenhang stehen, dar.
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Eine
erste Aufgabe der Erfindung besteht folglich darin, ein rekombinantes
defektes Virus bereitzustellen, das eine Nukleinsäuresequenz
enthält,
die für
eine Lipoproteinlipase (LPL) codiert, welche am Stoffwechsel der
Lipoproteine beteiligt ist.
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Die
Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung eines solchen rekombinanten
defekten Adenovirus für die Herstellung
einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die zur Behandlung von und/oder
Vorbeugung gegen Herz-Kreislauf-Erkrankungen
bestimmt ist.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung von Zellen,
die durch ein Virus gemäß der obigen
Beschreibung ex vivo genetisch verändert wurden, oder von Zellen,
die derartige Viren produzieren, wobei die Zellen in den Organismus
implantiert werden, wodurch eine lang andauernde und wirkungsvolle
in vivo Freisetzung einer biologisch aktiven Lipase ermöglicht wird.
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Die
Lipoproteinlipase (LPL) ist ein Enzym, mittels dessen die Triglyceride,
welche in den Lipoproteinen von sehr geringer Dichte (VLDL) oder
in den Chylomikronen enthalten sind, hydrolysiert können. Das
Apolipoprotein CII, welches sich auf der Oberfläche dieser Partikel befindet,
kommt bei dieser Hydrolyse als Co-Faktor zu Einsatz. Natürlicherweise
wird die LPL hauptsächlich
von den Adipozyten in Form einer monomeren Vorläufersubstanz von 51 kDa synthetisiert,
die anschließend
glykosyliert wird (58 kDa). Im Blut ist die LPL in Form eines Dimers
aktiv. Bis zu 80% des frisch synthetisierten LPL wird im lysomalen
Kompartiment abgebaut, bevor es abgesondert werden kann. Nach der
Absonderung wird die LPL von der lumenseitigen Fläche der
Zellen des Gefäßendothels
abgefangen, wo sie über
Glycosaminglykane andockt. Sie hat eine sehr starke Affinität zum Heparin,
aufgrund derer es möglich
ist, die LPL von ihrer Andockstelle an die Oberfläche der
Endothelzelle zu bringen. Mittels einer intravenösen Injektion von Heparin kann
bei Patienten die Konzentration und die Aktivität von LPL gemessen werden.
Die LPL wird bei Gefäßzellen,
aber auch bei Leberzellen zum Abfangen von Lipoproteinen verwendet,
wobei letztere verstärkt
auf der Zelloberfläche
zurückgehalten
werden, wodurch das Abfangen oder die Modifizierung derselben begünstigt wird.
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Die
cDNA, welche für
die menschliche LPL codiert, ist kloniert und sequenziert worden
(Wion et al, Science 235 (1987) 1638–1641). Es gibt zwei gleichzeitig
vorkommende Messengerformen mit 3350 und 3750 Basen, hauptsächlich im
Fett- und Muskelgewebe, die aus der Verwendung zweier Polyadenylierungsstellen hervorgehen.
Sie umfassen eine lange, nicht translatierte 3'-Sequenz und codieren für ein Präprotein
von 475 aa, von welchem eine Leadersequenz von 27 aa abgespalten
wird, um das ausgereifte monomere Protein mit 448 Resten zu bilden.
Das Gen der LPL ist ebenfalls kloniert worden (Kirchgessner et al,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, 262: 9647–9651). Die Synthese, die Aufarbeitung
und die Absonderung der LPL werden während der Entwicklung auf komplexe
Weise gesteuert, und zwar als Antwort auf hormonale Stimuli. Ein
erheblicher Teil dieser Steuerung erfolgt auf der Ebene der Transkription.
(Übersichtsartikel
in Auwerx et al., Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences,
1992, 29: 243–268).
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Die
vorliegende Erfindung zeigt, dass es möglich ist, eine DNA-Sequenz,
die für
die LPL codiert, in einen viralen Vektor einzufügen, und dass diese Vektoren
es ermöglichen,
eine ausgereifte, biologisch aktive (dimere) Form der LPL auf wirkungsvolle
Weise zu exprimieren und abzusondern. Insbesondere zeigt die Erfindung,
dass die in vivo-Expression der aktiven LPL erzielt werden kann,
indem ein Adenovirus direkt verabreicht wird oder indem eine Zelle,
die sie produziert oder genetisch durch ein Adenovirus verändert wurde,
implantiert wird oder aber durch ein Retrovirus, welches eine solche
DNA umfasst.
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Die
Vektoren der Erfindung können
insbesondere dazu verwendet werden, Mangelerscheinungen an LPL,
die auf Mutationen in dem LPL-Gen zurückzuführen sind, zu korrigieren.
Derartige Mangelerscheinungen sind relativ häufig und können in bestimmten Populationen
eine Prävalenz
von 1:5000 bis 1:10000 erreichen (S. Santamarina-Fojo, 1992, Cur.
Op. lipid., 3: 186–195).
Diese Mangelerscheinungen ergeben sich durch eine ausgeprägte Mutation
des Gens, welche dazu führt,
dass keine LPL-Synthese stattfindet oder dass ein trunkiertes oder
stark verändertes
Protein synthetisiert wird. Es ist in der Tat gezeigt worden, dass
bei bestimmten Kranken Mutationen des Typs Insertion, Deletion oder
non-sens vorliegen (Übersichtsartikel
in S. Santamarina-Fojo, 1992, Cur. Op. lipid., 3: 186–195). Sie
können
sich ebenfalls aus einem Fehler auf der Ebene der katabolen Stelle
ergeben, welcher auf missense-Mutationen des Gens zurückzuführen sein
kann. Sie können sich
weiterhin aus Modifikationen sowohl auf der Ebene der Heparin-Bindungsstelle als
auch auf der Ebene der katalytischen Stelle ergeben. Im heterozygoten
Stadium können
diese Mangelerscheinungen einen beträchtliche Teil der auf weitesten
verbreiteten Hyperlipidämien
ausmachen, zu denen die familienbedingten Hypertriglyceridämien, die
kombinierten familienbedingten Hyperlipidämien und die postprandialen
Hyperlipidämien
zählen.
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Die
vorliegende Erfindung ist besonders vorteilhaft, denn sie ermöglicht es,
in Organen, welche normalerweise nicht von der LPL-Expression betroffen
sind, eine Expression dieses Proteins einzuleiten, die kontrolliert
ist und keine schädlichen
Wirkungen ausübt.
Insbesondere wird eine uneingeschränkt vorteilhafte Freisetzung
erzielt, indem Zellen, welche Vektoren der Erfindung produzieren
oder welche ex vivo mit Vektoren der Erfindung infiziert wurden,
implantiert werden.
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Hinsichtlich
der Lipaseaktivität,
die im Rahmen der vorliegenden Erfindung erzeugt wird, kann es sich um
eine menschliche oder eine tierische Lipase handeln.
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Bei
der Nukleinsäuresequenz,
die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann es sich
um eine cDNA, eine genomische DNA (gDNA) eine RNA (im Falle der
Retroviren) oder aber um ein Hybridkonstrukt handeln, das beispielsweise
aus einer cDNA, in welche ein oder mehrere Introns eingefügt wurden,
besteht. Es kann sich auch um synthetische oder halbsynthetische
Sequenzen handeln. Besonders vorteilhaft ist es, eine cDNA oder
eine gDNA zu verwenden. Insbesondere ermöglicht die Verwendung einer
gDNA eine bessere Expression in menschlichen Zellen. Um ihren Einbau
in eine viralen Vektor gemäß der Erfindung zu
ermöglichen,
werden diese Sequenzen vorteilhafterweise modifiziert, beispielsweise
durch eine gesteuerte Mutagenese, insbesondere zum Einfügen an den
geeigneten Restriktionsstellen. Die Sequenzen, welche im Stand der
Technik beschrieben sind, wurden in der Tat nicht für eine Verwendung
gemäß der Erfindung
konstruiert, und es kann sich als notwendig erweisen, diese im Vorfeld
zu anzupassen, um ein hohes Expressionsniveau zu erreichen. Im Rahmen
der vorliegenden Erfindung wird es bevorzugt, eine Nukleinsäuresequenz zu
verwenden, die für
eine menschliche Lipase codiert. Darüber hinaus ist es möglich, ein
Konstrukt zu verwenden, welches für ein Derivat dieser Lipasen
codiert, insbesondere für
ein Derivat der menschlichen LPL und LH. Die HL (hepatische Lipase)
befindet sich an der Oberfläche
von hepatischen Endothelzellen. Sie unterscheidet sich von der LPL
dadurch, dass sie nicht auf die aktivierende Wirkung von apoC-II
anspricht. Die HL ist an der Hydrolyse der Lipide des IDL sowie
der Lipide des HDL2 beteiligt, wobei dies deren Umwandlung zu HDL3
nach sich zieht. Unter einem Derivat dieser Lipasen ist beispielsweise
jedwede Sequenz zu verstehen, die durch Mutation, Entfernen und/oder
Addition ausgehend von der nativen Sequenz entsteht und für ein Produkt
codiert, das weiterhin die Lipaseaktivität aufweist. Diese Modifizierungen
können
mittels der Techniken durchgeführt
werden, die dem Fachmann bekannt sind (siehe nachstehende Angaben
zu den allgemeinen Techniken der Molekularbiologie). Die biologische
Aktivität
der auf diese Weise erhaltenen Derivate kann anschließend auf
einfache Weise bestimmt werden, wie insbesondere in Beispiel 3 ausgeführt wird.
Die Derivate im Sinne der Erfindung können ebenfalls durch Hybridisierung
ausgehend von Nukleinsäurebanken
erhalten werden, wobei die native Sequenz oder ein Fragment derselben
als Sonde verwendet wird.
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Bei
diesen Derivaten handelt es sich insbesondere um Moleküle, die
eine starke Affinität
zu ihren jeweiligen Andockstellen aufweisen, sowie um Moleküle, die
eine große
Widerstandsfähigkeit
gegenüber
Proteasen aufweisen, oder um Moleküle, die eine bessere therapeutische
Wirksamkeit oder geringere Nebenwirkungen oder möglicherweise neuartige biologische
Eigenschaften aufweisen. Zu den Derivaten gehören ebenfalls diejenigen modifizierten
DNA-Sequenzen, welche
eine verbesserte in vivo Expression ermöglichen.
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Von
den bevorzugten Derivate wären
insbesondere die natürlichen
Varianten zu nennen sowie Moleküle,
bei denen bestimmte N- oder O-Glycosylierungsstellen modifiziert
oder entfernt wurden, sowie Moleküle, bei den ein oder mehrere
Reste substituiert wurden, oder Moleküle, bei denen sämtliche
Cysteinreste substituiert wurden (Muteine). Es wären weiterhin diejenigen Derivate
zu nennen, die erhalten werden, indem Regionen, die kaum oder gar
nicht an der Wechselwirkung mit den betreffenden Bindungsstellen
beteiligt sind oder die eine unerwünschte Aktivität exprimieren,
deletiert wurden, sowie diejenigen Derivate, die gegenüber der nativen
Sequenz zusätzliche
Reste aufweisen, wie beispielsweise ein Absonderungssignal und/oder
ein Verbindungspeptid.
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In
einer ersten Ausführungsform
betrifft die vorliegende Erfindung ein rekombinantes defektes Virus, das
eine cDNA-Sequenz umfasst, die für
eine Lipase codiert, welche am Stoffwechsel der Lipoproteine beteiligt
ist. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform handelt es sich
bei der DNA-Sequenz um eine gDNA-Sequenz.
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Die
Vektoren der Erfindung können
ausgehend von verschiedenartigen Viren hergestellt werden. Vorzugsweise
kommen Vektoren zum Einsatz, die sich von Adenoviren, von adeno-assoziierten
Viren (AAV) von Herpesviren (HSV) oder von Retroviren ableiten.
Es besonders vorteilhaft, einen Adenovirus zu verwenden, und zwar
für eine
direkte Verabreichung oder für
die ex vivo Modifizierung von Zellen, die dazu bestimmt sind, implantiert
zu werden, oder aber einen Retrovirus, und zwar für die Implantation
von produzierenden Zellen.
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Die
erfindungsgemäßen Viren
sind defekt, das heißt
sie sind unfähig,
sich in der Zielzelle eigenständig zu
vermehren. Im Allgemeinen fehlen im Genom der defekten Viren, die
im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, also mindestens
diejenigen Sequenzen, die zur Vermehrung des Virus in der infizierten
Zelle erforderlich sind. Diese Regionen können entweder (vollständig oder
teilweise) entfernt werden oder ihrer Funktionsfähigkeit beraubt werden oder
durch andere Sequenzen und insbesondere durch die Nukleinsäuresequenz,
welche für
die Lipase codiert, ersetzt werden. Vorzugsweise behält das defekte
Virus nichtsdestoweniger diejenigen Sequenzen seines Genoms, die
zur Umhüllung
der viralen Partikel mit einem Kapsid erforderlich sind.
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Was
insbesondere die Adenoviren betrifft, so sind verschiedene Serotypen
beschrieben worden, deren Aufbau und Eigenschaften sich geringfügig unterscheiden.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden von diesen Serotypen
vorzugsweise die menschlichen Adenoviren der Typen 2 oder 5 (Ad
2 oder Ad 5) oder aber Adenoviren tierischer Herkunft (siehe Anmeldung
WO94/26914 ) verwendet.
Von den Adenoviren tierischer Herkunft, die im Rahmen der vorliegenden
Erfindung verwendet werden können,
wären die
Adenoviren vom Hund, vom Rind, von der Maus (Beispiel: Mavl, Beard
et al., Virology 75 (1990) 81), vom Schaf, vom Schwein, von Vögeln oder
auch von Affen (Beispiel: SAV) zu nennen. Vorzugsweise handelt es
sich bei dem Adenovirus tierischer Herkunft um ein Adenovirus des
Hundes, insbesondere um ein CAV2-Adenovirus [Manhatten-Stamm oder
A26/61 (ATCC VR-800) zum Beispiel]. Vorzugsweise kommen im Rahmen
der Erfindung Adenoviren vom Menschen, vom Hund oder gemischter
Herkunft zum Einsatz. Vorzugsweise umfassen die defekten Adenoviren
der Erfindung die ITR, eine Sequenz, welche die Umhüllung mit
einem Kapsid ermöglicht, sowie
die Sequenz, welche für
die Lipase codiert. Vorteilhafterweise wurde im Genom der Adenoviren
der Erfindung mindestens die Region E1 ihrer Funktionsfähigkeit
beraubt. Mit noch größerem Vorzug
sind im Genom der Adenoviren der Erfindung das Gen E1 sowie mindestens
eines der Gene E2, E4, L1–L5
funktionsunfähig. Das
betreffende virale Gen kann mittels jeder beliebigen Technik, die
dem Fachmann bekannt ist, seiner Funktionsfähigkeit beraubt werden, und
insbesondere durch ein vollständiges
Ausschalten, eine Substitution, eine teilweise Deletion oder das
Hinzufügen
einer oder mehrerer Basen in dem oder den betreffenden Gen(en). Derartige
Modifizierungen können
in vitro erzielt werden (an isolierter DNA) oder in situ, beispielsweise
mit Hilfe von gentechnischen Verfahren, oder auch durch Behandlung
mit mutagenen Mitteln. Es können
auch andere Regionen modifiziert werden, und insbesondere die Regionen
E3 (
WO95/02697 ), E2
(
WO94/28938 ), E4 (
WO94/28152 ,
WO94/12649 ,
WO95/02697 ) und L5 (
WO95/02697 ). Gemäß einer bevorzugten Durchführungsweise
weist das erfindungsgemäße Adenovirus
in den Regionen E1 und E4 eine Deletion auf, und die Sequenz, die
für die
LPL codiert, ist auf Höhe
der inaktivierten Region E1 eingefügt. Gemäß einer weiteren bevorzugten
Ausführungsform,
weist es eine Deletion in der Region E1 auf, wobei auf dieser Höhe die Region E4
und die Sequenz, die für
die LPL codiert, eingefügt
sind (siehe
FR94 13355 ).
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Die
rekombinanten defekten Adenoviren gemäß der Erfindung können mittels
jeder beliebigen Technik, die dem Fachmann bekannt ist, hergestellt
werden (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195,
EP 185 573 ; Graham, EMBO J. 3 (1984)
2917). Insbesondere können
sie durch homologe Rekombination zwischen einem Adenovirus und einem
Plasmid, auf welchem sich unter anderem die DNA-Sequenz befindet, die für die Lipase codiert,
hergestellt werden. Die homologe Rekombination erfolgt nach der
Co-Transfektion des Adenovirus und des Plasmids in eine geeignete
Zelllinie. Die verwendete Zelllinie muss vorzugsweise (i) durch
die genannten Elemente transformierbar sein und (ii) diejenigen
Sequenzen aufweisen, welche dazu befähigt sind, den Teil des Genoms
des defekten Adenovirus zu ergänzen,
und zwar vorzugsweise in integrierter Form, um die Risiken der Rekombinationen
zu vermeiden. Als Beispiel für
eine Zelllinie wäre
die menschliche embryonale Nierenzelllinie 293 zu nennen (Graham
et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59), bei welcher insbesondere das
linke Teilstück
des Genoms eines Adenovirus Ad5 (12%) in das Genom integriert ist,
oder aber dies für
Linien zutrifft, die dazu befähigt
sind, die Funktionen E1 und E4 gemäß der Beschreibung insbesondere
in den Anmeldungen Nr.
WO 94/26914 und
WO95/02697 zu ergänzen.
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Anschließend werden
die Adenoviren, die sich vermehrt haben, gewonnen und gemäß den herkömmlichen
Techniken der Molekularbiologie aufgereinigt, wie in den Beispielen
erläutert
ist.
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Was
die adeno-assoziierten Viren (AAV) betrifft, so handelt es sich
um Viren mit einer relativ kurzen DNA, welche sich auf stabile und
stellenspezifische Art und Weise in das Genom der Zellen, die sie
infizieren, integrieren. Sie sind dazu befähigt, ein breites Spektrum
an Zellen zu infizieren, ohne dabei das Wachstum, die Beschaffenheit
oder die Ausdifferenzierung der Zellen zu beeinflussen. Darüber hinaus
scheinen sie nicht an Erkrankungen des Menschen beteiligt zu sein.
Das Genom der AAV ist kloniert, sequenziert und charakterisiert
worden. Es umfasst ungefähr
4700 Basen und enthält
an jedem seiner Enden eine umgekehrte wiederholte Region (ITR) von
ungefähr
145 Basen, welche dem Virus als Replikationsursprung dient. Der
Rest des Genoms ist in 2 Hauptregionen aufgeteilt, auf denen sich
die Funktionen zur Umhüllung
mit dem Kapsid befinden: der linke Teil des Genom, welcher das Gen
rep enthält,
das an der viralen Replikation und an der Expression der viralen
Gene beteiligt ist; der rechte Teil des Genoms, welcher das Gen
cap enthält,
das für
die Proteine des Virus-Kapsids codiert.
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Die
Verwendung von Vektoren, die sich von AAV ableiten, zur in vitro
und in vivo Übertragung
von Genen ist in der Literatur beschrieben (siehe insbesondere
WO 91/18088 ;
WO 93/09239 ;
US 4,797,368 ,
US5,139,941 ,
EP 488 528 ). Dieses Anmeldungen beschreiben
verschiedenartige Konstrukte, die sich von AAV ableiten und in denen
die Gene rep und/oder cap deletiert und durch ein Gen von Interesse
ersetzt sind, sowie deren Verwendung zur Übertragung des Gens von Interesse,
und zwar in vitro (auf Zellkulturen) oder in vivo (direkt auf einen
Organismus). In diesen Schriftstücken
werden jedoch weder die Verwendung eines rekombinanten AAV zur Übertragung
und in vivo oder ex vivo Expression einer Lipase noch die Vorteile
einer solchen Übertragung
beschrieben oder angedeutet. Die rekombinanten defekten AAV gemäß der Erfindung
können durch
Co-Transfektion einerseits eines Plasmids, das eine Sequenz enthält, die
für die
Lipase codiert und von zwei umgekehrt wiederholten AAV-Regionen
(ITR) eingerahmt ist, und andererseits eines Plasmids, das die AAV-Kapsid-Umhüllungsgene
(die Gene rep und cap) enthält,
in eine Zelllinie, die mit einem menschlichen Hilfsvirus (zum Beispiel
einem Adenovirus) infiziert ist, hergestellt werden. Die hergestellten
AAV werden anschließend
mittels herkömmlicher
Techniken aufgereinigt.
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Was
die Herpesviren und die Retroviren betrifft, so ist die Konstruktion
rekombinanter Vektoren ausgiebig in der Literatur beschrieben worden:
siehe insbesondere Breakfield et al., New Biologist 3 (1991) 203;
EP 453242 ,
EP178220 , Bernstein et al. Genet. Eng.
7 (1985) 235; McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689 usw.
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Insbesondere
handelt es sich bei den Retroviren um integrationsfähige Viren,
die sich teilende Zellen infizieren. Das Genom der Retroviren umfasst
im Wesentlichen zwei LTR, eine Kapsid-Umhüllungssequenz sowie drei codierende
Regionen (gag, pol und env). In den rekombinanten Vektoren, die
sich von Retroviren ableiten, sind die Gene gag, pol und env im
Allgemeinen vollständig
oder teilweise deletiert und wurden durch eine heterologe Nukleinsäuresequenz
von Interesse ersetzt. Diese Vektoren können ausgehend von verschiedenartigen
Retroviren hergestellt werden, wie etwa insbesondere dem MoMuLV
("murine moloney
leukemia virus";
manchmal auch als MoMLV bezeichnet), dem MSV "murine moloney sarcoma virus"), dem HaSV ("harvey sarcoma virus"); dem SNV ("spleen necrosis virus"); dem RSV ("rous sarcoma virus") oder auch dem Friend-Virus.
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Um
erfindungsgemäße rekombinante
Retroviren zu konstruieren, die eine Sequenz aufweisen, welche für die LPL
codiert, wird im Allgemeinen ein Plasmid konstruiert, das insbesondere
die LTR, die Kapsid- Umhüllungssequenz
und die codierende Sequenz aufweist, woraufhin es dazu verwendet
wird, eine Zelllinie zu transfizieren, die als Kapsid-Umhüllungszelllinie
bezeichnet wird und dazu befähigt
ist, die fehlerhaften retroviralen Funktionen auf dem Plasmid in
die trans-Form zu überführen. Im
Allgemeinen sind die Kapsid-Umhüllungszelllinien
also dazu befähigt,
die Gene gag, pol und env zu exprimieren. Derartige Kapsid-Umhüllungszelllinien
sind im Stand der Technik beschrieben, und zwar und insbesondere
di Linie PA317 (
US4,861,719 ), die
Linie PsiCRIP (
WO90/02806 )
und die Linie GP+envAm-12 (
WO89/07150 ).
Darüber
hinaus können
die rekombinanten Retrovirus Modifizierungen an den LTR aufweisen,
um die Transskriptionsaktivität
aufzuheben, sowie ausgedehnte Kapsid-Umhüllungssequenzen, welche einen
Teilbereich des Gens gag aufweisen (Bender et al., J. Virol. 61
(1987) 1639). Die hergestellten rekombinanten Retroviren werden
anschließend
mittels der herkömmlichen
Techniken aufgereinigt.
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Für die Durchführung der
vorliegenden Erfindung ist es ganz besonders vorteilhaft, ein rekombinantes defektes
Adenovirus zu verwenden. Die nachstehend aufgeführten Ergebnisse belegen in
der Tat die besonders interessanten Eigenschaften der Adenoviren
hinsichtlich der in vivo Expression eines Proteins mit Lipase-Aktivität. Die erfindungsgemäßen adenoviralen
Vektoren sind besonders vorteilhaft für eine direkte in vivo Verabreichung
einer aufgereinigten Suspension oder für die ex vivo Transformation
von Zellen, insbesondere autologer Art, die dazu bestimmt sind,
implantiert zu werden. Darüber
hinaus weisen die erfindungsgemäßen adenoviralen
Vektoren weitere wichtige Vorteile auf, wie etwa insbesondere ihre
sehr hohe Infektionwirksamkeit, welche es ermöglicht, mit sehr geringen Volumina
an Virussuspension eine Infektion zu erzielen. In einer besonders
bevorzugten Ausführungsform
wird erfindungsgemäß ein Adenovirus
verwendet, das zusätzlich
zu dem Gen, das für
die Lipase codiert, ein Gen aufweist, das für ein Apolipoprotein codiert.
Es handelt sich vorzugsweise um die hepatische Lipase und um ein
Apolipoprotein, das aus apoA-I und apoA-IV gewählt ist. Die beiden Gene werden
vorteilhafterweise in Form eines bicistronischen Konstrukts verwendet,
welches gemäß der vorstehend
beschriebenen Vorgehensweise in einen adenoviralen Vektor eingefügt wird,
um ein Adenovirus, das ein einziges Gen aufweist, zu konstruieren.
Vorteilhafterweise betrifft die Erfindung ein rekombinantes Adenovirus,
das ein Gen aufweist, welches für
die HL codiert, sowie ein Gen, welches für apoA-I codiert, wobei diese
in die Region E1 eingefügt
sind. Die Konstruktion von Adenoviren, die ein Gen aufweisen, welches
für ein
apo codiert, ist in der Anmeldung
PCT/FR94/00422 beschrieben,
die durch Literaturverweis in die vorliegende eingefügt ist.
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Gemäß einer
weiteren besonders vorteilhaften Durchführungsform der Erfindung wird
eine Linie verwendet, die retrovirale Vektoren produziert, welche
die Sequenz enthalten, die für
die Lipase codiert, und zwar für
eine in vivo Implantation. Bei den Linien, die zu diesem Zweck verwendet
werden können,
handelt es sich insbesondere um die Zellen PA317 (
US4,861,719 ), PsiCrip (
WO90/02806 ) und GP+envAm-12 (
US5,278,056 ), welche dahingehend
modifiziert werden, dass sie die Produktion eines Retrovirus ermöglichen,
der eine Nukleinsäuresequenz
enthält,
die für
eine erfindungsgemäße Lipase
codiert.
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Vorteilhafterweise
wird in den Vektoren der Erfindung die Sequenz, welche für die Lipase
codiert, durch Signale gesteuert, die ihre Expression in den infizierten
Zellen ermöglichen.
Es kann sich um homologe Expressionssignale handeln oder auch um
heterologe, das heißt
um Signale, die sich von denjenigen, die natürlicherweise für die Expression
der Lipase verantwortlich sind, unterscheiden. Es kann sich insbesondere
um Sequenzen handeln, die für
die Expression anderer Proteine verantwortlich sind, oder um synthetische
Sequenzen. Insbesondere kann es sich um Sequenzen aus Eukaryoten-
oder Virusgenen oder um abgeleitete Sequenzen handeln, welche die
Transkription eines Gens anregen oder unterdrücken, und zwar auf spezifische
oder unspezifische Weise und auf induzierbare oder nicht induzierbare
Weise. Beispielsweise kann es sich um Promotorsequenzen handeln,
die aus dem Genom der Zelle, die infiziert werden soll, oder aus
dem Genom eines Virus stammen, und insbesondere um die Promotoren
der Gene E1A, MLP von Adenoviren, um den Promotor CMV, LTR-CMV usw.
Von den Eukaryoten-Promotoren wären
weiterhin die ubiquitären
Promotoren (HPRT, Vimentin, α-Actin,
Tubulin usw.), die Promotoren der Intermediärfilamente (Desmin, Neurofilamente,
Keratin, GFAP usw.), die Promotoren von therapeutischen Genen (des
Typs MDR, CFTR, Faktor VIII usw.), die gewebespezifischen Promotoren
(Pyruvatkinase, Villin, Promotor der intestinalen Fettsäurebindungsproteins,
Promotor des α-Actins der Zellen
der glatten Muskulatur, leberspezifische Promotoren; Apo AI, Apo
AII, menschliches Albumin usw.) oder auch die Promotoren, die auf
einen Stimulus ansprechen (Rezeptor der Steroidhormone, Rezeptor
der Retinsäure
usw.) zu nennen. Ferner können
diese Expressionssequenzen durch Hinzufügen von Sequenzen zur Aktivierung,
Regulierung usw. modifiziert werden. Wenn das eingefügte Gen
keinerlei Expressionssequenzen aufweist, kann es weiterhin strangabwärts einer
solchen Sequenz in das Genom des defekten Virus eingefügt werden.
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In
einer besonderen Ausführungsform
betrifft die Erfindung ein rekombinantes defektes Virus, das eine Nukleinsäuresequenz
umfasst, welche für
eine Lipase codiert, die am Stoffwechsel der Lipoproteine beteiligt ist
und von einem Promotor gesteuert wird, der aus dem LTR-RSV und dem
frühen
Promotor des CMV gewählt ist.
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Mit
noch größerem Vorzug
umfasst die verwendete Nukleinsäuresequenz
darüber
hinaus Signale, welche eine Absonderung der Lipase durch die infizierten
Zellen ermöglichen.
Zu diesem Zwecke weist die Nukleinsäuresequenz im Allgemeinen,
strangaufwärts
der codierenden Sequenz, eine Signalsequenz auf, welche die synthetisierte
Lipase in die Absonderungswege der infizierten Zelle lenkt. Bei
dieser Signalsequenz kann es sich um die natürliche Signalsequenz der synthetisierten
Lipase oder auch um jede andere funktionsfähige Signalsequenz in der infizierten
Zelle oder um eine künstliche
Signalsequenz handeln.
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Wie
vorstehend angegeben wurde, betrifft die vorliegende Erfindung weiterhin
jedwede Verwendung eines Virus gemäß der obigen Beschreibung zur
Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die dazu bestimmt
ist, Erkrankungen, die mit Dyslipoproteinämien in Zusammenhang stehen,
zu behandeln oder diesen vorzubeugen.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft weiterhin eine pharmazeutische Zusammensetzung,
die ein oder mehrere rekombinante defekte Viren gemäß der obigen
Beschreibung umfasst. Diese pharmazeutischen Zusammensetzungen können derart
formuliert werden, dass sie auf topischem, oralem, parenteralem,
intranasalem, intravenösem,
intramuskulärem,
subkutanem, intraokulärem,
transdermalem usw. Wege verabreicht werden können. Vorzugsweise enthalten
die pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung einen pharmazeutisch
unbedenklichen Trägerstoff
für eine
Formulierung zur Injektion, insbesondere zur intravenösen Injektion,
wie beispielsweise in die Pfortader des Patienten. Es kann sich
insbesondere um sterile, isotonische Lösungen oder um trockene, insbesondere
gefriergetrocknete Zusammensetzungen handeln, aus welchen gegebenenfalls
durch Zusatz von sterilisiertem Wasser oder physiologischem Serum
injizierbare Solvate zubereitet werden können. Die direkte Injektion
in die Pfortader des Patienten ist vorteilhaft, da sie es ermöglicht, die
Infektion gezielt an der Leber anzugreifen und auf diese Weise die
therapeutische Wirkung auf dieses Organ zu konzentrieren.
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Die
Dosen an rekombinantem defektem Virus, die zur Injektion eingesetzt
werden, können
in Abhängigkeit
verschiedener Parameter angepasst werden, und zwar insbesondere
in Abhängigkeit
vom viralen Vektor, vom angewendeten Verabreichungsweg, vom jeweiligen
Krankheitsbild oder auch von der angestrebten Behandlungsdauer.
Im Allgemeinen werden die erfindungsgemäßen rekombinanten Adenoviren
in Form von Dosen formuliert und verabreicht, die zwischen 104 und 1014 pfu/ml,
vorzugsweise zwischen 106 und 1010 pfu/ml, liegen. Der Begriff pfu ("plaque forming unit") entspricht dem
Infektionsvermögen
einer Viruslösung
und wird bestimmt, indem eine geeignete Zellkultur infiziert wird,
woraufhin, im Allgemeinen nach 48 Stunden, die Anzahl der Plaques
mit infizierten Zellen gemessen wird. Die Techniken zur Bestimmung
des pfu-Gehalts
einer Viruslösung
sind in der Literatur ausführlich
beschrieben.
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Was
die Retroviren betrifft, so können
die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
direkt die produzierenden Zellen enthalten, sodass diese implantiert
werden können.
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Diesbezüglich betrifft
die Erfindung ferner jedwede Säugetierzelle,
die mit einem oder mehreren rekombinanten defekten Viren gemäß der obigen
Beschreibung infiziert ist. Insbesondere betrifft die Erfindung jedwede
menschliche Zellpopulation, die mit diesen Viren infiziert ist.
Es kann sich insbesondere um Fibroblasten, Myoblasten, Leberzellen, Keratinozyten,
Endothelzellen, Gliazellen usw. handeln.
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Die
erfindungsgemäßen Zellen
können
aus primären
Kulturen stammen. Diese können
mittels jedweder Technik, die dem Fachmann bekannt ist, entnommen
und anschließend
unter Bedingungen, die ihre Vermehrung gestatten, angezüchtet werden.
Wenn es sich insbesondere um Fibroblasten handelt, so können diese
auf einfache Weise durch eine Biopsie erhalten werden, beispielsweise
gemäß der Technik,
die Ham [Methods Cell. Biol. 21a (1980) 255] beschrieben wurde.
Diese Zellen können
direkt zur Infektion mit den Viren eingesetzt werden, oder beispielsweise
durch Einfrieren zwecks Erstellung autologer Banken konserviert
werden, um später
verwendet zu werden. Bei den erfindungsgemäßen Zellen kann es sich ferner
um Sekundärkulturen
handeln, die beispielsweise ausgehend von bereits erstellten Banken
erhalten wurden (siehe beispielsweise
EP
228458 ,
EP 289034 ,
EP 400047 ,
EP 456640 ).
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Die
angezüchteten
Zellen werden anschließend
mit den rekombinanten Viren infiziert, um ihnen die Fähigkeit
zu verleihen, eine biologisch aktive Lipase zu produzieren. Die
Infektion erfolgt in vitro gemäß den Techniken,
die dem Fachmann bekannt sind. Insbesondere kann der Fachmann, je
nach dem verwendeten Zelltyp und der angestrebten Anzahl von Viruskopien
pro Zelle, die Multiplizität
der Infektion und gegebenenfalls die Anzahl an Infektionszyklen
anpassen. Es versteht sich, dass diese Schritte unter geeigneten
Bedingungen hinsichtlich der Sterilität durchgeführt werden müssen, wenn
die Zellen für
eine in vivo Verabreichung bestimmt sind. Die Dosen an rekombinantem
Virus, die für
die Infektion der Zellen eingesetzt werden, können vom Fachmann gemäß dem angestrebten
Ziel angepasst werden. Die vorstehend für eine in vivo Verabreichung
beschriebenen Bedingungen können
auf die in vitro Infektion angewendet werden. Für die Infektion mit Retroviren
ist es ferner möglich,
die Zellen, welche infiziert werden sollen, mit den Zellen, welche
die erfindungsgemäßen rekombinanten
Retroviren produzieren, gemeinsam in Kultur zu nehmen. Dadurch ist
möglich, auf
eine Aufreinigung der Retroviren zu verzichten.
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Weiterhin
betrifft die Erfindung ein Implantat, das Säuretierzellen, welche mit einem
oder mehreren rekombinanten defekten Viren gemäß der obigen Beschreibung infiziert
wurden, oder Zellen, welche rekombinante Viren produzieren, sowie
eine extrazelluläre
Matrix umfasst. Vorzugsweise umfassen die erfindungsgemäßen Implantate
105 bis 1010 Zellen.
Mit noch größerem Vorzug
umfassen sie davon 106 bis 108.
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In
den Implantaten der Erfindung umfasst die extrazelluläre Matrix
insbesondere eine gelbildende Verbindung und möglicherweise eine Trägervorrichtung,
welche die Verankerung der Zellen ermöglicht.
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Um
die erfindungsgemäßen Implantate
herzustellen, können
verschiedenartige Gelbildner eingesetzt werden. Die Gelbildner werden
dazu verwendet, die Zellen in einer Matrix von gelartiger Beschaffenheit
einzuschließen
und gegebenenfalls die Verankerung der Zellen auf der Trägervorrichtung
zu begünstigen.
Es also können
verschiedenartige Zellhaftmittel als Gelbildner verwendet werden,
wie etwa insbesondere Kollagen, Gelatine, Glycosaminglykane, Fibronektin,
Lektine usw. Vorzugsweise wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung
Kollagen verwendet. Es kann sich um Kollagen vom Menschen, vom Rind
oder von der Maus handeln. Mit noch größerem Vorzug wird Kollagen
des Typs I verwendet.
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Wie
vorstehend angegeben wurde, umfassen die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
vorteilhafterweise eine Trägervorrichtung,
welche die Verankerung der Zellen ermöglicht. Der Begriff Verankerung bezeichnet
jedwede Form von biologischer und/oder chemischer und/oder physikalischer
Wechselwirkung, welche das Anhaften und/oder die Befestigung der
Zellen auf dem Träger
nach sich zieht. Ferner können
die Zellen entweder den verwendeten Träger bedecken oder ins Innere
dieses Trägers
vordringen oder beides kann der Fall sein. Im Rahmen der Erfindung
wird es bevorzugt, eine feststoffliche, ungiftige und/oder bioverträgliche Trägervorrichtung
zu verwenden. Insbesondere können
Polytetrafluorethylen(PTFE)-Fasern oder eine Trägervorrichtung biologischer
Herkunft verwendet werden.
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Die
erfindungsgemäßen Implantate
können
an verschiedenen Stellen des Organismus implantiert werden. Insbesondere
kann die Implantation in der Bauchhöhle, in einem subkutanen Gewebe
(suprapubischer Bereich, Becken- und Leistengruben usw.) in einem
Organ, einem Muskel, einem Tumor, im zentralen Nervensystem oder
auch in einer Schleimhaut erfolgen. Die erfindungsgemäßen Implantate
sind besonders dahingehend von Vorteil, dass sie es ermöglichen,
die Freisetzung der Lipase im Organismus zu steuern: sie wird zunächst durch
die Multiplizität
der Infektion und durch die Anzahl an implantierten Zellen bestimmt.
Im Weiteren kann die Freisetzung entweder durch die Entnahme des
Implantats gesteuert werden, wodurch die Behandlung endgültig beendet
wird, oder durch die Verwendung regulierbarer Expressionssysteme,
die es ermöglichen,
die Expression der therapeutischen Gene zu induzieren oder zu unterdrücken.
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Die
vorliegende Erfindung stellt somit ein sehr wirkungsvolles Mittel
bereit, das zur Behandlung von oder zur Vorbeugung gegen Erkrankungen,
die mit Dyslipoproteinämien
in Zusammenhang stehen, bestimmt ist, wobei es sich insbesondere
um Fettleibigkeit und Hypertriglyceridämie oder, im Bereich der Herz- Kreislauf-Erkrankungen,
um den Herzinfarkt, die Angina pectoris, den plötzlichen Tod, die kardiale
Dekompensation und um Schlaganfälle
handelt.
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Darüber hinaus
kann diese Behandlung sowohl den Menschen betreffen als auch ein
beliebiges Tier wie etwa Schafe, Rinder, Haustiere (Hunde, Katzen
usw.), Pferde, Fische usw.
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Die
vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele, die als
erläuternd
und nicht als einschränkend
aufzufassen sind, ausführlicher
beschrieben.
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Legende der Figuren:
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1:
Struktur des Vektors pXL2418
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2:
Struktur des Vektors pXL2419
-
3:
Struktur des Vektors pXL CMV-LPL
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4:
Struktur des Vektors pXL RSV-LPL
-
5:
Struktur des Vektors pXL RSV-LPLc
-
Allgemeine Techniken der Molekularbiologie
-
Die
herkömmlicherweise
in der Molekularbiologie angewendeten Verfahren wie etwa die präparative Entnahme
plasmidischer DNA, die Zentrifugation plasmidischer DNA mit Cäsiumchloridgradient,
die Elektrophorese auf Agarose- oder Acrylamidgelen, die Aufreinigung
von DNA-Fragmenten durch Elekroelution, die Proteinextraktion mit
Phenol oder mit Phenol-Chloroform,
die DNA-Fällung
in salzhaltigem Milieu mittels Ethanol oder Isopropanol, die Transformation
in Escherichia coli usw. sind dem Fachmann wohlbekannt und sind ausführlich in
der Literatur beschrieben [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y., 1982; Ausubel F. M. et al.
(Hrsg.), "Current
Protocols in Molecular Biology",
John Wiley & Sons,
New York, 1987].
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Die
Plasmide des Typs pBR322, pUC und die Phagen der Reihe M13 wurden über den
Handel bezogen (Bethesda Research Laboratories).
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Für die Ligaturen
können
die DNA-Fragmente mittels Elektrophorese auf Agarose- oder Acrylamidgel nach
ihrer Größe getrennt
werden, woraufhin sie mit Phenol oder mit einer Phenol/Chloroform-Mischung
extrahiert, mit Ethanol gefällt
und anschließend
in Gegenwart der DNA-Ligase des Phagen T4 (Biolabs) gemäß den Empfehlungen
der Herstellers inkubiert werden.
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Das
Auffüllen
der hervorstehenden 5'-Enden
kann mittels des Kienow-Fragments der DNA-Polymerase von E. coli
(Biolabs) gemäß den Spezifikationen
des Herstellers durchgeführt
werden. Das Entfernen der hervorstehenden 3'-Enden erfolgt in Gegenwart der DNA-Polymerase des Phagen
T4 (Biolabs), welche gemäß den Empfehlungen
des Herstellers verwendet wird. Das Entfernen der hervorstehenden
5'-Enden erfolgt durch
eine schonende Behandlung mit der Nuklease S1.
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Die
gelenkte in vitro Mutagenese mittels synthetischer Oligodesoxynukleotide
kann gemäß dem Verfahren,
das von Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749–8764] entwickelt
wurde, durchgeführt
werden, und zwar unter Verwendung des Kits, das von Amersham vertrieben
wird.
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Die
enzymatische Verstärkung
von DNA-Fragmenten mit Hilfe des als PCR bezeichneten Verfahren [Polymerase-catalyzed
Chain Reaction, Saiki R. K. et al., Science 230 (1985) 1350–1354; Mullis
K. B. und Faloona F. A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335–350] kann
unter Einsatz eines "DNA
thermal cycler"-Geräts (Perkin Elmer
Cetus) gemäß den Spezifikationen
des Herstellers durchgeführt
werden.
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Die Überprüfung der
Nukleotidsequenzen kann mittels des Verfahrens, das von Sanger et
al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463–5467] entwickelt wurde, durchgeführt werden,
und zwar unter Verwendung des Kits, das von Amersham vertrieben
wird.
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Beispiele
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Beispiel 1. Konstruktion des Vektors pXL2418,
der das Gen trägt,
welches für
die LPL codiert und vom frühen Promotor
des Cytomegalovirus (CMV) gesteuert wird (1).
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Dieses
Beispiel beschreibt die Konstruktion eines Vektors, der eine cDNA-Sequenz,
welche für
die LPL codiert und von einem Promotor gesteuert wird, der aus dem
frühen
Promotor des Cytomegalovirus (CMV) besteht, umfasst sowie eine Region
des Genoms des Adenovirus Ad5, welche die homologe Rekombination ermöglicht.
Dieser Vektor wurde wie nachstehend beschrieben konstruiert.
-
1.1. Konstruktion des Vektors pXL2375:
-
Der
Vektor pXL2375 enthält
insbesondere eine Region des Genoms des Adenovirus Ad5 und eine DNA-Sequenz,
die für
das Apolipoprotein A1 codiert und vom Promotor CMV gesteuert wird.
Insbesondere erstreckt sich der verwendete Promotor CMV bis zur
5'-Donor-Spleißstelle
in Verbindung mit den am stärksten in
Richtung 3' gelegenen
107 bp des synthetischen Introns, das von O'Gorman et al. (Science 251 (1991) 1351)
beschrieben wurde. Die Konstruktion dieses Vektors ist ausführlich in
der ebenfalls anhängigen
Anmeldung
FR 93 05125 beschrieben.
Es versteht sich, dass der Fachmann ähnliche Konstruktionen erstellen
kann.
-
1.2. Konstruktion einer cDNA-Sequenz,
die für
die LPL codiert.
-
Das
Plasmid pHLPL 26-1, das von Wion et al. (Science 235 (1987) 1638–1641) beschrieben
wurde, enthält
eine unvollständige
Sequenz der cDNA der LPL. Dieses Plasmid enthält die Basen 272 bis 1623 der cDNA
der LPL, wobei die Basen in zwei EcoRI-Stellen eingerahmt sind und
an die EcoRI-Stelle eines Plasmids pGEM1 (Promega) kloniert wurden.
-
Das
EcoRI-Fragment von pHLPL 26-1, welches Teile der cDNA der LPL enthält, ist
erneut an die EcoRI-Stelle eines Plasmids pMTL22 (Chambers et al,
Gens, 1988, 68: 138–149)
kloniert worden, wobei es derart ausgerichtet wurde, dass die 5'-Basen der cDNA auf
der Seite der BgIII-Stelle von pMTL22 liegen. Das erhaltene Plasmid
wurde als pXL2402 bezeichnet.
-
Anschließend wurden
die RNA des menschlichen Fettgewebes gemäß der Technik von Chromczynski et
Sacchin (Anal. Biochem. 162 (1987) 156–159) extrahiert. Ausgehend
von dieser RNA-Zubereitung wurde eine Verstärkung mittels RT-PCR durchgeführt, um
den fehlenden Teil des cDNA der LPL zu isolieren. Zu diesem Zwecke
wurden die folgenden Primer verwendet:
-
Dieser
Primer ermöglicht
es, eine BgIII-Stelle sowie eine ClaI-Stelle strangaufwärts des
ATG einzufügen.
-
-
Das
PCR-Fragment von 260 pb, das nach 25 Verstärkungszyklen erhalten wurden,
ist anschließend in
das Plasmid pCR-II (Invitrogen) kloniert und zur Überprüfung sequenziert
worden. Es ist anschließend
an den Stellen BgIII-Stelle und NcoI in den Vektor pXL2402 eingefügt worden,
wodurch eine vollständige
cDNA wiedergestellt wird, der eine ClaI-Stelle vorangeht und der
eine SalI-Stelle folgt. Das Plasmid, welches sich daraus ergibt,
wurde als pXL2417 bezeichnet.
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1.3. Konstruktion des Vektors pXL2418.
-
Die
cDNA der LPL ist schließlich
in das Plasmid pXL2375 eingefügt
worden, und zwar zwischen den Stellen SalI und ClaI, nachdem es
mittels derselben beiden Enzyme aus der cDNA des Apo A1 herausgeschnitten
wurde. Das erhaltene Plasmid wurde als pXL2418 bezeichnet (1).
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Beispiel 2. Konstruktion des Vektors pXL2419,
der das Gen trägt,
welches für
die LPL codiert und vom Promotor des LTR des Rous-Sarkom-Virus (LTR-RSV)
gesteuert wird (2).
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Dieses
Beispiel beschreibt die Konstruktion eines Vektors, der eine cDNA-Sequenz,
welche für
die LPL codiert und von einem Promotor gesteuert wird, der aus dem
LTR des Rous-Sarkom-Virus (LTR-RSV) besteht, umfasst sowie eine
Region des Genoms des Adenovirus Ad5, welche die homologe Rekombination
ermöglicht.
Dieser Vektor wurde wie nachstehend beschrieben konstruiert.
-
2.1. Konstruktion des Vektors pXL2244:
-
Der
Vektor pXL2244 enthält
insbesondere eine Region des Genoms des Adenovirus Ad5 und eine DNA-Sequenz,
die für
das Apolipoprotein A1 codiert und vom Promotor LTR-RSV gesteuert
wird.
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2.2. Konstruktion einer cDNA-Sequenz,
die für
die LPL codiert.
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Bei
der in diesem Beispiel verwendeten cDNA-Sequenz, die für die LPL
codiert, handelt es sich um diejenige, die in Beispiel 1.2 beschrieben
ist.
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2.3. Konstruktion des Vektors pXL2419.
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Die
cDNA der LPL ist in das Plasmid pXL2244 eingefügt worden, und zwar zwischen
den Stellen SalI und ClaI, nachdem es mittels derselben beiden Enzyme
aus der cDNA des Apo A1 herausgeschnitten wurde. Das erhaltene Plasmid
wurde als pXL2419 bezeichnet (2).
-
Beispiel 3: Konstruktion der Vektoren
pXL RSV-LPL und pXL CMV-LPL
-
Der
Vektor pRC-CMV LPL enthält
ein cDNA-Fragment der LPL, welches sich von den Basen 1 bis 2388
der Sequenz erstreckt, die von Wion et al. beschrieben wurde und
die an die HindIII und XbaI des Expressionsvektors pRC-CMV (Invitrogen).
Die HindIII-Stelle
ist zu einer ClaI-Stelle umgestaltet worden, indem das Oligonukleotid
AGC TAC ATC GAT GT (SEQ ID Nr. 3) eingefügt wurde. Die cDNA der LPL
und die Polyadenylierungsstelle des bovinen Wachstumshormons (ursprünglich in
pRC-CMV enthalten) werden schließlich durch einen SphI-Schnitt,
eine Behandlung mit der T4-Polymerase
und einen ClaI-Schnitt aus dem pRCMV LPL extrahiert. Das auf diese
Weise erhaltene Fragment wird in die Vektoren pXL2418 (Beispiel
1) und pXL2419 (Beispiel 2) kloniert, welche mit ClaI und EcoRV
geschnitten wurden, wodurch die Vektoren pXL CMV-LPL (3)
und pXL RSV-LPL (4) erhalten werden.
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Beispiel 4: Konstruktion des Vektors pXL
RSV-LPLc.
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In
diesem Beispiel wird die Konstruktion eines Vektors beschrieben,
der verwendet werden kann, um rekombinante Viren zu erzeugen, die
eine kurze cDNA enthalten, welche für die LPL codiert.
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Eine
kürzere
cDNA (Basen 146 bis 1635 der Sequenz von Wion et al.) ist ausgehend
von den RNA des menschlichen Fettgewebes kloniert worden. Es wurden
die Primer ATC GGA TCC ATC GAT GCA GCT CCT CCA GAG GGA CGC (SEQ
ID Nr. 4) und ATC TCT AGA GTC GAC ATG CCG TTC TTT GTT CTG TAG (SEQ
ID Nr. 5) verwendet, welche bei 5' der cDNA eine BamHI-Stelle beziehungsweise
eine ClaI-Stelle schaffen sowie bei 3' der cDNA der LPL eine XbaI-Stelle und
eine SalI-Stelle.
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Dieses
PCR-Fragment wird in PCR II kloniert, und seine Sequenz wird vollständig überprüft. Die
cDNA der LPL wird an den Stellen BamHI und XbaI wieder herausgetrennt
und in einen Expressionsvektor pcDNA3 (Invitrogen) kloniert, um
die Expression zu überprüfen, wobei
das Plasmid pcDNA3-LPLc entsteht.
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Das
Fragment ClaI-SalI, welches die cDNA der LPL enthält, wird
schließlich
an denselben Stellen in das Plasmid pXL RSV-LPL (Beispiel 3) kloniert,
um das Shuttle-Plasmid pXL RSV-LPLc (5) zu schaffen.
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Beispiel 5: Funktionsfähigkeit der Vektoren der Erfindung:
Nachweis einer LPL-Aktivität.
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Die
Fähigkeit
der Vektoren der Erfindung, in Zellkultur eine biologisch aktive
Form der LPL zu exprimieren, ist durch die transiente Transfektion
von Zellen des Typs 293 oder CosI aufgezeigt werden. Zu diesem Zwecke
wurden die Zellen (2·106 Zellen pro Schale mit 10 cm Durchmesser)
in Gegenwart von Transfectam transfiziert (8 μg an Vektor). Die Expression
der Sequenz, die für
die LPL codiert, sowie die Herstellung eines biologisch aktiven
Proteins werden entweder mit Hilfe eines enzymatischen Immunassays
(5.1.) anhand der Masse oder aber anhand der Lipase-Aktivität (5.2.)
nachgewiesen.
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5.1. Messung der LPL anhand der Masse
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Eine
ELISA-Platte des Typs Immulon I (Dynatech) wird mit bovinen monoklonalen
anti-LPL-Antikörpern
belegt, welche eine Kreuzreaktion mit der menschlichen LPL zeigen
(20 μg/ml
in PBS, 50 μl/Vertiefung). Die
potentiellen Stellen, die in den Vertiefungen verbleiben, werden
anschließend
blockiert (gesättigt),
indem in Gegenwart von 1%iger Gelatine 1 Stunde lang bei Raumtemperatur
inkubiert wird. Die zu messenden Proben werden anschließend 1 Stunde
lang bei 37°C
inkubiert.
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Die
Entwicklung erfolgt mit einem auf 10 μg/ml verdünnten anti-LPL-Serum, 100 μl/Vertiefung,
und dann mit einem peroxidasemarkierten Antiserum. Die Peroxidase-Aktivität wird mit
Hilfe eines TMB-Substrats (Kit von Kirkegaard und Perry Laboratories
inc.) nachgewiesen, wobei die Absorption bei 490 nm abgelesen wird.
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5.2. Messung der LPL-Aktivität
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Die
Lipase-Gesamtaktivität
wird anhand eines Substrats gemessen, das aus der Emulsion von 0,3
mg an Triolein (Sigma), 75 nCi an Glycerin (55 mCi/mmol, Amersham),
18 mg an BSA (Fraktion V, Sigma), 25 μl an normalem menschlichen Plasma
als ApoCII-Quelle besteht, wobei sich das Ganze in einem Endvolumen von
500 μl TRIS,
0,223 M, pH-Wert 8,5 befindet. Im Allgemeinen wird die Messung der
Aktivität
an 100 μl Überstand
von transfizierten Zellen oder an 50 μl Postheparin-Plasma vorgenommen.
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Nach
einer Inkubationszeit von 1 Stunde bei 37°C wird die Reaktion durch Zugabe
von 3,25 ml an Extraktionspuffer (Chloroform/Methanol/Heptan, 10:9:7,
(v/v/v)) sowie 0,75 ml an Carbonat/Borat-Puffer mit pH 10,5 abgebrochen,
und die organische Phase wird einem Zählverfahren unterzogen, um
die Menge an freigesetzten Fettsäuren
zu bestimmen.
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Um
die Aktivität
zu bestimmen, die spezifisch mit der LPL in Verbindung steht, wird
die hepatische Lipaseaktivität
in Gegenwart einer Konzentration von 1 M an NaCl bestimmt (zur Hemmung
der LPL) und anschließend
von der Gesamtaktivität
abgezogen. Es ist weiterhin möglich,
die Aktivität
der Lipoproteinlipase durch einen spezifischen monoklonalen Antikörper zu
hemmen (Babirak et al., Atheriosclerosis, 1989, 9: 326–334).
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Die
Plasmide pXL RSV-LPL und pXL CMV-LPL sind durch Transfektion in
die CosI-Zellen geprüft
worden, wobei ein Vergleich mit dem Plasmid pRC CMV-LPL vorgenommen
wurde. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 1 aufgeführt. Tabelle 1
Expressionsvektor | Aktivität im Überstand
Tag 2 |
pRC-CMV-LPL | 24,5 |
pXL
RSV-LPL | 15,1 |
pXL
CMV-LPL | 22,9 |
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Das
Plasmid pcDNA-LPLc ist durch Transfektion in die Zellen 293 geprüft worden,
wobei ein Vergleich mit einem Expressionsvektor pcDNA3, welcher
die gleiche cDNA enthält
wie der Vektor pRC-CMV-LPL, vorgenommen wurde. Die Ergebnisse sind
in der Tabelle 2 aufgeführt. Tabelle 2
Expressionsvektor | Aktivität im Überstand
Tag 1 | Aktivität im Überstand
Tag 2 |
pcDNA3-LPL | 106,4
mU/ml | 106,7
mU/ml |
pcDNA3-LPLc | 114
mU/ml | 109,6
mU/ml |
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Beispiel 6. Konstruktion eines rekombinanten
Adenovirus Ad-CMV.LPL, der eine Sequenz enthält, welche für die Lipase
LPL codiert
-
Die
Plasmide, die in den Beispielen 1 bis 4 hergestellt worden sind,
werden linearisiert und zur Rekombination mit dem fehlerhaften adenoviralen
Vektor in die helper-Zellen (Linie 293) co-transfiziert, wodurch
die Funktion, für
welche die Adenovirusregionen E1 (E1A und E11B) codieren, in die
trans-Form überführt werden.
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Insbesondere
wird das Adenovirus Ad.CMV.LPL durch homologe Rekombination in vivo
zwischen dem Adenovirus Ad.RSVβgal
(Stratford-Perricaudet et al., J. Clin. Invest 90 (1992) 626) und
dem Plasmid pXL2418 oder pXL CMV-LPL gemäß der folgenden Vorgehensweise
erhalten: Das linearisierte Plasmid pXL2418 oder pXL CMV-LPL und
das mittels ClaI linearisierte Adenovirus Ad.RSVβgal werden in die Linie 293 co-transfiziert,
und zwar in Gegenwart von Calciumphosphat, um die homologe Rekombination
zu ermöglichen.
Die auf diese Weise geschaffenen rekombinanten Adenoviren werden
durch Aufreinigung auf einer Platte selektiert. Nach der Isolierung
wird das rekombinante Adenovirus in der Zelllinie 293 verstärkt, wodurch
ein Kulturüberstand
erhalten wird, der einen Gehalt von ungefähr 1010 pfu/ml
an nicht-aufgereinigtem rekombinantem defektem Adenovirus aufweist.
-
Die
viralen Partikel werden anschließend durch Zentrifugation mit
Cäsiumchloridgradient
gemäß bekannten
Techniken aufgereinigt (siehe insbesondere Graham et al., Virology
52 (1973) 456). Das Adenovirus Ad-CMV.LPL kann bei –80°C in 20%
Glycerin aufbewahrt werden.
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Dieselbe
Vorgehensweise wird bei dem Plasmid pXL2419 oder pXL RSV-LPL oder
pXL RSV-LPLc erneut angewendet, wodurch das rekombinante Adenovirus
Ad.RSV.LPL oder Ad.RSV.LPLc entsteht.
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Beispiel 7 : in vivo Übertragung des Gens LPL durch
ein rekombinantes Adenovirus.
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In
diesem Beispiel wird die in vivo Übertragung des Gens LPL mittels
eines erfindungsgemäßen adenoviralen
Vektors beschrieben.
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Bei
den injizierten Adenoviren handelt es sich um die Adenoviren Ad-CMV.LPL
und Ad.LTR.LPL, die in Beispiel 5 hergestellt wurden und in aufgereinigter
Form (3,5 10
6 pfu/ml) in einer salzhaltigen
Phosphatlösung
(PBS) verwendet werden. Diese Virus werden der C57B1/6-Maus intravenös injiziert,
wobei die Vene des Schwanzes, der retroorbitale Sinus oder die Pfortader
verwendet werden. Die Expression einer aktiven Form der LPL wird
unter den Bedingungen, die in Beispiel 5 beschrieben sind, nachgewiesen. LISTE
DER SEQUENZEN
Schlüssel
zu den Figuren Figuren
Texte
source (français) | Zieltext
(Deutsch) |
|
Figure
1 | Figur
1 |
promoteur
CMV + intron | Promotor
CMV + Intron |
site
de polyadenylation de SV40 + intron t | Polyadenylierungsstelle
von SV40 + Intron t |
Figure
2 | Figur
2 |
promoteur
LTR-RSV | Promotor
LTR-RSV |
site
de polyadenylation de SV40 + intron t | Polyadenylierungsstelle
von SV40 + Intron t |
Figure
3 à 5 | Figur
3 bis 5 |
ADNc
de la LPL | cDNA
der LPL |
site
de polyadenylation de bGH | Polyadenylierungsstelle
von bGH |