DE69637251T2 - Kultivierung von Lawsonia intracellularis, Impfstoffe gegen Lawsonia intracellularis und diagnostische Mittel - Google Patents

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Impfstoffe gegen Lawsonia intracellularis und Verfahren zum Schutz gegen Lawsonia intracellularis-Infektionen und zu deren Diagnose. Die Produkte und Verfahren der Erfindung sind zum Teil als Ergebnis des verbesserten Verfahrens, das wir zum Züchten von L. intracellularis im Großmaßstab aufgefunden haben, zugänglich.
  • Beschreibung des Stands der Technik
  • L. intracellularis, der Erreger von porziner proliferativer Enteropathie ("PPE"), befällt praktisch alle Tiere, einschließlich Menschen, Kaninchen, Frettchen, Hamster, Füchse, Pferde und andere, so unterschiedliche Tiere, wie Strauße und Emus.
  • L. intracellularis stellt eine besonders wichtige Ursache für Verluste bei Schweineherden dar. Schätzungen über die Ausbreitung und das Auftreten von PPE in den USA gehen bis zu 20% der Schweineherden mit geschätzten Verlusten von jährlich 20 Millionen US-$.
  • Ein übereinstimmendes Merkmal von PPE ist das Auftreten von intrazytoplasmatischen, nicht-membrangebundenen, gekrümmten Bazillen innerhalb von Enterozyten in betroffenen Bereichen des Darms. Die mit PPE assoziierten Bakterien werden als "Campylobacter-artige Organismen" bezeichnet; S. McOrist et al., Vet. Pathol., Bd. 26 (1989), S. 260-264. Später wurden die bakteriellen Erreger als eine neue taxonomische Gattung und Spezies identifiziert und in der Fachsprache als "Ileal symbiont" (IS) intracellularis bezeichnet; C. Gebhart et al., Int'l. J. of Systemic Bacteriology, Bd. 43, Nr. 3 (1993), S. 533-538. Später erhielten diese neuen Bakterien die taxonomische Bezeichnung Lawsonia (L.) intracellularis; S. McOrist et al., Int'l. J. of Systemic Bacteriology, Bd. 45, Nr. 4 (1995), S. 820-825. Diese drei Bezeichnungen werden in austauschbarer Weise für den gleichen Organismus, der nachstehend näher identifiziert und beschrieben wird, verwendet. Wir entschieden uns dafür, bei der Erörterung der vorliegenden Erfindung durchgehend die taxonomische Bezeichnung L. intracellularis zu verwenden.
  • L. intracellularis ist ein ein abgeplattetes, intrazelluläres Bakterium, das nicht durch normale bakteriologische Methoden auf herkömmlichen zellfreien Medien gezüchtet werden kann und von dem man annimmt, dass es für sein Wachstum an Epithelzellen haften muss. S. McOrist et al., Infection and Immunity, Bd. 61, Nr. 10 (1993), S. 4286-4292, und G. Lawson et al., J. of Clinical Microbiology, Bd. 31, Nr. 5 (1993), S. 1136-1142, erörtern die Züchtung von L. intracellularis unter Verwendung von intestinalen IEC-18-Ratten-Epithelzellen-Monolayers in herkömmlichen Gewebekulturflaschen. Ferner erörtert H. Stills, Infection and Immunity, Bd. 59, Nr. 9 (1991), S. 3227-3236, die Verwendung von humanen, embryonalen, intestinalen "Intestine 407"-Zellmonolayers und Meerschweinchen-Kolon-Adenokarzinom-GPC-16-Zellmonolayers in herkömmlichen Gewebekulturflaschen. Diese bekannten Züchtungsverfahren sind arbeitsaufwändig und eignen sich nicht für eine Vergrößerung des Produktionsmaßstabs.
  • Die derzeitigen Kenntnisse über L. intracellularis-Infektionen und die Behandlung und wirksame Bekämpfung der Krankheit werden durch die anspruchsvollen Wachstumsbedürfnisse von L. intracellularis-in vitro-Kulturen stark behindert. Derzeit besteht ein Bedürfnis nach einem verbesserten Verfahren zur Züchtung von L. intracellularis. Ferner besteht ein Bedürfnis nach Impfstoffen gegen L. intracellularis und wirksamen Werkzeugen zur Diagnose von L. intracellularis-Infektionen.
  • Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
  • Eine Aufgabe der Erfindung ist es, Impfstoffe gegen L. intracellularis bereitzustellen.
  • Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, Verfahren zum Nachweisen des Vorliegens von Antikörpern gegen L. intracellularis in biologischen Proben bereitzustellen.
  • Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung eines verbesserten Züchtungsverfahrens, das eine Züchtung von L. intracellularis im Großmaßstab zur Erzeugung von Impfstoffen und Diagnostika ermöglicht.
  • Zur Lösung dieser und anderer Aufgaben und in Übereinstimmung mit den hier dargestellten und ausführlich beschriebenen Zielen der Erfindung werden erfindungsgemäß ein Verfahren zur Züchtung von L. intracellularis sowie die dadurch hergestellten Bakterien in großen Produktionsmengen bereitgestellt.
  • Gemäß diesem Verfahren werden L. intracellularis-Bakterien bei einer Sauerstoffkonzentration von etwa 0 bis etwa 18% inkubiert, wobei die Bakterien bewegt werden, um L. intracellularis zu züchten, während die Bakterien in Suspension gehalten werden.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird ein Verfahren zur Züchtung von L. intracellularis-Bakterien bereitgestellt, bei dem man eine HEp-2-, McCoys- oder IEC-18-Zellmonolayer, die eine Konfluenz von etwa 30% erreicht hat, mit einem Inokulum, das L. intracellularis-Bakterien umfasst, inokuliert, um die Zellen mit den Bakterien zu infizieren. Die infizierten Zellen werden sodann bei einer Temperatur von etwa 36 bis etwa 38°C bei einer Sauerstoffkonzentration von etwa 0% bis etwa 8,0% inkubiert, bis die Zellen einen konfluenten Zustand erreicht haben. Anschließend werden die infizierten Zellen und das Wachstumsmedium in einen Fermenter, einen Bioreaktor, eine Rührflasche oder einen anderen Behälter, der sich dazu eignet, die Zellen in Suspension zu halten, gegeben. Die infizierten Zellen werden unter Bewegen der Zellen inkubiert, so dass die Züchtung der L. intracellularis-Bakterien erfolgt, während die infizierten Zellen in Suspension gehalten werden. Ein Teil des gezüchteten L. intracellularis wird sodann auf frische Kulturzellen passagiert, um die Erzeugung von L. intracellularis-Bakterien zu erhöhen.
  • Erfindungsgemäß werden Impfstoffe gegen L. intracellularis und Verfahren zur Herstellung von Impfstoffen gegen L. intracellularis bereitgestellt. Avirulente L. intracellularis-Bakterien werden erzeugt, indem man die gezüchteten L. intracellularis-Bakterien einer ausreichenden Zahl von Passagen unterwirft und einen abgeschwächten Stamm auswählt oder indem man die gezüchteten Bakterien chemischen Abschwächungsmaßnahmen unterwirft. Abgetötete L. intracellularis-Impfstoffe werden ebenfalls unter Anwendung der erfindungsgemäßen Züchtungsverfahren hergestellt. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden die Bakterien kontinuierlich mindestens etwa 6 bis 8 Monate gezüchtet, während sie mindestens etwa 7 bis 12 Passagen unterworfen werden, um einen abgeschwächten Stamm zur Verwendung als Impfstoff zu erzeugen. Die abgeschwächten Bakterien werden sodann mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger vermischt und einem Tier in einer Menge verabreicht, die die Herbeiführung einer Immunantwort bewirkt. Wir haben den derzeit bevorzugten abgeschwächten Stamm (N343NP40wk) bei der American Type Culture Collection hinterlegt.
  • Erfindungsgemäß wird ferner ein Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit von Antikörpern, die in spezifischer Weise mit L. intracellularis-Bakterien in einer biologischen Probe reagieren, bereitgestellt, wobei man mindestens einen Teil der gezüchteten L. intracellularis-Bakterien erntet, eine von einem Tier stammende biologische Probe mit den geernteten L. intracellularis-Bakterien oder einer Komponente davon unter Bedingungen in Kontakt bringt, bei denen der in der biologischen Probe vorhandene Antikörper mit L. intracellularis oder der Komponente davon reagiert, und feststellt, ob eine Antikörper-Antigen-Reaktion stattgefunden hat.
  • Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden in der folgenden Beschreibung dargelegt und ergeben sich aus der Beschreibung oder bei der praktischen Ausübung der Erfindung.
  • Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
  • Der hier verwendete Ausdruck "L. intracellularis" bedeutet das intrazelluläre, gekrümmte, gram-negative Bakterium, das von C. Gebhart et al., Int'l. J. of Systemic Bacteriology, Bd. 43, Nr. 3 (1993), S. 533-538, und von S. McOrist et al., Int'l. J. of Systemic Bacteriology, Bd. 45, Nr. 4 (1995), S. 820-825 (diese Druckschriften werden jeweils vollständig durch Verweis zum Gegenstand der Beschreibung gemacht) beschrieben wird und umfasst (ohne Beschränkung hierauf) das als ATCC 55672 bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD, hinterlegte Bakterium; die als NCTC 12656 und 12657 beim National Collection of Type Cultures, Colindale, London, hinterlegten Bakterien; die bakteriellen Erreger, die von mit PPE infizierten Schweinen oder anderen Tieren weltweit auf der Grundlage des Fachwissens und der hier vermittelten Lehre erhalten werden können; und Varianten oder Mutanten beliebiger der vorstehenden Bakterien, die entweder spontan oder künstlich erhalten werden.
  • Der hier verwendete Ausdruck "abgeschwächter Stamm" bedeutet beliebige L. intracellularis-Stämme, die gemäß den hier vermittelten Züchtungs- und Passagetechniken zur Erreichung eines avirulenten Zustands unter Aufrechterhaltung von immunogenen Eigenschaften bei Verabreichung an ein Wirtstier hergestellt worden sind. Wie nachstehend dargelegt, wurden zahlreiche verschiedene L. intracellularis-Stämme unter Anwendung der vorliegenden Lehre gezüchtet und abgeschwächt, wodurch man abgeschwächte, immunogene Stämme erhielt, die wirksame Impfstoffe für Schweine und andere Tiere, die gegenüber L. intracellularis-Infektionen empfindlich sind, darstellen.
  • Es wird erwartet, dass die abgeschwächten Stämme der Erfindung sich als Immunogene in antimikrobiellen Impfstoffen für Tiere, einschließlich Vögel, Fische, Rinder, Schweine, Pferde, Säugetiere und allgemein Primaten sowie Menschen, eignen. Derartige Impfstoffe lassen sich bei Kenntnis der hier vermittelten Lehre durch dem Fachmann geläufige Techniken herstellen. Ein derartiger Impfstoff umfasst eine immunologisch wirksame Menge des abgeschwächten Stammes in einem pharmazeutisch verträglichen Träger. Der Impfstoff kann in einer oder mehreren Dosen verabreicht werden. Eine immunologisch wirksame Menge lässt sich ohne unzumutbaren experimentellen Aufwand bei Berücksichtigung der hier vermittelten Lehre durch dem Fachmann geläufige Maßnahmen festlegen. Die Menge der avirulenten Bakterien soll ausreichen, eine Immunantwort bei gegenüber der Krankheit empfindlichen Tieren hervorzurufen, wobei noch ein avirulenter Zustand erhalten bleibt. Diese Menge hängt jeweils von den speziellen Umständen hinsichtlich Tier, Bakterium und Krankheit ab. Die empfohlene Dosis zur Verabreichung an ein empfindliches Tier beträgt vorzugsweise etwa 103 bis 109 Bakterien/kg Körpergewicht und insbesondere etwa 105 bis 107 Bakterien/kg Körpergewicht. Die Trägerstoffe sind dem Fachmann geläufig und umfassen Stabilisatoren und Verdünnungsmittel. Ein derartiger Impfstoff kann auch ein geeignetes Adjuvans enthalten. Die erfindungsgemäßen Impfstoffe können in Kombination mit anderen Impfstoffen verwendet werden, z. B. als Verdünnungsmittel eines anderen lyophilisierten Impfstoffes, oder sie können vor der Lyophilisation mit einem anderen Impfstoff vereinigt werden. Die Impfstoffpräparate können auch beispielsweise durch Gefriertrocknung entwässert werden, um sie zu lagern oder für die anschließende Zubereitung zu flüssigen Impfstoffen bereitzustellen.
  • Demzufolge umfasst die Erfindung auch ein Verfahren zur Induktion einer Immunantwort gegen virulente Wildtyp-L. intracellularis-Bakterien in einem Wirtstier, um den Wirt gegen derartige Bakterien zu schützen. Das Verfahren umfasst die Verabreichung einer immunologisch wirksamen Menge der erfindungsgemäßen abgeschwächten oder abgetöteten Bakterien an den Wirt und vorzugsweise die Verabreichung des erfindungsgemäßen Impfstoffes an den Wirt.
  • Der hier verwendete Ausdruck "Züchtung im Großmaßstab" bedeutet einen Umfang der Züchtung von L. intracellularis in einer Menge von mehr als etwa 2,0 bis 3,0 Liter und umfasst die Herstellung in einem Maßstab von 100 Litern oder mehr. Der hier verwendete Ausdruck "Züchtung" bedeutet das Verfahren zur Förderung des Wachstums, der Reproduktion und/oder Proliferation von L. intracellularis.
  • Bei der praktischen Durchführung des erfindungsgemäßen Züchtungsverfahrens können Kulturzellen zunächst mit einem Inokulum, das L. intracellularis-Bakterien umfasst, inokuliert werden, um die Zellen mit den Bakterien zu infizieren. Bei der praktischen Ausübung der Erfindung können zahlreiche Zelllinien verwendet werden, einschließlich (ohne Beschränkung hierauf) IEC-18 (ATCC 1589) – Ratten-Darmepithelzellen, HEp-2 (ATCC 23) – humane, epidermoide Karzinomzellen, McCoys (ATCC 1696) – (unspezifizierte) Mäusezellen, MDCK (ATCC 34) – Madin-Darby-Hundenierenzellen, BGMK (Biowhittaker #71-176) – "Buffalo Green Monkey Kidney"-Zellen und intestinale Epithelzellen von Schweinen. Die bevorzugten Kulturzellen sind HEp-2-, McCoys- oder IEC-18-Zellen. Alternativ können die Bakterien in einem zellfreien System gezüchtet werden, sofern die Bakterien bei der entsprechenden Konzentration von gelöstem O2 gemäß der hier vermittelten Lehre gehalten werden.
  • Wenn Kulturzellen verwendet werden, liegen die Zellen vor der Inokulation vorzugsweise (jedoch nicht notwendigerweise) in Form einer Monolayer vor. Um eine Monolayer zu bilden, können die Zellen auf herkömmliche Flaschen überimpft werden. Jeder Kolben wird im allgemeinen mit 1 × 105 Zellen bis etwa 10 × 105 Zellen pro 25 cm2-Kolben im Gemisch mit Wachstumsmedium beimpft. Beim Wachstumsmedium kann es sich um ein beliebiges Medium für die Zellzüchtung handeln, das eine Stickstoffquelle, für die gewählten Kulturzellen notwendige Wachstumsfaktoren und eine Kohlenstoffquelle, wie Glucose oder Lactose, enthält. Beim bevorzugten Medium handelt es sich um DMEM mit 2-5% fötalem Kälberserum, obgleich verschiedene andere handelsübliche Medien unter Erzielung von guten Ergebnissen eingesetzt werden können.
  • Wir haben festgestellt, dass die erfolgreiche Züchtung von L. intracellularis durch Aufrechterhaltung der Kulturzellen in einem konstanten Wachstumszustand verstärkt werden kann. Daher soll die Kulturzellen-Monolayer zum Zeitpunkt der Inokulation bei etwa 20% bis etwa 50% Konfluenz vorliegen. Vorzugsweise sollen die Zellen zum Zeitpunkt der Inokulation bei einer Konfluenz von etwa 30% bis etwa 40% und insbesondere bei etwa 30% vorliegen.
  • Beim Inokulum kann es sich um eine reine Kultur von L. intracellularis handeln, die beispielsweise aus der ATCC-Hinterlegung 55672, aus den NCTC-Hinterlegungen 12656 oder 12657 oder von infizierten Schweinen oder anderen Tieren unter Anwendung der hier beschriebenen Isolierungs- und Reinigungstechniken stammt.
  • Gemäß einer Ausführungsform handelt es sich beim Inokulum für die praktische Durchführung der Erfindung um ein intestinales Homogenisat, das durch Abschaben der Schleimhaut vom Ileum eines Schweins oder eines anderen Tiers, die mit PPE infiziert sind, hergestellt worden ist. Bei der Herstellung eines intestinalen Homogenisats zeigen für die Kultur ausgewählte ileale Schnitte schwere Läsionen mit groben Verdickungen des Darms. Aufgrund der fragilen Natur der Bakterien sollen die Proben nach der Nekropsie so rasch wie möglich vorzugsweise bei -70°C aufbewahrt werden. Ein Antibiotikum, gegen das L. intracellularis resistent ist, z. B. Vancomycin, Amphotericin B oder Mitglieder der Aminoglycosid-Gruppe von Antibiotika, einschließlich Gentamicin und Neomycin, um nur einige aufzuführen, wird vorzugsweise dem Inokulum zugesetzt, um verunreinigende Bakterien zu unterdrücken, während das Wachstum von L. intracellularis zugelassen wird. Unabhängig davon, ob es sich beim Inokulum um eine reine Kultur oder um ein intestinales Homogenisat handelt, kann eine Inokulation der Kulturzellen nach verschiedenen Techniken, die aus dem Stand der Technik unter Berücksichtigung der hier vermittelten Lehre bekannt sind, durchgeführt werden.
  • Die Bakterien und/oder inokulierten Kulturzellen werden sodann bei einer verringerten Konzentration an gelöstem O2 inkubiert. Bei Konzentrationen an gelöstem Sauerstoff von mehr als 18% ergibt sich kein optimales Wachstum von L. intracellularis, wobei es bei Sauerstoffkonzentrationen außerhalb dieses Bereiches schließlich zum Wachstumsstillstand kommt. Vorzugsweise werden die inokulierten Kulturzellen bei einer Konzentration von gelöstem Sauerstoff im Bereich von etwa 0 bis etwa 10% inkubiert. Insbesondere werden die Zellen bei einer Sauerstoffkonzentration im Bereich von etwa 0 bis etwa 8% inkubiert, wobei eine Sauerstoffkonzentration von etwa 0 bis etwa 3,0% besonders bevorzugt wird.
  • Die geeignete Konzentration an Kohlendioxid ist ebenfalls für das einwandfreie Wachstum von L. intracellularis wichtig. Bei Kohlendioxidkonzentrationen von mehr als 10% und von weniger als 4% erfolgt kein optimales Wachstum, wobei bei Kohlendioxidkonzentrationen außerhalb dieses Bereiches schließlich ein Wachstumsstillstand eintritt. Vorzugsweise liegt die Kohlendioxidkonzentration im Bereich von etwa 6 bis etwa 9%, wobei eine Kohlendioxidkonzentration von etwa 8,8% besonders bevorzugt wird.
  • Ferner werden die Zellen vorzugsweise bei einer Wasserstoffkonzentration im Bereich von etwa 73% bis etwa 94% inkubiert. Stickstoff kann anstelle eines Teils oder der Gesamtheit des vorhandenen Wasserstoffes verwendet werden. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden die Zellen bei etwa 0-8,0% O2, etwa 8,8% CO2 und etwa 83,2% H2 inkubiert.
  • Inokulierte Zellen können in einem dualen Gasinkubator oder einer anderen Gaskammer inkubiert werden, die die geeigneten Konzentrationen an Sauerstoff und Kohlendioxid enthalten und die es erlauben, die Zellen während der Inkubation in Suspension zu halten. Die Kammer soll Mittel, um die inokulierten Zellen in Suspension zu halten, und einen Gasmonitor und eine Gaszufuhrquelle zur Zufuhr und Aufrechterhaltung der geeigneten Gaskonzentrationen umfassen. Die Inkubationstemperaturen sollen im Bereich von 30 bis 45°C und vorzugsweise im Bereich von etwa 36 bis etwa 38°C liegen. insbesondere beträgt die Temperatur etwa 37°C. Die erforderliche Ausrüstung für die erfindungsgemäßen Züchtungs- und Abschwächungsverfahren sind für den Fachmann bei Kenntnis der hier vermittelten Lehre leicht zugänglich. Ein Beispiel für eine Ausrüstung, die zur Ausübung der vorliegenden Erfindung geeignet ist, ist ein dualer Gasinkubator, z. B. das Modell 480 der Fa. Lab-Line, Melrose Park, Illinois, in Verbindung mit Rührflaschen, um die Zellen in Suspension zu halten. Die derzeit bevorzugte Ausrüstung umfasst einen Fermenter, einen Bioreaktor oder einen Drehschüttler, die mindestens etwa 2 Liter Medium enthalten und dazu befähigt sind, die Kulturzellen durch Einleiten von Gas oder eine andere Einrichtung zum mechanischen Bewegen in Suspension zu halten, wobei die Konzentration an gelöstem O2 im Medium kontinuierlich überwacht wird. Für diesen Zweck geeignete Fermenter und Bioreaktoren werden von New Brunswick, Braun und anderen Firmen hergestellt.
  • Indem man die inokulierten Zellen während der Inkubation im suspendierten Zustand hält, lässt sich ein maximales Wachstum der Zellen und somit von L. intracellularis erreichen, wobei die Einwirkung des Wachstumsmediums und des geeigneten Gemisches aus Sauerstoff und Kohlendioxid auf die einzelnen Zellen verstärkt wird. Die Kulturzellen können durch eine Reihe von aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren bewegt und in Suspension gehalten werden, wozu beispielsweise Kulturflaschen, Rollflaschen, Membrankulturen und Rührflaschen gehören. Die Zellen können während der Inkubation in Suspension gehalten werden, indem man die Zellen in einer Rührflasche im Innern eines dualen Gasinkubators oder einer ähnlichen Vorrichtung inkubiert. Der hier verwendete Ausdruck "Rührflasche" bedeutet eine Flasche oder einen anderen Behälter, der sich eines Rührarms, eines Propellers oder dergl. bedient, um die Kultur zu bewegen und die darin enthaltenen Zellen in Suspension zu halten.
  • Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die inokulierten Zellen so lange inkubiert, bis sie den konfluenten Zustand erreichen. Anschließend werden die Zellen in eine Rührflasche, die Wachstumsmedium enthält, gegeben und in einem dualen Gasinkubator unter Rühren der Flasche inkubiert. Vorzugsweise werden die inokulierten Zellen durch Abschaben in die Rührflasche gebracht. Dies kann durch eine Vielzahl von aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren erreicht werden, z. B. unter Verwendung eines Zellschabers zum Ablösen der Zellen. Nachdem die Zellen in die Rührflasche gebracht worden sind, wird der Rührarm der Rührflasche typischerweise mit etwa 30 bis etwa 60 U/min rotiert, um die infizierten Zellen in Suspension zu halten.
  • Ein Teil des gezüchteten L. intracellularis wird sodann auf frische Kulturzellen passagiert, um die Erzeugung der L. intracellularis-Bakterien zu verstärken. Der Ausdruck "Passagieren" oder Variationen davon bedeuten den Vorgang des Übertragens eines Teils des gezüchteten L. intracellularis auf frische Kulturzellen, um die frischen Zellen mit dem Bakterium zu infizieren. Der hier verwendete Ausdruck "frisch" bedeutet Zellen, die noch nicht mit L. intracellularis infiziert worden sind. Vorzugsweise weisen derartige Zellen durchschnittlich ein Alter von nicht mehr als etwa 1 Tag auf.
  • Die Passage von L. intracellularis in Suspensionskulturen kann erreicht werden, indem man einen Teil der ursprünglichen Kultur entnimmt und diesen Teil auf einen neuen Kolben, der frische Kulturzellen enthält, überträgt. Wenn die ursprüngliche Kultur eine große Anzahl an Bakterien/ml aufweist, z. B. mehr als etwa 104 Bakterien/ml, ist es bevorzugt, etwa 1 bis 10% (Vol./Vol.) Kultur aus der infizierten Flasche in eine neue Flasche mit einem Gehalt an frischen Zellen zu übertragen. Dies wird vorzugsweise durchgeführt, wenn 50 bis 100% der Zellen infiziert sind. Wenn weniger als 50% der Zellen infiziert sind, wird eine Passage vorzugsweise durchgeführt, indem man die Kultur im Verhältnis 1:2 auf eine neue Flasche aufteilt und das Volumen durch Zugabe von frischem Medium vergrößert. In beiden Fällen sind eine Lysis von Zellen und andere Stufen nicht erforderlich, in direktem Gegensatz zur Passage von Monolayer-Kulturen gemäß dem Stand der Technik.
  • Nach einem ausreichenden Wachstum der Kulturzellen und einer anschließenden Infektion durch L. intracellularis mit einer Zellinfektivität von mehr als etwa 70% (bestimmt durch IFA, TCID50 oder ein anderes vergleichbares Verfahren) wird mindestens ein Teil der gezüchteten L. intracellularis-Bakterien geerntet. Der Ernteschritt kann durchgeführt werden, indem man die Bakterien von der Suspension abtrennt, wobei man sich verschiedener Techniken, die für den Fachmann angesichts der hier vermittelten Lehre ersichtlich sind, bedient. Vorzugsweise werden die L. intracellularis-Bakterien geerntet, indem man den Inhalt der Gesamtheit der Suspension oder eines Teils davon zentrifugiert, um die Kulturzellen zu pelletisieren, die erhaltenen Zellpellets resuspendiert und die infizierten Zellen lysiert. Typischerweise wird mindestens ein Teil des Inhalts etwa 20 Minuten mit etwa 3 000 × g zentrifugiert, um die Zellen und Bakterien zu pelletisieren. Das Pellet kann anschließend beispielsweise in einer Saccharose-Phosphat-Glutamat (SPG)-Lösung resuspendiert werden und etwa 4-mal durch eine Nr. 25-Nadel geleitet werden, um die Lysis der Zellen vorzunehmen. Wenn eine weitere Reinigung angestrebt wird, können die Proben etwa 5 Minuten bei etwa 145 × g zentrifugiert werden, um Zellkerne und Bruchstücke zu entfernen. Der Überstand kann anschließend etwa 20 Minuten mit etwa 3 000 × g zentrifugiert werden, wonach das erhaltene Pellet in einem geeigneten Verdünnungsmittel, wie SPG mit fötalem Kälberserum (zur Herstellung von geernteten Bakterien, die sich zum Einfrieren oder als Inokulans eignen) oder Wachstumsmedium (zur Herstellung von geernteten Bakterien, die sich besser für die Passage auf frische Zellen eignen), resuspendiert werden kann.
  • Wie vorstehend erwähnt, wird das effektive Wachstum von L. intracellularis für eine Herstellung im Großmaßstab verstärkt, indem man die Gewebezellen in einem aktiven Wachstumszustand hält. Bei Monolayers nimmt dann, wenn die Kulturen den konfluenten Zustand erreicht haben, die Geschwindigkeit der Zellteilung erheblich ab. Versuche zur Züchtung von L. intracellularis auf Monolayer-Gewebekulturen hatten nur begrenzten Erfolg und eine Vergrößerung des Produktionsmaßstabs war nicht möglich. Dagegen erleichtert es die Verwendung von Suspensionskulturen in erheblichem Maße, das aktive Wachstum der Zellen aufrechtzuerhalten, und ermöglicht eine kontinuierliche Kulturerweiterung und Maßstabsvergrößerung. Unter Verwendung eines Fermenters und bei Anwendung einer Konzentration an gelöstem O2 von etwa 0-3% (wie vorstehend erläutert) waren wir dazu in der Lage, bis zu 108 Bakterien/ml zu züchten. Ferner waren wir in der Lage, die gezüchteten Bakterien über viele Monate hinweg in einem aktiven Wachstumszustand zu halten. Wir erwarten, dass es möglich sein wird, die Züchtung unbegrenzt fortzusetzen.
  • Vor der vorliegenden Erfindung hat man allgemein angenommen, dass Zellen an einer Oberfläche haften müssen, um mit L. intracellularis infiziert zu werden. Die erfindungsgemäßen Zellsuspensionen stellen etwas Besonderes dar und widersprechen dieser Theorie. Bei Verwendung von McCoys- oder IEC-18-Zellen ist es bevorzugt, Gelatine-, Agarose-, Kollagen-, Acrylamid- oder Siliciumdioxid-Kügelchen, z. B. die porösen Cultisphere-G-Mikroträger der Fa. HyClone Laboratories, Logan, UT, zusammen mit dem Wachstumsmedium zuzusetzen. Jedoch erfordern HEp-2-Zellen und andere Zellen beim erfindungsgemäßen Züchtungsverfahren keine Mikroträger. Dies stellt einen besonders vorteilhaften und wirtschaftlichen Weg für die Züchtung im Großmaßstab dar.
  • Zu Kultur-Aufrechterhaltungszwecken werden bei HEp-2-Kulturen in wöchentlichen Abständen vorzugsweise 25-50% der Kultur entnommen und durch frisches Medium ersetzt. Für Zellkulturen mit Mikroträgern oder Kügelchen werden 1- bis 2-mal wöchentlich vorzugsweise 25-50% der Kultur entfernt und durch frische Mikroträger oder Kügelchen und frisches Medium ersetzt. Zu Zwecken der Vergrößerung des Produktionsmaßstabs kann die Kultur mit weiteren 25-50% Medium oder Medium zusammen mit Mikroträgern versetzt werden.
  • Je nach der Geschwindigkeit, mit der die Kulturzellen infiziert werden, erfolgt die Passage auf frische Zellen im allgemeinen etwa alle 2 bis etwa alle 5 Wochen. Unter der Annahme, dass die Kulturzellen innerhalb von 2 bis 3 Wochen zu mindestens 70% infiziert werden, erfolgt die Passage nach etwa 3 bis 4 Wochen.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch Impfstoffe und Verfahren zur Erzeugung von Impfstoffen gegen L. intracellularis bereit. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden die infizierten Zellen für eine längere Zeitspanne (z. B. 6 bis 8 Monate) in Suspension gehalten, wonach mindestens ein Teil der gezüchteten L. intracellularis-Bakterien geerntet und auf eine potentielle Abschwächung geprüft wird. Eine derartige Prüfung wird vorzugsweise durch Belastung von Wirtstieren oder Tiermodellen durchgeführt, um einen abgeschwächten Stamm auszuwählen. Derartige abgeschwächte Stämme werden gemäß den hier beschriebenen Verfahren in Impfstoffen verwendet. Die abgeschwächten L. intracellularis-Impfstoffe gemäß der vorliegenden Erfindung haben sich als wirksam gegen L. intracellularis-Infektionen bei einer Vielzahl von Tieren erwiesen und ihre Wirksamkeit wird auch beim Menschen erwartet.
  • Die vorliegende Erfindung ermöglicht eine rasche Kulturexpansion, eine Ausbeutesteigerung von 100- bis 1000-fach und eine Kostenverringerung. Infolgedessen werden die durch das erfindungsgemäße Züchtungsverfahren in reichlichem Umfang erzeugten L. intracellularis-Bakterien zu Zwecken der Impfstofferzeugung in einfacher Weise abgeschwächt. Eine Abschwächung in Monolayer-Kulturen ist aufgrund der geringen Bakterienausbeute, die bei herkömmlichen Monolayer-Züchtungstechniken erzielt wird, schwierig. Im Gegensatz dazu werden durch das erfindungsgemäße Verfahren zur Züchtung von L. intracellularis die Einfachheit und die Geschwindigkeit der Züchtung sowie die Anzahl der für diesen Zweck verfügbaren Bakterien erheblich gesteigert. Je mehr Zellen vorliegen und je häufiger Zellteilungen erfolgen, desto höher ist der Grad von auftretenden Mutationen, die bei der Impfstoffentwicklung vorteilhaft sind. Das erfindungsgemäße Wachstum in Suspension erhöht die Expression von wichtigen Immunogenen, die durch umweltregulierte Gene und deren Expressionsprodukte gesteuert werden.
  • Die erhaltenen abgeschwächten Stämme können gemäß den nachstehenden Ausführungen in Beispiel 1 in Gewebekultur-Monolayers gezüchtet werden, werden aber vorzugsweise nach dem erfindungsgemäßen Verfahren in Suspensionskulturen gezüchtet. Zu weiteren Mitteln zur Abschwächung können eine chemische Abschwächung gehören, beispielsweise unter Verwendung von N-Methylnitrosoguanidin und anderen bekannten Mitteln. Unabhängig davon, ob Mehrfachpassagen vorgenommen oder chemische Maßnahmen ergriffen werden, wird abgeschwächtes L. intracellularis erzeugt und für die Impfstoffherstellung ausgewählt.
  • Gemäß einer erfindungsgemäßen Impfstoff-Ausführungsform wird das Antigen durch Zentrifugation oder Mikrofiltration gemäß den vorstehenden Ausführungen geerntet. Anschließend wird das Antigen auf einem definierten Niveau auf der Grundlage der optimalen Wirtstier-Immunantwort, die durch eine Dosistitration in der Wirtstierspezies festgelegt wird, standardisiert. Die Bakterien können durch längere Einwirkung, z. B. über 1 Woche hinweg, von Umwelt-O2-Konzentrationen oder durch Verwendung von 0,3% Formalin oder anderer Inaktivierungsmittel, inaktiviert werden, um einen abgetöteten Impfstoff herzustellen. Das Antigen wird sodann einem geeigneten Adjuvans, wie Aluminiumhydroxid oder Mineralöl, einverleibt, um die Immunantwort zu verstärken. Anschließend wird das Antigen zur Impfung des Wirts durch eine intramuskuläre oder subkutane Injektion verwendet, und zwar im Fall von Schweinen in einem Alter von etwa 3 bis 4 Wochen, wobei gegebenenfalls eine Auffrischungsdosis verabreicht wird.
  • Alternativ werden gemäß einer besonders bevorzugten Impfstoff-Ausführungsform unter Anwendung der vorstehend beschriebenen Züchtungsverfahren die Bakterien einer seriellen Passage unterzogen, um eine abgeschwächte, avirulente, lebende Kultur zu induzieren und auszuwählen. Die Kultur wird im Wirtstier (nach vorzugsweise mindestens 6 bis 8 Monaten oder mehr des Wachstums in der Suspensionskultur) auf Anzeichen von Abschwächung getestet. Die Kultur wird gemäß den vorstehenden Angaben geerntet und verdünnt. Schweine werden beispielsweise auf oralem Wege mit 1 × 105 bis 1 × 106 Bakterien geimpft. Etwa 28 Tage nach der Impfung werden die Schweine oral mit etwa 1 × 107 Organismen einer weniger oft passagierten (etwa 30 bis 45 Tage alten) virulenten Kultur von L. intracellularis inokuliert. Die infizierten Tiere werden 21 Tage nach der Belastung der Nekropsie unterzogen und ihr Dünndarm wird einer Inspektion auf große Läsionen sowie auf mikroskopische Läsionen unterzogen. Auch eine PCR- und Fluoreszenz-Antikörper-Analyse sollte durchgeführt werden. Etwa 80% der Kontrolltiere zeigen grobe oder mikroskopische Läsionen und ergeben einen positiven Test auf die Anwesenheit von L. intracellularis in den Schleimhautzellen des Dünndarms bei Anwendung von PCR- oder FA-Testverfahren. Geimpfte Tiere weisen normale Schleimhautoberflächen auf, wie durch histologische Begutachtung festgestellt wird, und erweisen sich beim PCR-Test als negativ.
  • Im allgemeinen wird ein abgeschwächter, immunogener L. intracellularis-Stamm nach kontinuierlicher Züchtung von mindestens etwa 150 bis 250 Tagen erzeugt, wobei während dieser Zeitspanne die Kultur mindestens etwa 7- bis 12-mal passagiert wird. Weitere abgeschwächte Kulturen können durch Variation dieser Zahlenwerte erzeugt werden, sofern man die hier angegebenen Überwachungs- und Selektionsverfahren anwendet.
  • Anschließend wird ein Impfstoff hergestellt, der eine immunologisch wirksame Menge des abgeschwächten L. intracellularis in einem pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst. Beim kombinierten Produkt aus Immunogen und Träger kann es sich um eine wässrige Lösung, Emulsion oder Suspension handeln. Eine immunologisch wirksame Menge lässt sich durch aus dem Stand der Technik bekannte Verfahren ohne unzumutbaren experimentellen Aufwand bei Berücksichtigung der hier vermittelten Lehre bestimmen. Im allgemeinen beträgt die Menge des Immunogens 50 bis 500 μg und vorzugsweise 107 bis 109 TCID50, wenn gereinigte Bakterien verwendet werden.
  • Die erfindungsgemäßen Impfstoffe werden im allgemeinen an empfindliche Tiere, vorzugsweise Schweine, in einer oder mehreren Dosen verabreicht. Der lebende oder abgetötete Impfstoff kann 1- oder 2-mal in Abständen von 2 Wochen verabreicht werden. Für die abgeschwächten Lebendimpfstoffe wird eine einzige Dosis bevorzugt. Bei den bevorzugten Verabreichungswegen für lebende, abgeschwächte Stämme handelt es sich um eine orale oder intranasale Verabreichung, wobei man sich aber auch einer intramuskulären oder subkutanen Injektion bedienen kann. Die Verabreichungswege durch intramuskuläre und subkutane Injektion werden für den abgetöteten Impfstoff bevorzugt.
  • Eine wirksame Diagnose von PPE wurde bisher auch durch den Zeitaufwand, der für die Züchtung der Erregerbakterien erforderlich war, behindert. Als Ergebnis der vorliegenden Erfindung ist nunmehr die Entwicklung von diagnostischen Werkzeugen möglich, die rasche und genaue Tests auf die Anwesenheit von L. intracellularis in biologischen Proben, die Schweinen oder anderen gegenüber PPE empfindlichen Tieren entnommen worden sind, fördern.
  • Die nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung gezüchteten L. intracellularis-Bakterien oder von derartigen Bakterien abgeleitete Komponenten können als ein Antigen in einem ELISA-Test oder einem anderen Immunoassay, z. B. im Immunofluoreszenz-Antikörpertest ("IFA"), verwendet werden, um Antikörper gegen L. intracellularis im Serum und anderen Körperflüssigkeiten von Tieren mit einem Verdacht an einer Infektion mit den Bakterien verwendet werden. Beim derzeit bevorzugten Immunoassay handelt es sich um einen IFA-Test, der im nachstehenden Beispiel beschrieben wird. Alternativ können die erfindungsgemäß gezüchteten Bakterien in einem Western-Blot-Test verwendet werden.
  • Das bevorzugte ELISA-Verfahren gemäß dieser Ausführungsform wird nachstehend angegeben:
    • 1. Es wird 0,1 ml/Vertiefung Antigen in Verdünnung in Beschichtungspuffer zugesetzt. Eine 18-ständige Inkubation bei 4°C wird durchgeführt.
    • 2. Es wird 3-mal mit PBS gewaschen.
    • 3. 0,25 ml Blockierungspuffer werden in die einzelnen Vertiefungen der Platte gegeben. Es wird eine 1- bis 2-stündige Inkubation bei 37°C durchgeführt.
    • 4. Es wird 3-mal mit Waschpuffer gewaschen.
    • 5. Serum wird im Blockierungspuffer verdünnt und in einer Menge von 0,1 ml zu den ersten Vertiefungen der Platte gegeben. Über die Platte hinweg werden 1:2-Reihenverdünnungen durchgeführt. Eine 1-stündige Inkubation bei 37°C wird durchgeführt.
    • 6. Es wird 3- bis 5-mal mit Waschpuffer gewaschen.
    • 7. Konjugat wird in Blockierungspuffer verdünnt und in einer Menge von 0,1 ml in die Vertiefungen der Platte gegeben und 1 Stunde bei 37°C inkubiert.
    • 8. Es wird 3- bis 5-mal mit Waschpuffer gewaschen.
    • 9. Substrat wird zugegeben.
    • 12. Die Absorption von Licht wird mit einem Spektrophotometer gemessen.
    • 13. Vertiefungen, die nicht mit Antigen versetzt worden sind, werden als Leerwerte verwendet.
    • 14. Positives und negatives Schweinekontrollserum sollte ebenfalls bei jedem Test eingesetzt werden.
  • Nachstehend wird das bevorzugte Western-Blot-Verfahren angegeben:
    • 1. Man lässt Antigen an 12% SDS-PAGE laufen und überträgt es auf eine Nitrocellulose-Membran.
    • 2. Man gibt die Membran 2 Stunden in Blockierungspuffer.
    • 3. Man entfernt den Blockierungspuffer und spült 1 Minute mit PBS.
    • 4. Serum wird im Blockierungspuffer verdünnt und zur Membran gegeben. Es wird eine 2-stündige Inkubation bei Raumtemperatur durchgeführt.
    • 5. Es wird 3-mal mit Waschpuffer gewaschen (5 Minuten für jeden Waschvorgang).
    • 6. Konjugat wird in Blockierungspuffer verdünnt und zur Membran gegeben. Es wird 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.
    • 7. Es wird 3-mal mit Waschpuffer gewaschen.
    • 8. Substrat wird 10 Minuten oder bis zum Auftreten einer starken Bandenbildung zugegeben.
    • 9. Es wird mit PBS gespült.
    • 10. Nach Trocknung an der Luft erfolgt eine Lagerung im Dunkeln.
  • Die vorliegende Erfindung wird in den nachstehenden Beispielen, die lediglich Erläuterungszwecken dienen und nicht als Beschränkung anzusehen sind, näher beschrieben.
  • Beispiel 1
  • Isolierung von L. intracellularis aus dem Darm von amerikanischen Schweinen mit porziner proliferativer Enteropathie
  • Materialien und Methoden
  • Auswahl von Inokulumproben
  • Die Probe N24912 wurde von einer Herde auf einer Farm in Iowa erhalten, wobei bei 15 von 300 schlachtreifen Tieren im Alter von 5 Monaten trotz Behandlung mit Penicillin hartnäckig blutiger Stuhl festgestellt wurde. Bei der Nekropsie der Schweine zeigte der Darm (Ileum) eine verdickte Schleimhaut. Histopathologische Untersuchungen mit Silberfärbung ergaben das Vorliegen von gekrümmten, intrazellulären Bakterien und eine verborgene Enterozyten-Hyperplasie, was die Diagnose von PPE bestätigte. Die Probe N72994 wurde von einer 1,5 Jahre alten Muttersau nach dem zweiten Wurf in einer Farm in Minnesota erhalten.
  • Die Größe der Herde betrug 70-80 Sauen. Über eine Behandlung mit Antibiotika war nichts bekannt. Bei Nekropsie erwies sich die Schleimhaut des Ileums als verdickt mit einigen Hämorrhagien. Eine Giminez-Färbung der Schleimhaut ergab zahlreiche gekrümmte Bakterien. Die Probe N101494 wurde von einem 12 Wochen alten Schwein aus einer Farm in Indiana mit 600 "Furrow to finish"-Sauen erhalten. Das Schwein wurde beim Einsetzen von blutigem Durchfall mit einer Tylan-Injektion behandelt. Jedoch starb das Tier bald nach der Behandlung.
  • Vorbereitung eines vom Schwein abgeleiteten bakteriellen Inokulums
  • Darmproben wurden bei -70°C aufbewahrt. Der Darm wurde geöffnet und mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen. Schleimhautproben von 1 g wurden in Natriumkaliumglutamat (SPG) geschabt und 30 Sekunden mit 4,0 ml 1% Trypsin (JRH Biosciences, Lenexa, KS) in SPG homogenisiert. Die Suspensionen wurden 35 Minuten bei 37°C inkubiert. 10 ml SPG/10% fötales Kälberserum (FCS) (JRH Biosciences, Lenexa, KS) wurden zugegeben und die Proben wurden 1 Minute in einer Gewebe-Mahlvorrichtung gemahlen. 10 ml SPG/10% FCS wurden zugegeben. Sodann wurde 1-mal durch Filterpapier (Whatman 113 V, Whatman Labsales, Hillsboro, OR) und anschließend durch 5,0-, 1,0- und 0,65 μm-Membranfilter filtriert. Die Filtrate wurden in Aliquotanteile aufgeteilt und in 1,0 ml-Aliquotmengen auf -70°C eingefroren. Die Schleimhaut wurde auf einem Objektträger für die Giminez-Färbung ausgestrichen. Getrennte Ausstriche von Filtraten wurden durch IFA unter Verwendung eines spezifischen monoklonalen Antikörpers für L. intracellularis gefärbt; S. McOrist et al., Vet. Rec., Bd. 121 (1987), S. 421-422 (durch Verweis wird der gesamte Inhalt dieser Druckschrift zum Gegenstand der Beschreibung gemacht).
  • Zellkultur
  • IEC-18-Zellen (Ratten-Darmepithelzellen, ATCC CRL 1589) wurden in DMEM (JRH Biosciences, Lenexa, KS) mit L-Glutamin und 10% FCS gezüchtet und wöchentlich einer routinemäßigen Trypsin-Passage unterworfen. Zell-Monolayers wurden in Luft mit einem Gehalt an 5% CO2 bei 37°C gezüchtet.
  • Infektion der Zellkultur
  • IEC-18-Zellen wurden in einer Menge von 1,25 × 105 Zellen auf 25 cm2-Flaschen überimpft und mit vergleichbaren Raten in Chamberslides (Objektträger mit Kammerstruktur, Nunc. Inc., Naperville, IL) 24 Stunden inkubiert. Anschließend wurden die Medien entfernt. Eingefrorene, von Schweinen stammende Bakterienisolate wurden rasch aufgetaut und in DMEM/7% FCS mit einem Gehalt an Vancomycin (100 μg/ml) und Amphotericin B (2,0 μg/ml) in einem Verhältnis von 1,0 ml Homogenisat auf 15 ml Medium verdünnt und zu den Monolayers gegeben. Monolayers und bakterielle Suspensionen wurden 30 Minuten mit 2 000 × g zentrifugiert und sodann auf anaerobe Standgefäße übertragen. Die Gefäße wurden evakuiert und das Gas wurde durch Wasserstoff und Kohlendioxid unter Erzielung eines Gemisches aus 8,0% O2, 10% CO2 und 82% H2 ersetzt. Die Kulturen wurden 3 Stunden bei 37°C inkubiert und sodann erneut mit DMEM/7% FCS mit L-Glutamin, Vancomycin (100 μg/ml), Neomycin (50 μg/Liter) und Amphotericin B (2,0 μg/ml) versorgt. Die Kulturen wurden erneut in die anaeroben Standgefäße gebracht und 6 Tage inkubiert, wobei alle 2 Tage das Medium ausgetauscht wurde.
  • Passage von L. intracellularis
  • L. intracellularis-Bakterien wurden durch Zell-Lysis unter Verwendung von Kaliumchlorid gemäß Literaturangaben passagiert (G. Lawson et al., J. Clin. Microbiol., Bd. 31 (1993), S. 1136-1142; durch Verweis im vollen Umfang zum Gegenstand der Beschreibung gemacht) und sodann zu frischen IEC-18-Monolayers gegeben. Das Medium wurde von den Monolayers abgegossen und 0,1% KCl wurde zugegeben. Sodann wurden die Zellen 10 Minuten bei 37°C inkubiert. Nach Entfernen des KCl wurde SPG/10% zugesetzt und die Monolayers wurden mechanisch mit einem Zellschaber abgelöst. Die Zellen wurden durch 3-malige Passage durch eine Spritze mit einer Nadel Nr. 21 der Lysis unterzogen. Die Zellkerne wurden durch 5-minütige Zentrifugation mit 100 × g entfernt und die bakterielle Suspension in der überstehenden Flüssigkeit wurde zu frischen, 1 Tag alten Monolayers von IEC-18-Zellen gegeben.
  • Überwachung der Infektion von Zellkulturen
  • Die Infektion wurde überwacht, indem die Zellen an Chamberslides 5 Minuten mit kaltem Aceton/Methanol fixiert wurden. Die Färbung wurde durch Immunofluoreszenz- und Immunoperoxidase-Verfahren durchgeführt. Bei beiden Verfahren wurden ein muriner monoklonaler Antikörper (S. McOrist et al., Vet. Rec., Bd. 121 (1987), S. 421-422) als primärer Antikörper und entweder anti- Maus-Immunoglobulin G-Fluorochrom-Konjugat (Fluoresceinisothiocyonat; Organon Teknika Corporation, Durham, NC) oder Peroxidase-Konjugat (Ziegen-anti-Maus-Immunoglobulin G; Kirkegaard and Perry Laborstories, Inc., Gaithersburg, MD) verwendet. Die quantitative Bestimmung der Bakterien wurde durch Zählen der Anzahl von spezifisch gefärbten Bakterien innerhalb der Zellen auf jedem Objektträger durchgeführt.
  • Polymerase-Kettenreaktion
  • Proben-Inokula und passagierte Bakterien wurden als Matrizen-DNA in eine PCR aufgenommen, wobei das Präparationsverfahren für die Proben, die Primer und die Zyklusparameter den Angaben von Jones et al., J. Clin. Microbiol., Bd. 31 (1993), S. 2611-2615, und McOrist et al., Vet. Microbiol., (1994), S. 1-8 (jeweils in vollen Umfang durch Verweis zum Gegenstand der Beschreibung gemacht) angewandt wurden. Folgende Zyklusparameter wurden eingehalten: 5 Minuten bei 93°C, 45 Sekunden bei 55°C und 45 Sekunden bei 72°C für den ersten Zyklus. 33 Zyklen wurden bei den vorerwähnten Temperaturen für 45 Sekunden pro Temperatur durchgeführt, sowie 1 Zyklus für 45 Sekunden bei 93°C, 45 Sekunden bei 55°C und 2 Minuten bei 72°C. Zur Inokulation von IEC-18-Zellen wurden nur positive Inokula verwendet. Die PCR wurde auch zur Überwachung des Passagenmaterials zur Bestätigung der Infektionen durchgeführt. Durch PCR erzeugte DNA wurde für die Sequenzierung der Iowa State University Nucleic Acid Facility zugeleitet. Die Ergebnisse der Sequenzierung wurden mit den Sequenzen von Gary F. Jones (Doktorarbeit, University of Minnesota, Minneapolis, MN (Juni 1993) verglichen.
  • Ergebnisse Auswahl von Inokulumproben
  • Die Schweine Nr. N24912 und N72994 litten an schwerer PPE mit blutigem Darminhalt und verdickter Schleimhaut. N101494 hatte schwere PPE und schwere Hämorrhagien, die zu einem großen Blutgerinnsel im intestinalen Lumen führten. Eine Giminez-Färbung der Schleimhautausstriche ergab eine große Anzahl an gekrümmten oder S-förmigen Bakterien. IFA-Färbungen ergaben eine große Anzahl von hell leuchtenden Bakterien in dem von den Schweinen abgeleiteten bakteriellen Inokula.
  • Überwachung der Infektion von Zellkulturen
  • Inokulierte Monolayers wurden durch lichtmikroskopische Untersuchung während des Wachstumszyklus überwacht. Dabei wurde nur eine geringe morphologische Veränderung der Zellen beobachtet. Uninfizierte Monolayers, die unter verringerter Sauerstoffspannung (8% O2) gezüchtet worden waren, wiesen eine ähnliche Morphologie auf.
  • Durch Immunofluoreszenz und Immunoperoxidase gefärbte infizierte Kulturen zeigten eine große Anzahl an gekrümmten oder S-förmigen, spezifisch gefärbten Bakterien, die offensichtlich innerhalb der Zellen vorlagen. Die Monolayers wiesen keine konfluente Infektion auf. Infizierte Zellen waren häufig eng mit infizierten Herden von 1 bis 10 Zellen assoziiert. Schwer infizierte Zellen (d. h. Zellen mit 30 oder mehr Bakterien) traten auch in Verbindung mit Zellen mit weniger als 30 Bakterien auf. Die Bakterienzahl erreichte in etwa nach 6 Tagen ihren Höhepunkt. Die Infektion war von den spezifischen Wachstumsbedingungen abhängig. Die Bakterien wurden in erfolgreicher Weise durch das hier beschriebene Zell-Lysisverfahren passagiert. Eine Zentrifugation von neu inokulierten Zellen war nicht erforderlich, erhöhte jedoch die Anzahl an infizierten Zellen. Eine Zentrifugation verringerte auch die Verunreinigungen, indem es ermöglicht wurde, Zellen, die einer Infektion mit antibiotikafreiem Medium ausgesetzt worden waren, nach 3 Stunden mit einem antibiotikahaltigem Medium frisch zu versorgen. Die Verringerung des FCS-Wertes von 10% auf 7% im Medium war erforderlich, um das Wachstum der IEC-18-Zellen zu verringern und es den Bakterien zu ermöglichen, sich zu einer höheren Anzahl zu vermehren, bevor die Monolayers konfluent wurden.
  • Polymerase-Kettenreaktion
  • Eine PCR von chromosomaler DNA erzeugte ein 319 bp-Fragment (einschließlich Primern) aus sämtlichen Isolaten. Ein Fragment von geeigneter Größe wurde visuell mit einer bekannten positiven Probe, die von McOrist et al. (1994) unter Anwendung von PCR erzeugt worden war, verglichen. Die Sequenzanalyse der PCR-Produkte von N24912, N72994 und N101494 bestätigten eine enge Homologie (97-99%) mit der von Jones (1993) bestimmten p78-Sequenz.
  • Beispiel 2
  • Wachstum von L. intracellularis in Suspensionskulturen von HEp-2-Zellen
  • Präparation von intestinalen Homogenisaten für das Inokulum
  • Ein intestinales Homogenisat wurde durch Abschaben der Mucosa eines Darmstückes von 6,0 bis 8,0 cm Länge von den Darmproben von Beispiel 1 hergestellt. Trypsin (1%) wurde zu der abgeschabten Schleimhaut gegeben und die Proben wurden kurz homogenisiert und anschließend 35 Minuten bei 37°C inkubiert. 10 ml SPG/10% FBS wurde sodann zugegeben und die Proben wurden in einem Gewebe-Mahlgerät gemahlen. Weitere 10 ml SPG/10% FBS wurden zugegeben. Die Homogenisate wurden durch einen Whatman V113-Filter und anschließend durch 5,0-, 1,0- und 0,65 μm-Filter gegeben. Sodann wurden die Proben in 1 ml-Aliquotanteile aufgeteilt und bei -70°C eingefroren.
  • Infektion einer Zellkultur
  • Verfahren A
  • Gewebezellen wurden in einer Konzentration von 1 × 107 Zellen in 50 ml DMEM/10% FBS in einer 100 ml fassenden Rührflasche überimpft. Die Kulturen wurden 24 Stunden inkubiert und sodann mit Vancomycin und Fungizon versetzt. 1 Fläschchen gefrorenes intestinales Homogenisat wurde rasch aufgetaut und mit 3,0 ml DMEM/5% FBS mit einem Gehalt an Vancomycin (100 μg/ml) und Amphotericin B (2,0 μg/ml) verdünnt. Die Probe wurde durch einen 0,65 μm-Filter geleitet und in die Flasche gegeben. Die Kultur wurde in eine Gaskammer gestellt, evakuiert und mit Wasserstoff und Kohlendioxid begast, wodurch man ein Gemisch aus 8,0% O2, 8,8% CO2 und 83,2% H2 erhielt. Die Kulturen wurden 3 Stunden bei 37°C inkubiert und sodann mit Neomycin und Gentamycin versetzt. Die Kultur wurde nach 24 Stunden frisch mit DMEM/5% FBS mit einem Gehalt an L-Glutamin, Vancomycin (100 μg/ml), Neomycin (50 μg/Liter), Gentamycin (50 μg/Liter) und Amphotericin B (2,0 μg/ml) versorgt.
  • Verfahren B
  • Zwei herkömmliche 25 cm2-Flaschen wurden mit 1,25 × 105 HEp-2-Zellen in DMEM/10% FBS beimpft und einer 18- bis 24-ständigen Züchtung unterzogen. Zum Zeitpunkt der Inokulation wiesen die Zellen eine 30%ige Konfluenz auf. Das Inokulum wurde in DMEM/5% FBS verdünnt. Wenn das Inokulum von einem intestinalen Homogenisat stammte, enthielt das Medium ferner Vancomycin (100 μg/ml) und Amphotericin B (2,0 μg/ml). Die Kulturen wurden in eine Gaskammer gestellt, evakuiert und mit Wasserstoff und Kohlendioxid begast, wodurch ein Gemisch aus 8,0% O2, 8,8% CO2 und 83,2% H2 erhalten wurde. Die Kulturen wurden 3 Stunden bei 37°C inkubiert und sodann mit Neomycin und Gentamycin versetzt. Nach 24 Stunden wurden die Kulturen erneut mit DMEM/5% FBS mit einem Gehalt an L-Glutamin, Vancomycin (100 μg/ml), Neomycin (50 μg/Liter), Gentamycin (50 μg/Liter) und Amphotericin B (2,0 μg/ml) versorgt. Wenn es sich beim Inokulum um eine Reinkultur handelte, waren keine Antibiotika erforderlich. Die Kulturen wurden 6 Tage oder bis zum Erreichen eines konfluenten Zustands inkubiert. Sodann wurden die Zellen von den Flaschen abgeschabt und in eine 100 ml fassende Rührflasche mit einem Gehalt an 50 ml DMEM/5% FBS gegeben.
  • Die Kulturen wurden in wöchentlichen Abständen im Verhältnis von 1:2 verdünnt, wobei entweder eine Hälfte der Kultur geerntet wurde und frisches Medium zugesetzt wurde oder das Medium in eine größere Rührflasche übertragen und mit weiterem Medium versetzt wurde.
  • Passage der Kultur
  • Die Kultur wurde auf frische HEp-2-Zellen übertragen, indem neue HEp-2-Zellen in einer Menge von 1 × 107 auf DMEM/5% FBS überimpft wurden. Man ließ die neue Kultur über Nacht bei 8,0% O2, 8,8% CO2 und 83,2% H2 inkubieren. Sodann wurde die neue Kultur mit einer infizierten Kultur inokuliert und bei verringerten O2-Konzentrationen gemäß den vorstehenden Angaben inkubiert. Die Mengen des Inokulums waren vom Grad der Infektion der ursprünglichen Kultur abhängig.
  • Ernte und Lagerung von Kulturen
  • Die Kulturen wurden geerntet, indem die gewünschte Kulturmenge durch 20-minütige Zentrifugation bei 3 000 × g gewonnen wurde. Das Pellet wurde in Saccharose-Phosphat-Glutamat (SPG)-Lösung resuspendiert und 4-mal durch eine Nadel Nr. 25 geleitet. Die Kulturen wurden in Aliquotanteile aufgeteilt und bei -70°C eingefroren. Zur weiteren Reinigung wurde die Probe 5 Minuten mit 145 × g zentrifugiert, um Zellkerne und Bruchstücke zu entfernen. Der Überstand wurde sodann 20 Minuten mit 3 000 × g zentrifugiert. Das Pellet wurde anschließend in Verdünnungsmittel resuspendiert.
  • Bestimmung von lebensfähigem L. intracellularis in Gewebekultur
  • Die quantitative Bestimmung von lebensfähigem L. intracellularis wurde durch Bestimmung der 50%igen Gewebekultur-Infektionsdosis (TCID50) vorgenommen. Hierzu wurden 2,0 ml der zu testenden Kultur entnommen und die Zellen wurden durch 4-malige Passage durch eine Nadel Nr. 25 lysiert. Die Probe wurde seriell im Verhältnis 1:10 in DMEM/5% FBS mit einem Gehalt an Vancomycin (100 μg/ml) und Amphotericin B (2,0 μg/ml) verdünnt. Die Verdünnungen wurden auf eine Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen in einer Menge von 0,1 ml/Vertiefung aufgesetzt. Die Mikrotiterplatten wurden mit HEp-2-Zellen in einer Menge von 1 250 Zellen/Vertiefung beimpft und vor der Infektion 18 bis 24 Stunden gezüchtet. Es wurden 3 bis 6 Vertiefungen/Verdünnung verwendet. Die Platte wurde 6 Tage bei Gaskonzentrationen von 8,0% O2, 8,8% CO2 und 83,2% H2 inkubiert. Sodann wurden die Zellen 2 Minuten in einem kalten Gemisch aus 50% Aceton und 50% Methanol fixiert. Anschließend wurden die Vertiefungen mit 0,03 ml/Vertiefung monoklonalem anti-IS-Intracellularis-Antikörper (McOrist, 1994) in einer Verdünnung von 1:2 000 in PBS versetzt. Die Platte wurde 30 Minuten bei 37°C inkubiert und sodann 3-mal mit PBS gewaschen. In einem Verhältnis von 1:30 verdünntes anti-Maus-FITC wurde in einer Menge von 0,03 ml/Vertiefung zugegeben und 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Sodann wurde die Platte 3-mal mit ddH2O gewaschen und getrocknet. Die Proben wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop betrachtet und der TCID50/ml-Wert wurde bestimmt.
  • Ergebnisse
  • Die TCID50-Ergebnisse zeigten, dass die Kulturen bis zu 1 × 106 Bakterien/ml enthielten. Dies wurde in 45 Tagen erreicht. Das Kulturvolumen wurde im gleichen Zeitraum auf 3,0 Liter erhöht.
  • Beispiel 3
  • Wachstum von L. intracellularis in Suspensionskulturen von McCoys-Zellen
  • Herstellung von intestinalen Homogenisaten für ein Inokulum
  • Ein intestinales Homogenisat wurde gemäß den Angaben in Beispiel 2 hergestellt. Eine Probe von L. intracellularis. die gemäß dem Verfahren des folgenden Beispiels gezüchtet worden war, wurde unter den Bestimmungen des Budapester Vertrags vom 19. Mai 1995 bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland USA 20852, hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer 55672.
  • Infektion der Zellkultur
  • Zwei herkömmliche 25 cm2-Flaschen wurden mit 1,25 × 105 McCoys-Zellen in DMEM/10% FBS beimpft und einer 18- bis 24-ständigen Züchtung unterworfen. Zum Zeitpunkt der Inokulation wiesen die Zellen eine 30%ige Konfluenz auf. Das Inokulum wurde in DMEM/5% FBS verdünnt. Wenn das Inokulum von einem intestinalen Homogenisat stammte, enthielt das Medium ferner Vancomycin (100 μg/ml) und Amphotericin B (2,0 μg/ml). Die Kulturen wurden in eine Gaskammer gestellt, evakuiert und mit Wasserstoff und Kohlendioxid so begast, dass sich ein Gemisch aus 8,0% O2, 10% CO2 und 82% H2 ergab. Die Kulturen wurden 3 Stunden bei 37°C inkubiert und sodann mit Neomycin und Gentamycin versetzt. Die Kulturen wurden nach 24 Stunden mit DMEM/5% FBS mit einem Gehalt an L-Glutamin, Vancomycin (100 μg/ml), Neomycin (50 μg/Liter), Gentamycin (50 μg/Liter) und Amphotericin B (2,0 μg/ml) versorgt. Es waren keine Antibiotika erforderlich, wenn es sich beim Inokulum um eine Reinkultur handelte. Die Kulturen wurden 6 Tage bis zum Erreichen eines konfluenten Zustands inkubiert. Sodann wurden die Zellen von den Flaschen abgeschabt und in eine 100 ml fassende Rührflasche mit einem Gehalt an 50 ml DMEM/2% FBS und 0,05 g Cultisphere-G-Mikroträgern gegeben. Die Kolben wurden mit 40-50 U/min gerührt.
  • Die Kulturen wurden alle 2 bis 3 Tage im Verhältnis von 1:2 verdünnt, indem entweder eine Hälfte der Kultur geerntet und frisches Medium und Cultisphere-G- Perlen zugesetzt wurden oder indem die Kultur in eine größere Rührflasche übertragen und mit weiterem Medium und weiteren Cultisphere-G-Perlen versetzt wurde. Die endgültige Konzentration der Perlen in der Kultur betrug etwa 0,001 g Perlen/ml.
  • Passage der Kultur
  • Die Kultur wurde auf frische McCoys-Zellen passagiert, indem 1 × 107 neue McCoys-Zellen auf DMEM/2% FBS und 0,05 g Cultisphere-G-Perlen überimpft wurden. Die neue Kultur wurde über Nacht bei 8,0% O2, 8,8% CO2 und 83,2% H2 inkubiert. Sodann wurde die neue Kultur mit 25 ml der infizierten Kultur inokuliert und bei verringerten O2-Konzentrationen gemäß den vorstehenden Angaben inkubiert.
  • Ernte und Aufbewahrung von Kulturen
  • Die Kulturen wurden geerntet, indem die gewünschte Kulturmenge gewonnen und 20 Minuten mit 3 000 × g zentrifugiert wurde. Das Pellet wurde in SPG resuspendiert und 4-mal durch eine Nadel Nr. 22 geleitet. Sodann wurden die Kulturen in Aliquotanteile aufgeteilt und bei -70°C eingefroren. Zur weiteren Reinigung wurde die Probe 5 Minuten mit 145 × g zentrifugiert, um die Perlen, Zellkerne und Zellbruchstücke zu entfernen. Der Überstand wurde sodann 20 Minuten mit 3 000 × g zentrifugiert. Das Pellet wurde anschließend in Verdünnungsmittel resuspendiert.
  • Bestimmung von lebensfähigem L. intracellularis in Gewebekultur
  • Eine quantitative Bestimmung von lebensfähigem L. intracellularis wurde gemäß Beispiel 2 unter Verwendung einer Nadel Nr. 22 zur Lysis der Zellen und unter Verwendung von McCoys-Zellen in einer Menge von 1 250 Zellen/Vertiefung zur Beimpfung der Mikrotiterplatten durchgeführt.
  • Ergebnisse
  • Die TCID50-Ergebnisse zeigten, dass die Kulturen bis zu 1 × 106 Bakterien/ml enthielten. Dies wurde in weniger als 1 Monat erreicht. Das Kulturvolumen wurde im gleichen Zeitraum auf 3,0 Liter erhöht.
  • Beispiel 4
  • Bestimmung der infektiösen Dosis von L. intracellularis-Reinkulturen bei Wirtstieren
  • Zusammenfassung
  • Eine Studie an 31 Schweinen wurde durch Infektion von herkömmlichen Schweinen im Alter von 6 Wochen mit Reinkulturen von L. intracellularis aus Probe N72994 durchgeführt. Die Schweine wurden willkürlich in 4 Gruppen eingeteilt und die Gruppen wurden getrennt gehalten. Die Gruppe 1 umfasste 7 Schweine und wurde als die negative Kontrollgruppe angesehen, die entweder die Verabreichung einer nicht-infizierten Gewebekultur oder keine Verabreichung erhielt. Die Gruppe 2 umfasste 8 Schweine mit einer Dosierung von 107 Bakterien/Schwein. Die Gruppe 3 umfasste 8 Schweine und erhielt eine Dosierung von 106 Bakterien/Schwein. Die Gruppe 4 umfasste 8 Schweine, die 105 Bakterien/Schwein erhielten.
  • Faeces-Abstriche wurde an den Tagen 0, 7, 14, 21 und 24 für den PCR-Test gewonnen. Am Tag 24 wurden die Schweine einer Nekropsie unterzogen. Das Ileum, das Jejunum und das Kolon wurden für den PCR-Test, für eine histopathologische Untersuchung und eine FA-Färbung, die gemäß den vorstehenden Ausführungen durchgeführt wurden, gewonnen.
  • Der PCR-Test der Ileum-Schleimhaut ergab die Anwesenheit von L. intracellularis bei 100% der Tiere mit der hohen Dosis, bei 75% mit der mittleren Dosis und bei 50% mit der niederen Dosis. Die histopathologischen Ergebnisse zeigten einen Anstieg von mononuklearen Zellen in der Lamina propria und submucosa von 88% der Tiere mit der hohen Dosis, von 75% mit der mittleren Dosis und von 88% mit der niederen Dosis. Eine verborgene Hyperplasie wurde bei 50% der Tiere mit der hohen Dosis, bei 63% mit der mittleren Dosis und bei 50% mit der niederen Dosis festgestellt. Die FA-Färbung ergab L. intracellularis in Gewebeschnitten des Ileums, des Jejunums und des Kolons bei 88% der Tiere mit der hohen Dosis, bei 63% mit der mittleren Dosis und bei 63% mit der niederen Dosis. Kontrolltiere erwiesen sich negativ in Bezug auf die Anwesenheit von L. intracellularis, und zwar bei PCR, FA und Silberfärbung.
  • Somit wurde in erfolgreicher Weise eine Reinkultur zur Infektion mit PPE und zur Verursachung von entsprechenden Läsionen verwendet. Die Postulate von Koch wurden durch die Identifizierung und Isolierung von L. intracellularis bei den infizierten Tieren erfüllt.
  • Bei den belasteten Tieren wurde bei 100% der Tiere mit der hohen Dosierung die Gewinnung und Identifizierung durch Silberfärbung, FA und PCR bestätigt.
  • Materialien und Methoden
  • Züchtung des Inokulums
  • Eine herkömmliche 75 cm2-Flasche wurde mit 3,75 × 105 HEp-2-Zellen in DMEM/10% FBS beimpft und einer 18- bis 24-ständigen Züchtung bei 37°C und 5% CO2 unterzogen (Die Zellen befanden sich zum Zeitpunkt der Inokulation in einem 30%igen Konfluenzzustand.). Ein Fläschchen mit N72994 wurde in 15 ml DMEM/5% FBS verdünnt. Die Kultur wurde in eine Gaskammer gebracht, evakuiert und mit Wasserstoff und Kohlendioxid unter Bildung eines Gemisches von 8,0% O2, 8,8% CO2 und 83,2% H2 begast. Die Kultur wurde nach 24 Stunden frisch mit DMEM/5% FBS versorgt.
  • Die Kulturen wurden 6 Tage inkubiert. Anschließend wurden die Zellen von den Flaschen abgeschabt und in 100 ml fassende Rührflaschen mit einem Gehalt an 50 ml DMEM/5% FBS gegeben. Das Flaschenvolumen wurde durch Verdopplung des Mediumvolumens in wöchentlichen Abständen vergrößert. Die Kultur wurde 3 Wochen in der Rührflasche gezüchtet.
  • Ernte der Kulturen
  • Die Kulturen wurden durch 20-minütige Zentrifugation mit 3 000 × g geerntet. Das Pellet wurde in Saccharose-Phosphat-Glutamat-Lösung (SPG) mit einem Gehalt an 10% FBS resuspendiert und 4-mal durch eine Nadel Nr. 25 geleitet. Das Inokulum wurde in SPG/10% FBS auf das Endvolumen verdünnt und 1:10-Verdünnungen wurden hergestellt.
  • Das Inokulum für die Kontrollen bestand aus nicht-infizierten HEp-2-Zellen, die auf die gleiche Konzentration von lebensfähigen Zellen wie die infizierte Kultur verdünnt worden waren. Die Zellen wurden zur gleichen Zeit wie die infizierte Kultur geerntet. Die Kontrollschweine erhielten eine ähnliche Dosis an Zellen wie die Gruppe mit der hohen Dosierung.
  • Quantitative Bestimmung von L. intracellularis
  • Die quantitative Bestimmung von lebensfähigem L. intracellularis wurde durch Bestimmung der 50%-Gewebekultur-Infektionsdosis (TCID50) vorgenommen. Dies wurde durchgeführt, indem 2 ml der zu testenden Kultur entnommen wurden und die Zellen durch 4-malige Passage durch eine Nadel Nr. 22 lysiert wurden. Die Probe wurde im Verhältnis von 1:10 seriell in DMEM/5% FBS mit einem Gehalt an Vancomycin (100 μg/ml) und Amphotericin B (2,0 μg/ml) verdünnt. Die Verdünnungen wurden in eine Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen in einer Menge von 0,1 ml/Vertiefung gegeben. Die Mikrotiterplatten wurden mit HEp-2-Zellen in einer Menge von 2 500 Zellen/Vertiefung beimpft und einer 18- bis 24-ständigen Züchtung vor der Infektion unterzogen. 12 Vertiefungen/Verdünnung wurden verwendet. Die Platte wurde 6 Tage bei Gaskonzentrationen von 8,0% O2, 8,8% CO2 und 83,2% N2 inkubiert. Die Zellen wurden 2 Minuten mit einem kalten Gemisch aus 50% Aceton und 50% Methanol fixiert. Sodann wurden die Vertiefungen mit 0,03 ml/Vertiefung monoklonalem anti-L. intracellularis-Antikörper (McOrist, 1987) bei Verdünnung in PBS im Verhältnis von 1:2 000 versetzt. Die Platte wurde 30 Minuten bei 37°C inkubiert und sodann 3-mal mit PBS gewaschen. Anti-Maus-FITC in einer Verdünnung von 1:30 wurde in einer Menge von 0,03 ml/Vertiefung zugegeben und 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Platte wurde 3-mal mit ddH2O gewaschen und getrocknet. Die Proben wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop betrachtet und der TCID50/ml-Wert wurde bestimmt.
  • Tiere
  • 31 Schweine beiderlei Geschlechts im Alter von 6 Wochen (weibliche Tiere PIC × Lieske und große weiße Eber) wurden von Dr. Kent Schwartz bereitgestellt. Die Schweine wurden willkürlich am Tag 0 nach dem Gewicht auf 4 Pferche aufgeteilt.
  • Anlage
  • Vier Pferche in einer kleinen Aufzuchtanlage, die jeweils einen Abstand von mindestens 3 Fuß aufwiesen, wurden zur Aufnahme der Schweine verwendet. Die Pferche wiesen einen Drahtboden und feste Pferchunterteilungen auf. Die Wärmeversorgung erfolgte durch einen Ofen mit zonaler Ergänzungswärme durch Heizlampen. Die Temperatur wurde während der Dauer der Studie auf 78 bis 85°F gehalten.
  • Futter und Wasser
  • Ein Futter aus gemahlenem Mais/Soja mit einem Proteingehalt von 19%, das frei von Antibiotika war, wurde nach Belieben über Fütterungsvorrichtungen aus rostfreiem Stahl zur Verfügung gestellt. Wasser wurde nach Belieben über Wassernippel bereitgestellt.
  • Infektion der Schweine
  • Am Tag 0 wurden die Schweine gewogen und Blutproben wurden über ein Kapillarrohr, das in den retroorbitalen Sinus eingesetzt worden war, entnommen. Das Serum wurde gewonnen und bei -20°C in eingefrorenem Zustand aufbewahrt. Ferner wurden Faeces-Abstriche für die PCR gewonnen. Die Schweine erhielten auf intragastrischem Weg über einen Magenschlauch eine Dosierung von 10 ml Inokulum.
    Behandlung Anzahl der Schweine
    Kontrolle – nicht infizierte Zellen 5
    Kontrolle – keine Behandlung 2
    Hohe Dosis 8
    Mittlere Dosis 8
    Niedrige Dosis 8
  • Die Schweine wurden gewogen und an den Tagen 0, 10, 17 und 24 wurde eine Blutentnahme vorgenommen.
  • Polymerase-Kettenreaktion
  • Die Infektion der Schweine wurde durch PCR unter Anwendung von Primern und Zyklusparametern gemäß den Angaben von Jones (1993) überwacht.
  • Faeces-Proben, die an den Tagen 0, 7, 14, 21 und 24 gewonnen worden waren, sowie die Darmschleimhaut wurden durch PCR geprüft.
  • Histopathologie
  • Schnitte von Ileum, Jejunum und Kolon wurden mit Formalin fixiert, routinemäßig verarbeitet, mit Ilematoxylin und Eosin sowie durch Silberimprägnierung gefärbt und bewertet. Die Schnitte wurden ferner unter Verwendung von monoklonalem Antikörper, der spezifisch für L. intracellularis war, gefärbt.
  • Ergebnisse Klinische Anzeichen
  • Klinische Anzeichen, die aus lockerem Stuhl bestanden, wurden bei der Gruppe mit der hohen Dosierung erstmals am dritten Tag beobachtet. Die Anzeichen erreichten nach 14 Tagen ihr Maximum und verschwanden anschließend allmählich.
  • Gewichtszunahme
  • Die durchschnittliche tägliche Gewichtszunahme wurde berechnet. Es zeigte sich, dass die Gruppen mit der hohen und mittleren Dosis im Vergleich zur Kontrollgruppe eine verminderte Gewichtszunahme aufwiesen. Bei einem Vergleich der Gruppen ergab sich eine Dosis-Titrationswirkung in der Gewichtszunahme.
  • PCR
  • Ein fäkaler Ausstoß wurde im Zeitraum bis zu 14 Tagen nicht festgestellt. Nach 21 Tagen zeigten 37,5% der Schweine mit der hohen Dosis einen PCR-positiven Kot. Nach Nekropsie wurde die Schleimhaut des Ileums durch PCR geprüft, wobei 100% der Tiere mit der hohen Dosis positiv waren, 75% mit der mittleren Dosis, 50% mit der niedrigen Dosis und 0% bei den Kontrolltieren.
  • Grobe Läsionen
  • Grobe Läsionen wurden bei 2 Schweinen der Gruppe mit der hohen Dosis festgestellt (#50 und #202). Die Schweine wiesen eine etwa 3 ft lange Verdickung im Ileum mit Nekrose bei Tier #202 auf.
  • Histopathologie FA
  • Die FA-Färbung von Schnitten des Ileums, Jejunums und Kolons ergab die Anwesenheit von L. intracellularis bei 87,5% der Tiere mit der hohen Dosis, bei 62,5% mit der mittleren und der geringen Dosis und bei 0% der Kontrolltiere.
  • Mikroskopische Läsionen
  • Bei 100% der Tiere mit der hohen Dosis wurden Läsionen beobachtet, bei 75% mit der mittleren Dosis, bei 87,5% mit der niedrigen Dosis und bei 14% der Kontrolltiere. Die Bestimmung erfolgte durch Beobachtung einer erhöhten Anzahl von mononuklearen Zellen in der Lamina propria und submucosa, häufig in Verbindung mit Hyperplasie von Peyer-Plaques. Ferner wurde eine verborgene Hyperplasie beobachtet.
  • Silberfärbung
  • Ferner wurde eine Silberfärbung von Schnitten zur Feststellung des Vorliegens von intrazellulären, gekrümmten Bakterien durchgeführt. Dies belegte die Anwesenheit von Bakterien bei 87,5% der Tiere mit der hohen Dosis, bei 62,5% mit der mittleren Dosis, bei 87,5% mit der niedrigen Dosis und bei 0% der Kontrolltiere.
  • Diskussion
  • Die Schweine wurden in erfolgreicher Weise mit Reinkulturen von L. intracellularis infiziert. Bei Dosen von 107 Bakterien zeigten 100% der Schweine bei Prüfung durch PCR und mikroskopische Läsionen eine Infektion. Die Schwere der Läsionen und die Mengen von Bakterien in Gewebeschnitten waren relativ gering. Diese Studie stellt ein zufriedenstellendes Belastungsmodell für L. intracellularis dar, und zwar aufgrund der Anwesenheit von L. intracellularis und von mikroskopischen Läsionen bei den Schweinen. Die Läsionen können durch eine zweite Dosis 7 Tage nach der ersten Dosis verbessert werden.
  • Beispiel 5
  • Wirksamkeitsprüfung eines Hamster-Impfstoffes
  • Ziel
  • In einem Modell mit Labortieren soll die Sicherheit und die Wirksamkeit eines avirulenten Lebendimpfstoffes von L. intracellularis bei Hamstern festgestellt werden.
  • Zusammenfassung
  • Eine Studie mit 40 Hamstern wurde durch Impfen von Hamstern im Alter von 3 Wochen mit Reinkulturen eines hochgradig passagierten Stammes von L. intracellularis und durch Belastung 22 Tage nach der Impfung mit Reinkulturen eines gering passagierten virulenten Materials durchgeführt. Die Hamster wurden in 3 Gruppen aufgeteilt. Die Gruppe A wurde am Tag 0 mit 1 Dosis von L. intracellularis Stamm N72994 geimpft. Die Gruppe B diente als Kontrollgruppe und erhielt keine Dosierung mit einer Impfstoffkultur. Beide Gruppen wurden mit 2 Dosen einer Reinkultur von L. intracellularis Stamm N343 an den Tagen 22 und 25 nach der Impfung belastet. Die Gruppe C erhielt den Belastungsstamm N101494, um die relative Virulenz im Vergleich zum Stamm N343 festzustellen. Die Gruppen A und B umfassten jeweils 15 Hamster und die Gruppe C umfasst 10 Hamster. Die Ergebnisse des 50% Gewebekultur-Infektionsdosis-Tests (TCID50) zeigten, dass die Hamster mit 105 TCID50/Dosis geimpft worden waren. Die N343-Belastung enthielt 105,5 TCID50/Dosis. Die Belastungsdosis für die Gruppe C betrug 102,75 TCID50/Dosis. Faeces-Abstriche wurden an den Tagen 0, 7, 14, 21, 29, 36 und 43 für den Test mit der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) gewonnen. Am Tag 21 wurden jeweils 5 Tiere der Gruppen A und B einer Nekropsie für den PCR-Test der Schleimhäute sowie für FA-Hematoxylin- und Eosin-Färbungen und Silber-Färbungen von Ileumschnitten unterzogen, um die Dauerhaftigkeit der Kolonisierung der Bakterien in den geimpften Hamstern festzustellen. Die restlichen Tiere wurden 21 Tage nach der Belastung einer Nekropsie unterzogen und auf die gleiche Weise getestet.
  • Die PCR-Ergebnisse zeigten die Anwesenheit von L. intracellularis in den Darmschleimhäuten von 100% der Hamster der Gruppe A 21 Tage nach der Impfung. Die Hamster der Gruppe B waren 21 Tage nach der Impfung alle negativ. 21 Tage nach der Belastung waren 50% der Hamster in Gruppe A PCR-positiv, während in Gruppe B 100% positiv waren. Die Histopathologie der Schnitte zeigte 21 Tage nach der Belastung bei 50% der Tiere der Gruppe A schwache bis schwere Läsionen und bei 50% der Gruppe B schwache Läsionen. Keines der Tiere zeigte 21 Tage nach der Impfung Läsionen. Die Tiere der Gruppe C zeigten 21 Tage nach der Belastung keine Läsionen. Durch FA- und Silberfärbung konnte die Anwesenheit von L. intracellularis in keinem der Schnitte nachgewiesen werden.
  • Insgesamt wurde eine 50%ige Verringerung der Infektionen bei Hamstern, die mit einem hochgradig passagierten Stamm von L. intracellularis geimpft worden waren, festgestellt, wie durch PCR gezeigt wurde. Der Darm war von einer geringen Anzahl an intrazellulären Organismen kolonisiert, was sich daraus ergab, dass in Schnitten mit FA- und Silberfärbung keine Organismen festgestellt wurden. Die Hamster der Gruppe C waren während der gesamten Studie nicht zur Entwicklung einer Infektion in der Lage, was höchstwahrscheinlich auf die geringe Dosierung der Bakterien zurückzuführen ist.
  • Materialien und Methoden
  • Beschreibung der Hamster
  • 40 weibliche Harlan Sprague Dawley-Hamster mit einem Alter von 3 Wochen wurden eingesetzt.
  • Züchtung des Inokulums Impfstoffkultur
  • Eine kontinuierliche Kultur von L. intracellularis, die 29 Wochen in HEp-2-Zellen gezüchtet worden war, wurde verwendet. Die Kultur wurde auf ähnliche Weise, wie es im Abschnitt über die Belastungskultur beschrieben worden war, gezüchtet, mit der Ausnahme, dass die Kultur alle 2 bis 3 Wochen auf HEp-2-Zellen übertragen wurde.
  • Belastungskulturen
  • Eine herkömmliche 75 cm2-Gewebekulturflasche wurde mit 3,75 × 105 McCoys-Zellen in gemäß Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit einem Gehalt an 10% fötalem Kälberserum (FBS) beimpft und einer 18- bis 24-stündigen Züchtung bei 37°C mit 5% CO2 unterzogen. Das Medium wurde von den Zellen entfernt und 1 Fläschchen mit N343 MSC in Verdünnung in 14 ml DMEM/2% FBS wurde in die Flasche gegeben. Die Kultur wurde in eine Gaskammer gebracht, evakuiert und wieder mit Wasserstoff und Kohlendioxid unter Bildung eines Gemisches aus 8,0% O2, 8,8% CO2 und 83,2% H2 begast. Die Kultur wurde 6 Tage gezüchtet und anschließend wurden die Zellen in eine 100 ml fassende Rührflasche mit einem Gehalt an 90 ml DMEM/2% FBS und 0,01 g Cultisphere-G-Perlen abgeschabt. Die Kultur wurde bei der vorstehend angegebenen Gaskonzentration gezüchtet. Das Flaschenvolumen wurde in wöchentlichen Abständen durch Verdoppeln des Mediumvolumens vergrößert. Die Kultur wurde 25 Tage in der Rührflasche bis zu einem Endvolumen von 250 ml gezüchtet.
  • Der Stamm N101494 wurde auf die gleiche Weise wie der Stamm N343 gezüchtet.
  • Ernte der Kulturen
  • Impfstoffkultur
  • Die Kultur wurde durch 20-minütiges Zentrifugieren mit 3 000 × g geerntet. Das Pellet wurde in Saccharose-Phosphat-Glutamat-Lösung (SPG) mit einem Gehalt an 10% FBS resuspendiert und 4-mal durch eine Nadel Nr. 25 geleitet. Das Inokulum wurde in SPG/10% FBS auf das Endvolumen (15 ml) verdünnt.
  • Belastungskulturen
  • Die Kulturen wurde durch 20-minütige Zentrifugation mit 3 000 × g geerntet. Die Pellets wurden in Saccharose-Phosphat-Glutamat-Lösung (SPG) mit einem Gehalt an 10% FBS resuspendiert und 4-mal durch eine Nadel Nr. 25 geleitet. Das Inokulum wurde in SPG/10% FBS auf das Endvolumen (20 ml für den Stamm N343 und 10 ml für den Stamm N101494) verdünnt.
  • Dosierung bei den Hamstern
  • Impfstoff
  • Am Tag 0 wurden sämtliche Hamster der Gruppe A auf oralem Wege mit 1 ml des hergestellten Impfstoffes geimpft.
  • Belastung
  • 22 Tage nach der Impfung erhielten 10 Hamster der Gruppe A und 10 Hamster der Gruppe B auf oralem Wege eine Dosierung von 0,5 ml der Belastungskultur mit dem Stamm N343. Die Gruppe C wurde mit 0,5 ml Belastungskultur mit dem Stamm N101494 belastet.
  • Quantitative Bestimmung von IS-intracellularis
  • Die quantitative Bestimmung von lebensfähigen IS-intracellularis wurde durch Bestimmung der 50%igen Gewebekultur-Infektionsdosis (TCID50) erreicht. Dazu wurden 2 ml der zu testenden Kultur entnommen und die Zellen wurden einer Lysis durch 4-malige Passage durch eine Nadel Nr. 22 unterzogen. Die Probe wurde seriell im Verhältnis 1:10 in DMEM/5% FBS mit einem Gehalt an Vancomycin (100 μg/ml) und Amphotericin B (2,0 μg/ml) verdünnt. Die Verdünnungen wurden in einer Menge von 0,1 ml/Vertiefung auf eine Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen verteilt, die vor der Infektion mit McCoys-Zellen in einer Menge von 1 250 Zellen/Vertiefung beimpft und 18 bis 24 Stunden bei 37°C und 5% CO2 inkubiert worden waren 12 Vertiefungen/Verdünnung wurden verwendet. Die Platte wurde 6 Tage bei Gaskonzentrationen von 8,0% O2, 8,8% CO2 und 83,2% N2 inkubiert. Am 6. Tag wurden die Zellen mit einem kalten Gemisch aus 50% Aceton und 50% Methanol 2 Minuten fixiert. Die Vertiefungen wurden in einer Menge von 0,03 ml/Vertiefung mit monoklonalem anti-IS-intracellularis-Antikörper in einer 1:2 000-Verdünnung in PBS versetzt. Die Platte wurde 30 Minuten bei 37°C inkubiert und sodann 3-mal mit PBS gewaschen. Anti-Maus-FITC in einer Verdünnung von 1:30 wurde in einer Menge von 0,03 ml/Vertiefung zugegeben und 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Platte wurde 3-mal mit ddH2O gewaschen und getrocknet. Die Proben wurden unter einem Fluoreszenzmikroskop betrachtet und der TCID50/ml-Wert wurde bestimmt.
  • Überwachung der Infektion von Hamstern
  • Die Infektion der Hamster wurde durch PCR unter Verwendung der von Gary Jones beschriebenen Primer und Zyklusparameter überwacht. Kotproben wurden an den Tagen 0, 7, 14, 21, 29, 36 und 43 nach der Impfung gewonnen. Nach Töten der Hamster wurde die Darmschleimhaut ebenfalls durch PCR geprüft.
  • Histopathologie
  • Schnitte von Ileum und Kolon wurden mit Formalin fixiert, routinemäßig verarbeitet, mit Hematoxylin und Eosin und durch Silberimprägnierung gefärbt und bewertet. Die Schnitte wurden ferner mit einem für L. intracellularis spezifischen monoklonalen Antikörper gefärbt.
  • Durchschnittliche tägliche Gewichtszunahme
  • Das Gewicht der Hamster wurde 21, 28, 35 und 42 Tage nach der Impfung bestimmt, um die durchschnittliche tägliche Gewichtszunahme zu ermitteln.
  • Ergebnisse
    • Vergl. die nachstehende Tabelle.
  • TCID50-Werte
  • Die TCID50-Ergebnisse zeigten, dass die Impfstoffgruppe (Gruppe A) 104,86 TCID50/Hamster erhalten hatte. Die Hamster in den Gruppen A und B wurden mit dem Stamm N343 belastet und erhielten 105,5 TCID50. Die Hamster der Gruppe C wurden mit dem Stamm N101494 belastet und erhielten 102,75 TCID50/Hamster.
  • PCR
  • Der PCR-Test zeigte die Anwesenheit von L. intracellularis bei 100% der geimpften Hamster, die 21 Tage nach der Impfung einer Nekropsie unterzogen wurden. Der 43 Tage nach der Impfung durchgeführte Test zeigte, dass 100% der Kontrollhamster und 50% der geimpften Hamster mit L. intracellularis infiziert waren. Keiner der mit N101494 belasteten Hamster war positiv. Während der gesamten Studie wurde bei keinem der Hamster eine fäkale Abstoßung festgestellt.
  • Histopathologie
  • Eine H & E-Färbung ergab keine histologischen Läsionen in sämtlichen Schnitten von Hamstern bei Nekropsie 21 Tage nach der Impfung. In Schnitten, die 43 Tage nach der Impfung gewonnen worden waren, zeigten 50% der Impfstoffgruppe eine milde bis schwere lymphozytische Enteritis und 50% der Kontrolltiere wiesen eine milde lymphozytische Enteritis auf. Keine Läsionen waren in der N101494-Belastungsgruppe zu sehen.
  • Durch FA-Färbung gelang bei keinem der Hamster 43 Tage nach der Impfung der Nachweis von L. intracellularis.
  • Diskussion
  • Bei Hamstern, die mit einem hochgradig passagierten Stamm von L. intracellularis geimpft worden waren, wurde eine 50%ige Verringerung der Infektionen festgestellt, wie durch PCR nachgewiesen wurde.
  • Figure 00320001
  • Figure 00330001
  • Figure 00340001
  • Beispiel 6
  • Experiment bezüglich der Wirksamkeit von Schweineimpfstoff
  • Zweck
  • Das Ziel dieser Studie bestand in der Bewertung der Sicherheit, der anhaltenden Kolonisierung und der Wirksamkeit eines avirulenten, lebenden Isolats und eines abgetöteten Isolats von L. intracellularis bei Schweinen im Alter von 2 bis 3 Wochen. Eine Wirtstierstudie wurde bei Schweinen im Alter von 3 Wochen durchgeführt, die geimpft und sodann einer virulenten Belastung mit L. intracellularis Stamm N343 unterzogen wurden, um die Unterschiede bezüglich des Schutzes unter den Impfstoffen zu vergleichen.
  • Methoden
  • Am 11. Dezember 1995 wurden insgesamt 45 Schweine im Alter von 3 Wochen von der H & K-Farm erworben. Sie wurden zur Firma Veterinary Resources, Inc., einer Forschungsstation in der Nähe von Cambridge, Iowa, transportiert, wo sie individuell markiert wurden, um jedes Schwein zu identifizieren. Die Schweine wurden vor Beginn der Studie 2 Tage in der Anlage belassen, um sie an die Anlage zu akklimatisieren. Während der gesamten Studie erhielten sie antibiotikafreies Futter.
  • Am 13. Dezember wurden sämtliche Schweine gewogen, einer Blutentnahme und Gewinnung von Serum unterzogen und klinisch bewertet. Rektale Abstriche wurden gewonnen. Die Schweine wurden sodann willkürlich in Gruppen von 5 Tieren eingeteilt und in Kästen gesetzt. 20 Schweine wurden in einen getrennten Raum gebracht und als Kontrollgruppe und strikte Kontrollgruppe bezeichnet. 15 Schweine wurden für den ISi-1-Impfstoff in einen zweiten Raum gebracht. In einem dritten Raum befanden sich 10 Schweine für ISi-2.
  • Der Lebendimpfstoff wurde in der NOBL Laborstories Research and Development-Anlage hergestellt und als experimentelles serielles ISi-1 identifiziert. ISi-1 (Stamm N343) wurde von einem Schwein isoliert und kontinuierlich 29 Wochen in Reinkultur gezüchtet. Der Impfstoff wurde in McCoys-Zellen in Rührflaschen bei vermindertem Sauerstoffgehalt gezüchtet, bis eine etwa 100%ige Infektion festgestellt wurde. Eine Probe des hochgradig passagierten N343-Stammes, der für ISi-1 verwendet wurde, wurde weitere 11 Wochen passagiert ("N343NP40wk") und gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags von 22. Mai 1996 bei der ATCC, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, USA, 20852, hinterlegt. Er erhielt die Hinterlegungsnummer 55783. Die Kulturen wurden durch 20-minütiges Zentrifugieren mit 3 000 × g geerntet. Die Pellets wurden in Saccharose-Phosphat-Glutamat-Lösung (SPG) mit einem Gehalt an 10% FBS resuspendiert und 4-mal durch eine Nadel Nr. 25 gegeben.
  • Die Lysate wurden 5 Minuten mit 500 × g zentrifugiert, um die Zellbruchstücke und Mikroträgerperlen zu pelletisieren. Der Überstand wurde gewonnen und bis etwa 1 Stunde vor der Impfung bei -70°C aufbewahrt. Bei der Impfung wurde er bis zur Verabreichung auf Eis gehalten.
  • Der abgetötete Impfstoff (ISi-2) wurde auf die gleiche Weise gezüchtet, 12 1/2 Wochen passagiert und geerntet und mit einem Percoll-Gradienten gereinigt. Die gereinigten Bakterien wurden sodann bis etwa 1 Woche vor der Impfung bei -70°C gelagert und anschließend bei 4°C bei normalen atmosphärischen Sauerstoffkonzentrationen, die für L. intracellularis toxisch sind, aufbewahrt. Die Bakterien wurden mit AlOH bis zur Erzielung eines endgültigen Gemisches mit 10% AlOH versetzt. Die Proteinkonzentration wurde nach dem Biuret-Verfahren bestimmt.
  • Quantitative Bestimmung von lebendem IS-intracellularis
  • Eine quantitative Bestimmung von lebensfähigem L. intracellularis wurde durch Bestimmung der 50%igen Gewebekultur-Infektionsdosis (TCID50) erreicht. Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen wurden 18 bis 24 Stunden vor der Infektion mit McCoys-Zellen in einer Menge von 1 250 Zellen/Vertiefung beimpft und gezüchtet. Die Proben wurden seriell im Verhältnis 1:10 mit DMEM/5% FBS mit einem Gehalt an Vancomycin (100 μg/ml) und Amphotericin B (2,0 μg/ml) verdünnt. Die Verdünnungen wurden in einer Menge von 0,1 ml/Vertiefung auf die Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen aufgesetzt. Es wurden 12 Vertiefungen/Verdünnung verwendet. Die Platte wurde 6 Tage bei 37°C und bei Gaskonzentrationen von 8,0% O2, 8,8% CO2 und 83,2% N2 inkubiert. Die Zellen wurden 2 Minuten mit einem kalten Gemisch aus 50% Aceton und 50% Methanol fixiert. Sodann wurden die Vertiefungen mit 0,03 ml/Vertiefung monoklonalem anti-L. intracellularis-Antikörper (entwickelt von Dr. Steven McOrist) in Verdünnung im Verhältnis 1:2 000 in PBS versetzt. Die Platte wurde 30 Minuten bei 37°C inkubiert und sodann 3-mal mit PBS gewaschen. Anti-Maus-Immunoglobulin G-Fluorochrom-Konjugat (FITC) in Verdünnung im Verhältnis 1:30 wurde in einer Menge von 0,03 ml/Vertiefung zugegeben und 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Platte wurde 3-mal mit ddH2O gewaschen und getrocknet. Die Proben wurden unter einem Fluoreszenzmikroskop betrachtet. Der TCID50/ml-Wert wurde unter Anwendung des Reed-Meunsch-Berechnungsverfahrens bestimmt.
  • Die TCID50-Ergebnisse zeigten, dass ISi-1 1,8 × 105 Bakterien/ml enthielt. Bei einem vierten Inokulum handelte es sich um ein Placebo, das sich von Gewebekulturzellen, die auf die gleiche Weise wie die Impfstoffe bearbeitet worden waren, ableitete.
  • Der abgetötete Impfstoff wurde einer Bestimmung des Gesamtproteingehalts unter Anwendung des Biuret-Verfahrens getestet. Er enthielt 0,311 mg/ml.
  • Die Schweine wurden am 13.12.1995 geimpft. Der Lebendimpfstoff wurde auf 1-mal in einer Dosis von 2 ml auf intranasalem Wege (1 ml/Nasenloch) verabreicht. Der abgetötete ISi-2-Impfstoff wurde auf intramuskulärem Wege in einer Menge von 1,5 ml/Schwein und nochmals 14 Tage später verabreicht. Sämtliche Kontrolltiere erhielten nicht-infizierte Zellen auf die gleiche Weise wie die Lebendimpfstoffe.
  • Beobachtung und Proben
  • Faeces-Abstriche und Seren wurden während der gesamten Studie in Abständen von 7 Tagen gewonnen. Die Faeces-Abstriche wurden einer PCR unter Verwendung des Primersets 5'-TATGGCTGTCAAACACTCCG-3' und 5'-TGAAGGTATTGGTATTCTCC-3' für die DNA-Amplifikationen verarbeitet. Folgende Zyklusparameter wurden eingehalten: 5 Minuten bei 93°C, 45 Sekunden bei 55°C und 45 Sekunden bei 72°C für den ersten Zyklus. 33 Zyklen wurden bei den vorerwähnten Temperaturen für 45 Sekunden pro Temperatur durchgeführt. Der letzte Zyklus umfasste 45 Sekunden bei 93°C, 45 Sekunden bei 55°C und 2 Minuten bei 72°C. Die Primer entsprachen den Angaben von Jones et al.
  • Belastung
  • Sämtliche Tiere (mit Ausnahme der strikten Kontrollen) erhielten 26 und 27 Tage nach der Impfung eine Belastungskultur, die aus niedrig passagierten Kulturen der L. intracellularis-Stämme N343 und N72994 bestanden, die 8 bis 12 Wochen kontinuierlich gezüchtet worden waren. Die Kulturen wurden durch 20-minütiges Zentrifugieren mit 3 000 × g geerntet. Die Pellets wurden in Saccharose-Phosphat-Glutamat-Lösung (SPG) mit einem Gehalt an 10% fötalem Kälberserum resuspendiert und 4-mal durch eine Nadel Nr. 25 geleitet. Einige geerntete Kulturen wurden bis zur Belastung bei -70°C aufbewahrt, während andere bis zum Tag der Belastung gezüchtet und dann geerntet wurden. Die Belastungsinokula wurden vereinigt und die TCID50 Werte der Kulturen wurden bestimmt. Die Proben wurden bis zur Verabreichung auf Eis aufbewahrt.
  • Die am 8.1.1996 verabreichte Belastungskultur bestand aus 4 × 104 Bakterien/ml und die am 9.1.1996 verabreichte Belastungskultur wies 3 × 104 Bakterien/ml auf. Die Schweine erhielten an beiden Tagen durch Magenspülung 15 ml der Belastungskultur. Auf diese Weise erhielten die Tiere 6 × 105 Bakterien/Schwein bzw. 4,7 × 105 Bakterien/Schwein am 8.1.96 bzw. am 9.1.96.
  • Ergebnisse Sicherheit
  • Faeces-PCR-Ergebnisse: Der Nachweis von L. intracellularis unter Anwendung von PCR bewies, dass zu Beginn der Studie keines der Schweine Bakterien ausschied. 7 Tage nach der Impfung erwiesen sich alle Schweine als negativ. 14 Tage nach der Impfung waren 3 Schweine in der ISi-1-Gruppe positiv.
  • 21 Tage nach der Impfung waren in der ISi-1-Gruppe 2 Tiere positiv und sämtliche anderen Schweine waren negativ. 26 Tage nach der Impfung schied keines der Tiere die Bakterien aus, wie durch PCR nachgewiesen wurde. 26 Tage nach der Impfung wurden 5 Schweine aus den ISi-1- und Kontrollgruppen und 4 Schweine aus der ISi-2-Gruppe der Nekropsie unterworfen. Proben wurden aus Ileum, Kolon, mesenterischen Lymphknoten und Mandeln gewonnen, sowie Lungenproben aus Schweinen mit Läsionen, die einen Verdacht auf Pneumonie zuließen.
  • Der PCR-Test wurde an den einzelnen Ileum- und Lungenproben durchgeführt. Mandeln, Kolon und Lymphknoten wurden in Bezug auf die Behandlungsgruppe vereinigt und einer PCR unterworfen. Die PCR-Ergebnisse sind nachstehend aufgeführt.
    Gruppe PCR von Ileum 26 Tage nach der Impfung Vereinigte Kolonproben Vereinigte Mandelproben Vereinigte mesenterische Lymphknoten proben Vereinigte Lungenproben
    ISi-1 1 von 5 + - - 1 von 1
    ISi-2 0 von 4 - - - 0 von 1
    Kontrollen 0 von 5 - - kein Test
    Strikte kein Test kein Test kein Test kein Test kein Test
    Kontrollen
  • Histologische Schnitte der Ileumproben wurden unter Verwendung eines für L. intracellularis spezifischen monoklonalen Antikörpers als primärem Antikörper und von anti-Maus-Immunoglobulin G-Fluorochrom-Konjugat als sekundärem Antikörper gefärbt. L. intracellularis wurde in 3 von 5 Schweinen der ISi-1-Gruppe festgestellt. Sämtliche übrigen Schweine waren bei Fluoreszenz-Antikörper-Färbung negativ.
  • Die übrigen Schweine wurden 21 Tage nach der Belastung der Nekropsie unterworfen und die gleichen Proben wurden für die Bewertung gewonnen. Die PCR-Ergebnisse sind nachstehend aufgeführt.
    Gruppe PCR von Ileum 21 Tage nach der Belastung Vereinigte Kolonproben Vereinigte Mandelproben Vereinigte mesenterische Lymphknotenproben Vereinigte Lungenproben
    ISi-1 0 von 10 + - - -
    ISi-2 0 von 6 - - - -
    Kontrollen 4 von 10 - - -
    Strikte 0 von 5 - - - -
    Kontrollen
  • FA-Färbungen der Illeumproben wurden auf die vorstehend angegebene Weise durchgeführt, wobei 7 von 10 Tieren in der Kontrollgruppe sich als positiv erwiesen. Sämtliche übrigen Tiere erwiesen sich in Bezug auf die Anwesenheit von L. intracellularis als negativ.
  • Das Serum wurde in Bezug auf die Erzeugung von IgG-Antikörper durch die Schweine nach Belastung mit L. intracellularis getestet. Der Test wurde durchgeführt, indem behandelte Gewebekultur-Terasaki-Platten mit McCoys-Zellen in einer Menge von 125 Zellen/Vertiefung beimpft und vor der Infektion 18 bis 24 Stunden gezüchtet wurden. Eine Reinkultur von L. intracellularis, die in DMEM mit einem Gehalt an 5% fötalem Kälberserum auf 1 000-3 000 Bakterien/ml verdünnt worden war, wurde sodann in die Vertiefungen in einer Menge von 0,01 ml/Vertiefung gegeben. Die Platte wurde 6 Tage bei Gaskonzentrationen von 8,0% O2, 8,8% CO2 und 83,2% N2 inkubiert. Die Zellen wurden 2 Minuten mit einem kalten Gemisch aus 50% Aceton und 50% Methanol fixiert. Die Seren der Schweine wurden in sterilem PBS im Verhältnis von 1:75 verdünnt. Das verdünnte Serum wurde in einer Menge von 0,01 ml/Vertiefung zugesetzt. Die Platten wurden sodann 30 bis 60 Minuten bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Platten 5-mal mit steriler PBS gewaschen. Sodann wurden die Vertiefungen in einer Menge von 0,01 ml/Vertiefung mit anti-Schwein-IgG-Immunoglobulin G-Fluorochrom-Konjugat versetzt. Die Platte wurde 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Sodann wurden die Platten 5-mal mit ddH2O gewaschen und getrocknet. Proben wurden unter einem Fluoreszenzmikroskop betrachtet. Vertiefungen, in denen Bakterien festgestellt wurden, wurden als positiv bezeichnet. Vertiefungen, in denen keine Bakterien festgestellt wurden, wurden als negativ bezeichnet. Ergebnisse:
    Gruppe Tag 0 26 Tage nach der 47 Tage nach der
    Impfung Impfung; 21 Tage
    nach der Belastung
    ISi-1 0 von 5 6 von 15 8 von 10
    ISi-2 0 von 10 3 von 10 5 von 6
    Kontrollen 1 von 15 0 von 15 9 von 10
    Strikte Kontrollen 0 von 5 0 von 0 von 15
  • Tiere, die am Tag 0 positiv waren, wurden in wöchentlichen Abständen erneut getestet. Die Ergebnisse zeigten, dass alle Tiere 14 Tage nach der Impfung serologisch negativ geworden waren. Dies ist nicht überraschend, da die Schweine am Tag 0 ein Alter von 3 Wochen hatten und positive Ergebnisse in diesem Alter auf mütterliche Antikörper zurückzuführen sein können.
  • Die Seren wurden zusammen mit einem positiven Kontrollserum, das durch Hyperimmunisierung eines Schweins mit in Reinkultur gezüchtetem L. intracellularis erhalten worden war, getestet. Negatives Kontrollserum wurde von einem gnotobiotischen Schwein in der South Dakota State University gewonnen.
  • Die vorstehende Beschreibung und die Beispiele stellen nur Erläuterungen von bevorzugten Ausführungsformen dar, mit denen die Ziele, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung realisiert werden. Damit ist keine Beschränkung der vorliegenden Erfindung beabsichtigt.

Claims (23)

  1. Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes gegen L. intracellularis, umfassend die folgenden Schritte: (1) Züchten von L. intracellularis-Bakterien, um mit L. intracellularis infizierte Kulturzellen zu erhalten; (2) Inkubieren der infizierten Zellen bei einer Sauerstoffkonzentration von weniger als etwa 18%, wobei die infizierten Zellen in Suspension gehalten werden; (3) Ernten der L. intracellularis-Bakterien; und (4) Vermischen der L. intracelluaris-Bakterien mit einem verträglichen pharmazeutischen Träger.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, ferner umfassend den Schritt des Passagierens eines Teils der infizierten Zellen auf frische Zellen, um die Erzeugung von L. intracellularis-Bakterien zu erhöhen.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die L. intracellularis-Bakterien aus einem mit L. intracellularis infizierten Tier erhalten werden.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei es sich bei dem Tier um ein Schwein handelt.
  5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Inkubation bei einer Sauerstoffkonzentration im Bereich von 0% bis etwa 8% erfolgt.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Inkubation bei einer Sauerstoffkonzentration im Bereich von 0% bis etwa 3% erfolgt.
  7. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Inkubation bei einer Kohlendioxidkonzentration im Bereich von etwa 6% bis etwa 9% erfolgt.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Inkubation bei einer Wasserstoffkonzentration im Bereich von etwa 73% bis etwa 94% erfolgt.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Inkubation bei etwa 0 bis etwa 8,0% O2, etwa 8,8% CO2 und etwa 83,2% H2 erfolgt.
  10. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Kulturzellen aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus HEp-2-, McCoys- und IEC-18-Zellen besteht.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die McCoys- und IEC-18-Zellen sich auf Mikroträgern befinden.
  12. Verfahren nach Anspruch 10, wobei es sich bei den Kulturzellen um HEp-2-Zellen handelt, die in Abwesenheit von Mikroträgern gezüchtet werden.
  13. Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes gegen L. intracellularis, umfassend die folgenden Schritte: (1) Inokulieren von Kulturzellen mit einem Inoculum, das L. intracellularis-Bakterien umfasst, um die Zellen mit diesen Bakterien zu infizieren; (2) Inkubieren der infizierten Zellen bei einer Temperatur von etwa 36°C bis etwa 38°C bei einer Sauerstoffkonzentration von 0% bis etwa 8% unter Bewegen der infizierten Zellen, um die L. intracellularis-Bakterien zu züchten, wobei die infizierten Zellen in Suspension gehalten werden; (3) Ernten der L. intracellularis-Bakterien; und (4) Vermischen der L. intracellularis-Bakterien mit einem verträglichen pharmazeutischen Träger.
  14. Verfahren nach Anspruch 1 oder 13, wobei das Verfahren ferner den Schritt der Inaktivierung der kultivierten L. intracellularis-Bakterien umfasst, um einen abgetöteten Impfstoff zu erhalten.
  15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei die L. intracellularis-Bakterien unter Verwendung von 0,3% Formalin oder durch eine längere Einwirkung von O2-Umgebungskonzentrationen inaktiviert werden.
  16. Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes gegen L. intracellularis, wobei der Impfstoff einen abgeschwächten L. intracellularis-Stamm umfasst, umfassend die folgenden Schritte: (1) Herstellen eines abgeschwächten L. intracellularis-Stammes, umfassend das Gewinnen von mit L. intracellularis-Bakterien infizierten Kulturzellen, das Inkubieren der infizierten Zellen bei einer Sauerstoffkonzentration von 0% bis etwa 18%, das Bewegen der infizierten Zellen, um die Bakterien zu züchten, während die infizierten Zellen in Suspension gehalten werden, das Passagieren mindestens eines Teils der gezüchteten Bakterien, das Ernten mindestens eines Teils der gezüchteten Bakterien und das Auswählen eines abgeschwächten Stammes, um abgeschwächte L. intracellularis-Bakterien bereitzustellen; und (2) das Vermischen der abgeschwächten L. intracellularis-Bakterien mit einem verträglichen pharmazeutischen Träger.
  17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Inkubation bei einer Sauerstoffkonzentration im Bereich von 0% bis etwa 3% erfolgt.
  18. Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Inkubation bei einer Kohlendioxidkonzentration im Bereich von etwa 6% bis etwa 9% erfolgt.
  19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei die Inkubation bei einer Wasserstoffkonzentration im Bereich von etwa 73% bis etwa 94% erfolgt.
  20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Inkubation bei etwa 0 bis etwa 8,0% O2, etwa 8,8% CO2 und etwa 83,2% H2 erfolgt.
  21. Verfahren nach Anspruch 18, wobei die Kulturzellen aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus HEp-2-, McCoys- und IEC-18-Zellen besteht.
  22. Verfahren nach Anspruch 17, wobei es sich bei den Kulturzellen um HEp-2-Zellen handelt, die in Abwesenheit von Mikroträgern gezüchtet werden.
  23. Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Kulturzellen 6 bis 8 Monate in Suspension gehalten werden.
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