KR20050048651A - 라우소니아 인트라셀룰라리스의 배양, 항-라우소니아인트라셀룰라리스 백신 및 진단시약 - Google Patents

라우소니아 인트라셀룰라리스의 배양, 항-라우소니아인트라셀룰라리스 백신 및 진단시약 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세포를 감염시키기 위하여 엘. 인트라셀룰라리스(L. intracellularis) 박테리아를 세포에 접종하며, 감소된 산소 농도에서 감염된 세포를 인큐베이션하고, 현탁액내에서 감염된 세포를 유지시킴으로써 엘. 인트라셀룰라리스 박테리아의 대량 배양 및 약독화를 위한 방법에 관한 것이다. 또한, 항-엘. 인트라셀룰라리스 백신을 현탁액에서 성장시킨 배양액으로부터 제조하였으며, 진단 시약도 공개하였다.

Description

라우소니아 인트라셀룰라리스의 배양, 항-라우소니아 인트라셀룰라리스 백신 및 진단시약{Lawsonia intracellularis cultivation, anti-lawsonia intracellularis vaccines and diagnostic agents}
본 발명은 항-라우소니아 인트라셀룰라리스 백신 및 라우소니아 인트라셀룰라리스의 감염에 대한 예방 및 그 진단 방법에 관한 것이다. 본 발명의 생성물 및 방법은 부분적으로는 대량 공급용 엘. 인트라셀룰라리스(L. intracellularis)를 배양하기 위하여 본 발명자가 밝혀낸 개선된 방법의 결과로서 얻을 수 있다.
돼지의 증식성 장질환("PPE")의 원인이 되는 엘. 인트라셀룰라리스는 결과적으로 토끼, 흰담비, 햄스터, 여우, 말 및 타조 및 에무스 만큼 다양한 다른 동물등을 포함한 모든 동물에게 영향을 끼친다.
엘. 인트라셀룰라리스는 특히 돼지 무리내에서 많은 손실의 원인이다. 미연방공화국에서 측정한 PPE의 유행 및 발생 빈도는 돼지 무리의 20% 이며, 매년 이천만 달러의 손실을 가져온다.
PPE의 일치된 특징은 장의 감염 부위의 장세포에서 세포질성이며, 막에 결합하지 않은 구부러진 간균(bacilli)의 발생이다. PPE와 관련된 박테리아는 S. McOrist 등에 의해서 Vet. Pathol. Vol. 26, 260-64(1989)에서 "캄필로박터(Campylobacter)-유사 미생물"로 언급되어져 왔다. 이어서, 원인성 박테리아는 C. Gebhart et al., Int'l. J. of Systemic Bacteriology, vol. 43, No. 3, 533-38(1993)에서 출생지로 언급되어진 이레알 심비온트(Ileal symbiont; IS) 인트라셀룰라리스로, 신규 분류 속 및 종으로 확인되었다. 좀 더 최근에, 이러한 신규 박테리아는 분류학적 이름 라우소니아(Lawsonia; L.) 인트라셀룰라리스(intracellularis)로 불리어진다(S. McOrist et al., Int'l. J. of Systemic Bacteriology, vol.45, No. 4, 820-25(1995)). 이러한 세 가지 이름은 본 발명에서 확인되고 언급된 바와 같이 상호 교환적으로 동일한 유기체에 사용된다. 본 발명자는 분류학적 이름인 엘. 인트라셀룰라리스를 본 발명의 설명 전반에 걸쳐 사용하려고 시도한 바 있다.
엘. 인트라셀룰라리스는 종래의 무세포 배양액 상에서 보통의 박테리아적 방법에 의해 배양될 수 없는 절대적인 세포내 박테리아이며, 성장하기 위해 부착할 상피세포가 필요하다고 여겨진다. S. Mcorist et al., Infection and Immunity, vol. 61, No.10, 4286-92(1993) 및 G. Lawson et al., J of Clinical Microbiology, Vol. 31, No. 5, 1136-42(1993) 에서는 종래의 조직 배양 플라스크에서 단층의 IEC-18 쥐의 장의 상피세포를 이용한 엘. 인트라셀룰라리스의 배양에 관한 내용을 기술하고 있다. 또한, H. Still, Infection and Immunity, Vol. 59, No. 9, 3227-36(1991)에서는 장 407 인간의 태아 장세포 단층 및 GPC-16 기니피그(guinea pig) 결장의 선암 세포 단층을 사용하여 종래의 조직 배양 플라스크에서 배양한 내용을 기술하고 있다. 이러한 선행 배양 방법은 더 많은 노력을 필요로 하며, 대규모 배양에는 적합하지 않다.
엘. 셀룰라리스의 감염, 치료 및 질병의 효과적인 구제에 대해서 통용되는 지식은 시험관내 배양에서는 엘. 인트라셀룰라리스의 까다로운 성장 요구 조건에 의해서 매우 방해된다는 것이다. 현재는 엘. 인트라셀룰라리스의 배양을 하기 위한 개선된 방법이 필요하다. 또한, 항-엘. 인트라셀룰라리스 백신 및 엘. 인트라셀룰라리스 감염을 진단하는 효과적인 기술이 필요하다.
본 발명의 목적은 항-엘. 인트라셀룰라리스 백신을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 생물학적 검체중에, 엘. 인트라셀룰라리스에 대한 항체의 존재를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 목적은 백신 생성 및 진단 물질을 위한 엘. 인트라셀룰라리스의 대규모 배양을 가능케하는 개선된 배양 방법을 제공하는 것이다.
이러한 목적 및 그외의 목적 등을 이루기 위하여, 여기에서 공지되고 넓게 기술된 바와 같이 본 발명의 목적에 따라, 본 발명은 엘. 인트라셀룰라리스의 배양 방법 및 그로 인해 생성된 박테리아의 대규모 공급 방법을 제공한다. 본 방법에 따라서, 엘. 인트라셀룰라리스 박테리아를 현탁액중에 박테리아를 유지시키는 동안 엘. 인트라셀룰라리스를 배양하기 위하여 박테리아를 진탕하면서 엘. 인트라셀룰라리스 박테리아를 약 0% 내지 약 18%의 산소 농도에서 인큐베이션시킨다.
다른 실험에 따르면, 박테리아로 세포를 감염시키기 위해서 약 30% 합류점을 가지는 단층의 HEp-2, 맥코이(McCoys), 또는 IEC-18 세포를 엘. 인트라셀룰라리스 박테리아를 함유하는 접종물로 접종함으로써 엘. 인트라셀룰라리스 박테리아를 배양하는 방법을 제공한다. 감염된 세포를 온도 약 36℃ 내지 38 ℃, 산소에 농도 약 0% 내지 약 8.0%에서 세포가 합류할 때까지 인큐베이션한다. 감염된 세포 및 성장 배지를 현탁액내에서 세포를 보존하기에 적합한 발효기, 바이오리액터, 스핀너 플라스크 또는 다른 용기에 넣는다. 현탁액중에 감염된 세포를 보존하는 동안 엘. 인트라셀룰라리스 박테리아를 배양하기 위해서 세포를 진탕하면서 인큐베이션한다. 이어서, 엘. 인트라셀룰라리스 박테리아의 생성을 증가시키기 위하여 배양된 엘. 인트라셀룰라리스의 일부를 신선한 배양 세포로 계대시킨다.
본 발명은 항-엘. 인트라셀룰라리스 백신 및 엘. 인트라셀룰라리스 백신을 생성하는 방법을 제공한다. 배양된 엘. 인트라셀룰라리스 박테리아를 충분히 여러번 계대하고, 약독화된 균주를 선별하거나, 배양된 박테리아를 화학적 방법에 의해 약독화하여 무발병성 엘. 인트라셀룰라리스 박테리아를 생성한다. 또한, 죽어있는 엘. 인트라셀룰라리스 박테리아 백신을 본 발명의 배양방법으로 제조할 수 있다. 특별히 바람직한 구체예에 따르면, 백신의 용도로 사용하기 위한 약독화된 균주를 생성하기 위하여 박테리아를 적어도 약 7회 내지 12회 계대하면서 적어도 약 6 내지 8 개월 동안 계속적으로 배양한다. 이어서, 약독화된 박테리아를 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합시키고, 면역 반응을 생성하기 위한 유효량을 동물에 투여한다. 본 발명자는 어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)에 통상적으로 바람직하게 약독화된 균주(N343NP40wk)를 기탁하였다.
또한, 본 발명은 배양된 엘. 인트라셀룰라리스 박테리아의 적어도 일부를 회수하고, 동물로부터 얻은 생물학적 검체를 생물학적 검제중에 존재하는 항체와 엘. 인트라셀룰라리스 또는 구성요소가 반응하는 조건하에서 회수된 엘. 인트라셀룰라리스 박테리아 또는 그의 구성요소와 접촉시키고, 항원-항체 반응의 발생여부를 관찰함으로써 생물학적 검체중에 엘. 인트라셀룰라리스 박테리아와 특이적으로 반응하는 항체의 존재 여부를 결정하는 방법을 제공한다.
본 발명의 추가적 특징 및 장점은 하기 설명에 기술하며, 그 설명으로 명백해지거나 본 발명의 실시에서 알 수 있을 것이다.
여기에서 사용된 바와 같이, 용어 "엘. 인트라셀룰라리스"는(C. Gebhart et al., Int'. J. of Systemic Bacteriology, vol. 43, No. 3, 533-38(1993) 및 S. McOrist et al. Int'l. J. of Systemic Bacteriology, Vol. 45, NO. 4, 820-25(1995))(각각은 본 명세서에서 전체적으로 참조문헌으로 인용됨)에 자세히 기술된 세포내의 굽은 형의 그람-음성 박테리아를 의미하며, 제한하는 것은 아니지만, 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션, 로크빌, 엠디(American Type Culture Collection, Rockville, MD)에 기탁된 박테리아 ATCC 55672; 내셔날 콜렉션 오브 타입 컬쳐, 코린데일, 런던(National Collection of Type Cultures, Colindale, London)에 기탁된 박테리아 NCTC 12656 및 12657. 본 기술 분야에서 공지되어 있는 지식 및 본 명세서의 내용에 의해 세계적으로 PPE 감염된 돼지 또는 다른 동물로부터 수득할 수 있는 원인성 박테리아; 자연 발생적으로 또는 인위적으로 수득되는 상기 박테리아중 어느 것의 변이체 또는 돌이변이를 포함한다.
여기에서 사용된 바와 같이, 용어 "약독화된 균주"는 본 명세서에서 습듭한 배양 및 계대 기술에 따라 제조되어 숙주 동물로 투여될 때 면역성을 유지하면서 무발병성을 얻은 어느 엘. 인트라셀룰라리스 균주를 의미한다. 하기에 나타낸 바와 같이, 다양하고 상이한 엘. 인트라셀룰라리스 균주들을 본 발명에 따라 배양하고 약독화하여 엘. 인트라셀룰라리스에 감염되기 쉬운 돼지 및 다른 동물에서 백신으로서 효능을 갖는 약독화된 면역 균주들을 수득한다.
본 발명의 약독화된 균주는 일반적으로 조류, 어류, 가축, 돼지, 말, 포유동물 및 영장류를 포함하는 동물에 대한 항미생물성 백신에서 면역원으로서의 용도를 가지리라고 기대된다. 본 발명에서 제공된 기술 분야의 기술자에게 알려진 기술에 의해 제조될 수 있다. 이러한 백신은 약제학적으로 허용되는 담체내에 면역학적으로 유효량의 약독화된 균주를 함유할 것이다. 백신은 1회 이상 투여될 수 있다. 면역학적으로 유효량은 과도한 실험없이도 본 기술에서 공지된 방법 및 여기에 포함된 기술에 의해 결정된다. 무발병성 박테리아의 양은 계속적으로 무발병성이면서 질병에 감염되기 쉬운 동물에서 면역 반응을 자극하기 위하여 충분하여야 한다. 이는 특별한 동물, 박테리아, 및 포함된 질병에 따라 달라질 것이다. 감염되기 쉬운 동물에게 권장되는 투여량은 바람직하게는 체중당 약 103 내지 109 박테리아/㎏이며, 가장 바람직하게는 체중당 약 105 내지 107 박테리아/㎏이다. 담체는 본 기술 분양의 기술자에게 공지되어 있고 안정화제 및 희석제를 포함한다. 또한, 그러한 백신은 적당한 면역보강제(아주반트)를 함유할 수 있다. 본 발명의 백신은 예를 들면, 또다른 동결건조된 백신의 희석제로서 다른 백신과의 혼합물의 형태로 사용될 수 있거나, 동결건조 전에 다른 백신과 혼합될 수 있다. 또한, 백신 제제는 또한 저장 목적 또는 액체 백신으로의 연속된 제형을 위해 예를 들면 동결 건조로 건조될 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한, 동물숙주를 엘. 인트라셀룰라리스 박테리아로 부터 보호할 목적으로 독성의 야생형 엘. 인트라셀룰라리스 박테리아에 대한 면역 반응을 유도하는 방법을 포함한다. 그 방법은 숙주에게 면역학적으로 유효량의 본 발명의 약독화된 박테리아 또는 살균된 박테리아를 투여하는 것이며, 바람직하게는 숙주에게 본 발명의 백신을 투여하는 것을 포함한다.
여기에서 사용된 바와 같이, 용어 "대량 배양"은 약 2.0 내지 3.0 ℓ 이상의 배양 수준을 의미하고 100 ℓ 이상 규모의 생산을 포함한다. 여기에서 사용된 바와 같이, "배양"은 엘. 인트라셀룰라리스의 성장, 생식 및/또는 증식을 촉진시키는 방법을 의미한다.
본 발명의 배양 방법의 실시에서, 세포를 박테리아로 감염시키시 위해서 배양세포를 먼저, 엘. 인트라셀룰라리스를 함유한 접종물로 접종한다. 제한하는 것은 아니지만, IEC-18(ATCC 1589)-래트의 내장 상피세포, HEp-2(ATCC 23)-인간의 표피 모양(epidermoid)의 암종 세포, McCoys(ATCC 1696)-마우스의(비특이성) 세포, MDCK(ATCC 34)-마딘-다르비(Madin-Darby) 개의 신장세포, BGMK(바이오화이트택커 #71-176)-버팔로 녹색 원숭이 신장세포, 및 돼지의 내장 상피세포를 포함하는 다수의 세포주가 본 발명의 실시에서 사용될 수 있다. 바람직한 배양세포는 HEp-2, McCoys 또는 IEC-18 세포이다. 다르게는, 박테리아를 본 명세서에서 지정한 적절한 용존 O2 농도에서 보존되는 동안 박테리아는 무세포계에서 배양될 수 있다.
배양세포를 사용하는 경우, 접종에 앞서, 필수적인 것은 아니지만, 바람직하게는 세포는 단층 형태이다. 단층을 형성하기 위해 세포를 통상의 플라스크에 시딩(seeding)할 수 있다. 각 플라스크를 일반적으로 성장 배지와 혼합된 세포를 25㎠의 플라스크당 약 1×105 세포 내지 약 10×105 세포로 시딩한다. 성장 배지는 질소원, 선택된 배양세포의 필수 성장 인자, 및 글루코오스 또는 락토오즈와 같은 탄소원을 포함하는 세포배양을 위한 어떠한 배양액일 수도 있다. 판매되는 다른 다양한 배지가 우수한 결과를 가지고 사용되더라도, 바람직한 배지는 2-5% 소의 태아혈청을 포함하는 DMEM이다.
본 발명자는 배양세포를 성장의 일정 상태에 유지시킴으로써 엘. 인트라셀룰라리스의 성공적인 배양은 증진된다는 것을 발견하였다. 그러므로, 단층의 배양세포는 접종시에 약 20% 내지 약 50% 합류점에 있어야 한다. 바람직하게는, 세포는 접종시에 약 30% 내지 약 40% 합류점에 있어야하며, 가장 바람직하게는 약 30% 합류점이다.
접종물은, 예를들면, ATCC 기탁번호 55672, NCTC 기탁 번호 12656 또는 12657, 또는 여기에 언급된 분리 및 정제 기술을 사용하여 감염된 돼지 또는 다른 동물로부터 수득된 엘. 인트라셀룰라리스의 순수 배양액일 수 있다.
한 구체예에 따르면, 본 발명을 실시하기 위한 접종물은 PPE로 감염된 돼지 또는 다른 동물의 회장의 점막을 긁어서 제조된 내장 균등액이다. 내장 균등액을 제조할때, 배양을 위해 선택된 회장의 단면은 전제적으로 장(gut) 비후를 갖는 심각한 병변을 보여야 한다. 박테리아의 약한 특성 때문에, 바람직하게는 검시후 가능한 신속하게 검체를 -70 ℃에 보관하여야한다. 바람직하게는 엘. 인트라셀룰라리스가 내성인 반코마이신, 암포테리신 B 또는 겐타마이신 및 네오마이신을 포함하는 아미노글리코시드 그룹의 항생제의 요소 등과 같은 항생제를 접종물에 가하여 엘. 인트라셀룰라리스를 성장하게 하는 동안 박테리아를 오염시키는 것을 억제하도록 한다. 접종물이 순수 배양액 또는 장의 균등액이든지간에, 배양세포의 접종은 여기에서 주어진 기술 분야의 공지된 다양한 기술에 의해 수행될 수 있다.
이어서, 박테리아 및/또는 접종된 배양 세포를 감소된 용존 O2 농도하에서 인큐베이션시킨다. 18% 이상의 용존 산소 농도에서 엘. 인트라셀룰라리스 성장은 이 범위외의 산소 농도에서 결국 발생하는 성장의 정지를 함께 결코 최적의 상태는 아니다. 바람직하게는, 접종된 배양세포는 약 0% 내지 약 10% 범위의 용존 산소 농도에서 인큐베이션된다. 더 바람직하게는, 세포는 약 0% 내지 약 8% 범위의 산소 농도에서 인큐베이션되며, 가장 바람직하게는 약 0% 내지 약 3.0%의 산소 농도이다.
또한, 적절한 이산화탄소의 농도는 엘. 인트라셀룰라리스의 적절한 성장에 중요하다. 10% 이상 및 4% 미만의 이산화탄소의 농도에서, 성장은 이 범위외의 이산화탄소 농도에서 결국 발생하는 성장의 정지와 함께 결코 최적의 상태는 아니다. 바람직하게는, 이산화탄소의 농도는 약 6% 내지 약 9% 범위, 가장 바람직하게는 약 8.8%의 이산화탄소의 농도이다.
또한, 세포는 바람직하게는 수소 농도 약 73% 내지 약 94%의 범위에서 인큐베이션된다. 질소가 존재하는 수소의 일부 또는 모두를 대신하여 사용될 수 있다. 특히 바람직한 구체예에 따라, 세포는 약 0-8.0% O2, 약 8.8% CO2, 및 약 83.2% H2에서 인큐베이션된다.
접종된 세포를 적절한 농도의 산소 및 이산화탄소를 함유하고, 배양하는 동안 세포가 현탁될 수 있게 하는 이중 가스 인큐베이터 또는 다른 가스 챔버내에서 인큐베이션시킬 수 있다. 이 챔버는 현탁액중에 접종된 세포를 보존하기 위한 수단, 및 적절한 가스 농도를 공급하고 유지하기 위한 가스 모니터 및 공급원을 포함하여야 한다. 인큐베이션 온도는 30 ℃ 내지 45 ℃ 범위에 있어야 하며, 더 바람직하게는 약 36 ℃ 내지 약 38 ℃범위이다. 가장 바람직한 온도는 약 37 ℃이다. 본 발명의 배양 및 약독화 방법을 위한 필수 장비는 본 명세서에서 주어진 기술 분야에서 종래의 기술자에게는 용이하게 이용될 수 있다. 본 발명을 수행하기 위해 적절한 장비의 한 예는 현탁액내에서 세포를 유지시키기 위하여 스핀너(spinner) 플라스크와 연결된 이중의 가스 배양기, 예를 들면, 랩-라인, 멜로세 파크, 일리노이스(lab-line, Melrose Park, Illinoise)에서 구입한 모델 480이다. 본 발명의 바람직한 장비는 적어도 약 2 ℓ의 배양액을 함유하며, 적절한 농도의 분리된 가스 또는 기계적 교반를 통하여 현탁액에서 배양세포를 유지할 수 있으며, 배양액내의 용존 산소 수준을 계속적으로 모니터하는 발효기, 바이오반응기 또는 회전 진탕기를 포함한다. 뉴 브룬스윅(New Brunswick), 브라운(Braun) 및 다른 회사들은 이 목적을 위해 적절한 발효기 및 바이오반응기를 제조한다.
인큐베이션하는 동안 현탁된 상태에 접종된 세포를 유지시킴으로써, 세포, 즉 엘. 인트라셀룰라리스의 성장을 성장 배지 및 산소 및 이산화탄소의 적절한 혼합액에 각각의 세포의 노출을 증가시킴으로써 최대로 할 수 있다. 배양세포는 예를들면, 배양 플라스크, 롤러병, 막 배양 및 스핀너 플라스크를 포함한 본 기술 분야에서 공지된 다양한 방법에 의해 현탁액내에서 진탕되고 유지될 수 있다. 세포는 내부에 이중의 가스 배양기 또는 유사한 장치를 가진 스핀너 플라스크내에 세포를 배양함으로써 배양하는 동안 현탁액에서 유지될 수 있다. 여기에서 사용된 바와 같이, 용어 "스핀너 플라스크"는 패들, 프로펠러 또는 배양액을 진탕하는 다른 수단을 사용하며, 그곳에 함유된 세포를 현탁액에 유지하는 플라스크 또는 다른 용기를 의미한다.
본 발명의 특히 바람직한 구체예에서, 접종된 세포가 합류점(confluency)에 도달할 때까지 배양한 후, 세포를 성장 배지를 함유하는 스핀너 플라스크(spinner flask)에 넣고 플라스크를 회전시키면서 이중 가스 배양기내에서 배양하였다. 바람직하게는, 접종된 세포를 스핀너 플라스크에서 긁어낸다. 이는 세포를 떨어뜨리기 위하여 예를들면, 세포 주걱(scraper)을 사용하는 것과 같은 본 기술 분야에서 공지된 다양한 방법에 의해 할 수 있다. 세포가 일단 스핀너 플라스크에 유입되면, 감염된 세포를 현탁액에 보존하기 위해 스핀너 풀라스크의 패들을 전형적으로 약 30 내지 약 60rpm의 범위내에서 회전시킨다.
배양된 엘. 인트라셀룰라리스의 일부를 신선한 배양세포로 계대시켜 엘. 인트라셀룰라리스 박테리아의 생성을 증가시킨다. 본 명세서에서 용어"계대" 또는 그의 변형어는 신선한 세포를 박테리아로 감염시키기 위하여 배양된 엘. 인트라셀룰라리스의 일부를 신선한 배양세포로 옮기는 과정을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "신선한"은 엘. 인트라셀룰라리스에 의해 아직 감염되지 않은 세포를 의미한다. 바람직하게 그러한 세포는 평균 약 하루를 넘기지 않은 세포이다.
현탁 배양액내에서 엘. 인트라셀룰라리스의 계대는 원배양액의 일부를 제거하고, 그것을 신선한 배양 세포를 함유하는 새 플라스크에 가함으로써 수행될 수 있다. 원배양액이 상당한 양의 박테리아/㎖, 예를들면, 약 104 박테리아/㎖ 이상을 가지는 경우, 약 1 내지 10%(부피:부피)의 배양액을 감염된 플라스크에서 신선한 세포를 함유하는 새 플라스크로 가하는 것이 바람직하다. 이는 50-100%의 세포가 감염될 때 바람직하게 수행된다. 50% 미만의 세포가 감염된 경우, 계대는 새 플라스크로 배양액을 1:2로 나누고, 신선한 배지를 가하여 부피를 크게함으로써 바람직하게 수행된다. 어느 경우에도, 단층의 배양액의 계대와는 정반대로, 선행기술에서와 같이 세포 용균 및 그외의 단계는 필요하지 않다.
배양세포를 충분히 성장시키고 IFA, TCID50 또는 다른 비교가능한 방법에 의해 측정되는 약 70% 이상의 세포 감염률로 엘. 인트라셀룰라리스로 연속하여 감염시킨 후, 적어도 일부의 배양된 엘. 셀룰라리스 박테리아를 회수한다. 회수 단계는 본 발명의 기술 분야에서 당업자에게 공지된 다양한 기술에 의해 박테리아를 현탁액으로부터 분리함으로써 수행될 수 있다. 바람직하게는, 엘. 인트라셀룰라리스 박테리아는 전부 또는 일부의 현탁액의 내용물을 원심분리하여 배양세포를 펠릿(pellet)화하며, 생성된 세포 펠릿을 재현탁시킨 다음, 감염된 세포를 용균시킴으로써 회수한다. 전형적으로, 세포 및 박테리아를 펠릿화하기 위하여 적어도 내용물의 일부를 약 3000×g에서 약 20분 동안 원심분리한다. 다음, 펠릿을 예를들면, 수크로즈-포스페이트-글루타메이트(SPG) 용액에 재현탁시킨 다음, 세포를 용균시키기 위하여 약 4시간 동안 25 게이지(gages) 바늘로 통과시킨다. 추가의 정제가 필요한 경우, 세포핵 및 그 부산물을 제거하기 위하여 검체를 약 145×g에서 약 5분 동안 원심분리할 수 있다. 이어서 상등액을 3000×g에서 약 20분 동안 원심분리하고 생성된 펠릿을 소의 태아 혈청을 포함하는 SPG(냉동 또는 접종물로서의 용도에 적합한 회수된 박테리아를 제조하기 위하여) 또는 성장 배지(신선한 세포로 계대하기에 더욱 적절한 회수된 박테리아를 제조하기 위하여)와 같은 적절한 희석제에 재현탁시킨다.
앞에서 언급한 바와 같이, 대규모 생산을 위한 엘. 인트라셀룰라리스의 효과적인 성장은 조직세포의 활성적인 성쟝을 유지시킴으로써 증진시킬 수 있다. 단층으로, 배양액이 합류되었을 때, 세포분열 속도는 실질적으로 감소한다. 단층의 조직 배양상에서 엘. 인트라셀룰라리스를 성장시키려는 시도는 제한적으로 성공하였으며, 대규모화는 가능하지 않았다. 그러나, 현탁 배양액을 사용하여 세포의 활성적 성장을 크게 촉진시켜 계대배양 및 대규모 배양을 허용되게 하였다. 상기에 설명한 바처럼 약 0-3% 용존 산소량 사이에서 발효기를 사용하여, 본 발명자들은 108박테리아/㎖까지 성장시킬 수 있었다. 본 발명자들은 또한 여러달 동안 배양된 박테리아가 활성적으로 성장하도록 유지시킬 수 있었으며, 무한적으로 그렇게 할 수 있다고 기대된다.
본 발명 이전에, 엘. 인트라셀룰라리스로 감염되기 위해서 세포가 표면에 부착되어져야 한다고 일반적으로 믿어왔다. 본 발명의 세포현탁액은 유일하며 이 이론에 모순된다. McCoy 또는 IEC-18 세포를 사용하는 경우, 젤라틴, 아가로즈, 콜라겐, 아크릴아미드 또는 하이클론 연구소 로간유티(HyClone lab. Logan, UT)에 의해 제조된 컬리스페레(Cultisphere)-G 다공성 미세담체와 같은 실리카 비드(bead)를 성장 배지과 함께 가한다. 그러나, HEp-2 세포 및 그외 세포들은 본 발명의 배양 방법에 따라서 미세담체를 필요로 하지 않는다. 이것은 대량 배양을 위한 특별한 장점 및 경제적인 면을 제공한다.
배양 보존 목적을 위하여 HEp-2로 배양시, 일주일 간격으로 바람직하게는 배양액의 25-50%를 제거하고 신선한 배양액으로 교환한다. 미세담체 또는 비드를 포함하는 세포배양을 하기 위하여, 바람직하게는 배양액의 25-50%를 제거하고 신선한 미세담체 또는 비드 및 신선한 배양액으로 1주일에 1-2회 교체한다. 대량화 목적을 위해, 추가의 25-50% 배지, 또는 미체담체를 포함하는 배지를 배양액에 가할 수 있다.
배양세포가 감염되는 속도에 따라, 일반적으로 2 내지 약 5주마다 신선한 세포로 계대한다. 배양세포가 2-3주내에 적어도 70%로 감염된다고 가정할 때, 바람직하게는 약 3 내지 4주마다 계대한다.
또한, 본 발명은 엘. 인트라셀라리스에 대한 백신 및 백신을 생산하는 방법을 제공한다. 특히 바람직한 구체예에 따르면, 연장된 시간(예를들면, 6-8개월)동안 현탁액중에 감염된 세포들을 보존한 후, 적어도 일부의 배양된 엘. 인트라셀라리스 박테리아를 회수되고, 잠재적인 약독화에 대하여 모니터한다. 이러한 모니터링은 약독화된 균주를 선별하기 위하여 바람직하게 숙주 동물 또는 동물 모델 시험감염(challenges)에 의해 수행된다. 약독화된 균주를 본 명세서 제시한 방법에 따라 백신으로 사용한다. 본 발명에 따른 약독화된 엘. 인트라셀룰라리스 백신이 다양한 동물에서 엘. 인트라셀룰라리스 감염에 대한 효능을 나타내며, 마찬가지로 인간에게도 효능이 있을 것이라고 예상된다.
본 발명은 배양 확장을 신속화하고, 100-1000배로 수득율을 증가시키며, 비용을 감소시킨다. 그 결과로서, 본 발명의 배양방법에 따라 생성되는 충분한 공급량의 엘. 인트라셀룰라리스 박테리아는 백신 생산 목적을 위하여 용이하게 약독화된다. 약독화는 종래의 단층 성장 기술을 사용하여 생성된 박테리아의 낮은 수득율 때문에 단층배양에서는 어렵다. 반대로, 본 발명의 엘. 인트라셀룰라리스의 배양방법은 용이도, 속도, 및 이 목적으로 이용될 수 있는 박테리아의 수를 크게 증가시킨다. 더욱 많은 세포가 존재하고 및 세포 분열이 더욱 많이 발생할수록, 백신 개발에 유익한 돌연변이 발생 수준은 증가한다. 본 발명에 따른 현탁액에서의 성장이 환경적으로 조절되는 유전자에 의해 억제되는 중요한 면역원의 발현 및 이들의 발현 산물을 증가시킨다.
생성된 약독화된 균주는 하기 실시예 1에서 기술된 바와 같이 조직 배양 단충에서 배양될 수 있지만, 바람직하게는 본 발명의 방법에 따른 현탁 배양액내에서 배양된다. 약독화를 시키는 다른 방법은 예를들면, N-메틸 니트로소구아나딘 및 본 기술분야에서 공지된 것들을 사용하여 화학적으로 약독화 시키는 것을 포함할 수 있다. 다중 계대 또는 화학적 방법에 의하든 지간에, 약독화된 엘. 인트라셀룰라리스는 백신 제조를 위해 생성되고 선별된다.
본 발명의 백신의 구체예에 따라, 항원을 상기 기술된 바처럼 원심분리 또는 미세여과(microfiltration)에 의해 회수한다. 이어서, 최적의 숙주 동물 면역 반응에 기초하여 항원을 숙주 동물 종에서 투여 적정량에 의해 측정된 정의된 수준으로 표준화한다. 박테리아는 주위 O2 수준에의, 예를들어, 1주일 지속적인 노출에 의하거나, 0.3% 포르말린 또는 다른 불활성화제를 사용함으로써 불활성화시켜 죽어있는 백신을 제조할 수 있다. 이어서, 항원을 적절한 면역 보강제, 예를 들면 수산화알루미늄 또는 광유내로 혼입시켜 면역 반응을 증진시킨다. 이어서, 3-4주령 돼지의 경우, 필요에 따라 효능 촉진제와 함께 근육내 또는 피하 주사를 통하여 항원을 사용함으로써 숙주를 백신화한다.
다르게는, 앞서 기술된 배양 방법을 사용하여 특히 바람직한 백신의 구체예에 따라, 박테리아를 연속적으로 계대하여 약독화시키고, 무발병성 생존 배양액을 유도하고 선별한다. 약독화의 징후를 위해 상기 배양액(현탁 배양액내에서 바람직하게는 적어도 6 내지 8개월 이상 성장시킨 후)을 숙주 동물에서 시험한다. 배양액을 앞서 기술된 바와 같이 회수하고, 희석한다. 예를 들면 돼지를 경구적으로 1×105 내지 1×106 박테리아로 백신화시켰다. 백신화 후 약 28일 경과시, 돼지를 다소 덜 계대된(약 30 내지 45일 경과) 발병성 엘. 인트라셀룰라리스의 배양액으로부터의 약 1×107 균주로 접종하였다. 시험감염 후 21일째 감염된 동물을 검시하고, 소장에서(육안적인)병변 및 현미경적 병변도 관찰된다. 또한, PCR 및 형광 항체가 수행되어야 한다. PCR 또는 FA 시험방법을 사용으로 약 80%의 대조군 동물은 육안적 또는 현미경적 병변을 보이고 내장의 점액 세포내 엘. 인트라셀룰라리스의 존재에 대해서 양성을 보인다. 백신화된 동물은 조직학적인 관찰에 의해 측정된 바처럼 정상적 점액 표면을 가질 것이며, PCR 시험에서는 음성으로 나타날 것이다.
일반적으로, 약독화된 면역성 엘. 인트라셀룰라리스 균주는 적어도 배양액을 약 7 내지 약 12회 계대하는 시간, 적어도 약 150 내지 250일동안 계속된 배양후에 제조된다. 본 발명에서 제시된 모니터링 및 선별 방법을 사용하는 한, 이들 수치를 다양화하여 다른 약독화된 배양액을 제조할 수 있다.
이어서 약제학적으로 허용되는 담체내에 면역학적 유효량의 엘. 인트라셀룰라리스를 포함하여 백신을 제조한다. 혼합된 면역원 및 담체는 수용액, 유제 또는 현탁액일 수 있다. 면역학적 유효량은 본 명세서에 포함된 기술에서 제시한 지나친 실험없이 본 기술분야에서 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다. 일반적으로, 정제된 박테리아를 사용할 때, 면역원의 양은 50 내지 500 ㎍ , 바람직하게는 107 및 109 TCID50 일 것이다.
본 발명에 따른 백신을 일반적으로 감염되기 쉬운 동물, 바람직하게는 돼지에, 1회이상 투여한다. 라이브(live) 또는 죽어있는(killed) 백신을 2주 간격으로 1 또는 2회 투여할 수 있다. 약독화된, 라이브 백신의 경우, 1회 투여가 바람직하다. 약독화된 라이브 균주의 바람직한 투여 경로는 경구 또는 비강내 투여이나, 근육 또는 피하주사 또한 사용될 수 있다. 근육 및 피하 주사 경로는 죽어있는 백신의 경우에 가장 바람직하다.
또한, PPE의 효과적인 진단은 원인성 박테리아를 배양하는데 필요한 시간에 의해 지연되어 왔다. 본 발명의 결과로서, PPE에 감염되기 쉬운 돼지 및 다른 동물에서 얻은 생물학적 검체중에 엘. 인트라셀룰라리스 존재에 대한 신속하고 정확한 분석을 증진시키는 진단 기술의 개발은 지금은 가능하다.
본 발명의 방법에 따라서 성장한 엘. 인트라셀룰라리스 박테리아, 또는 이 박테리아로부터 유래된 성분은 ELISA 또는 다른 면역분석, 예를 들면 형광성 면역항체 시험(immuno-fluorescent antibody test; "IFA")에서 박테리아로 감염되었다고 의심되는 동물의 혈청 및 다른 체액에서 엘. 인트라셀룰라리스에 대한 항체를 검출하기 위한 항원으로서 사용될 수 있다. 본 발명의 바람직한 면역분석은 하기 실시예에 기술된 바처럼 IFA이다. 다르게는, 본 발명에 따라 성장된 박테리아를 웨스턴 블럿(Western Blot)분석에서 사용할 수 있다.
본 발명의 이 구체예에 따른 바람직한 ELISA 방법은 하기와 같다:
1. 희석된 항원 0.1m/웰을 코팅(coating) 완충액에 가한다. 4 ℃에서 18시간 동안 인큐베이션한다.
2. PBS로 3회 세척한다.
3. 플레이트 각 웰(well)에 정지(blocking)완충액 0.25㎖을 가한다. 37 ℃에서 1 내지 2시간 인큐베이션한다.
4. 세척 완충액으로 3회 세척한다.
5. 정지 완충액으로 혈청을 희석하고, 이를 플레이트의 제 1번 웰에 0.1㎖ 가한다. 연속적인 1:2희석액을 플레이트의 웰에 가한다. 37℃ 에서 1시간동안 인큐베이션한다.
6. 세척 완충액으로 3-5회 세척한다.
7. 정지완충액으로 컨쥬게이트(conjugate) 을 희석하여 플레이트의 웰에 0.1㎖ 가한 후 37 ℃에서 1 시간 동안 인큐베이션한다.
8. 세척완충액으로 3-5회 세척한다.
9. 기질을 가한다.
10. 분광 광도계(spectrophotometer)로 흡광도를 측정한다.
11. 항원을 가하지 않은 웰을 블랭크(blank)로 사용한다.
12. 또한, 양성 및 음성의 대조군 돼지 혈청을 각 시험에서 사용한다.
바람직한 웨스턴 블럿 방법은 하기와 같다:
1. 12% SDS-PAGE상에 항원을 쏟아붓고 니트로셀루로즈 막에 옮긴다.
2. 막을 정지 완충액에 2시간동안 넣어둔다.
3. 정지 완충액을 제거하고 1분동안 PBS로 린스(rinse)한다.
4. 정지 완충액으로 혈청을 희석하고 막에 가한다. 실온에서 2시간동안, 인큐베이션한다.
5. 세척완충액으로 3회 세척한다(각 세척시 5분동안).
6. 정지완충액으로 컨쥬게이트를 희석하고 막에 가한다. 실온에서 1 시간동안 인큐베이션한다.
7. 세척완충액으로 3 회 세척한다.
8. 10분 또는 강한 밴딩(banding)이 생길 때까지 기질을 가한다.
9. PBS로 린스한다.
10. 공기 건조시키고 암실에 보관한다.
또한 본 발명을 하기 실시예에 기술하였으며, 이는 설명 목적으로 제공되는 것이고 제한하려는 것은 아니다.
실시예 1
돼지의 증식성 장질환을 앓는 미국산 돼지의 내장으로부터의 엘. 인트라셀룰라리스의 분리
물질 및 방법:
접종 검체의 선별:
아이오와에 있는 농장의 가축무리중 페니실린 치료에도 불구하고 계속된 혈변을 갖는 것으로 관찰된 5개월된 피니셔(finisher) 돼지 300마리 중 15마리에서 검체 N24912를 얻었다. 돼지를 검시하는 동안, 장(회장)은 비후화된 점막을 가졌다. 은 염색(silver stains)을 사용한 조직병리학적 조사에서 굽은 형의 세포내 박테리아의 존재 및 PPE의 진단을 입증하는 소낭선 장세포 과증식을 나타내었다. 미네소타에 있는 한 농장의 1.5년생의 SPF 암퇘지의 2배 새끼로부터 검체 N72994를 얻었다. 그 무리의 크기는 70-80 암퇘지 였으며 항생제 치료 여부는 공지되지 않았다. 검시에서, 회장의 점막 비후되었고 약간의 출현이 있었다. 점막의 지미네즈(Giminez) 염색에서는 많은 굽은형의 박테리아를 볼 수 있었다. 검체 N101494를 고랑이 600개인 인디아나 농장산 12주된 돼지로부터 얻고 암퇘지를 죽였다. 출혈성 설사시에 틸란(Tylan)을 주입하여 치료하였으나, 치료후 곧 죽었다.
돼지 유래된 박테리아 접종물의 제조:
내장 검체를 -70 ℃에서 보관하였다. 내장을 개복하고 인산 완충처리된 염수(PBS)로 세척하였다. 점막 1g 검체를 소디움 포타슘 글루타메이트(SPG)로 긁어내고, SPG내에서 4.0㎖의 1% 트립신(JRH Biosciences, Lenexa, KS)로 30초동안 균질화하였다. 현탁액을 37 ℃에서 35분동안 인큐베이션하였다. 10 ㎖ SPG /10%소태아 혈청(FCS)(JRH Biosciences, Lenexa, KS)을 가하고 검체를 조직 분쇄기로 1분동안 분쇄하였다. 10 ㎖ SPG /10% (FCS)를 가하고 여과지(Whatman 113V;Whatman Labsales, Hillsboro, OR)를 통과시켜 1회 여과하고 연속하여 5.0, 1.0, 및 0.65 미크론(micron) 막 여과지를 통과시켰다. 여액을 1.0㎖ 분취량으로 분리하고 -70 ℃ 에서 냉동시켰다. 점막을 지미네즈 염색을 하기 위하여 슬라이드 위에 도포(smear)하였다. 여과물의 분리된 도포 표본을 엘. 인트라셀룰라리스에 대한 특정 모노클로날 항체를 사용하여 IFA에 의해 염색하였다(S. McOrist et al., Vet. Rec. 121: 421-422(1987); 본 명세서에서 전체적으로 참조문헌으로 인용됨))
세포배양:
IEC-18 세포(래트의 장 표피세포, ATCC CRL 1589)를 L-글루타민 및 10% FCS를 첨가한 DMEM (JRH Biosciences, Lenexa, KS)에서 성장시키고, 매주 트립신을 처리함으로써 정해진 방법으로 계대하였다. 세포 단층을 37 ℃에서 5% CO2를 포함한 공기중에서 성장시켰다.
세포배양액의 감염:
IEC-18 세포를 챔버슬라이드(Numc, Inc., Naperville, IL)에서 25㎠ 플라스크중에 1.25×105세포로 비교할 만한 속도로 시딩(seed)하고, 24시간동안 인큐베이션한 다음 배지를 제거하였다. 냉동된 돼지 유래된 박테리아 분리물을 신속하게 해동시킨 다음, 15㎖ 배지당 1.0㎖ 균등물의 비율로 반코마이신(Vancomycin)( 100㎍/㎖) 및 암포테리신 B(Amphotericin B)(2.0㎍/㎖)를 포함하는 DMEM/7% FCS에 희석시키고 단층에 가하였다. 단층 및 박테리아 현탁액을 2000g에서 30분동안 원심분리하였으며 혐기성 용기로 옮겼다. 용기를 비우고 가스를 수소 및 이산화탄소로 치환하여 8.0% O2, 10% CO2, 및 82% H2의 혼합가스를 수득하였다. 배양액을 37 ℃에서 3시간동안 인큐베이션한 다음, L-글루타민, 반코마이신(100㎍/㎖), 네오마이신(50㎍/ℓ) 및 암포테리신 B(2.0㎍/㎖)을 포함하는 DMEM/7% FCS를 가하였다. 배양물을 혐기 용기로 치환하고 2주마다 배지를 교환하면서 6일 동안 인큐베이션하였다.
엘. 인트라셀룰라리스의 배양:
(G. Lawson et al., J. clin. Microbiol., 31:1136-1142(1993)(본 명세서에서 전체적으로 참조문헌으로 인용됨)에서 앞서 기술된 바처럼 염화 칼륨을 사용하여 세포를 용균시킴으로써 엘. 인트라셀룰라리스 박테리아를 배출(pass)한 후, 신선한 단층의 IEC-18에 가하였다. 배지를 단층에 붓고, 0.1% KCl을 가하고 세포를 37 ℃ 에서 10분동안 인큐베이션하였다. KCl을 제거한 다음, SPG/10%를 가하고 단층을 세포 스크레퍼로 기계적으로 분리시켰다. 세포를 21게이지 바늘을 가진 주사기로 3회 통과시켜 용균시켰다. 세포핵을 100×g에서 5분동안 원심분리하여 제거시키고 상등액 유체중의 박테리아 현탁액을 신선한 1d 단층의 IEC-18세포에 가하였다.
세포 배양액의 감염에 대한 모니터링:
챔버슬라이드 상에 냉각 아세톤/메탄올을 5분간 처리하여 세포를 고정시킴으로써 감염을 모니터링 하였다. 면역형광(immunofluorescence) 및 이뮤노퍼옥시다아제(immunoperoxidase) 방법으로 염색을 수행하였다. 두 방법 모두는 1차 항체로서 마우스의 모노클로날 항체(S. McOrist et al., Ver. Rec. 121:421-422(1987)에 기술)를 사용하였고, 항-마우스 이뮤노글로블린 G-플루오로크롬 컨쥬게이트(anti-mouse immunoglobulin G-fluorochrome conjugate; 플루오레스세인 이소티오시아네이트; Organon Teknika Corporation, Durham, NC) 또는 퍼옥시다아제 컨쥬게이트(염소의 항-마우스 이뮤노글로블린 G; Kirkegaard and perry Laboratones, Inc., Gaithersburg, MD)를 사용하였다. 각 슬라이드상에서 세포내에 있는 특정 염색된 박테리아의 수를 세어서 박테리아 정량화 하였다.
중합효소반응:
(Jones et al., J. Clin. Miorobiol., 31:2611-2615(1993) 및 McOrist et al., Vet. Microbiol 1-8(1994)(각각 전체적으로 본 명세서에서 참조 문헌으로 인용됨)에 의해 기술된 바처럼 주형 DNA로서 검체 접종물 및 계대된 박테리아를 검체 제조방법, 프라이머, 및 사이클 변수를 사용하여 PCR로 혼입하였다. 제 1 사이클에 대한 사이클 변수는 93 ℃에서 5분, 55 ℃에서 45초, 및 72 ℃에서 45초이다. 사이클을 상기 언급한 온도에서 온도당 45초동안 33회 수행하고, 93 ℃에서 45초, 55 ℃에서 45초, 및 72 ℃에서 2분동안 사이클을 1회 수행하였다. 양성의 접종물만을 IEC-18 세포에 접종하는데 사용하였다. 또한, 계대 물질을 모니터링하기 위해 PCR을 수해아여 감염을 확인하였다. PCR에 의해 생성된 DNA를 염기서열 분석을 위해 아이오와 주립대학의 Nucleic Acid Facility에 보냈다. 염기서열 분석 결과를 Gary F. Jones의 박사학위논문, 미네소타 대학, 미네아폴리스, MN(1993년 6월)에서 발표한 염기서열과 비교하였다.
결과:
접종 검체의 선별:
돼지 번호 N24912 및 N72994는 출혈성 장 내용물 및 비후된 점막을 갖는 심한 PPE를 앓고 있었다. N101494는 심한 PPE 장 내강(lumen)에 큰 응고된 혈덩어리가 생기는 심한 출혈을 가지고 있었다. 점막 도포의 지미네즈 염색이 다수의 굽은형 또는 S-형 박테리아를 나타내었다. IFA염색은 돼지 유래된 박테리아 접종물중에서 다수의 밝은 형광성 박테리아를 밝혀 내었다.
세포배양물의 감염에 대한 모니터링:
접종된 단층을 광학현미경으로 세포의 성장 사이클내내 모니터링하였고형태적 변화는 거의 관찰되지 않았다. 감소된 산소 압력(8% O2)하에서 성장된 감염되지 않은 단층은 유사한 형태를 가지고 있었다.
면역형광 및 이뮤노퍼옥시다아제로 염색된 감염된 배양액은 세포내에 외관상 굽은형 또는 S-형의 특이적으로 염색된 다수의 박테리아를 나타내었다. 단층은 합류된 감염을 가지지 않았다. 감염된 세포는 종종 1-10 세포의 감염된 병소와 밀접하게 관련되었다. 또한, 심하게 감염된 세포(즉, 30개 이상의 박테리아로 감염됨)는 30개 이하의 박테리아로 감염된 세포와 관련됨을 알 수 있었다. 박테리아 수는 6일째 또는 약 6일에 절정이었다. 감염은 특정한 성장 조건에 따라 달라졌다. 박테리아는 본 명세서에서 기술된 세포 용균 과정에 의해 연속적으로 계대시켰다. 새로이 접종된 세포의 원심분리는 필요하지 않으나 감염되는 세포의 수를 증가시켰다. 또한, 항생제가 포함되지 않은 배지에 노출시켜 감염시키고, 3시간째에 항생제를 함유한 배지를 재공급함으로써 원심분리는 오염을 감소시켰다. 배지에서 10% 내지 7%로의 FCS의 감소는 단층이 합류되기 전에 박테리아가 더 많이 증식되도록 하면서 IEC-18 세포의 성장을 느리게 하는데 필요하다.
중합효소반응:
염색체 DNA의 PCR에 의해 모든 분리물로부터 319bp 단편(프라이머 함유)이 생성되었다. 적당한 크기의 단편을 PCR을 사용한 McOrist et al.(1994)에 의해 생성된 공지된 양성 검체와 육안으로 비교하였다. N24912, N72994, 및 N101494의 PCR 생성물의 서열 분석으로 Jones(1993)에 의해 측정된 p78 서열과 상당히 상동성(97-99%)임을 확인하였다.
실시예 2
HEp-2 세포의 현탁 배양액에서 엘. 인트라셀룰라리스의 성장
접종물을 위한 장 균질물의 제조:
실시예 1의 검체로부터 회장의 점막 6.0 내지 8.0 cm을 긁어서 장 균질물을 제조하였다. 트립신(1%)를 긁어낸 점막에 가한 다음, 검체를 일시적으로 균질화한후, 37 ℃에서 35분동안 인큐베이션하였다. 이어서, 10㎖ SPG/10% FBS를 가하고 검체를 조직 분쇄기에서 분쇄하였다. 또다른 10㎖ SPG/10% FBS 를 가하였다. 균질물을 와트만 V113 여과지를 통해 통과시키고, 이어서 5.0, 1.0, 및 0.65 ㎛ 여과지를 통해 순차적으로 통과시켰다. 검체를 1㎖ 분취량으로로 나누어 -70 ℃ 에서 냉동시켰다.
세포 배양액의 감염:
방법A:
조직세포를 100㎖ 스핀너 플라스크 내에서 50㎖ DMEM/10% FBS중에 1×107세포로 시딩하였다. 배양액을 24시간동안 인큐베이션한 다음, 반코마이신 및 펀지존(fungizone)을 가하였다. 냉동된 장 균질물 1병을 신속하게 해동한 후, 반코마이신(100㎍/㎖) 및 암포테리신 B(2.0㎍/㎖)을 포함하는 3.0㎖ DMEM/5% FBS에 희석하였다. 검체를 0.65 ㎛ 여과지를 통해 통과시킨 다음, 플라스크에 가하였다. 배양액을 가스챔버에 넣고, 기체를 배출시킨 다음, 8.0% O2 , 8.8% CO2 , 및 83.2% H2 혼합가스를 형성하기 위해 수소 및 이산화탄소 가스를 재주입하였다. 배양액을 37 ℃에서 3시간동안 인큐베이션한 다음, 네오마이신 및 겐타마이신을 가하였다. 24시간째에 배양액에 L-글루타민, 반코마이신(100㎍/㎖), 네오마이신(50㎍/ℓ), 젠타마이신(50㎍/ℓ) 및 암포테리신 B(2.0㎍/㎖)를 포함하는 DMEM/5% FBS를 재공급하였다.
방법 B:
두 개의 25㎠의 통상의 플라스크에 DMEM/10% FBS중의 1.25×105 HEp-2 세포를 시딩하고 18-24시간 동안 성장시켰다. 세포는 접종시 30% 합류상태에 있었다. 접종물을 DMEM/5%FBS에 희석하였다. 또한, 접종물을 장 균질물에서 얻은 경우, 배양액은 또한 반코마이신(100㎍/㎖) 및 암포테리신 B(2.0㎍/㎖)를 함유하였다. 배양액을 가스챔버에 넣고, 기체를 배출한 다음, 8.0% O2, 8.8% CO2, 및 83.2% H2의 혼합가스를 만들기 위해 수소 및 이산화탄소를 재주입하였다. 배양액을 37 ℃에서 3 시간동안 인큐베이션한 다음, 네오마이신 및 겐타마이신을 가하였다. 24시간째에 배양액에 L-글루타민, 반코아미신(100㎍/㎖), 네오마이신(50㎍/ℓ), 겐타마이신(50㎍/ℓ), 및 암포테리신 B(2.0㎍/㎖)을 포함하는 DMEM/5% FBS를 재공급하였다. 접종물이 순수한 배양액일 경우, 항생제는 필요하지 않았다. 배양액을 6일 또는 합류시까지 인큐베이션하였다. 플라스크에서 세포를 긁어낸 후, 50㎖ DMEM/5% FBS를 함유한 100㎖ 스핀너 플라스크에 가하였다.
1주 간격으로, 배양액의 절반을 회수하고 신선한 배양액을 가하거나 더 큰 스핀너 플라스크로 옮기고 추가의 배지를 가함으로써 배양액을 1:2로 희석하였다.
배양액의 계대:
DMEM/5% FBS 중의 새로운 HEp-2 세포를 1×107 로 접종함으로써 배양액을 신선한 HEp-2 세포로 계대시켰다. 새 배양액을 8.0% O2, 8.8% CO2 , 및 83.2% H2 에서 밤새도록 인큐베이션하였다. 이어서 새 배양액을 감염된 배양액과 함께 접종한 다음, 앞에서 기술된 바와 같이 감소된 O2 농도에서 인큐베이션하였다. 접종물의 양은 원 배양액의 감염 정도에 따라 달라졌다.
배양액의 회수 및 보관:
배양액을 3000×g에서 20분동안 원심분리하면서 원하는 양의 배양액을 수집함으로써 회수하였다. 펠릿을 수크로오스-포스페이트-글루타메이트(SPG) 용액에서 재현탁시키고 25게이지 바늘을 4회 통과시켰다. 배양액을 나누고 -70 ℃에서 냉동시켰다. 추가의 정제를 위해, 검체를 145×g에서 5분간 원심분리하여 세포핵 및 부산물을 제거하였다. 이어서, 상등액을 3000×g에서 20분동안 원심분리하였다. 이어서, 펠릿을 희석액내에서 재현탁시켰다.
조직 배양중에 생존 가능한 엘. 인트라셀룰라리스의 측정:
조직 배양 감염 투여량 50%(TCID50)를 측정함으로써 생존가능한 엘. 인트라셀룰라리스를 정량화하였다. 이는 시험된 배양액 2.0㎖를 제거하고 세포를 25게이지 바늘로 4회 통과시켜 용균시킴으로써 수행되었다. 검체를 순차적으로 반코마이신(100 ㎍/㎖) 및 암포테리신 B(2.0 ㎍/㎖)을 함유한 DMEM/5% FBS에 1:10으로 희석시켰다. 96웰 마이크로타이터(microtiter) 플레이트에 희석액을 0.1㎖/웰으로 가하였다. 마이크로타이터 플레이트에 HEp-2 세포를 1250세포/웰으로 시딩하고 감염시키기 전 18-24시간 동안 성장시켰다. 3웰/희석액 내지 6웰/희석액을 사용하였다. 플레이트를 8.0% O2, 8.8% CO2 및 83.2% H2의 가스농도에서 6일동안 인큐베이션하였다. 세포를 냉각 50% 아세톤 및 50% 메탄올로 2분동안 고정시켰다. PBS중에 1:2000으로 희석된 항-IS 인트라셀룰라리스 모노클로날 항체(McOrist, 1994)를 웰에 0.03㎖/웰으로 가하였다. 플레이트를 37 ℃에서 30분동안 인큐베이션한 다음, PBS로 3회 세척하였다. 1:30으로 희석된 항-마우스 FITC를 0.03㎖/웰으로 가한 후, 37 ℃에서 30분동안 인큐베이션하였다. 이어서 플레이트를 ddH2O로 3회 세척한 다음, 건조시켰다. 검체를 형광 현미경상에서 관찰하여 TCID50/㎖을 측정하였다.
결과:
TCID50 결과는 배양액이 1×106 박테리아/㎖까지 함유하였음을 나타내었다. 이는 45일내에 이루어졌다. 배양액 부피를 동일한 시간내에 3.0 까지 대량화시켰다.
실시예 3
맥코이(McCoys) 세포의 현탁배양액 내에서 엘. 인트라셀룰라리스의성장
접종물을 위한 장 균질물의 제조:
장 균질물을 실시예 2에 기술된 바와 같이 제조하였다. 하기 실시예의 방법에 따라 배양된 엘. 인트라셀룰라리스의 검체를 부다페스트 조약하에 어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC), 12301 파크론 드라이브, 록크빌, 말릴랜드 U.S.A 20852 )(American Type Culture Collection(ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland U.S.A. 20852)에 1995년 5월 19일자로 기탁하여 기탁번호 55672를 부여받았다.
세포배양액의 감염:
두 개의 25㎠의 통상의 플라스크에 DMEM/10% FBS중의 1.25×105 맥코이 세포를 시딩하고 18-24 시간동안 성장시켰다. 접종시에 세포는 30% 합류상태였다. 접종물을 DMEM/5% FBS에 희석하였다. 접종물을 장 균질물루부터 얻은 경우, 이어서 배지는 또한 반코마이신(100㎍/㎖) 및 암포테리신 B(2.0㎍/㎖)을 함유하였다. 배양액을 가스챔버에 넣고, 기체를 배출시킨 다음, 8.0% O2, 10% CO2, 및 82% H2의 혼합가스를 만들기 위하여 수소 및 이산화탄소를 재주입하였다. 배양액을 37 ℃에서 3시간동안 인큐베이션한 다음, 네오마이신 및 겐타마이신을 가하였다. 24시간째에 배양액에 L- 글루타민, 반코마이신(100㎍/㎖), 네오마이신(50㎍/ℓ), 겐타마이신(50㎍/ℓ), 및 암포테이신 B(2.0㎍/㎖)를 포함하는 DMEM/5% FBS를 재공급하였다. 접종물이 순수 배양액일 경우에는 항생제는 필요하지 않다. 배양액을 합류할 때까지 또는 6일동안 인큐베이션하였다. 세포를 플라스크에서 긁어내어 50㎖ DMEM/2% FBS 및 0.05g 컬티스피어(Cultisphere)-G 미세담체를 함유한 100㎖ 스핀너 플라스크에 가하였다. 플라스크를 40-50rpm에서 교반하였다.
2-3일마다 배양액의 절반을 회수하고 신선한 배양액 및 컬티스피어-G 비드(beads)를 가하거나 배양액을 더 큰 스핀너 플라스크로 배양액을 옮기고 배양액 및 컬티스페어-G 비드를 추가함으로써 배양액을 1:2로 희석하였다. 배양액중의 비드의 최종 농도는 약 0.001g 비드/㎖였다.
배양액의 계대:
1×107의 새로운 맥코이 세포를 DMEM/2% FBS 및 0.05g 컬티스피어-G 비드에 시딩하여 배양액을 신선한 맥코이 세포로 계대시켰다. 새로운 배양액을 8.0% O2, 8.8% CO2, 및 83.2% H2에서 밤새도록 인큐베이션하였다. 새로운 배양액에 25㎖의 감염된 배양액으로 접종한 다음, 앞에서 기술된 바와같이 감소된 O2 농도에서 인큐베이션하였다.
배양액의 회수 및 보관:
원하는 양의 배양액을 수집하고 3000×g에서 20분 동안 원심분리함으로써 배양액을 회수하였다. 펠릿을 SPG에서 재현탁시킨 후, 22게이지 바늘을 4회 통과시켰다. 배양물을 나누어 -70 ℃에서 냉동시켰다. 추가의 정제를 위해, 검체를 145×g에서 5분동안 원심분리하여 비드, 세포핵 및 그 부산물을 제거하였다. 다음 상등액을 3000×g에서 20분동안 원심분리시켰다. 다음, 펠릿을 희석액에 재현탁시켰다.
조직 배양에서 생존가능한 엘. 인트라셀룰라리스의 측정:
22게이지 바늘을 사용하여 세포를 용균시키고, 1250 세포/웰으로 맥코이 세포를 마이크로타이터 플레이터에 시딩하여 실시예 2에 기술된 바와 같이 생존가능한 엘. 인트라셀룰라리스의 정량화를 측정하였다.
결과:
TCID50 결과는 배양액에 1×106 박테리아/㎖ 까지 박테리아를 함유함을 나타내었다. 이는 1달 이하에 이루어졌다. 배양 부피를 동일한 시간에 3.0ℓ까지 대량화하였다.
실시예 4
숙주 동물에서 엘. 인트라셀룰라리스 순수 배양액의 감염 투여량 측정
요약:
종래의 6주령된 돼지를 검체 N72994로부터의 엘. 인트라셀룰라리스 순수한 배양액으로 감염시킴으로써 31마리의 돼지 연구가 완성되었다. 돼지를 무작위로 4개의 그룹으로 나누고, 상기 그룹을 우리안에 넣었다. 그룹 1은 7마리의 돼지를 포함하였으며, 감염되지 않은 조직 배양액으로 투여되었거나 아무것도 투여하지 않은 음성 대조군으로 하였다. 그룹 2는 107 박테리아/돼지로 투여된 8마리의 돼지를 포함하였다. 그룹 3은 8마리의 돼지를 포함하였으며, 106 박테리아/돼지가 투여되었다. 그리고, 그룹 4는 105 박테리아/돼지를 받은 8마리의 돼지를 포함하였다.
PCR 시험을 위하여 배설물 스와브(swba)를 0, 7, 14, 및 21, 및 24일째에 수집하였다. 24일째에, 돼지를 검시하고 회장, 공장, 및 결장을 상기언급된 바와 같이 모두 PCR 시험, 조직 병리학, 및 FA 염색을 위하여 수집하였다.
회장 점막의 PCR 시험에서 고 투여군의 100%, 중 투여군의 75%, 및 저 투여군의 50%에서 엘. 인트라셀룰라리스가 존재함이 밝혀졌다. 조직 병리학적 결과는 고 투여군의 88%, 중 투여군의 75%, 및 저 투여군의 88%에서, 고유판(lamina propria) 및 점막하에 단핵 세포가 증가하였음을 나타내었다. 소낭선 과증식은 고 투여군의 50%, 중 투여군의 63%, 및 저 투여군의 50%에서 관찰되었다. FA 염색으로 회장, 공장, 및 결장의 조직 박편에서 고 투여군의 88%, 중 투여군의 63%, 및 저 투여군의 63%에서 엘. 인트라셀룰라리스가 존재함이 밝혀졌다. 대조군 동물에서는 PCR, FA, 및 은 염색에 의해 엘. 인트라셀룰라리스의 존재는 음성으로 나타났다.
결론으로, 감염시키고 PPE의 병변을 유발시키기 위해 순수배양액을 연속적으로 사용하였다. 코크(Koch)의 가정은 감염된 동물에서 엘. 인트라셀룰라리스의 동정 및 분리에 의해 완성되었다.
시험감염을 받은 동물중에서, 100%의 고 투여군 동물이 염색, FA, 및 PCR에 의해 회복 및 동정을 확인하였다.
물질 및 방법:
접종물의 성장:
75㎠ 의 통상의 플라스크에 DMEM/10% FBS중의 3.75×105 HEp-2세포를 시딩하고 5% CO2 , 37 ℃에서 18-24시간동안 성장시켰다(세포는 접종시에 30% 합류상태에 있었다). N72994 한 병을 15㎖ DMEM/5% FBS에 희석하였다. 배양액을 가스챔버에 넣고, 기체를 배출시킨 다음, 8.0% O2, 8.8% CO2, 83.2% H2 의 혼합기체로 만들기 위해 수소 및 이산화탄소를 재주입하였다. 24시간째에 배양액에 DMEM/5% FBS에 재공급하였다.
배양액을 6일동안 인큐베이션한 다음, 플라스크에서 세포를 긁어내고 50㎖ DMEM/5% FBS를 함유한 100㎖ 스핀너 플라스크에 가하였다. 1주 간격으로 배양액의 부피를 2배로 함으로써 플라스크의 부피를 대량화하였다. 배양액을 스핀너 플라스크에서 3주동안 성장시켰다.
배양액의 회수:
3000×g에서 20분동안 원심분리함으로써 배양액을 회수하였다. 펠릿을 10% FBS를 포함하는 수크로즈-포스페이트-글루타메이트 용액(SPG)중에 재현탁시킨 후, 25 게이지 바늘로 4회 통과시켰다. 접종물을 SPG/10% FBS중에 최종 부피로 희석시켜 1:10의 희석액을 만들었다.
대조군을 위한 접종물은 감염된 배양액과 같이 동일한 농도의 라이브 세포로 희석된 비 감염된 HEp-2 세포로 구성되었다. 세포를 감염시킨 배양액과 동일하게 회수하였다. 대조군 돼지는 고투여 그룹처럼 유사한 투여량의 세포를받았다.
엘. 인트라셀룰라리스의 정량화:
조직 배양 감염 투여량 50%(TCID50)를 측정함으로써 생존 가능한 엘. 인트라셀룰라리스를 정량화하였다. 이는 시험된 2㎖의 배양액을 제거하고 22게이지 바늘로 4회 통과시켜 세포를 용균시킴으로써 수행되었다. 검체를 순차적으로 반코마이신(100㎍/㎖) 및 암포테리신 B(2.0㎍/㎖)를 함유한 DMEM/5% FBS중에 1:10으로 희석시켰다. 희석액을 96웰 마이크로타이터 플레이트에 0.1㎖/웰으로 가하였다. 마이크로타이터 플레이트에 2500세포/웰로 HEp-2세포를 시딩하고 감염 전 18-24시간 동안 성장시켰다. 12웰/희석액을 사용하였다. 플레이트를 8.0% O2, 8.8% CO2, 및 83.2% N2 의 가스농도에서 6일동안 인큐베이션하였다. 냉각 50% 아세톤 및 50% 메탄올로 2분동안 세포를 고정시켰다. PBS중에 1:2000으로 희석된 항-엘. 인트라셀룰라리스 모노클로날 항체(McOrist, 1987) 0.03㎖/웰을 웰에 가하였다. 플레이트를 37 ℃에서 30분동안 인큐베이션한 다음, PBS로 3회 세척하였다. 1:30으로 희석된 항-마우스 FITC를 0.03㎖/웰으로 가하였으며, 37 ℃에서 30분동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 ddH20로 3회 세척한 후 건조시켰다. 검체를 형광 현미경상에서 관찰하고 TCID50 /㎖을 측정하였다.
동물:
PICx Lieske 암컷 및 커다란 흰 수퇘지로부터 암수가 혼합된 생후 6주령된 31마리의 돼지를 Kent Schwartz 박사에 의해 제공받았다. 돼지는 0일째 무작위로 중량에 의해 4개의 우리로 나뉘어졌다.
시설:
각각 적어도 3피트에 의해 분리된 작은 동물사육실내의 4개의 축사를 돼지를 사육하는데 사용하였다. 우리는 철사마루 및 견고한 우리 격리기를 가지고 있었다. 열은 열램프(heatlamp)에 의한 띠모양의 공급용 열을 갖는 노(furnace)에 의해 제공되었다. 연구하는 동안 온도를 78 내지 85 F 사이에서 유지하였다.
먹이 및 물:
항생제 첨가 없이 19%단백질, 분쇄한 옥수수-콩 식품을 스테인레스 스틸 사료 공급기를 통해 무제한 공급하였다. 물을 고무꼭지 관수로를 통해 무제한 공급하였다.
돼지의 감염:
0일째, 돼지의 중량을 달고 혈액 검체를 안와후(방)동굴(retroorbital sinus)에 놓인 모세 튜브에 의해 수집하였다. 혈청을 회수하고 -20 ℃에서 냉동보관하였다. 또한, 배설물 스와브를 PCR을 위해 수집하였다. 돼지에게 위장 튜브를 통하여 위내부에 10㎖의 접종물을 투여하였다.
처리 돼지의 일련번호
대조군-감염되지 않은 세포 5
대조군-처리안함 2
고 투여군 8
중 투여군 8
저 투여군 8
0, 10, 17 및 24일째에 돼지의 중량을 재었으며, 출혈시켰다.
중합효소반응:
존(1993)에 의해 기술된 바와 같이 프라이머 및 사이클 변수를 사용하여 PCR에 의해 돼지의 감염을 모니터링되었다. 장의 점막 및 0., 7, 14, 21, 및 24일째에 수집한 배설물 검체를 PCR에 의해 확인하였다.
조직 병리학:
회장, 공장, 및 결장의 박편을 포르말린으로 고정시켰으며, 정해진 순서에 따라 가공하고 일레마톡실린(Ilematoxylin) 및 에오신(Eosin) 및 은(silver) 주입으로 염색하고 평가하였다. 또한, 박편을 엘. 인트라셀룰라리스에 특이적인 모노클로날 항체를 사용하여 염색하였다.
결과:
임상적 징후(sign):
설사(loose stool)로 구성된 임상적 징후가 처음 3일째에 고투여 그룹에서 관찰되었다. 이 징후는 14일째에 절정이었으며 그후 회복되기 시작했다.
평균 일일 중량 증가:
평균 일일 중량 증가는 대조군그룹과 비교하여 고 및 중 투여 그룹은 중량 증가가 감소하였음을 나타낸다고 계산되었다. 대조군 그룹과 비교시 중량증가에서 투여 적정 효과가 있었다.
PCR:
배설물의 우리는 14일째까지 관찰되지 않았다. 21일째에 고 투여군 돼지의 37.5%는 배설물에서 PCR 양성을 나타내었다. 검시 후, PCR에 의해 회장의 점막은 고 투여에서 100% , 중 투여군에서 75%, 저 투여군에서 50% 및 대조군에서 0%의 양성이 관찰되었다.
육안적 병변:
육안적인 병변은 고 투여 그룹의 2마리의 돼지(#50 및 #202)에서 발견되었다. #202의 검시 결과, 돼지의 회장이 약 3ft 비후되었다.
조직 병리학:
FA:
회장, 공장 및 결장 박편의 FA염색은 고 투여군의 87.5%, 중 및 저 투여군의 62.5% 및 대조군의 0%에 엘. 인트라셀룰라리스가 존재함을 밝혀내었다.
현미경적 병변:
병변은 고 투여군의 100%, 중 투여군의 75%, 저 투여군의 87.5% 및 대조군의 14%에서 관찰되었다. 이것은 파이어판(Peyer's Patchers)의 과증식과 종종 관련되는 고유판 및 점막하에 증가된 단핵 세포의 관찰에 의해 측정되었다. 또한, 소낭선 과증식이 관찰되었다.
은 염색(siver stain):
또한 세포내의 굽은형 박테리아의 존재를 확인하기 위하여 박편을 은 염색하였다. 이 결과에서 , 박테리아는 고 투여군의 87.5%, 중 투여군의 62.5%, 저투여군의 87.5% 및 대조군의 0%에 존재하였다.
논의:
돼지를 엘. 인트라셀룰라리스의 순수배양액으로 성공적으로 감염시켰다. 107 박테리아의 투여로, 돼지의 100%는 PCR 및 현미경적 병변에 의해 감염을 나타내었다. 조직 박편에서의 병변의 정도 및 박테리아의 양은 비교적 낮았다. 이 연구는 돼지에서 엘. 인트라셀룰라리스의 존재 및 현미경적 병변 때문에 엘. 인트라셀룰라리스에 대한 만족스러운 시험감염 모델이다. 병변은 최초의 투여 후 7일째에 두번째 투여로 개선될 수 있었다.
실시예 5
햄스터 백신 효능 실험
목적:
햄스터에서 엘. 인트라셀룰라리스의 무발병성의 라이브 백신의 안정성 및 유효성 측정하기 위하여 실험 동물 모델을 평가한다.
요약:
엘. 인트라셀룰라리스의 고계대(high passage) 균주의 순수 배양액으로 3주령된 햄스터를 백신화하고 백신 후 22일째에 저계대 독성 물질의 순수배양액으로 시험감염을 시킴으로써 40마리의 햄스터 연구를 완성하였다. 햄스터는 3개의 그룹으로 나누어졌다. 그룹A를 0일째에 엘. 인트라셀룰라리스 균주 N72994 의 1 투여량으로 백신화하였다. 그룹 B를 대조군으로 하고 백신 배양액을 투여하지 않았다. 백신화 후 22일 및 25일째에 엘. 인트라셀룰라리스 균주 N343의 순수 배양액의 2 투여량으로 두 그룹을 시험감염시켰다. 그룹 C에 면역성 균주 N101494를 투여하고 균주 N343와 상대적인 독성을 비교하였다. 그룹 A 및 B는 각각 15마리의 햄스터를 포함하였으며 그룹 C는 10마리의 햄스터를 포함하였다. 조직 배양 감염 투여량 50%(TCID50) 결과는 햄스터가 105 TCID 50/투여량으로 백신화되었음을 시사하는 결과를 나타내었다. N343 시험감염은 105.5 TCID50 /투여량를 함유하였다. 그룹 C에 대한 시험감염 투여량은 102.75 TCID50/투여량이었다. 배설물 스와브를 중합효소반응 시험을 위하여 0, 7, 14, 21, 29, 36, 및 43일째에 수집되었다. 백신화시킨 햄스터에서 박테리아의 전이 증식의 항구성을 측정하기 위하여, 21일째에 점막의 PCR 시험 및 FA, 헤마톡살린(Hematoxalin) 및 에오신 염색, 및 회장 박편의 은 염색을 위하여 각각 그룹 A 및 그룹 B로부터 5마리의 동물을 검시하였다. 남아있는 동물은 유사한 시험으로 검사후 21일째에 검시되었다.
PCR결과는 백신화 후 21일째 100%의 그룹 A 햄스터의 장 점막에서 엘. 인트라셀룰라리스가 존재함을 나타내었다. 그룹 B 햄스터는 백신화 후 21일째 모두 음성이었다. 시험감염 후 21일째 햄스터의 50%는 그룹 A에서 PCR 양성이었으며 100%는 그룹 B에서 양성이었다. 시험감염 후 21일째 박편의 조직병리학은 그룹 A의 동물 50% 에서 경미한 병변 내지 심한 병변을 , 그룹 B 는 경미한 병변을 나타내었다. 백신화 후 21일째 어느 동물에서도 병변을 나타내지 않았다. 시험감염 후 21일째 그룹 C 동물은 병변을 가지고 있지 않았다. FA 및 은 염색은 어떠한 박편에서도 엘. 인트라셀룰라리스의 존재를 나타낼 수 없었다.
결론적으로, PCR에 의해 증명되는 바와 같이 고계대의 엘. 인트라셀룰라리스로 백신화된 햄스터에서는 감염이 50% 감소됨이 관찰되었다. FA 및 은 염색된 박편에서 관찰된 미생물의 부족으로 장은 적은 수의 세포내 미생물에 의해 전이 증식되었다. 그룹 C 의 햄스터는 연구 전반에 걸쳐 박테리아의 낮은 투여량때문에 감염을 나타내는 것이 불가능했다.
물질 및 방법:
햄스터 설명:
하르란 스프라구에 도우레이(Harlan Sprague Dawley)로부터 3주령된 암컷 햄스터 40마리를 사용하였다.
접종물의 성장:
백신 배양:
HEp-2세포에서 29주 동안 성장한 엘. 인트라셀룰라리스의 연속적인 배양액을 사용하였다. 배양액을 새 HEp-2 세포로 2-3주마다 계대시키는 것을 제외하고는 시험감염 배양약 부분에서 기술한 바와 유사한 방법으로 배양액을 성장시켰다.
시험감염 배양액:
75㎠의 종래의 조직 배양 플라스크에 10% 소의 태아 혈청(FBS)를 포함하는 둘벡코스 모디파이드 이글스 배지(Dulbecco`s Modified Eagles`sedium; DMEM)중의 3.75× 105 맥코이 세포를 시딩하고 5% CO2로 37 ℃에서 18-24시간동안 성장시켰다. 배지를 세포로부터 제거하였으며 14㎖ DMEM/2% FBS 중에 희석된 N343 MSC X 한 병을 플라스크에 가하였다. 배양액을 가스챔버에 넣고, 가스를 빼고, 8.0% O2, 8.8% CO2, 및 83.2% H2로 혼합가스를 주기 위해 수소 및 이산화탄소를 재주입하였다. 배양액을 6일동안 성장 시킨 다음, 90㎖ DMEM/2% FBS 및 0.01g의 컬티스피어-G-비드를 포함하는 100㎖의 스핀너 플라스크에서 세포를 긁어내었다. 상기 기술된 가스 농도에서 배양액을 성장시켰다. 플라스크 부피를 주 간격으로 배양액 부피를 두배로 하여 대량화하였다. 배양액을 스핀너 플라스크에서 25일동안 성장시켜 최종부피가 250㎖로하였다.
균주 N343과 같은 방식으로 균주 N101494를 성장시켰다.
배양액의 회수:
백신배양액:
배양액을 3000×g에서 20분동안 원심분리하여 회수하였다. 펠릿을 10% FBS를 포함하는 수크로즈-포스페이트-글루타메이트 용액(SPG)에서 재현탁시킨 후, 25게이지 바늘을 4회 통과시켰다. 접종물을 SPG/10% FBS중에서 최종부피(15㎖)로 희석하였다.
시험감염 배양액:
배양액은 3000×g에서 20분동안 원심분리하여 회수하였다. 펠릿을 10% FBS를 포함하는 수크로즈-포스페이트-글루타메이트 용액(SPG)에 재현탁시킨 후, 25게이지 바늘에 4회 통과시켰다. 접종물을 SPG/10% FBS중에 최종부피로희석하였다(균주 343에 대해서는 20㎖ 및 균주 N101494에 대해서는 10㎖)
햄스터의 투여량:
백신:
0일째에, 그룹 A 의 모든 햄스터를 제조된 백신 1㎖로 경구적으로 백신화하였다.
시험감염:
백신화후 22일째, 그룹 A중 햄스터 10마리 및 그룹 B중 햄스터 10마리에 0.5㎖의 시험 감염 균주 N 343를 경구적으로 투여하였다. 그룹 C를 0.5㎖의 시험 감염 균주 N101494으로 시험감염하였다.
IS 인트라셀룰라리스의 정량화:
조직 배양 감염 투여량 50%(TCID50)를 측정하여 생존가능한 IS 인트라셀룰라리스의 정량화하였다. 이는 시험된 배양액 2㎖를 제거하고 22게이지 바늘에 4회 통과시켜 세포를 용균시킴으로써 수행되었다. 검체를 순차적으로 반코마이신(100㎍/㎖) 및 암포테리신 B(2.0㎍/㎖)를 함유한 DMEM/5% FBS중에 1:10으로 희석시켰다. 희석액을 1250 세포/웰으로 멕코이 세포가 시딩되고 감염 전 5% CO2으로 37 ℃에서 18-24 시간동안 인큐베이션된 96웰 마이크로타이터 플레이트에 희석액을 0.1㎖/웰으로 분배하였다. 12웰/희석액이 사용되었다. 플레이트는 8.0% O2, 8.8% CO2 및 83.2% N2의 가스 농도에서 6일동안 인큐베이션하였다. 6일째에 세포를 냉각 50% 아세톤 및 50% 메탄올로 2분 동안 고정시켰다. PBS중에 1:2000으로 희석된 0.03㎖/웰의 항-IS 인트라셀룰라리스 모노클로날 항체를 각 웰에 가하였다. 플레이트를 37 ℃에서 30분동안 인큐베이션한 다음, PBS로 3회 세척하였다. 1:30으로 희석된 항-마우스 FITC를 0.03㎖/웰으로 가하고 37 ℃에서 30분동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 ddH2O로 3회 세척한 다음, 건조시켰다. 검체를 형광 현미경상에서 관찰하고 TCID50/㎖를 측정하였다.
햄스터의 감염에 대한 모니터링:
햄스터의 감염을 가리 존(Gary Johnes)에 의해 기술된 바처럼 프라이머 및 사이클 변수를 이용하여 PCR에 의해 모니터하였다. 백신화후 0, 7, 14, 21, 29, 36 및 43일째 배설물 검체를 수집하였다. 햄스터를 죽인 후, 장 점막을 또한 PCR에 의해 조사하였다.
조직병리학:
회장 및 결장의 박편을 포르말린으로 고정시킨 다음, 정해진 방법으로 가공하고 헴톡실린 및 에오신 및 은 주입으로 염색하고 평가하였다. 또한, 박편을 엘. 인트라셀룰라리스에 특이성을 갖는 모노클로날 항체로 염색하였다.
평균 일일 중량의 증가:
평균 일일 중량 증가를 측정하기 위하여 백신화 후 21, 28, 35 및 42일째 햄스터의 중량을 수집하였다.
결과: 하기표를 참조하라
TCID 50 :
TCID50 결과는 백신 그룹(그룹 A)은 104.86 TCID50/햄스터를 받았음을 나타낸다. 그룹 A 및 그룹 B 의 햄스터는 균주 N343으로 시험감염되었고 105.5 TCID50을 투여받았다. 균주 N101494로 시험감염된 그룹 C 햄스터는 102.75 TCID50/햄스터를 투여받았다.
PCR:
백신화후 21일째 검시된 햄스터 100%에서 엘. 인트라셀룰라리스의 존재를 나타내었다. 백신화 후 43일째 시험에서는 100%의 대조군 햄스터 및 50%의 백신화된 햄스터가 엘. 인트라셀룰라리스로 감염되었음을 나타내었다. N101494로 시험감염된 햄스터중 어느 것도 양성을 나타내지 않았다. 연구 전반에 걸쳐 어느 햄스터에서도 배설물 우리는 검출되지 않았다.
조직 병리학:
H & E 염색은 백신화후 21일째 검시된 햄스터의 모든 박편에서 조직의 병변은 드러나지 않았다. 백신화 후 43일째 회수된 박편에서, 50%의 백신 그룹은 경미한 내지 심한 림프구성의 장염(lymphocytic enteritis)을 50%의 대조군은 경미한 림프구성의 장염을 가지고 있었다. N101494 시험감염 그룹에서는 병변이 발견되지 않았다.
백신화 후 43일째 어느 햄스터에서도 엘. 인트라셀룰라리스의 존재를 나나태지 않았다.
논의:
PCR에 의해 나타난 것처럼 고계대의 엘. 인트라셀룰라리스으로 백신화된 햄스터에서 감염이 50% 감소되었음이 관찰되었다.
실시예 6
돼지 백신 효능 실험
목적:
이 연구의 목적은 2-3주령된 돼지에서 엘. 인트라셀룰라리스의 무발병성-라이브 분리물 및 사(killed) 분리물의 안정성, 영구적 전이증식 및 효능을 평가하는 것이다. 숙주 동물 연구는 3주령된 돼지를 백신화시킨 다음 엘. 인트라셀룰라리스 균주 N343으로 독성의 시험감염에 노출시켜 백신 사이의 면역상의 차이를 비교하여 수행하였다.
방법:
1995년 12월 11일, 3주령된 총 45마리의 돼지를 H & K 농장으로부터 구입하였다. 이들을 캠브리지, 아이오와 근처에 위치한 연구기관인 베테리나히 레소우르세스 주식회사로(Veterinary Resources, Inc.) 이동시키고, 거기에서 각각의 돼지를 개별적으로 확인하기 위하여 꼬리표를 달았다. 돼지는 본 연구의 시작에 앞서 2일 동안 이 기관에서 적응되도록 하였으며 연구전반에 걸쳐 항생제를 넣지 않은 음식을 주었다.
12월 13일, 모든 돼지의 중량을 재었으며, 혈청을 수집하기 위하여 출혈시키고, 임상적으로 기록하였으며, 직장의 스와브를 수집하였다. 이어서 돼지를 무작위로 5개의 그룹으로 나누고 욕실에 넣었다. 20마리의 돼지를 분리된 방에 넣고, 대조군 및 엄격한 대조군 그룹을 표시하였다. 15마리의 돼지를 ISi-1 백신을 위하여 제 2 방에 넣었다. 제 3방에 ISi-2를 위한 10마리의 돼지를 넣었다.
라이브 백신은 노블 연구실(NOBL Laboratories Research) 및 개발기관(Development facility)에서 제조되었고, 실험 일련번호 ISi-1로서 확인되었다. ISi-1(균주 N343)을 돼지로부터 분리하였으며 29주동안 순수배양액에서 계속적으로 성장시켰다. 약 100%로 감염될 때까지, 백신을 감소된 산소에서 스핀너 플라스크 중의 맥코이 세포에서 성장시켰다. ISi-1을 위해 사용된 고계대 N343 균주의 검체를 추가로 11주("N343NP40wk)를 계대하였으며, 부다페스트 조약하에 미연방공화국 메릴랜드, 락크빌, 파크로운 드라이브 12301(12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland U.S.A.) ATCC에 1996년 5월 22일자로 기탁하여 기탁번호 55783을 부여받았다. 배양액을 3000×g에서 20분동안 원심분리하여 회수하였다. 펠릿을 10% FBS를 가한 수크로즈-포스페이트-글루타메이트 용액(SPG)에 재현탁시켰으며 25게이지 바늘에 4회 통과시켰다. 용해물을 500×g에서 5분동안 원심분리하여 그 부산물 및 미세담체 비드를 펠릿으로 만들었다. 상등액을 저장하고, 백신화 약 1시간 전까지 -70 ℃에서 보관하였으며, 투여될 때까지 아이스에서 보관하였다.
죽어있는 백신(ISi-2)을 상기와 유사한 방식으로 성장시키고 12 1/2 주동안 계대하여 회수한 다음 퍼콜(percol)구배에 의해 정제하였다. 이어서, 박테리아를 엘. 인트라셀룰라리스에 독성이 되는 보통의 대기 산소 수준, 4 ℃에서 저장하는 백신화 약 1 주일 전까지 정제된 박테리아를 -70 ℃에서 저장하였다. AIOH를 최종적으로 10% AlOH의 혼합액으로 박테리아에 가하였다. 단백질 농도를 뷰렛(Biurett) 방법으로 측정하였다.
라이브 IS 인트라셀룰라리스의 정량화:
조직 배양 감염 투여량 50%(TCID50)을 측정함으로써 생존가능한 엘. 인트라셀룰라리스의 정량화하였다. 96웰 마이크로타이터 플레이트에 맥코이 세포를1250세포/웰로 시딩하고 감염 전 18-24시간 동안 성장시켰다. 검체를 순차적으로 반코마이신(100㎍/㎖) 및 암포테리신 B(2.0㎍/㎖)을 포함하는 DMEM/5% FBS중에 1:10으로 희석하였다. 희석액을 0.1㎖/웰으로 96웰 마이크로타이터 플레이트에 가하였다. 12웰/희석액을 사용하였다. 플레이트를 37 ℃ 및 8.0% O2, 8.8% CO2, 및 83.2% N2의 가스 농도에서 6일동안 인큐베이션하였다. 세포를 냉각 50% 아세톤 및 50%에탄올로 2분동안 고정시켰다. PBS중에 1:2000으로 희석된 항-엘. 인트라셀룰라리스 모노클로날 항체(스티븐 맥오리스트(steven McOrist)박사에 의해 개발)를 0.03㎖/웰으로 웰에 가하였다. 플레이트를 37 ℃에서 30분동안 인큐베이션한 다음, PBS로 3회 세척하였다. 1:30으로 희석된 항-마우스 이뮤노글로블린 G-플루오로크롬 컨쥬게이트(FITC)를 0.03ml/웰으로 가한 다음, 37 ℃에서 30분동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 ddH2O로 3회 세척한 후 건조시켰다. 검체를 형광현미경상에서 관찰하고 Reed-Meunch 계산방법을 사용하여 TCID50/ml을 측정하였다.
TCID50 결과는 ISi-1이 1.8×105 박테리아/㎖ 을 가지고 있음을 나타내었다. 네 번째 접종물은 가약(placebo)이었으며 백신과 동일한 방식으로 가공되는 조직 배양 세포로부터 유래되었다.
죽어있는 백신의 총 단백질 함량을 뷰렛 방법으로 시험한 결과, 0.33 mg/㎖을 함유하였다. 돼지를 12/13/95일에 백신화시켰다. 라이브 백신을 모두에게 1㎖/노스트릴(nostril)과 함께 IN 2㎖를 투여하였다. ISi-2(죽어있는) 백신을 1.5ml/돼지와 함께 IM을 투여하였고 다시 14일 후에 투여하였다. 모든 대조군 동물들에게 동일한 방식으로 라이브 백신으로 감염되지 않은 세포를 주었다.
관찰 및 검체들:
배설물 스와브 및 혈청을 연구전반에 걸쳐 7일 간격으로 수집하였다. DNA를 증폭시키기 위하여 플라이머 5'-TATGGCTGTCAAACACTCCG-3' 및 5'-TGAAGGTATTGGTATTCTCC-3' 을 사용하는 PCR 시험을 위해 하여 배설물 스와브를 공정하였다. 사이클 변수는 제 1 사이클에서 93 ℃-5분, 55 ℃-45초, 및 72 ℃-45초이었다. 33 사이클을 상기 언급된 온도에서 온도마다 45초동안 수행하였다. 마지막 사이클은 93 ℃-45초, 55 ℃-45초, 및 72 ℃-2분이었으며, 존(Jones) 등에 의해 정의된 프라이머를 사용하였다.
시험감염:
백신화후 26 및 27일째 엄격한 대조군을 제외한 모든 동물에게 8과 12주사이에서 계속 성장시킨 엘. 인트라셀룰라리스 균주 N343 및 N72994의 저계대배양액으로 구성된 시험감염 배양액을 투여하였다. 배양액을 3000×g에서 20분동안 원심 분리하여 회수하였다. 펠릿은 10% 소의 태아혈청을 포함한 수크로즈-포스페이트-글루타메이트 용액(SPG)내에서 재현탁시킨 다음, 25게이지 바늘에 4회 통과시켰다. 일부의 회수된 배양액을 시험감염시까지 -70 ℃에서 저장하고 나머지들은 시험감염시까지 성장시키고 배양하였다. 시험감염 접종물을 혼합하고 배양액의 TCID50을 측정하였다. 검체를 투여할 때까지 얼음상에 저장하였다.
96년 8월1일에 투여된 시험감염 배양액은 4×104 박테리아/㎖로 구성되었으며, 96년 9월 1일에 투여된 시험감염 배양액은 3×104박테리아/㎖을 가지고 있었다. 돼지에게 위세척을 통하여 상기 양일에 시험감염물 15㎖를 투여하였다. 그리하여 동물은 96년 8월1일 및 96년 9월 1일에 각각 6×105 박테리아/돼지 및 4.7×105 박테리아/돼지를 받았다.
결과:
안정성:
배설물 PCR 결과: PCR을 이용한 엘. 인트라셀룰라리스의 검출은 본 연구 시작에 돼지는 박테리아를 갖지 않음을 나타내었다. 백신화 후 7일째 모든 돼지는 음성이었다. 백신화 후 14일째 ISi-1 그룹내의 3마리의 돼지는 양성이었다. 백신화 후 21일째 두 마리 동물이 양성이었고 다른 모든 돼지는 음성이었다. 백신화 후 26일째 PCR에 의해 검출된 바와 같이 동물은 박테리아를 갖지 않았다. 백신화 후 26일째 그룹 ISi-1에서 돼지 5마리 및 대조군 및 그룹 ISi-2에서 돼지 4마리를 검시하였다. 회수된 검체는 폐렴이 의심되는 병변을 가진 돼지로부터 회장, 직장, 장간막의 림프절, 및 편도 및 폐 검체였다.
PCR 시험은 개별적으로 회장 및 폐 검체상에서 수행되었다. 편도, 결장, 및 림프절을 처리군에 의해 충혈(pooling)시키고 PCR을 수행하였다. PCR 시험의 결과는 하기와 같다.
회장의 조직학적 박편을 1차 항체로서 엘. 인트라셀룰라리스에 특이성인 모노클로날 항체 및 2차 항체로서 항-마우스 이뮤노글로불린 G-플루오로크롬 컨쥬게이트를 사용하여 염색하였다. 엘. 인트라셀룰라리스는 ISi-1로부터 돼지 5마리 중에 3마리에서 관찰되었다. 다른 모든 돼지는 형광 항체 염색에서 음성이었다.
남아 있는 돼지를 시험감염 후 21일째에 검시하고, 평가를 위해 동일한 검체를 수집하였다. PCR결과를 하기에 기재한다.
대조군 그룹내에서 양성인 10마리중 7마리로 상기 기술된 바처럼 회장의 FA 염색은 수행하였다. 다른 모든 동물은 엘. 인트라셀룰라리스의 존재에 대해서 음성이었다.
엘. 인트라셀룰라리스 노출 후 돼지에 의해 생성된 IgG 항체에 대해 혈청을 시험하였다. 조직 배양액 처리된 테라사키 플레이트에 맥코이 세포를 25세포/웰으로 시딩하고 감염전 18-24시간 성장시켜 시험을 시작하였다. 이어서, 5% 소의 태아 혈청을 포함하는 DMEM중에 1000-3000 박테리아/㎖으로 희석된 엘. 인트라셀룰라리스의 순수 배양액을 0.01ml/웰으로 웰에 가하였다. 플레이트를 6일동안 8.0% O2 , 8.8% CO2 및 83.2% N2의 가스 농도에서 인큐베이션하였다. 세포를 냉각 50% 아세톤 및 50% 메탄올로 2분동안 고정시켰다. 돼지의 혈청을 멸균된 PBS중에 1:75로 희석시켰다. 희석된 혈청을 0.01㎖/웰으로 웰에 가하였다. 다음, 플레이트를 37 ℃에서 30-60분동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 멸균된 PBS로 5회 세척하였다. 항-돼지 IgG 이뮤노글로블린 G-플루오르크롬 컨쥬게이트를 0.01㎖/웰으로 웰에 가하였다. 플레이트를 37 ℃에서 30분동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 ddH2O로 5회 세척한 다음, 건조시켰다. 검체를 ddH2O로 5회 세척한 다음, 건조시켰다. 검체를 형광 현미경상에서 관찰하여 박테리아가 관찰된 웰은 양성으로 표시하고 박테리아가 관찰되지 않은 웰은 음성으로 표시하였다.
0일째에 양성인 동물을 다시 주 간격으로 다시 시험하였다. 결과는 백신화 후 14일까지 모두 혈청학적으로 음성이었다. 이는 0일째에 돼지 나이는 생후 3 주이었으며, 그 때의 양성 결과는 모체의 항체에 기인할 수도 있기 때문이라고 예상된다.
순수 배양액에서 성장한 엘. 인트라셀룰라리스로 고면역된 돼지에서 얻은 양성 대조군 혈청으로 혈청을 시험하였다. 사용된 음성 대조군 혈청은 South Dakota 주립 대학에서 무균 동물 돼지로부터 수집하였다.
상기 설명 및 실시예는 본 발명의 목적, 특징, 및 장점을 달성하기 위한 바람직한 구체예의 설명일 뿐이며, 본 발명을 여기에 한정하려는 의도는 아니다. 하기 청구항의 개념 및 범위내에서 본 발명의 어떠한 변형도 본 발명의 일부라고 생각된다.

Claims (22)

  1. 엘. 인트라셀룰라리스(L. intracellularis) 박테리아를 배양하기 위해 약 18% 미만의 산소 농도에서 인큐베이션하며, 현탁액내에서 상기 박테리아를 보존시키는 단계를 포함함을 특징으로하는, 엘. 인트라셀룰라리스 박테리아를 배양하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 박테리아가 현탁액중에 보존되어 있는 배양세포내에 존재하는 방법.
  3. 제 2항에 있어서, 엘. 인트라셀룰라리스 박테리아의 생성을 증가시키기 위해서, 세포의 일부를 신선한 세포로 계대시키는 추가의 단계를 포함하는 방법.
  4. 제 3항에 있어서, 적어도 상기 세포의 일부를 회수하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 엘. 인트라셀룰라리스 박테리아가 엘. 인트라셀룰라리스로 감염된 동물로부터 수득된 것인 방법.
  6. 제 5항에 있어서, 동물이 돼지인 방법.
  7. 제 1항에 있어서, 인큐베이션이 약 0% 내지 약 8% 범위의 산소 농도에서 수행되는 방법.
  8. 제 7항에 있어서, 인큐베이션이 약 0% 내지 약 3% 범위의 산소 농도에서 수행되는 방법.
  9. 제 2항에 있어서, 배양세포가 HEp-2, McCoys, 및 IEC-18 세포로 구성된 그룹 중에서 선택되는 방법.
  10. 제 9항에 있어서, McCoys, 및 IEC-18 세포가 미세담체상에서 인큐베이션되는 방법.
  11. 제 1항의 방법에 따라서 성장시킨 엘. 인트라셀룰라리스(L. intracellularis).
  12. (1) 엘. 인트라셀룰라리스(L. intracellularis) 박테리아로 배양 세포를 감염시키기 위해서 박테리아를 함유하는 접종물로 배양세포를 접종하고;
    (2) 현탁액중에 상기 감염된 세포를 보존하는 동안 엘. 인트라셀룰라리스를 배양하기 위하여, 감염된 세포를 진탕시키면서 약 36 ℃ 내지 약 38 ℃의 온도에 약 0% 내지 약 8%의 산소 농도에서 인큐베이션하는 단계를 포함하는, 엘. 인트라셀룰라리스 박테리아의 배양 방법.
  13. 엘. 인트라셀룰라리스(L. intracellularis) 박테리아로 감염시킨 배양세포를 수득하고, 감염된 세포를 약 0% 내지 약 18%의 산소 농도에서 인큐베이션하고, 현탁액중에 감염된 세포를 보존하는 동안 박테리아를 배양하기 위하여 감염된 세포를 진탕하고, 배양된 박테리아의 적어도 일부를 계대시키고, 배양된 박테리아의 적어도 일부를 회수하고, 약독화된 엘. 인트라셀룰라리스 박테리아를 제공하기 위하여 약독화된 균주를 선별하는 것을 포함하는, 약독화된 엘. 인트라셀룰라리스 균주를 생성하는 방법.
  14. 제 1항의 방법에 따라서 생성된 엘. 인트라셀룰라리스(L. intracellularis) 박테리아 또는 상기 박테리아의 구성요소를 이용하여 생물학적 검체중에 엘. 인트라셀룰라리스와 특이적으로 반응하는 항체가 존재하는지를 검출하기 위한 진단 시험.
  15. 엘. 인트라셀룰라리스(L. intracellularis) 박테리아로 감염된 배양세포를 수득하고, 감염된 세포를 약 0% 내지 약 18%의 산소 농도에서 인큐베이션하고, 현탁액중에 감염된 세포를 보존하는 동안 엘. 인트라셀룰라리스를 배양하기 위하여 감염된 세포를 진탕하고, 배양된 엘. 인트라셀룰라리스 박테리아의 적어도 일부를 회수하고, 동물로부터 생물학적 검체를 수득하고, 생물학적 검체내에 존재하는 항체가 엘. 인트라셀룰라리스 또는 그의 구성요소와 반응하는 조건하에 검체를 회수된 엘. 인트라셀룰라리스 박테리아 또는 그로부터 유래된 구성요소와 접촉시키고, 항원-항체 반응이 일어나는지를 관찰함으로써 검체내에 엘. 인트라셀룰라리스에 대한 항체가 존재하는지를 결정하는 단계를 포함하는, 생물학적 검체내에 엘. 인트라셀룰라리스 박테리아와 특이적으로 반응하는 항체가 존재하는지를 결정하는 방법.
  16. 약제학적으로 허용되는 담체내에 면역반응을 나타내기 위한 유효량의 약독화된 엘. 인트라셀룰라리스(L. intracellularis) 균주를 함유하는, 동물에서 엘. 인트라셀룰라리스 박테리아에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 백신.
  17. 제 16항에 있어서, 약독화된 균주가 제 13항에 따라서 생성된 것인 백신.
  18. 제 1항의 방법에 따라 생성되었으며 사멸된 엘. 인트라셀룰라리스(L. intracellularis) 균주를 약제학적으로 허용되는 담체내에 면역반응을 나타내기 위한유효량을 함유하는, 동물에서 엘. 인트라셀룰라리스 박테리아에 대한 면역반응을 유도하기 위한 백신.
  19. 제 16항 또는 제 18항에 있어서, 배양세포에 감염시킨 엘. 인트라셀룰라리스가 엘. 인트라셀룰라리스로 감염된 동물의 장균질액(intestinal homogenate)으로부터 제조된 것인 백신.
  20. 제 16항에 있어서, 약독화된 균주가 균주 N343NP40wk 인 백신.
  21. 제 16항 또는 제 18항의 백신을 면역학적 유효량으로 동물에 투여함에 의해 동물에서 엘. 인트라셀룰라리스(L. intracellularis) 박테리아에 대한 면역 반응을 유도하는 방법.
  22. 제 13항의 방법에 따라서 생성된 약독화된 균주.
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