DD282393A5 - Mycoplasma impfstoff - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes zur Bekaempfung von Mykoplasmainfektionen bei Gefluegel. Dieser Impfstoff ist fuer Huehner avirulent und fuer Truthuehner nicht pathogen. Er enthaelt speziell den Mykoplasma-Stamm Intervat 6/85 (Deponie-Nr. I-673 am CNCM, Pasteur-Institut, Paris, Frankreich).{Herstellungsverfahren; Impfstoff; Mykoplasmainfektionen; Huehner; Truthuehner; Mykoplasma-Stamm}

Description

Hierzu 1 Seite Zeichnung

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Vorfahren zur Herstellung eines Mykoplasma-Impfstoffes zum Schutz von Geflügel vor Mykoplasmainfektionen durch Verabreichung eines solchen Impfstoffes.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik Mykoplasma, und in.« sesondere M. gallisepticum, ist eine Bakterie, die insbesondere für Geflügel infektiös ist. Die Infektion

kommerziell wichtiger Vögel mit der genannten Bakterie verursacht erhebliche wirtschaftliche Verluste.

Das durch M. gallisepticum verursachte Syndrom wird bei Hühnern als „chronische Atmungserkrankung" und bei Truthühnern

als „infektiöse Sinusitis" bezeichnet. Die Infektion durch M. gallisepticum ist auch oft durch eine Infektion mit Viren der

Atemwege und durch Escherichia coli begleitet. Infektionen durch M. gallisepticum können mit bestimmten Antibiotika bekämpft werden, beispielsweise Erythromycin, Streptomycin, Chlorotetrazyklin, Tylosin und Magnamycin, die in der Regel dem Futter beigemischt werden, aber im

wachsenden Maße entwickeln die Bakterien eine Resistenz gegen diese Substanzen, wodurch die Bekämpfung der Erkrankungimmer schwieriger wird.

Es wurden Impfstoffe für den immunologischen Schutz von Geflügel vor Infektionen mit M. gallisepticum entwickelt. Inaktivierte M. gallisepticum-Bakterienimpfstoffe wurden mit unterschiedlichem Ergebnis eingesetzt. Diese Impfstoffe ergaben

zwar, besonders bei Verabreichung in Verbindung mit einem Öl-Emulsion-Adjuvans, eine gute serologische Reaktion, schienenaber nicht vor den Infektionen ru schützen.

In einigen wenigen Staaten der USA, vor allem in den sogenannten „Eierfarmen", wurden Impfungen mit geschwächten,

lebenden M. gallisepticum des F-Stammes durchgeführt. Dieser Stamm wird nach der Spritzmethode verabreicht und bieteteinen angemessenen Schutz von Luftsackentzündungen und verringert den Rückgang in der Eierproduktion auf einannehmbares Maß.

Die bekannten inaktivierten Impfstoffe haben zahlreiche Nachteile. Jedes Tier muß einzeln gespritzt werden. Der Impfstoff ist

sehr teuer. Die Tiere sind nicht gegen die Infektion geschützt, d. h., nach der Infektion können sie Träger von (virulentem)

Mykoplasma bleiben. Selbst die vorhandenen l.ebendvakzine sind nicht problemlos. Obwohl der F-Stamm für Hüher ziemlich avirulent is\, ist er für Truthühner sehr pathogon. Außerdem bleiben die Hühner nach der Impfung Träger des Impfstammec. der sich comii auch über

eine längere Zeitspanne weiter ausbreiten kann.

Ziel der Erfindung Mit der Erfindung wird ein Mykoplasma-Impfstoff zur Verfügung gestellt, der Geflügel vor Mykoplasmainfektionon schützt. Darlegung des Wesens der Erfindung Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, einen Impfstoff zum Schutz von Geflügel vor Mykoplasmainfektionen bereitzustellen. Es wurde nun ein M. gallisepticum-lmpfstoff gefunden, der nicht die oben genannten Nachteile aufweist. Der rVlykoplasma-lmpfstoff nach der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß er von einem M. gallisepticum-Stamm abgeleitet

wird, der die immunologischen Eigenschaften des Stamems Intervet 6/85 hat.

Per Stamm Intervet 6/85 ist ein neuer M. gallisepticum-Stamm - ein Mutant, der durch eine Reihe von In-Vitro-Passagen des

bekannten S6-Stammes (ATCC No. 15302) gewonnen wurde.

Dieser neue Stamm, der am 7. Juli 1987 unter der Nummer I-673 bei der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes

des Pasteur-Instituts in Paris deponiert wurde, ist damit Teil der Erfindung. Zur Erfindung gehören auch Stämme, welchedieselben charakteristischen immunologischen Eigenschaften wie der Stamm Intervet 6/85 haben. Insbesondere sii'd auch

Stämme, welche unter Beibehaltung der besonders günstigen immunologischen Eigenschaften vom Stamm Intervet 6/85

abgeleitet wurden, Teil der Erfindung.

Der Stamm Intervet 6/85 hat eine Reihe wichtiger Vorteile gegenüber den bekannten Stämmen von M. gallisepticum, durch die er für Impfstoffanwendungen außerordentlich geeignet ist und durch die er sich von den bekannten M. gallisepticum-Stämmen unterscheidet:

a) er ist nicht virulent für Hühner; keinerlei klinische Symptome; l.uftsackentzündungen treten faktisch nicht auf;

b) nicht virulent für Truthühner;

c) vier Wochen nach dar Verabreichung wird er nur noch bei einer unbedeutend geringen Zahl von Tieren festgestellt, während der F-Stamm über eine lange Zeitspanne von fast 100% der Tiere ausgeschieden wird;

d) er hat ein Endonukleaserestriktionsschema, wie es in der Abb. 1 gezeigt wird.

Der Impfstoff nach der Erfindung wird an Geflügel vorzugsweise in Form eines Lebendvakzins verarbeitet, obwohl er auch als

inaktivierter Impfstoff verwendet werden kann.

Der Mykoplasma-Impfstoff kann auf die für ähnliche Impfstoffe übliche Weise verabreicht werden, besonders aber eignet sich

der vorliegende Impfstoff für die Verabreichung als Aerosol. Sehr fein verteilte Aerosol« des Impfstoffes können beispielsweisemit einem Vineland-Aerosolgerät hergestellt werden.

Der Mykoplasma-Impfstoff nach der Erfindung kann beispielsweise in gefriergetrockneter Form auf den Markt gebracht werden. Daraus kann durch den Zusatz einer wäßrigen Flüssigkeit, beispielsweise von Leitungswasser, eine Suspension hergestellt

werden. Der Impfstoff kann natürlich auch als Suspension auf den Markt gebracht werden. Auf Wunsch können in dem Impfstoffneben dem Mykoplasmamaterial auch ein oder mehrere Stabilisatoren (wie Magermilch oder Kaseinhydrolysat) und/oder einoder mehrere Antibiotika (wie Ampicillin oder Polymycin) vorhanden sein.

Der vorliegende Impfstoff ist für die Bekämpfung von Mykoplasmainfektionen bei Geflügel geeignet. Besonders geeignet ist er

für die Bekämpfung von Mykoplasmainfektionen bei Hühnern und Truthühnern. Der Impfstoff kann am besten in der

Aufzuchtperiode, vorzugsweise im Alter von 8 bis 15 Wochen, verabreicht werden, als Schutz gegen ein« η Rückgang der Produktion während der Legezeit. Die Impfung sollte aus folgenden Gründen vorzugsweise während der Aufzuchtperiode

durchgefüh^. werden:

a) weil eine leichte Impfreaktion, die aus der Impfung resultieren könnte, in dieser Phase keine Auswirkungen auf die Eierproduktion hat;

b) weil der Schutz zu dem Zeitpunkt, an dem die Tiere zu legen beginnen, angemessen sein muß;

c) weil die Tiere geschützt sein sollten, wenn sie aus der Aufzuchtfarm in die Legefarm gebracht werden, wo in der Regel die Infektion erfolgt.

Eine der vorteilhaften Eigenschaften des Impfstoffes nach der Erfindung ist seine sehr geringe Virulenz für Hühner. Das wurde mit Leghorn-Zuchttieren nachgewiesen, bei denen die Wirkungen des Stammes Intervet 6/85, des R-Stammes und des F-Stammes verglichen wurden. Der R-Stamm wird als ein sehr virulenter M. gallisepticum-Stamm betrachtet. Der F-Stamm wird in den USA als Impfstamm verwendet. Beide Stämme wurden von S. Kleven von der University of Georgia zur Verfügung gestellt. Der F- und der R-Stamm wurden in den von Frey u.a. beschriebenen Medien (M. C. Frey, R. P. Hanson und D. P.Anderson [1968], Amer. J. Vet. Res. 29,2164-2171) gezüchtet, während der Stamm Intervet fi/G5 in einem modifizierten Adler-Medium (H.E.Adler, R.Yamamoto und S. Bankowski [1954], Amer. J. Vet. Res. 15,463-465) kultiviert wurde. Die Modifikation des Adler-Mediums bestand darin, daß Bacto PPLO-Brühe durch Proteasepepton und Pferdesei um durch Schweineserum ersetzt wurden. Bei den für diese Experimente verwendeten Hühnern wu'de vorher festgestellt, daß sie sowohl für M. gallisepticum als auch für M. synoviae seronegativ waren.

Etwa eine Woche vor den Experimenten wurden 10 Hühner in einen Isolationskäfig mit vermindertem Druck gebracht. Diesen Hühnern wurde nach der Aerosolmethode Mykoplasrra verabreicht. Im Isolationskäfig wurden 100ml der entsprechenden Mykoplasmakultur für die Dauer von 10 min zerstäubt, die Luftabgabevorrichtung war ausgeschaltet. Die verabreichte Suspension von Intervet 6/85 enthielt 10'° lebensfähige Organismen je Milliliter, während die Suspensionen des F- und des R-Stammes jeweils nur 10³ lebensfähige Organismen je Milliliter enthielten.

Zehn und 24 Tage nach der Verarbreichung des Mykoplasmas wurde eine Pi ist-mortem-Untersuchung durchgeführt- in beiden Fällen mit 5 Hühnern. Die Hühner wurden auf Luftsackschüden, Eierstockdt generation und die Anzahl der Tiere untersucht, aus denen M. gallisepticum isoliert werden konnte. Die Ergebnisse wurden reproduziert, wie das im Beispiel 2 unter a, b bzw. c beschrieben wird

Die Ergebnisse werden in den untenstehenden Tabellen gezeigt.

Infektion von 27 Wochen alten Hühnern

Verabreicht	Tage nach der Verabreichung	Tage nach der Verabreichung	Luftsack schäden	Eierstock degenerat.	Reisolat. (%)
R-Stamm Intervet 6/85	10 10	10 10	3,0 0,6 0,0	3,0 0,2 0,0	100 40 0
R-Stamm Intervet 6/85	24 24	1,0 0,0 0,0	0,6 0,2 0,0	100 40 0
Infektion von 32 Wochen alten Hühnern
Verabreicht	Luftsack schäden	Eierstock degenerat.	Reisolat. (%)
R-Stamm Intervet 6/85	3,2» 0,3 0,0	2,5 0,8 0,0	100 17 0

Durchschnitt von 6 Hühnern. Infection von 35 Wochen alten Hühnern

Verabreicht	Tage nach der Verabreichung	Tage nach der Verabreichung	Luftsnck- schädon	Eierstock degenerat.	Reisolat. (%)
R-Stamm Intervet 6/85 F-Stamm	10 10 10	10 10 10 (40Wo. alt)	2,8 0,2 2,0 0,0	2,8 1,4 1,6 0,1	100 20 100 0
R-Stamm Intervet 6/85 F-Stamm	24 24 24	0,6 0,0 0,6 0,0	0,8 0,0 0,4 0,0	100 0 80 0
Infektion von 39 Wochen alten Hühnern
Verabreicht	Luftsack schäden	Eierstock degenerat.	Reisolat. {%)
R-Stamm Intervet6/85 F-Stamm	2,2 0,0 2,0 0,0	2,4 0,8 1,4 0,4	O O O O

Aus den obenstehenden Daten geht hervor, daß der Stamm Intervet 6/85 erheblich geringere Luftsack- und Eierstockschäden

erzeugt als sowohl der F- wie auch der R-Stamm.

Außerdem wird offensichtlich, daß der Stamm Intervet 6/85 in den infizierten Hühnern nach etwa 4 Wochen nicht mehr

feststellbar ist, während sowohl der R- als auch der F-Stamm zu diesem Zeitpunkt tatsächlich noch häufig nachgewiesen werdenkonnte.

Ähnliche Experimente sind mit vier Wochen alten weißen Truthühne. π durchgeführt wurden. Die Ergebnisse werden in

nachstehender Tabelle gegeben.

Verabreicht	Tage nach der	Luftsackschäden	Reisolation (%)
	Verabreichung
R-Stamm	10	3,2	100
Intervet 6/85	10	0,2	100
F-Stamm	10	2,6	100
-	(5VjWo. alt)	0,4	0
R-Stamm	28	3,75	100
Intervet 6/85	28	0,5	0
F-Stamm	28	2,6	100
-	(8 Wo. alt)	0,2	0

Es ist bekannt, daß Truthühner besonders anfällig gegen M. gallisepticum sind, selbst gegenüber relativ wenig virulenten Stämmen, wie dem F-Stamm, die bei Hühnern als Vakzin-Stämme verwendet werden. Die obigen Ergebnisse zeigen jedoch, daß der neue Stamm Intervet 6/85 für Truthühner ebenfalls nur sehr wenig virulent ist und

tatsächlich keine Schaden erzeugt.

Der Stamm Intervet 6/85 wurde auch auf Reversion zu Virulenz untersucht. Zu diesem Zweck wurde der Stamm fünfmal Hühnern

zugeführt, wobei das durch „Trachealtupfer" reisolierte Mykoplasma jeweils neuen Hühnern verabreicht wurde. Die Ergebnissewerden unten in der Tabelle gezeigt. Selbst nach fünf Wiederholungen wurde keine Virulenz festgestellt.

Verabreicht	Durch	Tagenach	Alter	Luft	Eier	Reisola-
	gang Nr.	Verabr.	(Wo.)	sack	stock	tion (%)
				schäden	degen.
lntervet6/85	2	10	29	0,75	1,2	66
			29	0,25	0,0	0
lntervet6/85	3	10	35	0,0	1,0	20
lntervet6/85	O	10	35	0,2	1,4	20
R-Stamm	O	10	35	2,8	2,6	100
-			35	0,0	0,1	0
lntervet6/85	4	10	39	0,4	1,4	20
lntervet6/85	O	10	39	0,0	0,8	0
R-Stamm	O	10	39	2,2	2,4	100
-			39	0,0	0,4	0
Intervet6/ö5	5	10	41	0,4	1,4	2G
R-Stamm	O	10	41	2,2	2,2	100
-			41	0,0	0,4	0

Ausfuhrungsbeispiele

Beispiel Ί:

Herstellung eines Lebendvakzins

Eine Menge von etwa 1 ml Brutmaterial des Stammes Intervtt 6/85 von Mykoplasma gallisepticum wird in 10 ml modifiziertem Adler-Medium rekonstituiert und bei 37°C inkubiert.

Nachdem ein ausreichendes Wachstum erfolgt ist, was auf der Grundlage der Farbänderung eines Indikators, der zugesetzt wurde (Phenolrot) eingeschätzt wurde, wird die Suspension in einem Volumenverhältnis von 1:20 in ein frisches, modifiziertes Adler-Medium inokuliert jnd erneut in der beschriebenen Weise inkubiert.

Diese Skalierung nach oben wird so lange fortgesetzt, bis man ein Inokulum erhält, das ausreichend groß ist, um den zu verwendenden Fermenter zu inokulieren (für 100-l-Fermenter werden etwa 5I Inokulum gebraucht).

Nach der Inokulation des Fermenters erfolgt über eine Zeitspanne von 24 bis 30 Stunden bei einem pH-Wert von 7,5 die Inkubation, wobei die Temperatur 37⁰C beträgt und mit einer konstanten Rührgeschwindigkeit und mit Belüftung gearbeitet

Dann werden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen und in Magermilch (10%) aufgenommen, der Ampicillin zugesetzt worden war.

Nach dem Einfüllen in geeignete Phiolen wird das Vakzin gefriergetrocknet, und anschließend werden die Phiolen versiegelt.

Beispiel 2: Impfungsexperimente mit Hühnern

Zwei Gruppen von 10 Hühnern wurden nach der Aerosolmethode mit dem F-Stamm bzw. dem Stamm Intervet 6/85 geimpft und in Isolationskäfige mit vermindertem Druck gebracht.

Zwei Wochen später wurden die beiden Gruppen und eine ungeimpfte Kontrollgruppe mit dem virulenten R-Stamm infiziert und 10 Tage später getötet. Luftsackschäden, Eierstockdegeneration und die relative Menge von M. gallisepticum, die in den getöteten Tieren vorhanden war, wurde auf die unten beschriebene weise bestimmt:

a) Die Abstufungen bei der Luftsackschädigung wurden folgendermaßen klassifiziert:

0 = klarer Luftsack ohne lymphofollikiiläre Schäden;

1 = leichte Trübung in einem der beiden Luftsäcke oder lymphofollikuläre Schaden in einem oder beiden der

Luftsäcke;

2 =· wie 1, aber in diesem Fall in beiden Luftsäcken oder intensive Trübung in einem oder beiden der Luftsäcke oder

käseartige Sekretion an einem oder beiden der Luftsäcke oder einer oder beide der Luftsäcke sind dick und fleischig geworden;

3 = beide Luftsäcke intensiv trübe oder käseartige Sekretion oder verdickt und fleischig;

4 = Kombination der Symptome unter3.

b) Der Grad der Eierstockdegeneration wurde folgendermaßen klassifiziert:

0 = aktive Eierstöcke ohne Degeneration;

1 = einige der Follikel im Eierstock gegeneriert;

2 = alle Follikel degeneriert und einige mit Blutungen;

3 = alle Follikel mit Blutungen degeneriert.

c) Es wurde die Anzahl der Hühner bestimmt, aus denen wieder Mykoplasma gallisepticum isoliert werden konnte. Sie wurde als Prozentsatz der Gesamtzahl der Hüher in den jeweiligen Gruppen ausgedrückt.

Die Ergebnisse der oben beschriebenen Experimente nach der Impfung von Hühnern unterschiedlichen Alters werden unten beschrieben.

I.Impfung von 27 Wopchen alten Hühnern

Gruppe	Luftsack schäden	Eierstock degeneration	Reisolation* (%)	Luftsack schäden	Eierstock degeneration	Reisolation* (%)
Impfung mit lntarvet6/85 plus Infektion mitR-Stamm	1,0	0,5	80	1,2	2,0	100
Keine Impfung, aber Infektion mitR-Stamm	3,0	2,8	100	1,0	1,0	100
Impfung mit !ntervot6/85, keine Infektion mitR-Stamm	0,0	0,2	40	2,4	2,6	100
Keine Impfung, keine Infektion mitR-Stamm	0,0	0,0	0	0,0	0,0	0
* Es wurde keine Unterscheidung zwischen R-Stamm und Stamm Intervet 6/85 vorgenommen. II. Impfung von 35 Wochen alten Hühnern	0,6	0,4	80
Gruppe	0,0	0,0	0
Impfung mit Intervet 6/85 plus Infektion mitR-Stamm
Impfung mit F-Stamm plus Infektion mit R-Stamm
Keine Impfung, aber Infektion mitR-Stamm
Impfung mit Intervet 6/85, keine Infektion
Impfung mit F-Stamm, keine Infektion
Keine Impfung, keine Infektion

Es wurde keine Unterscheidung zwischen R-Stamm, F-Stamm und Stamm Intervet 6/85 vorgenommen. III. Impfung von 39 Wochen alten Hühnern

Gruppe	Luftsack schäden	Eierstock degeneration	Reisolation* (%)
Impfung mit Intorvet6/05 plus Infektion mit R-Stamm	0,0	1,0	100
Impfung mit F-Stamm plus Infektion mit R-Stamm	1,4	1,4	80
Keine Impfung, aber Infektion mii R-Stamm	2,2	2,2	100
Keine Impfung, keine Infektion	0,0	0,4	0

• Es wurde keine Unterscheidung zwischen R-Stamm, F-Stamm und Stamm Intervet 6/85 vorgenommen.

Aus diesen Experimenten kann die Schlußfolgerung gezogen werden, daß der Stamm Intervet 6/85 Schutz vor Luftsackschäden und Eierstockdegenerierung infolge einer ernsthaften Infektion bieten kann, welcher vergleichbar ist mit dem durch den F-Stamm erreichten Schutz.

Claims (3)

1. Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes zur Bekämpfung von Mykoplasmainfektionen bei Geflügel, gekennzeichnet dadurch, daß Bakterien eines Mykoplasma gallisepticum-Stammes, der die immunologischen Eigenschaften des Stammes Intervet 6/85 hat, zu einem pharmazeutischen Präparat mit Immunisierungsaktivität entwickelt werden, wobei wahlweise ein Stabilisator und/ oder Adjuvans und/oder Antibiotikum und/oder ein Inaktivierung der Bi kterien hinzukommen können.

2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß Bakterien eines Mykoplasma gallisepticum-Stammes verwendet werden, die vom Stamm Intervet 6/85 abgeleitet werden.

3. Verfahren nach Anspruch 2, gekennzeichnet dadurch, daß Bakterien des Stammes Intervet 6/85 verwendet werden.