ES2332587T3 - Cultivo de lawsonia intracellularis, vacunas anti-lawsonia intracellularis y agentes de diagnostico. - Google Patents
Cultivo de lawsonia intracellularis, vacunas anti-lawsonia intracellularis y agentes de diagnostico. Download PDFInfo
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Abstract
Una vacuna para inducir una respuesta inmunitaria en bacterias L. intracellularis en un animal que comprende una cepa atenuada de L. intracellularis en un soporte farmacéuticamente aceptable, en donde dicha cepa atenuada está en una cantidad eficaz para producir una respuesta inmunitaria, y en donde la vacuna comprende 50-500 microgramos de inmunógeno, y se utilizan bacterias purificadas, y en donde la cepa atenuada de L. intracellularis se puede obtener por un método que comprende obtener células de cultivo, infectadas con bacterias L. intracellularis, incubar dichas células infectadas a una concentración de oxígeno de aproximadamente 0 hasta aproximadamente 18 por ciento, agitar dichas células infectadas con el fin de cultivar dichas bacterias, al tiempo que se mantiene a dichas células infectadas en suspensión, hacer pasar al menos una parte de dichas bacterias cultivadas, recolectar al menos una parte de dichas bacterias cultivadas y seleccionar una cepa atenuada para proporcionar bacterias L. Intracellularis atenuadas.
Description
Cultivo de Lawsonia intracellularis,
vacunas anti-Lawsonia intracellularis y agentes de
diagnóstico.
La presente invención está dirigida a vacunas
anti-Lawsonia intracellularis, y a métodos para proteger
contra la infección por Lawsonia intracellularis, y para
diagnosticarla. Los productos y procesos de la invención se pueden
conseguir, en parte, como resultado del método mejorado que los
autores de la invención han descubierto para cultivar grandes
cantidades de L. intracellularis.
L. intracellularis, el agente causante de
la enteropatía proliferativa porcina (siglas inglesas: PPE), afecta
virtualmente a todos los animales, entre ellos a los seres humanos,
conejos, hurones, hámsters, zorros, caballos, y otros animales tan
distintos como avestruces y emús.
L. intracellularis causa pérdidas
particularmente grandes en piaras de cerdos. Se ha estimado que la
prevalencia e incidencia de la PPE en los Estados Unidos alcanzan
hasta el 20% de la cabaña porcina, con unas pérdidas estimadas de
20 millones de dólares al año.
Una característica recurrente de la PPE es la
presencia de bacilos intracitoplasmáticos curvados, no ligados a
membrana, dentro de enterocitos en las porciones del intestino
afectadas. Las bacterias asociadas con la PPE han sido denominadas
"organismos similares a Campylobacter" (S. McOrist y otros.,
Vet. Pathol., volumen 26, 260-64 (1989)). Se ha
identificado posteriormente a las bacterias causantes como género y
especie taxonómicos nuevos, denominados en nuestro idioma
simbionte ileal (siglas inglesas: IS) intracelular (C.
Gebhart y otros, Int'l. J. of Systemic Bacteriology, volumen 43,
número 3, 533-38 (1993)). Más recientemente, se ha
dado a estas nuevas bacterias el nombre taxonómico Lawsonia (L.)
intracellularis S. McOrist y otros, Int'l. J. of Systemic
Bacteriology, volumen 45, número 4, 820-25 (1995)).
Se han empleado estos tres nombres, de manera indistinta, para
designar al mismo organismo, que es identificado y descrito con
mayor detalle en la presente memoria. Los autores de la invención
se han propuesto emplear el nombre taxonómico, L.
intracellularis, a lo largo de la discusión de la presente
invención.
L. intracellularis es una bacteria
intracelular obligada que no puede ser cultivada por métodos
bacteriológicos normales en medios convencionales, exentos de
células, y se ha pensado que para crecer precisa células epiteliales
unidas. S. McOrist y otros, Infection and Immunity, volumen 61,
número 10, 4286-92 (1993) y G. Lawson y otros, J.
of Clinical Microbiology, volumen 31, número 5,
1136-42 (1993) discuten el cultivo de L.
intracellularis empleando monocapas de células
IEC-18 del epitelio intestinal de rata en frascos
convencionales para cultivo de tejidos. Además, H. Stills, en
Infection and Immunity, volumen 59, número 9,
3227-36 (1991) discute el empleo de monocapas de
células intestinales embriónicas humanas Intestine 407 y de
monocapas de células GPC-16 de adenocarcinoma de
colon de cobaya en frascos convencionales para cultivo de tejidos.
Estos métodos de cultivo existentes son muy laboriosos e
inadecuados para ser escalados.
Los fastidiosos requisitos de crecimiento de
L. intracellularis en cultivos in vitro han
dificultado en gran medida la comprensión actual de la infección
por L. intracellularis y el tratamiento y control eficaces
de la enfermedad. Existe actualmente la necesidad de un método
mejorado para cultivar L. intracellularis. Existe también la
necesidad de vacunas contra L. intracellularis, y de
herramientas eficaces para diagnosticar la infección por L.
intracellularis.
Es un objeto de la invención proporcionar
vacunas anti-L. intracellularis.
Otro objeto de la invención es proporcionar
métodos para detectar la presencia de anticuerpos contra L.
Intracellularis en muestras biológicas.
Es un objeto adicional proporcionar un método de
cultivo mejorado que permita el cultivo a gran escala de L.
intracellularis, para producir vacunas y agentes de
diagnóstico.
Para conseguir estos y otros objetos, y de
acuerdo con el propósito de la invención, tal como se realiza y se
describe a grandes rasgos en la presente memoria, la presente
invención proporciona un método para cultivar L.
intracellularis, y suministrar a gran escala bacterias
producidas mediante dicho método.
Según dicho método, se incuban bacterias de
L. intracellularis bajo una concentración de oxígeno de
aproximadamente 0 por ciento a aproximadamente 18 por ciento,
mientras se agitan las bacterias para cultivar L.
intracellularis, manteniendo las bacterias en suspensión.
Según otra realización, se proporciona un método
para cultivar bacterias de L. intracellularis inoculando una
monocapa de células HEp-2, McCoys o
IEC-18, que presente aproximadamente 30 por ciento
de confluencia, con un inóculo que comprenda bacterias de L.
intracellularis, a fin de infestar las células con las
bacterias. Después se incuban las células infectadas, a una
temperatura de aproximadamente 36 hasta aproximadamente 38ºC, bajo
una concentración de oxígeno de aproximadamente 0 por ciento hasta
aproximadamente 8,0 por ciento, hasta que las células alcanzan la
confluencia. A continuación se disponen las células infectadas y
medio de cultivo en un fermentador, biorreactor, matraz agitado u
otro recipiente adecuado para mantener las células en suspensión.
Se incuban las células infectadas mientras son agitadas, a fin de
cultivar las bacterias de L. intracellularis mientras se
mantienen en suspensión las células infectadas. A continuación se
traspasa una porción de L. intracellularis cultivada a
nuevas células de cultivo, para incrementar la producción de
bacterias de L. intracellularis.
La invención proporciona vacunas anti-L.
intracellularis y métodos para producir vacunas contra L.
intracellularis. Se produce una bacteria L.
intracellularis avirulenta traspasando un número de veces
suficiente las bacterias L. intracellularis cultivadas, y
seleccionando una cepa atenuada, o bien sometiendo a las bacterias
cultivadas a medios químicos de atenuación. Empleando los métodos
de cultivo de la invención también se preparan vacunas con L.
intracellularis muertas. De acuerdo con una realización
particularmente preferida, se cultivan de manera continua las
bacterias durante al menos aproximadamente 6 a 8 meses, durante los
cuales son traspasadas al menos aproximadamente 7 a 12 veces, a fin
de producir una cepa atenuada destinada al empleo como vacuna. A
continuación se mezclan las bacterias atenuadas con un vehículo
farmacéuticamente aceptable, y se administran a un animal en una
cantidad eficaz para producir una respuesta inmunitaria. Los autores
de la invención han depositado la cepa atenuada actualmente
preferida (N343NP40wk) en la colección estadounidense de cultivos
tipo American Type Culture Collection.
La invención también proporciona un método para
determinar la presencia de anticuerpos que específicamente
reaccionan con bacterias L. Intracellularis en una muestra
biológica, recolectando al menos una parte de las bacterias L.
Intracellularis cultivadas, poniendo en contacto una muestra
biológica de un animal con bacterias L. Intracellularis
recolectadas o un componente de las mismas en condiciones en las que
el anticuerpo presente en la muestra biológica reacciona con la
L. Intracellularis o el componente, y determinar si ha
ocurrido una reacción anticuerpo-
antígeno.
antígeno.
En la descripción que sigue se expondrán
características y ventajas adicionales de la invención, que serán
evidentes de dicha descripción, o bien de la práctica de la
invención.
Tal como se emplea en esta memoria, la expresión
"L. intracellularis" significa las bacterias
intracelulares, curvadas, gram-negativas, descritas
con detalle por C. Gebhart y otros, Int'l. J. of Systemic
Bacteriology, volumen 43, número 3, 533-38 (1993) y
S. McOrist y otros, Int'l. J. of Systemic Bacteriology, volumen 45,
número 4, 820-25 (1995) (cada uno de los cuales se
incorpora en esta memoria como referencia en su totalidad), e
incluye, aunque sin estar limitada a las mismas, las bacterias
depositada como ATCC 55672 en la American Type Culture Collección,
Rockville, MD; las bacterias depositadas como NCTC 12656 y 12657 en
la colección de cultivos tipo National Collection of Type Cultures,
Colindale, London; la bacterias causantes que pueden ser obtenidas
de cerdos u otros animales infectados con PPE de todo el mundo, con
el conocimiento de la técnica y las enseñanzas de la presente
memoria; y variantes o mutantes de cualquiera de las bacterias
mencionadas, tanto si son obtenidos de manera espontánea o de
manera artificial.
Tal como se emplea en esta memoria, la expresión
"cepa atenuada" significa cualquier cepa de L.
intracellularis que haya sido preparada según las técnicas de
cultivo y traspaso que se enseñan en la presente memoria, a fin de
conseguir la avirulencia y al mismo tiempo mantener las propiedades
inmunogénicas cuando sea administrada a un animal anfitrión. Tal
como se mostrará más adelante, se han cultivado y atenuado según las
presentes enseñanzas distintas cepas de L. intracellularis,
obteniendo cepas inmunogénicas atenuadas, que tienen eficacia como
vacunas en cerdos y otros animales susceptibles a la infección por
L. intracellularis.
Se espera que las cepas atenuadas de la
invención sean útiles como inmunógenos en vacunas antimicrobianas
para animales, con inclusión de pájaros, peces, ganado vacuno,
cerdos, caballos, mamíferos y primates en general, y seres humanos.
Estas vacunas pueden ser preparadas mediante técnicas conocidas por
los expertos en la materia, basándose en las enseñanzas contenidas
en la presente memoria. Una vacuna semejante comprendería una
cantidad inmunológicamente eficaz de la cepa atenuada, en el seno
de un vehículo farmacéuticamente aceptable. La vacuna podría ser
administrada en una o más dosis. Se puede determinar si una cantidad
es inmunológicamente eficaz por medios conocidos en la técnica, y
sin experimentación excesiva, basándose en las enseñanzas contenidas
en la presente memoria. La cantidad de bacterias avirulentas debe
ser suficiente para estimular una respuesta inmunitaria en animales
susceptibles a la enfermedad, y al mismo tiempo seguir siendo
avirulenta. Dicha cantidad dependerá del animal, la bacteria y la
enfermedad en particular que estén implicados. La dosis recomendada
que se ha de administrar al animal susceptible se sitúa con
preferencia en aproximadamente 10^{3} hasta 10^{9} bacterias/kg
de peso corporal, y muy preferentemente en torno a 10^{5} hasta
10^{7} bacterias/kg de peso corporal. Los vehículos son conocidos
por los expertos en la materia, e incluyen estabilizantes y
diluyentes. Dicha vacuna puede contener también un adyuvante
adecuado. Las vacunas de la invención pueden ser empleadas en
combinación con otras vacunas, por ejemplo como diluyentes de otra
vacuna liofilizada, o bien se pueden combinar con otra vacuna antes
de la liofilización. También se pueden desecar las preparaciones de
vacuna, por ejemplo liofilizándolas para su conservación o para su
posterior formulación como vacunas líquidas.
\newpage
Por consiguiente, la invención también comprende
un método para inducir una respuesta inmune en bacterias L.
Intracellularis virulentas, de tipo salvaje, en un hospedante
animal con el fin de proteger al hospedante de bacterias de este
tipo. El método comprende administrar una cantidad inmunológicamente
eficaz de las bacterias atenuadas o bacterias exterminadas de la
invención al hospedante y, de preferencia, administrar la vacuna de
la invención al hospedante.
Tal como se emplea en esta memoria, la expresión
"cultivo a gran escala" significa un nivel de cultivo de L.
intracellularis superior a aproximadamente 2,0 a 3,0 litros, e
incluye la producción a una escala de 100 litros o más. El término
"cultivo" tal como se emplea en esta memoria, significa el
proceso de promover el crecimiento, reproducción y/o proliferación
de L. intracellularis.
Para poner en práctica el método de cultivo de
la invención, primeramente se pueden inocular células de cultivo
con un inóculo que comprende bacterias de L. intracellularis,
a fin de infectar las células con las bacterias. Para poner en
práctica la invención se pueden emplear numerosas líneas celulares,
que incluyen, pero sin estar limitadas a éstas, células epiteliales
de intestino de rata IEC-18
(ATCC-1589), células de carcinoma epidermoide
humano HEp-2 (ATCC 23), células de ratón (sin
especificar) McCoys (ATCC 1696), células renales caninas
Madin-Darby MDCK (ATCC 34), células renales de mono
búfalo verde BGMK (Biowhittaker #71-176), y células
epiteliales de intestino de cerdo. Las células de cultivo
preferidas son células HEp-2, McCoys o
IEC-18. De manera alternativa, se pueden cultivar
las bacterias en un sistema exento de células, siempre que se
mantengan las bacterias bajo la concentración apropiada de O_{2}
disuelto, tal como se enseña en la presente memoria.
Si se emplean células de cultivo, las células se
encuentran preferentemente en forma de una monocapa antes de ser
inoculadas, aunque no es imprescindible. Para formar una monocapa,
se pueden sembrar las células en frascos convencionales.
Generalmente, se siembra cada frasco con una cantidad entre
aproximadamente 1 x 10^{5} células y aproximadamente 10 X
10^{5} células para un frasco de 25 cm^{2}, mezcladas con medio
de cultivo. El medio de cultivo puede ser cualquier medio para el
cultivo de células, lo cual incluye una fuente de nitrógeno,
factores de crecimiento necesarios para las células cultivadas
elegidas, y una fuente de carbono, por ejemplo glucosa o lactosa.
El medio preferido es DMEM con suero fetal de bovino al
2-5%, aunque se pueden emplear con buen resultado
otros diversos medios comercialmente disponibles.
Los autores de la invención han hallado que el
cultivo satisfactorio de L. intracellularis se ve facilitado
manteniendo en un estado de crecimiento constante a las células
cultivadas. Por tanto, la monocapa de células de cultivo debe
presentar, en el momento de la inoculación, una confluencia de
aproximadamente 20 por ciento a aproximadamente 50 por ciento.
Preferiblemente, las células deben encontrarse en una confluencia de
aproximadamente 30 por ciento hasta aproximadamente 40 por ciento
en el momento de la inoculación, siendo muy preferida una
confluencia de aproximadamente 30 por ciento.
El inóculo puede ser un cultivo puro de L.
intracellularis obtenido, por ejemplo, partiendo del depósito
ATCC 55672, de los depósitos NCTC 12656 ó 12657, o bien de cerdos u
otros animales infectados, aprovechando las enseñanzas de
aislamiento y purificación que se discuten en la presente
memoria.
Según una realización, el inóculo para poner en
práctica la invención es un homogenizado intestinal preparado
raspando la mucosa del íleon de un cerdo u otro animal infectado con
PPE. Cuando se prepara un homogenizado intestinal, los cortes del
íleon seleccionados para el cultivo deben mostrar lesiones graves,
con gran engrosamiento del intestino. A causa de la naturaleza
frágil de las bacterias, las muestras deben ser conservadas con
preferencia a -70ºC lo más rápidamente posible tras la necropsia.
Preferentemente, se añade al inóculo un antibiótico al cual sea
resistente L. intracellularis, por ejemplo vancomicina,
anfotericina B, o miembros del grupo de los antibióticos
aminoglicósidos, que incluyen la gentamicina y la neomicina, por
nombrar algunos, con el fin de eliminar bacterias contaminantes, y
permitir al mismo tiempo el crecimiento de L.
intracellularis. Sea el inóculo un cultivo puro o un
homogenizado intestinal, se puede llevar a cabo la inoculación de
las células de cultivo mediante diversas técnicas conocidas en la
técnica, y basándose en las enseñanzas de la presente memoria.
A continuación se incuban las bacterias y/o las
células de cultivo inoculadas, bajo una concentración disminuida de
O_{2} disuelto. A concentraciones de oxígeno disuelto por encima
de 18%, el crecimiento de L. intracellularis es inferior al
óptimo, y eventualmente se produce el cese del crecimiento a
concentraciones de oxígeno fuera de este intervalo. Las células de
cultivo inoculadas se incuban preferentemente bajo una concentración
de oxígeno disuelto situada dentro del intervalo de aproximadamente
0% hasta aproximadamente 10%. Más preferentemente, se incuban las
células bajo una concentración de oxígeno situada en el intervalo de
aproximadamente 0% a aproximadamente 8%, siendo muy preferida una
concentración de oxígeno de aproximadamente 0% a aproximadamente
3,0%.
También es importante para el crecimiento
adecuado de L. intracellularis una concentración apropiada de
dióxido de carbono. A concentraciones de dióxido de carbono
superiores a 10% e inferiores a 4%, se produce un crecimiento que
no es el óptimo, y eventualmente se produce el cese del crecimiento
a concentraciones de dióxido de carbono fuera de este intervalo.
Con preferencia, la concentración de dióxido de carbono se sitúa en
el intervalo de aproximadamente 6% a aproximadamente 9%, siendo muy
preferida una concentración de dióxido de carbono de
aproximadamente 8,8%.
\newpage
Además, las células son incubadas,
preferentemente, a una concentración de hidrógeno situada en el
intervalo de aproximadamente 73% a aproximadamente 94%. Se puede
emplear nitrógeno en lugar de parte o todo el hidrógeno presente.
Según una realización particularmente preferida, se incuban las
células bajo aproximadamente 0-8,0% de O_{2},
aproximadamente 8,8% de CO_{2}, y aproximadamente 83,2% de
H_{2}.
Se pueden incubar las células inoculadas, en un
incubador de dos gases, o en cualquier otra cámara de gas que
contenga las concentraciones adecuadas de oxígeno y de dióxido de
carbono, y que permita que las células estén suspendidas durante la
incubación. La cámara debe comprender medios para mantener en
suspensión las células inoculadas, y un detector de gases y una
fuente de suministro para aportar y mantener las concentraciones de
gases adecuadas. La temperatura de incubación debe situarse en el
intervalo de 30ºC a 45ºC, y más preferentemente en el intervalo de
aproximadamente 36ºC a aproximadamente 38ºC. Muy preferentemente, la
temperatura es aproximadamente 37ºC. El equipo necesario para los
métodos de cultivo y de atenuación de la invención es fácilmente
asequible para los especialistas con una pericia ordinaria en la
técnica, basándose en las enseñanzas de la presente memoria. Un
ejemplo de equipo adecuado para llevar a cabo la presente invención
es un incubador con dos gases, por ejemplo el modelo 480 disponible
de Lab-Line, Melrose Park, Illinois, junto con
matraces agitados, a fin de mantener en suspensión las células. El
equipo aquí preferido comprende un fermentador, biorreactor o
agitador giratorio que contiene al menos aproximadamente 2 litros
de medio, y que es capaz de mantener en suspensión las células del
cultivo mediante el borboteo de gas con la concentración apropiada,
o bien mediante otros métodos de agitación mecánica, y que controla
de manera continua los niveles de O_{2} disuelto en el medio. New
Brunswick, Braun y otras compañías fabrican fermentadores y
biorreactores adecuados para este fin.
Manteniendo las células inoculadas en un estado
suspendido durante la incubación, se consigue el máximo crecimiento
de las células, y por tanto de L. intracellularis, cuando se
aumenta la exposición de cada célula individual al medio de cultivo
y a la mezcla adecuada de oxígeno y dióxido de carbono. Se pueden
agitar y mantener en suspensión las células de cultivo mediante
diversos métodos conocidos en la técnica, que incluyen, por ejemplo,
frascos de cultivo, botellas rodantes, cultivos de membrana y
matraces agitados. Se pueden mantener en suspensión las células
durante la incubación, incubando dichas células en un matraz agitado
dentro de un incubador de dos gases, o aparato similar. La
expresión "matraz agitado", tal como se emplea en esta memoria,
significa un matraz u otro recipiente que emplea una paleta, una
hélice, u otro medio para agitar el cultivo y mantener en
suspensión las células contenidas en el mismo.
En una realización particularmente preferida de
la invención, se incuban las células inoculadas hasta que alcanzan
la confluencia, y después se transfieren las células a un matraz
agitado que contiene medio de cultivo y se incuban en un incubador
de dos gases mientras se agita el matraz. Preferiblemente, se raspan
las células inoculadas, introduciéndolas en el matraz agitado. Esto
se puede realizar mediante diversos métodos conocidos en la
técnica, por ejemplo empleando un rascador de células para
desprenderlas. Una vez que se han introducido las células en el
matraz agitado, típicamente se hace girar la paleta del matraz
agitado a una velocidad en el intervalo de aproximadamente 30 a
aproximadamente 60 rpm, para mantener en suspensión las células
infectadas.
Después se traspasa una porción de las L.
intracellularis cultivadas a células de cultivo nuevas, para
incrementar la producción de bacterias de L. intracellularis.
El término "traspasar", o variaciones del mismo, significa en
la presente memoria el proceso de transferir una porción de las
L. intracellularis cultivadas a células de cultivo nuevas,
para infectar las células nuevas con la bacteria. La expresión
"células nuevas", tal como se emplea en esta memoria,
significa que no han sido infectadas hasta ese momento por L.
intracellularis. Preferiblemente, dichas células no tienen, por
término medio, más de aproximadamente un día de edad.
El traspaso de L. intracellularis en
cultivos en suspensión puede efectuarse retirando una porción del
cultivo original y añadiéndolo a un matraz nuevo que contiene
células de cultivo nuevas. Si el cultivo original contiene un
elevado número de bacterias por mililitro, por ejemplo más de
aproximadamente 10^{4} bacterias/ml, es preferible añadir entre
aproximadamente 1 y 10% (volumen/volumen) de cultivo desde el matraz
infectado al matraz nuevo que contiene células nuevas. Esto se
realiza preferiblemente cuando se ha infectado
50-100% de las células. Si están infectadas menos
de 50% de las células, el traspaso se realiza preferiblemente
dividiendo el cultivo en proporción 1:2 a un frasco nuevo, y
aumentando el volumen mediante la adición de medio nuevo. En
cualquier caso no son necesarias lisis celulares ni otras
operaciones, lo que contrasta directamente con lo que ocurre en el
traspaso de cultivos en monocapa, tal como se realizaba en la
técnica anterior.
Tras un crecimiento suficiente de las células en
cultivo y la subsiguiente infección por L. intracellularis,
con una infectividad superior a aproximadamente 70% de las células,
lo que se determina mediante IFA, TCID_{50} u otro método
comparable, se cosecha al menos una porción de las bacterias L.
intracellularis cultivadas. La operación de recolección se
puede llevar a cabo separando las bacterias y extrayéndolas de la
suspensión mediante diversas técnicas, conocidas por los
especialistas con una pericia ordinaria en la técnica, basándose en
las enseñanzas de la presente memoria. Preferiblemente, las
bacterias de L. intracellularis se cosechan centrifugando el
contenido de toda la suspensión, o una parte de la misma, para
aglomerar las células del cultivo en forma de un sedimento,
resuspendiendo los sedimentos celulares resultantes, y lisando las
células infectadas. Típicamente, al menos una porción del contenido
es centrifugada a aproximadamente 3000 x g durante unos 20 minutos,
para formar un sedimento de células y bacterias. Después se puede
resuspender el sedimento en, por ejemplo, una solución de
sacarosa-fosfato-glutamato (SPG), y
se hace pasar unas cuatro veces a través de una aguja de calibre 25
para lisar las células. Si se desea una purificación adicional, se
pueden centrifugar las muestras a aproximadamente 145 x g durante
unos cinco minutos para eliminar los núcleos y restos celulares.
Después se puede centrifugar el sobrenadante a aproximadamente 3000
x g durante unos veinte minutos, y resuspender el sedimento
resultante en un diluyente adecuado, por ejemplo SPG con suero fetal
de bovino (para hacer que las bacterias cosechadas sean adecuadas
para la congelación o para el empleo como inoculante) o bien medio
de cultivo (para hacer a las bacterias cosechadas más adecuadas para
el traspaso a células nuevas).
Tal como se ha mencionado antes, se incrementa
el crecimiento eficaz de L. intracellularis para la
producción a gran escala si se mantienen las células del tejido
creciendo activamente. Con monocapas, cuando los cultivos se hacen
confluentes, la velocidad de división celular disminuye
sustancialmente. Los intentos de cultivar L. intracellularis
en cultivos de tejidos en monocapa han tenido un éxito limitado, y
no ha sido posible su aumento de escala. Sin embargo, el empleo de
cultivos en suspensión facilita en gran medida el mantener a las
células en crecimiento activo, y permite la expansión continua del
cultivo y el aumento de escala. Empleando un fermentador y
aproximadamente entre 0 y 3% de O_{2} disuelto, tal como se ha
explicado antes, los autores de la invención han sido capaces de
cultivar hasta 10^{8} bacterias/ml. Los autores de la invención
han sido capaces también de mantener las bacterias cultivadas en un
crecimiento activo durante muchos meses, y esperan ser capaces de
hacerlo así de manera indefinida.
Antes de la presente invención, se creía
generalmente que las células debían estar unidas a una superficie
para ser infectadas por L. intracellularis. Las suspensiones
de células de la presente invención son únicas, y contradicen esta
teoría. Cuando se emplean células McCoys o IEC-18,
es preferible añadir junto con el medio de cultivo perlas de
gelatina, agarosa, colágeno, acrilamida o sílice, por ejemplo los
microsoportes porosos Cultisphere-G fabricados por
HyClone Laboratories, Logan, UT. Sin embargo, según el método de
cultivo de la invención, las células HEp-2 y otras
no precisan microsoportes. Esto proporciona una vía especialmente
ventajosa y económica para el cultivo a gran escala.
Para el mantenimiento del cultivo, en el caso de
cultivos de HEp-2, preferiblemente se retira con
periodicidad semanal 25-50% del cultivo y se
reemplaza con medio nuevo. Para cultivos celulares con microsoportes
o perlas, se retira preferiblemente 25-50% del
cultivo, y se reemplaza con microsoportes o perlas nuevos, y medio
nuevo, 1-2 veces por semana. Si se quiere
incrementar la escala se puede añadir al cultivo
25-50% adicional de medio, o de medio con
microsoportes.
Dependiendo de la velocidad con la que se
infecten las células del cultivo, el traspaso a células nuevas se
produce por regla general a intervalos de aproximadamente cada 2 a
aproximadamente 5 semanas. Suponiendo que al menos 70% de las
células de cultivo quedan infectadas en el transcurso de
2-3 semanas, el traspaso tiene lugar con
preferencia aproximadamente cada 3 a 4 semanas.
La presente invención proporciona también
vacunas y métodos para producir vacunas contra L.
intracellularis. Según una realización particularmente
preferida, tras haber mantenido las células en suspensión durante un
período de tiempo prolongado (por ejemplo, 6-8
meses), se cosecha al menos una porción de las bacterias L.
intracellularis cultivadas, y se analiza en busca de una
potencial atenuación. Este análisis se efectúa preferiblemente
mediante pruebas de exposición en animales anfitrión o modelos
animales, para seleccionar una cepa atenuada. Dichas cepas
atenuadas se emplean en vacunas según los métodos que se enseñan en
la presente memoria. Las vacunas con L. intracellularis
atenuadas de acuerdo con la presente invención han demostrado su
eficacia contra la infección por L. intracellularis en
diversos animales, y se espera que también sean eficaces en seres
humanos.
La presente invención permite una rápida
expansión del cultivo, un incremento de 100-1000
veces en el rendimiento, y un coste reducido. En consecuencia, el
abundante suministro de bacterias de L. intracellularis
producido según el método de cultivo de la invención es atenuado
fácilmente a fin de producir vacunas. La atenuación es difícil en
cultivos en monocapa debido al bajo rendimiento de bacterias
obtenido mediante el empleo de técnicas de cultivo en monocapa
convencionales. Por el contrario, el método de cultivo de L.
intracellularis de la presente invención aumenta enormemente la
facilidad, la rapidez y el número de bacterias disponibles para
dicho fin. Cuanto mayor es el número de células que se producen y el
número de divisiones celulares que tienen lugar, mayor es el nivel
de mutaciones que suceden, lo cual resulta ventajoso para el
desarrollo de vacunas. El cultivo en el seno de suspensiones, de
acuerdo con la invención, incrementa la expresión de importantes
inmunógenos controlados por genes regulados por el entorno y sus
productos de expresión.
Las cepas atenuadas resultantes pueden ser
cultivadas en monocapas de cultivo de tejido tal como se describe
más adelante en el Ejemplo 1, pero preferiblemente son cultivadas en
cultivos en suspensión de acuerdo con el método de la invención.
Otros medios de atenuación pueden incluir la atenuación química
mediante el empleo, por ejemplo, de
N-metilnitrosoguanadina y otras sustancias conocidas
en la técnica. Sea mediante múltiples traspasos, o sea por medios
químicos, se produce una L. intracellularis atenuada, que es
seleccionada para preparar vacunas.
De acuerdo con una realización de vacuna de la
invención., el antígeno se recolecta mediante centrifugación o
microfiltración según se describe antes. A continuación, el antígeno
se estandariza a un nivel definido basado en la respuesta inmune
óptima del animal hospedante, determinado por una titulación de la
dosis en la especie del animal hospedante. Las bacterias se pueden
inactivar mediante exposición prolongada, por ejemplo una semana, a
niveles de O_{2} ambiente, o utilizando formalina al 0,3% u otro
agente inactivamente para preparar una vacuna exterminada. El
antígeno se incorpora luego en un adyuvante adecuado, tal como
hidróxido de aluminio o aceite mineral, para reforzar la respuesta
inmune. Después, el antígeno se utiliza para vacunar al hospedante
a través de inyección intramuscular o subcutánea, en el caso de
cerdos de aproximadamente 3-4 semanas de edad, con
una dosis de refuerzo si es necesaria.
Alternativamente, de acuerdo con una realización
de vacuna particularmente preferida utilizando los métodos de
cultivo previamente descritos, las bacterias se hacen pasar en serie
para inducir y seleccionar un cultivo vivo atenuado y avirulento.
El cultivo se testa en el animal hospedante (después de
preferiblemente al menos 6 a 8 meses o más de desarrollo en el
cultivo en suspensión) en cuanto a signos de atenuación. El cultivo
se recolecta según se describe antes y se diluye. A los cerdos, por
ejemplo, se les vacuna por vía oral con 1 X 10^{5} a 1 X 10^{6}
bacterias. Aproximadamente veintiocho días después de la
vacunación, a los cerdos se les inocula por vía oral con
aproximadamente 1 X 10^{7} organismos procedentes de un cultivo de
L. intracellularis menos virulento traspasado
(aproximadamente de 30 a 45 días de edad). Los animales infectados
se necropsizan 21 días después del enfrentamiento y se observan los
intestinos delgados tanto en cuanto a lesiones toscas como también
lesiones microscópicas. También se debería realizar una PCR y un
anticuerpo fluorescente. Aproximadamente el ochenta por ciento de
los animales control mostrarán también lesiones toscas o
microscópicas y testarán ser positivos en cuanto a la presencia de
L. intracellularis en las células de la mucosa de los
intestinos utilizando métodos de ensayo de PCR o FA. Los animales
vacunados tendrán superficies de la mucosa normales según se
determina por observaciones histológicas y serán negativos por
ensayo PCR.
Por regla general, se produce una cepa de L.
intracellularis inmunogénica atenuada tras un cultivo continuo
durante al menos aproximadamente 150 a 250 días, y durante este
tiempo el cultivo es traspasado al menos unas 7 a 12 veces. Se
pueden producir otros cultivos atenuados en los cuales estas cifras
son distintas, siempre que se utilicen los métodos de control y
selección que se enseñan en la presente memoria.
Luego se prepara una vacuna que comprende una
cantidad inmunológicamente eficaz de L. intracellularis
atenuada en un soporte farmacéuticamente aceptable. El inmunógeno y
soporte combinados pueden ser una solución, emulsión o suspensión
acuosa. Una cantidad inmunológicamente eficaz se puede determinar
por medios conocidos en la técnica sin una experimentación
indebida, dadas las enseñanzas contenidas en esta memoria. En
general, la cantidad de inmunógenos oscilará entre 50 y 500
microgramos y, de preferencia, entre 10^{7} y 10^{6} y
TCD_{50}, cuando se utilizan bacterias purificadas.
Las vacunas de acuerdo con la invención se
administran generalmente a animales susceptibles, preferiblemente
cerdas, en una o más dosis. La vacuna viva o exterminada se puede
administrar 1 ó 2 veces a intervalos de 2 semanas. Para las vacunas
vivas atenuadas, se prefiere una dosis. Las vías preferidas de
administración de cepas atenuadas vivas son la oral o intranasal,
pero también se puede utilizar la inyección intramuscular o
subcutánea. Las vías de inyección intramuscular y subcutánea son las
más preferidas para la vacuna exterminada.
El diagnóstico eficaz de PPE también ha sido
impedido por el tiempo requerido para cultivar las bacterias
causantes. Como resultado de la presente invención, ahora es posible
el desarrollo de herramientas de diagnóstico que fomenten ensayos
rápidos y fiables en cuanto a la presencia de L.
intracellularis en muestras biológicas tomadas de cerdas y
otros animales susceptibles a PPE.
Las bacterias L. intracellularis
desarrolladas de acuerdo con el método de la presente invención, o
componentes derivados de bacterias de este tipo, se pueden utilizar
con un antígeno en un ELISA u otro inmunoensayo, tal como el ensayo
de anticuerpos inmunofluoroescentes ("IFA"), para detectar
anticuerpos contra L. intracellularis en el suero u otros
fluidos corporales de animales de los que se sospecha están
infestados con la bacteria. El inmunoensayo actualmente preferido
es un IFA según se describe en el ejemplo que figura más abajo.
Alternativamente, las bacterias desarrolladas de acuerdo con la
invención se pueden utilizar en un ensayo de transferencia
Western.
El protocolo ELISA preferido de acuerdo con esta
realización de la invención es como sigue:
- 1.
- Añadir 0,1 ml/pocillo de antígeno diluido en tampón de revestimiento. Incubar durante 18 horas a 4ºC.
- 2.
- Lavar 3 veces con PBS.
- 3.
- Añadir 0,25 ml de tampón de bloqueo a cada pocillo de la placa. Incubar 1 ó 2 horas a 37ºC.
- 4.
- Lavas 3 veces con tampón de lavado.
- 5.
- Diluir el suero en tampón de bloqueo y añadir 0,1 ml a los primeros pocillos de la placa. Hacer diluciones en serie 1:2 a lo largo de la placa. Incubar durante 1 hora a 37ºC.
- 6.
- Lavar 3-5 veces con tampón de lavado.
- 7.
- Diluir el conjugado en tampón de bloqueo y añadir 0,1 ml a pocillos de la placa e incubar durante 1 h a 37ºC.
- 8.
- Lavar 3-5 veces con tampón de lavado.
- 9.
- Añadir sustrato.
- 12.
- Medir la absorbancia de la luz con un espectrofotómetro.
- 13.
- Los pocillos en los que no se añadió antígeno se utilizan como patrones.
- 14.
- Con cada ensayo también se debería utilizar suero de cerdo control positivo y negativo.
\vskip1.000000\baselineskip
El protocolo de la transferencia Western
preferido es como sigue:
- 1.
- Hacer pasar antígeno sobre SDS-PAGE al 12% y transferir a membrana de nitrocelulosa.
- 2.
- Colocar la membrana en tampón de bloqueo durante 2 h.
- 3.
- Retirar el tampón de bloqueo y aclarar con PBS durante 1 minuto.
- 4.
- Diluir el suero en tampón de bloqueo y añadir a la membrana. Incubar durante 2 horas a la temperatura ambiente.
- 5.
- Lavar 3 veces con tampón de lavado (5 minutos para cada lavado)
- 6.
- Diluir el conjugado en tampón de bloqueo y añadir a la membrana. Incubar durante 1 h a la temperatura ambiente.
- 7.
- Lavar 3 veces con tampón de lavado.
- 8.
- Añadir sustrato durante 10 minutos o hasta que se produzca un bandeo fuerte.
- 9.
- Aclarar con PBS.
- 10.
- Secar al aire y almacenar en la oscuridad.
La presente invención queda descrita
adicionalmente en los siguientes ejemplos, que se proporcionan sólo
con fines ilustrativos, y no deben ser considerados limitantes.
La muestra N24912 fue obtenida de una piara
criada en una granja del estado de Iowa, en la cual se observaron,
en quince animales de un total de 300 cerdos de engorde de cinco
meses de edad, heces sanguinolentas persistentes a pesar del
tratamiento con penicilina. Al efectuar la necropsia de estos
animales, el intestino (el íleon) presentaba una mucosa engrosada.
Los exámenes histopatológicos mediante tinción con plata demostraron
la presencia de bacterias intracelulares curvadas e hiperplasia
enterocítica críptica, lo cual confirmó el diagnóstico de PPE. La
muestra N72994 fue obtenida de una cerda SPF de segunda camada, de
1,5 años de edad, criada en una granja del estado de Minnesota.
La piara tenía un tamaño de entre 70 y 80
animales, y se desconoce su tratamiento con antibióticos. Al
efectuar la necropsia, la mucosa del íleon estaba engrosada,
observándose cierta hemorragia. La tinción Giminez de la mucosa
demostró gran número de bacterias curvadas. La muestra N101494 fue
obtenida de un cerdo de 12 semanas de edad, criado en una granja
del estado de Indiana, con 600 cerdas en fases comprendidas desde la
crianza hasta la finalización. El cerdo había sido tratado con
Tylan inyectable desde el comienzo de la diarrea hemorrágica, pero
el animal murió poco tiempo después del tratamiento.
Las muestras de intestinos habían sido
conservadas a -70ºC. Se abrieron los intestinos, y se lavaron con
solución salina tamponada con fosfato (siglas inglesas PBS). Se
trocearon muestras de un gramo de mucosa dentro de glutamato
sódico-potásico (siglas inglesas SPG), y se
homogenizó durante 30 segundos con 4,0 ml de tripsina al 1% (JRH
Biosciences, Lenexa, KS) en SPG. Se incubaron las suspensiones
durante 35 minutos a 37ºC. Se añadieron diez mililitros de
SPG/suero fetal de bovino (siglas inglesas FCS) al 10% (JRH
Biosciences, Lenexa, KS), y se trituraron las muestras en una
trituradora de tejidos durante 1 minuto. Se añadieron diez
mililitros de SPG/FCS al 10%, y se filtró una vez a través de papel
de filtro (Whatman 113V; Whatman Labsales, Hillsboro, OR) y después
a través de filtros de membrana en una secuencia de 5,0, 1,0 y 0,65
micrómetros. Se dividieron en alícuotas los filtrados, y se
congelaron a -70ºC en porciones alícuotas de 1,0 ml. Se realizó un
frotis de mucosa sobre un portaobjetos, para realizar la tinción
Giminez. Se tiñeron con IFA distintos frotis de filtrados,
empleando un anticuerpo monoclonal específico para L.
intracellularis (S. McOrist y otros, Vet. Rec.
121:421-422 (1987)) (incorporada en su totalidad en
esta memoria como referencia).
Se cultivaron células IEC-18
(células epiteliales del intestino de rata, ATCC CRL 1589) en DMEM
(JRH Biosciences, Lenexa, KS) con L-glutamina y FCS
al 10%, y se traspasaron con tripsina de manera rutinaria una vez
por semana. Se cultivaron monocapas de células a 37ºC en aire con
5% de CO_{2}.
Se sembraron las células IEC-18
a razón de 1,25 x 10^{5} células en frascos de 25 cm^{2}, y en
cantidades comparables también en portaobjetos de cámara (Nunc,
Inc., Naperville, IL), se incubaron durante 24 horas, y después se
eliminó el medio. Se descongelaron rápidamente aislados bacterianos
derivados de cerdos, se diluyeron en DMEM/FCS al 7% con vancomicina
(100 \mug/ml) y anfotericina B (2,0 \mug/ml) en proporción de
1,0 ml de homogeneizado para cada 15 ml de medio, y se añadieron a
las monocapas. Se centrifugaron las monocapas y las suspensiones
bacterianas durante 30 minutos a 2000 g, y se transfirieron a
botellas anaeróbicas. Se hizo el vacío en las botellas, y se
sustituyó el gas con hidrógeno y dióxido de carbono para
proporcionar una mezcla de 8,0% de O_{2}, 10% de CO_{2} y 82%
de H_{2}. Se incubaron los cultivos durante 3 horas a 37ºC, y
después se repuso DMEM/FCS al 7% con L-glutamina,
vancomicina (100 \mug/ml), neomicina (50 \mug/L), y
anfotericina B (2,0 \mug/ml). Se devolvieron los cultivos a las
botellas anaeróbicas, y se incubaron durante 6 días, cambiando el
medio cada 2 días.
Se traspasaron bacterias de L.
intracellularis mediante lisis celular, empleando cloruro
potásico de la manera descrita anteriormente en el artículo de G.
Lawson y otros, J. Clin. Microbiol., 31:1136-1142
(1993) (incorporada en su totalidad en esta memoria como
referencia), y después se añadieron a monocapas de
IEC-18 recientes. Por decantación se separó el
medio de las monocapas, se añadió KCl al 0,1% y se incubaron las
células durante 10 minutos a 37ºC. Se eliminó el KCl, se añadió
SPG/FBS al 10%, y se arrancaron mecánicamente las monocapas con un
rascador de células. Se lisaron las células haciéndolas pasar tres
veces a través de una jeringa con una aguja de calibre 21. Se
eliminaron los núcleos de las células por centrifugación a 100 x g
durante 5 minutos, y se añadió la suspensión bacteriana, que
constituía el fluido sobrenadante, a monocapas de células
IEC-18 recientes, con 1 día de edad.
Se controló la infección fijando las células en
portaobjetos con cámara, por medio de acetona/metanol fríos,
durante 5 minutos. La tinción se llevó a cabo mediante métodos de
inmunofluorescencia e inmunoperoxidasa. Ambos métodos empleaban un
anticuerpo monoclonal de ratón (tal como se describe en el artículo
de S. McOrist y otros, Vet. Rec. 121:421-422
(1987)) como anticuerpo primario y, o bien conjugado de
G-fluorochrome (isotiocianato de fluoresceína;
Organon Teknika Corporation, Durham, NC) e inmunoglobulina
anti-ratón, o bien conjugado de peroxidasa (e
inmunoglobulina G anti-ratón, de cabra; Kirkegaard
and Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD). La cuantificación
de las bacterias se efectuó contando el número de bacterias
específicamente teñidas dentro de las células en cada
portaobjetos.
Se incorporaron a una reacción en cadena de la
polimerasa (siglas inglesas PCR) los inóculos de muestra y las
bacterias traspasadas, como plantilla de ADN, utilizando el mismo
método de preparación de las muestras, los mismos cebadores, y los
mismos parámetros de ciclo descritos por Jones y otros, en J. Clin.
Microbiol., 31:2611-2615 (1993), y por McOrist y
otros, Vet: Microbiol. 1-8 (1994) (incorporadas en
cada caso en su totalidad en esta memoria como referencia). Los
parámetros de ciclo fueron 93ºC durante 5 minutos, 55ºC durante 45
segundos y 72ºC durante 45 segundos para el primer ciclo. Se
llevaron a cabo treinta y tres ciclos a las temperaturas antes
mencionadas, durante 45 segundos por temperatura, así como un ciclo
a 93ºC durante 45 segundos, 55ºC durante 45 segundos y 72ºC durante
2 minutos. Para inocular las células IEC-18 se
emplearon sólo inóculos positivos. También se efectuó la PCR para
controlar el material de traspaso, y confirmar las infecciones.
Para determinar su secuencia, el ADN producido mediante PCR fue
remitido a la Nucleic Acid Facility (instalaciones para ácidos
nucleicos) de Iowa State University. Se compararon los resultados de
la determinación de la secuencia con los obtenidos por Gary F.
Jones, tal como están descritos en su tesis doctoral en la
Universidad de Minnesota, Minneapolis, MN (junio de 1993).
Los cerdos identificados con los números N24912
y N72994 presentaban una PPE grave, con contenido intestinal
hemorrágico y mucosa engrosada. N101494 presentaba PPE grave e
intensa hemorragia, que había originado un gran coágulo de sangre
en la luz intestinal. La tinción Giminez de los frotis de mucosa
evidenció un gran número de bacterias curvadas o con forma de S. La
tinción con IFA puso de manifiesto gran número de bacterias con
fluorescencia brillante en inóculos bacterianos derivados de
cerdos.
Se observaron mediante microscopía óptica las
monocapas inoculadas, durante todo el ciclo de crecimiento,
observándose escaso cambio morfológico de las células. Cultivadas
bajo presión de oxígeno reducida (8% de O_{2}), las monocapas que
no habían sido infectadas presentaron una morfología similar.
Los cultivos infectados, teñidos por
inmunofluorescencia e inmunoperoxidasa, revelaron un gran número de
bacterias curvadas o con forma de S, específicamente teñidas,
aparentemente en el interior de las células. Las monocapas no
presentaron infección confluente. Las células infectadas se
presentaban a menudo estrechamente asociadas con focos infectados
de 1-10 células. También se observaron células
intensamente infectadas (es decir, células con 30 o más bacterias)
en asociación con células que tenían menos de 30 bacterias. El
número de bacterias alcanzó su máximo aproximadamente a los 6 días.
La infección dependió de las condiciones de cultivo específicas.
Las bacterias fueron traspasadas satisfactoriamente mediante el
procedimiento de lisis celular que se describe en la presente
memoria. La centrifugación de células inoculadas por vez primera no
era imprescindible, pero incrementó el número de células
infectadas. La centrifugación también disminuyó la contaminación al
permitir realimentar a las 3 horas con medio que contenía
antibiótico, a células expuestas a la infección en medio exento de
antibiótico. Fue necesario disminuir la concentración de FCS en el
medio, de 10% a 7%, para aminorar el crecimiento de las células
IEC-18, permitiendo que las bacterias proliferasen
en un número más elevado, antes de que las monocapas llegasen a ser
confluentes.
La PCR del ADN cromosómico generó un
sub-fragmento de 319 pares de bases (contando los
cebadores) a partir de cualquiera de los aislados. Se comparó
visualmente un fragmento de tamaño adecuado, con una muestra
positiva conocida generada por McOrist y otros (1994) por medio de
PCR. El análisis de la secuencia de los productos PCR de N24912,
N72994 y N101494 confirmó una estrecha homología
(97-99%) respecto a la secuencia p78 determinada
por Jones (1993).
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon homogeneizados intestinales
separando por raspado la mucosa de una porción de 6,0 a 8,0 cm de
íleon de las muestras de intestino del Ejemplo 1. Se añadió tripsina
(1%) a la mucosa raspada, se homogeneizaron brevemente las
muestras, y después se incubaron durante 35 minutos a 37ºC. A
continuación se añadieron diez ml de SPG/FBS al 10%, y se
trituraron las muestras en una trituradora de tejidos. Se añadieron
otros 10 ml de SPG/FBS al 10%. Se hicieron pasar los homogeneizados
a través de un filtro Whatman V113, y después sucesivamente a
través de filtros de 5,0, 1,0 y 0,65 \mum. Se dividieron las
muestras en alícuotas de 1 ml, y se congelaron a -70ºC.
Método
A
Se sembraron células de tejido a razón de 1 X
10^{7} células in 50 ml de DMEM/FBS al 10%, en un matraz agitado
de 100 ml. Se incubaron los cultivos durante 24 h, y después se
añadieron vancomicina y fungizona. Se descongeló rápidamente un
vial de homogeneizado intestinal congelado, y se diluyó en 3,0 ml de
DMEM/FBS al 5% con vancomicina (100 \mug/ml) y anfotericina B
(2,0 \mug/ml). Se hizo pasar la muestra a través de un filtro de
0,65 \mum, y se añadió al matraz. Se dispuso el cultivo en una
cámara de gas, se hizo el vacío, y se repuso el gas con hidrógeno y
dióxido de carbono para proporcionar una mezcla de 8,0% de O_{2},
8,8% de CO_{2} y 83,2% de H_{2}. Se incubaron los cultivos
durante 3 horas a 37ºC, y después se añadieron neomicina y
gentamicina. Se cambió el cultivo a las 24 horas, reponiéndolo con
DMEM/FBS al 5%, que contenía L-glutamina,
vancomicina (100 \mug/ml), neomicina (50 \mug/L), gentamicina
(50 \mug/L) y anfotericina B (2,0 \mug/ml).
Método
B
Se sembraron con 1,25 x 10^{5} células
HEp-2 en DMEM/FBS al 10% dos matraces convencionales
de 25 cm^{2}, y se cultivaron durante 18-24
horas. Las células habían alcanzado 30% de confluencia en el momento
de la inoculación. Se diluyó el inóculo en DMEM/FBS al 5%. Cuando
el inóculo procedía de un homogeneizado intestinal, el medio
contenía también vancomicina (100 \mug/ml) y anfotericina B (2,0
\mug/ml). Se dispusieron los cultivos en una cámara de gas, se
hizo el vacío y se repuso el gas con hidrógeno y dióxido de carbono
para proporcionar una mezcla de 8,0% de O_{2}, 8,8% de CO_{2} y
83,2% de H_{2}. Se incubaron los cultivos durante 3 horas a 37ºC,
y después se añadieron neomicina y gentamicina. Se cambió el medio a
las 24 horas, reponiéndolo con DMEM/FBS al 5%, que contenía
L-glutamina, vancomicina (100 \mug/ml), neomicina
(50 \mug/L), gentamicina (50 \mug/L) y anfotericina B (2,0
\mug/ml). No se precisaron antibióticos cuando el inóculo era un
cultivo puro. Se incubaron los cultivos durante 6 días, o hasta
llegar a la confluencia. Se extrajeron las células de los matraces,
raspándolas, y se añadieron a un matraz agitado de 100 ml que
contenía 50 ml de DMEM/FBS al 5%.
Se diluyó 1:2 el cultivo a intervalos de una
semana, o bien cosechando una mitad del cultivo y añadiendo medio
de cultivo nuevo, o bien traspasándolo a un matraz agitado más
grande, y añadiendo más medio.
Se traspasó el cultivo a células
HEp-2 recientes sembrando estas células
HEp-2 nuevas a una concentración de 1 X 10^{7} en
DMEM/FBS al 5%. Se incubó el nuevo cultivo durante una noche bajo
8,0% de O_{2}, 8,8% de CO_{2} y 83,2% de H_{2}. Después se
inoculó el nuevo cultivo con cultivo infectado, y se incubó bajo
una concentración de O_{2} reducida tal como se ha indicado antes.
Las cantidades de inóculo dependieron del grado de infección del
cultivo original.
Se recolectaron los cultivos retirando la
cantidad deseada de cultivo, y centrifugándola a 3000 x g durante
20 minutos. Se resuspendió el sedimento en solución de
sacarosa-fosfato-glutamato (SPG), y
se hizo pasar esta suspensión 4 veces a través de una aguja de
calibre 25. Se dividieron los cultivos en partes alícuotas, y se
congelaron a -70ºC. Para purificarla aún más, se centrifugó la
muestra a 145 x g durante 5 minutos, a fin de eliminar las perlas,
núcleos celulares y restos de células. Después se centrifugó el
sobrenadante a 3000 x g durante 20 minutos. Por último, se
resuspendió el sedimento en diluyente.
La cuantificación del número de L.
intracellularis viables se realizó determinando la dosis
infecciosa para el 50 por ciento de los cultivos de tejido
(TCID_{50}). Esto se realizó retirando 2,0 ml de cultivo a
ensayar, y lisando las células al hacerlas pasar 4 veces a través de
una aguja de calibre 25. Se diluyó sucesivamente la muestra 1:10 en
DMEM/FBS al 5% que contenía vancomicina (100 \mug/ml) y
anfotericina B (2,0 \mug/ml). Se añadieron las diluciones a una
placa de microvaloración de 96 pocillos, a razón de 0,1 ml por
pocillo. Se sembraron las placas de microvaloración con células
HEp-2 a razón de 1250 células/pocillo, y se
cultivaron durante 18-24 horas antes de la
infección. Se utilizaron entre 3 y 6 pocillos por cada dilución. Se
incubó la placa durante 6 días bajo concentraciones gaseosas de 8,0%
de O_{2}, 8,8% de CO_{2} y 83,2% de H_{2}. Se fijaron las
células con 50% de acetona y 50% de metanol, fríos, durante 2
minutos. Se añadieron a los pocillos 0,03 ml/pocillo de anticuerpo
monoclonal anti-L. intracellularis (McOrist, 1994),
diluido 1:2000 en PBS. Se incubó la placa durante 30 minutos a
37ºC, y después se lavó 3 veces con PBS. Se añadió FITC
anti-ratón, diluido 1:30, en una cantidad de 0,03
ml/pocillo, y se incubó durante 30 minutos a 37ºC. Se lavó la placa
3 veces con H_{2}O bidestilada, y se dejó secar. Se observaron las
muestras bajo un microscopio de fluorescencia, y se determinó la
TCID_{50}/ml.
Los resultados de TCID_{50} indicaron que los
cultivos contenían hasta 1 X 10^{6} bacterias/ml. Esto se
consiguió en 45 días. En el mismo período de tiempo, se había
escalado el volumen de cultivo hasta 3,0 litros.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó un homogeneizado intestinal de la
manera descrita en el Ejemplo 2. El 19 de mayo de 1995 se depositó
en la colección de cultivos tipo estadounidense American Type
Culture Collección (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville,
Maryland U.S.A. 20852, bajo el Tratado de Budapest, una muestra de
L. intracellularis cultivada de acuerdo con el método del
ejemplo siguiente, siendo asignada a dicha muestra el número de
registro de entrada 55672.
Se sembraron con 1,25 x 10^{5} células McCoys
en DMEM/FBS al 10% dos matraces convencionales de 25 cm^{2}, y se
cultivaron durante 18-24 horas. Las células habían
alcanzado 30% de confluencia en el momento de la inoculación. Se
diluyó el inóculo en DMEM/FBS al 5%. Cuando el inóculo procedía de
un homogeneizado intestinal, el medio contenía también vancomicina
(100 \mug/ml) y anfotericina B (2,0 \mug/ml). Se dispusieron los
cultivos en una cámara de gas, se hizo el vacío, y se repuso el gas
con hidrógeno y dióxido de carbono para proporcionar una mezcla de
8,0% de O_{2}, 10% de CO_{2} y 82% de H_{2}. Se incubaron los
cultivos durante 3 horas a 37ºC, y después se añadieron neomicina y
gentamicina. Se cambió el medio a las 24 horas, reponiéndolo con
DMEM/FBS al 5%, que contenía L-glutamina,
vancomicina (100 \mug/ml), neomicina (50 \mug/L), gentamicina
(50 \mug/L) y anfotericina B (2,0 \mug/ml). No se precisaron
antibióticos cuando el inóculo era un cultivo puro. Se incubaron
los cultivos durante 6 días hasta llegar a la confluencia. Se
rasparon las células, extrayéndolas de los matraces, y se añadieron
a un matraz agitado de 100 ml que contenía 50 ml de DMEM/FBS al 2% y
0,05 g de microsoportes Cultisphere-G
Microcarriers. Se agitaron los matraces a 40-50
rpm.
\newpage
Se diluyó 1:2 el cultivo cada
2-3 días, o bien cosechando una mitad del cultivo y
añadiendo medio de cultivo y perlas Cultisphere-G
nuevos, o bien traspasando el cultivo a un matraz agitado más
grande, y añadiendo más medio y más perlas
Cultisphere-G. La concentración final de perlas en
el cultivo era aproximadamente 0,001 g de perlas por mililitro.
Se traspasó el cultivo a células McCoys
recientes sembrando 1 X 10^{7} células McCoys nuevas en DMEM/FBS
al 2% y 0,05 g de perlas Cultisphere-G. Se incubó el
nuevo cultivo durante una noche con 8,0% de O_{2}, 8,8% de
CO_{2} y 83,2% de H_{2}. Después se inoculó el nuevo cultivo con
25 ml de cultivo infectado, y se incubó bajo concentraciones de
O_{2} reducidas, tal como se ha indicado antes.
Se recolectaron los cultivos retirando la
cantidad deseada de cultivo, y centrifugándola a 3000 x g durante
20 minutos. Se resuspendió el sedimento en SPG, y se hizo pasar esta
suspensión 4 veces a través de una aguja de calibre 22. Se
dividieron los cultivos en partes alícuotas, y se congelaron a
-70ºC. Para purificarla aún más, se centrifugó la muestra a 145 x g
durante 5 minutos, a fin de eliminar perlas, núcleos celulares y
restos de células. Después se centrifugó el sobrenadante a 3000 x g
durante 20 minutos. Por último, se resuspendió el sedimento en
diluyente.
La cantidad de L. intracellularis viables
se determinó de la manera descrita en el Ejemplo 2, utilizando una
aguja de calibre 22 para lisar las células y empleando células
McCoys a razón de 1250 células por pocillo para sembrar las placas
de microvaloración.
Los resultados de TCID_{50} indicaron que los
cultivos contenían hasta 1 X 10^{6} bacterias/ml. Esto se
consiguió en menos de un mes. En el mismo período de tiempo, se
había escalado el volumen de cultivo hasta 3,0 litros.
\vskip1.000000\baselineskip
Se completó un estudio con treinta y un cerdos
infectando cerdos convencionales, de 6 semanas de edad, con
cultivos puros de L. intracellularis procedentes de la
muestra N72994. Se dividieron al azar los cerdos en 4 grupos, y se
estabularon por separado. El grupo 1 contenía 7 cerdos, y fue
considerado como el grupo testigo negativo, al cual se le
administró, o bien cultivo de tejido no infectado, o nada. El grupo
2 contenía 8 cerdos, a los que se administraron 10^{7} bacterias
por animal. El grupo 3 contenía 8 cerdos, a los que se
administraron 10^{6} bacterias por animal, y el grupo 4 contenía 8
cerdos, que recibieron 10^{5} bacterias por animal.
Se recogieron muestras fecales con un
bastoncillo los días 0, 7, 14, 21 y 24, para ser ensayadas mediante
PCR. El día 24 se realizó la necropsia a los cerdos, y se extrajeron
el íleon, el yeyuno y el colon, para los análisis mediante PCR,
histopatología, y tinción FA, todos ellos de la manera anteriormente
descrita.
El análisis de la PCR de la mucosa ileal reveló
la presencia de L. intracellularis en el 100% del grupo de
dosis alta, en el 75% del grupo de dosis media, y en el 50% del
grupo de dosis baja. Los resultados de histopatología indicaron un
incremento de células mononucleares en la lámina propia y la
submucosa en el 88% del grupo de dosis alta, en el 75% del grupo de
dosis media, y en el 88% del grupo de dosis baja. Se observó
hiperplasia críptica en el 50% del grupo de dosis alta, en el 63%
del grupo de dosis media, y en el 50% del grupo de dosis baja. La
tinción FA reveló la presencia de L. intracellularis en
cortes de tejido del íleon, del yeyuno y del colon en el 88% del
grupo de dosis alta, en el 63% del grupo de dosis media, y en el 63%
del grupo de dosis baja. Los animales testigo resultaron negativos
respecto a la presencia de L. intracellularis tanto por PCR
como por tinción FA y tinción con plata.
En conclusión, se utilizó con éxito un cultivo
puro para infectar y causar lesiones de PPE. Se cumplieron los
postulados de Koch mediante la identificación y el aislamiento de
L. intracellularis en los animales infectados.
En los animales sometidos a la prueba de
exposición, 100% de los animales que habían recibido dosis alta
confirmaron la recuperación y la identificación por medio de
tinción con plata, tinción FA y PCR.
Se sembró un matraz convencional de 75 cm^{2}
con 3,75 x 10^{5} células HEp-2 en DMEM/FBS al
10%, y se cultivaron durante 18-24 horas a 37ºC y
5% de CO_{2} (las células habían alcanzado 30% de confluencia en
el momento de la inoculación). Se diluyó un vial de N72994 en 15 ml
de DMEM/FBS al 5%. Se dispuso el cultivo en una cámara de gas, se
hizo el vacío, y se repuso el gas con hidrógeno y dióxido de carbono
para proporcionar una mezcla de 8,0% de O_{2}, 8,8% de CO_{2} y
83,2% de H_{2}. Se cambió el medio a las 24 horas, reponiéndolo
con DMEM/FBS al 5%.
Se incubaron los cultivos durante 6 días,
después se rasparon las células, extrayéndolas de los matraces, y
se añadieron a un matraz agitado de 100 ml que contenía 50 ml de
DMEM/FBS al 5%. Se aumentó escalonadamente el volumen del matraz
doblando el volumen de medio de cultivo a intervalos semanales. Se
dejó crecer el cultivo durante tres semanas en el matraz
agitado.
Se cosechó el cultivo centrifugándolo a 3000 x g
durante 20 minutos. Se resuspendió el sedimento en solución de
sacarosa-fosfato-glutamato (SPG) con
FBS al 10%, y se hizo pasar esta suspensión 4 veces a través de una
aguja de calibre 25. Se diluyó el inóculo hasta el volumen final en
SPG/FBS al 10%, y se hicieron diluciones 1:10.
El inóculo para los testigos estaba compuesto
por células HEp-2 no infectadas, diluidas a la misma
concentración de células viables que el cultivo infectado. Se
cosecharon las células del mismo modo que en el caso del cultivo
infectado. Los cerdos testigo recibieron una dosis de células
similar a la del grupo de dosis alta.
La cuantificación del número de L.
intracellularis viables se realizó determinando la dosis
infecciosa de 50 por ciento de los cultivos de tejido
(TCID_{50}). Esto se realizó retirando 2 ml de cultivo a ensayar,
y lisando las células al hacerlas pasar cuatro veces a través de una
aguja de calibre 22. Se diluyó sucesivamente la muestra 1:10 en
DMEM/FBS al 5% que contenía vancomicina (100 \mug/ml) y
anfotericina B (2,0 \mug/ml). Se añadieron las diluciones a una
placa de microvaloración de 96 pocillos, a razón de 0,1 ml por
pocillo. Se sembraron las placas de microvaloración con células
HEp-2 a razón de 2500 células por pocillo, y se
cultivaron durante 18-24 horas antes de la
infección. Se emplearon doce pocillos para cada dilución. Se incubó
la placa durante 6 días bajo concentraciones gaseosas de 8,0% de
O_{2}, 8,8% de CO_{2} y 83,2% de N_{2}. Se fijaron las
células con 50% de acetona y 50% de metanol, fríos, durante 2
minutos. Se añadieron a los pocillos 0,03 ml de anticuerpo
monoclonal anti-L. intracellularis (McOrist, 1987),
diluido 1:2000 en PBS, por cada pocillo. Se incubó la placa durante
30 minutos a 37ºC, y después se lavó 3 veces con PBS. Se añadió FITC
anti-ratón, diluido 1:30, en una cantidad de 0,03
ml/pocillo, y se incubó durante 30 minutos a 37ºC. Se lavó la placa
3 veces con H_{2}O bidestilada, y se dejó secar. Se observaron las
muestras bajo un microscopio de fluorescencia, y se determinó la
TCID_{50}/ml.
El Dr. Kent Schwartz proporcionó treinta y un
cerdos, de seis semanas de edad, y de distinto sexo, procedentes de
hembras PIC x Lieske, y machos blancos de gran tamaño. El día 0 se
distribuyeron los cerdos al azar, en función de su peso, entre
cuatro corrales.
Se utilizaron para alojar a los animales cuatro
corrales dentro de las instalaciones de un pequeño criadero,
estando los corrales separados entre sí al menos 90 cm. Los corrales
tenían suelo de alambre y divisores laterales enteros. Una estufa
proporcionaba el calor, y se complementaba por zonas con lámparas
térmicas. Durante todo el estudio se mantuvo la temperatura entre
25 y 30ºC.
Los animales tuvieron acceso sin restricciones a
una dieta a base de maíz y soja molidos, con 19% de proteína, y
exenta de antibióticos, en comederos de acero inoxidable. Se
proporcionó agua a voluntad mediante bebederos de chupete.
El día 0 se pesó cada animal, y se extrajeron
muestras de sangre mediante un tubo capilar aplicado al seno
retroorbital. Se separó el suero y se conservó congelado a -20ºC.
También se recogieron con bastoncillos muestras fecales para la
PCR. Se administró a los animales 10 ml de inóculo por vía
intragástrica, por medio de un tubo hasta el estómago.
Los días 0, 10, 17 y 24 se pesó cada animal, y
se le extrajo sangre.
Se controló mediante PCR la infección de los
cerdos, empleando los cebadores y parámetros de ciclo descritos por
Jones (1993). Los días 0, 7, 14, 21, y 24 se obtuvieron muestras
fecales y de la mucosa de los intestinos, y se analizaron mediante
PCR.
Se fijaron con formol cortes del íleon, del
yeyuno y del colon, se elaboraron de la manera usual, se tiñeron
con hematoxilina y con eosina, y también mediante impregnación con
plata, y se evaluaron. También se tiñeron cortes por medio de
anticuerpos monoclonales específicos para L.
intracellularis.
A los 3 días se observaron por primera vez
signos clínicos, consistentes en heces sueltas, en el grupo de
dosis alta. Los signos presentaron su máximo a los 14 días, y
después comenzaron a remitir.
Se calcularon los aumentos diarios de peso,
encontrándose que los grupos de dosis alta y media presentaban
menores aumentos de peso que el grupo testigo. Cuando se comparaban
los aumentos de peso, se observó que el efecto tenía relación
directa con la dosis.
No se observó diarrea hasta el día 14. A los 21
días, 37,5% de los cerdos con dosis alta resultaron positivos según
la PCR de las heces. Tras la necropsia, se analizaron mediante PCR
las mucosas del íleon, resultando positivo el 100% de los animales
con dosis alta, el 75% de los de dosis media, el 50% en el caso de
la dosis baja y el 0% en los testigos.
Se hallaron lesiones de gran tamaño en 2 cerdos
del grupo de dosis alta (animales números 50 y 202). Dichos cerdos
presentaban aproximadamente 90 cm de engrosamiento del íleon, con
necrosis en el animal número 202.
La tinción FA de cortes de tejido del íleon, del
yeyuno y del colon reveló la presencia de L. intracellularis
en el 87,5% del grupo de dosis alta, en el 62,5% del grupo de dosis
media, en el 62,5% del grupo de dosis baja, y en el 0% de los
testigos.
Se observaron lesiones en el 100% del grupo de
dosis alta, en el 75% del grupo de dosis media, en el 87,5% del
grupo de dosis baja y en el 14% de los testigos. Estos valores
fueron determinados mediante la observación del incremento de
células mononuclares en la lámina propia y en la submucosa, a menudo
asociado con hiperplasia de las placas de Peyer. También se observó
hiperplasia críptica.
También se tiñeron con plata los cortes, en
busca de bacterias curvadas intracelulares. Este método demostró la
presencia de bacterias en el 87,5% del grupo de dosis alta, en el
62,5% del grupo de dosis media, en el 87,5% del grupo de dosis baja
y en el 0% de los testigos.
Los cerdos fueron infectados satisfactoriamente
con cultivos puros de L. intracellularis. A dosis de 10^{7}
bacterias, 100% de los animales mostraron infección según la PCR y
las lesiones microscópicas. La gravedad de las lesiones y la
cantidad de bacterias en los cortes de tejido eran relativamente
bajas. Este estudio es un modelo satisfactorio de prueba de
exposición deliberada a L. intracellularis tal como confirman
la presencia de L. intracellularis en los cerdos y sus
lesiones microscópicas. Las lesiones pueden aumentar si se
administra una segunda dosis 7 días después de la primera dosis.
\vskip1.000000\baselineskip
Evaluar un modelo en animales de laboratorio
para determinar la seguridad y la eficacia en hámsters de una
vacuna viva avirulenta de L. intracellularis.
Se completó un estudio con 40 hámsters vacunando
hámsters de 3 semanas de edad con cultivos puros de una cepa de
L. intracellularis con elevado número de traspasos, y
exponiendo a los animales, 22 días después de la vacunación, a
cultivos puros de material virulento, con bajo número de traspasos.
Se dividió a los hámsters en 3 grupos. Se vacunó al grupo A con 1
dosis de la cepa N72994 de L. intracellularis el día 0. El
grupo B fue designado grupo testigo, y no se le administró ningún
cultivo de vacuna. Se expuso a los animales de ambos grupos a la
infección administrándoles 2 dosis de un cultivo puro de la cepa
N343 de L. intracellularis los días 22 y 25 después de la
vacunación. Al grupo C se le administró la cepa de prueba, N101494,
a fin de comparar su virulencia relativa frente a la cepa N343. Los
grupos A y B contenían cada uno 15 hámsters, y el grupo C contenía
10 hámsters. Los resultados de las determinaciones de la dosis
infecciosa al 50% con cultivo de tejidos (TCID_{50}) indicaron
que los hámsters habían quedado vacunados con 10^{5} TCID_{50}
por dosis. La prueba de infección con N343 contenía 10^{5.5}
TCID_{50}/dosis. La dosis de prueba para el grupo C fue
10^{2,75} TCID_{50}/dosis. Se recogieron muestras fecales
mediante bastoncillos los días 0, 7, 14, 21, 29, 36 y 43 para ser
analizadas mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El
día 21 se sacrificaron 5 animales de cada uno de los grupos A y B,
y se efectuó su necropsia, para analizar las mucosas mediante PCR,
y mediante tinción FA, tinción con hematoxalina y con eosina, y
tinción con plata, de cortes de íleon, a fin de determinar la
persistencia de la colonización por bacterias en los hámsters
vacunados. Los restantes animales fueron sacrificados 21 días
después de la prueba de infección, y se efectuó su necropsia
mediante un ensayo similar.
Los resultados de la PCR indicaron la presencia
de L. intracellularis, 21 días después de la vacunación, en
las mucosas intestinales de 100% de los hámsters del grupo A. Todos
los hámsters del grupo B resultaron negativos 21 días después de la
vacunación. Veintiún días después de la exposición de prueba, 50% de
los hámsters resultaron positivos por PCR en el grupo A, y 100%
resultaron positivos en el grupo B. La histopatología de los cortes
indicó lesiones de ligeras a graves en 50% de los animales del grupo
A y lesiones ligeras en 50% del grupo B 21 días después de la
prueba de exposición. Ningún animal presentaba lesiones 21 días
después de la vacunación. Los animales del grupo C no presentaban
lesiones 21 días después de la prueba de exposición. La tinción FA
y la tinción con plata no pudieron demostrar la presencia de L.
intracellularis en ninguno de los cortes.
En conclusión, se observó una reducción de 50%
de la infección, demostrada por PCR, en hámsters vacunados con una
cepa de L. intracellularis que había experimentado un elevado
número de traspasos. Los intestinos fueron colonizados por un
número escaso de organismos intracelulares, como lo demuestra la
falta de organismos observados en los cortes teñidos con FA y
teñidos con plata. Los hámsters del grupo C no mostraron infección
en ningún momento del estudio, muy probablemente a causa de la baja
dosis de bacterias.
Se emplearon cuarenta hámsters hembra, de 3
semanas de edad, de la raza Harlan Sprague Dawley.
Se empleó un cultivo continuo de L.
intracellularis cultivado en células HEp-2
durante 29 semanas. El cultivo fue cultivado de una manera similar
a la que se indica en el apartado del cultivo para la prueba de
exposición, salvo por el hecho de que se traspasaba el cultivo a
células HEp-2 nuevas cada 2-3
semanas.
Se sembró un frasco de cultivo convencional, de
75 cm^{2}, con 3,75 x 10^{5} células McCoys en medio de Eagle
modificado por Dulbecco (siglas inglesas DMEM), con suero fetal de
bovino (siglas inglesas FBS) al 10%, y se cultivó durante
18-24 horas a 37ºC, con 5% de CO_{2}. Se retiró el
medio de cultivo de las células, y se añadió al frasco un vial de
N343 MSC X diluido en 14 ml de DMEM/FBS al 2%. Se dispuso el cultivo
en una cámara de gas, se hizo el vacío, y se repuso el gas con
hidrógeno y dióxido de carbono para proporcionar una mezcla de 8,0%
de O_{2}, 8,8% de CO_{2} y 83,2% de H_{2}. Se incubó el
cultivo durante 6 días, y después se rasparon las células
transfiriéndolas a un matraz agitado de 100 ml, que contenía 90 ml
de DMEM/FBS al 2% y 0,01 g de perlas Cultisphere-G.
Se incubó el cultivo con las concentraciones gaseosas que se han
indicado antes. Se aumentó escalonadamente el volumen del matraz
doblando el volumen de medio de cultivo a intervalos semanales. Se
cultivó el cultivo durante 25 días en el matraz agitado hasta llegar
a un volumen final de 250 ml.
La cepa N101494 fue cultivada de una manera
similar a la N343.
Se cosechó el cultivo centrifugándolo a 3000 x g
durante 20 minutos. Se resuspendió el sedimento en solución de
sacarosa-fosfato-glutamato (SPG) con
FBS al 10%, y se hizo pasar esta suspensión 4 veces a través de una
aguja de calibre 25. Se diluyó el inóculo hasta el volumen final (15
ml) en SPG/FBS al 10%.
Se cosecharon los cultivos centrifugándolos a
3000 x g durante 20 minutos. Se resuspendieron los sedimentos en
solución de
sacarosa-fosfato-glutamato (SPG) con
FBS al 10%, y se hizo pasar esta suspensión 4 veces a través de una
aguja de calibre 25. Se diluyó el inóculo hasta el volumen final en
SPG/FBS al 10% (20 ml para la cepa N343 y 10 ml para la cepa
N101494).
En el día 0 se vacunaron por vía oral todos los
hámsters del grupo A, con 1 ml de la vacuna preparada.
Veintidós días después de la vacunación, se
administraron a 10 hámsters del grupo A y a 10 hámsters del grupo
B, por vía oral, 0,5 ml de la cepa de cultivo N343 para la prueba de
exposición. Al grupo C se le administraron 0,5 ml de la cepa de
cultivo N101494 para la prueba de exposición.
La cuantificación del número de L.
intracellularis viables se realizó determinando la dosis
infecciosa de 50 por ciento de los cultivos de tejido
(TCID_{50}). Esto se realizó retirando 2 ml de cultivo a ensayar,
y lisando las células al hacerlas pasar 4 veces a través de una
aguja de calibre 22. Se diluyó sucesivamente la muestra 1:10 en
DMEM/FBS al 5% que contenía vancomicina (100 \mug/ml) y
anfotericina B (2,0 \mug/ml). Se dispensaron las diluciones, en
un volumen de 0,1 ml por pocillo, en una placa de microvaloración de
96 pocillos que había sido sembrada con células McCoys a razón de
1250 células por pocillo, y se incubaron durante
18-24 horas a 37ºC y 5% de CO_{2} antes de la
infección. Se emplearon doce pocillos para cada dilución. Se incubó
la placa durante 6 días bajo concentraciones gaseosas de 8,0% de
O_{2}, 8,8% de CO_{2} y 83,2% de N_{2}. El día 6 se fijaron
las células con 50% de acetona y 50% de metanol, fríos, durante 2
minutos. Se añadieron a los pocillos 0,03 ml de anticuerpo
monoclonal anti-L. intracellularis, diluido 1:2000 en PBS,
por cada pocillo. Se incubó la placa durante 30 minutos a 37ºC, y
después se lavó 3 veces con PBS. Se añadió FITC
anti-ratón, diluido 1:30, en una cantidad de 0,03
ml/pocillo, y se incubó durante 30 minutos a 37ºC. Se lavó la placa
3 veces con H_{2}O bidestilada, y se dejó secar. Se observaron las
muestras bajo un microscopio de fluorescencia, y se determinó la
TCID_{50}/ml.
Se siguió mediante la PCR la infección de los
hámsters, empleando los cebadores y parámetros de ciclo descritos
por Gary Jones. Se recogieron muestras fecales en los días 0, 7, 14,
21, 29, 36 y 43 después de la vacunación. Tras sacrificar a los
hámsters también se analizó mediante PCR la mucosa de los
intestinos.
Se fijaron con formol cortes del íleon y del
colon, se elaboraron de la manera usual, se tiñeron con hematoxilina
y con eosina, y también mediante impregnación con plata, y se
evaluaron. También se tiñeron los cortes por medio de un anticuerpo
monoclonal específico para L. intracellularis.
Se anotaron los pesos de los hámsters al cabo de
21, 28, 35 y 42 días después de la vacunación, a fin de determinar
los aumentos de peso diarios promedios.
Los resultados de TCID_{50} indicaron que el
grupo al que se administró la vacuna (grupo A) recibió 10^{4,86}
TCID_{50} por hámster. Se sometió a los hámsters de los grupos A y
B a la prueba de exposición con la cepa N343, y recibieron
10^{5,5} TCID_{50}. Los hámsters del grupo C, sometidos a la
prueba de exposición con la cepa N101494, recibieron 10^{2,75}
TCID_{50} por hámster.
El análisis mediante PCR demostró la presencia
de L. intracellularis en 100% de los hámsters vacunados a
los que se realizó la necropsia 21 días después de la vacunación. El
análisis realizado 43 días después de la vacunación demostró que
100% de los hámsters testigos y 50% de los hámsters vacunados
estaban infectados con L. intracellularis. Ninguno de los
hámsters sometidos a la prueba de exposición con N101494 resultó
positivo. No se detectó diarrea en ninguno de los hámsters en ningún
momento del estudio.
Tinciones H & E no revelaron lesiones
histológicas en ninguno de los cortes procedentes de hámsters a los
que se realizó la necropsia 21 días después de la vacunación. En los
cortes preparados 43 días después de la vacunación, 50% del grupo
de la vacuna presentaban enteritis linfocítica de ligera a grave, y
50% del grupo testigo presentaba enteritis linfocítica ligera. No
se observaron lesiones en el grupo sometido a la prueba de
exposición con N101494.
Tinciones FA no revelaron L.
intracellularis en ninguno de los hámsters 43 días después de la
vacunación.
Se observó una reducción de 50% de la infección,
demostrada por PCR, en hámsters vacunados con una cepa de L.
intracellularis que había experimentado un elevado número de
traspasos.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
El objeto del estudio consistía en evaluar la
seguridad, la colonización persistente y la eficacia de un aislado
vivo avirulento y de un aislado de microorganismos muertos de L.
intracellularis en cerdos de 2-3 semanas de
edad. Se llevó a cabo un estudio en animales anfitriones en el cual
se vacunaron cerdos de 3 semanas de edad, y después fueron
sometidos a una prueba de exposición virulenta con la cepa N343 de
L. intracellularis, a fin de comparar las diferencias de
protección entre las vacunas.
El 11 de diciembre de 1995 se adquirieron de H
& K Farms 45 cerdos en total, de 3 semanas de edad. Fueron
transportados a Veterinary Resources, Inc., unas instalaciones de
investigación situadas cerca de Cambridge, Iowa, donde se les
colocó a cada uno una placa para identificar individualmente cada
animal. Se mantuvo a los cerdos en estas instalaciones durante dos
días antes de iniciar el estudio, para permitir su aclimatación al
lugar. A lo largo de todo el estudio recibieron una alimentación
exenta de antibióticos.
El 13 de diciembre se pesó cada cerdo, se les
extrajo sangre para obtener suero, se les calificó clínicamente, y
se recogieron muestras fecales mediante bastoncillos. Se dividió
aleatoriamente a los animales en grupos de cinco, y se les colocó
en cubículos. En una sala separada se dispuso a veinte cerdos, que
fueron designados como grupos testigo y testigo estricto. En una
segunda sala se dispuso a quince cerdos, para recibir la vacuna
ISi-1. Una tercera sala contenía 10 cerdos
destinados a recibir la ISi-2.
La vacuna viva fue preparada en las
instalaciones de investigación y desarrollo NOBL Laboratories
Research and Development, y se identificó con el número de serie
experimental ISi-1. Esta vacuna
ISi-1 (cepa N343) había sido aislada de un cerdo, y
fue cultivada de manera continua en cultivo puro durante 29 semanas.
Se cultivó la vacuna en células McCoys, dentro de matraces
agitados, bajo una atmósfera con contenido de oxígeno reducido,
hasta que se observó aproximadamente 100% de infección. Una muestra
de la cepa N343, con elevado número de traspasos, empleada para
ISi-1, fue traspasada durante 11 semanas más
("N343NP40wk") y depositada de acuerdo con el Tratado de
Budapest el 22 mayo de 1996 en la ATCC, 12301 Parklawn Drive,
Rockville, Maryland, EE.UU. 20852, siendo asignada a la misma el
número de registro de entrada 55783. Se cosecharon los cultivos
centrifugándolos a 3000 x g durante 20 minutos. Se resuspendieron
los sedimentos en solución de
sacarosa-fosfato-glutamato (SPG)
con FBS al 10%, y se hizo pasar esta suspensión cuatro veces a
través de una aguja de calibre 25. Se centrifugaron los lisados a
500 x g durante 5 minutos para aglomerar en un sedimento los restos
celulares y las perlas de microsoporte. Se separó el sobrenadante,
y se conservó a -70ºC hasta aproximadamente una hora antes de la
vacunación, momento a partir del cual se conservó en hielo hasta su
administración.
Se cultivó la vacuna de microorganismos muertos
(ISi-2), se traspasó durante 12 semanas y media, se
cosechó de una manera similar a la antes indicada, y se purificó
mediante un gradiente en Percol. Después se conservaron a -70ºC las
bacterias purificadas, hasta aproximadamente una semana antes de la
vacunación, momento a partir del cual se conservaron a 4ºC bajo
niveles normales de oxígeno atmosférico, que son tóxicos para L.
intracellularis. Se añadió AIOH a las bacterias para conseguir
una mezcla final con 10% de AlOH. Se determinó la concentración de
proteína por el método de Biurett.
La cuantificación del número de L.
intracellularis viables se realizó determinando la dosis
infecciosa de 50 por ciento de los cultivos de tejido
(TCID_{50}). Se sembraron placas de microvaloración de noventa y
seis pocillos con células McCoys a razón de 1250 células por
pocillo, y se cultivaron durante 18-24 horas antes
de la infección. Se diluyeron sucesivamente las muestras 1:10 en
DMEM/FBS al 5% que contenía vancomicina (100 \mug/ml) y
anfotericina B (2,0 \mug/ml). Se añadieron las diluciones a las
placas de microvaloración de 96 pocillos, a razón de 0,1 ml por
pocillo. Se emplearon doce pocillos para cada dilución. Se incubó la
placa durante 6 días a 37ºC, y bajo concentraciones gaseosas de
8,0% de O_{2}, 8,8% de CO_{2} y 83,2% de N_{2}. Se fijaron
las células con 50% de acetona y 50% de metanol, fríos, durante 2
minutos. Se añadieron a los pocillos 0,03 ml de anticuerpo
monoclonal anti-L. intracellularis (desarrollado por el Dr.
Steven McOrist), diluido 1:2000 en PBS, por cada pocillo. Se incubó
la placa durante 30 minutos a 37ºC, y después se lavó 3 veces con
PBS. Se añadió conjugado de inmunoglobulina G y fluorocromo (FITC)
anti-ratón, diluido 1:30, en una cantidad de 0,03
ml/pocillo, y se incubó durante 30 minutos a 37ºC. Se lavó la placa
3 veces con H_{2}O bidestilada, y se dejó secar. Se observaron
las muestras bajo un microscopio de fluorescencia, y se determinó
la TCID_{50}/ml empleando el método de cálculo de
Reed-Meunsch.
Los resultados de TCID_{50} indicaron que la
vacuna ISi-1 contenía 1,8 x10^{5} bacterias/ml. Un
cuarto inóculo era un placebo, y se había obtenido de células de
cultivo de tejidos elaboradas de la misma manera que las
vacunas.
Se analizó el contenido de proteína total de la
vacuna de microorganismos muertos, por el método de Biuret, y
contenía 0,311 mg/ml.
\newpage
Se vacunó a los cerdos el 13 de diciembre de
1995. La vacuna viva fue administrada en todos los casos en una
dosis de 2 ml por vía intranasal, a razón de 1 ml en cada orificio
nasal. La vacuna ISi-2 (de microorganismos muertos)
fue administrada por vía intramuscular en una dosis de 1,5 ml por
animal, y se repitió 14 días después. A todos los animales testigos
se les administraron células no infectadas, del mismo modo que las
vacunas vivas.
A lo largo de todo el estudio se tomaron
muestras fecales mediante bastoncillos, y se extrajo suero, a
intervalos de 7 días. Se prepararon las muestras fecales para el
análisis PCR utilizando el conjunto de cebadores,
5'-TATGGCTGT
CAAACACTCCG-3' y 5'-TGAAGGTATTGGTATTCTCC-3' para las amplificaciones del ADN. Los parámetros de ciclo fueron 93ºC durante 5 minutos, 55ºC durante 45 segundos y 72ºC durante 45 segundos en el primer ciclo. Se efectuaron treinta y tres ciclos a las temperaturas antes mencionadas, durante 45 segundos por temperatura. El ciclo final consistió en 93ºC durante 45 segundos, 55ºC durante 45 segundos y 72ºC durante 2 minutos, con cebadores definidos por Jones y colaboradores.
CAAACACTCCG-3' y 5'-TGAAGGTATTGGTATTCTCC-3' para las amplificaciones del ADN. Los parámetros de ciclo fueron 93ºC durante 5 minutos, 55ºC durante 45 segundos y 72ºC durante 45 segundos en el primer ciclo. Se efectuaron treinta y tres ciclos a las temperaturas antes mencionadas, durante 45 segundos por temperatura. El ciclo final consistió en 93ºC durante 45 segundos, 55ºC durante 45 segundos y 72ºC durante 2 minutos, con cebadores definidos por Jones y colaboradores.
En los días 26 y 27 después de la vacunación se
administró a todos los animales, salvo a los testigos estrictos, un
cultivo para prueba de exposición compuesto por cultivos con bajo
número de traspasos de las cepas N343 y N72994 de L.
intracellularis, que habían sido cultivados de manera continua
entre 8 y 12 semanas. Se cosecharon los cultivos centrifugándolos a
3000 x g durante 20 minutos. Se resuspendieron los sedimentos en
solución de
sacarosa-fosfato-glutamato (SPG) con
suero fetal de bovino al 10%, y se hizo pasar esta suspensión 4
veces a través de una aguja de calibre 25. Se conservaron a -70ºC
hasta el momento de la prueba de exposición algunos cultivos
cosechados, mientras que otros fueron cultivados hasta el mismo día
de la prueba de exposición, y se cosecharon. Se combinaron los
inóculos para la prueba de exposición, y se determinó la TCID50 de
los cultivos. Se conservaron las muestras sobre hielo hasta el
momento de la administración.
El cultivo para prueba de exposición
administrado el 8 de enero de 1996 contenía 4 x 10^{4}
bacterias/ml y el cultivo para prueba de exposición administrado el
9 de enero de 1996 contenía 3 x 10^{4} bacterias/ml. Se
administraron a los cerdos 15 ml de prueba de exposición, ambos
días, mediante sonda gástrica. Por tanto, los animales recibieron 6
x 10^{5} bacterias por animal y 4,7 x 10^{5} bacterias por
animal los días 8 de enero de 1996 y 9 de enero de 1996,
respectivamente.
Resultados de la PCR fecal: La detección de
L. intracellularis por medio de la PCR demostró que ningún
cerdo estaba diseminando la bacteria al comienzo del estudio.
Transcurridos siete días después de la vacunación, todos los cerdos
resultaron negativos. Catorce días después de la vacunación, 3
cerdos del grupo ISi-1 grupo eran positivos. En el
grupo ISi-1 dos animales eran positivos 21 días
después de la vacunación, y todos los demás cerdos eran negativos.
En el día 26 después de la vacunación ningún animal estaba
diseminando la bacteria, según reveló la PCR. Veintiséis días
después de la vacunación se realizó la necropsia de 5 cerdos de los
grupos ISi-1 y testigos, y 4 cerdos del grupo
ISi-2. Se tomaron muestras del íleon, del colon, del
nódulo linfático mesentérico y de las amígdalas, y también de los
pulmones de animales con lesiones sospechosas de neumonía.
Se realizó el análisis PCR de las muestras
individuales de íleon y de pulmón. Las muestras de amígdalas, de
colon y de nódulos linfáticos fueron combinadas por grupo de
tratamiento, y se realizó la PCR. A continuación figuran los
resultados de los análisis mediante PCR.
Se tiñeron cortes histológicos de los ileones,
empleando un anticuerpo monoclonal específico contra L.
intracellularis como anticuerpo primario y conjugado de
G-fluorocromo e inmunoglobulina
anti-ratón como anticuerpo secundario. Se
observaron L. intracellularis en 3 de los cinco cerdos del
ISi-1. Todos los demás animales resultaron
negativos en la tinción con anticuerpo fluorescente.
Se realizó la necropsia de los restantes cerdos
21 días después de la prueba de exposición, y se tomaron las mismas
muestras para la evaluación. A continuación se presentan los
resultados de la PCR.
Se realizaron tinciones FA de los ileones, de la
manera antes descrita, resultando positivos 7 de 10 animales en el
grupo testigo. Todos los demás animales resultaron negativos
respecto a la presencia de L. intracellularis.
Se analizó en el suero la producción de
anticuerpo IgG por los cerdos tras la exposición a L.
intracellularis. Se inició el ensayo sembrando placas Terasaki
tratadas para cultivo de tejidos, con células McCoys a razón de 125
células/pocillo, y se cultivaron durante 18-24 horas
antes de la infección. Después se añadió a los pocillos, a razón de
0,01 ml por pocillo, un cultivo puro de L. intracellularis
diluido hasta una concentración de 1000-3000
bacterias/ml en DMEM con suero fetal de bovino al 5%. Se incubó la
placa durante 6 días bajo concentraciones gaseosas de 8,0% de
O_{2}, 8,8% de CO_{2} y 83,2% de N_{2}. Se fijaron las células
con 50% de acetona y 50% de metanol, fríos, durante 2 minutos. Se
diluyeron los sueros de los cerdos en proporción 1:75 con PBS
estéril. Se añadió el suero diluido a los pocillos, a razón de 0,01
ml por pocillo. Después se incubaron las placas durante 30 -60
minutos a 37ºC. Se lavaron las placas 5 veces con PBS estéril. Se
añadió a cada pocillo 0,01 ml de conjugado de
G-fluorocromo e inmunoglobulina IgG
anti-cerdo. Se incubó la placa durante 30 minutos a
37ºC. Se lavaron las placas 5 veces con H_{2}O bidestilada, y se
dejaron secar. Se lavaron las muestras 5 veces con H_{2}O
bidestilada, y se dejaron secar. Se observaron las muestras bajo un
microscopio de fluorescencia, y se marcaron como positivos los
pocillos en donde se observaban bacterias, y como negativos los
pocillos en donde no se observaban bacterias.
Se analizaron nuevamente, a intervalos de una
semana, los animales que habían resultado positivos el día 0. Los
resultados indicaron que todos terminaron siendo serológicamente
negativos 14 días después de la vacunación. Esto no era un hecho
inesperado, ya que los cerdos tenían tres semanas de edad el día 0,
y a esta edad los resultados positivos podían ser debidos a
anticuerpos maternos.
Se analizaron los sueros junto con un suero
testigo positivo obtenido sobre-inmunizando un cerdo
con L. intracellularis incubado en cultivo puro. El suero
testigo negativo empleado fue obtenido de un cerdo gnotobiótico de
la universidad South Dakota State University.
Claims (14)
1. Una vacuna para inducir una respuesta
inmunitaria en bacterias L. intracellularis en un animal que
comprende una cepa atenuada de L. intracellularis en un
soporte farmacéuticamente aceptable, en donde dicha cepa atenuada
está en una cantidad eficaz para producir una respuesta inmunitaria,
y en donde la vacuna comprende 50-500 microgramos
de inmunógeno, y se utilizan bacterias purificadas, y en donde la
cepa atenuada de L. intracellularis se puede obtener por un
método que comprende obtener células de cultivo, infectadas con
bacterias L. intracellularis, incubar dichas células
infectadas a una concentración de oxígeno de aproximadamente 0
hasta aproximadamente 18 por ciento, agitar dichas células
infectadas con el fin de cultivar dichas bacterias, al tiempo que
se mantiene a dichas células infectadas en suspensión, hacer pasar
al menos una parte de dichas bacterias cultivadas, recolectar al
menos una parte de dichas bacterias cultivadas y seleccionar una
cepa atenuada para proporcionar bacterias L. Intracellularis
atenuadas.
2. La vacuna según la reivindicación 1, en donde
la vacuna comprende entre 10^{7} y 10^{9} TCID_{50} de
inmunógeno.
3. La vacuna según la reivindicación 1, en donde
el soporte se selecciona del grupo que consiste en solución,
emulsión o suspensión acuosa.
4. Una vacuna para inducir una respuesta
inmunitaria en bacterias L. intracellularis en un animal, que
comprende bacterias L. intracellularis muertas en un soporte
farmacéuticamente aceptable, en donde dichas bacterias se producen
de acuerdo con el método de cultivar bacterias L.
intracellularis, que comprende las etapas de incubar dichas
bacterias a una concentración de oxígeno de menos de aproximadamente
18 por ciento, y mantener dichas bacterias en suspensión para
cultivar dichas bacterias, en donde dichas bacterias están en
células de cultivo que se mantienen en suspensión y están en una
cantidad eficaz para producir una respuesta inmunitaria, y en donde
la vacuna comprende 50 - 500 microgramos de inmunógeno, y se
utilizan bacterias purificadas.
5. La vacuna según la reivindicación 4, en donde
la vacuna comprende entre 10^{7} y 10^{9} TCID_{50} de
inmunógeno.
6. La vacuna según la reivindicación 4 ó 5, en
donde las bacterias se exterminan mediante exposición prolongada a
niveles de O_{2} ambiente o formalina al 0,3%.
7. La vacuna según la reivindicación 6, en donde
la vacuna comprende, además, un adyuvante seleccionado del grupo
que consiste en hidróxido de aluminio o aceite mineral.
8. La vacuna según la reivindicación 1 ó 4, en
donde L. intracellularis que infecta las células de cultivo
se prepara a partir de un homogeneizado intestinal de un animal
infectado con L. intracellularis.
9. La vacuna según la reivindicación 1, en donde
dicha cepa atenuada es la cepa N343NP40wk depositada como ATCC
55783.
10. La vacuna según las reivindicaciones 1 a 9,
en donde dicha vacuna se utiliza en combinación con otras
vacunas.
11. Uso de una vacuna según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, en la fabricación de un medicamento para
proteger animales frente a infecciones por L.
Intracellularis.
12. Una vacuna, que comprende una cantidad
inmunológicamente eficaz de una cepa atenuada de bacterias L.
intracellularis en un soporte farmacéuticamente aceptable, en
donde la cepa atenuada de L. intracellularis se puede
obtener por un método que comprende obtener células de cultivo,
infectadas con bacterias L. intracellularis, incubar dichas
células infectadas a una concentración de oxígeno de aproximadamente
0 hasta aproximadamente 18 por ciento, agitar dichas células
infectadas con el fin de cultivar dichas bacterias, al tiempo que se
mantiene a dichas células infectadas en suspensión, hacer pasar al
menos una parte de dichas bacterias cultivadas, recolectar al menos
una parte de dichas bacterias cultivadas y seleccionar una cepa
atenuada para proporcionar bacterias L. Intracellularis
atenuadas.
13. La vacuna según la reivindicación 12, en
donde una dosis de dicha vacuna comprende 10^{3} hasta 10^{9}
bacterias por kg de peso corporal del animal.
14. La vacuna según la reivindicación 12 ó 13,
en donde dicha vacuna se utiliza en combinación con otras
vacunas.
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