KR20180062468A

KR20180062468A - 신규한 로소니아 인트라셀룰라리스 균주 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20180062468A
Application number: KR1020160153857A
Authority: KR
Inventors: 황정민; 김성재; 손동현; 문형준; 한상윤; 고대웅; 김종만; 강보규; 예정용
Original assignee: 녹십자수의약품(주)
Priority date: 2016-11-18
Filing date: 2016-11-18
Publication date: 2018-06-11
Also published as: WO2018092974A1

Abstract

본 발명은 신규한 로소니아 인트라셀룰라리스 균주 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 수탁번호 KCTC13152BP로 기탁된 로소니아 인트라셀룰라리스(Lawsonia intracellularis) 균주, 상기 균주를 제작하는 방법, 상기 균주를 유효 성분으로 포함하는 증식성 회장염(proliferative enteritis)의 예방 또는 치료용 백신 조성물, 및 증식성 회장염(proliferative enteritis)의 예방 또는 치료 방법을 제공한다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 균주는 안전성, 안정성, 면역원성 및 대상에 투여하였을 때 치료 효율이 높은, 약독화 백신을 제조하는데 효과적으로 이용될 수 있다.

Description

신규한 로소니아 인트라셀룰라리스 균주 및 이의 용도{Novel Lawsonia intracellularis and Uses Thereof}

본 발명은 신규한 로소니아 인트라셀룰라리스 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.

회장염(ileitis), 장선종(intestinal adenomatosis), 출혈성 장염(hemorrhagic enteropathy), 또는 괴사성 장염(necrotic enteritis)으로 알려져 있는 돼지 증식성 회장염(porcine proliferative enteritis, PPE)은 어린 성체 이후의 돼지에게 영향을 주는 자연 발생 질환이다.

돼지의 증식성 회장염은 우리나라를 비롯하여 전 세계적으로 양돈 산업에 큰 문제가 되고 있으며 수많은 양돈 농가가 돼지 증식성 회장염으로 경제적인 피해를 입고 있지만, 그 원인체 균의 분리배양이 어려워 연구가 미진한 실정이다. 영국과 미국 등지에서 증식성 회장염의 원인균인 로소니아 인트라셀룰라리스(Lawsonia intracellularis, L. intracellularis)를 실험실 내에서 순수 분리배양하는 데 성공하여 연구가 활발히 진행 중에 있으나, 로소니아 인트라셀룰라리스는 종래의 세포 배양액 상에서 보통의 박테리아적 방법에 의해 배양될 수 없는 절대적인 세포내 박테리아이며, 성장하기 위해 부착할 상피세포를 필요로 한다. 이러한 선행 배양방법은 많은 노력을 필요로 하며, 대규모 배양에는 적합하지 않은 실정이다.

증식성 회장염에 대한 예방제, 치료제 등의 연구를 수행하기 위하여 국내 분리주의 확보가 매우 시급한 실정이나, 로소니아 인트라셀룰라리스의 분리에는 1) 세포배양 기술의 확립 2), 증식성 회장염균 배양에 적합한 배양조건의 구축, 3) 증식성 회장염에 대한 정확한 진단기술, 4) 신선한 가검물의 확보, 5) 다른 세균 및 바이러스를 배제하고 증식성 회장염균의 단독 선택 및 분리, 및 6) 분리배양된 증식성 회장염균에 대한 병원성 재현실험 등의 문제가 따른다.

이러한 배경에 의해 국내에서 발생하는 증식성 회장염의 예방을 위한 백신개발, 진단 및 면역학적 연구를 위해 로소니아 인트라셀룰라리스 균주의 확보가 절대적으로 요구되고 있다.

본 발명자는 돼지 회장염에 대한 신규한 백신을 개발하기 위하여 예의 노력하였다. 그 결과, 확보된 회장염 균주를 약독화시켜서 신규한 균주를 제작하였고, 상기 균주를 백신으로 이용하여 탁월한 면역원성 효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 신규한 로소니아 인트라셀룰라리스(Lawsonia intracellularis) 균주를 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 증식성 회장염(proliferative enteritis)의 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 증식성 회장염(proliferative enteritis)의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 신규한 로소니아 인트라셀룰라리스(Lawsonia intracellularis) 균주 제작 방법을 제공하는 데 있다.

이하, 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 수탁번호 KCTC13152BP로 기탁된 신규한 로소니아 인트라셀룰라리스(Lawsonia intracellularis) 균주를 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 상기 균주는 로소니아 인트라셀룰라리스(Lawsonia intracellularis) 분리체를 CV-1 세포 감염 및 계대배양을 통해 약독화 또는 불활성화시킨 약독화주로서, 서열번호 1에 기재된 16S rRNA 염기서열을 가진다.

본 명세서에서 "로소니아 인트라셀룰라리스(Lawsonia intracellularis , L. intracellularis)"는 증식성 회장염의 원인균을 의미하며, "증식성 회장염균" 또는 "회장염균"과 교환가능하게 사용된다.

상기 약독화는 당업계에 알려진 방법에 의하여 수행되는 것일 수 있다. 상기 약독화된 균주는 화학물질 처리 예를 들면, 포르말린 처리에 의하여 약독화되거나, 자외선 조사 또는 계대배양에 의하여 약독화된 것일 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어, "약독화"란 대상에게 면역반응을 유도할 수 있지만 대상에게 백신으로 사용할 수 있을 정도로 치명적이지 않은 정도의 독성을 갖는 것을 말한다. 본 명세서에 있어서, 약독화는 "불활성화"와 교환가능하게 사용된다. 상기 약독화는 균주의 증식 능력이 약화된 것뿐만 아니라 증식능력이 완전하게 상실된 것도 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 약독화는 5세대 내지 200세대를 연속 계대배양한 것이고, 보다 바람직하게는 80세대 내지 120세대, 가장 바람직하게는 100세대를 연속 계대 배양한 것이다.

본 발명에 따른 수탁번호 KCTC13152BP로 기탁된 신규한 로소니아 인트라셀룰라리스(Lawsonia intracellularis) 균주는 공지 균주와 비교하여 특정 부위의 염기서열이 상이한바, 신규한 균주이다. 보다 구체적으로, 공지된 로소니아 인트라셀룰라리스(NC_008011.1)와 상기 연속 계대 배양을 통하여 획득한 본 발명의 수탁번호 KCTC13152BP로 기탁된 신규한 로소니아 인트라셀룰라리스(Lawsonia intracellularis) 균주 및 이의 모균주인 로소니아 인트라셀룰라리스 분리체의 서열 상 차이를 비교 분석하였다.

그 결과, 공지된 로소니아 인트라셀룰라리스(NC_008011.1)를 기준으로 비교하여, 모균주인 로소니아 인트라셀룰라리스 분리체의 182329 번째 뉴클레오티드; 339993 번째 뉴클레오티드; 544127 번째 뉴클레오티드; 787441 번째 뉴클레오티드; 및 1397904 번째 뉴클레오티드;의 위치들 중 하나 이상에 상응하는 영역에서 하나 이상의 차이가 있는 염기서열을 가지는 것으로 확인된 바, 이는 본 발명의 수탁번호 KCTC13152BP로 기탁된 로소니아 인트라셀룰라리스(Lawsonia intracellularis) 균주가 모균주와 상이한 신규한 균주임을 나타낸다.

즉, 본 발명의 수탁번호 KCTC13152BP로 기탁된 신규한 로소니아 인트라셀룰라리스(Lawsonia intracellularis) 균주는 증식성 회장염(proliferative enteritis)에 걸린 대상으로부터 로소니아 인트라셀룰라리스(Lawsonia intracellularis) 분리주를 분리하고, 이를 CV-1 세포에서 100세대까지 연속 계대배양하여 획득한 것이다.

상기 균주는 면역원성이 높으면서도, 병원성을 전혀 갖지 않는 특성을 갖는다. 또한, 본 발명의 일 실시예에서 돼지 및 헴스터에 상기 균주를 경구 투여하였을 경우에도 면역을 유도하였다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는, 수탁번호 KCTC13152BP로 기탁된 로소니아 인트라셀룰라리스(Lawsonia intracellularis) 균주의 제작 방법을 제공한다:

(a) 로소니아 인트라셀룰라리스(Lawsonia intracellularis) 양성 가검물 장 조직에서 분리체를 수득하는 단계;

(b) 상기 (a) 단계의 분리체를 CV-1(ATCC CCL-70) 세포에 접종감염시키는 단계; 및

(c) 상기 (b) 단계의 감염세포를 5세대 내지 200세대 연속 계대배양하여 약독화시키는 단계.

본 명세서에서 용어 "분리체"는 2010년 녹십자수의약품 수의연구소에서 병성감정한 회장염균(L. intracellularis) 양성 가검물 장 조직으로부터 분리된 로소니아 인트라셀룰라리스(Lawsonia intracellularis)의 분리주를 의미하며, 본 발명에서 "분리주"와 교환가능하게 이용될 수 있다.

보다 상세하게는, 본 발명의 방법은 증식성 회장염에 양성 가검물 장 조직을 채취하여 면역조직화학염색법 및/또는 PCR 법으로 증식성 회장염의 원인균인 로소니아 인트라셀룰라리스의 존재를 확인하고; 상기 장 조직으로부터 수득된 로소니아 인트라셀룰라리스 분리체를 CV-1 세포에 접종한 다음, 혐기조건에서 CV-1 세포를 로소니아 인트라셀룰라리스 분리체를 포함하는 접종물로 감염시키고; 상기 감염된 CV-1 세포를 2~5시간 배양한 다음, 항생제가 첨가된 배지로 교체하고; 접종 후 1-6일이 경과한 시점에 0.1% 염화칼륨 용액과 주사기를 사용하여 감염세포를 파열시키고, 세포핵을 제거한 상층액을 신선한 CV-1 세포에 접종하는 것을 100회 이상 반복하여 약독화시켜서 순수한 로소니아 인트라셀룰라리스로 감염된 CV-1 세포를 수득함으로써 신규한 로소니아 인트라셀룰라리스(Lawsonia intracellularis) 균주를 제작하는 방법이다.

즉, 본 발명에서 로소니아 인트라셀룰라리스 균주의 계대는 염화칼륨 용액과 주사기를 사용하여 감염된 CV-1 세포를 파열시키고, 세포핵을 제거한 로소니아 인트라셀룰라리스 균주가 함유된 상층액을 신선한 CV-1 세포에 접종하여 수행한다.

본 발명에서 상기 접종물은 감염된 대상으로부터 수득한 로소니아 인트라셀룰라리스의 배양물 또는 로소니아 인트라셀룰라리스로 감염된 대상의 회장으로부터 점막을 긁어내어 제조된 장 파쇄물일 수 있다. 장 파쇄물을 제조하는 경우, 배양용으로 선택된 회장 부분은 장 전체가 두터워진 중증 병변부를 나타내어야만 한다. 세균이 본래 약체이기 때문에, 당해 샘플은 바람직하게 검시 후 가능한한 신속하게 -70℃에서 저장되어야만 한다. 로소니아 인트라셀룰라리스가 내성인 항생제, 예를 들어, 반코마이신, 앰포테리신 B 또는 젠타마이신 및 네오마이신을 포함하는 아미노글리코사이드 그룹 항생제의 구성원을 바람직하게 접종물에 첨가하여 오염 세균을 억제시키면서 로소니아 인트라셀룰라리스를 증식시킨다. 접종물이 순수한 배양물 또는 장 파쇄물이든 상관없이 배양 세포의 접종은 본원에 교시된 당업계에 공지된 다양한 기술에 의해 수행될 수 있다.

이어서 감소된 O₂ 용존 농도하에 세균 및/또는 접종 배양 세포를 배양한다. 10% 초과의 용존 산소 농도에서, 로소니아 인트라셀룰라리스 증식은 최적 이하이고 궁극적으로 당해 범위를 벗어나는 산소 농도에서 결국 증식이 정지된다. 바람직하게, 세균 및/또는 접종 배양 세포는 0.1% 내지 10% 범위의 용존 산소 농도에서 배양한다.

보다 바람직하게, 세균 및/또는 세포는 0.1% 내지 8% 범위의 산소 농도에서 배양하고 5.0-7.0% 범위의 산소 농도가 가장 바람직하다.

적당한 이산화탄소의 농도는 또한 엘. 인트라셀룰라리스의 적절한 증식에 중요하다. 0% 내지 4% 범위의 이산화탄소 농도에서, 비최적으로 증식하게 되고 당해 범위를 벗어나는 이산화탄소 농도에서 결국 증식은 정지된다. 바람직하게, 이산화탄소 농도는 6% 내지 10% 범위이고, 7.5-9% 범위의 이산화탄소 농도가 가장 바람직하다.

추가로, 당해 세포는 바람직하게 73% 내지 96%의 수소 농도 범위에서 배양한다. 질소는 존재하는 수소의 일부 또는 전부를 대신하여 사용될 수 있다. 가장 바람직하게, 당해 세포는 0.1 내지 8.0% 범위의 O₂, 8.8%의 CO₂에서 배양한다.

접종 세포는 적당한 수소, 산소 및 이산화탄소 농도를 함유하고 세포를 배양동안에 현탁시키는 이원 가스 배양기 또는 기타 가스 챔버에서 배양할 수 있다. 챔버는 배양된 세포의 현탁을 유지시키는 수단 및 가스 모니터 및 적당한 가스 농도를 공급하고 유지시키는 공급원을 포함해야만 한다. 배양 온도는 30℃ 내지 45℃ 범위이어야만 하고 보다 바람직하게는 36℃ 내지 38℃ 범위이어야만 한다. 가장 바람직하게, 당해 온도는 37℃이다. 배양 및 약독화를 위한 필수 장비는 본원에 교시된 바와 같이 당업자가 용이하게 구입할 수 있다.

접종 세포를 배양 동안에 현탁된 상태로 유지시킴으로써 각각의 개별 세포는 증식 배지 및 수소, 산소 및 이산화탄소의 적당한 혼합물에 대한 노출이 증가되어 세포 및 이에 따른 엘. 인트라셀룰라리스는 최대로 증식된다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 수탁번호 KCTC13152BP로 기탁된 로소니아 인트라셀룰라리스(Lawsonia intracellularis) 균주를 유효 성분으로 포함하는 증식성 회장염(proliferative enteritis)의 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공한다.

본 발명의 상술한 방법으로 제작된 로소니아 인트라셀룰라리스 균주를 이용하여 약독화 백신 및 살균된 로소니아 인트라셀룰라리스 백신을 생산할 수 있다. 즉, 본 발명의 방법으로 분리하여 배양된 균주를 충분히 여러번 계대하여, 독성이 약화된 균주를 선별하거나, 화학적 방법에 의해 독성을 약화시킴으로써 대상에게 접종하였을 때 회장염 증상이 나타나지 않거나 약하게 나타나게 하는 독성이 약화된 균주를 확보하여 치료학적으로 유효한 양의 약독화주를 백신으로 사용하는 백신 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명의 로소니아 인트라셀룰라리스 약독화주를 열처리 등으로 살균하여 백신으로 사용할 수 있다. 상기 약독화된 백신과 살균된 백신은 약제학적으로 허용되는 안정화제, 희석제, 아주반트 등을 함유할 수 있다.

상기 조성물의 투여량은 대상 두당 10⁵ 내지 10¹⁰ TCID₅₀, 바람직하기로는 10⁵ 내지 10⁷TCID₅₀인 것이다. 상기 조성물은 액제, 주사제, 정제, 및 캅셀제의 형태가 될 수 있으나, 여기에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 조성물은 추가적으로 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용가능한 담체에는 통상적인 부형제, 붕해제, 결합제 및 활택제 중에서 1종 또는 2종 이상을 선택적으로 사용할 수 있으며, 구체적으로는 부형제로서 미결정셀룰로오스, 유당, 저치환도 히드록시셀룰로오스 등, 붕해제로서 전분글리콜산 나트륨, 무수인산일수소 칼슘 등, 결합제로는 폴리비닐피롤리돈, 저치환도히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스 등, 활택제로서는 스테아린산 마그네슘, 이산화규소, 탈크 등에서 선택하여 사용할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 백신 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 증식성 회장염(proliferative enteritis)의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

상기 대상은 돼지, 인간, 토끼, 담비, 햄스터, 여우, 말, 타조 및 에뮤로 이루어진 군으로부터 선택되며, 바람직하게는 돼지, 인간, 토끼, 담비 및 햄스터로 이루어진 군으로부터 선택되고, 가장 바람직하게는 돼지이다.

본 발명의 방법은 상술한 본 백신 조성물을 이용하므로, 공통된 내용은 반복 기재에 따른 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 증식성 회장염(proliferative enteritis) 진단 방법을 제공한다:

(a) 대상의 시료를 준비하는 단계; 및

(b) 상기 시료 내에서 수탁번호 KCTC13152BP로 기탁된 로소니아 인트라셀룰라리스(Lawsonia intracellularis) 균주를 검출하는 단계.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 균주를 검출하는 단계는 프라이머 셋트를 이용한 PCR 증폭을 수행하여 PCR 산물의 수준을 확인하는 것이다.

상기 PCR 산물의 수준이 정상인 수준과 비교하여 고수준이면, 로소니아 인트라셀룰라리스(Lawsonia intracellularis)에 감염된 것으로 판단할 수 있다.

상기 PCR 실시 및 판단 방법은 공지된 프라이머 셋트를 이용하여 실시할 수 있는 한, 당업계에 공지된 어떠한 방법도 이용할 수 있다.

상기 시료는 대상으로부터 분리된 것으로서, 본 발명의 로소니아 인트라셀룰라리스 균주의 검출을 확인할 수 있는 한, 어떠한 시료도 이용될 수 있다.

본 발명의 방법은 상술한 균주를 검출하는 것이므로, 공통된 내용은 반복 기재에 따른 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 신규한 로소니아 인트라셀룰라리스 균주는 100 회 이사의 계대 배양을 통해 약독화된 것으로 안전성 및 안정성이 우수하고, 면역원성 및 대상에 투여하였을 때 치료 효율이 높은, 약독화 백신을 제조하는데 효과적으로 이용될 수 있다.

도 1은 로소니아 인트라셀룰라리스에 감염된 CV-1 세포단층(왼쪽)과 비감염CV-1 세포단층(오른쪽)의 IHC 결과를 보여준다.
도 2a 및 도 2b는 분리된 균주가 로소니아 인트라셀룰라리스 균주임을 확인한 결과를 보여준다.
도 3은 본 약독화주의 병원성을 햄스터에서 확인한 장 육안병변 결과를 보여준다.
도 4는 본 약독화주의 병원성을 햄스터에서 확인한 회장부의 병리조직검사 결과를 보여준다.
도 5는 본 약독화주의 병원성을 돼지에서 확인한 회장의 육안병변 결과를 보여준다.
도 6은 본 약독화주의 병원성을 돼지에서 확인한 회장부의 병리조직검사 결과를 보여준다.
도 7은 약독화주를 돼지에 접종한 뒤 공격접종에 대한 본 약독화주의 방어효과를 확인한 결과를 보여준다.
도 8은 약독화주를 돼지에 접종한 뒤 공격접종에 대한 시험돈의 평균 체중 변화를 보여준다.
도 9는 약독화주를 돼지에 접종한 뒤 공격접종에 대한 본 약독화주의 항체반응을 확인한 결과를 보여준다.
도 10은 약독화주를 돼지에 접종한 뒤 공격접종에 대한 본 약독화주의 목적 장기에서의 조직학적 변화를 확인한 결과를 보여준다.

이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 회장염 원인균인 로소니아 인트라셀룰라리스( Lawsonia intracellularis , L. intracellularis )의 분리 및 배양

본 발명자들은 신규한 로소니아 인트라셀룰라리스 균주의 제작을 위해, 회장염 원인균인 로소니아 인트라셀룰라리스(Lawsonia intracellularis, L. intracellularis)를 분리 및 배양하였다.

2010년 녹십자수의약품 수의연구소에서 병성감정한 회장염균(L.intracellularis) 양성 가검물 장 조직에서 균을 수거하여 CV1 세포에 접종을 통해 분리주를 확보한 후, 도 1에 나타낸 바와 같이, 로소니아 인트라셀룰라리스에 특이적으로 면역반응하는 단클론항체를 통해 균의 존재를 확인하였다.

또한, 하기 표 1의 프라이머를 이용하여 16S rDNA를 증폭하여 PCR을 실시한 결과 로소니아 인트라셀룰라리스에 양성임을 확인하였고(도 2a), 이를 NCBI GenBank에 등록된 것과 상동성을 조사한 결과 99% 일치하는 것으로 나타나 로소니아 인트라셀룰라리스 균주의 분리체로서 공지되지 않은 신규한 균주임을 확인하였다(도 2b).

실시예 2. 세포 배양

로소니아 인트라셀룰라리스의 감염을 위해 CV-1(ATCC CCL-70) 세포를 이용하였다. 세포 배양을 위해 사용되는 배지는 1~10%의 FBS(Fetal bovine serum), 0.1~5%의 L-글루타민(glutamine)과 암포테리신(Amphotericin) B가 첨가된 D-MEM을 사용하였으며, 배양은 2~10%의 CO₂가 공급되는 37℃ 인큐베이터에서 수행하였다. 세포는 4~5일 간격으로 EDTA-Trypsin을 처리하여 계대배양을 하였고, 1ml 당 5 X 10⁵의 세포의 농도가 되도록 하여 새로운 조직배양플라스크로 옮겨담았다.

실시예 3. 분리된 로소니아 인트라셀룰라리스의 세포 감염

실시예 1에서 분리된 로소니아 인트라셀룰라리스균 희석 접종액을 CV-1 세포 단층표면에 접종하고, 접종한 세포 단층 표면은 1000~2,000g의 원심력을 이용하여 회전시킨 후 접종 플라스크는 혐기 배양 용기로 옮겼다. 혐기 배양용기의 가스는 500mmHg의 압력으로 탈기하였다가 의료용 순도의 수소가스로 교체하고, 다시 500mmHg의 압력으로 재탈기한 후 5~10%의 O₂, 5~10%의 CO₂의 혼합가스 인큐베이터에서 37℃, 3시간동안 배양한 후, 동일한 세포 배양배지 조성에 네오마이신, 겐타마이신, 반코마이신 등과 같은 항생제를 50~300ppm의 농도로 첨가한 배지로 교체하여 주었다. 접종 후 2일, 4일이 경과한 시점에서 동일한 항생제 첨가 배지로 교체하였고, 이때 FBS 농도는 5%가 되게 하였다. 그리고 접종 후 6~7 일째가 되는 날에 계대를 위한 처리를 하였다.

실시예 4. 감염된 분리주의 계대 배양

분리주의 계대에는 0.1% KCl 용액을 이용한 세포 융해액을 1:3의 비율로 사용하였다. 일단 감염 후 일주일이 지난 조직배양 플라스크 배양 상층액을 수거하였다. 상층액이 제거된 세포 단층 표면에 0.1% KCl 용액을 적용시키고 10분간 반응시켰다. 반응이 끝나면 0.1% KCl 용액을 제거하고 10% FBS가 첨가된 SPG 용액과 세포 스크레이퍼를 이용하여 조직배양플라스크 바닥면의 세포를 수거하였다. 수거된 세포들은 20게이지의 유제화 바늘을 통해 10회 반복하여 물리적으로 파열시켰다. 이 과정에서 생긴 세포핵들은 100g로 5분간 원심분리하여 제거하고, 이때 얻어진 상층액을 새로 준비한 신선한 CV-1 세포에 접종하는데 이용하였다.

로소니아 인트라셀룰라리스에 감염된 CV-1 세포들은 6~7일 간격으로 상기 방법에 의해 계대하였다. 계대를 넘어갈 때 하나의 조직배양플라스크는 다음 계대에서 3개의 조직배양플라스크가 되도록 1:3의 비율을 적용하여 계대하였다.

상기 방법으로 분리된 균주를 100대 이상 계대 배양하여 약독화시켰고, 상기 약독화된 균주를 Lawsonia intracellularis L1/CV1로 명명하여 2016년 11월 08일에 한국생명공학연구원 미생물자원센터에 기탁하였다(수탁번호: KCTC 13152BP).

또한, 공지된 로소니아 인트라셀룰라리스(NC_008011.1)와 상기 연속 계대 배양을 통하여 획득한 본 발명의 수탁번호 KCTC13152BP로 기탁된 신규한 로소니아 인트라셀룰라리스(Lawsonia intracellularis) 균주 및 이의 모균주인 로소니아 인트라셀룰라리스 분리체의 서열 상 차이를 비교 분석하였다.

그 결과, 공지된 로소니아 인트라셀룰라리스(NC_008011.1)를 기준으로 비교하여, 모균주인 로소니아 인트라셀룰라리스 분리체(LI)의 182329 번째 뉴클레오티드; 339993 번째 뉴클레오티드; 544127 번째 뉴클레오티드; 787441 번째 뉴클레오티드; 및 1397904 번째 뉴클레오티드;의 위치들 중 하나 이상에 상응하는 영역에서 하나 이상의 차이가 있는 염기서열을 가지는 것으로 확인된 바, 이는 본 발명의 수탁번호 KCTC13152BP로 기탁된 로소니아 인트라셀룰라리스(Lawsonia intracellularis) 균주(LI-100)가 모균주와 상이한 신규한 균주임을 나타낸다.

또한, 상기 서열 분석 결과는 하기 표 2에 나타내었다.

공지된 로소니아 인트라셀룰라리스	위치	레퍼런스 서열	변경된 서열	LI	LI-100
공지된 로소니아 인트라셀룰라리스	위치	레퍼런스 서열	변경된 서열	유전자형 서열(genotype sequence)	유전자형 서열(genotype sequence)
NC_008011.1	182329	CA	CAA	CA	CAA
NC_008011.1	339993	C	T	C	T
NC_008011.1	544127	C	T	C	T
NC_008011.1	787441	C	A	C	A
NC_008011.1	1397904	T	G	T	G

실시예 5. 동물에서의 약독화주의 병원성 확인

본 발명자들은 실시예 4에서 제작된 약독화주를 목적동물 및 감수성 동물인 햄스터 및 돼지에 경구 접종하여 병원성 소실여부를 확인하였다.

하기 표 3과 같이, 3 주령의 로소니아 인트라셀룰라리스 항체 음성인 자돈 8두 및 3주령의 시리안 햄스터(Syrian hamster) 10 마리를 각각 100대 계대배양된 분리주(L. intracellularis, 수탁번호: KCTC13152BP)인 A 그룹과 5대 계대배양된 분리주(L. intracellularis)인 B 그룹으로 나누었다.

각 시험 백신별로 3주령 자돈 3마리에 2 ml을, 3주령 햄스터 4마리에는 1 ml을 경구투여하고, 나머지 자돈 2마리와 햄스터 2마리는 대조군으로 이용하였다. 21일간 설사, 식욕부진, 폐사 등 임상증상을 관찰하고 관찰기간이 종료된 돼지 및 햄스터는 부검을 실시하여 회장부위를 포함한 장의 육안병변 및 조직병리학적 소견을 관찰하였다.

5-1. 임상증상의 평가

본 발명자들은 실시예 4에서 제작된 약독화주를 접종하고 이에 의한 임상증상을 관찰하였다.

그 결과, 하기 표 4에 나타낸 바와 같이, 돼지에서의 임상증상(안전성 조사)은, 100대 계대배양된 분리주(수탁번호: KCTC13152BP)를 항원으로 이용한 백신군 A는 호흡곤란, 구토, 식욕부진, 설사 등의 증상 없이 모두 생존한 반면, 5대 계대배양된 분리주를 항원으로 이용한 백신군 B는 일부 개체가 식욕부진, 설사 등의 증상을 보였다. 또한, 음성 대조군은 호흡곤란, 구토, 식욕부진, 설사 등의 증상 없이 모두 생존하였다.

또한, 하기 표 5에 나타낸 바와 같이, 햄스터에서의 임상증상(안전성 조사)은, 100대 계대배양된 분리주(수탁번호: KCTC13152BP)를 항원으로 이용한 백신군 A는 호흡곤란, 구토, 식욕부진, 설사 등의 증상 없이 모두 생존한 반면, 5대 계대배양된 분리주를 항원으로 이용한 백신군 B는 일부 개체가 식욕부진, 설사 등의 증상을 보였다. 또한, 음성 대조군은 호흡곤란, 구토, 식욕부진, 설사 등의 증상 없이 모두 생존하였다.

5-2. 육안병변의 평가

본 발명자들은 실시예 4에서 제작된 약독화주를 접종하고 이에 의한 육안병변을 관찰하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 햄스터에서의 육안병변은, 100대 계대배양된 분리주(수탁번호: KCTC13152BP)를 항원으로 이용한 백신군 A는 돼지 증식성 회장염의 전형적인 병변이 관찰되지 않은 반면, 5대 계대배양된 분리주를 항원으로 이용한 백신군 B는 소장부위가 두껍게 비후되어 주름진 점막과 충혈 소견이 확인되었으며 대조군의 소장에 비해 길이가 확연히 짧아져 있었다. 또한, 음성 대조군은 돼지 증식성 회장염의 전형적인 병변이 관찰되지 않았다.

또한, 도 5에 나타낸 바와 같이, 돼지에서의 육안 병변은, 100대 계대배양된 분리주(수탁번호: KCTC13152BP)를 항원으로 이용한 백신군 A는 돼지 증식성 회장염의 전형적인 병변이 관찰되지 않은 반면, 5대 계대배양된 분리주를 항원으로 이용한 백신군 B는 소장부위가 두껍게 비후되어 주름진 점막과 충혈 소견이 확인되었다. 또한, 음성 대조군은 돼지 증식성 회장염의 전형적인 병변이 관찰되지 않았다.

5-3. 조직병리학적 평가

본 발명자들은 실시예 4에서 제작된 약독화주를 접종하고 이에 의한 조직병리학적 상태를 관찰하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 햄스터에서의 조직병리학적 소견은, 100대 계대배양된 분리주(수탁번호: KCTC13152BP)를 항원으로 이용한 백신군 A는 정상적인 소장조직으로 회장염균이 확인되지 않은 반면, 5대 계대배양된 분리주를 항원으로 이용한 백신군 B는 점막층을 중심으로 현저한 음와(Crypt) 상피세포의 증식과 염증세포침윤이 확인되었으며, 음와 상피세포의 세포질 일부와 침윤된 대식세포(macrophage)의 세포질에서 회장염균이 확인되었다. 또한, 음성 대조군은 정상적인 소장조직으로 회장염균 확인되지 않았다.

또한, 도 6에 나타낸 바와 같이, 돼지에서의 조직병리학적 소견은, 100대 계대배양된 분리주(수탁번호: KCTC13152BP)를 항원으로 이용한 백신군 A는 정상적인 소장조직으로 회장염균이 확인되지 않은 반면, 5대 계대배양된 분리주를 항원으로 이용한 백신군 B는 소장 융모 길이의 감소와 음와 상피세포의 증식, 음와 내강에 호중구와 같은 염증세포들이 차 있는 국소 농양이 관찰되었을 뿐만 아니라 전체적인 장벽의 두께가 증가하였으며, 음와 상피세포의 세포질 일부와 침윤된 대식세포의 세포질에서 회장염균이 확인되었다. 또한, 음성 대조군은 정상적인 소장조직으로 회장염균 확인되지 않았다.

즉, 항원 B(5대)를 접종한 돼지에서는 돼지 증식성 회장염의 전형적인 병변이 주로 소장에서 명확히 나타났으며, 소장은 두껍게 비후되어 주름진 점막과 충혈 소견을 확인할 수 있었다. 반면, 항원A(100대, 수탁번호: KCTC13152BP)를 접종한 돼지의 부검소견에서는 위와 같은 병리학적 변화를 관찰할 수 없었다.

또한, 항원 B(5대)를 접종한 햄스터군에서도 항원A(100대)를 접종한 햄스터군의 장관벽에 비해서 현저히 비후되고 충혈되어 있음을 확인할 수 있었으며, 소장의 길이 역시 항원A(100대)를 접종한 접종군의 햄스터들의 소장에 비해 확연히 짧아져 있음을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명에 따른 CV-1 세포에서 100대 계대 배양된 분리주(수탁번호: KCTC13152BP)는 약독화되어 백신으로 사용 가능함을 확인할 수 있었다.

실시예 6. 목적동물에 대한 면역원성 및 방어효과 확인

본 발명자들은 상기 실시예 5에서 확인된 약독화주(100대 계대 배양된 분리주, 수탁번호: KCTC13152BP)를 본 발명의 시험백신으로서 용법 및 용량에 따라 목적동물인 자돈(3주령 이상)에 경구 투여하였을 때, 유효한 수준의 항체가의 형성 여부와 공격 접종시 방어능 여부를 확인하였다.

돼지 회장염균(Lawsonia intracellularis)에 감수성 있는 3주령 돼지 7두 중 3두에 2ml씩 경구투여하여 백신 접종시키고, 나머지 4두는 비백신 대조군으로 하였다.

6-1. 본 백신의 면역원성 확인

본 발명자들은 본 발명의 백신의 면역원성을 확인하기 위하여, 백신접종전과 접종 1주 후, 2주 후, 3주 후(공격접종), 4주 후, 5주 후, 6주 후에 백신 접종군과 대조군을 모두 채혈하여 혈청을 분리, 비동화(56℃, 30분)하여 IFA(Indirect fluorescent antibody) 시험 방법으로 항체가를 측정하였다.

상기 IFA 시험 방법은 다음과 같다: 96웰 조직배양플레이트의 각 웰에 5 X 10³의 농도로 세포를 24시간 배양한 후 10⁵의 Lawsonia intracellularis를 감염시켰다. 이 조직배양 플레이트를 37℃, 혐기조건(8.8% CO₂, 8% O₂)에서 5일간 배양한 후, 상층액을 제거하고 아세톤과 메탄올을 50:50으로 희석한 용액을 이용하여 감염세포 단층을 고정하였다. 그리고 채혈된 혈액에서 혈청을 분리하고, 최초 1:30 농도의 희석 혈청을 시작으로 2진법으로 희석하여 감염세포 플레이트에 적용하여 37℃에서 30분간 반응하였다. 그리고 나서 30분간 PBS로 5차례 세척한 후 anti-swine IgG FITC conjugate 이용하여 37℃에서 30분간 반응시킨 후 형광현미경 하에서 관찰하였다. 200배에서 400배의 배율에서 형광을 발하는 세균항원이 관찰되는 경우 양성으로 판정하였다.

그 결과, 하기 표 6에 나타낸 바와 같이, 백신접종 돼지의 주기별 항체가는 백신군 개체 모두 접종 후 21일부터 항체가 형성되어 실험이 종료되는 시점까지 꾸준히 증가하는 양상을 나타내었다. 또한, 대조군 돼지는 모두 음성으로 나타나, 본 발명의 시험백신이 만족할 만한 수준의 면역원성을 지니고 있음을 확인할 수 있었다.

6-2. 공격접종에 대한 방어효과 확인

본 발명자들은 본 발명의 백신의 방어효능을 확인하기 위하여, 항체가 검사를 위하여 공시한 돼지를 방어효과 시험용 돼지로 이용하였다. 즉, 백신 접종 3주 후, 회장염 원인균(L. intracellularis)에 대한 방어효능을 확인하기 위하여, 백신 접종군 3두와 대조군 2두에 병원성이 있는 L. intracellularis 배양균액(10^7.7TCID₅₀/dose) 2ml를 경구로 투여하고 나머지 대조군 2두는 무처치하여 3주간 설사, 식욕부진, 폐사 등 임상증상을 조사하였다. 또한, 공격접종 후 21일간 분변을 통한 공격 접종균의 배출여부를 주기적으로 확인하였다. 관찰기간이 종료된 돼지는 부검을 실시하여 임상병리 소견을 조사하고 회장 등의 가검물에서 L. intracellularis 검출유무를 검사하였다. 또한 방어효과 시험 기간 동안의 시험돈의 증체율을 확인하였다.

그 결과, 하기 표 7에 나타낸 바와 같이, 방어효능을 확인하기 위하여 백신을 투여한 자돈에 병원성 있는 분리주로 공격접종을 실시한 경우, 백신 접종군 모두 회장염의 임상증상 없이 생존하였으며 백신을 접종하지 않은 양성 대조군에서는 설사, 식욕부진 등의 임상증상을 나타내었다.

또한, 하기 표 8 및 도 7에 나타낸 바와 같이, 부검시 시험돈의 육안병변을 확인한 결과, 백신군 돼지의 장에서는 회장염 특유의 장 병변이 관찰되지 않았으나, 양성대조군 돼지에서는 장 비후 및 출혈 등의 병변이 관찰되었으므로 본 발명의 시험백신이 만족할만한 방어효과를 가지고 있음을 확인할 수 있었다.

또한, 하기 표 9에 나타낸 바와 같이, 분변을 통한 균 배출을 확인한 결과, 백신군 돼지의 분변에서의 접종 후 7일째부터 검출되었으며, 35일 시점까지 계속되었다. 반면에 동일한 실험기간 동안 음성대조군 돼지의 분변에서는 어떠한 균체도 관찰되지 않았다.

또한, 하기 표 10에 나타낸 바와 같이, 장 조직에서의 균 동정을 확인한 결과, 백신군 돼지의 장에서는 검출되지 않은 반면, 양성대조군 돼지의 장에서는 검출되었다.

또한, 도 8에 나타낸 바와 같이, 공격접종 후 시험돈의 평균 체중 변화를 확인한 결과, 양성대조군에서는 증체율 저하가 확인되었으며, 백신군에서는 양성대조군에 비해 높은 증체율을 관찰할 수 있었다.

실시예 7. 목적동물에 대한 방어효과 비교확인

본 발명자들은 본 발명의 시험백신[녹수 p100 고역가(10^9.3TCID₅₀/dose) 및 녹수 p100 저역가(10^6.0TCID₅₀/dose); 1 dose=1 ml] 및 상업적으로 이용되고 있는 백신인 베링거 백신(10^6.0 TCID₅₀/dose)을 각각 목적동물인 자돈(3주령 이상)에 접종한 후 공격 접종한 경우 방어능 여부를 비교 확인하기 위하여, 분변 PCR 및 혈청(ELISA) 검사를 실시하였다. 또한, 관찰기간이 종료된 돼지는 부검을 실시하여 임상병리 소견을 확인하였다. 실험군별 조건은 하기 표 11에 나타내었다.

	방어효과 시험
Group	녹수 (p100, 고역가)	녹수 (p100, 저역가)	베링거백신	Cont.
Group	녹수 (p100, 고역가)	녹수 (p100, 저역가)	베링거백신	challenge	Neg.
개체수	3마리	3마리	3마리	3마리	2마리
개체번호	6B-3 6B-6 6R-9	6R-1 6B-7 6B-9	6R-4 6R-5 1-1	G2적 G2황 G2무
백신접종	2ml/두, Oral	2ml/두, Oral	2ml/두, Oral	-	-
공격접종	접종 후 3주차 - PHE(P5) 2ml (10^7.7TCID₅₀/dose)				-
부검	6주차, 10주차 - 부검

PHE(Proliferative Hemorrhagic Enteropathy)

7-1. 분변 PCR 결과 확인

각 실험군 별 분변을 PCR로 분석하였다.

그 결과, 하기 표 12에 나타낸 바와 같이, 분변 PCR에서 모든 백신 접종군들 (고역가군, 저역가군 및 베링거 백신군)이 비백신 대조군(challenge cont.)에 비하여 공격접종 후 35일째부터 분변을 통한 균 배출량이 적었음을 확인하였다.

	p100, 고역가			베링거 백신			p100, 저역가			challenge cont.
개체번호	6B-3	6B-6	6R-9	6R-4	6R-5	1-1	6B-7	6B-9	6R-1	G2적	황	무
채혈일	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
11/10 (7DPI)	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
11/18 (15DPI)	-	-	-	-	-	-	-	-	-
11/24 (21DPI)	-	-	-	-	-	-	-	-	-
12/1 (28DPI)	±	±	-	+약	+약	-	+약	-	+약	+약	+약	+약
12/8 (35DPI)	++	-	-	+약	+약	-	+약	+	+++	++	+	-
12/15 (42DPI)			+		+			++		+++	++	+
12/22 (49DPI)	+	+약		+++		+	+++		+++
1/14 (72DPI)	-	급사		+		-	-		-

p100 고역가는 본 발명의 백신 접종군(10^9.3TCID₅₀/dose)을 가르킨다.

p100 저역가는 본 발명의 백신 접종군(10^6.0TCID₅₀/dose)을 가르킨다.

베링거 백신은 비교 백신 접종군(저역가, 10^6.0TCID₅₀/dose)을 가르킨다.

challenge cont.은 비백신 대조군을 가르킨다.

7-2. 혈청(ELISA) 검사 결과 확인

각 실험군 별 혈청을 ELISA로 분석하였다.

그 결과, 표 13에 나타낸 바와 같이, 증식성회장염 균에 대한 면역반응으로 나타난 ELISA항체가 검사결과, 백신 접종 후 3주째 고역가 백신군 1마리와 베링거백신군 1마리가 양전되는 것이 확인되었고, 공격접종 후 7일째 고역가 백신군은 모두 양전되었으나 베링거백신군과 저역가 백신군, 대조군은 2주째부터 양전되기 시작하여 3주째 모든 돼지가 양전되었다.

	p100, 고역가			베링거 백신			p100, 저역가			challenge cont.
개체번호	6B-3	6B-6	6R-9	6R-4	6R-5	1-1	6B-7	6B-9	6R-1	G2적	황	무
채혈일	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
11/3 (0DPI)	-	-	-	-	-	-	-	-	-
11/17 (14DPI)	-	-	-	-	-	-	-	-	-
11/25 (22DPI)	-	-	+	-	+	-	-	-	-	-	-	-
12/1 (28DPI)	-	±	+	-	-	-	-	-	-	-	-	-
12/8 (35DPI)	+	±	-	-	±	-	-	+	+	+	-	-
12/17 (44DPI)	+	+	-	+	-	+	+	+	+	+	+	+
12/22 (49DPI)	+	+		+	-	+	+		+

7-3. 임상병리 결과 확인

각 실험군 별 임상병리학적 결과를 분석하였다.

그 결과, 표 14에 나타낸 바와 같이, 모든 백신 접종군들이 비백신 대조군에 비하여 공격접종 후 회장의 육안 병변 및 병리조직 검사결과 상에서 현저히 완화된 병리소견을 나타내었다.

따라서, 본 발명의 고역가 백신이 통상적으로 이용되고 있는 백신 및 본 발명의 저역가 백신에 비하여 분변을 통한 균 배출량, 회장의 육안 병변 및 조직 병리학적인 병리소견이 상대적으로 더 완화된 것을 확인하였다.

실시예 8. 공격 접종 후 방어효과 확인

본 발명자들은 본 발명의 시험백신(GCVP; 10^6.0TCID₅₀/dose) 및 상업적으로 이용되고 있는 기존 백신인 베링거 백신(BI; 10^6.0 TCID₅₀/dose) 2ml을 각각 목적동물인 자돈(3주령 이상)에 접종한 지 3 주 후 공격 접종(병원성이 있는 L. intracellularis 배양균액(10^7.7TCID₅₀/dose) 2 ml를 경구 투여)한 경우 박테리아 방출(shedding) 기간, 항체 반응 및 조직병리학적 변화를 추가적으로 확인하였다.

8-1. 박테리아 배출(shedding) 시기 확인

각 실험군 별 박테리아 배출 기간을 분석하였다.

그 결과, 표 15에 나타낸 바와 같이, 본 백신 접종군이 기존 백신 대조군에 비하여 병원균을 경쟁적으로 먼저 신속하게 밖으로 배출시켰다.

Group	GCVP	BI	대조군
배출 기간(Shedding duration)	56 dpi	= 70 dpi	= 70 dpi

8-2. 항체 반응 결과 확인

각 실험군 별 항체 반응을 분석하였다.

그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 백신 접종 후 공격접종 후 증식성회장염균에 대한 주기적인 혈청학적(ELISA) 양성율을 나타내며, 본 발명의 백신주와 베링거백신 간의 혈청학적인 면역반응에 있어 차이가 없음을 나타낸다.

8-3. 병리조직결과 확인

각 실험군 별 목적 장기에서의 병리학적 변화를 분석하였다.

그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, 백신 접종 후 3주째 병원성 원인균으로 모든 시험군의 동물에 공격접종을 실시하여 목적장기인 소장(회장포함)의 병리조직학적 변화를 수치화하였다. 비백신군에 비하여 본 백신접종군은 기존 백신인 베링거백신 접종군에서의 병리적인 변화와 거의 동일하게 매우 적게 나타났으며, 이는 본 발명이 저역가일경우에도 기존 백신만큼 효과적인 방어표과를 나타낸다는 것을 의미한다.

따라서, 본 발명에 따른 신규한 로소니아 인트라셀룰라리스 균주를 포함하는 백신은 기존 백신 대조군에 비하여 효과적이면서 안전한 백신 효능을 나타낸다는 것을 확인할 수 있다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

한국생명공학연구원

KCTC13152BP

20161108

<110> GREEN CORSS VETERINARY PORDUCTS CO., LTD <120> Novel Lawsonia intracellularis and Uses Thereof <130> GCVP1-15p <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 633 <212> RNA <213> Lawsonia intracellularis 16S rRNA <400> 1 cttgagacgg ggataacggc tggaaacggt cgctaatacc ggataaccat tatggtaaaa 60 agttgtagtg caaagggtag cctctgtatg taagctatcg cttgaagatg agtccgcgtc 120 ccattagcta gttggtgagg taaatgctca ccaaggcgat gatgggtagc cgatctaaga 180 ggataatcgg ccacactgga actggaacac ggtccagact cctacgggag gcagcagtgg 240 ggaatattgc gcaatgggcg aaagcctgac gcagcgacgc cgcgtgaggg atgaaggtct 300 ttggatcgta aacctctgtc aggggggaag aaatggatgg gctctaatag ggtctatttt 360 tgacggtacc cccagaggaa gcaccggcta actccgtgcc agcagccgcg gtaatacgga 420 gggtgcaagc gttaatcgga attactgggc gtaaagcgcg cgtaggtggt tatataagtc 480 aggggtgaaa gcccaccgct taacggtgga acagcctttg atactgtata acttgagtat 540 cggagagggt ggcggaattc caggtgtagg ggtgaaatcc gtagatatct ggaggaacac 600 cagtggcgaa ggcggccacc tggacgataa ctg 633

Claims

수탁번호 KCTC13152BP로 기탁된 로소니아 인트라셀룰라리스(Lawsonia intracellularis) 균주.
제1항에 있어서, 상기 균주는 약독화 또는 불활성화된 것을 특징으로 하는 균주.
제2항에 있어서, 상기 약독화는 5세대 내지 200세대를 연속 계대배양에 의한 것을 특징으로 하는 균주.
제1항에 있어서, 상기 균주는 서열번호 1에 기재된 16S rRNA 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 균주.
다음 단계를 포함하는, 수탁번호 KCTC13152BP로 기탁된 로소니아 인트라셀룰라리스(Lawsonia intracellularis) 균주 제작 방법:
(a) 로소니아 인트라셀룰라리스(Lawsonia intracellularis) 양성 가검물 장 조직에서 분리체를 수득하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 분리체를 CV-1(ATCC CCL-70) 세포에 접종감염시키는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계의 감염세포를 5세대 내지 200세대 연속 계대배양하여 약독화시키는 단계.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 수탁번호 KCTC13152BP로 기탁된 로소니아 인트라셀룰라리스(Lawsonia intracellularis) 균주를 유효 성분으로 포함하는 증식성 회장염(proliferative enteritis)의 예방 또는 치료용 백신 조성물.
제6항의 백신 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 증식성 회장염(proliferative enteritis)의 예방 또는 치료 방법.