PL189286B1 - Zastosowanie atenuowanego szczepu Lawsonia intracellularis - Google Patents
Zastosowanie atenuowanego szczepu Lawsonia intracellularisInfo
- Publication number
- PL189286B1 PL189286B1 PL96358165A PL35816596A PL189286B1 PL 189286 B1 PL189286 B1 PL 189286B1 PL 96358165 A PL96358165 A PL 96358165A PL 35816596 A PL35816596 A PL 35816596A PL 189286 B1 PL189286 B1 PL 189286B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- intracellularis
- cells
- cultures
- culture
- lawsonia intracellularis
- Prior art date
Links
- 241001148567 Lawsonia intracellularis Species 0.000 title claims abstract description 140
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 title claims abstract description 45
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 82
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 57
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 54
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 30
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 26
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims abstract description 26
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 26
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims abstract description 25
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims abstract description 14
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 claims abstract description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 45
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 144
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 62
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 54
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 44
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 42
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 37
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 37
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 35
- 239000000463 material Substances 0.000 description 34
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 30
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 28
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 21
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 21
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 21
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 20
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 20
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 17
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 17
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 17
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 16
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 14
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 14
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 14
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 14
- 108010059993 Vancomycin Proteins 0.000 description 13
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 13
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 13
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 13
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 13
- 229960003165 vancomycin Drugs 0.000 description 13
- MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-N vancomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=C2C=C3C=C1OC1=CC=C(C=C1Cl)[C@@H](O)[C@H](C(N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H]3C(=O)N[C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](C3=CC(O)=CC(O)=C3C=3C(O)=CC=C1C=3)C(O)=O)=O)[C@H](O)C1=CC=C(C(=C1)Cl)O2)=O)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC)[C@H]1C[C@](C)(N)[C@H](O)[C@H](C)O1 MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-N 0.000 description 13
- MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N vancomycin Natural products O1C(C(=C2)Cl)=CC=C2C(O)C(C(NC(C2=CC(O)=CC(O)=C2C=2C(O)=CC=C3C=2)C(O)=O)=O)NC(=O)C3NC(=O)C2NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CC(C)C)NC)C(O)C(C=C3Cl)=CC=C3OC3=CC2=CC1=C3OC1OC(CO)C(O)C(O)C1OC1CC(C)(N)C(O)C(C)O1 MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N Amphotericin-B Natural products O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1C=CC=CC=CC=CC=CC=CC=C[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N 0.000 description 12
- 229960003942 amphotericin b Drugs 0.000 description 12
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 12
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 12
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 12
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 11
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 11
- 210000003405 ileum Anatomy 0.000 description 11
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 10
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 10
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 10
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 10
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 10
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 10
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 9
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 8
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 8
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 8
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 8
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 8
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 8
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 7
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 7
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 7
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 7
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 7
- 238000012809 post-inoculation Methods 0.000 description 7
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 7
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 7
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 6
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 6
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 6
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 6
- 229930195714 L-glutamate Natural products 0.000 description 5
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 5
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 5
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 5
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 5
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 5
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 5
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 5
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 4
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 4
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 4
- 210000001630 jejunum Anatomy 0.000 description 4
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 4
- 210000002741 palatine tonsil Anatomy 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 3
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 244000144980 herd Species 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- 210000002490 intestinal epithelial cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 3
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 3
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 3
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 3
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 208000004232 Enteritis Diseases 0.000 description 2
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methylglycine Chemical compound OCC(CO)(CO)[NH2+]CC([O-])=O SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011887 Necropsy Methods 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 208000012868 Overgrowth Diseases 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 2
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 2
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 2
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 210000001842 enterocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000002550 fecal effect Effects 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 238000007490 hematoxylin and eosin (H&E) staining Methods 0.000 description 2
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000000527 lymphocytic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 2
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 2
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 2
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 210000004876 tela submucosa Anatomy 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- NUKQEEMKQGMUQH-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-1-nitrosoguanidine Chemical compound O=NN(C)C(N)=N NUKQEEMKQGMUQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 239000010755 BS 2869 Class G Substances 0.000 description 1
- 208000034309 Bacterial disease carrier Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000282421 Canidae Species 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 241000867607 Chlorocebus sabaeus Species 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 206010012741 Diarrhoea haemorrhagic Diseases 0.000 description 1
- 241000271559 Dromaiidae Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 206010022653 Intestinal haemorrhages Diseases 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 241001469654 Lawsonia <weevil> Species 0.000 description 1
- 241000376148 Lawsonia intracellularis N343 Species 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000282339 Mustela Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 241000255969 Pieris brassicae Species 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 206010037549 Purpura Diseases 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 108010073771 Soybean Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000271567 Struthioniformes Species 0.000 description 1
- UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N Syringetin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2=C(C(=O)C3=C(O)C=C(O)C=C3O2)O)=C1 UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007997 Tricine buffer Substances 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- DVKFVGVMPLXLKC-PUGXJXRHSA-N [(2s,3r,4s,5s,6r)-2-[(2s,3s,4s,5r)-3,4-dihydroxy-2,5-bis(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl] dihydrogen phosphate Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@]1(CO)[C@@]1(OP(O)(O)=O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 DVKFVGVMPLXLKC-PUGXJXRHSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 229940008309 acetone / ethanol Drugs 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940126575 aminoglycoside Drugs 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 235000021052 average daily weight gain Nutrition 0.000 description 1
- 235000021053 average weight gain Nutrition 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- OHJMTUPIZMNBFR-UHFFFAOYSA-N biuret Chemical compound NC(=O)NC(N)=O OHJMTUPIZMNBFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000027503 bloody stool Diseases 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 210000004671 cell-free system Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 235000021051 daily weight gain Nutrition 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N dihydrochrysin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C2)=C1 KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 208000037902 enteropathy Diseases 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 208000037828 epithelial carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 210000003736 gastrointestinal content Anatomy 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 208000035861 hematochezia Diseases 0.000 description 1
- 230000000521 hyperimmunizing effect Effects 0.000 description 1
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001524 infective effect Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 208000028774 intestinal disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 229940057995 liquid paraffin Drugs 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 229960005030 other vaccine in atc Drugs 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 235000020030 perry Nutrition 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 206010034754 petechiae Diseases 0.000 description 1
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 1
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 1
- CEAVGODCDNSBKB-QTNFYWBSSA-L potassium;sodium;(2s)-2-aminopentanedioate Chemical compound [Na+].[K+].[O-]C(=O)[C@@H](N)CCC([O-])=O CEAVGODCDNSBKB-QTNFYWBSSA-L 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000005464 sample preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000013341 scale-up Methods 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000009528 severe injury Effects 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 229940001941 soy protein Drugs 0.000 description 1
- 238000012453 sprague-dawley rat model Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 1
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/554—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being a biological cell or cell fragment, e.g. bacteria, yeast cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/105—Delta proteobacteriales, e.g. Lawsonia; Epsilon proteobacteriales, e.g. campylobacter, helicobacter
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
- C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/90—Isomerases (5.)
- C12N9/92—Glucose isomerase (5.3.1.5; 5.3.1.9; 5.3.1.18)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56911—Bacteria
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56911—Bacteria
- G01N33/56922—Campylobacter
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
- A61K2039/521—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells inactivated (killed)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
- A61K2039/522—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells avirulent or attenuated
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
- A61K2039/552—Veterinary vaccine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
- G01N2469/20—Detection of antibodies in sample from host which are directed against antigens from microorganisms
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
- Y10S424/825—Bacterial vaccine for porcine species, e.g. swine
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Mycology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
Abstract
1. Zastosowanie atenuowanego szczepu Lawsonia intracellularis, wytworzonego przez otrzymywanie hodowli komórkowych, zwlaszcza Hep-2, McCoy i IEC-18 zakazonych bakteria Lawsonia intracellularis, inkubowanie wymienionych zakazonych komórek w stezeniu tlenu od okolo 0 % do okolo 18%, wytrzasanie wymienionych zakazonych komórek tak by hodowac Lawsonia intracellularis podczas utrzymywania wy- mienionych zakazonych komórek w zawiesinie, pasazowanie przynajmniej czesci wymienionych hodowa- nych bakterii, zbieranie przynajmniej czesci hodowli wymienionych hodowanych bakterii i wybieranie szczepów atenuowanych w celu dostarczenia atenuowanej bakterii Lawsonia intracellularis do wytwarzania szczepionki do wywolania odpowiedzi immunologicznej przeciwko bakterii Lawso- nia intracellularis zwlaszcza ATCC 55783 u zwierzat 2. Zastosowanie wedlug zastrz. 1, znam ienne tym, ze wymienionym szczepem atenuowanym jest szczep N343NP40wk. 3. Zastosowanie atenuowanego szczepu Lawsonia intracellularis wytworzonego przez otrzymywanie hodowli komórkowych, zwlaszcza Hep-2, McCoy i IEC-18 zakazonych bakteria Lawsonia intracellularis, inkubowanie wymienionych zakazonych komórek w stezeniu tlenu od 2 % do okolo 18%, wytrzasanie wy- mienionych zakazonych komórek tak by hodowac Lawsonia intracellularis podczas utrzymywania wymie- nionych zakazonych komórek w zawiesinie, pasazowanie przynajmniej czesci wymienionych hodowanych bakterii, zbieranie przynajmniej czesci hodowli wymienionych hodowanych bakterii i wybieranie szczepów atenuowanych w celu dostarczenia atenuowanej bakterii Lawsonia intracellularis do wytwarzania szczepionki do wywolania odpowiedzi immunologicznej przeciwko bakterii Lawso- nia intracellularis zwlaszcza ATCC 55783 u zwierzat. PL PL PL PL PL PL PL PL
Description
Niniejszy wynalazek dotyczy zastosowania atenuowanego szczepu Lawsonia intracelluraris do wytwarzania szczepionki do wywołania odpowiedzi immunologicznej przeciwko bakterii Lawsonia intracellularis. Zastosowanie według wynalazku jest dostępne jako wynik wynalezienia ulepszonych sposobów hodowania na wielką skalę zasobów L. intracellularis.
L. intracellularis, czynnik wywołujący enteropatię proliferacyjną u świń (PPE), skutecznie atakuje wszystkie zwierzęta, w tym ludzi, króliki, fretki, chomiki, lisy, konie i inne zwierzęta tak odmienne jak strusie i emu.
Zakażenie L. intracellularis powoduje znaczne straty szczególnie w stadach świń. Oceniając rozpowszechnienie i występowanie PPE w USA szacuje się, że około 20 procent trzody chlewnej jest zakażone z szacunkową stratą 20 milionów dolarów rocznie.
Stałą cechą PPE jest występowanie wewnątrzcytoplazmatycznych, nie związanych z błoną zakrzywionych bakterii w enterocytach zakażonych fragmentów jelita. Bakteria związana z wywołaniem PPE opisywana jako „organizmy podobne do Campylobacter”. S. McOrist i in., Vet. Pathol., Vol. 26, 260-64 (1989). Następnie, bakteria wywołująca to schorzenie została zidentyfikowana jako nowy taksonomiczny rodzaj i gatunek,· endemicznie opisywany jako wewnątrzkomórkowy symbiont jelitowy (IS). C. Gebhart i in., Int'l. J. of Systemie Bacteriology, Vol. 43, No 3, 533-38 (1993). Obecnie, tym nowym bakteriom nadano taksonomiczną nazwę Lawsonia (L.) intracellularis. S. McOrist i in., Int'l. J. of Systemie Bacteriology, Vol. 45, No 4, 820-25 (1995). Te trzy nazwy używano zamiennie do opisania tego samego organizmu dalej tu zidentyfikowanego i opisanego. W dyskusji niniejszego wynalazku usiłowano używać nazwę taksonomiczną L. intracellularis.
189 286
L. intracellularis jest obligatoryjną, wewnątrzkomórkową bakterią, która nie może być hodowana zwykłymi metodami bakteriologicznymi w konwencjonalnych pozbawionych komórek pożywkach i wydaje się, że wymaga do wzrostu dołączenia komórek nabłonkowych. S. McOrist i in., w Infection and Immunity, Vol. 61, nr 10, 4286-92 (1993) i G. Lawson i in., w J. of Clinical Microbiology, Vol. 31, nr 5, 1136-42 (1993) omawiają hodowanie L. intracellularis przy użyciu hodowli jednowarstwowych komórek nabłonkowych szczurów IEC-18 w zwykłych butelkach do hodowli tkankowej. Dodatkowo, H. Stills, w Infection and Immunity, Vol. 59, nr 9, 3227-36 (1991) omawia zastosowanie hodowli jednowarstwowych ludzkich, płodowych komórek nabłonkowych Intestine 407 i hodowli jednowarstwowych raka nabłonkowego okrężnicy świnki morskiej GPC-16 w zwykłych butelkach do hodowli tkankowych. Te wcześniejsze sposoby hodowli wymagają dużego nakładu pracy i są bezwartościowe w hodowli na dużą skalę.
Obecne zrozumienie zakażenia L. intracellularis, leczenie i skuteczna kontrola choroby są poważnie hamowane przez wymyślne potrzeby L. intracellularis w hodowli in vitro. Istnieje obecnie potrzeba polepszenia sposobu hodowania L. intracellularis. Istnieje również obecnie zapotrzebowanie na szczepionki przeciwko L. intracellularis i skuteczne narzędzia do diagnostyki zakażenia L. intracellularis.
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest zastosowanie atenuowanego szczepu Lawsonia intracellularis wytworzonego przez otrzymywanie hodowli komórkowych, zwłaszcza Hep-2, McCoy i IEC-18 zakażonych bakterią Lawsonia intracellularis, inkubowanie wymienionych zakażonych komórek w stężeniu tlenu od około 0% do około 18%, wytrząsanie wymienionych zakażonych komórek tak by hodować Lawsonia intracellularis podczas utrzymywania wymienionych zakażonych komórek w zawiesinie, pasażowanie przynajmniej części wymienionych hodowanych bakterii, zbieranie przynajmniej części hodowli wymienionych hodowanych bakterii i wybieranie szczepów atenuowanych w celu dostarczenia atenuowanej bakterii Lawsonia intracellularis do wytwarzania szczepionki do wywołania odpowiedzi immunologicznej przeciwko bakterii Lawsonia intracellularis zwłaszcza ATCC 55783 u zwierząt.
Korzystnie wymienionym szczepem atenuowanym jest szczep N343NP40wk.
Odmianą zastosowania według wynalazku jest zastosowanie atenuowanego szczepu Lawsonia intracellularis wytworzonego przez otrzymywanie hodowli komórkowych, zwłaszcza Hep-2, McCoy i IEC-18 zakażonych bakterią Lawsonia intracellularis, inkubowanie wymienionych zakażonych komórek w stężeniu tlenu od 2 % do około 18%o, wytrząsanie wymienionych zakażonych komórek tak by hodować Lawsonia intracellularis podczas utrzymywania wymienionych zakażonych komórek w zawiesinie, pasażowanie przynajmniej części wymienionych hodowanych bakterii, zbieranie przynajmniej części hodowli wymienionych hodowanych bakterii i wybieranie szczepów atenuowanych w celu dostarczenia atenuowanej bakterii Lawsonia intracellularis do wytwarzania szczepionki do wywołania odpowiedzi immunologicznej przeciwko bakterii Lawsonia intracellularis zwłaszcza ATCC 55783 u zwierząt.
Do osiągnięcia tych i innych przedmiotów zgodnie z celem niniejszego wynalazku jak to zawarto i szeroko tutaj opisano, dostarczono metodę hodowania L. intracellularis i wytworzonych w ten sposób na wielką skalę zasobów bakterii. Zgodnie ze sposobem, bakterie L. intracellularis są inkubowane w stężeniu tlenu od około 0 do 18 procent, podczas pobudzania bakterii L. intracellularis do wzrostu, w czasie utrzymywania bakterii w zawiesinie.
Dostarczona jest również metoda hodowania bakterii L. intracellularis przez posianie na hodowle jednowarstwowe Hep-2, McCoys lub IEC-18, o około 30 procentowej zlewności, z materiałem inokulacyjnym zawierającym bakterie L. intracellularis do zakażania komórek. Zakażone komórki następnie inkubuje się w temperaturze od około 36°C do około 38°C w stężeniu tlenu od około 0 do 8,0 procent do osiągnięcia przez komorki zlewności. Zakażone komórki i pożywkę hodowlaną umieszcza się następnie w fermentatorach, hioreaktorach, butelkach typu spinner Iub innych pojemnikach, w których można utrzymywać komórki w zawiesinie. Zakażone komórki wytrząsa się podczas inkubacji komórek tak, że bakterie L. intracellularis są hodowane podczas utrzymywania zakażonych komórek w zawiesinie.
Część wyhodowanych L. intracellularis pasażuje się następnie do świeżych komórek hodowlanych w celu zwiększenia wytwarzania bakterii L. intracellularis.
189 286
Dzięki takiemu sposobowi wytwarzania można dostarczyć szczepionki stosowane do wywołania odpowiedzi immunologicznej przeciwko L. intracellularis i sposobów wytwarzania szczepionki stosowanej do wywołania odpowiedzi immunologicznej przeciwko L. intracellularis.
Niezjadliwe bakterie L. intracellularis uzyskuje się przez pasażowanie wyhodowanych bakterii L. intracellularis w wystarczającej ilości w jednostce czasu i selekcję w celu uzyskania szczepów atenuowanych lub przez poddanie wyhodowanych bakterii działaniu środków chemicznych w celu uzyskania atenuacji. Szczepionki zawierające zabite L. intracellularis są również wytwarzane z zastosowaniem metod hodowania według wynalazku. Zgodnie ze szczególnie korzystnym wykonaniem bakterie są ciągle hodowane przez przynajmniej około 6 do 8 miesięcy, i w tym czasie są pasażowane przynajmniej od około 7 do 12 razy w celu wytworzenia atenuowanych szczepów w celu uzyskania szczepionki. Atenuowane bakterie miesza się następnie z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem i podaje zwierzętom w skutecznej ilości do uzyskania odpowiedzi immunologicznej. Aktualnie korzystny atenuowany szczep (N343P40wk) zdeponowano w American Type Culture Collection.
Dzięki tym metodom dostarczono również metodę oceny obecności w próbce biologicznej przeciwciał swoiście reagujących z bakteriami L. intracellularis przez zbieranie przynajmniej części wyhodowanych L. intracellularis, doprowadzenie do kontaktu próbki biologicznej z zebranymi hodowlami L. intracellularis Iub ich składnikiem w warunkach, w których przeciwciało obecne w próbce biologicznej reaguje z L. intracellularis Iub ich składnikiem i ocenę występującej reakcji przeciwciało-antygen.
Dodatkowe cechy i korzyści wynalazku zostaną następnie przedstawione w dalej następującym opisie i staną się jasne z opisu i mogą być poznane przez praktyczne zastosowanie wynalazku.
Opis korzystnych wykonań
Zastosowany tutaj termin „L. intracellularis” oznacza wewnątrzkomórkową, zakrzywioną, gram-ujemną bakterię opisaną szczegółowo przez C. Gebharta i in., Int'l J. of Systemie Bacteriology, vol. 43, nr 3, 533-38 (1993) i S. McOrist'a i in., Int'l J. of Systemie Bacteriology, vol. 45, nr 4, 820-25 (1995) (każde z nich włączone tutaj w całości przez piśmiennictwo) i obejmują, choć nie są ograniczone do bakterii zdeponowanej jako ATCC 55672 w American Type Culture Collection, Rockville, MD; bakterię zdeponowaną jako NTCT 12656 i 12657 w National Collection of Type Cultures, Colindale, London; bakteria wywołująca, która została uzyskana od świń zakażonych PPE i innych zwierząt wykorzystując światowy stan wiedzy i techniki; warianty i mutanty każdej z powyższych bakterii, uzyskane w sposób spontaniczny Iub sztuczny.
W sposób tutaj zastosowany termin „szczep atenuowany” oznacza każdy szczep L. intracellularis uzyskany zgodnie z technikami hodowli i pasażowania tutaj podanymi w celu uzyskania szczepów niezjadliwych przy zachowaniu własności immunogennych w czasie podawania gospodarzom zwierzęcym. Jak podano poniżej liczne, różne szczepy L. intracellularis hodowano i atenuowano zgodnie z współczesnymi technikami w celu uzyskania atenuowanych, immunogennych szczepów wykazujących skuteczność jako szczepionki dla świń i innych zwierząt wrażliwych na zakażenie L. intracellularis.
Oczekuje się, że atenuowane szczepy posiadają własności jako immunogeny w szczepionkach przeciwbakteryjnych dla zwierząt, włączając w to ptaki, ryby, bydło, świnie, konie, ssaki i ogólnie naczelne, w tym ludzi. Takie szczepionki mogą być przygotowane stosując techniki znane specjalistom wykorzystując wskazówki zawarte tutaj. Taka szczepionka powinna obejmować skuteczną ilość atenuowanego szczepu w farmaceutycznie dostępnym nośniku. Szczepionka może być podawana w jednej Iub więcej dawkach. Immunologicznie skuteczna ilość jest określana środkami znanymi w stanie techniki bez zbytnich eksperymentów, wykorzystując wskazówki zawarte tutaj. Ilość niezjadliwej bakterii powinna być wystarczająca do pobudzenia odpowiedzi immunologicznej u zwierząt wrażliwych na to schorzenie, podczas gdy ta ilość stale pozostaje niezjadliwa. Zależy ona od poszczególnych zwierząt, bakterii i schorzeń towarzyszących. Zalecana podawana dawka wynosi korzystnie od około 10 do 10y bakterii/kg wagi ciała i najkorzystniej od około lO5 do lO7 bakterii/kg wagi ciała. Nośniki są znane specjalistom i obejmują stabilizatory i rozpuszczalniki. Taka szczepionka może rów189 286 nież zawierać odpowiedni adiuwant. Szczepionki mogą być stosowane w kombinacji z innymi szczepionkami, na przykład jako rozpuszczalnik innej liofilizowanej szczepionki, lub połączone przed liofilizacją z inną szczepionką. Preparaty szczepionek mogą być również wysuszane, na przykład przez suche zamrażanie w celu przechowywania lub przez następową formulację w płynne szczepionki.
Odpowiednio, wynalazek w formie zastosowania medycznego obejmuje sposób pobudzenia odpowiedzi immunologicznej na zjadliwe, bakterie L. intracellularis typu dzikiego u zwierząt gospodarzy, w celu zabezpieczenia gospodarzy przed takimi bakteriami. Sposób obejmuje podawanie gospodarzowi immunologicznie efektywnej ilości atenuowanych lub zabitych bakterii otrzymanych według wynalazku, i korzystnie podawanie gospodarzowi szczepionki otrzymanej z zastosowaniem wynalazku.
Jak użyto tutaj termin „hodowla na wielką skalę” oznacza poziom hodowli L. intracellularis większy niż około 2,0 do 3,0 litrów i obejmujący produkcję na skalę 100 lub więcej litrów. „Hodowanie” w sposób tu użyty oznacza proces promowania wzrostu, reprodukcji i/lub proliferacji L. intracellularis.
W praktycznym wykorzystaniu zastosowania sposobu hodowania, komórki hodowlane mogą być najpierw zakażane materiałem zakażającym zawierającym bakterie L. intracellularis, tak by uzyskać komórki zakażone. Ilość linii komórkowych stosowanych w praktycznym wykonaniu wynalazku, obejmuje lecz nie jest ograniczona do: IEC-18 (ATCC 1589)- szczurzych komórek nabłonka jelitowego, Hep-2 (ATCC 23) - ludzkich komórek raka nabłonkowego, McCoys (ATCC 1696) - mysich komórek (nie określone), MDCK (ATCC 34) - psich komórek nerki Madin-Darby, BGMk (Biowhittaker #71-176) - komórek nerki małp „buffalo green” i komórek nabłonka jelitowego świni. Korzystnymi komórkami hodowlanymi są komórki Hep-2, McCoys lub iEC-18. Alternatywnie, bakterie mogą być hodowane w układach bezkomórkowych, tak długo jak bakterie są utrzymywane w odpowiednim stężeniu tlenu takim jak tu podano.
Jeśli używa się komórki hodowlane, to przed zakażeniem, komórki korzystnie, lecz nie koniecznie powinny występować w postaci hodowli jednowarstwowej. By uzyskać postać hodowli jednowarstwowej, komórki mogą być hodowane w zwykłych butelkach hodowlanych. W każdej butelce można hodować komórki zmieszane z pożywką hodowlaną w ilości między około 1x IO5 komórek do około 10 x IO5 komórek na butelkę o pojemności 25 cm2. Pożywką hodowlaną może być każda pożywka hodowlana, która obejmuje źródło azotu, potrzebne czynniki wzrostowe dla wybranych komórek hodowlanych i źródło węgla, takie jak glukoza i laktoza. Korzystną pożywką jest DMEM z 2-5% bydlęcą surowicą płodową, jednakże różne inne dostępne na rynku pożywki mogą być stosowane z dobrym wynikiem.
Stwierdzono, że udane hodowanie L. intracellularis jest zwiększone przez utrzymywanie komórek hodowlanych na stałym poziomie wzrostu. Tak więc, hodowla jednowarstwowa komórek powinna mieć od około 20% do około 50% zlewności w momencie zakażania. Korzystnie, hodowle komórkowe powinny mieć od około 30% do około 40% zlewności w momencie zakażania, 30% zlewność jest najkorzystniejsza.
Materiałem zakażającym może być uzyskana czysta hodowla L. intracellularis, na przykład z depozytu 55672 ATCC, depozytu 12656 lub 12657 NCTC, lub z zakażonych świń lub innych zwierząt, po zastosowaniu sposobów izolacji i oczyszczania opisywanych tutaj.
Zgodnie z jednym wykonaniem, materiałem zakażającym do praktycznego zastosowania w wynalazku jest homogenat jelitowy przygotowany przez zdrapanie śluzówki z jelit świni lub innych zwierząt zakażonych PPE. Podczas przygotowania homogenatu jelitowego, skrawki jelitowe wybrane do hodowli powinny wykazywać ciężkie uszkodzenie ze znacznym scieńczeniem śluzówki. W związku z chwiejną strukturą, próbki bakterii powinny być korzystnie umieszczone w -70°C tak szybko jak to możliwe po sekcji. Korzystnie jest dodać do materiału zakażającego antybiotyki, na które L. intracellularis jest oporna takie jak wankomycyna, amfoterycyna B i innych członków grupy aminoglikozydów, obejmujący gentamycynę i neomycynę, by nazwać jedynie kilka, w celu stłumienia zanieczyszczających bakterii, podczas wzrostu L. intracellularis. Gdy materiał zakażający jest czystą hodowlą lub homogenatem jelitowym, zakażenie hodowli komórkowej może być przeprowadzone różnymi technikami znanymi w stanie techniki podanymi tutaj.
189 286
Bakterie i/lub zakażone hodowle komórkowe są następnie inkubowane w warunkach zmniejszonego stężenia tlenu. W stężeniu tlenu większym niż 18% wzrost L. intracellularis jest mniejszy niż optymalny, z ograniczeniem wzrostu pojawiającym się gdy stężenie tlenu jest poza optymalnym zakresem. Korzystnie zakażone komórki hodowlane są inkubowane w stężeniu tlenu wahającym się w granicach od 0% do około 10%. Bardziej korzystnie, komórki są inkubowane w stężeniu tlenu w zakresie od około 0% do około 8%, najkorzystniejsze stężenie tlenu waha się od 0% do 3 %.
Właściwe stężenie dwutlenku węgla jest również ważne dla właściwego wzrostu L. intracellularis. W stężeniu dwutlenku węgla większym niż 10% i mniejszym niż 4% pojawia się wzrost nieoptymalny z ewentualnym ograniczeniem wzrostu w przy stężeniach poza tym zakresem. Korzystnie, stężenie dwutlenku węgla waha się w zakresie od około 6% do 9%, najkorzystniejszym stężeniem dwutlenku węgla jest stężenie około 8,8%.
Dodatkowo, komórki są inkubowane korzystnie w stężeniu wodoru wahającym się w granicach od 73% do 94%. Azot może być użyty w miejsce części łub całości obecnego wodoru. Zgodnie z korzystnym wykonaniem, komórki są inkubowane w stężeniu około 08,0% tlenu, około 8,8% dwutlenku węgla i około 83,2% wodoru.
Zakażone komórki mogą być inkubowane w podwójnym inkubatorze gazowym łub innej komorze gazowej zawierającej prawidłowe stężenie tlenu i dwutlenku węgla, i który pozwala na zawieszanie komórek w trakcie inkubacji. Komora powinna zawierać środki utrzymujące zakażone komórki w zawiesinie, monitor stężenia gazu i źródło pozwalające na utrzymanie prawidłowego stężenia gazów. Temperatura inkubacji powinna wahać się w granicach od 30°C do 45°C, bardziej korzystnie od 36°C do 38°C. Najkorzystniej temperatura powinna wynosić około 37°C. Konieczne wyposażenie do hodowli i sposoby atenuacji w zastosowaniu według wynalazku są tu dla specjalistów czytelnie przedstawione. Jednym z przykładów sprzętu potrzebnego do przeprowadzenia niniejszego wynalazku jest podwójny inkubator gazowy, np. model 480 dostępny z Lab-Line, Melrose Park, łllnois, w połączeniu z butelkami hodowlanymi typu spinner w celu utrzymania komórek w zawiesinie. Obecnie korzystne wyposażenie obejmuje fermentator, bioreaktor, wytrząsacz obrotowy zawierający przynajmniej 2 litry pożywki i jest zdolny do utrzymywania komórek hodowlanych w zawiesinie przy przepływającym gazie o odpowiednim stężeniu, łub inne środki do mechanicznego wytrząsania i monitorujące stężenie rozpuszczonego tlenu w pożywce. Odpowiednie fermentatory i bioreaktory można uzyskać od New Brunswick, Braun łub innych wytwarzających je przedsiębiorstw.
Maksymalny wzrost komórek i przez to L. intracellularis jest uzyskiwany przez utrzymywanie zakażonych komórek w zawiesinie w trakcie inkubacji, przez co jest zwiększona ekspozycja poszczególnych komórek na pożywkę hodowlaną i właściwą mieszaninę tlenu i dwutlenku węgla. Komórki hodowlane mogą być wytrząsane i utrzymywane w zawiesinie różnymi metodami znanymi w stanie techniki obejmującymi na przykład, butelki hodowlane, butelki hodowlane typu roller, hodowle błonowe i butelki hodowlane typu spinner. Komórki mogą być utrzymywane w zawiesinie podczas inkubacji przez inkubowanie komórek w butelkach hodowlanych typu spinner wewnątrz podwójnych inkubatorów gazowych łub innych podobnych urządzeń. Termin „butelki hodowlane typu spinner” w sposób tu zastosowany, oznacza butelki łub inne pojemniki, wykorzystujące łopatki, śmigła łub inne środki do wytrząsania hodowli i utrzymujące zawarte komórki w postaci zawiesiny.
W szczególnie korzystnym wykonaniu według wynalazku, zakażone komórki są inkubowane aż do osiągnięcia przez komórki zlewności i następnie komórki są umieszczane butelkach typu spinner zawierających pożywkę hodowlaną i inkubowane w podwójnym inkubatorze gazowym podczas wytrząsania butelki. Korzystnie zakażone komorki są zeskrobane do butelki typu spinner. Można to osiągnąć różnymi metodami znanymi w stanie techniki używając specjalnego skrobaka do komórek w celu odizolowania komórek. Gdy komórki zostaną wprowadzone do butelki typu spinner, wiosełko w butelce typu spinner jest obracane w zakresie od około 30 do około 60 obrotów/minutę w celu utrzymania zakażonych komórek w zawiesinie.
Część hodowanych L. intracellularis jest następnie pasa-żowana na świeże komórki hodowlane w celu zwiększenia produkcji bakterii L. intracellularis. Termin „pasażowanie” łub
189 286 jego odmiany oznacza proces przeniesienia porcji hodowanych L. intracellularis na świeże komórki hodowlane w celu zakażenia tych świeżych komórek bakteriami. Termin „świeże” w sposób tu zastosowany oznaczą komórki, które nie były do tej pory zakażone L. intracellularis. Korzystnie takie komórki są średnio nie starsze niż mniej więcej jednodniowe.
Pasażowi L. intracellularis w zawiesinach hodowlanych może towarzyszyć usunięcie części oryginalnej pożywki i dodanie jej do nowej butelki zawierającej nowe komórki hodowlane. W oryginalnych hodowlach jest wysoka ilości bakterii/ml, na przykład większe niż około 10 4 bidrteriiimll jest korzystnym dodanie między około 1 do 10% (objętość do objętości) hodowli z zakażonych butelek do nowych butelek zawierających świeże komórki. Korzystne jest przeprowadzenie tego gdy 50-100% komórek jest zakażonych. Jeśli mniej niż 50% komórek jest zakażonych, pasażowaniu korzystnie towarzyszy podzielenie hodowli 1:2 do nowych butelek i powiększenie objętości przez dodanie nowej pożywki. W tym przypadku, liza komórkowa i inne etapy nie są wymagane, jak to było w przypadku pasażu hodowli jednowarstwowych, tak jak to przeprowadzano według wcześniejszego stanu techniki.
Po wystarczającym wzroście komórek hodowlanych i następnym osiągnięciu przez zakażenie L. intracellularis więcej niż 70% zakażalności komórkowej, w sposób określony przez IFA, TCID 50 lub inne porównywalne metody jest następnie zbierana przynajmniej część hodowanych bakterii L. intracellularis. Etap zbierania hodowli bakteryjnych może być przeprowadzony przez separację bakterii z zawiesiny różnymi technikami znanymi specjalistom podanymi tutaj. Korzystnie hodowle L. intracellularis są zbierane przez wirowanie całej zawartości lub części zawiesiny do postaci peletek komórek hodowlanych, ponowne zawieszane peletek i liza zakażonych komórek. Typowo przynajmniej część zawartości jest wirowana w około 3000 x g przez około 20 minut w celu uzyskania peletek komórek i bakterii. Peletki mogą być następnie zawieszane w, na przykład roztworze sacharoza-fosforan-glutaminian (SPG) i przepuszczane około cztery razy przez igłę kaliber w celu lizy komórek. Następnie wymagane jest dalsze oczyszczanie, próbki mogą być wirowane w około 145 x g przez około 5 minut w celu usuwania jąder i resztek komórkowych. Supematant może być następnie wirowany w około 3000 x g przez około 20 minut i uzyskane peletki ponownie zawieszane w odpowiednim rozpuszczalniku, takim jak SPG z płodową surowicą bydlęcą (w celu przygotowania zebranych hodowli komórkowych do zamrożenia lub zastosowania jako materiał zakażający) lub pożywka hodowlana (w celu przygotowania zebranych hodowli komórkowych do pasażowania na świeże komórki).
Jak to wcześniej wspomniano, skuteczny wzrost L. intracellularis w produkcji na wielką skalę jest zwiększany przez utrzymywanie komórek w stanie aktywnego wzrostu. W przypadku hodowli jednowarstwowych, gdy hodowle stają się zlewne stopień podziałów komórkowych znacznie maleje. Próby wzrostu L. intracellularis w jednowarstwowych hodowlach tkankowych są ograniczone i nie jest możliwe zwiększenie skali hodowli. Tak więc zastosowanie zawiesin hodowlanych znacznie ułatwia utrzymanie aktywnego wzrostu komórkowego i ułatwia ciągłe zwiększanie hodowli i jej skali. Stosując fermentator i między około 0-3% rozpuszczonego tlenu, jak to wyjaśniono powyżej, można wyhodować do 10 8 bakterii/ml. Można również utrzymywać aktywny wzrost bakterii przez wiele miesięcy i można oczekiwać, że można utrzymywać je bez końca.
Przed niniejszym wynalazkiem uważano, że komórki muszą być przymocowane do powierzchni w celu zakażenia L. intracellularis. Zawiesina komórkowa według niniejszego wynalazku jest unikalna i przeciwstawia się tej teorii. Używając komórek McCoy'a i IEC-18, korzystne jest dodanie żelatyny, agarozy, kolagenu, akrylamidu lub krzemionkowych perełek, takich jak porowate nośniki Cultisphere-G wytwarzane przez HyClone Laboratories, Logan, UT razem z pożywką hodowlaną. Kornorki Uep-2 i inne me wymagają mrkronośmkow do hodowli zgodnie ze sposobem według wynalazku. Zapewnia to szczególne korzyści i ekonomiczny sposób hodowli na wielką skalę.
W celach utrzymania hodowli z hodowlami komórkowymi Hep-2, usuwane jest i zamieniane świeżą pożywką korzystnie 25-50% hodowli w odstępach tygodniowych. W celu hodowli komórkowych z mikronośnikami i perełkami, korzystnie 25-50% hodowli jest usuwane i zamieniane świeżą pożywką 1-2 razy w tygodniu. W hodowli na wielką skalę dodatkowe 25-50% pożywki, lub pożywki w mikronośnikami może być dodane do hodowli.
189 286
Zależnie od stopnia zakażenia komórek hodowlanych pasaż na świeże komórki następuje zwykle co dwa do pięciu tygodni. Zakładając, że komórki hodowlane są zakażone przynajmniej w 70% w ciągu 2-3 tygodni, korzystnie pasaż następuje co 3-4 tygodnie.
Niniejszy wynalazek dotyczący zastosowania dostarcza również szczepionkę i sposoby wytwarzania szczepionek przeciwko L. intracellularis. Zgodnie ze szczególnie korzystnym wykonaniem, po utrzymywaniu komórek w zawiesinie przez długi czas (na przykład, 6-8 miesięcy), przynajmniej część hodowanych bakterii L. intracellularis jest zbierana i sprawdzana w kierunku potencjalnej atenuacji. Takiemu monitorowaniu korzystnie towarzyszy prowokacja zwierząt lub modeli zwierzęcych w celu wybrania szczepu atenuowanego. Takie szczepy ate-nuowane są wykorzystywane do wytwarzania szczepionek zgodnie z zastosowaniem według wynalazku. Atenuowane szczepionki L. intracellularis zastosowane według niniejszego wynalazku wykazują skuteczność przeciwko zakażeniu L. intracellularis u różnych zwierząt i należy się spodziewać, że będą również skuteczne u zwierząt.
Niniejszy wynalazek pozwala na szybki rozwój hodowli, zwiększenie wyników hodowli 100-1000-krotne i zmniejszenie kosztów. Jako wynik, obfitość dostarczonych bakterii L. intracellularis wyhodowanych zgodnie z nowym, przedstawionym sposobem hodowli podlega atenuacji w celu wytworzenia szczepionki.
Atenuacja jest trudna w hodowlach jednowarstwowych ze względu na niewielką ilość wyhodowanych bakterii przy stosowaniu konwencjonalnych technik hodowli jednowarstwowych. W przeciwieństwie, obecny sposób hodowli L. intracellularis znacznie ułatwia, przyspiesza i zwiększa liczbę wykorzystywanych bakterii. Więcej komórek i więcej pojawiających się podziałów, większa liczba pojawiających się mutacji jest korzystne w wytwarzaniu szczepionki. Wzrost w zawiesinie według wynalazku zwiększa ekspresję ważnych immunogenów kontrolowanych przez geny regulowane przez środowisko i ich produkty ekspresji.
Powstałe szczepy atenuowane mogą być hodowane w tkankowych hodowlach jednowarstwowych jak opisano w poniższym przykładzie 1, lecz korzystnym jest hodowanie ich w hodowlach w zawiesinie zgodnie z przedstawionym sposobem. Inne środki atenuujące mogą obejmować zastosowanie na przykład, N-metylonitrozoguanidyny, lub innych środków znanych w stanie techniki. Tak więc przez wielokrotne pasażowanie lub środkami chemicznymi wytwarzane są atenuowane L. intracellularis i wybierane do przygotowania szczepionki.
Zgodnie z wykonaniem szczepionki, hodowle antygenu są zbierane przez wirowanie lub mikrofiltrowanie jak to opisano poniżej. Antygen jest następnie standaryzowany do określonego poziomu opartego na optymalnej odpowiedzi immmunologicznej zwierz.ąt-gospodarzy, określonego przez miareczkowanie dawki w próbkach zwierząt gospodarzy. Bakteria może być inaktywowana przez przedłużoną ekspozycję na otaczające środowisko tlenu, lub przez zastosowanie 0,3% formaliny lub innych czynników inaktywujących w celu przygotowania zabitej szczepionki. Antygen jest następnie włączany do odpowiedniego adiuwantu, takiego jak wodorotlenek glinu lub płynna parafina celem zwiększenia odpowiedzi immunologicznej. Antygen jest następnie stosowany do szczepienia gospodarza przez wstrzyknięcie domięśniowe Iub podskórne, w przypadku świń w wieku około 3-4 tygodni, z dawką przypominającą jeśli jest wymaganą.
Alternatywnie, zgodnie ze szczególnie korzystnym wykonaniem szczepionki wykorzystującym metody hodowli wcześniej opisane, bakterie są kilkakrotnie pasażowane w celu wywołania i wybrania atenuowanych, nie zjadliwych żywych hodowli. Hodowla bakteryjna jest testowana na zwierzętach-gospodarzach (po korzystnie 6-8 miesiącach lub więcej wzrostu w hodowlach w zawiesinach) w celu uzyskania objawu atenuacji. Hodowana kultura bakteryjna jest zbierana jak to opisano wcześniej i rozcieńczana. Świnie, na przykład, są szczepione doustnie bakteriami w ilości 1x 105 do 1x IO6. Około 28 dnia po zaszczepieniu, świnie są zakażane organizmami w ilości około 1x IO7 mniej pasażowanymi (około 30 do 45 dni) zjadliwymi kulturami L. intracellularis. Zakażone zwierzęta są zabijane i poddawane sekcji po 21 dniach od ekspozycji i w jelicie cienkim poszukuje się znacznych i mikroskopowych uszkodzeń. PCR i metody badawcze z przeciwciałem fluorescencyjnym powinny również być przeprowadzone. Około 80% zwierząt kontrolnych wykazuje znaczne i mikroskopowe uszkodzenia komórek śluzówki jelit przy zastosowaniu zarówno metod PCR jak i FA. Zaszczepione
189 286 zwierzęta mają prawidłową powierzchnię błony śluzowej jak to będzie potwierdzone obserwacją histologiczną i ujemnym wynikiem reakcji PCR.
Ogólnie, atenuowane immunogenne szczepy L. intracellularis są wytwarzane po ciągłej trwającej 150 i 250 dni hodowli, w trakcie której hodowla jest pasażowana przynajmniej 7 do 12 razy. Inne atenuowane hodowle bakteryjne mogą być wytwarzane przez różne odmiany podanych tu sposobów monitorowania i wybierania.
Przygotowywanie szczepionki następnie obejmuje immunologicznie skuteczną ilość atenuowanych L. intracellularis w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku. Kombinacja immunogenu i nośnika może być w postaci roztworu wodnego, emulsji lub zawiesiny. Immunologicznie skuteczna ilość jest określana środkami znanymi w stanie techniki bez przeprowadzania niepotrzebnych doświadczeń, stosując wskazówki tu podane. Ogólnie, ilość immunogenu będzie się wahać między 50 a 500 mikrogramów, korzystnie między 107 a 109 TCID50, gdy stosuje się oczyszczone bakterie.
Szczepionki są ogólnie podawane wrażliwym zwierzętom, korzystnie świniom, w jednej lub więcej dawkach. Żywa lub zabita szczepionka może być podawana 1 lub 2 razy w odstępach dwutygodniowych.
Korzystne jest podawanie atenuowanej, żywej szczepionki w jednej dawce. Korzystną drogą podawania żywych atenuowanych szczepów jest droga doustna, donosowa, również można stosować podawanie domięśniowe i podskórne. Droga podania domięśniowa i podskórna jest najkorzystniejsza dla zabitej szczepionki.
Skuteczna diagnoza PPE jest również ograniczana przez czas potrzebny do hodowli bakterii wywołujących to schorzenie. Skutkiem niniejszego wynalazku możliwy stał się rozwój sposobów diagnostycznych umożliwiających powstanie szybkich i skutecznych testów do badania obecności L. intracellularis w próbkach biologicznych pobieranych od świń i innych zwierząt wrażliwych.
Bakterie L. intracellularis wyhodowane zgodnie z przedstawionym sposobem, lub składniki tych bakterii mogą być zastosowane jako antygen w testach ELISA lub w innych testach immunologicznych, takich jak test immunologiczny z zastosowaniem przeciwciał znakowanych fluoresceiną („IFA”), w celu wykrycia przeciwciał przeciwko L. intracellularis w surowicy i innych płynach zwierząt podejrzanych o zakażenie tymi bakteriami. Obecnie korzystnym jest stosowanie testu immunologicznego IFA jak to opisano w przykładzie poniżej. Alternatywnie bakterie obecnie wyhodowane mogą być stosowane w analizie metodą Western blot.
Korzystny protokół testu ELISA zgodnie z wykonaniem według wynalazku obejmuje co następuje:
1. Dodanie 0,1 ml/studzienkę antygenu rozcieńczonego w buforze opłaszczającym. Inkubacja przez 18 godz. w4°C.
2. Trzykrotne przemycie PBS.
3. Dodanie 0,25 ml buforu blokującego do każdej studzienki na płytce.
Inkubowanie 1 do 2 godz. w 37°C.
4. Trzykrotne przemycie w buforze przemywającym.
5. Rozcieńczenie surowicy w buforze blokującym i dodanie 0,1 ml do pierwszych studzienek płytki. Przeprowadzenie seryjnych rozcieńczeń 1:2 przez całą płytkę. Inkubowanie przez 1 godz. w 37°C.
6. Przemycie 3-5-krotne w buforze przemywającym.
7. Rozcieńczenie koniugatu w buforze blokującym i dodanie 0,1 ml na studzienkę płytki i inkubowanie przez 1 godz. w 37°C.
O ttu mm—sy C 1 Χ-Χ 4-M m. w-r r ł Λ «Μ o MM α V M
o. j-j-muuic w u ui wizją vvaj4vyni.
9. Dodanie substratu.
12. Zmierzenie absorbancji światła spektrofotometrem.
13. Studzienki, do których nie dodano antygenu zastosowano jako kontrolę.
14. Dodatnia i ujemna kontrola surowicy świńskiej powin na być również zastosowana w każdym teście.
189 286
Korzystny protokół analizy metodą Western biot:
1. Przeprowadzenie antygenu na 12% SDS-PAGE i przeniesienie na błonę nitrocelulozową.
2. Umieszczenie błony w buforze blokującym na 2 godz.
3. Usunięcie buforu blokującego i przemycie PBS w ciągu 1 min.
4. Rozcieńczenie surowicy w buforze blokującym i dodanie na błonę. Inkubacja przez 2 godz. w temp. pokojowej.
5. Trzykrotne przemycie buforem przemywającym (5 min. każde przemycie).
6. Rozcieńczenie koniugatu w buforze blokującym i dodanie do błony. Inkubacja przez 1 godz. w temp. pokojowej.
7. Trzykrotne przemycie buforem przemywającym.
8. Dodanie substratu na 10 min. lub do ukazania się silnego wiązania.
9. Spłukanie PBS.
10. Wysuszsnie powietaiem i przechowywanie w ciemności. Niniejszy szynalanekjest dalej opisany w następujących przykładach, które podano jedynie w celu zilustrowania, a nie ograniczenia.
Przykład 1. Izolacja L. intracellularis z jelit świń amerykańskich chorujących na enterocetię proliferacyjną świń.
Materiały i metody:
Selekcja próbek zakażających:
Próbkę N24912 uzyskano ze stada z farmy z Iowa, w której 15 z 300 świń, które ukończyły 5 miesięcy cierpiało na uporczywe krwiste stolce mimo leczenia penicyliną. Podczas sekcji świń obserwowano scieńczenie śluzówki jelita (cienkiego).
Badania histopatologiczne z użyciem barwienia srebrem wykazało obecność zakrzywionych, wewnątrzkomórkowych bakterii i hiperplazję enterocytów krypt potwierdzające rozpoznanie PPE. Próbkę N72994 uzyskano z drugiego 1,5 rocznego miotu loch SPF hodowanego na farmie w Minnesocie. Wielkość stada wynosiła około 70-80 loch, nieznane było leczenie antybiotykami. Podczas sekcji śluzówka jelit była scieńczała z wybroczynami. Barwienie Giminez'a błony śluzowej wykazało wiele zakrzywionych bakterii. Próbkę NI0M94 uzyskano od 12-to tygodniowych świń z farmy w Indiana, przeznaczonej dla 600 loch. Świnie były leczone dożylnym Tyla^em od początku wystąpienia krwawej biegunki, lecz wszystkie zwierzęta zdechły wkrótce po leczeniu.
Przygotowanie bakteryjnego materiału zakażającego pochodzącego ze świń.
Próbki jelitowe utrzymywano w temp. -70°C. Jelita przecięto i przemyto solą fizjologiczną buforowaną fosoforencm (PBS). Jeden gram próbki błony śluzowej zeskrobano i umieszczono w glutaminianie sodowo-potasowym (SPG) i homogenizowano przez 30 sekund z 4,0 ml trycszny (JRH Biosciences, Lenexa, KS) w SPG. Zawiesiny inkubowano przez 35 min w 37°C. Dziesięć ml SPG/10% bydlęcą surowicę płodową (FCS) (JRH Biosciences, Lenexa, KS) dodano do próbek i próbki umieszczono w yomogenizatorze tkankowym na 1 min. Dziesięć ml SPG/10% (FCS) dodano i filtrowano jednokrotnie przez filtr papierowy (Whetmen 113V; Wyetmen Labsales, Hillsboro, OR), a następnie przez 5,0-, 1,0- i 0,65mikronowe błony filtrujące. Filtraty rozdzielano do 1,0 ml probówek i zamrażano w -70°C. Błonę śluzową roztarto na szkiełku w celu przccrowadzenie barwienia metoda Gimineza. Oddzielne rozmazy filtratów znakowano metodą iFa stosując swoiste przeciwciała monoklonelne przeciwko L. istracelluleris S. McOrist i in., Vet. Rec. 121:421-422 (1987) (włączone w całości przez referencje).
Hodowla komórkowa:
Komórki IEC-18 (szczurze komórki nabłonka jelitowego, ATCC CRL 1589) hodowano w DMEM (JRH Biosciences, Lenexa, KS) z L-glutaminianem i 10% FCS i nermelnie pasażoweno przez tydzień trycszną. Jednowarstwowe hodowle komórkowe hodowano w 37°C w powietrzu z 5% CO2.
Zakażenie hodowli komórkowych:
Komórki ffiC-18 posiewano w ilości 1,25 x IO5 komórek w 25 cm2 butelki hodowlane w porównywalnym stosunku w szkiełka histologiczne (Nunc, Inc., nepervillc, IL), inkubowa189 286 ne przez 24 godz., a następnie usunięto pożywkę. Zamrożone bakteryjne izolaty pochodzące od świń szybko rozmrażano i rozcieńczano w DMEM/7% FCS z wankomycyną (100 pg/ml) i amfoterycyną B (2,0 (im/ml) w stosunku 1,0 ml homogenatu do 15 ml pożywki i dodano do hodowli jednowarstwowej. Hodowle jednowarstwowe i zawiesiny bakteryjne wirowano przez 30 min w 2000 g i przenoszono do pojemników beztlenowych. Pojemniki następnie przenoszono i gaz był zastępowany mieszaniną wodoru i dwutlenku węgla, w celu otrzymania mieszaniny 8,0% O2, 10% CO2 i 82% H2. Hodowle komórkowe inkubowano przez 3 godz. w 37°C, a następnie odżywiane DMEM/7% FCS z L-glutaminianem, wankomycyną (100 (μ g/ml), neomycyną (50 (g/ml i amfoterycyną B (2,0 (g/ml). Hodowle przenoszono do pojemników beztlenowych i inkubowano przez 6 dni, wymieniając pożywkę co 2 dni.
Pasażowanie L. intracellularis:
Bakterie L. intracellularis pasażowano przez lizę komórek stosując chlorek potasu tak jak to opisano poprzednio G. Lawson i in.. J. Clin. Microbiol., 31:1136-1142 (1993) (włączono tutaj w całości przez referencje), a następnie dodano do świeżych hodowli jednowarstwowych IEC-18. Pożywkę wymywano z hodowli jednowarstwowych i dodawano 0,1% KCl i inkubowano przez 10 min w 37°C. Usuwano KCl i dodawano SPG/10% i hodowle jednowarstwowe rozdzielano mechaniczne skrobakiem komórkowym. Komórki poddawano lizie przez trzykrotne przepuszczenie przez strzykawkę z igła kaliber 25. Jądra komórkowe usuwano przez wirowanie w 100 x g przez 5 min i zawiesinę bakteryjną. w płynnym supernatancie dodano do świeżej hodowli jednowarstwowej 1 d komórek E3CM8.
Monitorowanie zakażenia hodowli komórkowych:
Zakażenie monitorowano przez utrwalenie komórek na szkiełkach laboratoryjnych zimnym acetonem/etanolem przez 5 min. Znakowanie przeprowadzono metodami immunofluorescencji i immunoperoksydazy. Obie metody stosują mysie przeciwciało monoklonalne (jak opisano przez S. McOrist i in., Vet. Rec. 121:421-422 (1987)) jako przeciwciało pierwszorzędowe i zarówno koniugaty przeciwko mysiej immunoglobulinie G-flourochrom (izotiocjanian fluoresceiny; Organon Teknika Corporation, Durham, NC) jak i koniugat peroksydazy (kozia anty-mysia immunoglobulina G; Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD). Liczeniu bakterii towarzyszy liczenie swoiście barwionych bakterii wewnątrz komórek na każdym szkiełku.
Reakcja łańcuchowa polimerazy:
Zakażona próbka i bakterie poddane pasażowi zostały włączone jako DNA matrycowy do PCR stosując sposoby przygotowania próbki, startery i parametry cyklu jak opisano to przez Jones'a i in., J. Clin. Microbiol., 31:2611-2615 (1993) i McOrist i in., Vet. Microbiol. 1-8 (1994)(każde z nich włączone tu w całości przez referencje). Parametrami cyklu były 93 °C przez 5 min, 55°C przez 45 s i 72°C przez 45 s dla pierwszego cyklu. Przeprowadzono 33 cykle we wcześniej wymienionych przez 45 s dla danej temperatury, jak również 93°C przez 45 s, 55°C przez 45 s i 72°C przez 2 min. Jedynie dodatni materiał zakażający użyto do zakażenia komórek IEC-18. PGR przeprowadzono również do monitorowania pasażowanego materiału w celu potwierdzenia zakażenia. DNA wytworzone w technice PCR poddano sekwencjonowaniu w Iowa State University Nucleic Acid Facility. Wyniki sekwencjonowania porównywano z sekwencjami wytworzonymi przez Gary'ego F. Jones'a i podanymi w tezach doktorskich, University of Minnesota, Minneapolis, MN (czerwiec, 1993).
Wyniki:
Wybór próbek zakażających:
Świnie o numerze N24912 i N72994 chorowały na ciężkie PPE z krwistą zawartością jelitową i scieńczeniem błony śluzowej. N10i494 chorowała na ciężką PPE i miała ciężkie krwawienie jelitowe, które spowodowało powstanie wielkiej skrze-pliny w świetle jelit. Barwienie metodą Giemza rozmazów jelitowych wykazało znaczną liczbę bakterii zakrzywionych łub w kształcie litery S. Znakowanie IFA wykazało w pochodzącym od świń materiale zakażającym znaczną liczbę jasno, fluorescencyjnych bakterii.
Monitorowanie zakażenia w hodowlach komórkowych:
Zakażone hodowle jednowarstwowe monitorowano w mikroskopie świetlnym w trakcie wzrostu i obserwowano niewielkie zmiany morfologiczne komórek. Niezakażone hodowle
189 286 jednowarstwowe hodowano w warunkach zmniejszonego ciśnienia tlenu (8% O2) wykazywały podobną morfologię.
Znakowanie immunofluorescencyjne i metodą immunoperoksydazy zakażonych hodowli wykazało wewnątrz komórek znaczną liczbę zakrzywionych i w kształcie litery S specyficznie wybarwionych bakterii. Hodowle jednowarstwowe nie wykazywały zlewnego zakażenia. Zakażone komórki były często powiązane z zakażonymi ogniskami 1-10 komórek. Poważnie zakażone komórki (tj. komórki z 30 lub więcej bakteriami) były również widoczne z komórkami z mniej niż 30 bakteriami. Szczyt liczby bakterii występował około lub 6 dnia. Zakażenie było zależne od swoistych warunków hodowli. Bakterie skutecznie pasażowano stosując tu opisane sposoby lizy komórkowej. Wirowanie świeżo zakażonych komórek nie było konieczne lecz znacznie zwiększało liczbę zakażonych komórek. Wirowanie również zmniejszało zanieczyszczenie przez dopuszczenie komórek eksponowanych na zakażenie w pozbawionej antybiotyku pożywce na odżywienie po 3 godz. pożywką zawierającą antybiotyk. Zmniejszenie FCS z 10% do 7% w pożywce było konieczne do spowolnienia wzrostu komórek IEC-18 co pozwoliło na zwiększenie proliferacji bakterii przez wystąpieniem zlewności hodowli komórkowej.
Reakcja łańcuchowa polimerazy:
PCR chromosomalnego DNA pozwoliło na wytworzenie fragmentu 319 bp (włączając startery) z wszystkich izolatów. Fragment o odpowiedniej wielkości był wizualnie porównywany ze znanymi dodatnimi próbkami wytworzonymi przez McOrista i in., (1994) przy użyciu techniki PCR. Analiza sekwencji produktów PCR próbek N24912, N72994 i N101494 potwierdziła bliską homologię (97-99%) do sekwencji p78 określonej przez Jones'a (1993).
Przykład 2. Wzrost L. intracellularis w hodowlach w zawiesinie komórek Hep-2.
Przygotowanie materiałów zakażających z homogenatów jelitowych:
Homogenaty jelitowe przygotowano przez zdrapywanie błony śluzowej z 6 do 8 cm odcinków jelita cienkiego z próbek jelitowych opisanych w przykładzie 1. Dodano trypsynę (1%) do zdrapanej błony śluzowej i próbki dokładnie homogenizowano, a następnie inkubowano przez 35 min w 37°C. 10 ml SPG/10% FBS dodano do próbki i umieszczono w homogenizatorze tkankowym. Kolejne 10 ml SPG/10% FBS dodano. Homogenizaty przepuszczono przez filtr Whatman V113, a kolejno przez filtry 5,0, 1,0 i 0, 65pm. Próbki następnie rozdzielono do 1 ml probówek i zamrożono w -70°C.
Zakażenie hodowli komórkowych:
Sposób A:
Komórki pochodzące z tkanek posiano na 1 x 107 komórek w 50 ml DMEM/10% FBS w 100 ml butelki typu spinner. Hodowle inkubowano 24 godz., a następnie dodano vankomycynę i fungizon. Jedna probówka zamrożonego homogenatu jelitowego została szybko rozmrożona i rozpuszczona w 3 ml DMEM/5% FBS z wankomycyną (100 μg/ml) i amfoterycynąB (2,0 μg/ml). Próbka została przepuszczona przez filtr 0,65 pm i dodana do butelki. Hodowlę umieszczono w komorze gazowej, przeniesiono i dodano wodoru i dwutlenku węgla by uzyskać mieszaninę 0,8% 02,8,8% CO2 i 83,2% H2. Hodowle inkubowano przez 3 godz. w 37°C, a następnie dodano neomycynę i gentamycynę. Hodowle odżywiono w 24 godz. DMEM/5% FBS z L-glutaminianem, wankomycyną (100 pg/ml), neomycyną (50 pg/L), gentamycyną (50 pg/L) i amfoterycyną B (2,0 pg/ml).
Sposób B:
W dwie zwykłe 25 cm2 butelki posiano 1,25 x 10? komórek Hep-2 w DMEM/10% FBS i pozwolono na wzrost przez 18-24 godz. Komórki uzyskały 30% zlewności w czasie zakażenia. Materiał zakażający rozcieńczono w DMEM/5% FBS. Gdy materiał zakażający pochodził z homogenatów jelitowych, pożywka zawierała również wankomycynę (100 pg/ml) i amfoterycynę B (2,0 pg/ml). Hodowle umieszczono w komorze gazowej, przeniesiono i dodano wodoru i dwutlenku węgla by uzyskać mieszaninę 0,8% O2, 8,8% CO 2 i 83,2% H2. Hodowle inkubowano przez 3 godz. w 37°C, a następnie dodano neomycynę i gentamycynę. Hodowle odżywiono w 24 godz. DMEM/5% FBS z L-glutaminianem, wankomycyną (100 pg/ml), neomycyną (50 pg/L), gentamycyną (50 pg/L) i amfoterycyną B (2,0 pg/ml). Antybiotyki nie
189 286 były wymagane gdy materiał zakażający był czystą hodowlą. Hodowle inkubowano przez 6 dni do uzyskania zlewności. Komórki oddzielano od butelek i dodawano do 100 ml butelek typu spinner zawierających 50 ml DMEM/5% FBS.
Hodowle rozcieńczano 1:2 w odstępach tygodniowych przez zbieranie połowy hodowli i dodawanie świeżej pożywki lub przez pasażowanie do większych butelek typu spinner i dalsze dodawanie pożywki.
Pasażowanie hodowli:
Hodowle pasażowano na świeże komórki Hep-2 przez wysiewanie nowych komórek Hep-2 w ilości 1 x IO7 na DMEM/5%FBS. Nowe hodowle inkubowano przez noc w 8,0% O2, 8,8 % CO2 i 83,2% H2. Nowe hodowle następnie zakażano zakażonymi hodowlami i inkubowano w zmniejszonym stężeniu tlenu jak to wcześniej ustalono. Ilość materiału zakażającego zależy od stopnia zakażenia hodowli oryginalnej.
Zbieranie i przechowywanie hodowli:
Hodowle zbierano przez gromadzenie odpowiedniej ilości hodowli w trakcie wirowania 3000 x g przez 20 minut. Peletki ponownie zawieszano w roztworze Sacharozy-FosforanuGlutaminianu (SPG) i pasażowano 4-krotnie przez igłę o kalibrze 25. Hodowle rozdzielano do probówek i zamrażano w -70°C. W celu dalszego oczyszczania, probówki wirowano w 145 x g przez 5 min w celu usunięcia jąder komórkowych i resztek komórkowych. Supernatant następnie wirowano w 3000 x g przez 20 min. Peletki następnie ponownie zawieszano w rozcieńczalniku.
Określenie żywotności L. intracellularis w hodowlach tkankowych:
Ilościowe określenie żywotności L. intracellularis osiąga się przez określenie dawki zakażającej hodowlę tkankową w 50% (TCID 50). Przeprowadza się to przez usunięcie 2,0 ml hodowli, która ma być poddana badaniu i poddanie lizie komórek przez przeprowadzenie ich czterokrotnie przez igłę o kalibrze 25. Próbkę kolejno rozcieńczano 1:10 w DMEM/5% FBS zawierającym wankomycynę (100 ng/ml) i amfoterycynę B (2,0 pg/ml). Rozcieńczenia dodano do 96-studzienkowych płytek do mikromiareczkowania w ilości 0,1 ml/studzienkę. Do płytek do mikromiareczkowania wysiano komórki Hep-2 w ilości 1250 komórek/studzienkę i hodowano 18-24 godz. przed zakażeniem. Stosowano rozcieńczenie między 3 a 6 studzienek/rozcieńczenie. Płytki inkubowano przez 6 dni w stężeniu gazów 8,0% O2, 8,8% CO2 i 83,2% H2. Komórki utrwalano zimnym 50% acetonem i 50% metanolem przez 2 minuty. Do studzienek dodawano 0,03 ml/studzienkę przeciwciała monoklonalnego przeciwko IS intracellularis (McOrist, 1994) w rozcieńczeniu 1:2000 w PBS. Płytki inkubowano przez 30 min w 37°C, a następnie przemywano trzykrotnie PBS. Dodano anty-mysie FITC w rozcieńczeniu 1:30 w ilości 0,03 ml/studzienkę i inkubowano 30 min w 37°C. Płytki następnie przemywano trzykrotnie ddH2O i pozwalano im wyschnąć. Próbki następnie obserwowano w mikroskopie fluorescencyjnym i określano TCIDso/ml.
Wyniki:
Wyniki TICD 50 wskazują. że hodowle zawierają więcej niż 1 x IO6 bakterii/ml. Zjawisko to dokonuje się w 45 dniu. Objętość hodowli powiększa się do 3 litrów w tym samym czasie.
Przykład 3. Przygotowanie materiałów zakażających z homogenatów jelitowych
Homogenaty jelitowe przygotowano jak to opisano w przykładzie 2. Próbka L. intracellularis hodowana zgodnie ze sposobem według poniższego przykładu była zdeponowana zgodnie z Traktatem Budapeszteńskim 19 maja 1995 r w American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland USA 20852 i ozaczona numerem dostępu 55672.
Zakażenie hodowli komórkowych:
W dwie zwykłe 25 cm2 butelki posiano 1,25 x IO5 komórek Hep-2 w DMEM/10% FBS i pozwolono na wzrost przez 18-24 godz. Komórki uzyskały 30% zlewności w czasie zakażenia. Materiał zakażający rozcieńczono w DMEM/5% FBS. Gdy materiał zakażający pochodził z homogenatów jelitowych, pożywka zawierała również wankomycynę (100 pg/ml) i amfotetycynę B (2,0 pg/ml). Hodowle umieszczono w komorze gazowej, przeniesiono i dodano wodoru
189 286 i dwutlenku węgla by uzyskać mieszaninę 8,0% 02, 10% CO2 i 82% H2. Hodowle inkubowano przez 3 godz. w 37°C, a następnie dodano neomycynę i gentamycynę. Hodowle odżywiono w 24 godz. DMEM/5% fBs z L-glutaminianem, wankomycyną (100 pg/ml), neomycyną (50 fig/L), gentamycyną (50 pg/L) i amfoterycyną B (2,0 ng/ml). Antybiotyki nie były wymagane gdy materiał zakażający był czystą hodowlą. Hodowle inkubowano przez 6 dni do uzyskania zlewności. Komórki oddzielano od butelek i dodawano do 100 ml butelek typu spinner zawierających 50 ml DMEM/5% FBS i 0,05 g Cultisphere-G Microcarriers. Zawartość butelek mieszano przy 40-50 rpm.
Hodowle rozcieńczano 1:2 co 2-3 dni przez zbieranie połowy hodowli i dodawanie świeżej pożywki z perełkami Culti-sphere-G lub przez pasażowanie do większych butelek typu spinner i dalsze dodawanie pożywki i perełek Cultisphere-G. Ostateczne stężenie koralików w hodowli wynosiło około 0,001 g perełek/ml.
Pasażowanie hodowli:
Hodowle pasażowano na świeże komórki McCoy'a przez wysiewanie nowych komórek McCoy'a w ilości 1x łO7 na DMEM/2%FBS i 0,05 g koralików Cultisphere-G. Nowe hodowle in-kubowano przez noc w 8,0% 02, 8,8 % CO2 i 83,2% H2. Nowe hodowle następnie zakażano 25 ml zakażonych hodowli i inkubowano w zmniejszonym stężeniu tlenu jak to wcześniej ustalono.
Zbieranie i przechowywanie hodowli:
Hodowle zbierano przez gromadzenie odpowiedniej ilości hodowli w trakcie wirowania 3000 x g przez 20 minut. Peletki ponownie zawieszano w roztworze SPG i pasażowano 4-krotnie przez igłę o kalibrze 22. Hodowle rozdzielano do probówek i zamrażano w -70°C. W celu dalszego oczyszczania, probówki wirowano w 145 x g przez 5 min w celu usunięcia perełek, jąder komórkowych i resztek komórkowych. Supernatant następnie wirowano w 3000 x g przez 20 min. Peletki następnie ponownie zawieszano w rozcieńczalniku. Określenie żywotności L intracellularis w hodowlach tkankowych:
łlościowe określenie żywotności L. intracellularis określano jak opisano w przykładzie 2 stosując igłę kaliber 22 do lizy komórek i siejąc na płytki do miareczkowania komórki McCoy'a 1250 komórek/wgłębienie.
Wyniki:
Wyniki TłCD 50 wskazują, że hodowle zawierają więcej niż 1 x łO6 bakterii/ml. Zjawisko to dokonuje się krócej niż w ciągu miesiąca. Objętość hodowli powiększa się do 3 litrów w tym samym czasie.
Przykład 4. Określenie dawki zakażającej czystej hodowli L. intracellularis: Podsumowanie:
Badano 31 świnie zakażone w 6 tygodniu życia czystymi hodowlami L. intracellularis pochodzącymi z próbki N72994. Świnie rozdzielano w sposób przypadkowy na 4 grupy, które trzymano w osobnych zagrodach. Grupa 1 składała się z 7 świń stanowiących kontrolę ujemną, której podawano nie zakażone hodowle lub nie podawano nic. Grupa 2 składała się z 8 świń, które otrzymały 1O7 bakterii/świnię. Grupa 3 składała się z 8 świń, które otrzymały łO6 bakterii/świnię. Grupa 4 składała się z 8 świń, które otrzymały łO5 bakterii/świnię.
Wymazy kału pobierano 0, 7, 14,21 i 24 dnia do badania metodą PCR. 24 dnia świnie zabijano i jelito kręte, czcze i grube pobierano do badania PCR, histopatologicznego i znakowania FA, tak jak opisano powyżej.
Badanie PCR błony śluzowej jelita krętego wykazało obecność L. intracellularis w 100% przy wysokiej dawce, w 75% przy średniej dawce i w 50% przy niskiej dawce. Wyniki histopatologiczne wskazywały na zwiększoną ilość komórek jednojądrzastych w błonie podstawnej i podśluzowej w 88% przypadków przy wysokiej dawce, 75% przy średniej dawce i 88% przy niskiej dawce. Przerost krypt obserwowano w 50% przypadków przy wysokiej dawce, 63% przy średniej dawce i 50% przy dawce niskiej. Znakowanie FA wykazało obecność L. intracellularis w preparatach tkankowych jelita krętego, czczego i grubego w 88% przypadkach przy wysokiej dawce, 63% przy średniej dawce i 63% przy dawce niskiej. Zwie189 286 rzęta kontrolne nie wykazywały obecności L. intracellularis ani w metodzie PCR, ani FA, ani w barwieniu srebrem.
Czystą hodowlą można skutecznie zakazić i spowodować uszkodzenie typowe dla PPE. Postulaty Kocha są spełnione dla identyfikacji i izolacji L. intracellularis z zakażonych zwierząt.
Wśród zwierząt poddanych prowokacji dla 100% zwierząt uzyskano wyzdrowienie przy wysokiej dawce bakterii i identyfikację stosując barwienie srebrem, znakowanie fA i metodę PCR.
Materiały i metody:
Hodowla materiału zakażającego:
Do jednej zwykłej butelki hodowlanej posiano 3,75 x IO5 komórek Hep-2 do DMEM/10% FBS i pozwolono na wzrost przez 18-24 godziny w 37°C i 5% stężeniu CO2. (Komórki wykazywały 30% zlewność w trakcie zakażania). Jedną probówkę N72994 rozcieńczono w 15 ml DMEM/5% FBS. Hodowlę przeniesiono do komory gazowej, usunięto i wymieniono gaz na wodór i dwutlenek węgla, w celu uzyskania mieszaniny 8,0% O2, 8,8% CO2 i 83,2% H2. Hodowla została odżywiona w 24 godz. DMEM/5% PBS.
Hodowle inkubowano przez 6 dni, następnie komórki oddzielano i dodano do 100 ml butelek typu spinner zawierających 50 ml DMEM/5% FBS. Objętość zawartości butelek została zwiększona przez podwajanie objętości pożywki w odstępach tygodniowych. Hodowle utrzymywano przez 3 tygodnie w butelkach typu spinner.
Zbieranie hodowli komórkowych:
Hodowle zbierano przez wirowanie w około 3000 x g przez około 20 minut. Peletki następnie zawieszano w roztworze sacharoza-fosforan-glutaminian (SPG) z 10% FBS i przepuszczano cztery razy przez igłę o kalibrze 25. Materiał zakażający rozcieńczano do ostatecznej objętości w SPG/10% FBS i uzyskano rozcieńczenie 1:10.
Materiał zakażający dla zwierząt kontrolnych składał się z nie zakażonych komórek Hep-2 rozcieńczonych w tym samym stężeniu żywych komórek co zakażone hodowle. Hodowle komórkowe zbierano tak samo jak zakażone hodowle. Świnie kontrolne otrzymywały taką samą dawkę komórek, co grupa otrzymująca wysoką dawkę.
Ilościowe określenie L. intracellularis
Ilościowe określenie żywotności L. intracellularis osiąga się przez określenie dawki zakażającej hodowlę tkankową w 50% (TCID 50). Przeprowadza się to przez usunięcie 2,0 ml hodowli, która ma być poddana badaniu i lizie komórek przez przeprowadzenie ich czterokrotnie przez igłę o kalibrze 22. Próbkę kolejno rozcieńczano 1:10 w DMEM/5% FBS zawierającym wankomycynę (100 pg/ml) i amfoterycynę B (2,0 ng/ml). Rozcieńczone dodano do 96-studzienkowych płytek do mikromiareczkowania w ilości 0,1 ml/studzienkę. Do płytek do mikromiareczkowania wysiano komórki Hep-2 w ilości 2500 komórek/wgłębienie i hodowano 18-24 godz. przed zakażeniem. Stosowano 12 studzienek/rozcieńczenie. Płytki inkubowano przez 6 dni w stężeniu gazów 8,0% O2, 8,8% CC>2 i 83,2% H2. Komórki utrwalano zimnym 50% acetonem i 50% metanolem przez 2 minuty. Do wgłębień dodawano 0,03 ml/wgłębienie przeciwciała monoklonalnego przeciwko IS intracellularis (McOrist, 1987) w rozcieńczeniu 1:2000 w PBS. Płytki inkubowano przez 30 min w 37°C, a następnie przemywano trzykrotnie PBS. Dodano anty-mysie FITC w rozcieńczeniu 1:30 w ilości 0,03 ml/wgłębienie i inkubowano 30 min w 37°C. Płytki następnie przemywano trzykrotnie ddl^O i pozwalano im wyschnąć. Próbki następnie obserwowano w mikroskopie fluorescencyjnym i określano TCIDso/ml.
Zwierzęta. .
świń, obu płci w wieku 6 tygo6ni gochodzących z loch PIC x Lie sXe i knurów rasy large white dostarczone przez dr Kent Schwartz. Świnie rozdzielono w sposób przypadkowy i umieszczano w 4 zagrodach w zależności od wagi w dniu 0.
Pomieszczenia:
Cztery zagrody w małym pomieszczeniu dla młodych świń, każde oddzielone odległością przynajmniej 1 metra. Zagrody posiadały drucianą podłogę i trwałe ściany zagród. Ciepło
189 286 dostarczano centralnym ogrzewaniem, ze strefowym rozprowadzeniem ciepła przez lampy grzewcze. Temperaturę utrzymywano między 78 a 85°F przez czas badania.
Pokarm i woda:
Dietę opartą o białko sojowe o zawartości 19% białka, bez antybiotyków dostarczano ad libitum stalowymi karmnikami. Wodę dostarczano ad libitum poidełkami.
Zakażenie świń:
Dnia 0, świnie ważono, pobierano próbki krwi rurkami włosowatymi z zatok zaoczodołowych. Surowicę zbierano i przechowywano w -20°C. Wymazy kału pobierano w celu przeprowadzenia badania PCR. Świniom podawano dawki 10 ml materiału zakażającego dożołądkowo sondą żołądkową.
Leczenie Liczba świń kontrola-komórki niezakażone 5 kontrola-bez leczenia 2 wysoka dawka 8 średnia dawka 8 niska dawka 8
Świnie ważono i pobierano krew w dniu 0, 10, 17 i 24.
Reakcja łańcuchowa polimerazy:
Zakażenie świń monitorowano metodą PCR stosując startery i parametry cyklu jak opisał Jones (1993). Próbki kału zbierano w dniu 0, 7, 14, 21 i 24 i tak samo jak błonę śluzową jelit badano metodą PCR.
Histopatologia:
Skrawki jelita krętego, czczego i grubego utrwalano w formalinie, poddano zwykłym procedurom, zabarwiono hematoksyliną i eozyną, jak również impregnowano srebrem i oceniano. Skrawki również znakowano stosując przeciwciała monoklonalne przeciwko L. intracellularis.
Wyniki:
Objawy kliniczne:
Objawy kliniczne - luźne stolce po raz pierwszy obserwowano w grupie wysokiej dawki w trzecim dniu. Objawy miały nasilenie 14 dnia i zaczynały się zmniejszać.
Zwiększenie wagi zwierząt:
Średnie dzienne zwiększenie wagi wykazało, że w grupie wysokiej i średniej dawki nastąpiło zmniejszenie wagi w porównaniu z grupą kontrolną. Wykazano efekt zależny od dawki w stosunku do zwiększenia wagi, porównując grupy.
PCR.: , .
Wydalanie bakterii w kale nie obserwowano aż do 14 dnia. W 21 dniu, 37,5% świń z grupy wysokiej dawki wykazywało pozytywny wynik PCR z próbek kału. Po sekcji, wynik badania PCR błony śluzowej jelit był dodatni w 100% w grupie wysokiej dawki, w 75% w grupie średniej dawki, w 50% w grupie niskiej dawki i w 0% w grupie kontrolnej.
Wielkość ubytków: r
Znaczne ubytki znaleziono u 2 świń z grupy wysokiej dawki (#50 i #202). Świnie wykazywały około 1 m scieńczenia jelita krętego z martwicą w #202.
Histopatologia:
FA: , , . · u , τ Znakowanie FA skrawków jelita krętego, czczego i grubego wykazało obecność L. intracellularis w 87,5% w grupie wysokiej dawki, 62,5% w obu zarówno w grupie średniej jak i niskiej dawki i 0% w grupie kontrolnej.
Ubytki mikroskopowe:
Ubytki obserwowano w 100% w grupie wysokiej dawki, w 75% w grupie średniej dawki, w 87,5% w grupie niskiej dawki i w 14% w grupie kontrolnej. Było to ocenione przez obserwację zwiększenia ilości komórek jednojądrzastych w błonie podstawnej i podśluzowej, często związane z przerostem kępek Peyer'a. Obserwowano również przerost krypt.
189 286
Barwienie srebrem:
Przeprowadzono również barwienie srebrem w kierunku obecności wewnątrzkomórkowych, zakrzywionych bakterii. Wykazało ono obecność bakterii w 87,5% w grupie wysokiej dawki, w 62,5% w grupie średniej dawki, w 87,5% w grupie niskiej dawki i w 0% w grupie kontrolnej.
Dyskusja:
Świnie skutecznie zakażono czystymi hodowlami L. intracellularis. Przy dawce 10 7 b^ikt^rii 100% świń wykazywało zakażenie zarówno metodą PCR jak i przez mikroskopowe ubytki. Nasilenie uszkodzeń i liczba bakterii w skrawkach tkankowych było relatywnie niskie. Badanie to jest satysfakcjonującym modelem prowokacji L. intracellularis wskutek obecności L. intracellularis i mikrouszkodzeń u świń. Uszkodzenia mogą być zwiększone przez podanie drugiej dawki 7 dni po pierwszej dawce.
Przykład 5. Doświadczenie nad skutecznością szczepionki u chomików:
Cel:
Badanie modelu laboratoryjnego w celu określenia bezpieczeństwa i skuteczności niezjadliwej żywej szczepionki przeciwko L. intracellularis u chomików.
Podsumowanie:
Przeprowadzono badanie 40 chomików. Zaszczepiono trzytygodniowe chomiki czystymi hodowlami, intensywnie pasażowanych szczepów L. intracellularis i poddano prowokacji 22 dnia po szczepieniu czystymi hodowlami mało pasażowanych, zjadliwych szczepów. Chomiki podzielono na trzy grupy. Grupa A została zaszczepiona jedna dawką L. intracełlularis szczepu N72994 w dniu 0. Grupa B została zaplanowana jako grupa kontrolna i nie została zaszczepiona hodowlą. Obie grupy poddane zostały prowokacji dwiema dawkami czystej hodowli szczepu L. intracellularis N343 w dniu 22 i 25 po zaszczepieniu. Grupa C była prowokowana szczepem NI01494, by porównać wirulencję ze szczepem N343. Grupy A i B liczyły po 15 chomików w każdej grupie, grupa C liczyła 10 chomików. Wyniki dawki zakażającej hodowlę tkankową w 50% (TCID50) wskazują, że chomiki szczepiono IO5 TCIDso/dawkę. Prowokacja N343 wynosiła IO5’5 TCIDso^dawkę. Dawka prowokacyjna dla grupy C wynosiła IO2,75 TCID5()/dawkę. Rozmazy kału pobierano w dniu 0, 7, 14, 21, 29, 36 i 43 w celu przeprowadzenia badania reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). W 21 dniu 5 zwierząt z grupy A i B poddawano sekcji i przeprowadzano badanie PCR błony śluzowej, jak również znakowanie FA i barwienie hematoksyliną i eozyną i barwienie srebrem skrawków jelita krętego w celu oceny utrzymywania się kolonizacji bakterii w zaszczepionych chomikach. Pozostałe zwierzęta poddawano sekcji 21 dnia po prowokacji i poddawano podobnym badaniom.
Wyniki PCR wskazywały na obecność L. intracellularis w śluzówce jelitowej 100% chomików grupy A w 21 dniu po zaszczepieniu. Wyniki wszystkich chomików grupy B były ujemne w 21 dni po zaszczepieniu. 21 dnia po prowokacji materiałem zakażającym wyniki PCR 50% chomików były dodatnie w grupie A, a 100% było dodatnich w grupie B. Badanie histopatologiczne skrawków wykazało łagodne do średnich uszkodzeń u 50% zwierząt w grupie A i łagodne uszkodzenia u 50% w grupie B w 21 dniu po prowokacji. Żadne zwierzę nie wykazywało uszkodzeń w 21 dniu po zaszczepieniu. W grupie C zwierzęta nie wykazywały uszkodzenia w 21 dniu po prowokacji. Znakowanie FA i barwienie srebrem nie wykazywało obecności L. intracellularis w żadnym ze skrawków. .
We wnioskach, 50% zmniejszenie zakażenia obserwowano u chomików szczepionych intensywnie pasażowanymi szczepami L. intracellularis jak wykazano to badaniem PCR. Jelita były skolonizowane niewielką ilością organizmów wewnątrzkomórkowych co wykazano brakiem obserwowanych organizmów w skrawkach znakowanych FA i barwionych srebrem. Chomiki w grupie C nie wykazywały zakażenia w trakcie badania, najprawdopodobniej wskutek małej dawki bakterii.
Materiały i sposoby:
Opis chomików:
Wykorzystano 40 trzytygodniowych samic chomików z Harlan Spraąue Dawley.
189 286
Wzrost materiału zakażającego:
Hodowla szczepionki:
Wykorzystano rosnącą przez 29 dni hodowlę L. intracellularis w komórkach Hep-2. Hodowla wzrastała w takich samych warunkach jak to opisano o hodowlach skrawków do prowokacji za wyjątkiem tego, że hodowle pasażowano na nowe komórki Hep-2 co 2-3 tygodnie.
Hodowle do prowokacji:
W jedną zwykłą 75 cm2 butelki do hodowli tkankowej posiano 3,75 χ 105 komórek McCoy'a do zmodyfikowanej przez Dulbecco pożywki Eagle'a (DMEM) z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i pozwolono na wzrost przez 18-24 godz. w 37°C z 5% CO2.Usunięto pożywkę z komórek i do butelek dodano jedną probówkę N343 MSC X rozcieńczoną w 14 ml DMEM/5% FBS. Hodowle umieszczono w komorze gazowej, przeniesiono i dodano wodoru i dwutlenku węgla by uzyskać mieszaninę 8% O2, 8,8% CO2 i 83,2% H2. Hodowle rosły przez 6 dni. Komórki oddzielano do 100 ml butelek typu spinner zawierających 90 ml DMEM/2% FBS i 0,01 g perełek Cultisphere-G. Hodowle rosły w stężeniu gazu opisanym powyżej. Objętość w butelkach zwiększano przez podwajanie objętości pożywki w odstępach tygodniowych. Hodowle rosły w butelkach typu spinner do osiągnięcia ostatecznej objętości 250 ml.
Szczep N 101494 hodowano według tych samych zasad co szczep N343.
Zbieranie hodowli:
Hodowla szczepionki:
Hodowle zbierano przez wirowanie przy 3000 x g przez 20 minut. Peletki ponownie zawieszano w roztworze sacharoza-fosforan-glutaminian (SPG) z 10% FBS i pasażowano 4-krotnie przez igłę o kalibrze 25. Materiał zakażający rozcieńczano do ostatecznej objętości (15 ml) w SPG/10% FBS.
Hodowle materiału do prowokacji:
Hodowle zbierano przez wirowanie przy 3000 x g przez 20 minut. Peletki ponownie zawieszano w roztworze sacharoza-fosforan-glutaminian (SPG) z 10% FBS i pasażowano 4-krotnie przez igłę o kalibrze 25. Materiał zakażający rozcieńczano do ostatecznej objętości w SPG/10% FBS. (20 ml dla szczepu N343 i 10 ml dla szczepu NI01494).
Dawkowanie chomikom:
W dniu 0 chomiki z grupy A szczepiono doustnie 1 ml przygotowanej szczepionki. Prowokacja:
dni po szczepieniu, 10 chomików w grupie A i 10 chomików w grupie B poddano doustnej prowokacji 0,5 ml hodowli do prowokacji szczepu N343. Grupa C była poddana prowokacji 0,5 ml hodowli do prowokacji szczepu N 101494.
Określenie ilościowe IS L. intracellularis:
Ilościowe określenie żywotności IS L. intracellularis osiąga się przez określenie dawki zakażającej hodowlę tkankową w 50% (TCID50). Przeprowadzone to było przez usunięcie 2,0 ml hodowli, która ma być poddana badaniu i poddanie lizie komórek przez przeprowadzenie ich czterokrotnie przez igłę o kalibrze 22. Próbkę kolejno rozcieńczano 1:10 w DMEM/5% FBS zawierającym wankomycynę (100 pg/ml) i amfoterycynę B (2,0 pg/ml). Rozcieńczenia dodano do 96-studzienkowych płytek do mikromiareczkowania w ilości 0,1 mł/wgłębienie, do których wysiano komórki McCoy'a w ilości 1250 komórek/studzienkę i inkubowano przez 18-24 godz.przy 37°C w 5% CO2 przed zakażeniem. Stosowano 12 studzienek/rozcieńczenie. Płytki inkubowano przez 6 dni w stężeniu gazów 8,0% O2, 8,8% CO2 i 83,2% H2. 6 dnia komórki utrwalano zimnym 50% acetonem i 50% metanolem przez 2 minuty. Do studzienek dodawano 0,03 ml/wgłębienie przeciwciała monoklonalnego przeciwko IS intracellularis w rozcieńczeniu 1:2000 w PBS. Płytki inkubowano przez 30 min w 37°C, a następnie przemywano trzykrotnie PBS. Dodano anty-mysie FITC w rozcieńczeniu 1:30 w ilości 0,03 ml/wgłębienie i inkubowano 30 min w 37°C. Płytki następnie przemywano trzykrotnie ddH2O i pozwalano im wyschnąć. Próbki następnie obserwowano w mikroskopie fluorescencyjnym i określano TCIDso/ml.
189 286
Zakażenie chomików monitorowano stosując metodę PCR stosując startery i parametry cyklu jak to opisał Gary Jones. Próbki kału pobierano w 0, 7, 14, 21, 29, 36 i 43 dniu po zaszczepieniu. Po zakończeniu badania błonę śluzową jelit chomików badano również stosując technikę PCR.
Histopatologia:
Skrawki jelita krętego i grubego utrwalano w formalinie, poddawano rutynowemu postępowaniu, barwiono h.ematoksy.linią i eozyną, impregnowano srebrem i oceniano. Skrawki znaczono również przeciwciałem monoklonalnym swoistym dla L. intracellularis.
Średni dzienny przyrost wagi:
Chomiki ważono 21, 28, 35 i 42 dnia po zaszczepieniu w celu określenia średniego przyrostu wagi.
Wyniki: patrz tablica poniżej.
TCIDio:
Wyniki TCTD50 wskazują że grupa szczepiona (grupa A) otrzymała 104’86 TCłD50chomika. Chomiki w grupie A i B poddawano prowokacji szczepem N343 i otrzymały 105’5 TCłD50/chomika. Chomiki grupy C poddawano prowokacji szczepem N101494 otrzymały 102’75 TCłD50/chomika.
PCR:
Wyniki testu PCR wskazują obecność L. intracellularis u 100% szczepionych chomików, które zabito i poddano sekcji w 21 dni po zaszczepieniu. Badanie 43 dni po zaszczepieniu wykazało, że 1 (000% chomików kontrolnych i 50% zaszczepionych chomików było zakażonych L. intracellularis. Wynik żadnego z królików poddanych prowokacji szczepem N101494 nie był dodatni. Wydalania bakterii w kale nie stwierdzono w trakcie badania u żadnego chomika.
Histopatologia:
Barwienie HE nie wykazało histologicznych uszkodzeń u wszystkich chomików zabitych i poddanych sekcji 21 dnia po zaszczepieniu. W skrawkach pobranych 43 dnia po zaszczepieniu 50% zwierząt w grupie zaszczepionej wykazywało łagodne do ciężkiego limfocytarnego zapalenia jelit i 50% zwierząt grupy kontrolnej wykazywało łagodne limfocytarne zapalenie jelit.
Nie było widocznych uszkodzeń w grupie poddanej prowokacji szczepem N101494.
Znakowanie FA nie wykazało L. intracellularis u żadnego z chomików w 43 po zaszczepieniu.
Dyskusja:
Obserwowano 50% zmniejszenie zakażenia u chomików zaszczepionych intensywnie pasażowanym szczepem L. intracellularis jak to wykazano w badaniu PCR.
| Kał | Kał | Kał | Kał | Kał | Kał | Kał | śluzówka | śluzówka | ||||
| id | PCR d0 | PCR d7 | PCR d14 | PCR d21 | PCR d29 | PCR d36 | PCR d43 | PCR Day21 | PCR Day43 | Ubytki mikroskopowe | ||
| barwienie HE | sre- brem | FA | ||||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 |
| A-1 | - | - | - | - | - | - | - | NA | + | łagodne zapalenie jelit | - | |
| A-2 | - | - | - | - | - | - | - | NA | - | - | - | - |
| A-3 | - | - | - | - | - | - | - | NA | + | łagodne zapalenie jelit | - | - |
189 286
c.d. tabeli
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 |
| A-4 | - | - | - | - | - | - | - | NA | - | - | - | - |
| A-5 | - | - | - | - | - | - | - | NA | + | - | - | - |
| A-6 | - | - | - | - | - | - | - | NA | - | - | - | - |
| A-7 | - | - | - | - | - | - | - | NA | + | cężkie zapalenie jelit | - | - |
| A-8 | - | - | - | - | - | - | NA | + | umiar- kowane zapalenie jelit | - | - | |
| A-9 | - | - | - | - | - | - | - | NA | - | - | - | - |
| A-10 | - | - | - | - | - | - | - | NA | - | łagodne zapalenie jelit | - | - |
| A-11 | - | - | - | - | NA | NA | NA | + | NA | - | - | - |
| A-12 | - | - | - | - | NA | NA | NA | + | NA | - | - | - |
| A-13 | - | - | - | - | NA | NA | NA | + | NA | - | - | - |
| A-14 | - | - | - | - | NA | NA | NA | + | NA | - | - | - |
| A-15 | - | - | - | - | NA | NA | NA | + | NA | - | - | - |
| B-1 | - | - | - | - | - | - | - | NA | + | minimalne zapalenie jelit | - | - |
| B-2 | - | - | - | - | - | - | - | NA | + | minimalne zapalenie jelit | - | - |
| B-3 | - | - | - | - | - | - | - | NA | + | - | - | - |
| B-4 | - | - | - | - | - | - | - | NA | + | minimalne zapalenie jelit | - | - |
| B-5 | - | - | - | - | - | - | - | NA | + | minimalne zapalenie jelit | - | - |
| B-6 | - | - | - | - | - | - | - | NA | + | minimalne zapalenie jelit | - | - |
| B-7 | - | - | - | - | - | - | - | NA | + | - | - | - |
| B-8 | - | - | - | - | - | - | - | NA | + | - | - | - |
| B-9 | - | - | - | - | - | - | - | NA | + | - | - | - |
| B-10 | - | - | - | - | - | - | NA | + | - | - | - |
189 286
c.d. tabeli
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 |
| B-ll | - | - | - | - | NA | NA | NA | - | NA | - | - | - |
| B-12 | - | - | - | - | NA | NA | NA | - | NA | - | - | - |
| B-13 | - | - | - | - | NA | NA | NA | - | NA | - | - | - |
| B-14 | - | - | - | - | NA | NA | NA | - | NA | - | - | - |
| B-15 | - | - | - | - | NA | NA | NA | - | NA | - | - | - |
| C-l | - | - | - | - | - | - | - | NA | - | - | - | - |
| C-2 | - | - | - | - | - | - | NA | - | - | - | - | |
| C-3 | - | - | - | - | - | - | NA | - | - | - | - | |
| C-4 | - | - | - | - | - | - | NA | - | - | - | - | |
| C-5 | - | - | - | - | - | - | NA | - | - | - | - | |
| C-6 | - | - | - | - | - | - | NA | - | - | - | - | |
| C-7 | - | - | - | - | - | - | NA | - | - | - | - | |
| C-8 | - | - | - | - | - | - | NA | - | - | - | - | |
| C-9 | - | - | - | - | - | - | NA | - | - | - | - | |
| C-10 | - | - | - | - | - | - | NA | - | - | - | - |
Przykład 6. Doświadczenie nad skutecznością szczepionki dla świń
Cel:
Przedmiotem tego doświadczenia jest ocena bezpieczeństwa, utrzymującej się kolonizacji i skuteczności niczjadliwncy, żywych izolatów i zabitych izolatów L. intrecelluleris u 2-3tygodniowych świń. Badanie na zwierzętach przeprowadzono na trzytygodniowych świniach zaszczepionych, a następnie poddanych ekspozycji na zjadliwy szczep M343 L. intracclluleris i porównanie zabezpieczenia pomiędzy szczepionkami.
Sposoby:
grudnia 19^» eigólna 45 nwiń5 w wiew tr^n^^<^t^h rygoclnż zodupic^i^o w HoeK Farms. Xostały przewiezione do Veterinery Resources, Inc., pomieszczenia badawcze mieściły się niedaleko Cambridge, Iowa, gdzie je znakowano celem identyfikacji poszczególnych świń. Świnie sprowadzono do ich pomieszczeń na dwa dni przed rozpoczęciem be9euie, by mogły się zaaklimatyzować do pomieszczeń i karmiono je karmą pozbawioną antybiotyków w trakcie trwania badania.
grudnig wsnystwie źstar^ie eważona, ponoano krew celew ιcΊcPania paóbak surowicy, przeprowadzono ocenę kliniczną i pobrano rozmazy kału. Następnie świnie reudomizewene do grup po 5 i umieszczano w wannach. 20 świń umieszczono w oddzielnym pomieszczeniu i były zeclauoweuc jako grupy kontrolne i ściśle kontrolne. 15 świń umieszczono w drugim pomieszczeniu i były poddawane szczepieniu szczepionką Isi-1, w trzecim pomieszczeniu 10 świń otrzymywało Isi-2.
Żywe szczepionki przygotowano w NOBL Laboratories Research and Development i oznaczono numerem doświadczalnym Isi-1. Isi-1 (szczep N343) izolowano ze świń i hodowano w sposób ciągły przez 29 tygodni. Szczepionkę hodowano na komórkach McComa w butelkach typu spinner i w warunkach zmniejszonego stężenia tlenu aż do zauważenia zakażenia około 100% komórek. Próbka intensywnie ceseżoκeucgo szczepu N343 wykorzystanego w wytworzeniu ISi-1 pasażowa^ dodatkowo przez 11 tygodni („N343NP40wk”) i zdeponowano zgodnie z warunkami Porozumienia Budapeszteńskiego 22 maja 1996 w ATCC.
189 286
12301 Parklawn Drive, Ryckvillu, Maryland, USA 200852 i oznaczono numerem dostępu 55783. Hodowle zbiurahy przez wirowanie przy 3000 x g przez 20 min. Peletki zostały ponownie zawieszone w roztworze sacharoza-fosforan-glutaminian (SPG) w 10% FBS i pasażowahz 4 razy przez igłę kaliber 25. Lizaty wirowano przy 500 x g przez 5 min w celu oddzielenia reszt komórkowych i koralików miyrohośhika. Supematant zachowano i przechowywano w -70°C w lodzie przed podaniem do około 1 godz. przed szczepieniem.
Zabite szczepionki (Isi-2) hodowano, pasażowano przez 12,5 tygodnia i zbierano według podobnych zasad jak opisano powyżej i oczyszczano na gradiencie percollu. Oczyszczone bakterie przechowywano w -70°C do około tygodnia przez szczepieniem, następnie przechowywano je w 4°C w przy normalnym poziomie tlenu atmosferycznego, który jest toksyczny dla L. intracellularis. AlOH dodano do bakterii do uzyskania ostatecznego stężenia 10% AlOH. Stężenie białka oznaczano stosują metodę Biuretta.
Określenie ilościowe żywych IS L. intracellularis:
Ilościowe określenie żywotności L. intracellularis osiąga się przez określenie dawki zakażającej hodowlę tkankową w 50% (TCIDso). Do 96-stgdziuhkowych płytek do mikromiaraczkowania wysiano komórki McCoy'a w ilości 1250 komórek/wgłębienie i hodowano przez 18-24 godz. przed zakażeniem. Próbkę kolejno rozcieńczano 1:10 w DMEM/5% FBS zawierającym wa.nkymycyhę (100 pg/ml) i amfoterycynę B (2,0 pg/ml). Rozcieńczenia dodano do 96-stgdziunkzwych płytek do mikromiareczkowania w ilości 0,1 ml/wgłębienie. Stosowano 12 shidzienelkrozcieńczenie. Płytki pr^ez 6 dni w stężeniu gazów 8,0% O2, 8,8%
CO2 i 83,2% H2. Komórki utrwalano zimnym 50% acetonem i 50% metanolem przez 2 minuty. Do studzienek dodawano 0,03 ml/wgłębienie przeciwciała mznoylohalnugy przeciwko L. intracellularis (uzyskane od dr Stevena McOrist'a) w rozcieńczeniu 1:2000 w PBS. Płytki inkubowano przez 30 min w 37°C, a następnie przemywano trzykrotnie PBS. Dodano antymysie koniugaty immgnygloggliny klasy G - fluorochrom (FITC) w rozcieńczeniu 1:30 w ilości 0,03 ml/wgłębienie i inkgbywaho 30 min w 37°C. Płytki następnie przemywano trzykrotnie ddH20 i pozwalano im wyschnąć. Próbki następnie obserwowano w mikroskopie fluorescencyjnym i określano TCID 5oml stosując metodę obliczeń RueC-Mughsch'a.
Wyniki TICD50 wskazują, że ISi-1 zawierają więcej niż 1 x IO5 bakterii/ml. Czwartym materiałem zakażającym było placebo pochodzące z komórkowych hodowli tkankowych przygotowanych w ten sam sposób co szczepionki.
Zabita szczepionka badana w kierunku zawartości białka metodą Biuret'a zawierała 0,311 mg/ml.
Świnie zaszczepiono 13 grudnia 1995. Wszystkie żywe szczepionki podano w dawce 2 ml IN w ilości 1 ml/ nozdrze. Isi-2 (zabite) szczepionki podano domięśniowo w ilości 1,5 ml/świnię i powtórzono po 14 dniach. Wszystkim zwierzętom kontrolnym podano niezakażone komórki w ten sam sposób co żywe szczepionki.
Obserwacje i próbki:
Rozmazy kału i próbki surowicy pobierano co 7 dni w trakcie trwania badania. Rozmazy kału badano metodą PCR stosując zestaw starterów, 5'-TATGGCTGTCAAACACTCCG-3' 5'-TGAAGGTATTGGTATTCTCC-3' do amplifikacji DNA. Parametry cyklu to 93°C przez 5 min, 55°C przez 45 s i 72°C przez 45 s dla pierwszego cyklu. Przeprowadzono 33 cykle we wcześniej podanych temperaturach przez 45 s dla danej temperatury. Ostatni cykl przeprowadzono w 72°C przez 2 min, startery określono przez Jones© i in.
Prowokacja:
Wszystkim zwierzętom, za wyjątkiem ścisłej kontroli poddano prowokacji hodowlami 26 i 27 dnia po szczepieniu, CoCzwle zawierały hiu-ihtehsywniu pasażzwahymi hodowlami L. intracellularis szczepów N343 i N72994, które były hodowane w sposób ciągły przez 8 do 12 tygodni. Hodowle zbierano przez wirowanie przy 3000 x g 20 minut. Peletki ponownie zawieszano w roztworze sacharzza-fosforah-glgtamihiah (SPG) z 10% płodowej surowicy bydlęcej (PBS) i pasażowahy 4-krotme przez igłę o kalibrze 25. Niektóre hodowle przechowywano w -70°C do czasu prowokacji i zbierania hodowli. Prowokacja materiałami zakażającymi została połączona i określono TCID50 hodowli. Próbki trzymano na lodzie aż do momentu podawania.
189 286 stycznia 1996 podano do hodowle prowokacji składające się z 4 x 104 bakterii/ml, a 9 stycznia 1996 podano hodowle prowokacji składające się z 3 x 104 bakterii/ml. Świniom podano w obu tych dniach po 15 ml materiału do prowokacji drogą płukania żołądkowego. Tak więc zwierzęta otrzymały odpowiednio 8 i 9 stycznia 1996 6 x 105 bakterii/świnię i 4,7 x 105 bakterii/świnię.
Wyniki:
Bezpieczeństwo:
Wyniki PCR rozmazów kałowych: Wykrywanie L. intracellularis przy zastosowaniu metody PCR wykazało, że żadna ze świń nie wydalała bakterii z kałem na początku badania. Siódmego DNA po zaszczepieniu wyniki wszystkich świń były ujemne. Czternastego DNA po zaszczepieniu wyniki 3 świń w grupie ISi-1 były dodatnie. Wyniki dwóch zwierząt w grupie ISi-1 w 21 dniu po zaszczepieniu były dodatnie, a wszystkich innych zwierząt ujemne. W 26 dniu po zaszczepieniu żadne ze zwierząt nie wydzielało bakterii z kałem jak to wykazano w badaniu PCR. 26 dnia po zaszczepieniu po 5 świń z grupy Isi-1 i z grupy kontrolnej i 4 świnie z grupy Isi-2 zostało zabitych i poddano sekcji. Pobrano próbki jelita krętego, okrężnicy, krezkowych węzłów limfatycznych i migdałki jak również próbki płuc od świń podejrzanych o zapalenie płuc.
Badnie PCR na zwierzętach przeprowadzono wykorzystując próbki jelita krętego i płuc. Jedynie w grupie leczonej pobrano próbki migdałków, jelita grubego i węzłach chłonnych i przeprowadzono PCR. Wyniki badania PCR pokazano poniżej.
| Grupa | PCR jelita krętego w 26 dniu po szczepieniu | Próbki jelita grubego | Próbki migdałków | Próbki krezkowych węzłów chłonnych | Próbki płuc |
| ISi-1 | 1 z5 | + | - | - | 1 z 1 |
| TSi-2 | 0 z 4 | - | - | - | 0 z 1 |
| Kontrole | 0 z 5 | - | - | - | nie badano |
| Ścisłe kontrole | nie badano | nie badano | nie badano | nie badano | nie badano |
Histologiczne skrawki jelita krętego znakowano stosując swoiste przeciwciało monoklonalne przeciwko L. intracellularis jako przeciwciało pierwszorzędowe i anty-mysie koniugaty immunoglobuliny klasy G-fluorochrom jako przeciwciało drugorzędowe. L. intracellularis obserwowano u 3 z 5 świń z grupy Isi-1. Wyniki wszystkich inne świń były ujemne w znakowaniu przeciwciałem fluorescencyjnym.
Wymienione świnie zostały zabite i poddane sekcji 21 dnia po prowokacji i te same próbki zostały pobrane dla określenia wyników. Wyniki PCR podano poniżej.
| Grupa | PCR jelita krętego w 21 dniu po szczepieniu | Próbki jelita grubego | Próbki migdałków | Próbki krezkowych węzłów chłonnych | Próbki płuc |
| ISi-1 | 0 z 10 | + | - | - | - |
| ISi-2 | 0 z 6 | - | - | - | - |
| Kontrole | 4 z 10 | - | - | . - | - · |
| Ścisłe kontrole | 0 z 5 | - | - | - | - |
Znakowanie FA jelita krętego przeprowadzono jak to pokazano powyżej, 7 z 10 zwierząt miało dodatnie wyniki w grupie kontrolnej. U wszystkich pozostałych zwierząt nie wykazano obecności L. intracellularis.
Surowicę badano w kierunku wytwarzania przeciwciał IgG przez świnie po ekspozycji na L. intracellularis. Test przeprowadzono przez wysiewanie hodowli tkankowych na płytki Terasaki z komórkami McCoy'a w ilości 125 komórek/wgłębienie i hodowanie
189 286 przez 18-24 godziny przez zakażeniem. Czyste hodowle L. intracellularis rozcieńczone do 1000-3000 bakterii/ml w DMEM z 5% płodową surowicą bydlęcą dodano do studzienek w ilości 0,01 ml/wgłębienie. Płytki inkubowano przez 6 dni w stężeniu gazów 8,0% O2, 8,8% CO2 i 83,2% H2. Komórki utrwalano zimnym 50% acetonem i 50% metanolem przez 2 minuty. Surowicę świń rozcieńczono 1:75 w sterylnym PBS. Do studzienek dodawano 0,01 ml/wgłębienie rozcieńczonej surowicy. Płytki inkubowano przez 30-60 min w 37°C. Płytki przemywano 5 razy sterylnym PBS. Do studzienek dodawano 0,01 ml/wgłębienie anty-świński koniugat immunoglobuliny klasy IgG z fluorochromem. Płytki inkubowano przez 30 min w 37°C. Płytki przemywano 5 razy ddHbO i pozwalano im wyschnąć. Próbki obserwowano w mikroskopie fluorescencyjnym i studzienki, w których obserwowano bakterie były znakowane jako dodatnie, a te w których nie obserwowano bakterii znakowano jako ujemne.
Wyniki:
| Grupa | Dzień 0 | 26 dzień po zaszczepieniu | 47 dzień po zaszczepieniu 21 dzień po prowokacji |
| ISi-1 | Oz 15 | 6 z 15 | 8 z 10 |
| ISi-2 | Oz 10 | 3 z 10 | 5 z 6 |
| Kontrole | 1 z 15 | Oz 15 | 9z 10 |
| Ścisłe kontrole | 0 z 5 | 0 z 5 | 0 z 5 |
Zwierzęta, które miały wyniki dodatnie w dniu 0 ponownie badano w odstępach tygodniowych. Wyniki wskazują że wszystkie zwierzęta miały ujemne wyniki serologiczne przez 14 dn7 po zaszczepienm. Nie oczekiwano takiego wyniku , lecz wiek i^v'/ń7 w cbim 0 wynosił 3 tygodine 7 dodaU-ne 7^7^^ mogfy zaaeżeć od przeciwciat .Kzzkazanych przzz maakę.
Surowice badano cały czas z dodatnią surowicą kontrolną uzyskaną przez hiperimmunizację świń czystymi hodowlami L. intracellularis. Wykorzystywana ujemna surowica kontrolna była uzyskana z gnotobiotycznych świń z South Dakota State University.
Podany powyżej opis i przykłady są jedynie ilustracją korzystnego wykonania osiągniętego przy wykorzystaniu przedmiotów, cech i korzyści według niniejszego wynalazku, lecz nie było zamiarem ograniczenie przez to niniejszego wynalazku. Wszystkie modyfikacje niniejszego wynalazku objęte myślą i zakresem następujących zastrzeżeń są częścią niniejszego wynalazku.
Claims (3)
- Zastrzeżenia patentowe1. Zastosowanie atenuowanego szczepu Lawsonia intracellularis, wytworzonego przez otrzymywanie hodowli komórkowych, zwłaszcza Hep-2, McCoy i IEC-18 zakażonych bakterią Lawsonia intracellularis, inkubowanie wymienionych zakażonych komórek w stężeniu tlenu od około 0% do około 18%, wytrząsanie wymienionych zakażonych komórek tak by hodować Lawsonia intracellularis podczas utrzymywania wymienionych zakażonych komórek w zawiesinie, pasażowanie przynajmniej części wymienionych hodowanych bakterii, zbieranie przynajmniej części hodowli wymienionych hodowanych bakterii i wybieranie szczepów atenuowanych w celu dostarczenia atenuowanej bakterii Lawsonia intracellularis do wytwarzania szczepionki do wywołania odpowiedzi immunologicznej przeciwko bakterii Lawsonia intracellularis zwłaszcza ATCC 55783 u zwierząt
- 2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że wymienionym szczepem atenuowanymjest szczep N343NP40wk.
- 3. Zastosowanie atenuowanego szczepu Lawsonia intracellularis wytworzonego przez otrzymywanie hodowli komórkowych, zwłaszcza Hep-2, McCoy i IEC-18 zakażonych bakterią Lawsonia intracellularis, inkubowanie wymienionych zakażonych komórek w stężeniu tlenu od 2 % do około 18%, wytrząsanie wymienionych zakażonych komórek tak by hodować Lawsonia intracellularis podczas utrzymywania wymienionych zakażonych komórek w zawiesinie, pasażowanie przynajmniej części wymienionych hodowanych bakterii, zbieranie przynajmniej części hodowli wymienionych hodowanych bakterii i wybieranie szczepów atenuowanych w celu dostarczenia atenuowanej bakterii Lawsonia intracellularis do wytwarzania szczepionki do wywołania odpowiedzi immunologicznej przeciwko bakterii Lawsonia intracellularis zwłaszcza ATCC 55783 u zwierząt.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/465,337 US5714375A (en) | 1995-06-05 | 1995-06-05 | Ileal symbiont intracellularis propagation in suspended host cells |
| US08/658,194 US5885823A (en) | 1995-06-05 | 1996-06-04 | Lawsonia intracellularis cultivation, anti-Lawsonia intracellularis vaccines and diagnostic agents |
| PCT/US1996/009576 WO1996039629A1 (en) | 1995-06-05 | 1996-06-05 | Lawsonia intracellularis cultivation, anti-lawsonia intracellularis vaccines and diagnostic agents |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL189286B1 true PL189286B1 (pl) | 2005-07-29 |
Family
ID=27041284
Family Applications (6)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL35816296A PL187849B1 (pl) | 1995-06-05 | 1996-06-05 | Sposób wykrywania obecności przeciwciał i test diagnostyczny |
| PL96358164A PL189187B1 (pl) | 1995-06-05 | 1996-06-05 | Szczepionka do wywoływania odpowiedzi immunologicznej przeciwko bakterii Lawsonia intracellularis |
| PL35816396A PL187850B1 (pl) | 1995-06-05 | 1996-06-05 | Nowa metoda hodowli bakterii Lawsonia intracellularis |
| PL96358165A PL189286B1 (pl) | 1995-06-05 | 1996-06-05 | Zastosowanie atenuowanego szczepu Lawsonia intracellularis |
| PL96325872A PL189250B1 (pl) | 1995-06-05 | 1996-06-05 | Sposób hodowania Lawsonia intracellularis, bakterie hodowane tym sposobem i sposób wytwarzania atenuowanych szczepów Lawsonia intracellularis |
| PL96358166A PL189287B1 (pl) | 1995-06-05 | 1996-06-05 | Atenuowany szczep Lawsonia intracellularis |
Family Applications Before (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL35816296A PL187849B1 (pl) | 1995-06-05 | 1996-06-05 | Sposób wykrywania obecności przeciwciał i test diagnostyczny |
| PL96358164A PL189187B1 (pl) | 1995-06-05 | 1996-06-05 | Szczepionka do wywoływania odpowiedzi immunologicznej przeciwko bakterii Lawsonia intracellularis |
| PL35816396A PL187850B1 (pl) | 1995-06-05 | 1996-06-05 | Nowa metoda hodowli bakterii Lawsonia intracellularis |
Family Applications After (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL96325872A PL189250B1 (pl) | 1995-06-05 | 1996-06-05 | Sposób hodowania Lawsonia intracellularis, bakterie hodowane tym sposobem i sposób wytwarzania atenuowanych szczepów Lawsonia intracellularis |
| PL96358166A PL189287B1 (pl) | 1995-06-05 | 1996-06-05 | Atenuowany szczep Lawsonia intracellularis |
Country Status (24)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5885823A (pl) |
| EP (5) | EP1645567B2 (pl) |
| JP (4) | JP3765834B2 (pl) |
| KR (4) | KR20060129549A (pl) |
| AT (3) | ATE289069T1 (pl) |
| AU (1) | AU717045B2 (pl) |
| BG (1) | BG64292B1 (pl) |
| BR (2) | BRPI9612938B8 (pl) |
| CA (1) | CA2222643C (pl) |
| CZ (1) | CZ295933B6 (pl) |
| DE (5) | DE69638016D1 (pl) |
| DK (3) | DK1645567T4 (pl) |
| ES (3) | ES2173055T3 (pl) |
| FR (1) | FR07C0071I2 (pl) |
| HK (1) | HK1010911A1 (pl) |
| HU (1) | HU230199B1 (pl) |
| LU (1) | LU91405I2 (pl) |
| NL (1) | NL300331I2 (pl) |
| NZ (1) | NZ319994A (pl) |
| PL (6) | PL187849B1 (pl) |
| PT (3) | PT1403643E (pl) |
| RO (1) | RO118885B1 (pl) |
| RU (2) | RU2265849C2 (pl) |
| WO (1) | WO1996039629A1 (pl) |
Families Citing this family (61)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1145697C (zh) | 1995-11-30 | 2004-04-14 | 维多利亚农业服务控股公司 | 治疗和诊断组合物 |
| FR2772047B1 (fr) | 1997-12-05 | 2004-04-09 | Ct Nat D Etudes Veterinaires E | Sequence genomique et polypeptides de circovirus associe a la maladie de l'amaigrissement du porcelet (map), applications au diagnostic et a la prevention et/ou au traitement de l'infection |
| CA2372098A1 (en) * | 1999-05-13 | 2000-11-23 | Pfizer Products Inc. | Lawsonia derived gene and related flge polypeptides, peptides and proteins and their uses |
| MXPA01011570A (es) * | 1999-05-13 | 2003-08-20 | Australian Pork Ltd | Gen derivado de lawsonia y polipeptidos, peptidos y proteinas relacionadas con peptido h de membrana externa. |
| EP1177213A4 (en) * | 1999-05-13 | 2002-08-28 | Pfizer Prod Inc | LAWSONIA DERIVATIVE GENE, POLYPEPTIDES, PEPTIDES AND HEMOLYSIN PROTEINS AND USES THEREOF |
| US7052697B1 (en) * | 1999-05-13 | 2006-05-30 | Agriculture Victoria Services Pty Ltd | Lawsonia derived gene and related OmpH polypeptides, peptides and proteins and their uses |
| MXPA01011670A (es) * | 1999-05-13 | 2003-10-14 | Pfizer Prod Inc | Gen derivado de lawsonia y polipeptidos, peptidos y proteinas sodc relacionadso y sus usos. |
| US7029683B1 (en) | 1999-05-13 | 2006-04-18 | Pfizer Products, Inc. | Lawsonia derived gene and related hemolysin polypeptides, peptides and proteins and their uses |
| US6605696B1 (en) * | 1999-10-22 | 2003-08-12 | Pfizer, Inc. | Lawsonia intracellularis proteins, and related methods and materials |
| HUP0303655A2 (hu) * | 2000-09-29 | 2004-03-01 | Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona | Proliferatív ileitis elleni hatékonyabb vakcinák, előállításuk és alkalmazásuk |
| JP2004512851A (ja) * | 2000-11-10 | 2004-04-30 | アグリカルチュア ビクトリア サービシーズプロプライエトリー リミティッド | ラウソニア種による感染を処置する新規な治療用組成物 |
| AUPR138100A0 (en) | 2000-11-10 | 2000-12-07 | Agriculture Victoria Services Pty Ltd | Novel therapeutic compositions for treating infection by lawsonia spp |
| DK1586646T3 (da) * | 2000-12-20 | 2011-06-27 | Intervet Int Bv | Lawsonia intracellularis-vaccine |
| US20030087421A1 (en) * | 2001-07-11 | 2003-05-08 | Gebhart Connie J | Lawsonia intracellularis |
| EP1570045A4 (en) * | 2002-10-04 | 2007-09-05 | Univ Minnesota | NUCLEIC ACID AND POLYPEPTIDE SEQUENCES FROM LAWSONIA INTRACELLULARIS AND METHOD OF USE |
| PT1651260E (pt) * | 2003-07-25 | 2009-09-24 | Boehringer Ingelheim Vetmed | Lawsonia intracellularis de origem europeia e vacinas, agentes de diagnóstico e métodos para sua utilização |
| US7662390B2 (en) | 2003-09-12 | 2010-02-16 | Intarvet International B.V. | Lawsonia intracellularis subunit vaccine |
| BRPI0417440A (pt) * | 2003-12-09 | 2007-03-06 | Intervet Int Bv | ácido nucleico, fragmento e molécula de dna, veìculo recombinante vivo, célula hospedeira, proteìna de lawsonia intracellularis, vacina para combater as infecções com lawsonia intracelularis, método para a preparação de uma vacina, e, testes de diagnóstico para aldetecção de anticorpos contra lawsonia intracellularis e material antigênico de lawsonia intracellularis |
| MXPA06008217A (es) * | 2004-01-22 | 2007-05-23 | Intervet Int Bv | Vacunas con subunidad de lawsonia intracellularis. |
| EP1609870A1 (en) * | 2004-06-24 | 2005-12-28 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Method of diagnosing lawsonia intracellularis |
| MY146476A (en) | 2004-06-24 | 2012-08-15 | Boehringer Ingelheim Vetmed | Method of diagnosing lawsonia intracellularis |
| US20060021536A1 (en) * | 2004-07-30 | 2006-02-02 | Limin Song | Method for creating an absorbent article exhibiting a harmonic color scheme |
| KR100621882B1 (ko) * | 2004-09-30 | 2006-09-19 | 건국대학교 산학협력단 | 돼지 증식성 회장염 감염돈에서 로소니아인트라셀룰라리스 균을 분리하는 방법 |
| AU2005308583A1 (en) * | 2004-11-24 | 2006-06-01 | Pharmacia & Upjohn Company Llc | Methods for cultivating Lawsonia intracellularis |
| US20070212373A1 (en) * | 2004-12-08 | 2007-09-13 | Akzo Nobel N.V. | Lawsonia Intracellularis 26 Kd Subunit Vaccine |
| US7833707B2 (en) * | 2004-12-30 | 2010-11-16 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Methods of overexpression and recovery of porcine circovirus type 2 ORF2 |
| UA95602C2 (ru) | 2004-12-30 | 2011-08-25 | Берингер Ингельхейм Ветмедика, Инк. | Иммуногенная композиция цвс2 и способы приготовления такой композиции |
| US7700285B1 (en) | 2005-12-29 | 2010-04-20 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | PCV2 immunogenic compositions and methods of producing such compositions |
| US8834891B2 (en) | 2005-03-14 | 2014-09-16 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Immunogenic compositions comprising Lawsonia intracellularis |
| US8398994B2 (en) * | 2005-07-15 | 2013-03-19 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Lawsonia vaccine and methods of use thereof |
| CN109125721A (zh) | 2005-12-29 | 2019-01-04 | 贝林格尔.英格海姆维特梅迪卡有限公司 | Pcv2免疫原性组合物用于减轻猪临床症状的用途 |
| BR122015028489B1 (pt) | 2005-12-29 | 2021-10-13 | Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc | Vacina de combinação multivalente contra pcv2, bem como uso de uma proteína orf2 na preparação da mesma |
| US8470336B2 (en) * | 2006-05-25 | 2013-06-25 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Vaccination of young animals against Lawsonia intracellularis infections |
| US20080241190A1 (en) * | 2006-11-13 | 2008-10-02 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Vaccination of horses against lawsonia intracellularis |
| WO2008073464A2 (en) * | 2006-12-11 | 2008-06-19 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Effective method of treatment of porcine circovirus and lawsonia intracellularis infections |
| ES2726777T3 (es) | 2006-12-15 | 2019-10-09 | Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc | Vacuna porcina anti-PCV2 en dosis única |
| EP1941903A1 (en) | 2007-01-03 | 2008-07-09 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Prophylaxis and treatment of PRDC |
| EP1958644A1 (en) | 2007-02-13 | 2008-08-20 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Prevention and treatment of sub-clinical pcvd |
| US7829274B2 (en) * | 2007-09-04 | 2010-11-09 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Reduction of concomitant infections in pigs by the use of PCV2 antigen |
| WO2009037262A2 (en) * | 2007-09-17 | 2009-03-26 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Method of preventing early lawsonia intracellularis infections |
| CN101874106A (zh) * | 2007-10-12 | 2010-10-27 | 辉瑞大药厂 | 培养胞内劳森氏菌的方法 |
| KR20100103535A (ko) * | 2007-12-31 | 2010-09-27 | 베링거잉겔하임베트메디카인코퍼레이티드 | 외래 아미노산 삽입물을 갖는 ｐｃｖ２ ｏｒｆ２ 바이러스 유사 입자 |
| CA2712006A1 (en) | 2008-01-23 | 2009-10-15 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Pcv2 mycoplasma hyopneumoniae immunogenic compositions and methods of producing such compositions |
| EP2254595A4 (en) * | 2008-02-15 | 2012-12-05 | Boehringer Ingelheim Vetmed | METHODS AND COMPOSITIONS FOR REDUCING THE IMPACT OF ENTERIC DISEASES |
| TWI449533B (zh) | 2008-04-18 | 2014-08-21 | Intervet Int Bv | 防備胞內勞森菌（Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）、豬肺炎黴漿菌（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）及豬環狀病毒（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏ ｖｉｒｕｓ）用疫苗 |
| TWI551295B (zh) | 2008-04-18 | 2016-10-01 | 英特威特國際股份有限公司 | 防備胞內勞森菌（Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）用疫苗 |
| EP2318041B1 (en) | 2008-07-22 | 2015-02-25 | Intervet International BV | Lawsonia intracellularis bacterium of a novel serotype, vaccine based on that bacterium, antibodies suitable for diagnosing the novel lawsonia intracellularis serotype and hybridomas for producing the said antibodies |
| US8142760B2 (en) * | 2008-09-05 | 2012-03-27 | Nathan Len Winkelman | Vaccination for Lawsonia intracellularis |
| WO2011006880A1 (en) * | 2009-07-14 | 2011-01-20 | Intervet International B.V. | Lawsonia intracellularis propagation |
| AR078253A1 (es) * | 2009-09-02 | 2011-10-26 | Boehringer Ingelheim Vetmed | Metodos para reducir la actividad antivirica en composiciones pcv-2 y composiciones pcv-2 con mejor inmunogenicidad |
| US8530223B2 (en) * | 2009-11-09 | 2013-09-10 | Intervet International B.V. | Method to grow Lawsonia intracellularis bacteria in persistently infected McCoy cells |
| CN108379571A (zh) | 2012-12-28 | 2018-08-10 | 勃林格殷格翰动物保健有限公司 | 支原体疫苗的制备方法 |
| EP4091629A1 (en) | 2013-09-25 | 2022-11-23 | Zoetis Services LLC | Pcv2b divergent vaccine composition and methods of use |
| US9505808B2 (en) | 2013-10-02 | 2016-11-29 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | PCV2 ORF2 protein variant and virus like particles composed thereof |
| CN107206062B (zh) | 2015-02-04 | 2021-07-02 | 英特维特国际股份有限公司 | 用于针对猪中亚临床劳森氏菌感染的疫苗 |
| RU2709197C2 (ru) | 2015-02-04 | 2019-12-17 | Интервет Интернэшнл Б.В. | Вакцина для применения против субклинической инфекции lawsonia у свиней |
| KR20180062468A (ko) * | 2016-11-18 | 2018-06-11 | 녹십자수의약품(주) | 신규한 로소니아 인트라셀룰라리스 균주 및 이의 용도 |
| CA3088651A1 (en) | 2018-02-28 | 2019-09-06 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Method for reducing skatole and/or indole in animals |
| CA3185751A1 (en) | 2020-07-24 | 2022-01-27 | Edgar DIAZ | Combination porcine vaccine |
| AU2022375120A1 (en) | 2021-11-01 | 2024-04-11 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Immunogenic gel compositions |
| WO2024068637A1 (en) * | 2022-09-27 | 2024-04-04 | Intervet International B.V. | A method of culturing lawsonia intracellularis bacteria |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4132597A (en) * | 1976-06-09 | 1979-01-02 | Ab Medipharm | Method for cultivation of bacteria |
| US4237218A (en) * | 1979-02-09 | 1980-12-02 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Micro-carrier cell culture |
| JPS5991879A (ja) * | 1982-11-16 | 1984-05-26 | Hideaki Yamada | シユ−ドモナス属細菌の培養法 |
| DK594084A (da) * | 1984-12-12 | 1986-06-13 | Novo Industri As | Fremgangsmaade til stabilisering af extra-chromosomale elementer i bakterier under dyrkning |
| JPH0644865B2 (ja) * | 1985-10-29 | 1994-06-15 | 三菱瓦斯化学株式会社 | カンピロバクタ−属細菌の培養方法 |
| US5338670A (en) * | 1986-07-28 | 1994-08-16 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Production of bordetella pertussis toxin with a low concentration of iron |
| IT1227657B (it) * | 1988-12-01 | 1991-04-23 | Mini Ricerca Scient Tecnolog | Antibiotici ab-021 e processo per la loro produzione |
| JPH0822221B2 (ja) * | 1988-12-28 | 1996-03-06 | 日東化学工業株式会社 | シュードモナス属細菌の培養法 |
| JPH02308754A (ja) * | 1989-05-24 | 1990-12-21 | Yakult Honsha Co Ltd | 乳発酵食品の製造法 |
| US5296221A (en) * | 1990-01-31 | 1994-03-22 | Sani-Ei Sucrochemical Co., Ltd. | Lactobacillus johnsonii ferm bp-2680 lactic acid bacteria preparations using the same and a process of manufacturing the preparations |
| ES2150419T3 (es) * | 1990-11-01 | 2000-12-01 | Univ Iowa State Res Found Inc | Procedimiento de atenuacion bacteriana y vacuna. |
| ES2194841T3 (es) * | 1991-11-15 | 2003-12-01 | Pfizer | Procedimiento de produccion de vacunas bacterianas gram negativas. |
| DE4208785A1 (de) * | 1992-03-19 | 1993-09-23 | Degussa | Verfahren zum auffinden von insertionselementen (is-elemente) oder transposonen |
| US5610059A (en) * | 1992-11-09 | 1997-03-11 | University Of Arizona | Etiological agent for porcine enteritis |
-
1996
- 1996-06-04 US US08/658,194 patent/US5885823A/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-05 EP EP05023400.4A patent/EP1645567B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-05 KR KR1020067024337A patent/KR20060129549A/ko not_active Application Discontinuation
- 1996-06-05 HU HU9900884A patent/HU230199B1/hu unknown
- 1996-06-05 EP EP96921391.7A patent/EP0843818B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-05 PL PL35816296A patent/PL187849B1/pl unknown
- 1996-06-05 DE DE69638016T patent/DE69638016D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-05 AT AT96921391T patent/ATE289069T1/de active
- 1996-06-05 ES ES96921391T patent/ES2173055T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-05 PL PL96358164A patent/PL189187B1/pl unknown
- 1996-06-05 ES ES03022895T patent/ES2332587T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-05 RO RO97-02211A patent/RO118885B1/ro unknown
- 1996-06-05 DE DE0843818T patent/DE843818T1/de active Pending
- 1996-06-05 EP EP10150886.9A patent/EP2199795B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-05 EP EP03022895.1A patent/EP1403643B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-05 PT PT03022895T patent/PT1403643E/pt unknown
- 1996-06-05 PT PT96921391T patent/PT843818E/pt unknown
- 1996-06-05 PL PL35816396A patent/PL187850B1/pl unknown
- 1996-06-05 AU AU62627/96A patent/AU717045B2/en not_active Expired
- 1996-06-05 AT AT05023400T patent/ATE373015T1/de active
- 1996-06-05 CZ CZ19973899A patent/CZ295933B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1996-06-05 KR KR1020057005243A patent/KR100544857B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1996-06-05 EP EP20050023398 patent/EP1655607B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-05 BR BRPI9612938A patent/BRPI9612938B8/pt not_active IP Right Cessation
- 1996-06-05 NZ NZ319994A patent/NZ319994A/xx not_active IP Right Cessation
- 1996-06-05 PL PL96358165A patent/PL189286B1/pl unknown
- 1996-06-05 DK DK05023400.4T patent/DK1645567T4/en active
- 1996-06-05 ES ES05023400.4T patent/ES2294620T5/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-05 PT PT05023400T patent/PT1645567E/pt unknown
- 1996-06-05 JP JP50186797A patent/JP3765834B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-05 DK DK96921391T patent/DK0843818T3/da active
- 1996-06-05 DE DE69634334T patent/DE69634334T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-05 AT AT03022895T patent/ATE441863T1/de active
- 1996-06-05 CA CA2222643A patent/CA2222643C/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-05 PL PL96325872A patent/PL189250B1/pl unknown
- 1996-06-05 KR KR1019970708990A patent/KR100513481B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1996-06-05 RU RU98100430/13A patent/RU2265849C2/ru active
- 1996-06-05 KR KR1020057003259A patent/KR100758614B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1996-06-05 DK DK03022895T patent/DK1403643T3/da active
- 1996-06-05 DE DE122007000102C patent/DE122007000102I1/de active Pending
- 1996-06-05 WO PCT/US1996/009576 patent/WO1996039629A1/en active IP Right Grant
- 1996-06-05 PL PL96358166A patent/PL189287B1/pl unknown
- 1996-06-05 DE DE69637251.7T patent/DE69637251T3/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-05 BR BRPI9608338-7A patent/BR9608338B1/pt active IP Right Grant
-
1997
- 1997-12-18 BG BG102130A patent/BG64292B1/bg unknown
-
1998
- 1998-11-18 HK HK98112116A patent/HK1010911A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2005
- 2005-05-13 RU RU2005114739/13A patent/RU2305707C2/ru active
- 2005-10-19 JP JP2005304585A patent/JP3920300B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2006
- 2006-12-28 JP JP2006355093A patent/JP4263212B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2007
- 2007-12-21 LU LU91405C patent/LU91405I2/fr unknown
- 2007-12-21 FR FR07C0071C patent/FR07C0071I2/fr active Active
-
2008
- 2008-01-08 NL NL300331C patent/NL300331I2/nl unknown
- 2008-05-12 JP JP2008124788A patent/JP5078740B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PL189286B1 (pl) | Zastosowanie atenuowanego szczepu Lawsonia intracellularis | |
| EP1651260B1 (en) | Lawsonia intracellularis of european origin and vaccines, diagnostic agents and methods of use thereof | |
| MXPA97009464A (en) | Culture of lawsonia intracellularis, vaccines against lawsonia intracellulares and agents of diagnost |