DE69637153T2 - Verbesserungen in oder in bezug auf pfanzenstärkeverbindungen - Google Patents

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Stephen Alan Jobling
Richard Bedford SAFFORD
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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Diese Erfindung betrifft neue Nukleotidsequenzen, Polypeptide, die dadurch kodiert werden, Vektoren und Wirtszellen und Wirtsorganismen, die eine oder mehrere der neuen Sequenzen umfassen, und ein Verfahren zur Veränderung von einer oder mehreren Eigenschaften eines Organismus'. Die Erfindung betrifft ebenso Stärke mit neuen Eigenschaften und deren Verwendung.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Stärke ist die Hauptform der Kohlenstoff-Reserven in Pflanzen, die 50 % oder mehr des Trockengewichts von vielen Speicherorganen ausmachen, zum Beispiel von Knollen oder Samen von Getreidearten. Stärke wird in zahlreichen Anwendungen auf dem Gebiet der Lebensmittel und der Industrie verwendet. In vielen Fällen ist es jedoch notwendig, die nativen Stärken anhand chemischer oder physikalischer Mittel zu modifizieren, um bestimmte Eigenschaften herzustellen, die für besondere Anwendungen geeignet sind. Es würde in hohem Maß wünschenswert sein, wenn man in der Lage wäre, Stärken mit den geforderten Eigenschaften unmittelbar in der Pflanze herzustellen, und somit die Notwendigkeit für eine weitere Modifikation zu umgehen. Um dieses Ziel über ein genetisches Verfahren zu erreichen, ist ein Wissen über die Stoffwechselwege der Stärke-Biosynthese erforderlich. Dieses umfasst die Charakterisierung der Gene und der durch die Gene kodierten Produkte, welche die Synthese der Stärke katalysieren. Das Wissen über die Regulation der Stärke-Biosynthese bringt die Möglichkeit mit sich, die biosynthetischen Stoffwechselwege zu „reprogrammieren", um Stärken mit neuen Eigenschaften zu erzeugen, die neue kommerzielle Anwendungen haben könnten.
  • Die kommerziell nützlichen Eigenschaften der Stärke leiten sich von der Fähigkeit der nativen granulären Form ab, bei einer geeigneten Behandlung zu quellen und Wasser zu absorbieren. Üblicherweise ist Hitze erforderlich, um die Körner zur Quellung in einem Verfahren zu veranlassen, das als Gelatinierung bekannt ist, welches definiert wurde (W. A. Atwell et al., Cereal Foods World 33, 306-311, 1988) als „... das Zusammenbrechen (das Aufreißen) der molekularen Ordnung innerhalb der Stärkekörner, die sich in unumkehrbaren Veränderungen in den Eigenschaften niederschlägt, wie zum Beispiel dem Quellen der Körner, dem Schmelzen nativer Kristallite, dem Verlust der Doppelbrechung und der Stärke-Solubilisierung. Der Punkt der anfänglichen Gelatinierung und der Bereich, in welchem sie auftritt, wird durch die Stärke-Konzentration, durch die Art der Beobachtung, durch den Korntyp und die Heterogenitäten innerhalb der beobachteten Population von Körnern bestimmt". Eine Anzahl von Verfahren sind für die Bestimmung der Gelatinierung verfügbar, wie sie durch Erhitzen herbeigeführt wird; ein bequemes und genaues Verfahren stellt die Differential-Scanning-Kalorimetrie dar, welche den Temperaturbereich und die Enthalpie detektiert, die mit dem Zusammenbruch der molekularen Ordnung innerhalb des Korns einhergehen. Um genaue und sinnvolle Ergebnisse zu erzielen, werden üblicherweise der Spitzenwert und/oder die Temperatur beim Einsetzen der endothermen Reaktion bestimmt, welche durch Differential-Scanning-Kalorimetrie beobachtet werden.
  • Die Folge des Zusammenbruchs der molekularen Ordnung innerhalb der Stärkekörner liegt darin, dass die Körner in der Lage sind, Wasser in einem Prozess aufzunehmen, der als Teigbildung (pasting) bekannt ist, das definiert wurde (W. A. Atwell et al., Cereal Fonds World 33, 306-311, 1988) als „... das Phänomen, das der Gelatinierung bei der Lösung der Stärke folgt. Es beinhaltet das Quellen der Körner, das Austreten molekularer Bestandteile aus dem Korn und gegebenenfalls die vollständige Spaltung der Körner". Als das beste Verfahren zur Bewertung der Eigenschaften bezüglich der Teigbildung wird die Viskoamylographie (Atwell et al., 1988 vorstehend zitiert) angesehen, bei der die Viskosität einer gerührten Stärke-Suspension unter bestimmten Zeit- und Temperatur-Bedingungen beobachtet wird. Ein typisches Profil einer viskoamylographischen Messung für Kartoffelstärke zeigt ein anfängliches Ansteigen der Viskosität, das man auf das Quellen der Körner zurückführt. Über die allgemeine Ausprägung der Viskositätsreaktion in einem Viskoamylographen hinaus stellt die Temperatur der anfänglichen Viskositäts-Entwicklung (das heißt, die Temperatur beim Einsetzen der Viskosität) eine bequeme quantitative Messgröße dar. 1 zeigt ein solches typisches Viskositätsprofil für Kartoffelstärke während und nach dem Kochen, und umfasst die Stadien A-D, welche dem Einsetzen der Viskosität (A), der maximalen Viskosität (B), der vollständigen Dispersion (C) und der Reassoziation der Moleküle (oder der Retrogradation, D) entsprechen. In der Figur stellt die gestrichelte Linie die Viskosität (in Einheiten der Drehzahl) einer 10 % w/w Stärke-Suspension dar, und die ununterbrochene Linie zeigt die Temperatur in °C. An einem bestimmten Punkt, der durch den Spitzenwert der Viskosi tät bestimmt wird, ist das Quellen der Körner so umfangreich, dass die erhaltenen, hochgradig expandierten Strukturen gegenüber einer mechanisch herbeigeführten Fragmentierung unter den verwendeten Rühr-Bedingungen anfällig sind. Wenn die Reaktionsmasse weiter erhitzt und bei 95 °C gehalten wird, wird eine weitere Abnahme der Viskosität aufgrund der zunehmenden Fragmentierung der gequollenen Körner beobachtet. Dieses allgemeine Profil wurde zuvor stets für native Kartoffelstärke gefunden.
  • Nach dem Erhitzen der Stärken in Wasser auf 95 °C und dem Beibehalten bei dieser Temperatur (typischerweise für 15 Minuten) führt das nachfolgende Abkühlen auf 50 °C zu einer Zunahme der Viskosität aufgrund des Prozesses der Retrogradation oder der Rückstellung. Die Retrogradation (oder die Rückstellung) ist definiert (Atwell et al., 1988 vorstehend zitiert) als „... ein Prozess, der auftritt, wenn die Moleküle, einschließlich gelatinierter Stärke, sich in einer geordneten Struktur erneut zu assoziieren beginnen ...". Bei 50 °C ist es in erster Linie der Amylose-Bestandteil, der erneut assoziiert, wie es der Anstieg der viskoamylographischen Viskosität für Stärke aus normalem Mais (21,6 % Amylose) wiederspiegelt, im Vergleich mit Stärke aus wachsartigem Mais (1,1 Amylose), die in 2 gezeigt ist. 2 zeigt viskoamylographische Profile von 10 % (w/w) Suspensionen aus wachsartiger Maisstärke (durchgezogene Linie), herkömmlicher Maisstärke (Punkte und Striche), einer Varietät mit einem hohen Amylose-Anteil (Nylon 5, gepunktete Linie) und einer Varietät mit einem sehr hohen Amylose-Anteil (Nylon 7, Kreuze). Das Temperaturprofil ist wie in 1 auch anhand einer durchgezogenen Linie gezeigt. Das Ausmaß der Zunahme der Viskosität in der Viskoamylographie beim Kühlen und während des Beibehaltens der Temperatur von 50 °C hängt von der Menge der Amylose ab, die in der Lage ist, aufgrund ihres Austretens aus den Stärkekörnern während des Gelatinierungs- und Teigbildungs-Prozesses (pasting process) erneut zu assoziieren. Ein Kennzeichen von amylosereichen Stärken aus Maispflanzen liegt darin, dass sehr wenig Amylose durch Gelatinierung und durch die Teigbildung bis zu 95 °C aus den Körnern austritt, vermutlich aufgrund der begrenzten Quellung der Körner. Dieser Umstand wird in 2 erläutert, welche niedrige Viskositäten für eine Stärke mit einem hohen Amylose-Anteil (44,9 %; Nylon 5) aus Mais während der Gelatinierung und der Teigbildung bei 95 °C, sowie eine geringe Zunahme der Viskosität beim Abkühlen und während des Beibehaltens der Temperatur von 50 °C zeigt. Dieser Effekt ist stärker ausgeprägt für einen höheren Amylose-Anteil (58 %, wie in Nylon 7), der sogar gerin gere Viskositäten im Viskoamylographie-Test (2) zeigt. Für die im Handel erhältlichen Stärken mit hohem Amylose-Anteil (derzeit erhältlich aus Maispflanzen, wie zum Beispiel den vorstehend beschriebenen) ist eine Verarbeitung bei mehr als 100 °C üblicherweise notwendig, um die Vorteile von hohen Amylose-Anteilen in Bezug auf die erhöhten Geschwindigkeiten und das Ausmaß der Reassoziation umzusetzen, jedoch ist der Einsatz von solch hohen Temperaturen energetisch ungünstig und kostspielig. Dementsprechend gibt es ein unerfülltes Bedürfnis nach Stärken mit einem hohen Amylose-Anteil, die unterhalb von 100 °C verarbeitet werden können und noch einen höheren Grad der Reassoziation zeigen, wie zum Beispiel durch Messungen mit einem Viskoamylographen gezeigt.
  • Die Eigenschaften von Kartoffelstärke sind nützlich in einer Reihe von Anwendungen sowohl für Lebensmittel als auch für Nicht-Lebensmittel (wie zum Beispiel für Papier, Textilien, Klebstoffe und dergleichen). Jedoch sind die Eigenschaften für viele Anwendungen nicht optimal, und zahlreiche chemische und physikalische Modifikationen, die im Stand der Technik gut bekannt sind, werden unternommen, um nützliche Eigenschaften zu verbessern. Zwei Arten der Manipulation der Eigenschaften, die von Nutzen sein würden, sind: die kontrollierte Veränderung der Temperatur der Gelatinierung und der Teigbildung; und Stärken, die weniger unter der Körnerfragmentierung während der Teigbildung leiden als herkömmliche Stärken.
  • Derzeit stellen die einzigen Wege für die Manipulation der Temperaturen der Gelatinierung und der Teigbildung von Kartoffelstärke die Zugabe von Zusatzstoffen, wie zum Beispiel von Zuckern, Polyhydroxy-Verbindungen von Salzen (Evans & Haisman, Stärke 34, 224-231, 1982), oder die ausgiebige physikalische oder chemische Vorbehandlung dar (zum Beispiel Stute, Stärke 44, 205-214, 1992). Die Verringerung der Körner-Fragmentierung während der Teigbildung kann entweder durch ausgiebige physikalische Vorbehandlung (Stute, Stärke 44, 205-214, 1992) oder durch chemische Vernetzung erreicht werden. Solche Verfahren sind unbequem und unergiebig. Es ist daher wünschenswert, Pflanzen zu erhalten, die Stärke produzieren, welche solche vorteilhaften Eigenschaften bereits an sich besitzt.
  • Stärke besteht aus zwei wichtigen Polysacchariden, Amylose und Amylopectin. Amylose ist ein im Allgemeinen lineares Polymer, das α-1,4-verknüpfte Glucose-Einheiten enthält, während Amylopectin ein in hohem Maße verzweigtes Polymer darstellt, das aus einem α-1,4-verknüpften Glucan-Rückgrat mit α-1,6-verknüpften Glucan-Verzweigungen besteht. In den meisten pflanzlichen Speicherreserven macht Amylopectin etwa 75 des Stärkegehalts aus. Amylopectin wird in einer konzertierten Aktion der Synthase für lösliche Stärke und des Stärke-Verzweigungsenzyms (α-1,4-Glucan: α-1,4-Glucan-6-glycosyltransferase, EC 2.4.1.18) synthetisiert. Das Stärke-Verzweigungsenzym (starch branching enzyme; SBE) hydrolysiert α-1,4-Verknüpfungen, und verbindet erneut das gespaltene Glucan über eine α-1,6-Verknüpfung mit einer Akzeptor-Kette, um eine verzweigte Struktur zu erzeugen. Die physikalischen Eigenschaften der Stärke werden stark durch das relative Vorkommen von Amylose und Amylopectin beeinflusst, und SBE ist daher ein kritisches Enzym bei der Bestimmung von sowohl der Quantität als auch der Qualität von Stärken, die in pflanzlichen Systemen erzeugt wurden.
  • In den meisten, bis heute studierten Pflanzen, zum Beispiel Mais (Boyer & Preiss, Biochem. Biophys. Res. Commun. 80, 169-175, 1978), Reis (Smyth, Plant Sci. 57, 1-8, 1988) und Erbse (Smith, Planta 175, 270-279) wurden zwei Formen von SBE identifiziert, die jeweils durch ein eigenes Gen kodiert werden. Ein kürzlicher Übersichtsartikel von Burton et al. (The Plant Journal 7, 3-15, 1995) hat gezeigt, dass zwei Formen von SBE verschiedenen Klassen des Enzyms angehören, so dass im Allgemeinen Enzyme der gleichen Klasse aus verschiedenen Pflanzen eine größere Ähnlichkeit zeigen können als Enzyme verschiedener Klassen aus der gleichen Pflanze. In diesem Übersichtsartikel nannten Burton et al. die beiden jeweiligen Enzym-Familien Klasse „A" und Klasse „B", und der Leser wird für eine ausführliche Diskussion der Unterschiede zwischen den zwei Klassen darauf verwiesen (und auf die darin angegebenen Referenzen). Als ein allgemeiner Unterschied von Bedeutung würde in den SBE-Molekülen der Klasse A das Vorliegen einer flexiblen, N-terminalen Domäne erscheinen, die in den Molekülen der Klasse B nicht gefunden wird. Die von Burton et al. beobachteten Unterschiede beziehen sich in diesem Fall darauf, SBE-Moleküle der Klasse A und der Klasse B zu definieren, welche Ausdrücke entsprechend zu verstehen sind.
  • In der Kartoffel wurde bis heute jedoch nur eine Isoform des SBE-Moleküls (das der Klasse B angehört) beschrieben, und es wurde nur ein Gen kloniert (Blennow & Johannson, Phytochem. 30, 437-444, 1991 und Koßmann et al., Mol. Gen. Genet. 230, 39-44, 1991). Darüber hinaus waren die veröffentlichten Versuche, die Eigenschaften von Stärke in Kartoffelpflanzen zu modifizieren (indem man die Expression des einzigen bekannten SBE verhindert) im Allgemeinen nicht erfolgreich (zum Beispiel Müller-Rober & Koßmann, Plant Cell and Environment 17, 601-613, 1994).
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Unter einem ersten Gesichtspunkt stellt die Erfindung eine isolierte Nukleotid-Sequenz bereit, die für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäure-Sequenz der Reste 49 bis 882 der in 5 gezeigten Sequenz oder deren Komplement umfasst.
  • Die in 5 (SEQ ID Nr. 15) gezeigte Aminosäuresequenz umfasst eine Leader-Sequenz, welche das Polypeptid zu den Amyloplasten steuert, wenn es in Kartoffelzellen synthetisiert wird. Der Fachmann wird erkennen, dass die Leader-Sequenz entfernt wird, um ein reifes Enzym zu ergeben, und dass die Leader-Sequenz daher für die Enzymaktivität nicht wesentlich ist. Dementsprechend ist ein „wirksamer Abschnitt" des Polypeptids ein solcher, der eine ausreichende SBE-Aktivität aufweist, um die Mutation des Verzweigungsenzyms in Escherichia coli KV 832 Zellen (nachfolgend beschrieben) zu komplementieren, und welches SBE aktiv ist, wenn es in E. coli im Stimulierungs-Assay in Bezug auf die Phosphorylierung exprimiert wird. Ein Beispiel eines unvollständigen Polypeptids, welches dennoch einen „wirksamen Abschnitt" darstellt, ist das reife Enzym, dem die Leader-Sequenz fehlt. Aufgrund der Analogie mit der SBE-Sequenz der Klasse A aus Erbse besitzt die in 5 gezeigte Sequenz der Klasse A aus Kartoffel vermutlich eine Leader-Sequenz von etwa 48 Aminosäure-Resten, so dass man glaubt, dass die N-terminale Aminosäure-Sequenz etwa bei dem Glutaminsäure-Rest (E) an Position 49 (EKSSYN ... etc.) beginnt. Der Fachmann wird zu schätzen wissen, dass ein wirksamer Abschnitt des Enzyms gut andere Teile der Sequenz, die in der Figur gezeigt sind, ohne eine wesentliche schädigende Wirkung entbehren kann. Zum Beispiel könnte der Glutaminsäure-reiche Bereich am C-Terminus in der Länge verringert oder möglicherweise ganz deletiert werden, ohne die SBE-Aktivität der Klasse A zu verlieren. Ein Vergleich mit anderen bekannten SBE-Sequenzen, insbesondere mit anderen SBE-Sequenzen der Klasse A (siehe zum Beispiel Burton et al., 1995, vorstehend zitiert) sollte auf solche Abschnitte hinweisen, die in hohem Maße konserviert sind (und somit wahrscheinlich für die Aktivität wesentlich sind), sowie auf solche Abschnitte, die weniger gut konserviert sind (und somit wahrscheinlich toleranter gegenüber Sequenz-Veränderungen, ohne einen wesentlichen Verlust der Enzymaktivität zu verursachen).
  • In herkömmlicher Weise wird die Nukleotid-Sequenz im Wesentlichen die Nukleotide 289 bis 2790 der DNA-Sequenz (SEQ ID Nr. 14), die in 5 gezeigt ist (welche Nukleotide für das reife Enzym kodieren), oder ein funktionelles Äquivalent derselben umfassen, und sie kann ebenso weitere Nukleotide am 5'- oder 3'-Ende umfassen. Zum Beispiel wird die Sequenz aus Gründen der Einfachheit der Expression ebenso in wünschenswerter Weise ein ATG-Startkodon im Leseraster umfassen, und sie kann ebenso für eine Leader-Sequenz kodieren. Somit umfasst die Sequenz in einer Ausführungsform darüber hinaus die Nukleotide 145 bis 288 der in 5 gezeigten Sequenz. Weitere Ausführungsformen sind die Nukleotide 228 bis 2855 der Sequenz, die als „psbe2con.seq" in der 8 markiert ist, sowie die Nukleotide 57 bis 2564 der in 12 gezeigten Sequenz (die vorzugsweise ein ATG-Startkodon im Leseraster umfasst, wie zum Beispiel die Sequenz der Nukleotide 24 bis 56 in der gleichen Figur), oder funktionelle Äquivalente der vorstehend genannten Sequenzen.
  • Der Ausdruck „funktionelles Äquivalent", wie er hier für Nukleotid-Sequenzen verwendet wird, soll jene Sequenzen umfassen, die sich in ihrer Nukleotid-Zusammensetzung von jener in 5 gezeigten unterscheiden, die jedoch aufgrund der Entartung des genetischen Kodes für Polypeptide kodieren, welche identische oder im Wesentlichen identische Aminosäure-Sequenzen aufweisen. Es ist beabsichtigt, dass der Ausdruck ebenso auf Sequenzen angewendet wird, die mit der Sequenz der Erfindung ausreichend homolog sind, so dass sie mit der komplementären Sequenz derselben unter stringenten Hybridisierungs-Bedingungen hybridisieren können – solche Äquivalente werden vorzugsweise mindestens 85 %, stärker bevorzugt mindestens 90 % und am meisten bevorzugt mindestens 95 % Sequenz-Homologie mit der Sequenz der Erfindung aufweisen, wie es durch die Nukleotide 289 bis 2790 der in 5 gezeigten DNA-Sequenz beispielhaft gezeigt ist. Es wird für den Fachmann ersichtlich werden, dass die Nukleotid-Sequenz der Erfindung ebenso eine nützliche Anwendung finden kann, wenn sie als eine „Antisens"-Sequenz vorliegt. Dementsprechend werden funktionell äquivalente Sequenzen ebenso jene Sequenzen umfassen, die unter stringenten Hybridisierungs-Bedingungen mit der Sequenz der Erfindung (vielmehr mit deren Komplement) hybridisieren können. Solche „Antisens"-Äquivalente werden vorzugsweise mindestens 85 %, stärker bevorzugt mindestens 90 % und am meisten bevorzugt 95 % Sequenz-Homologie mit dem Komplement der erfindungsgemäßen Sequenz aufweisen, wie sie durch die Nuk leotide 289 bis 2790 der in 5 gezeigten DNA-Sequenz beispielhaft gezeigt wird. Besondere funktionelle Äquivalente sind zum Beispiel in den 8 und 10 gezeigt (falls man die zahlreichen Verschiebungen des Leserasters außer Betracht lässt, die hier angegeben sind).
  • Die Erfindung stellt ebenso Vektoren bereit, insbesondere Expressionsvektoren, welche die Nukleotid-Sequenz der Erfindung umfassen. Der Vektor wird typischerweise einen Promotor und ein oder mehrere regulatorische Signale von jener Art umfassen, die dem Fachmann gut bekannt sind. Die Erfindung beinhaltet ebenso die Bereitstellung von transformierten Zellen (welcher Ausdruck die Transduktion und Transfektion umfasst), die mit einem Vektor transformiert sind, der die Nukleotid-Sequenz der Erfindung umfasst.
  • Die Erfindung stellt darüber hinaus ein SBE-Polypeptid der Klasse A bereit, das aus Kartoffelpflanzen erhältlich ist und das von der Nukleinsäure-Sequenz im Sinne des ersten Gesichtspunkts der Erfindung kodiert wird. Insbesondere stellt die Erfindung das Polypeptid in einer im Wesentlichen reinen Form bereit, insbesondere in einer Form, die frei von anderen, aus Pflanzen stammenden (insbesondere aus Kartoffelpflanzen stammenden) Bestandteilen ist, die leicht durch Expression der betreffenden Nukleotid-Sequenz in einem geeigneten, nicht-pflanzlichen Wirt (wie zum Beispiel einem beliebigen Hefestamm, der routinemäßig für Expressionszwecke verwendet wird, zum Beispiel Pichia spp. oder Saccharomyces spp.), bewerkstelligt werden kann. Typischerweise wird das Enzym im Wesentlichen die Sequenz der Aminosäure-Reste 49 bis 882, die in 5 gezeigt sind (abgesehen von der Sequenz MNKRIDL, die nicht Teil des Enzyms ist), oder ein funktionelles Äquivalent derselben umfassen. Das Polypeptid der Erfindung kann in einem Verfahren zur Modifikation von Stärke in vitro verwendet werden, welches Verfahren die Behandlung der Stärke unter geeigneten Bedingungen (zum Beispiel geeignete Temperatur, pH-Wert und dergleichen) mit einer wirksamen Menge des erfindungsgemäßen Polypeptids umfasst.
  • Der Ausdruck „funktionell äquivalent", wie er hier für Aminosäure-Sequenzen verwendet wird, soll Aminosäure-Sequenzen umfassen, die im Wesentlichen zu jener in 5 gezeigten ähnlich sind, so dass das Polypeptid eine ausreichende Aktivität besitzt, um die Mutation des Verzweigungsenzyms in Escherichia coli KV 832 Zeilen (nachfolgend beschrieben) zu komplementieren, und dass das Polypeptid in E. coli im Stimulations-Assay in Bezug auf die Phosphorylierung aktiv ist. Typischerweise werden solche funktionell äquivalenten Aminosäure-Sequenzen vorzugsweise mindestens 85 %, stärker bevorzugt mindestens 90 % und am meisten bevorzugt mindestens 95 % Sequenz-Identität mit der Aminosäure-Sequenz des reifen Enzyms (das heißt ohne Leader-Sequenz) aufweisen, welche Aminosäure-Sequenz in 5 gezeigt ist. Der Fachmann wird zu schätzen wissen, dass konservative Substitutionen im Allgemeinen über das gesamte Molekül erfolgen können, ohne die Aktivität des Enzyms wesentlich zu beeinflussen. Darüber hinaus können manche der nicht-konservativen Substitutionen toleriert werden, insbesondere in den weniger hoch konservierten Bereichen des Moleküls. Solche Substitutionen können zum Beispiel gemacht werden, um die Aktivität des Enzyms leicht zu modifizieren. Das Polypeptid kann eine Leader-Sequenz umfassen, wie zum Beispiel jene, die durch die Reste 1 bis 48 der in 5 gezeigten Aminosäure-Sequenz beispielhaft vorgestellt wird, falls gewünscht, obwohl andere Leader-Sequenzen und Signal-Peptide und dergleichen bekannt sind, und enthalten sein können.
  • Ein Abschnitt der erfindungsgemäßen Nukleotid-Sequenz wurde in eine Pflanze eingeführt, und es wurde gefunden, dass sie die Eigenschaften der Pflanze beeinflusst. Es wurde insbesondere gefunden, dass die Einführung der erfindungsgemäßen Sequenz, die funktionell in Antisens-Orientierung mit einem geeigneten Promotor verknüpft ist, die Menge der verzweigten Stärkemoleküle in der Pflanze herabsetzt. Es wurde darüber hinaus vor kurzem in anderen experimentellen Systemen gezeigt, dass die „Sens-Unterdrückung" ebenso auftreten kann (das heißt die Expression einer eingeführten Sequenz, die funktionell in Sens-Orientierung verknüpft ist, kann über manche unbekannte Mechanismen mit der Expression des nativen Gens wechselwirken), wie beschrieben von Matzke & Matzke (Plant Physiol. 170, 679-685, 1995). Irgendeines der von Matzke & Matzke erwähnten Verfahren könnte in der Theorie dazu verwendet werden, um die Expression eines homologen SBE-Gens in einem Wirt zu beeinflussen.
  • Man glaubt, dass die Antisens-Verfahren hauptsächlich auf der Erzeugung von Antisens-mRNA beruhen, die mit der Sens-mRNA hybridisiert, und somit ihre Translation in ein funktionelles Polypeptid verhindert, möglicherweise dadurch, dass sie den Abbau der Hybrid-RNA veranlasst (zum Beispiel Sheehy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 8805-8809, 1988; Van der Krol et al., Mol. Gen. Genet. 220, 204-212). Die Sens-Unterdrü ckung erfordert ebenso eine Homologie zwischen der eingeführten Sequenz und dem Ziel-Gen, jedoch ist der exakte Mechanismus unklar. Es ist jedoch ersichtlich, dass in Bezug sowohl auf die Antisens- als auch die Sens-Unterdrückung weder eine Nukleotid-Sequenz von vollständiger Länge, noch eine „native" Sequenz wesentlich ist. Vorzugsweise wird der „wirksame Abschnitt", der im Verfahren verwendet wird, mindestens ein Drittel der Sequenz mit vollständiger Länge umfassen, jedoch können durch einfaches Ausprobieren (trial and error) weitere Fragmente (das heißt, kleinere oder größere Fragmente) gefunden werden, die bei der Veränderung der Eigenschaften der Pflanze funktionell sind.
  • Somit stellt die Erfindung unter einem weiteren Gesichtspunkt ein Verfahren zur Veränderung der Eigenschaften einer Pflanze bereit, welches Verfahren das Einführen eines Abschnittes einer erfindungsgemäßen Sequenz in die Pflanze umfasst, welcher Abschnitt funktionell mit einem geeigneten Promotor verknüpft ist und in der Pflanze aktiv ist, um die Expression eines in der Pflanze vorhandenen Gens zu beeinflussen. In herkömmlicher Weise wird die Sequenz in Antisens-Orientierung mit dem Promotor verknüpft sein. Vorzugsweise ist die Pflanze eine Kartoffelpflanze. In herkömmlicher Weise betrifft die veränderte Eigenschaft den Stärkegehalt und/oder die Stärkezusammensetzung der Pflanze (das heißt die in der Pflanze vorhandene Menge und/oder die Art der Stärke). Vorzugsweise wird das Verfahren zur Veränderung der Eigenschaft der Pflanze ebenso die Einführung von einer oder mehreren weiteren Sequenzen umfassen, zusätzlich zu einem Abschnitt der erfindungsgemäßen Sequenz. Die eingeführte erfindungsgemäße Sequenz sowie eine oder mehrere weitere Sequenzen (welche Sens- oder Antisens-Sequenzen sein können), können in funktioneller Weise mit einem einzelnen Promotor verknüpft sein (welcher gewährleisten würde, dass beide Sequenzen im Wesentlichen zur gleichen Zeit transkribiert würden), oder sie können funktionell mit getrennten Promotoren verknüpft sein (welche für eine optimale Expression notwendig sein können). Wenn getrennte Promotoren verwendet werden, können sie identisch oder voneinander verschieden sein. Geeignete Promotoren sind dem Fachmann gut bekannt, und umfassen sowohl konstitutive als auch induzierbare Typen. Beispiele hierfür umfassen den CaMV-35S-Promotor (zum Beispiel die Einzel- oder die Tandem-Wiederholung) und den Patatin-Promotor. In vorteilhafter Weise wird der Promotor gewebespezifisch sein. In wünschenswerter Weise wird der Promotor die Expression der funktionell verknüpften Sequenz in wesentlichem Ausmaß nur in demjenigen Gewebe der Pflanze veranlassen, in welchem die Stärkesynthese und/oder die Stärkespeicherung hauptsächlich auftreten. Wenn somit die Sequenz zum Beispiel in eine Kartoffelpflanze eingeführt wird, kann der funktionell verknüpfte Promotor knollenspezifisch sein, wie zum Beispiel der Patatin-Promotor.
  • In wünschenswerter Weise wird die weitere Sequenz einen Abschnitt der Sequenz umfassen, die für ein SBE-Molekül der Klasse B aus Kartoffel kodiert. In wünschenswerter Weise wird das Verfahren zum Beispiel die Einführung eines Abschnittes einer Sequenz umfassen, welche Sequenz für SBE der Klasse B kodiert und funktionell in Antisens-Orientierung mit einem geeigneten Promotor verknüpft ist, der in der Pflanze aktiv ist. In herkömmlicher Weise wird die weitere Sequenz einen wirksamen Abschnitt der von Blennow & Johannson (Phytochem. 30, 437-444, 1991) beschriebenen Sequenz umfassen, oder jener Sequenz, die in WO 92/11 375 offenbart ist. In stärker bevorzugter Weise wird die weitere Sequenz mindestens einen Abschnitt der in der internationalen Patentanmeldung Nr. WO 95/26 407 offenbarten Sequenz umfassen. Es wurde von den vorliegenden Erfindern gefunden, dass die Verwendung von Antisens-Sequenzen sowohl gegen SBE der Klasse A als auch gegen SBE der Klasse B in Kombination zur Erzeugung von Stärke mit sehr stark veränderten Eigenschaften führt (siehe unten). Der Fachmann wird die Möglichkeit zu schätzen wissen, dass, falls die Pflanze bereits eine Sens- oder Antisens-Sequenz umfasst, welche die SBE-Aktivität der Klasse B effizient hemmt, die Einführung einer Sens- oder Antisens-Sequenz, um die SBE-Aktivität der Klasse A zu hemmen (und somit eine Pflanze herzustellen, in der sowohl die Aktivität der Klasse A als auch die Aktivität der Klasse B gehemmt ist) in großem Umfang die Eigenschaften der Stärke in der Pflanze verändern kann, ohne dass eine Notwendigkeit für die Einführung von einer oder mehreren weiteren Sequenzen besteht. Somit wird die Sequenz der Erfindung in herkömmlicher Weise in Pflanzen eingeführt, die bereits ein geringes Niveau der SBE-Aktivität der Klasse A und/oder der Klasse B aufweisen, so dass die Hemmung, die sich aus der Einführung der erfindungsgemäßen Sequenz ergibt, wahrscheinlich eine ziemlich ausgeprägte Wirkung aufweist.
  • Die erfindungsgemäße Sequenz sowie eine oder mehrere weitere Sequenzen können in die Pflanze durch ein beliebiges Verfahren aus einer Reihe gut bekannter Verfahren eingeführt werden, falls gewünscht (zum Beispiel durch eine Agrobacterium-vermittelte Transformation, oder durch „biolistische" Verfahren). Die Sequenzen sind wahrscheinlich am meisten bei der Hemmung der SBE-Aktivität in Kartoffelpflanzen wirksam, jedoch können sie theoretisch in eine beliebige Pflanze eingeführt werden. Wünschenswerte Beispiele umfassen Erbse, Tomate, Mais, Weizen, Reis, Gerste, Süßkartoffel und Maniokpflanzen. Vorzugsweise wird die Pflanze ein natürliches Gen umfassen, das für ein SBE-Molekül kodiert, welches eine vernünftige Homologie mit der eingeführten erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Sequenz zeigt.
  • Unter einem anderen Gesichtspunkt stellt die Erfindung eine Pflanzenzelle, eine Pflanze oder die Nachkommen derselben bereit, welche ein Konstrukt umfassen, das die Sequenz im Sinne des ersten Gesichtspunkts der Erfindung aufweist. Die Nachkommen der veränderten Pflanze können zum Beispiel durch vegetative Vermehrung oder durch Kreuzung der veränderten Pflanze und Aufbewahrung des so erhaltenen Samens erhalten werden. Die Erfindung stellt ebenso Teile der veränderten Pflanze bereit, wie zum Beispiel Speicherorgane. In herkömmlicher Weise liefert die Erfindung zum Beispiel Knollen, die veränderte Stärke umfassen, wobei die Knollen aus einer veränderten Pflanze oder deren Nachkommen erhalten werden. Die Kartoffelknollen, die von veränderten Pflanzen (oder deren Nachkommen) erhalten wurden, werden besonders nützliche Materialien in bestimmten industriellen Anwendungen oder für die Herstellung und/oder die Verarbeitung von Lebensmitteln darstellen, und sie können zum Beispiel dazu verwendet werden, Waffeln und Chips mit wenig Fett herzustellen (Amylose wird im Allgemeinen als Beschichtung verwendet, um die Aufnahme von Fett zu verhindern), und um Kartoffelbrei herzustellen (insbesondere „Instant"-Kartoffelbrei), der besondere Eigenschaften aufweist.
  • Die Erfindung stellt ebenso Stärke bereit, wie sie in einem der Ansprüche 1 bis 16 in den anhängenden Ansprüchen definiert ist. Die Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleotid-Sequenzen hat es den vorliegenden Erfindern ermöglicht, Kartoffelstärken herzustellen, die neue Eigenschaften in einem breiten Bereich aufweisen.
  • Insbesondere stellt die Erfindung die folgenden Gegenstände bereit: eine Pflanze (insbesondere eine Kartoffelpflanze), die eine Stärke enthält, welche, wenn sie durch Nassmahlen bei Umgebungstemperatur aus der Pflanze extrahiert wird, eine erhöhte Temperatur beim Einsetzen der Viskosität (üblicherweise um 10 bis 25 °C erhöht) aufweist, die anhand eines Viskoamylographie-Profils beurteilt wird, welche Beurteilung entspre chend dem in Anspruch 7 der anhängenden Ansprüche definierten Protokoll durchgeführt wird, im Vergleich mit einer Stärke, die aus einer unveränderten, jedoch sonst genetisch identischen Pflanze extrahiert wird; eine Pflanze (insbesondere eine Kartoffelpflanze), die eine Stärke enthält, welche, wenn sie aus der Pflanze durch Nassmahlen bei Umgebungstemperatur extrahiert wird, einen verminderten Spitzenwert der Viskosität (üblicherweise um 240 bis 700 SNUs vermindert) aufweist, die anhand eines Viskoamylographie-Profils beurteilt wird, welche Beurteilung entsprechend dem in Anspruch 7 der anhängenden Ansprüche definierten Protokoll durchgeführt wird, im Vergleich mit einer Stärke, die aus einer unveränderten, jedoch sonst genetisch identischen Pflanze extrahiert wird; eine Pflanze (insbesondere eine Kartoffelpflanze), die eine Stärke enthält, welche, wenn sie aus der Pflanze durch Nassmahlen bei Umgebungstemperatur extrahiert wird, eine erhöhte Viskosität bei der Teigbildung (üblicherweise um mehr als 37 bis 260 SNUs erhöht) aufweist, die anhand eines Viskoamylographie-Profils beurteilt wird, welche Beurteilung gemäß dem in Anspruch 7 der anhängenden Ansprüche definierten Protokoll durchgeführt wird, im Vergleich mit einer Stärke, die aus einer unveränderten, jedoch sonst genetisch identischen Pflanze extrahiert wird; eine Pflanze (insbesondere eine Kartoffelpflanze), die eine Stärke enthält, welche, wenn sie aus der Pflanze durch Nassmahlen bei Umgebungstemperatur extrahiert wird, eine erhöhte Rücksteil-Viskosität (set-back viscosity) (üblicherweise um 224 bis 313 SNUs erhöht) aufweist, wie sie anhand eines Viskoamylographie-Profils beurteilt wird, welche Beurteilung gemäß dem in Anspruch 7 der anhängenden Ansprüche definierten Protokoll durchgeführt wird, im Vergleich mit einer Stärke, die aus einer unveränderten, jedoch sonst genetisch identischen Pflanze extrahiert wird; eine Pflanze (insbesondere eine Kartoffelpflanze), die eine Stärke enthält, welche, wenn sie aus der Pflanze durch Nassmahlen bei Umgebungstemperatur extrahiert wird, eine Rückstell-Viskosität aufweist, wie sie anhand eines Viskoamylographie-Profils beurteilt wird, welche Beurteilung gemäß dem in Anspruch 7 der anhängenden Ansprüche definierten Protokoll durchgeführt wird, im Vergleich mit einer Stärke, die aus einer unveränderten, jedoch sonst genetisch identischen Pflanze extrahiert wird; und eine Pflanze (insbesondere eine Kartoffelpflanze), die eine Stärke enthält, welche, wenn sie aus der Pflanze durch Nassmahlen bei Umgebungstemperatur extrahiert wird, einen erhöhten Amylosegehalt aufweist, der durch einen indometrischen Assay nach dem Verfahren von Morrison & Laignelet (1983, vorstehend zitiert) abgeschätzt wird, im Vergleich mit einer Stärke, die aus einer unveränderten, jedoch sonst genetisch identischen Pflanze extrahiert wird. Die Erfindung stellt ebenso eine Stärke mit solchen Eigenschaften wie vorstehend beschrieben bereit.
  • Insbesondere sorgt die Erfindung für eine Stärke, welche, wenn sie aus einer Kartoffelpflanze durch Nassmahlen bei Umgebungstemperatur extrahiert wird, eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften aufweist, die durch eine Analyse mit dem Viskoamylographen beurteilt werden, welche Analyse gemäß den im Folgenden definierten Bedingungen durchgeführt wird: die Temperatur beim Einsetzen der Viskosität liegt im Bereich von 70 bis 95 °C, (vorzugsweise von 75 bis 95 °C); der Spitzenwert der Viskosität liegt im Bereich von 500 bis 12 Drehzahleinheiten (stirring number units; SNUs); die Viskosität während der Teigbildung liegt im Bereich von 214 bis 434 Drehzahleinheiten; die Rücksteil-Viskosität liegt im Bereich von 450 bis 618 oder 14 bis 192 Drehzahleinheiten; oder die Stärke zeigt keine erhebliche Zunahme der Viskosität während der Viskoamylographie. Der Spitzenwert der Viskosität, die Viskosität während der Teigbildung sowie die Rücksteil-Viskosität sind wie nachstehend definiert. Die Temperatur beim Einsetzen der Viskosität ist die Temperatur, bei der eine plötzliche merkliche Zunahme der Viskosität vom Niveau der Grundlinie während der Viskoamylographie auftritt, und sie stellt einen Ausdruck dar, der dem Fachmann gut bekannt ist.
  • In anderen besonderen Ausführungsformen stellt die Erfindung eine Stärke bereit, die aus einer Kartoffelpflanze durch Nassmahlen bei Umgebungstemperatur extrahiert wird, und einen Spitzenwert der Viskosität im Bereich von 200 bis 500 SNUs und eine Rücksteil-Viskosität im Bereich von 275 bis 618 SNUs aufweist, wie die Stärke anhand des Viskoamylographie-Profils gemäß dem nachstehend definierten Protokoll beurteilt wird; sowie eine Stärke, welche, wenn sie aus einer Kartoffelpflanze durch Nassmahlen bei Umgebungstemperatur extrahiert wird, eine Viskosität aufweist, die zwischen dem Start der Heizphase (Schritt 2) und dem Start der endgültigen Haltephase (Schritt 5) nicht abnimmt, und die eine Rücksteil-Viskosität von 303 SNUs oder weniger aufweist, wie die Stärke anhand des Viskoamylographie-Profils gemäß dem nachstehend definierten Protokoll beurteilt wird.
  • Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung sollen die Bedingungen für die Viskoamylographie so verstanden werden, als erstreckten sie sich auf eine Analyse einer 10 (w/w) wässrigen Suspension von Stärke bei Umgebungsdruck, wobei ein Analysator der Marke „Newport Scientific Rapid Visco Analyser" mit folgendem Heizprofil verwendet wird: Halten der Temperatur von 50 °C für 2 Minuten (Schritt 1), Erhitzen von 50 auf 95 °C bei einer Geschwindigkeit von 1,5 °C pro Minute (Schritt 2), Halten der Temperatur von 95 °C für 15 Minuten (Schritt 3), Kühlen von 95 auf 50 °C bei einer Geschwindigkeit von 1,5 °C pro Minute (Schritt 4), und anschließend Halten der Temperatur von 50 °C für 15 Minuten (Schritt 5). Der Spitzenwert der Viskosität kann für die vorliegenden Zwecke als die maximale Viskosität definiert werden, die während der Heizphase (Schritt 2) oder der Halte-Phase (Schritt 3) in der viskoamylographischen Messung erreicht wird. Die Viskosität während der Teigbildung kann als diejenige Viskosität definiert werden, die von den Stärkesuspensionen am Ende der Haltephase (Schritt 3) der viskoamylographischen Messung erreicht wird. Die Rücksteil-Viskosität kann als diejenige Viskosität der Stärkesuspension am Ende von Schritt 5 der viskoamylographischen Messung definiert werden.
  • In einem weiteren Gesichtspunkt stellt die Erfindung eine Stärke aus einer Kartoffelpflanze mit einem scheinbaren Amylosegehalt (%, w/w) von mindestens 35 % bereit, der durch einen indometrischen Assay gemäß dem von Morrison & Laignelet (J. Cereal Science 1, 9-20, 1983) beschriebenen Verfahren abgeschätzt wird. Vorzugsweise wird die Stärke einen Amylosegehalt von mindestens 40 %, stärker bevorzugt von mindestens 50 %, und am meisten bevorzugt von mindestens 66 % aufweisen. Eine Stärke, die unmittelbar aus einer Kartoffelpflanze erhalten wurde und solche Eigenschaften aufweist, wurde bisher nicht hergestellt. In der Tat ist es als ein Ergebnis der vorliegenden Erfindung nunmehr möglich, in vivo Kartoffelstärke zu erzeugen, die manche Eigenschaften in Analogie zu den Stärken mit sehr hohem Amylosegehalt (z.B: Hylon 7) aufweist, die aus Mais erhältlich sind.
  • Stärken mit hohen (mindestens 35 %) Amylosegehalten finden kommerzielle Anwendung, da aus anderen Gründen der Amylose-Bestandteil der Stärke während des Retrogradations-Prozesses stärker und schneller reassoziiert als der Amylopectin-Bestandteil. Dies kann zum Beispiel im Falle von Stärken mit hohen Amylosegehalten (mindestens 35 %), verglichen mit Stärken von normalem Amylosegehalt (weniger als 35 %), zu Teigen mit höheren Viskositäten, Gelen von größerer Kohäsion, oder Filmen von größerer Festigkeit führen. In alternativer Weise können Stärken mit sehr hohen Amylosegehalten erhalten werden, so dass die Kornstruktur während des Erhitzens im Wesentlichen erhalten wird, und so dass es zur Bildung von Stärkesuspensionen kommt, welche im Wesentlichen keinen Anstieg in der Viskosität während des Kochens zeigen (das heißt, es gibt keinen erheblichen Anstieg der Viskosität während der vorstehend definierten Bedingungen für die Viskoamylographie). Solche Stärken zeigen typischerweise einen Anstieg der Viskosität von weniger als 10 % (vorzugsweise von weniger als 5 %) unter den vorstehend definierten Bedingungen für die Viskoamylographie.
  • Im Handel werden diese wertvollen Eigenschaften derzeit aus Stärken mit hohem Amylosegehalt erhalten, die aus Maispflanzen stammen. Es würde von kommerziellem Wert sein, eine alternative Quelle für Stärken mit hohem Amylosegehalt aus Kartoffeln zu besitzen, da sich die Leistungsmerkmale bei der Anwendung von Stärken mit einem hohen Amylosegehalt aus Mais- und Kartoffel-Pflanzen aufgrund von anderen Eigenschaften, wie zum Beispiel der Korngröße, der organoleptischen Eigenschaften und der strukturellen Eigenschaften, voneinander unterscheiden können.
  • Somit können Stärken mit einem hohen Amylosegehalt, die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung gewonnen werden, in vielen verschiedenen technologischen Gebieten Anwendung finden, welche grob in zwei Gruppen eingeteilt werden können: Nahrungsmittelprodukte und deren Verarbeitung; und „industrielle" Anwendungen. Unter der Überschrift „Nahrungsmittelprodukte" können die neuen Stärken der vorliegenden Erfindung zum Beispiel Anwendung finden als Filme, Schichten, Überzüge oder Geliermittel. Im Allgemeinen absorbieren Stärken mit einem hohen Amylosegehalt weniger Fett während des Bratens als Stärken mit einem niedrigen Amylosegehalt, so dass erfindungsgemäße Stärken mit einem hohen Amylosegehalt in vorteilhafter Weise bei der Herstellung von Bratprodukten mit niedrigem Fettgehalt eingesetzt werden können (zum Beispiel für Kartoffelchips, Crisps und dergleichen). Die neuen Stärken können ebenso mit Vorteil bei der Herstellung von Konditoreiwaren und bei kornartigen und bezüglich der Retrogradation „resistenten" Stärken verwendet werden. Eine „resistente" Stärke ist eine Stärke, die resistent gegenüber der Verdauung durch α-Amylase ist. Als solche wird resistente Stärke durch α-Amylasen, die im humanen Dünndarm vorliegen, nicht verdaut, sondern tritt in den Dickdarm ein, wo sie Eigenschaften zeigt, die ähnlich den löslichen und unlöslichen diätetischen Fasern sind. Resistente Stärke stellt somit einen großen Vorteil aufgrund ihres geringen kalorischen Brennwerts und ihres hohen Gehalts an diätetischen Fasern dar. Resistente Stärke wird durch Retrogradation (ver wandt der Rekristallisation) von Amylose aus Stärkegelen gebildet. Eine solche Retrogradation wird durch Amylopectin gehemmt. Dementsprechend sind die Stärken der vorliegenden Erfindung mit einem hohen Amylosegehalt ausgezeichnete Ausgangsmaterialien für die Herstellung von resistenten Stärken. Geeignete Verfahren zur Herstellung von resistenter Stärke sind dem Fachmann gut bekannt und umfassen zum Beispiel jene, die in den US-Patenten Nr. 5,051,271 und 5,281,276 beschrieben sind. In herkömmlicher Weise umfassen die resistenten Stärken, welche durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt werden, insgesamt mindestens 5 % diätetische Fasern, wie der Gehalt durch das Verfahren von Prosky et al. (J. Assoc. Off. Anal. Chem. 68, 677, 1985) abgeschätzt wird, das in US 5,281,276 erwähnt ist.
  • Unter der Überschrift „industrielle Anwendungen" können die neuen Stärken der Erfindung zum Beispiel als Klebstoffe in Wellpappe, in biologisch abbaubaren Produkten, wie zum Beispiel für eine Verpackung mit losem Füllmaterial (loose fill packaging) und für geschäumte Formteile, sowie bei der Herstellung von Glasfasern und Textilien mit Vorteil verwendet werden.
  • Der Fachmann wird zu schätzen wissen, dass die neuen Stärken der Erfindung, falls gewünscht, in vitro einer herkömmlichen enzymatischen, physikalischen und/oder chemischen Modifikation unterworfen werden können, wie zum Beispiel der Vernetzung, der Einführung von hydrophoben Gruppen (zum Beispiel Octenylbernsteinsäure, Dodecylbernsteinsäure), oder der Derivatisierung (zum Beispiel mittels Veresterung oder Veretherung).
  • Die Erfindung stellt Stärken mit hohem Amylosegehalt (35 % oder mehr) bereit, welche Teig-Viskositäten erzeugen können, die größer als jene sind, die aus Stärken mit hohem Amylosegehalt aus Maispflanzen erreicht werden, nachdem sie bei Temperaturen von unter 100 °C verarbeitet wurden. Dies bietet den Vorteil einer wirtschaftlicheren Stärke-Gelatinierung und einer Teig-Behandlung durch die Verwendung von niedrigeren Verarbeitungstemperaturen als sie derzeit für Stärken mit einem hohen Amylosegehalt aus Maispflanzen erforderlich sind.
  • Die Erfindung wird nunmehr anhand von erläuternden Beispielen und mit Bezugnahme auf die Zeichnungen beschrieben, welche bedeuten:
  • 1 zeigt das Profil einer typischen viskoamylographischen Messung für eine 10 (w/w) Suspension von Kartoffelstärke.
  • 2 zeigt das Profil einer viskoamylographischen Messung für 10 % Suspensionen von Stärke aus verschiedenen Mais-Varietäten.
  • 3 ist eine schematische Darstellung der Klonierungsstrategie, die von den vorliegenden Erfindern verwendet wurde.
  • 4a zeigt das Aminosäure-Alignment des C-terminalen Abschnittes der Enzym-Isoformen des Stärke-Verzweigungsenzyms aus verschiedenen Quellen; Aminosäurereste, welche der Konsensus-Sequenz entsprechen, sind schattiert.
  • 4b zeigt die Alignments der DNA-Sequenzen von verschiedenen Isoformen des Stärke-Verzweigungsenzyms, welche für eine konservierte Aminosäure-Sequenz kodieren.
  • 5 zeigt die DNA-Sequenz (SEQ ID Nr. 14) und die vorhergesagte Aminosäure-Sequenz (SEQ ID Nr. 15) eines cDNA-Klons für SBE der Klasse A mit vollständiger Länge aus Kartoffel, welcher Klon durch PCR erhalten wurde.
  • 6 zeigt einen Vergleich des am besten konservierten Teils der Aminosäure-Sequenzen von SBE-Molekülen der Klasse A (obere Sequenz) und der Klasse B (untere Sequenz) aus Kartoffel.
  • 7 zeigt einen Vergleich der Aminosäure-Sequenz von SBE-Molekülen der Klasse A mit voller Länge aus Kartoffel (obere Sequenz) und aus Erbse (untere Sequenz).
  • 8 zeigt ein DNA-Alignment von verschiedenen SBE-Klonen der Klasse A mit vollständiger Länge aus Kartoffel, welche Klone von den Erfindern erhalten wurden.
  • 9 zeigt die DNA-Sequenz eines SBE-Klons der Klasse A aus Kartoffel, welche Sequenz durch direkte Sequenzierung der PCR-Produkte bestimmt wurde, zusammen mit der vorhergesagten Aminosäure-Sequenz.
  • 10 ist ein mehrfaches DNA-Alignment von verschiedenen SBE-Klonen der Klasse A mit vollständiger Länge aus Kartoffel, welche Klone von den Erfindern erhalten wurden.
  • 11 ist eine schematische Erläuterung des Plasmids pSJ64.
  • 12 zeigt die DNA-Sequenz und die vorhergesagte Aminosäure-Sequenz des SBE-Klons der Klasse A mit vollständiger Länge aus Kartoffel, wie sie in dem Plasmid pSJ90 vorliegt.
  • 13 zeigt das Profil einer viskoamylographischen Messung für 10 % (w/w) Suspensionen von Stärke aus verschiedenen transgenen Kartoffelpflanzen, die durch das Verfahren der Erfindung hergestellt wurden.
  • Beispiele
  • Beispiel 1: Klonierung von SBE der Klasse A aus Kartoffel
  • Die Strategie zur Klonierung der zweiten Form des Stärke-Verzweigungsenzyms aus Kartoffel ist in 3 gezeigt. Die kleine Pfeilspitze stellt die Primer dar, welche von den Erfindern in der PCR-Reaktion und den RACE-Protokollen verwendet wurden. Die ungefähre Größe der isolierten Fragmente wird durch die Werte auf der rechten Seite der Figur angegeben. Zum Zwecke der Erläuterung erlaubt ein Vergleich der Aminosäure-Sequenzen von einigen klonierten pflanzlichen Stärke-Verzweigungsenzymen (SBE) aus Mais (Klasse A), Erbse (Klasse A), Mais (Klasse B), Reis (Klasse B) und Kartoffel (Klasse B) sowie dem menschlichen Glykogen-Verzweigungsenzym den Erfindern, einen Bereich im ersten Drittel des Proteins, bezogen auf den Carboxy-Terminus, zu identifizieren, der nahezu vollständig konserviert ist (GYLNFMGNEFGHPEWIDFPR) (4a). Ein mehrfaches Alignment von DNA-Sequenzen (Mensch, Erbse Klasse A, Kartoffel Klasse B, Mais Klasse B, Mais Klasse A bzw. Reis Klasse B), welche diesem Bereich entsprechen, ist in der 4b gezeigt und wurde dazu verwendet, ein Oligonukleotid zu konstruieren, welches möglicherweise mit allen bekannten pflanzlichen Stärke-Verzweigungsenzymen hybridisieren würde: AAT TT(C/T) ATG GGI AA(C/T) GA(A/G) TT(C/T) GG (SEQ ID Nr. 20).
  • PCR-Bibliothek
  • Die anfängliche Isolierung eines unvollständigen cDNA-Klons für SBE der Klasse A aus Kartoffel erfolgte aus einer amplifizierten cDNA-Bibliothek aus einer Kartoffelknolle im λZap-Vektor (Stratagene). 0,5 μl einer cDNA-Bibliothek (cDNA-Bank) aus Kartoffel (Titer 2,3 × 109 pfu/ml) wurde als Templat in einer 50 μl Reaktion verwendet, die 100 pmol des 16-fach degenerierten POTSBE-Primers und 25 pmol des T7-Primers (der im λZap-Vektor am 3'-Ende in Bezug auf die cDNA-Sequenzen vorliegt – siehe 3), 100 μM dNTPs, 2,5 U Taq-Polymerase und den mit der Taq-Polymerase (Stragagene) gelieferten Puffer enthält. Alle Bestandteile, ausgenommen das Enzym, wurden in ein Mikrozentrifugen-Röhrchen für 0,5 ml gegeben, mit Mineralöl bedeckt und bei 94 °C für 7 Minuten inkubiert und anschließend bei 55 °C gehalten, während die Taq-Polymerase zugegeben und durch Pipettieren vermischt wurde. Die PCR-Reaktion wurde anschließend durch Inkubation für 1 Minute bei 94 °C, 1 Minute bei 58 °C und 3 Minuten bei 72 °C für 35 Zyklen durchgeführt. Die PCR-Produkte wurden mit Phenol und Chloroform extrahiert, mit Ethanol präzipitiert und erneut in TE-Puffer (pH 8,0) aufgenommen, ehe sie in den T/A-Klonierungsvektor pT7BlueR (Invitrogen) kloniert wurden.
  • Einige Fragmente zwischen 600 und 1300 bp wurden amplifiziert. Diese wurden aus einem Agarose-Gel isoliert und in den T/A-Klonierungsvektor pT7BlueR kloniert. Die Restriktionskartierung von 24 zufällig ausgewählten Klonen zeigte, dass sie zu mehreren verschiedenen Gruppen gehörten (auf der Grundlage der Größe und des Vorliegens bzw. des Fehlens von Restriktionsstellen). Anfänglich vier Klone wurden für die Sequenzierung ausgewählt. Es wurde gefunden, dass zwei von diesen vier Klonen der bekannten SBE-Sequenz der Klasse B aus Kartoffel entsprachen, dass jedoch die anderen beiden, obwohl sie homolog sind, erheblich abwichen und eine stärkere Ähnlichkeit mit der SBE-Sequenz der Klasse A aus Erbse aufwiesen, so dass der Schluss nahegelegt wird, dass sie zur Familie der Klasse A der Verzweigungsenzyme gehören (Burton et al., The Plant Journal, 1995, vorstehend zitiert). Die beiden letzteren Klone (ca. 800 bp) wurden vollständig sequenziert. Die beiden Klone enthielten am 5'-Ende jene Sequenz, die dem entarteten Oligonukleotid entspricht, das in der PCR-Reaktion verwendet wurde, und sie wiesen ein vorhergesagtes offenes Leseraster von 192 Aminosäuren auf. Die abgeleitete Aminosäure-Sequenz war in hohem Maße homolog zu jener des SBE der Klasse A aus Erbse.
  • Das aus der PCR stammende, ca. 800 bp große cDNA-Fragment (das den Nukleotiden 2281 bis 3076 der in 8 gezeigten psbe2con.seq entspricht) wurde als eine Sonde verwendet, um die cDNA-Bibliothek der Kartoffelknolle zu screenen. Von 180.000 Plaques wurden sieben positive bei einem ersten Screening erhalten. Die PCR-Analyse zeigte, dass fünf dieser Klone kleiner waren als der ursprüngliche, 800 bp große cDNA-Klon, so dass sie nicht weiter analysiert wurden. Die beiden anderen Klone (genannt 3.2.1 und 3.1.1) wiesen eine Länge von annähernd 1200 bzw. 1500 bp auf. Sie wurden beginnend von ihren 5'-Enden sequenziert, und die kombinierte Konsensus-Sequenz wurde mit der Sequenz abgeglichen, die aus den durch die PCR-Reaktion erzeugten Klonen erhalten wurde. Der cDNA-Klon 3.2.1 wurde aus dem Phagenvektor ausgeschnitten, und die Plasmid-DNA wurde isoliert, und das Insert wurde vollständig sequenziert. Einige Versuche, längere Klone aus der cDNA-Bibliothek zu erhalten, waren nicht erfolgreich, daher wurden diejenigen Klone, welche das 5'-Ende des Gens mit vollständiger Länge enthalten, durch die Verwendung von RACE (rapid amplification of cDNA ends; schnelle Vervielfältigung von cDNA-Enden) erhalten.
  • Schnelle Vervielfältigung von cDNA-Enden (RACE) und PCR-Bedingungen
  • Das RACE-Verfahren wurde im Wesentlichen nach Frohman (1992, Amplifications 11-15) durchgeführt. 2 μg Gesamt-RNA aus reifen Kartoffelknollen wurden auf für 5 Minuten auf 65 °C erhitzt und schnell auf Eis gekühlt. Die RNA wurde anschließend für 1 Stunde bei 37 °C in einer 20 μl Reaktion revers transkribiert, wobei BRL's M-MLV reverser Transkriptase und ein Puffer mit 1 mM DTT, 1 mM dNTPs, 1 U/μl RNAsin (Promega) und 500 pmol von zufälligen Hexameren (Pharmacia) als Primer verwendet wurden. Die überschüssigen Primer wurden mit einer Centricon 100 Säule entfernt, und die cDNA wurde wiedergewonnen und mit Isopropanol gefällt. Die cDNA wurde mit einem Adenin-Schwanz versehen, wobei 10 Einheiten terminaler Transferase (BRL), 200 μM dATP in einem Volumen von 20 μl für 10 Minunten bei 37 °C verwendet wurden, gefolgt von 5 Minuten bei 65 °C. Die Reaktion wurde anschließend auf 0,5 ml mit TE-Puffer (pH 8,0) verdünnt, und bei 4 °C als cDNA-Pool gelagert. Die cDNA-Klone wurden durch PCR-Amplifikation unter Verwendung der Primer RoRIdT17, Ro und POTSBE24 isoliert. Die PCR-Reaktion wurde in 50 μl unter Verwendung eines Heißstart-Verfahrens durchgeführt: 10 μl des cDNA-Pools wurden in Wasser mit 25 pmol POTSBE24, 25 pmol Ro und 2,5 pmol RoRIdT1 7 für 5 Minuten auf 94 °C erhitzt und auf 75 °C gekühlt. 5 μl von 10 × PCR-Puffer (Stratagene), 200 μM dNTPs und 1,25 Einheiten Taq-Polymerase wurden zugegeben, die Mischung wurde für 2 Minuten auf 45 °C erhitzt und für 40 Minuten auf 72 °C, gefolgt von 35 Zyklen bei 94 °C für 45 Sekunden, 50 °C für 25 Sekunden, und 72 °C für 1,5 Minuten, sowie einer abschließenden Inkubation bei 72 °C für 10 Minuten. Die PCR-Produkte wurden durch Elektrophorese auf einem niedrig schmelzenden Agarose-Gel mit 1 % getrennt, und die Schlieren von Fragmenten, die sich über den Bereich von 600 bis 800 bp erstrecken, wurden ausgeschnitten und in einer zweiten PCR-Amplifikation mit 25 pmol der Primer RI und POTSBE25 in einer 50 μl Reaktion (28 Zyklen bei 94 °C für 1 Minute, bei 50 °C für 1 Minute, und bei 72 °C für 2 Minuten) verwendet. Die Produkte wurden durch Chloroform-Extraktion gereinigt und in pT7 Blue kloniert. Die PCR-Reaktion wurde verwendet, um die Kolonien zu screenen, und die längsten Klone wurden sequenziert.
  • Die erste Runde des RACE-Verfahrens verlängerte die Länge der SBE-Sequenz um annähernd 100 Basen, daher wurde eine neue, mit einem Adenin-Schwanz versehene cDNA-Bibliothek konstruiert, wobei das für das SBE der Klasse A spezifische Oligonukleotid POTSBE24 (10 pmol) in einem Versuch verwendet wurde, um längere RACE-Produkte zu erlangen. Die erste und die zweite Runde der PCR-Reaktionen wurden unter Verwendung von neuen SBE-Primern der Klasse A (POTSBE 28 bzw. 29) durchgeführt, die sich von den neuen Sequenzdaten ableiten. Die Bedingungen waren wie vorher, mit der Ausnahme, dass der Verlängerungsschritt in der ersten PCR-Reaktion 3 Minuten betrug, und die zweite PCR-Reaktion aus 28 Zyklen bei 94 °C für 45 Sekunden, bei 55 °C für 25 Sekunden und bei 72 °C für 1 Minute 45 Sekunden bestand.
  • Die Klone, die in einer Größe von 400 bp bis 1,4 kbp lagen, wurden isoliert und sequenziert. Die vereinigte Sequenz der längsten RACE-Produkte und der cDNA-Klone sagten ein Gen mit vollständiger Länge von etwa 3.150 Nukleotiden voraus, wobei der Poly(Adenin)-Schwanz ausgenommen ist (psbe 2con.seq in 8).
  • Da die Sequenz der 5'-Hälfte des Gens aus der Sequenz von einigen RACE-Produkten erstellt wurde, die unter Verwendung von Taq-Polymerase erzeugt wurden, war es möglich, dass die erstellte Sequenz nicht jene Sequenz von einer einzelnen mRNA-Spezies darstellte, und/oder Veränderungen der Nukleotid-Sequenz aufwies. Die 1600 Basen am 5'-Ende des Gens wurden daher erneut durch PCR unter Verwendung von Ultra isoliert, einer thermostabilen DNA-Polymerase, welche eine geringere Fehlerrate im Vergleich zur Taq-Polymerase aufweist, da sie eine 3'-5'-Exonuklease-Aktivität besitzt. Einige PCR-Produkte wurden kloniert und bezüglich der Restriktion kartiert, und es wurde gefunden, dass sie sich in der Anzahl der HindIII-, SspI- und EcoRI-Schnittstellen unterscheiden. Diese Unterschiede stellen keine PCR Artefakte dar, wie sie in Klonen beobachtet wurden, die aus unabhängigen PCR-Reaktionen erhalten wurden (Daten nicht gezeigt), und weisen darauf hin, dass es einige Formen des SBE-Gens der Klasse A gibt, die in Kartoffelknollen transkribiert werden.
  • Um zu gewährleisten, dass die Sequenz des cNDA-Klons mit vollständiger Länge von einer einzelnen mRNA-Spezies abstammt, war es daher notwendig, das gesamte Gen in einem einzigen Stück in einer PCR-Reaktion zu erhalten. Die cDNA wurde gemäß dem RACE-Protokoll präpariert, mit der Ausnahme, dass das Adaptor-Oligonukleotid RoRIdT17 (5 pmol) als ein Primer verwendet wurde, und nach der Synthese wurde die Reaktion auf 200 μl mit TE-Puffer (pH 8) verdünnt und bei 4 °C gelagert. 2 μl der cDNA wurden in einer PCR-Reaktion von 50 μl eingesetzt, wobei 25 pmol der für SBE der Klasse A spezifischen Primer PBER1 und PBERT (siehe unten) eingesetzt wurden, und 30 Zyklen bei 94 °C für 1 Minute, bei 60 °C für 1 Minute und bei 72 °C für 3 Minuten durchgeführt wurden. Falls Taq-Polymerase verwendet wurde, wurden die PCR-Produkte in den Vektor pT7Blue kloniert, während die PCR-Produkte durch Chloroform-Extraktion und Fällung mit Ethanol gereinigt wurden, und in einem Volumen von 20 μl mit Kinase behandelt wurden (und anschließend in den Vektor pBSSK IIP kloniert wurden, der mit EcoRV geschnitten und dephosphoryliert wurde), wenn Ultma-Polymerase verwendet wurde. Mindestens vier Klassen von cDNA wurden isoliert, welche sich wiederum bezüglich des Vorliegens oder Fehlens der Schnittstellen für HindIII, SspI und EcoRI unterschieden. Drei von diesen Klonen wurden vollständig sequenziert, jedoch konnte ein Klon nicht in einer ausreichenden Menge isoliert werden, um ihn zu sequenzieren.
  • Die Sequenz von einem der Klone (Nummer 19) ist in 5 gezeigt. Das erste Methionin-Kodon (Startkodon) öffnet ein kurzes offenes Leseraster (open reading frame; ORF) von 7 Aminosäuren, das außerhalb des Rasters des nächsten vorhergesagten ORF von 882 Aminosäuren liegt, der ein Molekulargewicht (Mr) von annähernd 100 kDa aufweist.
  • Die Nukleotide 6 bis 2996 entsprechen der SBE-Sequenz; der Rest der gezeigten Sequenz stammt aus dem Vektor. 6 zeigt einen Vergleich des am höchsten konservierten Teils der Aminosäure-Sequenz von SBE der Klasse A aus Kartoffel (Reste 180 bis 871, obere Reihe) und von SBE der Klasse B aus Kartoffel (untere Reihe, Reste 98 bis 792); die mittlere Reihe weist auf den Grad der Ähnlichkeit hin, identische Reste sind durch einen gemeinsamen Buchstaben notiert, konservative Veränderungen durch zwei Punkte und neutrale Veränderungen durch einen einzelnen Punkt. Striche zeigen Lücken an, die eingeführt wurden, um das Alignment zu optimieren. Das SBE-Protein der Klasse A besitzt 44 % Identität über die gesamte Länge mit dem SBE der Klasse B aus Kartoffel, und 56 % Identität mit diesem in der zentralen konservierten Domäne (6), wie durch das „Megalign"-Programm (DNASTAR) abgeschätzt. Jedoch zeigt 7 einen Vergleich zwischen SBE der Klasse A aus Kartoffel (obere Reihe, Reste 1 bis 873) und SBE der Klasse A aus Erbse (untere Reihe, Reste 1 bis 861), aus der man beobachten kann, dass das klonierte Kartoffel-Gen stärker homolog zum Erbsen-Enzym der Klasse A ist, wo die Identität 70 % über nahezu die gesamte Länge beträgt, und die Ähnlichkeit nimmt auf 83 % über den zentralen konservierten Bereich zu (beginnend bei IPPP, ungefähr an Position 170). Es wird aus dieser Analyse deutlich, dass dieses klonierte SBE-Gen aus Kartoffel zur Familie der Klasse A der SBE-Gene gehört.
  • Eine Kultur von E. coli, die das Plasmid pSJ78 enthält (welches die Expression eines SBE-Gens der Klasse A mit vollständiger Länge aus Kartoffel steuert), wurde am 3. Januar 1996 gemäß den Vorschriften des Budapester Vertrages unter der Zugangsnummer NCIMB 40781 hinterlegt bei: The National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited (23 St. Machar Drive, Aberdeen, AB2 1RY, Vereinigtes Königreich). Das Plasmid pSJ78 ist dem vorstehend beschriebenen Klon 19 äquivalent. Es stellt eine cDNA des SBE-Gens der Klasse A mit vollständiger Länge dar, das mit glatten Enden in den Vektor pBSSKIIP ligiert wurde.
  • Polymorphismus von SBE-Genen der Klasse A
  • Die Sequenzanalyse der beiden anderen SBE-Gene der Klasse A mit vollständiger Länge zeigten, dass sie Leseraster-Verschiebungen enthalten, und daher nicht in der Lage sind, für Proteine mit vollständiger Länge zu kodieren, und in der Tat waren sie nicht in der Lage, das Fehlen des Verzweigungs-Enzyms in der KV 832-Mutante (nachstehend beschrieben) zu komplementieren. Ein Alignment der DNA-Sequenzen mit vollständiger Länge ist in 8 gezeigt: „10con.seq" (SEQ ID Nr. 12), „19con.seq" (SEQ ID Nr. 14) und „11con.seq" (SEQ ID Nr. 13) stellen die Sequenz der Klone 10, 19 und 11 mit vollständiger Länge dar, die durch PCR-Reaktion unter Verwendung der Primer PBER1 und PBERT (siehe nachstehend) erhalten wurden, während „psbe2con.seq" (SEQ ID Nr. 18) die Konsensus-Sequenz der RACE-Klone und des cDNA-Klons 3.2.1 darstellt. Jene Nukleotide, die sich von der gesamten Konsensus-Sequenz unterscheiden (nicht gezeigt) sind schattiert. Striche zeigen Lücken an, die eingefügt wurden, um das Alignment zu optimieren. Abgesehen von den Leseraster-Verschiebungen sind diese Klone in hohem Maße homolog. Es sollte angemerkt werden, dass die 5'-Sequenz von psbe2con länger ist, da diese das längste RACE-Produkt darstellt und ebenso einige Veränderungen enthält, im Vergleich mit den anderen Klonen. Das stromaufwärts gelegene Methionin-Kodon liegt nach wie vor in diesem Klon vor, jedoch ist das stromaufwärts gelegene offene Leseraster auf gerade 3 Aminosäuren verkürzt, und darüber hinaus gibt es eine Deletion von 10 Basen in dem 5'-untranslatierten Leader-Bereich.
  • Der andere signifikante Bereich der Variation liegt im carboxy-terminalen Bereich des Protein-kodierenden Bereichs. Eine genauere Untersuchung dieses Bereichs ergibt eine wiederholte Struktur von GAA-Trinukleotiden, die sich bezüglich der Länge innerhalb der vier Klone unterscheiden. Diese sind typische Eigenschaften eines Wiederholungsbereichs eines Mikrosatelliten. Der am meisten abweichende Klon ist Nr. 11, der lediglich ein GAA-Trielet aufweist, während Klon 19 elf vollständige Wiederholungen aufweist, und die anderen beiden Klone fünf bzw. sieben GAA-Wiederholungen aufweisen. Alle diese Deletionen behalten das offene Leseraster bei, verändern jedoch die Anzahl der Glutaminsäure-Reste am Carboxy-Terminus des Proteins.
  • Die meisten der anderen Unterschiede zwischen den Klonen sind Veränderungen einzelner Basen. Es ist gut möglich, das manche von ihnen PCR-Fehler darstellen. Um diese Frage zu behandeln, wurde eine direkte Sequenzierung der PCR-Fragmente durchgeführt, die aus dem ersten Strang der cDNA amplifiziert wurden. 9 zeigt die DNA-Sequenz und die vorhergesagte Aminosäure-Sequenz, die durch eine solche direkte Sequenzierung erhalten wurde. Bestimmte Restriktionsschnittstellen sind ebenso gekennzeichnet. Nukleotide, die nicht eindeutig zugeordnet werden konnten, sind unter Verwendung der standardmäßigen IUPAC-Notation angegeben, und falls diese Unsicherheit die vorhergesagte Aminosäure-Sequenz beeinträchtigt, wird ein Fragezeichen verwendet. Die Sequenz an den äußersten 5'- und 3'-Enden des Gens konnte aufgrund der Heterogenität nicht bestimmt werden, die in den verschiedenen klonierten Genen in diesen Bereichen beobachtet wurde (siehe vorhergehender Absatz). Jedoch kann dieser Umstand als ein unmittelbarer Hinweis dafür betrachtet werden, dass diese Unterschiede wirklich existieren und keine Artefakte der PCR oder der Klonierung darstellen.
  • Es gibt absolut keinen Beweis für die Leseraster-Verschiebungen in der aus der PCR-Reaktion stammenden Sequenz, und es würde den Anschein erwecken, dass diese Mutationen ein Artefakt des Klonierungsverfahrens darstellen, welche Mutationen sich aus einem negativen Selektionsdruck in E. coli ergeben. Diese These wird durch die Tatsache gestützt, dass es sich als äußerst schwierig erwiesen hat, die PCR-Produkte mit vollständiger Länge im intakten Zustand zu klonieren, da viele große Deletionen beobachtet wurden und die erhaltenen Klone mit vollständiger Länge alle in einer Orientierung (vom LacZ-Promotor weg) kloniert wurden, was vielleicht den Schluss nahelegt, dass die Expression des Gens toxisch für die Zellen ist. Schwierigkeiten dieser Art können zumindest teilweise für das vorhergehende Scheitern anderer Forscher verantwortlich gewesen sein, um die vorliegende Erfindung zu machen.
  • Ein Vergleich von allen Sequenzen mit vollständiger Länge ist in 10 gezeigt. Über die Klone 10, 11 und 19 hinaus sind die Sequenzen eines BglII-XhoI-Produkts, das unmittelbar in den QE32-Expressionsvektor („86con.seq", SEQ ID Nr. 16) kloniert wurde, sowie die Konsensus-Sequenz der unmittelbar sequenzierten PCR-Produkte („persbe2con.seq", SEQ ID Nr. 17) gezeigt. Jene Nukleotide, die sich von der Konsensus-Sequenz (nicht gezeigt) unterscheiden, sind schattiert. Striche weisen auf Lücken hin, die eingefügt wurden, um das Alignment zu optimieren. Es gibt 11 unterschiedliche Nukleotide, deren Vorliegen in der mRNA-Population vorausgesagt wurde und die durch Sternchen oberhalb und unterhalb der Sequenz gekennzeichnet sind. Die anderen Unterschiede sind vermutlich PCR-Artefakte oder möglicherweise Sequenzierfehler.
  • Komplementation einer E. coli Mutante, der das Verzweigungsenzym fehlt Um zu bestimmen, ob das isolierte SBE-Gen für ein aktives Protein kodiert, das heißt für eines, das die Aktivität eines Verzweigungsenzyms aufweist, wurde ein Komplementations-Test in dem E. coli Stamm KV 832 durchgeführt. Dieser Stamm ist unfähig, bakterielles Glycogen herzustellen, da das Gen für das Glycogen-Verzweigungsenzym deletiert wurde (Keil et al., Mol. Gen. Genet. 207, 294-301, 1987). Wenn Wildtyp-Zellen in Gegenwart von Glucose gezüchtet werden, synthetisieren sie Glycogen (ein hochgradig verzweigtes Glucose-Polymer), welches einen braunen Farbstoff mit Iod ergibt, während die KV 832 Zellen lediglich ein Glucose-Polymer in Form einer linearen Kette herstellen, welches Polymer mit Iod eine bläulich-grüne Farbe ergibt. Um zu bestimmen, ob das klonierte SBE-Gen die Fähigkeit der KV 832 Zellen, ein verzweigtes Polymer herzustellen, wiederherstellen kann, wurde der Klon pSJ90 (SEQ ID Nr. 19) verwendet, und wie nachstehend konstruiert. Das Konstrukt ist ein Fragment, das aus der PCR-Reaktion stammt und im Wesentlichen bezüglich der Länge vollständig ist (und das unter Verwendung der Primer PBE 26 und PBE 2X hergestellt wurde, die in Einzelheiten nachfolgend angegeben sind), welches Fragment mit BglII und XhoI geschnitten und in die BamHI/SalI-Schnittstellen des Expressionsvektors pQE32 mit einem His-Tag (Qiagen) kloniert wurde. Dieser Klon pSJ86 wurde sequenziert, und es wurde gefunden, dass er eine Leseraster-Verschiebung von zwei Basen in der 5'-Hälfte des Gens aufweist. Diese Verschiebung des Leserasters wurde durch Verdau mit NsiI und SnaBI beseitigt und durch das entsprechende Fragment aus dem Taq-generierten PCR-Klon ersetzt, um das Plasmid pSJ90 herzustellen (die Sequenz ist in 12 gezeigt; die ersten 10 Aminosäuren stammen aus dem Expressionsvektor). Das durch pSJ90 kodierte Polypeptid würde der Voraussage nach den Aminosäuren 46 bis 882 der für SBE kodierenden Sequenz mit vollständiger Länge entsprechen. Das Konstrukt pSJ90 wurde in die KV 832 Zellen transformiert, denen das Verzweigungsenzym fehlt, und die Transformanten wurden auf festem PYG-Medium gezüchtet (0,85 % KH2PO4, 1,1 % K2HPO4, 0,6 % Hefeextrakt), das 1,0 % Glucose enthielt. Um einen Test in Bezug auf die Komplementation durchzuführen, wurde eine Öse voller Zellen abgekratzt und in 150 μl Wasser suspendiert, zudem 15 μl Lugol'sche Lösung (2 g KI und 1 g I2 pro 300 ml Wasser) gegeben wurden. Es wurde gefunden, dass die mit dem SBE-Fragment aus Kartoffel transformierten KV 832 Zellen nunmehr eine gelb-braune Farbe mit Iod ergaben, während die Kontrollzellen, die lediglich den Vektor pQE32 enthielten, weiterhin eine blau-grüne Farbe zeigten.
  • Expression von SBE der Klasse A aus Kartoffel in E. coli Einzelne Kolonien von KV 832, die eines der Plasmide pQE32, pAGCR1 oder pSJ90 enthielten, wurden in 50 ml 2 × YT-Medium, das Carbenicillin, Kanamycin und Streptomycin in geeigneten Mengen (100, 50 bzw. 25 mg/l) enthielt und das sich in einem 250 ml Gefäß befand, überimpft und für 5 Stunden unter Schütteln bei 37 °C kultiviert. Die Substanz IPTG wurde anschließend auf eine Endkonzentration von 1 mM zugegeben, um die Expression auszulösen, und die Gefäße wurden darüber hinaus über Nacht bei 25 °C inkubiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet und in 50 mM Natriumphosphat-Puffer (pH 8,0) suspendiert, der 300 mM NaCl, 1 mg/ml Lysozym und 1 mM PMSF enthielt, und auf Eis für 1 Stunde belassen. Die Zelllysate wurden anschließend mit Ultraschall behandelt (3 Pulse von 10 Sekunden bei 40 % Leistung unter Verwendung einer Mikrosonde) und durch Zentrifugation bei 12.000 g für 10 Minuten bei 4 °C geklärt. Die klaren Zelllysate wurden annähernd auf das 10-fache mit einer Filtrationseinheit Centricon 30 konzentriert. Doppelte Proben von 10 μl des erhaltenen Extraktes wurden in einem Assay für die Bestimmung der SBE-Aktivität durch das Stimulations-Verfahren bezüglich der Phosphorylierung bestimmt, wie in der Internationalen Patentveröffentlichung Nr. PCT/GB 95/00 634 beschrieben. Kurz gesagt war die Reaktionsmischung (0,2 ml) für den Standardassay ein Puffer aus 200 mM 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure (MES), pH 6,5, der 100 nCi 14C-Glucose-1-phosphat bei einer Konzentration von 50 mM, 0,05 mg Phosphorylase A aus Kaninchen, und Lysat aus E. coli enthielt. Die Reaktionsmischung wurde für 60 Minuten bei 30 °C inkubiert, die Reaktion wurde beendet, und durch die Zugabe von 1 ml 75 % (v/v) Methanol, 1 (w/v) Kaliumhydroxid und anschließend von 0,1 ml Glycogen (10 mg/ml) wurde die Reaktion beendet und das Glucan-Polymer ausgefällt. Die Ergebnisse sind nachfolgend gezeigt:
    Konstrukt SBE-Aktivität (Zerfälle/Min.; cpm)
    pQE32 (Kontrolle) 1.829
    pSJ90 (SBE der Klasse A aus Kartoffel) 14.327
    pAGCR1 (SBE der Klasse A aus Erbse) 29.707
  • Die SBE-Aktivität der Klasse A aus Kartoffel beträgt das 7-8-fache im Vergleich zum Niveau des Hintergrunds. Es wurde daher der Schluss daraus gezogen, dass das SBE-Gen der Klasse A aus Kartoffel in der Lage war, die BE-Mutation im Stimulierungs-Assay bezüglich der Phosphorylierung zu komplementieren, und dass das klonierte Gen in der Tat für ein Protein mit einer verzweigenden Enzymaktivität kodiert.
  • Oligonukleotide
  • Die folgenden synthetischen Oligonukleotide (SEQ ID Nr. 1-11) wurden verwendet:
    RoRIdT17 MG GAT CCG TCG ACA TCG ATA ATA CGA CTC ACT ATA GGG A(T)17
    Ro MG GAT CCG TCG ACA TC
    RI GAC ATC GAT MT ACG AC
    POTSBE24 CAT CCA ACC ACC ATC TCG CA
    POTSBE25 TTG AGA GAA GAT ACC TAA GT
    POTSBE28 ATG TTC AGT CCA TCT AM GT
    POTSBE29 AGA ACA ACA ATT CCT AGC PC
    PBER1 GGG GCC TTG AAC TCA GCA AT
    PBERT CGT CCC AGC ATT CGA CAT AA
    PBE2B CTT GGA TCC TTG AAC TCA GCA ATT TG
    PBE2X TAA CTC GAG CM CGC GAT CAC MG TTC GT
  • Beispiel 2: Herstellung transgener Pflanzen
  • Konstruktion von Vektoren zur Pflanzen-Transformation mit Antisens-Genen des Stärke-Verzweigungsenzyms
  • Ein 1200 bp SacI-XhoI-Fragment, das annähernd für die carboxyterminale Hälfte des Stärke-Verzweigungsenzyms der Klasse A aus Kartoffeln kodiert (das aus dem geretteten λZap-Klon 3.2.1 isoliert wurde), wurde in die Schnittstellen SacI-SalI des Vektors pSJ29 für die Pflanzen-Transformation kloniert, um das Plasmid pSJ64 zu erzeugen, das schematisch in 11 erläutert ist. In der Figur stellt die schwarze Linie die DNA-Sequenz dar. Die unterbrochene Linie stellt das bakterielle Plasmid-Rückgrat dar (welches den Replikationsursprung und einen bakteriellen Selektionsmarker enthält), welches Plasmid-Rückgrat nicht vollständig gezeigt ist. Die ausgefüllten Dreiecke auf der Linie bezeichnen die T-DNA-Grenzen (RB = rechte Grenze, LB = linke Grenze). Die relevanten Restriktionsschnittstellen sind oberhalb der schwarzen Linie gezeigt, wobei die ungefähren Abstände (in Kilobasen) zwischen den Schnittstellen (die durch einen Stern gekennzeichnet sind), durch die Zahlenwerte unterhalb der Linie angegeben sind. Die dünnsten Pfeile zeigen Polyadenylierungs-Signale an (pAnos = Nopalin-Synthase, pAg7 = Agrobacterium-Gen 7), die Pfeile mit mittlerer Dicke bezeichnen die proteinkodierenden Bereiche (SBE II = Stärkeverzweigungsenzym der Klasse A aus Kartoffel, HYG = Hygromycin-Resistenzgen) und die dicksten Pfeile bezeichnen die Promotor-Bereiche (P-2x35 = ein doppelter CaMV 35S-Promotor, Pnos = Nopalin-Synthase-Promotor). Somit enthielt der Vektor pSJ64 das Genfragment des Stärke-Verzweigungsenzyms der Klasse A in einer Antisens-Orientierung zwischen dem 2x35S CaMV-Promotor und dem Polyadenylierungs-Signal der Nopalin-Synthase.
  • Der Information halber sei angemerkt, dass der Vektor pSJ29 ein Derivat des binären Vektors pGPTV-HYG (Becker et al., Plant Mol. Biol. 20, 1195-1197, 1992) darstellt, der wie folgt modifiziert wurde: ein annähernd 750 bp großes Fragment (SacI, mit T4-DNA-Polymerase stumpf gemachte SalI-Schnittstelle) des Vektors pJIT60 (Guerineau et al., Plant Mol. Biol. 18, 815-818, 1992), der den doppelten 35S-Promotor aus dem Blumenkohl-Mosaikvirus (CaMV) enthält, (Cabb-JI-Stamm, äquivalent den Nukleotiden 7040 bis 7376, verdoppelt stromaufwärts von 7040 bis 7433, Frank et al., Cell 21, 285-294, 1980), der in die Schnittstellen HindIII (mit Klenow-Polymerase repariert) und SalI des Vektors pGPTV-HYG kloniert wurde, um den Vektor pSJ29 zu erzeugen.
  • Pflanzen-Transformation
  • Die Transformation wurde mit zwei Arten von Auspflanzungen einer Kartoffelpflanze durchgeführt; entweder mit nicht-transformierten Miniknollen des Wildtyps (um einzelne Transformanten zu erhalten, die allein das Antisens-Konstrukt der Klasse A enthalten) oder Miniknollen aus drei Zellkulturlinien (die zu den Pflanzen Nr. 12, 15, 17 und 18 führten, die in Tabelle 1 angegeben sind), welche bereits erfolgreich mit dem Antisens-Konstrukt der Klasse B (SBE I) transformiert wurden, das den Tandem-35S-Promotor enthielt (um damit doppelt transformierte Pflanzen zu erhalten, die Antisens-Sequenzen sowohl für das Enzym der Klasse B als auch für das Enzym der Klasse A enthalten).
  • Die Einzelheiten des Verfahrens der Transformation mittels Agrobacterium und das Wachstum der transformierten Pflanzen sind in der Internationalen Patentanmeldung Nr. WO 95/26 407 beschrieben, mit der Ausnahme, dass das verwendete Medium 3 Saccharose (nicht 1 %) bis zum abschließenden Transfer enthielt, und dass die anfängliche Inkubation mit Agrobacterium (Stamm 3850) in der Dunkelheit durchgeführt wurde. Die Transformanten, welche die Antisens-Sequenz der Klasse A enthielten, wurden durch Wachstum in einem Medium selektiert, das 15 mg/l Hygromycin enthielt (das Antisens-Konstrukt der Klasse A umfasste das HYG-Gen, das heißt Hygromycin-Phosphotransferase).
  • Die Transformation wurde in allen Fällen durch die Erzeugung eines DNA-Fragments aus dem Antisens-Gen nach der PCR-Reaktion in Gegenwart von geeigneten Primern und einem Rohextrakt von genomischer DNA aus jedem regenerierten Transformationsansatz (shoot) bestätigt.
  • Charakterisierung der Stärke aus Kartoffelpflanzen
  • Die Stärke wurde aus den Pflanzen wie folgt extrahiert: Kartoffelknollen wurden in Wasser für 2 Minuten in einem „Waring"-Mischer homogenisiert, der bei hoher Geschwindigkeit arbeitete. Das Homogenat wurde gewaschen und filtriert (zuerst durch 2 mm Filter, anschließend durch 1 mm Filter), wobei etwa 4 Liter Wasser pro 100 g Knollen (6 Extraktionen) verwendet wurden. Die gewaschenen Stärkekörner wurden schließlich mit Aceton extrahiert und an der Luft getrocknet.
  • Die Stärke, welche aus den jeweils einzeln transformierten Kartoffelpflanzen (Klasse A/SBE II Antisens, oder Klasse B/SBE I Antisens), oder aus den doppelt transformierten Pflanzen (Klasse A/SBE II und Klasse B/SBE I Antisens), oder aus den nicht-transformierten Kontrollpflanzen extrahiert wurde, wurde zum Teil charakterisiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Die Tabelle zeigt die Menge der SBE-Aktivität (Einheiten/g Gewebe) in den Knollen aus jeder transformierten Pflanze. Der endotherme Spitzenwert der Temperatur (°C) von einer Stärke, die aus einigen Pflanzen extrahiert wurde, wurde durch Differential-Scanning-Kalorimetrie bestimmt, und die Temperatur (°C) bei der die Teigbildung einsetzte, wurde durch Bezugnahme auf die Viskoamylographie (reference to viscoamylography; „RVA") bestimmt, wie es in der internationalen Anmeldung WO 95/26 407 beschrieben ist. Das Viskoamylographie-Profil war wie folgt: Schritt 1-50 °C für 2 Minuten; Schritt 2 – Zunahme der Temperatur von 50 °C auf 95 °C bei einer Geschwindigkeit von 1,5 °C pro Minute; Schritt 3 – Halten der Temperatur von 95 °C für 15 Minuten; Schritt 4 – Kühlen von 95 °C auf 50 °C bei einer Geschwindigkeit von 1,5 °C pro Minute; und schließlich Schritt 5 – Halten der Temperatur von 50 °C für 15 Minuten. Die Tabelle 1 zeigt die Viskosität in Bezug auf den Spitzenwert, den Wert beim Einsetzen der Teigbildung und den Wert der Rückstellung in Drehzahleinheiten (stirring number units, SNUs), die ein Maß für die Menge des Drehmomentes darstellen, das erforderlich ist, um die Suspensionen zu rühren. Der Spitzenwert der Viskosität kann für die vorliegenden Zwecke als die maximale Viskosität definiert werden, die während der Heizphase (Schritt 2) oder während der Temperatur-Haltephase (Schritt 3) in der Viskoamylographie erreicht wird. Die Viskosität beim Einsetzen der Teigbildung kann als diejenige Viskosität definiert werden, die von den Stärke-Suspensionen am Ende der Temperatur-Haltephase (Schritt 3) in der Viskoamylographie erreicht wird. Der Rückstellwert der Viskosität kann als diejenige Viskosität der Stärke-Suspension am Ende von Schritt 5 der Viskoamylographie definiert werden.
  • Eine Bestimmung des scheinbaren Amylose-Gehalts (%, w/w) wurde ebenso durchgeführt, wobei ein indometrisches Assay-Verfahren von Morrison & Laignelet (3. Cereal Sci. 1, 9-20, 1983) verwendet wurde. Die Ergebnisse (Prozentwert des scheinbaren Amylose-Gehalts) sind in Tabelle 1 gezeigt. Die nicht-transformierten und transformierten Kontroll-Pflanzen führten zu Stärken mit scheinbaren Amylose-Gehalten im Bereich von 29 ± 3%.
  • Im Allgemeinen wurden ähnliche Werte eines Amylose-Gehaltes für Stärken erhalten, die meistens aus einzeln transformierten Pflanzen extrahiert wurden, welche die Antisens-Sequenz der Klasse A (SBE II) enthielten. Jedoch führten manche Pflanzen (Nr. 152, 249) zu Stärken mit einem scheinbaren Amylose-Gehalt von 37-38 %, der bemerkenswert höher als der Kontrollwert liegt. Die Stärke, die aus diesen Pflanzen extrahiert wurde, besaß merklich erhöhte Temperaturen in Bezug auf das Einsetzen der Teigbildung, und die Stärke aus der Pflanze 152 zeigte ebenso eine erhöhte endotherme Spitzentemperatur (die Stärke aus der Pflanze 249 wurde nicht durch Differential-Scanning-Kalorimetrie geprüft).
  • Figure 00330001
  • Es sollte angemerkt werden, dass, auch wenn andere einzeln transformierte Pflanzen keine Stärke mit einem veränderten Verhältnis von Amylose zu Amylopectin lieferten, die Stärke aus solchen Pflanzen dennoch unterschiedliche Eigenschaften in Bezug auf die Stärke von herkömmlichen Pflanzen aufweisen kann (zum Beispiel ein unterschiedliches durchschnittliches Molekulargewicht oder unterschiedliche Amylopectin-Verzweigungsmuster), die nützlich sein können.
  • Doppelt transformierte Pflanzen, die Antisens-Sequenzen sowohl für das Enzym der Klasse A als auch für das Enzym der Klasse B enthielten, wiesen eine in hohem Maß herabgesetzte SBE-Aktivität (Einheiten/g) auf, im Vergleich mit nicht-transformierten Pflanzen oder einzeln transformierten Pflanzen, die lediglich das Antisens-Konstrukt der Klasse A enthielten (wie in Tabelle 1 gezeigt ist). Darüber hinaus enthielten bestimmte doppelt transformierte Pflanzen eine Stärke, die Eigenschaften aufwies, welche in sehr erheblicher Weise verändert waren. Zum Beispiel wiesen die Stärken, die aus den Pflanzen Nr. 201, 202, 208, 208 a, 236 und 236 a extrahiert wurden, erheblich veränderte Verhältnisse von Amylose zu Amylopectin auf, bis zu dem Ausmaß, dass Amylose der Hauptbestandteil der Stärke in diesen Pflanzen war. Die Temperaturen des Einsetzens der Teigbildung der Stärke aus diesen Pflanzen nahm ebenso am meisten zu (um etwa 25-30 °C). Die Stärke aus den Pflanzen, wie zum Beispiel von Nr. 150, 161, 212, 220 und 230 a, stellte einen Bereich von dazwischen liegenden Produkten dar, in dem Sinn, dass solche Stärken einen weitaus gemäßigteren Anstieg sowohl bezüglich des Amylose-Gehaltes als auch bezüglich der Temperatur des Einsetzens der Teigbildung aufwiesen. Die Ergebnisse würden den Schluss nahe legen, dass es im Allgemeinen eine wechselseitige Beziehung zwischen dem prozentualen Amylosegehalt und der Temperatur des Einsetzens der Teigbildung gibt, die sich in Übereinstimmung mit dem bekannten Verhalten der Stärken aus anderen Quellen, insbesondere aus Mais, befindet.
  • Die merkliche Zunahme des Amylose-Gehaltes, die ausschließlich durch Hemmung von SBE der Klasse A erhalten wurde, im Vergleich mit der ausschließlichen Hemmung von SBE der Klasse B (siehe PCT/GB 95/00 634 ) könnte den Schluss nahe legen, dass es vorteilhaft sein würde, die Pflanzen zunächst mit einem Konstrukt zu transformieren, um die SBE-Expression der Klasse A zu unterdrücken (wahrscheinlich in der Praxis mit einem Antisens-Konstrukt), und solche Pflanzen zu selektieren, welche zu Stärken mit den am meisten veränderten Eigenschaften führen, und anschließend erneut mit einem Konstrukt zu transformieren, um die SBE-Expression der Klasse B zu unterdrücken (wiederum in der Praxis wahrscheinlich mit einem Antisens-Konstrukt), um damit das Ausmaß der Veränderung der Stärke zu maximieren.
  • Über die Temperaturen des Einsetzens der Teigbildung hinaus zeigten andere Merkmale des Viskoamylographie-Profils, zum Beispiel für Stärken aus den Pflanzen Nr. 149, 150, 152, 161, 201, 236 und 236 a, erhebliche Unterschiede im Vergleich mit Stärken aus Kontrollpflanzen, wie es in 13 erläutert ist. Unter Bezugnahme auf 13 ist eine Anzahl von Viskoamylographie-Läufen gezeigt. Die Legende ist wie folgt: schattiertes Quadrat – normale Kartoffelstärke zur Kontrolle (29,8 % Amylose-Gehalt); schattierter Kreis – Stärke aus der Pflanze 149 (35,6 % Amylose-Gehalt); schattiertes Dreieck, Spitze nach oben – Pflanze 152 (37,5 %); schattiertes Dreieck, Spitze nach unten – Pflanze 161 (40,9 %); schattierte Raute – Pflanze 150 (53,1 %); freies Quadrat – Pflanze 236 a (56,7 %); freier Kreis – Pflanze 236 (60,4 %); freies Dreieck, Spitze nach oben – Pflanze 201 (66,4 %); freies Dreieck, Spitze nach unten – Stärke Hylon V aus Mais (44,9 % Amylose). Die dünne Linie bezeichnet das Heizprofil.
  • Mit zunehmendem Amylose-Gehalt nehmen die Spitzenwerte der Viskositäten während der Verarbeitung bei 95 °C ab, und das Abfallen bezüglich der Viskosität vom Spitzenwert bis zum Ende der Temperatur-Haltezeit bei 95 °C nimmt ebenso im Allgemeinen ab (tatsächlich gibt es für manche der Stärke-Proben einen Anstieg in der Viskosität in diesem Zeitraum). Beide Ergebnisse sind ein Hinweis auf eine verminderte Körner-Fragmentierung und daher für eine zunehmende Körner-Stabilität während der Teigbildung. Diese Eigenschaft war ohne ausgiebige vorherige chemische oder physikalische Modifikation bei Kartoffelstärke bisher nicht verfügbar. Für Anwendungen, bei denen eine maximale Viskosität nach der Verarbeitung bei 95 °C wünschenswert ist (das heißt entsprechend der Viskosität nach 47 Minuten im Viskoamylographie-Test), würde die Stärke aus der Pflanze Nr. 152 ausgewählt werden, da Stärken sowohl mit einem geringeren (Kontrollen, Nr. 149) als auch mit einem höheren (Nr. 161, Nr. 150) Amylose-Gehalt geringere Viskositäten aufweisen, wenn man dieser Gelatinierungs- und Teigbildungs-Verfahrensvorschrift (13 und Tabelle 1) folgt. Man glaubt, dass die Viskosität in diesem Stadium durch eine Kombination des Ausmaßes der Körnerquellung und der Beständigkeit der gequollenen Körner gegenüber einer mechanischen Fragmentierung bestimmt wird. Für ein beliebiges gewünschtes Viskositätsverhalten würde ein Fach mann eine Kartoffelstärke aus einem Bereich auswählen, der unterschiedliche Amylosegehalte enthält, die entsprechend der Erfindung durch Ausführung geeigneter standardmäßiger Viskositäts-Tests hergestellt wurden.
  • Bei der Kühlung der Teige von 95 °C auf 50 °C zeigten die Kartoffelstärken aus den meisten Pflanzen, die in Übereinstimmung mit der Erfindung transformiert wurden, eine Zunahme der Viskosität in der Viskoamylographie, wie sie für eine teilweise Reassoziation der Amylose erwartet wird. Die Stärken aus den Pflanzen Nr. 149, 152 und 161 zeigten alle Viskositäten bei 50 °C, die in erheblicher Weise über jenen der Stärken aus Kontrollpflanzen lagen (13 und Tabelle 1). Diese Tatsache steht im Gegensatz mit der Wirkung von erhöhten Amylose-Gehalten in Stärken aus Maispflanzen (2), welche sehr geringe Viskositäten während des gesamten Viskoamylographie-Tests zeigen. Von besonderem Interesse ist die Tatsache, dass bei ähnlichen Amylose-Gehalten die Stärke aus der Kartoffelpflanze 150 (53 % Amylose) eine merklich erhöhte Viskosität zeigt, im Vergleich mit der Stärke Hylon 5 (44,9 % Amylose), wie es in 13 erläutert ist. Dieser Umstand zeigt, dass nützliche Eigenschaften, welche erhöhte (35 % oder mehr) Amylose-Gehalte erfordern, durch Verarbeitung von Stärken aus Kartoffelpflanzen unterhalb von 100 °C erhalten werden können, während eine stärker energieintensive Verarbeitung erforderlich ist, um ähnlich nützliche Eigenschaften aus Stärken mit hohem Amylose-Gehalt zu erhalten, die aus Maispflanzen stammen.
  • Die Viskosität am Ende des Viskoamylographie-Tests (Rückstellwert der Viskosität nach 92 Minuten) ist unter den getesteten Stärken (13 und Tabelle 1) am größten für die Stärke aus der Pflanze Nr. 161 (40,9 % Amylose). Abnehmende Viskositäten am Ende werden erhalten für Stärken aus den Pflanzen Nr. 152 (37,5 % Amylose), Nr. 149 (35,6 Amylose) und Nr. 150 (53,1 % Amylose). Die Rücksteil-Viskosität tritt auf, wenn Amylose-Moleküle, die aus dem Stärkekorn während der Teigbildung austreten, außerhalb des Korns zu reassoziieren beginnen und eine viskose gel-ähnliche Substanz bilden. Man glaubt, dass die Werte für die Rücksteil-Viskosität von Stärken aus transgenen Kartoffelpflanzen ein Gleichgewicht zwischen dem inhärenten Amylose-Gehalt der Stärken und der Fähigkeit der Amylose-Fraktion darstellen, während der Teigbildung aus dem Korn auszutreten und daher für den Reassoziations-Prozess verfügbar zu sein, welcher zu einer Zunahme der Viskosität führt. Für Stärken mit einem niedrigen Amylose-Gehalt neigt eine Steigerung des Amylose-Gehalts dazu, mehr Amylose für die Reasso ziation verfügbar zu machen und somit die Rücksteil-Viskosität zu erhöhen. Man glaubt jedoch, dass ein erhöhter Amylose-Gehalt oberhalb eines Schwellenwerts das Quellen der Körner hemmt, und somit das Austreten von Amylose aus dem Stärkekorn verhindert und die für die Reassoziation verfügbare Menge der Amylose herabsetzt. Diese Auffassung wird unterstützt durch die RVA-Ergebnisse, die für Kartoffelstärken mit einem sehr hohen Amylose-Gehalt erhalten wurden und in den Viskoamylographie-Profilen in 13 dargestellt sind. Für ein beliebiges gewünschtes Viskositätsverhalten, das auf die Rückstellung oder Retrogradation auf eine beliebige gewünschte Temperatur über einen beliebigen gewünschten Zeitraum folgt, würde ein Fachmann eine Kartoffelstärke aus einem Bereich auswählen, der unterschiedliche Amylose-Gehalte enthält, die entsprechend der Erfindung durch Ausführung von standardmäßigen Viskositäts-Tests hergestellt wurden.
  • Weitere Experimente mit Stärken aus den Pflanzen Nr. 201 und 208 zeigten, dass diese einen scheinbaren Amylose-Gehalt von mehr als 62 % hatten (siehe Tabelle 1). Die Viskoamylographie-Studien zeigten, dass die Stärke aus diesen Pflanzen sehr stark veränderte Eigenschaften aufwies und sich in einer Weise verhielt, die ähnlich zu der Stärke Hylon 5 aus Maispflanzen war (13). Unter den in der Viskoamylographie verwendeten Bedingungen zeigte diese Stärke ein äußerst begrenztes (nahezu nicht nachweisbares) Quellen der Körner. Somit zeigte zum Beispiel die Stärke aus den Pflanzen Nr. 201, 208 und 208 a, im Gegensatz zu Stärke aus Kontrollpflanzen, keinen klar definierten Spitzenwert für die Viskosität beim Einsetzen der Teigbildung während der Heizphase. Die mikroskopische Analyse bestätigte, dass die Struktur der Stärkekörner lediglich eine geringe Quellung während der experimentellen Heizphase erfahren hat. Diese Eigenschaft kann in bestimmten Anwendungen durchaus besonders nützlich sein, wie es für den Fachmann ersichtlich sein wird.
  • Es wurde gefunden, dass manche, zum wiederholten Mal gezüchtete Pflanzen den scheinbaren Amylose-Gehalt der Stärke, welche daraus extrahiert wurde, noch weiter steigern. Eine solche Zunahme kann folgende Gründe haben:
    • (i) das Wachstum und die Entwicklung der ersten Generation der transformierten Pflanzen können bis zu einem gewissen Grad von äußeren Wachstumshormonen beeinflusst werden, die im Gewebe-Kultursystem vorliegen, welche exogenen Hormone während des Wachstums der zweiten Generation der Pflanzen nicht anwesend waren; und
    • (ii) die nachfolgenden Generationen wurden unter Feld-Bedingungen gezüchtet, welche es ermöglichen können, dass eine größere Reife erzielt wird, als beim Wachstum unter Laborbedingungen, wobei man im Allgemeinen annimmt, dass der Amylose-Gehalt der Kartoffelstärke mit der Reife der Kartoffelknolle zunimmt.
  • Dementsprechend sollte es möglich sein, Kartoffelpflanzen zu erhalten, die zu Knollen mit einem Amylose-Gehalt der Stärke von mehr als 66 % führen – das ist der bisher erreichte Wert – indem einfach eine größere Zahl von transformierten Pflanzen analysiert und/oder indem transgene Pflanzen über eine oder mehrere Generationen und unter Feld-Bedingungen wiederholt gezüchtet werden.
  • Die Tabelle 1 zeigt, dass der Phosphor-Gehalt ein weiteres Merkmal der Stärke ist, der durch das Vorliegen von Antisens-Sequenzen von SBE beeinflusst wird. Die Stärke aus nicht-transformierten Kontrollpflanzen wies einen Phosphor-Gehalt von etwa 60-70 mg/100 g Trockengewicht auf (wie gemäß den offiziellen Verfahren zur Analyse ADAC, 15. Auflage, Verfahren 948.09: „Phosphor in Mehl", bestimmt). Es wurde gefunden, dass die Einführung einer Antisens-SBE-Sequenz der Klasse B in die Pflanze einen mäßigen Anstieg (etwa um das zweifache) des Phosphor-Gehaltes verursacht – ein Umstand, der mit den vorstehenden Befunden übereinstimmt, die bei wissenschaftlichen Treffen beschrieben wurden. In ähnlicher Weise verursacht ein Antisens-Konstrukt für SBE der Klasse A allein lediglich einen geringen Anstieg des Phosphor-Gehaltes in Bezug auf nicht-transformierte Kontrollpflanzen. Jedoch führt die Verwendung eines Antisens-Konstruktes sowohl für SBE der Klasse A als auch für SBE der Klasse B in Kombination bis zu einem vierfachen Anstieg des Phosphor-Gehaltes, der bei weitem größer als ein beliebiger in planta Phosphor-Gehalt ist, der zuvor für Kartoffelstärke bestimmt wurde.
  • Dies ist für bestimmte Anwendungen nützlich in dem Sinn, dass Stärke in vitro durch eine chemische Modifikation phosphoryliert werden muss. Die Möglichkeit, eine Kartoffelstärke zu erhalten, die bereits einen hohen Phosphor-Gehalt aufweist, wenn sie aus der Pflanze extrahiert wird, wird die Menge der in vitro Phosphorylierung vermindern, die erforderlich ist, um die Stärke in geeigneter Weise zu modifizieren. Somit stellt die Erfindung unter einem anderen Gesichtspunkt eine Kartoffelstärke bereit, die einen Phosphor-Gehalt von mehr als 200 mg/100 g Trockengewicht der Stärke aufweist, wenn sie aus der Pflanze extrahiert wird. Typischerweise wird die Stärke einen Phosphor-Gehalt im Bereich von 200-240 mg/100 g Trockengewicht der Stärke aufweisen. SEQUENZLISTE
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Claims (56)

  1. Stärke, die aus einer Kartoffelpflanze extrahiert wird und einen Amylosegehalt von mindestens 35 % aufweist, wie er durch das indometrische Assay-Verfahren von Morrison & Laignelet (1983, J. Cereal Science 1, 9-20) bestimmt wird.
  2. Stärke nach Anspruch 1 mit einem Amylosegehalt von mindestens 37 %, wie er durch das in Anspruch 1 definierte Verfahren bestimmt wird.
  3. Stärke nach Anspruch 1 mit einem Amylosegehalt von mindestens 40 %, wie er durch das in Anspruch 1 definierte Verfahren bestimmt wird.
  4. Stärke nach Anspruch 1 mit einem Amylosegehalt von mindestens 50 %, wie er durch das in Anspruch 1 definierte Verfahren bestimmt wird.
  5. Stärke nach Anspruch 1 mit einem Amylosegehalt von mindestens 66 %, wie er durch das in Anspruch 1 definierte Verfahren bestimmt wird.
  6. Stärke nach einem der Ansprüche 1-5 mit einem Amylosegehalt von 35 bis 66 %, wie er durch das in Anspruch 1 definierte Verfahren bestimmt wird.
  7. Stärke nach einem der vorstehenden Ansprüche, die, wenn sie aus einer Kartoffelpflanze durch Nassmahlen bei Umgebungstemperatur extrahiert wird, eine Temperatur für den Viskositätsanstieg („viscosity onset temperature") im Bereich von 70-95 °C aufweist, wie sie durch Viskoamylographie einer 10 % (w/w) wässrigen Suspension derselben bestimmt wird, die bei atmosphärischem Druck unter Verwendung des Geräts „Rapid Visco Analyser 3C" der Fa. Newport Scientific durchgeführt wird, wobei folgendes Temperaturprofil eingehalten wird: Halten der Temperatur bei 50 °C für 2 Minuten, Heizen von 50 °C auf 95 °C mit einer Geschwindigkeit von 1,5 °C pro Minute, Halten der Temperatur bei 95 °C für 15 Minuten, Kühlen von 95 °C auf 50 °C mit einer Geschwindigkeit von 1,5 °C pro Minute, und anschließend Halten der Temperatur bei 50 °C für 15 Minuten.
  8. Stärke nach einem der vorstehenden Ansprüche 1-6, die, wenn sie aus einer Kartoffelpflanze durch Nassmahlen bei Umgebungstemperatur gewonnen wird, eine Spitzenviskosität im Bereich von 500-12 Drehzahleinheiten (stirring number units; SNUs) aufweist, wie sie durch Viskoamylographie bestimmt wird, die gemäß dem in Anspruch 7 definierten Protokoll durchgeführt wird.
  9. Stärke nach einem der Ansprüche 1-6, die, wenn sie aus einer Kartoffelpflanze durch Nassmahlen bei Umgebungstemperatur gewonnen wird, eine Pastenviskosität im Bereich von 214-434 Drehzahleinheiten aufweist, wie sie durch Viskoamylographie bestimmt wird, die gemäß dem in Anspruch 7 definierten Protokoll durchgeführt wird.
  10. Stärke nach einem der Ansprüche 1-6, die, wenn sie aus einer Kartoffelpflanze durch Nassmahlen bei Umgebungstemperatur gewonnen wird, eine rückläufige Viskosität („set-back viscosity") im Bereich von 450-618 Drehzahleinheiten aufweist, wie sie durch Viskoamylographie bestimmt wird, die gemäß dem in Anspruch 7 definierten Protokoll durchgeführt wird.
  11. Stärke nach einem der Ansprüche 1-6, die, wenn sie aus einer Kartoffelpflanze durch Nassmahlen bei Umgebungstemperatur gewonnen wird, eine rückläufige Viskosität („set-back viscosity") im Bereich von 14-192 Drehzahleinheiten aufweist, wie sie durch Viskoamylographie bestimmt wird, die gemäß dem in Anspruch 7 definierten Protokoll durchgeführt wird.
  12. Stärke nach einem der Ansprüche 1-6, die, wenn sie aus einer Kartoffelpflanze durch Nassmahlen bei Umgebungstemperatur gewonnen wird, eine Spitzenviskosität im Bereich von 200 – 500 Drehzahleinheiten und eine rückläufige Viskosität („set-back viscosity") im Bereich von 275-618 Drehzahleinheiten aufweist, wie sie durch Viskoamylographie gemäß dem in Anspruch 7 definierten Protokoll bestimmt werden.
  13. Stärke nach einem der Ansprüche 1-6, die, wenn sie aus einer Kartoffelpflanze durch Nassmahlen bei Umgebungstemperatur gewonnen wird, eine Viskosität aufweist, welche zwischen dem Beginn der Heizphase (Schritt 2) und dem Beginn der abschließenden Halte-Phase (Schritt 5) nicht abnimmt, und eine rückläufige Viskosität („setback viscosity") von 303 Drehzahleinheiten oder weniger aufweist, wie sie durch Viskoamylographie gemäß dem in Anspruch 7 definierten Protokoll bestimmt wird.
  14. Stärke nach einem der Ansprüche 1-6, die, wenn sie aus einer Kartoffelpflanze durch Nassmahlen bei Umgebungstemperatur gewonnen wird, keine erhebliche Zunahme in der Viskosität zeigt, wie sie durch Viskoamylographie bestimmt wird, die gemäß dem in Anspruch 7 definierten Protokoll durchgeführt wird.
  15. Stärke nach einem der Ansprüche 1-6, die, wenn sie aus einer Kartoffelpflanze durch Nassmahlen bei Umgebungstemperatur gewonnen wird, sich in Übereinstimmung mit Anspruch 7 und in Übereinstimmung mit einem der Ansprüche 8-14 befindet.
  16. Stärke nach einem der vorstehenden Ansprüche, die, wenn sie aus einer Kartoffelpflanze extrahiert wird, einen Phosphorgehalt von mehr als 200 mg pro 100 g Trockengewicht der Stärke aufweist.
  17. Verwendung der Stärke nach einem der Ansprüche 1-16 zur Herstellung oder Verarbeitung eines Nahrungsmittels.
  18. Verwendung der Stärke nach Anspruch 17, wobei die Stärke dazu verwendet wird, einen Film, eine Schicht, einen Überzug bereitzustellen, oder als ein Geliermittel zu dienen.
  19. Verwendung der Stärke nach Anspruch 17, um resistente Stärke-Zusammensetzungen herzustellen.
  20. Verwendung der Stärke nach einem der Ansprüche 1-16 zur Herstellung oder Verarbeitung von Wellen bildenden Haftmitteln, biologisch abbaubaren Produkten, Verpackungsmitteln, Glasfasern und Textilien.
  21. Isoliertes Nukleinsäure-Molekül, das für ein Polypeptid kodiert, welches die Aminosäure-Sequenz der Reste 49 bis 882 der in 5 gezeigten Sequenz oder das Komplement derselben umfasst.
  22. Nukleinsäure-Molekül nach Anspruch 21, das im Wesentlichen die Sequenz der Nukleotide 289 bis 2790 der in 5 gezeigten Sequenz oder das Komplement derselben umfasst.
  23. Nukleinsäure-Molekül nach Anspruch 22, das darüber hinaus die Sequenz der Nukleotide 145 bis 288 der in 5 gezeigten Sequenz oder das Komplement derselben umfasst.
  24. Nukleinsäure-Molekül nach Anspruch 21, das die Sequenz der Nukleotide 228 bis 2855 derjenigen Sequenz, die in 8 als psbe2con.seq markiert ist, oder das Komplement derselben umfasst.
  25. Nukleinsäure-Molekül nach Anspruch 21, das die Sequenz der Nukleotide 57 bis 2564 derjenigen Sequenz, die in 12 als psbe2con.seq markiert ist, oder das Komplement derselben umfasst.
  26. Nukleinsäure-Molekül nach einem der Ansprüche 21 bis 25, das ein ATG-Startkodon im Leseraster umfasst, und das ggf. einen 5'- und/oder einen 3'-nicht-translatierten Bereich umfasst.
  27. Nukleinsäure-Molekül nach Anspruch 21, das die Sequenz der Nukleotide 45 bis 3200 derjenigen Sequenz, die in 8 als psbe2con.seq markiert ist, oder das Komplement derselben umfasst.
  28. Nukleinsäure-Konstrukt, das ein Molekül nach einem der Ansprüche 21 bis 27 umfasst.
  29. Vektor, der ein Nukleinsäure-Konstrukt nach Anspruch 28 umfasst.
  30. Isolierte Wirtszelle, die einen Vektor nach Anspruch 29 umfasst.
  31. SBE-Polypeptid der Klasse A, das aus Kartoffelpflanzen erhältlich ist, und das durch eine Nukleinsäure-Sequenz nach einem der Ansprüche 21 bis 29 kodiert wird.
  32. Polypeptid nach Anspruch 31, das darüber hinaus die Sequenz der Aminosäuren 1 bis 48 der in 5 gezeigten Sequenz umfasst.
  33. Polypeptid nach Anspruch 31 oder 32, das im Wesentlichen von anderen, aus Pflanzen stammenden Bestandteilen isoliert ist.
  34. Verfahren zur Veränderung der Eigenschaften einer Pflanze, umfassend die Einführung eines Nukleinsäure-Moleküls in eine Pflanze nach einem der Ansprüche 21 bis 29, welches Nukleinsäure-Molekül funktionell mit einem geeigneten Promotor verknüpft ist, der in der Pflanze aktiv ist, um die Expression eines in der Pflanze vorhandenen Gens zu beeinflussen, das für ein Stärke-Verzweigungs-Enzym der Klasse A kodiert.
  35. Verfahren nach Anspruch 34, wobei die Nukleotid-Sequenz funktionell in antisense-Orientierung mit einem geeigneten Promotor verknüpft ist, der in der Pflanze aktiv ist.
  36. Verfahren nach Anspruch 34, wobei die eingeführte Sequenz eine oder mehrere der folgenden Sequenzen umfasst, die funktionell in sense-Orientierung mit einem Promotor verknüpft sind, der in der Pflanze aktiv ist, um dadurch eine sense-Unterdrückung eines in natürlicher Weise in der Pflanze exprimierten Enzyms zu verursachen: einen 5'-nicht-translatierten Bereich, einen 3'-nicht-translatierten Bereich oder einen kodierenden Abschnitt des Stärke-Verzweigungs-Enzyms (SBE) der Klasse A aus der Kartoffel.
  37. Verfahren nach einem der Ansprüche 34, 35 oder 36, welches darüber hinaus die Einführung von einer oder mehreren weiteren Sequenzen in die Pflanze umfasst.
  38. Verfahren nach Anspruch 37, wobei eine oder mehrere weitere Sequenzen in antisense-Orientierung mit einem geeigneten Promotor, der in der Pflanze aktiv ist, funktionell verknüpft sind.
  39. Verfahren nach Anspruch 37 oder 38, wobei die weitere Sequenz einen Abschnitt der Nukleotid-Sequenz des Stärke-Verzweigungs-Enzyms (SBE) der Klasse 'B umfasst.
  40. Verfahren nach einem der Ansprüche 34 bis 39, das bei der Veränderung der Stärke-Zusammensetzung einer Pflanze wirksam ist.
  41. Pflanze oder Pflanzenzelle oder Abkömmling einer solchen Pflanze oder ein Teil einer solchen Pflanze, die einen Vektor in Übereinstimmung mit Anspruch 29 umfasst.
  42. Pflanze nach Anspruch 41, die aus einer der folgenden Pflanzen ausgewählt wird: Kartoffel, Erbse, Tomate, Mais, Weizen, Reis, Gerste, Süßkartoffel und Maniok.
  43. Knolle oder anderes Speicherorgan aus einer Pflanze nach Anspruch 41 oder 42.
  44. Verwendung einer Knolle oder eines anderen Speicherorgans nach Anspruch 43 bei der Herstellung und/oder der Verarbeitung eines Nahrungsmittels.
  45. Pflanze nach Anspruch 41 oder 42, die Stärke enthält, welche, wenn sie aus der Pflanze durch Nassmahlen bei Umgebungstemperatur gewonnen wird, eine erhöhte Temperatur für den Viskositätsanstieg („viscosity onset temperature") aufweist, wie sie durch Viskoamylographie bestimmt wird, die gemäß dem in Anspruch 7 definierten Protokoll durchgeführt wird, im Vergleich mit einer Stärke, die aus einer nicht veränderten, jedoch sonst genetisch identischen Pflanze gewonnen wurde.
  46. Pflanze nach Anspruch 45, wobei die Temperatur für den Viskositätsanstieg („viscosity onset temperature") um einen Betrag im Bereich von 10 °C bis 25 °C erhöht ist.
  47. Pflanze nach Anspruch 41 oder 42, die eine Stärke enthält, welche, wenn sie aus der Pflanze durch Nassmahlen bei Umgebungstemperatur gewonnen wird, eine verminderte Spitzenviskosität aufweist, wie er durch Viskoamylagraphie bestimmt wird, die gemäß dem in Anspruch 7 definierten Protokoll durchgeführt wird, im Vergleich mit einer Stärke, die aus einer nicht veränderten, jedoch sonst genetisch identischen Pflanze gewonnen wurde.
  48. Pflanze nach Anspruch 47, wobei die Spitzenviskosität um einen Betrag im Bereich von 240 bis 700 Drehzahleinheiten vermindert ist.
  49. Pflanze nach Anspruch 41 oder 42, die eine Stärke enthält, welche, wenn sie aus der Pflanze durch Nassmahlen bei Umgebungstemperatur gewonnen wird, eine erhöhte Pastenviskosität aufweist, wie sie durch Viskoamylographie bestimmt wird, die gemäß dem in Anspruch 7 definierten Protokoll durchgeführt wird, im Vergleich mit einer Stärke, die aus einer nicht veränderten, jedoch sonst genetisch identischen Pflanze gewonnen wurde.
  50. Pflanze nach Anspruch 49, wobei die Pastenviskosität um einen Betrag im Bereich von 37 bis 260 Drehzahleinheiten erhöht ist.
  51. Pflanze nach Anspruch 41 oder 42, die eine Stärke enthält, welche, wenn sie aus der Pflanze durch Nassmahlen bei Umgebungstemperatur gewonnen wird, eine erhöhte rückläufige Viskosität („set-back viscosity") aufweist, wie sie durch Viskoamylographie bestimmt wird, die gemäß dem in Anspruch 7 definierten Protokoll durchgeführt wird, im Vergleich mit einer Stärke, die aus einer nicht veränderten, jedoch sonst genetisch identischen Pflanze gewonnen wurde.
  52. Pflanze nach Anspruch 51, wobei die rückläufige Viskosität („set-back viscosity") um einen Betrag im Bereich von 224 bis 313 Drehzahleinheiten erhöht ist.
  53. Pflanze nach Anspruch 41 oder 42, die eine Stärke enthält, welche, wenn sie aus der Pflanze durch Nassmahlen bei Umgebungstemperatur gewonnen wird, eine verminderte rückläufige Viskosität („set-back viscosity") aufweist, wie sie durch Viskoamylographie bestimmt wird, die gemäß dem in Anspruch 7 definierten Protokoll durchgeführt wird, im Vergleich mit einer Stärke, die aus einer nicht veränderten, jedoch sonst genetisch identischen Pflanze gewonnen wurde.
  54. Pflanze nach Anspruch 41 oder 42, die eine Stärke enthält, welche, wenn sie aus der Pflanze durch Nassmahlen bei Umgebungstemperatur gewonnen wird, einen erhöhten scheinbaren Amylosegehalt aufweist, wie er durch einen indometrischen As say nach dem Verfahren von Morrison & Laignelet bestimmt wird, im Vergleich mit einer Stärke, die aus einer nicht veränderten, jedoch sonst genetisch identischen Pflanze gewonnen wurde.
  55. Pflanze nach Anspruch 41 oder 42, die eine Stärke enthält, welche, wenn sie aus der Pflanze gewonnen wurde, einen Phosphorgehalt von mehr als 200 mg pro 100 g Trockengewicht der Stärke aufweist.
  56. Verfahren zur Modifikation der Stärke in vitro, welche das Behandeln der Stärke unter geeigneten Bedingungen mit einer wirksamen Menge eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 31 bis 33 umfasst.
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