ES2290956T3 - Mejoras en o relacionadas con una composicion de almidon de una planta. - Google Patents
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Abstract
SE DESCUBRE UNA SECUENCIA NUCLEOTIDICA QUE CODIFICA UNA PORCION EFECTIVA DE UN ENZIMA RAMIFICADOR DE ALMIDON DE CLASE A (SBE) OBTENIBLE A PARTIR DE PLANTAS DE PATATA, O UN EQUIVALENTE FUNCIONAL DEL MISMO, JUNTO CON, ENTRE OTROS, UN POLIPEPTIDO CORRESPONDIENTE, UN METODO PARA ALTERAR LAS CARACTERISTICAS DE UNA PLANTA, UNA PLANTA CON CARACTERISTICAS ALTERADAS; Y ALMIDON, EN PARTICULAR ALMIDON OBTENIDO DE UNA PLANTA DE PATATA, CON NUEVAS PROPIEDADES.
Description
Mejoras en o relacionadas con una composición de
almidón de una planta.
Esta invención se relaciona con nuevas
secuencias de nucleótidos, con los polipéptidos codificados por
ellas, con vectores y células huésped y organismos huésped que
contienen una o más de las secuencias nuevas, y con un método para
alterar una o más de las características de un organismo. La
invención también se relaciona con un almidón que tiene propiedades
nuevas y con los usos del mismo.
El almidón es la forma principal de reserva de
carbono en las plantas, constituyendo 50% o más del peso seco de
muchos órganos de almacenamiento - por ejemplo tubérculos, semillas
de cereales. El almidón se utiliza en numerosos alimentos y
aplicaciones industriales. En muchos casos, sin embargo, es
necesario modificar los almidones nativos, a través de medios
químicos o físicos, con el propósito de producir propiedades
distintas para satisfacer aplicaciones particulares. Sería altamente
deseable poder producir almidones con las propiedades referidas
directamente en la planta, eliminando así la necesidad de
modificaciones adicionales. Para lograr esto a través de ingeniería
genética se requiere el conocimiento de la ruta metabólica de la
biosíntesis de almidón. Esto incluye la caracterización de genes y
de los productos génicos codificados que catalizan la síntesis del
almidón. El conocimiento acerca de la regulación de la biosíntesis
del almidón permite la posibilidad de rutas biosintéticas de
"reprogramación" para crear almidones con nuevas propiedades
que podrían tener nuevas aplicaciones comerciales.
Las propiedades comerciales útiles del almidón
se derivan de la habilidad de la forma granular nativa para
hincharse y absorber agua por un tratamiento adecuado. Usualmente se
requiere calor para provocar que los gránulos se hinchen en un
proceso conocido como gelatinización, que ha sido definido como (W
A Atwell y colaboradores, Cereal Foods World 33,
306-311, 1988): "... el colapso (ruptura) del
ordenamiento molecular dentro del gránulo de almidón que se
manifiesta en cambios irreversibles en propiedades tales como el
hinchamiento granular, la fundición del cristal nativo, la pérdida
de birrefringencia, y la solubilización del almidón. El punto
inicial de la gelatinización y el rango sobre el cuál ocurre están
gobernados por la concentración del almidón, el método de
observación, el tipo de gránulo, y la heterogeneidad dentro de la
población de gránulos bajo observación". Se encuentran
disponibles un gran número de técnicas para la determinación de la
gelatinización como la inducida por calor, siendo un método
conveniente y preciso el de la calorimetría diferencial de barrido,
que detecta el rango de temperatura y la entalpía asociados con el
colapso del ordenamiento molecular dentro del gránulo. Para obtener
resultados precisos y significativos, usualmente se determina la
temperatura de inicio y/o la de pico de la endoterma observada por
medio de calorimetría diferencial de barrido.
La consecuencia del colapso del ordenamiento
molecular dentro de los gránulos de almidón es que los gránulos son
capaces de recoger agua en un proceso conocido como adhesión, que ha
sido definido como (W A Atwell y colaboradores, Cereal Foods World
33, 306-311, 1988): "... el fenómeno después
de la gelatinización en la disolución de almidón. Involucra
hinchamiento granular, exudación de componentes moleculares del
gránulo, y eventualmente, la ruptura total de los gránulos".
El mejor método para evaluar las propiedades de adhesión se
considera que es la viscoamilografía (Atwell y colaboradores, 1998,
citado anteriormente) en la cual se hace seguimiento a la viscosidad
de una suspensión agitada de almidón bajo un régimen definido de
tiempo/temperatura. Un perfil típico de viscoamilografa para almidón
de patata muestra una elevación inicial de la viscosidad, que se
considera que es debida al hinchamiento del gránulo. Además de la
forma total de la respuesta de viscosidad en un viscoamilógrafo, una
medida cuantitativa conveniente es la temperatura del desarrollo
inicial de viscosidad (inicio). La Figura 1 muestra un perfil
típico de viscosidad de esta clase para almidón de patata, durante y
después de la cocción, e incluye las etapas A-D que
corresponden al comienzo de la viscosidad (A), a la viscosidad
máxima (B), a la dispersión completa (C) y a la reasociación de
moléculas (o retrogradación, D). En la figura, la línea punteada
representa la viscosidad (en el número de unidades can agitación) de
una suspensión de almidón al 10% p/p y la línea continúa muestra la
temperatura en grados centígrados. En un cierto punto, definido por
el pico de viscosidad, el hinchamiento del gránulo es tan grande que
las estructuras altamente expandidas resultantes son sensibles a
una fragmentación mecánicamente inducida bajo las condiciones de
agitación utilizadas. Con un calentamiento mayor y sostenido a
95°C, se observa una reducción adicional en la viscosidad debido a
una mayor fragmentación de los gránulos hinchados. Este perfil
general ha sido siempre previamente encontrado para almidón nativo
de patata.
Después del calentamiento de almidones en agua a
95°C y de mantenerlos a esa temperatura (típicamente durante 15
minutos), el enfriamiento posterior a 50°C resulta en un incremento
en la viscosidad debido al proceso de retrogradación o de
retroceso. La retrogradación (o retroceso) se define como (Atwell y
colaboradores, 1998, citado anteriormente) "... un proceso que
se presenta cuando las moléculas que contienen almidón gelatinizado
comienzan a reasociarse en una estructura ordenada...". A
50°C, es principalmente el componente amilosa el que se reasocia,
como lo indica el incremento en la viscosidad con el
viscoamilógrafo para el almidón a partir de maíz normal (21,6% de
amilosa) comparado con el almidón del maíz ceroso (1,1% de amilosa)
como se observa en la Figura 2. La Figura 2 es una viscoamilografía
de suspensiones de almidón al 10% p/p a partir de maíz ceroso
(línea continua), maíz convencional (puntos y rayas), una variedad
con alto contenido de amilosa (hylon 5, línea punteada) y una
variedad con un contenido muy alto de amilosa (hylon 7, cruces). Se
observa también el perfil de temperatura por medio de una línea
continua, como la Figura 1. El grado de incremento en la viscosidad
en el viscoamilógrafo enfriando y manteniendo 50°C depende de la
cantidad de amilosa que sea capaz de reasociarse debido a su
exudación a partir de los gránulos de almidón durante los procesos
de gelatinización y adhesión. Una característica de los almidones
ricos en amilosa a partir de plantas de maíz es que se exuda muy
poca amilosa a partir de los gránulos por gelatinización y adhesión
hasta 95°C, probablemente debido al hinchamiento restringido de los
gránulos. Esto es ilustrado la Figura 2 que muestra bajas
viscosidades para un almidón (Hylon 5) con amilosa alta (44,9%) a
partir de maíz durante la gelatinización y adhesión a 95°C y un bajo
incremento en la viscosidad al enfriar y mantener a 50°C. Éste
efecto es más extremo para un mayor contenido de amilosa (58%, como
en Hylon 7), que muestra viscosidades aún menores en el ensayo con
el viscoamilógrafo (Figura 2). Para los almidones comercialmente
disponibles con alto contenido de amilosa (actualmente disponibles
a partir de plantas de maíz, tal como aquellas descritas más
arriba), usualmente es necesario un procesamiento por encima de
100°C con el propósito de generar los beneficios de contenidos
altos de amilosa con respecto a velocidades y concentraciones
mayores de reasociación, pero el uso de temperatura tan altas es
energéticamente desfavorable y costoso. Por lo tanto, existe una
necesidad insatisfecha por almidones con alto contenido de amilosa
que puedan ser procesados por debajo de 100°C y que muestra aún
niveles mejorados de reasociación, como lo indican por ejemplo las
mediciones por medio de un viscoamilógrafo.
Las propiedades del almidón de patata son útiles
en una variedad eje aplicaciones tanto alimenticias como no
alimenticias (papel, textiles, adhesivos, etc.). Sin embargo, para
muchas aplicaciones, las propiedades no son óptimas y se emprenden
diferentes modificaciones químicas y físicas conocidas en el arte
con el propósito de mejorar las propiedades útiles. Dos tipos de
manipulación apropiadas que serían útiles son: la alteración
controlada de las temperaturas de gelatinización y de adhesión; y
almidones que sufran menos fragmentación granular durante la
adhesión que los almidones convencionales.
Actualmente las únicas formas de manipular las
temperaturas de gelatinización y de adhesión del almidón de patata
son por medio de la inclusión de aditivos tales como azúcares,
polihidroxi compuestos de sales (Evans & Haisman. Starke 34,
224-231, 1982) o por medio de pretratamientos
fisicos o químicos extensivos (por ejemplo Stute, Starke 44,
205-214, 1992) La reducción de la fragmentación de
los gránulos durante la adhesión se puede lograr ya sea por medio de
pretratamientos físicos extensivos (Stute, Starke 44,
205-214, 1992) o por medio de entrelazamiento
químico. Tales procesos son inconvenientes e ineficientes. Por lo
tanto es deseable obtener plantas que produzca almidón que
intrínsecamente posean tales propiedades ventajosas.
El almidón consiste de dos polisacáridos
principales, amilosa y amilopectina. La amilosa es un polímero
generalmente lineal que contienen unidades de glucosa enlazadas
\alpha-1,4, mientras que la amilopectina es un
polímero altamente ramificado que consiste de una columna vertebral
de glucano enlazado \alpha-1,4 con ramificaciones
de glucano enlazadas \alpha-1,6. En la mayoría de
las plantas las reservas almacenadas de amilopectina constituyen
aproximadamente el 75% del contenido de almidón. La amilopectina se
sintetiza por medio de la acción concertada de la sintasa de almidón
soluble y de la enzima de ramificación del almidón [glucano
\alpha-1,4: 6-glicosiltransferasa
de glucano \alpha-1,6, EC 2.4.1.18]. La enzima de
ramificación del almidón (SBE) hidroliza los enlaces
\alpha-1,4 y vuelve a unir al glucano escindido,
a través de un enlace \alpha-1,6, a una cadena
aceptora para producir una estructura ramificada. Las propiedades
físicas del almidón se afectan fuertemente por la abundancia
relativa de amilosa y amilopectina, y SBE es por lo tanto una enzima
crucial en la determinación tanto de la cantidad como de la calidad
de los almidones producidos en sistemas de plantas.
En la mayoría de las plantas estudiadas hasta la
fecha, por ejemplo maíz (Boyer & Preiss, 1978 Biochem. Biophys.
Res. Comm. 80, 169-175), arroz (Smyth, 1988, Plant
Sci. 57, 1-8) y guisantes (Smith. Planta 175,
270-279), se han identificado dos formas de SBE,
cada una codificada por un gen separado. Una revisión reciente por
Burton y colaboradores, (1995 The Plant Journal 7,
3-15) ha demostrado que las dos formas de SBE
constituyen clases distintas de la enzima de manera que, en
general, enzimas de la misma clase de plantas diferentes pueden
exhibir una mayor similitud que enzimas de clases diferentes de la
misma planta. En su revisión, Burton y colaboradores llamaron a las
dos respectivas familias de enzimas clase "A" y clase "B",
y el lector es remitido a las mismas (y a las referencias citadas
aquí) para una discusión detallada de las distinciones entre las dos
clases. Una distinción general observada parecería ser la
presencia, en las moléculas de SBE de clase A, de un dominio
N-terminal flexible, quien no se encuentra en
moléculas de clase B. Las distinciones observadas por Burton y
colaboradores son tenidas en cuenta aquí para definir las moléculas
de SBE clase A y clase B, cuyos términos se deben interpretar de
conformidad.
Sin embargo en patatas, únicamente una isoforma
de la molécula de SBE (que pertenece la clase B) ha sido reportada
hasta el momento y solamente un gen clonado (Blennow &
Johansson, 1991 Phytochem. 30, 437-444, y Koßmann y
colaboradores, 1991 Mol. Gen. Genet. 230, 39-44).
Además, los intentos publicados para modificar las propiedades del
almidón en plantas de patata (evitando la expresión de la única SBE
conocida) generalmente no han sido exitosos (por ejemplo,
Muller-Rober & Koßmann 1994 Plant Cell and
Environment 17, 601-613).
En un primer aspecto la invención provee una
secuencia aislada de nucleótidos que codifican a un polipéptido que
contiene la secuencia de aminoácidos de los residuos
49-882 de la secuencia mostrada en la Figura 5, o
el complemento de la misma.
\newpage
La secuencia de aminoácidos mostrada en la
Figura 5 (Seq ID No. 15) incluye una secuencia líder que dirige al
polipéptido, cuando es sintetizado en células de patata, al
amiloplasto. Aquellos capacitados el arte reconocerán que la
secuencia líder es removida para producir una enzima madura y que
la secuencia líder no es por lo tanto esencial para la actividad de
la enzima. Por lo tanto, una "porción efectiva" del
polipéptido es una que posee suficiente actividad de la SB E para
complementar la mutación de la enzima de ramificación en células KV
832 de E. coli (es que describen más adelante) y que es
activa cuando se expresa en E. coli en el ensayo de
estimulación de la fosforilación. Un ejemplo de un polipéptido
incompleto que constituye sin embargo una "porción efectiva" es
la enzima madura que carece de la secuencia líder. Por analogía con
la secuencia de la SBE clase A del guisante, la secuencia clase A
de la patata mostrada en la Figura 5, probablemente posee una
secuencia líder de aproximadamente 48 residuos de aminoácidos, de
tal manera que se piensa que la secuencia de aminoácidos
N-terminal comienza alrededor del residuo (E) de
ácido glutámico en la posición 49 (EKSSYN...etc.). Aquellos
capacitados en el arte apreciarán que una porción efectiva de la
enzima puede excluir bien otras partes de la secuencia mostradas en
la figura sin un efecto nocivo sustancial. Por ejemplo, la región
rica en ácido glutámico C-terminal podría ser
reducida en longitud, o posiblemente suprimida completamente, sin
suprimir los la actividad de la SBE clase A. Una comparación con
otras secuencias conocidas de la SBE, especialmente otras secuencias
de la SBE clase A (ver por ejemplo, Burton y colaboradores, 1995
citado anteriormente), debe indicar aquellas porciones que están
altamente conservadas (y por lo tanto probablemente sea esencial
para la actividad) y aquellas porciones que están menos bien
conservadas (y por lo tanto probablemente toleran más cambios en la
secuencia sin una pérdida sustancial de actividad de la enzima).
Convenientemente, la secuencia de nucleótidos
comprenderá sustancialmente a los nucleótidos 289 a 2790 de la
secuencia de ADN (Seq ID No. 14) mostrada en la Figura 5 (cuyos
nucleótidos codifican a la enzima madura) o a un equivalente
funcional de la misma, y puede incluir también nucleótidos
adicionales en el extremo 5' o en el extremo 3'. Por ejemplo, por
facilidad de expresión, la secuencia también comprenderá
deseablemente un codón de inicio ATG en el marco, y puede codificar
también una secuencia líder. Por lo tanto, en una modalidad, la
secuencia comprende además a los nucleótidos 145 a 288 de la
secuencia mostrada en la Figura 5. Otras modalidades son los
nucleótidos 228 a 2855 de la secuencia marcada como
"psbe2con.seq" en la Figura 8, y los nucleótidos 57 a 2564 de
la secuencia mostrada en la Figura 12 (preferiblemente contiene un
codón de inicio ATG en el marco, tal como la secuencia de
nucleótidos 24 a 56 en la misma Figura), o equivalentes funcionales
de la secuencias anteriormente mencionadas.
El término "equivalente funcional" como se
lo aplica aquí a las secuencias de nucleótidos se propone abarcar a
aquellas secuencias que difieren en su composición de nucleótidos de
aquella mostrada en la Figura 5 pero que, en virtud de la
degeneración del código genético, codifica polipéptidos que tienen
secuencias idénticas o sustancialmente idénticas de aminoácidos. Se
pretende que el término se aplique también a secuencias que son
suficientemente homólogas a la secuencia de la invención que ellas
puedan hibridar hasta el complemento de la misma bajo condiciones
rigurosas de hibridación - tales equivalentes poseerán
preferiblemente al menos 85%, más preferiblemente al menos 90%, y lo
más preferiblemente al menos 95% de homología de secuencia con la
secuencia de la invención como la ejemplificada por los nucleótidos
289 a 2790 de la secuencia de ADN mostrada en la Figura 5. Será
claro para aquellos capacitados en el arte que la secuencia de
nucleótidos de la invención puede encontrar también aplicación útil
cuando se presenta como una secuencia "antisentido". Por lo
tanto, las secuencias funcionalmente equivalentes incluirán también
a aquellas secuencias que pueden hibridar, bajo condiciones
rigurosas de hibridación, hasta la secuencia de la invención (en
vez de hasta el complemento de la misma). Tales equivalentes
"antisentido" preferiblemente poseerán al menos 85%, más
preferiblemente al menos 90%, y lo más preferiblemente 95% de
homología de secuencia con el complemento de la secuencia de
invención como la ejemplificada por los nucleótidos 289 a 2790 de
la secuencia de ADN mostrada en la Figura 5. Se muestran
equivalentes funcionales particulares, por ejemplo, en las Figuras 8
y 10 (si uno hace caso omiso de las diferentes mutaciones del marco
de lectura observadas aquí).
La invención también provee vectores,
particularmente vectores de expresión, que contienen la secuencia
de nucleótidos de la invención. El vector típicamente comprenderá un
promotor y una o más señales reguladoras del tipo conocido por
aquellos capacitados en el arte. La invención también incluye una
provisión de células transformadas (cuyo término abarca transducción
y transfección) con un vector que contiene la secuencia de
nucleótidos de la invención.
La invención provee además un polipéptido de la
SBE clase A, que puede obtenerse a partir de plantas de patata y
codificado por la secuencia de ácido nucleico del primer aspecto de
la invención. En particular, la invención provee al polipéptido en
una forma sustancialmente pura, especialmente en una forma libre de
otros componentes derivados de la planta (especialmente derivados
de la planta de patata), que puede lograrse fácilmente por medio de
la expresión de la secuencia relevante de nucleótidos en un huésped
adecuado que no es una planta (tal como cualquiera de las cepas de
levadura rutinariamente utilizadas para propósitos de expresión, por
ejemplo, Pichia spp, o Saccharomyces spp).
Típicamente, la enzima comprenderá sustancialmente la secuencia de
residuos aminoácidos 49 a 882 mostrada en la Figura 5 (haciendo caso
omiso de la secuencia MNKRIDL, que no hace parte de la enzima), o
un equivalente funcional de la misma. El polipéptido de la
invención se puede usar en un método para modificar almidón in
vitro, que comprende el tratamiento del almidón bajo
condiciones adecuadas (por ejemplo, temperatura y pH apropiados,
etc.) con una cantidad efectiva del polipéptido de acuerdo con la
invención.
El término "equivalente funcional", como se
lo aplica aquí a las secuencias de aminoácidos, se propone abarcar
las secuencias de aminoácidos sustancialmente similares a aquellas
mostradas en la Figura 5, ya que el polipéptido posee suficiente
actividad para complementar la mutación de la enzima de
ramificación en células KV 832 de E. coli (descritas más
adelante) y que es activo en E. coli en los ensayos de estimulación
de la fosforilación. Típicamente, tales secuencias de aminoácidos
funcionalmente equivalentes poseerán preferiblemente al menos 85%,
más preferiblemente al menos 90%, y lo más preferiblemente al menos
95% de identidad de la secuencia con la secuencia de aminoácidos de
la enzima madura (esto es, menos secuencia líder) mostrada en la
Figura 5. Aquellos capacitados en el arte apreciarán que se pueden
hacer sustituciones conservadoras generalmente en toda la molécula
sin afectar sustancialmente la actividad de la enzima. Además, se
pueden tolerar algunas sustituciones no conservadoras,
especialmente en las regiones menos altamente conservadas de la
molécula. Tales sustituciones pueden hacerse, por ejemplo, para
modificar ligeramente la actividad de la enzima. El polipéptido
puede, si se desea, incluir una secuencia líder, tal como aquella
ejemplificada por los residuos 1 a 48 de la secuencia de aminoácidos
mostrada en la Figura 5, aunque se conocen y se pueden incluir
otras secuencias líder y péptidos señal y similares.
Una porción de la secuencia de nucleótidos de la
invención ha sido introducida en una planta y se encontró que
afecta las características de la planta. En particular, se encontró
que la introducción de la secuencia de la invención, operativamente
enlazada en la orientación antisentido a un promotor adecuado,
reduce la cantidad de moléculas de almidón ramificadas en la
planta.. Adicionalmente, se ha demostrado recientemente en otros
sistemas experimentales que puede ocurrir también una "supresión
sentido" (esto es, la expresión de una secuencia introducida
operativamente enlazada en la orientación sentido puede interferir,
por medio de algún mecanismo desconocido, con la expresión del gen
nativo), como lo describen Matzke & Matzke (1995 Plant Physiol.
107, 679-685). Cualquiera de los métodos
mencionados por Matzke & Matzke podría, en teoría, ser utilizado
para afectar la expresión en un huésped de un gen homólogo que
codifica para la SBE.
Se cree que los métodos antisentido son
principalmente operables por medio de la producción de ARNm
antisentido que hibrida al ARNm sentido, previniendo su traducción
en un polipéptido funcional, posiblemente provocando que el ARN
híbrido se degrade (por ejemplo, Sheehy y colaboradores, 1988 PNAS
85, 8805-8809: Van der Krol y colaboradores, Mol.
Gen. Genet. 220, 204-212). La supresión sentido
también requiere de homología entre la secuencia introducida y el
gen objetivo, pero el mecanismo exacto no es claro. Es claro sin
embargo que, en relación tanto con la supresión sentido como
antisentido, ni una secuencia de nucleótidos completa, ni una
secuencia "nativa" son esenciales. Preferiblemente, la
"porción efectiva" utilizada en el método comprenderá al menos
un tercio de la secuencia de longitud completa, pero por simple
ensayo y error se pueden encontrar otros argumentos (más pequeños o
más grandes) que son funcionales en la alteración de las
características de la planta.
Por lo tanto, en un aspecto adicional la
invención provee un método de alterar las características de una
planta, que comprende introducir dentro de la planta una porción de
la secuencia de la invención operativamente enlazada a un promotor
adecuado activo en la planta, para afectar la expresión de un gen
presente en la planta. Convenientemente, la secuencia se enlazará en
la orientación antisentido al promotor. Preferiblemente, la planta
es una planta de patata. Convenientemente, las características
alteradas se relacionan con el contenido de almidón y/o con la
composición del almidón de la planta (esto es, la cantidad y/o el
tipo de almidón presente en la planta). Preferiblemente, el método
de alterar las características de la planta comprenderá también la
introducción que una o más secuencias adicionales, además de una
porción de la secuencia de la invención. La secuencia introducida
de la invención y una o más secuencias adicionales (que pueden ser
secuencias sentido o antisentido) pueden ser operativamente
enlazadas a un promotor único (que garantizaría que ambas
secuencias se transcribieran esencialmente al mismo tiempo), o
pueden ser operativamente enlazadas a promotores separados (lo que
puede ser necesario para una expresión óptima). Donde se emplean
promotores separados, ellos pueden ser idénticos entre sí o
diferentes. Los promotores adecuados son conocidos por aquellos
capacitados en el arte e incluyen tanto tipos constitutivos como
inducibles. Los ejemplos incluyen al promotor 35S del CaMV (por
ejemplo una repetición sencilla o en tándem) y al promotor de la
patatina. Convenientemente, el promotor será específico del tejido.
Deseablemente, el promotor causará la expresión de la secuencia
operativamente enlazada en niveles sustanciales únicamente en el
tejido de la planta donde ocurre principalmente la síntesis del
almidón y/o el almacenamiento del almidón. Así, por ejemplo, donde
se introduzca la secuencia en una planta de patata, el promotor
operativamente enlazado puede ser específico del tubérculo, tal
como el promotor de la patatina.
Deseablemente, la secuencia adicional contendrá
una porción de la secuencia que codifica a la molécula de la SBE
clase B de la patata. Deseablemente, por ejemplo, el método
comprenderá también la introducción de una porción de una secuencia
que codifica a una SBE clase B, operativamente enlazada en la
orientación antisentido a un promotor adecuado activo en la planta.
Convenientemente, la secuencia adicional comprenderá una porción
efectiva de la secuencia descrita por Blennow & Johansson (1991
Phytochem. 30, 437-444) o aquella divulgada en WO
92/11375. Más preferiblemente, la secuencia adicional comprenderá
al menos una porción de la secuencia divulgada en la Solicitud
Internacional de Patente No. WO 95/26407. Los presentes inventores
han encontrado ahora que el uso de secuencias antisentido tanto
contra la SBE clase A como clase B en combinación, resulta en la
producción de un almidón que tiene propiedades muy grandemente
alteradas (ver más abajo). Aquellos capacitados en el arte
apreciarán la posibilidad de que, si la planta ya contiene una
secuencia sentido o antisentido que inhibe eficientemente la
actividad de la SBE clase B, la introducción de una secuencia
sentido o antisentido para inhibir la actividad de la SBE clase A
(produciendo por lo tanto una planta con inhibición tanto de
actividad clase A como clase B) puede alterar grandemente las
propiedades del almidón en la planta, sin necesidad de la.
introducción de una o más secuencias adicionales. Por lo tanto, se
introduce convenientemente la secuencia la invención en plantas que
ya tienen niveles bajos de actividad de la SBE clase A y/o clase B,
de tal manera que la inhibición resultante de la introducción de la
secuencia de la invención probablemente tenga un efecto más
pronunciado.
La secuencia de la invención, y una o más
secuencias adicionales si se desea, se puede introducir en la
planta por cualquiera entre una variedad de técnicas conocidas (por
ejemplo, una transformación mediada por Agrobacterium, o por medio
de métodos "biolísticos"). Las secuencias son probablemente
más efectivas en la inhibición de la actividad de la SBE en plantas
de patata, pero teóricamente podrían ser introducidas en cualquier
planta. Los ejemplos deseables incluyen guisantes, tomate, maíz,
trigo, arroz, cebada, patata dulce y plantas de casabe.
Preferiblemente, la planta contendrá un gen natural que codifica a
una molécula de la SBE que exhibe una homología razonable con la
secuencia introducida de ácido nucleico de la invención.
En otro aspecto, la invención provee una célula
de una planta, o una planta o la progenie de la misma, que
contienen una construcción que tiene la secuencia del primer aspecto
de la invención. La progenie de la planta alterada se puede
obtener, por ejemplo, por medio de propagación vegetativa, o por
cruzamiento de la planta alterada y guardando la semilla así
obtenida. La invención también provee partes de la planta alterada,
tal como los órganos de almacenamiento. Convenientemente, por
ejemplo, la invención provee tubérculos que contienen almidón
alterado, siendo obtenidos dichos tubérculos a partir de una planta
alterada o de la progenie de la misma. Los tubérculos de la patata
obtenidos a partir de plantas alteradas (o la progenie de las
mismas) serán materiales particularmente útiles en ciertas
aplicaciones industriales y para la preparación y/o el procesamiento
de productos alimenticios y pueden ser utilizados, por ejemplo,
para preparar gofres y patatas fritas bajos en grasa (siendo
generalmente utilizada la amilosa como un recubrimiento para
prevenir la incorporación de grasa), y para preparar puré de
patatas (especialmente puré de patata "instantáneo") con
características particulares.
La invención también provee almidón como el
definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-16
en las reivindicaciones anexas. El uso de secuencias de nucleótidos
de acuerdo con la invención les ha permitido a los inventores
presentes producir almidones de patata que tienen una amplia
variedad de propiedades nuevas.
En particular la invención provee lo siguiente:
una planta (especialmente una planta de patata) que contienen
almidón el cual, cuando se extrae de la planta por medio de molienda
en húmedo a temperatura ambiente, tiene una temperatura elevada del
desarrollo Inicial de viscosidad (convenientemente elevada en
10-25°C) de acuerdo a lo juzgado por la
viscoamilografía llevada a cabo de acuerdo al protocolo definido en
la reivindicación 7 de las reivindicaciones anexas comparado con el
almidón extraído de una planta inalterada, o bien genéticamente
idéntica; una planta (especialmente una planta de patata) que
contienen almidón el cual, cuando es extraído de la planta por
medio de molienda en húmedo a temperatura ambiente, tiene una menor
viscosidad de pico (convenientemente menor en
240-700 SNUs) de acuerdo a lo juzgado por la
viscoamilografía llevada a cabo de acuerdo al protocolo definido en
la reivindicación 7 de las reivindicaciones anexas comparado con el
almidón extraído de una planta inalterada, o bien genéticamente
idéntica; una planta (especialmente una planta de patata) que
contienen almidón el cual, cuando es extraído de la planta por
medio de molienda en húmedo a temperatura ambiente, tiene una mayor
viscosidad de adhesión (convenientemente incrementada en
37-260 SNUs) de acuerdo a lo juzgado por la
viscoamilografía llevada a cabo de acuerdo al protocolo definido en
la reivindicación 7 de las reivindicaciones anexas comparado con el
almidón extraído de una planta inalterada, o bien genéticamente
idéntica; una planta (especialmente una planta de patata) que
contienen almidón el cual, cuando es extraído de la planta por
medio de molienda en húmedo a temperatura ambiente, tiene una mayor
viscosidad de retroceso (convenientemente incrementada en
224-313 SNUs) de acuerdo a lo juzgado por la
viscoamilografía llevada a cabo de acuerdo al protocolo definido en
la reivindicación 7 de las reivindicaciones anexas comparado con el
almidón extraído de una planta inalterada, o bien genéticamente
idéntica; una planta (especialmente una planta de patata) que
contienen almidón el cual, cuando es extraído de la planta por
medio de molienda en húmedo a temperatura ambiente, tiene una menor
viscosidad de retroceso de acuerdo a lo juzgado por la
viscoamilografía llevada a cabo de acuerdo al protocolo definido en
la reivindicación 7 de las reivindicaciones anexas comparado con el
almidón extraído de una planta inalterada, o bien genéticamente
idéntica; y una planta (especialmente una planta de patata) que
contienen almidón el cual, cuando es extraído de la planta por medio
de molienda en húmedo a temperatura ambiente, tiene un contenido
elevado de amilosa de acuerdo a lo juzgado por el ensayo
iodométrico de acuerdo con el método de Morrison & Laignelet
1983, (citado anteriormente) comparado con el almidón extraído de
una planta inalterada, o bien genéticamente idéntica. La invención
también provee almidón que tiene propiedades tales como las
mencionadas anteriormente.
En particular la invención provee un almidón el
cual, una vez extraído de una planta de patata por medio de
molienda en húmedo a temperatura ambiente, tiene una o más de las
siguientes propiedades, de acuerdo a lo juzgado por el análisis con
el viscoamilógrafo llevado a cabo de acuerdo con las condiciones
definidas más abajo: temperatura de inicio de desarrollo eh la
viscosidad en el rango entre 70-95°C
(preferiblemente 75-95°C); viscosidad pico en el
rango entre 500-12 unidades numéricas de agitación;
viscosidad de adhesión en el rango entre 214-413
unidades numéricas de agitación; viscosidad de retroceso en el
rango entre 450-618 ó 14-192
unidades numéricas de agitación; o no muestra un incremento
significativo en la viscosidad durante la viscoamilografía. Las
viscosidades pico, de adhesión y de retroceso se definen más abajo.
La temperatura de inicio de desarrollo de la viscosidad es la
temperatura a la cual existe un repentino incremento marcado en la
viscosidad a partir de niveles de línea base durante la
viscoamilografía, y es un término conocido por aquellos capacitados
en el arte.
En otras modalidades particulares, la inversión
provee almidón que ya extraído de una planta de patata por medio de
molienda en húmedo a temperatura ambiente, tiene una viscosidad pico
en el rango entre 200-500 SNUs y una viscosidad de
retroceso en el rango entre dos entre 275-618 SNUs
de acuerdo a lo juzgado por la viscoamilografía según el protocolo
definido más abajo; y almidón que una vez extraído de una planta de
patata por medio de molienda en húmedo a temperatura ambiente tiene
una viscosidad que no disminuye entre el inicio de la fase de
calentamiento (etapa 2) y el inicio de la fase final de
sostenimiento (etapa 5) y tiene una viscosidad de retroceso de 303
SNUs o menor de acuerdo a lo juzgado por la viscoamilografía según
el protocolo definido más abajo.
Para los propósitos de la presente invención, se
entiende que las condiciones de la viscoamilografía corresponden al
análisis de una suspensión acuosa al 10% (p/p) de almidón a presión
atmosférica, utilizando un Newport Scientific Rapid Visco Analyzer
(etapa 2), manteniendo a 95°C durante 15 minutos (etapa 3),
enfriando desde 95 hasta 50°C a una velocidad de 1,5°C por minuto
(etapa 4), y luego mantener a 50°C durante 15 minutos (etapa 5). La
velocidad pico se puede defmir para los propósitos presentes como
la viscosidad máxima lograda durante la fase de calentamiento
(etapa 2) o la fase de sostenimiento (etapa 3) de la
viscoamilografía. La viscosidad de adhesión se puede definir como
la viscosidad lograda por las suspensiones de almidón al final de la
fase de sostenimiento (etapa 3) de la viscoamilografía. La
viscosidad de retroceso se puede definir como la viscosidad de la
suspensión de almidón al final de la etapa 5 de la
viscoamilografía.
Aún en otro aspecto la invención provee almidón
de una planta de patata que tiene un contenido aparente de amilosa
(% p/p) de al menos 35%, de acuerdo a lo citado por el análisis
iodométrico según el método descrito por Morrison & Laignelet
(1983, J. Cereal Science 1, 9-20). Preferiblemente,
el almidón tendrá un contenido de amilosa al menos del 40%, m 3s
preferiblemente al menos del 50%, y lo más preferiblemente al menos
del 66%. El almidón obtenido directamente a partir de una planta de
patata y que tiene tales propiedades no ha sido producido hasta
ahora. En realidad, como resultado de la presente invención, es
posible generar ahora un almidón de patata in vivo que tiene
algunas propiedades análogas a las de los almidones de amilosa muy
alta (por ejemplo Hylon 7) que se puede obtener del maíz.
Los almidones con altos contenidos de amilosa
(al menos 35%) encuentran aplicación comercial, entre otras
razones, ya que el componente de amilosa del almidón se reasocia más
fuerte y rápidamente que el componente de amilopectina durante los
procesos de retrogradación. Esto puede resultar, por ejemplo, en
pastas con viscosidades altas, en geles de mayor cohesión, o en
películas de mayor resistencia para almidones con alto contenido de
amilosa (al menos 35%) en comparación con contenidos normales de
amilosa (menores al 35%). Alternativamente, se pueden obtener los
almidones con contenidos muy altos de amilosa, de tal manera que la
estructura del gránulo se preserve sustancialmente durante el
calentamiento, resultando en suspensiones de almidón que no
demuestran un incremento sustancial en la viscosidad durante la
cocción (esto es, no existe un incremento significativo en la
viscosidad durante las condiciones de la viscoamilografía definidas
anteriormente). Tales almidones típicamente exhiben un incremento
de la viscosidad menor al 10% (preferiblemente menor al 5%) durante
la viscoamilografía bajo las condiciones definidas
anteriormente.
En el comercio, estas valiosas propiedades se
obtienen actualmente a partir de almidones de alto contenido de
amilosa derivados de planta de maíz. Sería de valor comercial tener
una fuente alternativa de almidones con alto contenido de amilosa a
partir de la patata ya quia otras características tales como el
tamaño de gránulo, propiedades organolépticas y cualidades
texturales pueden diferenciar los desempeños de almidones con alto
contenido de amilosa de las plantas de maíz y de patata.
Por lo tanto, este almidón con alto contenido de
amilosa obtenido a partir del método de la presente invención puede
encontrar aplicación en muchos campos tecnológicos diferentes, que
pueden ser categorizados en forma amplia en dos grupos: productos
alimenticios y procesamiento; y aplicaciones "industriales".
Bajo el encabezado de productos alimenticios, los nuevos almidones
de la presente invención pueden encontrar aplicación como, por
ejemplo, películas, barreras, recubrimientos o agentes de
gelificación. En general, los almidones con alto contenido de
amilosa absorben menos grasa durante el fritado que los almidones
con bajo contenido de amilosa, de tal manera que los almidones con
alto contenido de amilosa de la invención pueden ser utilizados
convenientemente en la preparación de productos fritos bajos en
grasa (por ejemplo, patatas fritas y similares). Los nuevos
almidones se pueden emplear también convenientemente en la
preparación de golosinas y en almidones granulados y
"resistentes" a la retrogradación. Un almidón
"resistentes" es un almidón que es resistente a la digestión
por \alpha-amilasa. Por lo tanto, un almidón
resistente no es digerido por las \alpha-amilasas
presentes en el intestino delgado humano, sino que pasa al colon
donde exhibe propiedades similares a las de la fibra dietética
soluble e insoluble. El almidón resistente es por lo tanto muy
benéfico en los productos alimenticios debido a su bajo contenido
calórico y a su alto contenido de fibra dietética. El almidón
resistente se forma por medio de la retrogradación (semejante a
recristalización) de la amilosa de los geles de almidón. Tale
retrogradación se inhibe por medio de la amilopectina. Por lo
tanto, los almidones con alto contenido de amilosa de la presente
invención son excelentes materiales de partida para la preparación
de almidón resistente. Los métodos adecuados para la preparación de
almidón resistente son conocidos por aquellos capacitados en el arte
e incluyen, por ejemplo, aquellos descritos en las patentes
estadounidenses Nos. 5.05 1.271 y 5.281.276. Convenientemente, los
almidones resistentes proveídos por la presente invención contienen
al menos un 5% de fibra dietética total, de acuerdo a lo juzgado
por el método de Prosky y colaboradores, (1985 J. Assoc. Off. Anal.
Chem. 68, 677), mencionado en la patente estadounidense No.
5.281.276.
Bajo el título de aplicaciones
"industriales", se pueden emplear provechosamente los nuevos
almidones de la invención, por ejemplo, en adhesivos para
corrugados, en productos biodegradables tales como los empaques
tipo loose fill y formas de espuma, y en la producción de fibras de
vidrio y textiles.
Aquellos capacitados en el arte apreciarán que
los nuevos almidones de la invención, si se desea, pueden ser
sometidos in vitro a una modificación enzimática, física y/o
química convencional, tal como el entrelazamiento, la introducción
de grupos hidrófobos (por ejemplo ácido octenil succínico, ácido
dodecil succínico), o derivatización (por ejemplo por medio de
esterificación o de eterificación).
La invención provee almidones con alto contenido
de amilosa (35% o más) que pueden generar viscosidades de pasta
superiores a aquellas obtenidas a partir de almidones con alto
contenido de amilosa de plantas de maíz después de procesamiento a
temperaturas por debajo de 100°C. Esto provee la ventaja de
tratamientos de gelatinización y adhesión del almidón en forma más
económica por medio del uso de temperaturas de procesamiento más
bajas que las actualmente requeridas para almidones con alto
contenido de amilosa a partir de plantas de maíz.
Se describirá ahora adicionalmente la invención
por medio de un ejemplo ilustrativo y con referencia a los dibujos,
de los cuales:
La Figura 1 muestra una viscoamilografía típica
para una suspensión al 10% p/p de almidón de patata;
La Figura 2 muestra viscoamilografías para
suspensiones al 10% de almidón de diferentes variedades de
maíz;
La Figura 3 es una representación esquemática de
una estrategia de clonación utilizada por los presentes
inventores;
La Figura 4a muestra el alineamiento de
aminoácidos de la porción C-terminal de isoformas de
la enzima para ramificación del almidón a partir de diferentes
fuentes: los residuos de aminoácido que hacen juego con la
secuencia de consenso están sombreados;
La Figura 4b muestra el alineamiento de las
secuencias de ADN de diferentes isoformas de la enzima para
ramificación del almidón que codifican a una secuencia conservada de
aminoácidos;
La Figura 5 muestra la secuencia de ADN (Seq ID
No. 14) y la secuencia predicha de aminoácidos (Seq ID No. 15) de
un clon de ADNc de la SBE clase A de patata de longitud completa
obtenido por PCR;
La Figura 6 muestra una comparación de la parte
más altamente conservada de las secuencias de aminoácidos de las
moléculas de SBE clase A (la secuencia más alta) y clase B (la
secuencia inferior) de patata;
La Figura 7 muestra una comparación de la
secuencia de aminoácidos de las moléculas de SBE clase A de patata
(la secuencia más alta) y clase A de guisante (la secuencia
inferior) de longitud completa;
La Figura 8 muestra un alineamiento de ADN de
diferentes clones de la SBE clase A de patata de longitud completa
obtenido por los inventores;
La Figura 9 muestra la secuencia de ADN de un
clon de la SBE clase A de patata determinada por medio de
secuenciación directa de productos PCR, junto con la secuencia
predicha de aminoácidos;
La Figura 10 es una alineación múltiple de ADN
de diferentes clones A de la SBE de patata de longitud completa
obtenida por los inventores;
La Figura 11 es una ilustración esquemática del
plásmido pSJ64;
La Figura 12 muestra la secuencia de ADN y la
secuencia predicha de aminc ácidos del clon de la SBE clase A de
patata de longitud completa como está presente en el plásmido pSJ90;
y
La Figura 13 muestra las viscoamilografías para
suspensiones al 10% p/p de almidón de diferentes plantas
transgénicas de patata elaboradas por medio del aspecto relevante el
método la invención.
La estrategia para la donación de la segunda
forma de la enzima para ramificación del almidón a partir de la
patata es mostrada en la Figura 3. Las flechas pequeñas representan
a los iniciadores utilizados por los inventores en los protocolos
para la PCR y RACE. El tamaño aproximado de los fragmentos aislados
se indica por medio de los numerales al lado derecho de la Figura.
A manera de explicación, una comparación de las secuencias de
aminoácidos de diferentes enzimas clonadas para ramificación del
almidón (SBE) de la planta de maíz (clase A), de guisante (clase
A), de maíz (clase B), de arroz (clase B) y de patata (clase B), así
como la enzima para ramificación de glicógeno humano, permitió a
los inventores identificar una región en el tercio del carboxilo
terminal de la proteína que está casi completamente conservada
(GYLNFMGNEFGHPEWIDFPR) (Figura 4a). Una alineación múltiple de las
secuencias de ADN (humano, clase A de guisante, clase B de patata,
clase B de maíz, clase A de maíz y clase B de arroz,
respectivamente) correspondiente a esta región es mostrada en la
Figura 4b y fue utilizada para diseñar un oligo que potencialmente
hibridaría a todas las enzimas conocidas para ramificación del
almidón de la planta:
AATTT(C/T)ATGGGIAA(C/T)GA(A/G)TT(C/T)GG
(Seq ID No. 20).
El aislamiento inicial de un clon parcial de
ADNc de la SBE clase A de patata se hizo a partir de una biblioteca
amplificada de ADNc de tubérculo de patata en el vector \lambdaZap
(Stratagene). Se utilizó como molde medio \muL de una biblioteca
de ADNc de patata (título 2,3 x 10^{9} pfu/mL) en una reacción de
50 \muL que contenía 100 pmol de un iniciador POTSBE degenerado 16
veces y 25 pmol de un iniciador T7 (presente en el vector
\lambdaZap 3' a las secuencias de ADNc - ver Figura 3), dNTPs 100
\muM. 2,5 U Taq polimerasa y el amortiguador suministrado con la
Taq polimerasa (Stratagene). Todos los componentes excepto la
enzima fueron añadidos a un tubo de microcentrífuga de 0,5 mL,
cubierto con aceite mineral e incubado a 94°C durante 7 minutos y
luego mantenido a 55ºC, al mismo tiempo que se añadía la Taq
polimerasa y se mezclaba por pipeteo. Se llevó a cabo entonces la
PCR incubando durante 1 min a 94°C, 1 min a 58°C y 3 min a 72°C,
durante 35 ciclos. Se extrajeron los productos de la PCR con
fenol/cloroformo, se precipitó con etanol y se resuspendió en TE pH
8,0 antes de la clonación dentro director de clonación T/A pT7BlueR
(Invitrogen).
Se amplificaron varios fragmentos entre 600 y
1300 pb. Estos fueron aislados a partir de un gel de agarosa y
clonados dentro del vector de clonación T/A pT7BlueR. El mapeo de
restricción de 24 clones seleccionados en forma aleatoria mostró
que ellos pertenecían a varios grupos diferentes (con base en el
tamaño y la presencia/ausencia de sitios de restricción).
Inicialmente se escogieron cuatro clones para secuenciación. De
estos cuatro, se encontró que dos correspondían a la secuencia
conocida de la SBE clase B de patata, sin embargo los otros dos,
aunque homólogos, diferían significativamente y eran más similares
a la secuencia de la SBE clase A de guisante, sugiriendo que ellos
pertenecían a la familia clase A de enzimas de ramificación (Burton
y colaboradores, 1995, The Plant Journal, citado anteriormente).
Los dos últimos clones (\sim 800 pb) túeron secuenciados
completamente. Ambos contenían en el extremo 5' la secuencia
correspondiente al oligonucleótido degenerado utilizado en la PCR y
tenía un marco de lectura abierta predicho de 192 aminoácidos. La
secuencia deducida de aminoácidos era altamente homologa con aquella
de la SBE clase A de guisante.
El fragmento de ADNc derivado de la PCR de
\sim 800 pb (correspondiente a los nucleótidos 2281 a 3076 de la
secuencia psbe2con.seq mostrada en la Figura 8) fue utilizado como
sonda para seleccionar la biblioteca de ADNc de tubérculo de
patata. De ciento ochenta mil placas, se obtuvieron siete positivas
en la selección primaria. El análisis por PCR mostró que cinco de
estos clones eran más pequeños que el clon original de ADNc de 800
pb, de modo que esto no fueron analizados más. Los otros dos clones
(designados como 3.2.1 y 3.1.1) eran aproximadamente de 1200 y 1500
pb en longitud, respectivamente. Estos fueron secuenciados a partir
de sus extremos 5' y la secuencia combinada de consenso alineada
con la secuencia de los clones generados por la PCR. El clon de
ADNc 3.2.1 fue cortado del vector fago y se preparó un ADN de
plásmido y se secuenció completamente el inserto. Varios de los
intentos para obtener clones mayores a partir de la biblioteca
fueron infructuosos, por lo tanto se obtuvieron clones que contenían
el extremo 5' del gen de longitud completa utilizando RACE
(amplificación rápida de extremos de ADNc).
RACE fue realizado esencialmente de acuerdo con
Frohman (1992 Amplifications 11-15). Se calentaron
dos \mug de ARN total de tubérculos de patata madura a 65°C
durante 5 min y se los enfrió rápidamente sobre hielo. Se
trascribió luego en forma inversa al ARN en un volumen de reacción
de 20 \muL durante 1 hora a 37°C utilizando transcriptasa inversa
M-MLV de BRL y amortiguador con DTT 1 mM. dNTPs 1
mM, 1 U/\muL de RNAsin (Promega) y 500 pmol de hexámeros
aleatorios (Pharmacia) como iniciador. Se removió el exceso de
iniciadores sobre una columna Centricon 100 y se recuperó el ADNc y
se lo precipitó con isopropanol, al ADNc se le colocó una cola de
poli A en un volumen de 20 \mul utilizando 10 unidades de
transferasa terminal (BRL), 200 \muM de dATP durante 10 min a
37°C, seguido por 5 min a 65°C. Se dividió luego la reacción hasta
0,5 ml con TE pH 8 y se la almacenó a 4°C como la reserva de ADNc,
se aislaron los clones de ADNc por medio de amplificación por PCR
utilizando los iniciadores R_{0}R_{1}dT_{17}, R_{0} y
POTSBE24. La PCR se realizó en 50 \muL utilizando una técnica de
arranque en caliente: se calentaron 10 \muL de la reserva de ADNc
a 94°C en agua durante 5 min con 25 pmol de POTSBE24, 25 pmol de
R_{0} y 2,5 pmol de R_{0}R_{1}dT_{17} y se enfrió hasta
75°C. Se añadieron cinco \muL de amortiguador 10 x PCR
(Stratagene), dNTPs 200 \muM y 1,25 unidades de Taq polimerasa,
se calentó la mezcla a 45°C durante 2 min y a 72°C durante 40 min
seguido por 35 ciclos de 94°C durante 45 segundos, 50°C durante 25
segundos, 72°C durante 1,5 min y una incubación final a 72°C
durante 10 min. Se separaron los productos PCR por medio de
electroforesis sobre geles de agarosa al 1% con bajo punto de fusión
y la mancha cubriendo los fragmentos en el rango de
600-800 pb fue cortada y utilizada en una segunda
amplificación por PCR con 25 pmol de R_{1} e iniciadores POTSBE25
en un volumen de reacción de 50 \muL (28 ciclos de 94°C durante 1
min, 50°C durante 1 min, 72°C durante 2 min). Se purificaron los
productos por medio de extracción con cloroformo y se los clonó
dentro del pT7 Blue. Se utilizó PCR para seleccionar las colonias y
se secuenciaron los clones más largos.
La primera vuelta de RACE únicamente extendió la
longitud de la secuencia de la SBE aproximadamente en 100 bases,
por lo cual se construyó una nueva biblioteca de ADNc con cola A
utilizando el oligo POTSBE24 específico de la SBE clase A (10 pmol)
en un intento por recobrar productos RACE más largos. La primera y
segunda vueltas de las reacciones PCR fueron realizadas utilizando
nuevos iniciadores de la SBE clase A (POTSBE 28 y 29
respectivamente) derivados de los nuevos datos de la secuencia. Las
condiciones fueron las mismas de antes excepto porque la etapa de
alargamiento en la primera PCR fue de 3 min y la segunda PCR
consistió de 28 ciclos a 94°C durante 45 segundos, 55°C durante 25
segundos y 72°C durante 1 min 45 segundos.
Se aislaron los clones en el rango de tamaño
entre 400 pb y 1.4 kb y se los secuenció. La secuencia combinada de
los productos RACE más largos y los clones de ADNc predijeron un gen
de longitud completa de aproximadamente 3150 nucleótidos, excluida
la cola poli(A) (psbe2con.seq en la Fig. 8).
Ya que la secuencia de la mitad 5' del gen fue
compilada a partir de la secuencia de varios productos RACE
generados utilizando Taq polimerasa, fue posible que la secuencia
compilada no representara a aquella de una especie única de ARNm
y/o tenía cambios en la secuencia de nucleótidos. Las 1600 bases 5'
del gen fueron por lo tanto aisladas nuevamente por medio de la PCR
utilizando Ultma, una ADN polimerasa termoestable que, debido a que
posee actividad de exonucleasa 3'-5', tiene una
menor rata de error comparada con la Taq polimerasa. Varios
productos PCR fueron donados y se mapeo la restricción y se
encontró que diferían en el número de sitios Hind III, Ssp I, y
EcoR I. Estas diferencias no representan productos de la PCR ya que
ellas fueron observadas en clones que fueron obtenidos a partir de
reacciones PCR independientes (datos no mostrados) e indican que
existen varias formas del gen que codifica para la SBE clase A
transcritas en tubérculos de patata.
Con el propósito de garantizar que la secuencia
del clon de ADNc de longitud completa se derivara de una especie
única de ARNm fue necesario por lo tanto someter a PCR al gen
completo en una pieza, se preparó el ADNc de acuerdo con el
protocolo para RACE excepto porque se utilizó el adaptador oligo
R_{0}R_{1}dT_{17} (5 pmol) como iniciador y después de la
síntesis se diluyó la reacción hasta 200 \muL con TE pH 8 y se la
almacenó a 4°C. Se utilizaron dos \muL del ADNc en una reacción
PCR de 50 \muL utilizando 25 pmoles de los iniciadores
específicos de la SBE clase A, P13ER1 y PBERT (ver más abajo), y
treinta ciclos de 94° durante 1 min, 60°C durante 1 min y 72°C
durante 3 min. Si se utilizó Taq polimerasa, se donaron los
productos PCR dentro de pT7Blue mientras que si se utilizó Ultma
polimerasa, se purificaron los productos PCR por medio de extracción
con cloroformo, precipitación con etanol y sometidos a la acción de
la quinasa en un volumen de 20 \muL (y luego se los clonó dentro
de pBSSK IIP que había sido cortado con EcoRV y desfosforilado). Se
aislaron al menos cuatro clases de ADNc, que nuevamente diferían en
la presencia o ausencia de sitios Hind III, Ssp I y EcoRI. Tres de
estos clones fueron secuenciados completamente, aunque un clon no
pudo ser aislado en cantidad suficiente para la secuenciación.
La secuencia de uno de los clones (número 19) se
muestra la Figura 5. El primer codón de metionina (iniciación)
inicia un marco corto de lectura abierta (ORF) de 7 aminoácidos que
está por fuera del marco con el siguiente ORF predicho de 882
aminoácidos que tiene una masa molecular (Mr) aproximadamente de
100 Kd. Los nucleótidos 6-2996 corresponden a la
secuencia de la SBE - el resto de la secuencia mostrada se deriva
del vector. La Figura 6 muestra una comparación de la parte más
altamente conservada de la secuencia de aminoácidos de la SBE clase
A de patata (residuos 180-871, fila superior) y de
la SBE clase B de patata (fila inferior, residuos
98-792); la fila del medio indica el grado de
similitud, siendo los residuos idénticos simbolizados con letra
común, los cambios conservadores por dos puntos y los cambios
neutros por un único punto. Los guiones indican vacíos introducidos
para optimizar la alineación. La proteína de la SBE clase A tiene
44% de identidad sobre la longitud completa con la SBE clase B de
patata, y 56% de identidad con esta en el dominio central
conservado (Figura 6), de acuerdo a lo juzgado por el programa
"Mesalign" (DNASTAR). Sin embargo, la Figura 7 muestra una
comparación entre la SBE clase A de patata (fila superior, residuos
1-873) y la SBE clase A de guisante (fila inferior,
residuos 1-861), a partir de la cual se puede
observar que el gen clonado de la patata es más homólogo a la enzima
clase A de guisante, donde la identidad está casi por encima del
70% de la longitud completa, y ésta se incrementa hasta el 83%
sobre la región central conservada (comenzando en IPPP
aproximadamente en la posición 170). Es claro a partir de éste
análisis que este gen clonado que codifica para la SBE de patata
pertenece a la familia clase A de los genes que codifican para la
SBE.
Un cultivo de E. coli, que contiene al
plásmido pSJ78 (que dirige la expresión de un gen de longitud
completa que codifica para la SBE clase A de patata), ha sido
depositado (el 3 de enero de 1996) bajo los términos del Tratado de
Budapest en The National Collections of Industrial and Marine
Bacteria Limited (23 St Machar Drive, Aberdeen, AB2 1RY, Reino
Unido), bajo el número de acceso NCIMB 40781. En plásmido pSJ78 es
equivalente al clon 19 descrito anteriormente. Representa un ADNc
de longitud completa de poli A de la SBE de extremo romo ligado
dentro del vector pBSSKIIP.
El análisis de la secuencia de otros dos genes
que codifican para la SBE clase A de longitud completa mostró que
ellos contenían mutaciones del marco de lectura y que por 1D tanto
son incapaces de codificar proteínas de longitud completa y
realmente son incapaces de complementar la deficiencia de la enzima
de ramificación en el mutante KV832 (que se describe más abajo). En
la Figura 8 se muestra una alineación de las secuencias de ADN de
longitud completa: "10con.seq" (Seq ID No. 12),
"19con.seq" (Seq ID No. 14) y "11con.seq" (Seq ID No. 13)
representan la secuencia de los clones 10, 19 y 11 de longitud
completa obtenidos por medio de PCR utilizando los iniciadores PBER1
y PBERT (ver más abajo), mientras que "psbe2con.seq" (Seq ID
No. 18) representa la secuencia de consenso de los clones RACE y
del clon 3.2.1 de ADNc. Aquellos nucleótidos que difieren de la
secuencia total de consenso (no mostrada) están sombreados. Los
guiones indican vacíos introducidos para optimizar la alineación.
Aparte de las mutaciones del marco de lectura estos clones son
altamente homólogos. Debe observarse que la secuencia 5' de
psbe2con es más larga debido a que este es el producto RACE más
largo y también contiene varios cambios comparado con los otros
clones. El codón de metionina secuencia arriba está aún presente en
este clon pero el ORF secuencia arriba se acorta a sólo 3
aminoácidos y además existe una supresión en la base 10 en la
secuencia líder 5' no traducida.
\newpage
La otra área significativa de variación está en
la región carboxilo terminal de la región de codificación de la
proteína. Un examen más cercano de esta área revela una estructura
de repetición trinucleótida GAA que varía en longitud entre los
cuatro clones. Estas son características típicas de una región
microsatélite de repetición. El clon más divergente es el #11 que
tiene únicamente un triplete GAA mientras que el clon 19 tiene once
repeticiones perfectas y los otros dos clones tienen cinco y siete
repeticiones GAA. Todas estas supresiones mantienen al ORF pero
cambia el número de residuos de ácido glutámico en el carboxilo
terminal de la proteína.
La mayoría de las otras diferencias entre los
clones son cambios sencillos de base. Es muy posible que algunos de
estos sean errores de la PCR. Para dirimir esta cuestión se llevó a
cabo una secuenciación directa de fragmentos de la PCR amplificados
a partir de la primera cadena de ADNc. La Figura 9 demuestra la
secuencia de ADN, y la secuencia predicha de aminoácidos, obtenida
por dicha secuenciación directa. Ciertos sitios de restricción
están también marcados. Los nucleótidos que podrían ser asignados
en forma no ambigua se indican utilizando notación IUPAC estándar y,
donde esta incertidumbre afecta la secuencia predicha de
aminoácidos, se utiliza un signo de interrogación. La secuencia en
el extremo 5' y en el extremo 3' del gen no podía ser determinada
debido a la heterogeneidad observada en los diferentes genes
clonados en estas regiones (ver párrafo anterior). Sin embargo esto
puede ser tomado como evidencia directa de que estas diferencias son
reales y no son productos de la PCR o de clonación.
No existe ninguna evidencia el absoluto para las
mutaciones del marco de lectura en la secuencia derivada de la PCR
y parecería que estas mutaciones son producto de los procesos de
clonación, que resultan de la presión de selección negativa en E.
coli. Esto está soportado por el hecho de que probó ser
extremadamente difícil clonar los productos intactos de la PCR de
longitud completa ya que se observaron muchas supresiones grandes y
los clones de longitud completa obtenidos fueron todos clonados en
una orientación (lejos del promotor LacZ), sugiriendo quizás que la
expresión del gen es tóxica para las células. Las dificultades de
este estilo pueden haber sido las responsables, al menos en parte,
para las fallas previas de otros investigadores para obtener la
presente invención.
Se observa una comparación de todas las
secuencias de longitud completa en la Figura 10. Además de los
clones 10, 11 y 19 se observan las secuencias de un producto
BGl II - Xho I donado directamente dentro del vector
de expresión QE32 ("86CON.SEQ", Seq ID No.16) y la secuencia de
consenso de los productos PCR secuenciados directamente
("persbe2con.seq". Seq ID No. 17). Aquellos nucleótidos que
difieren de la secuencia de consenso (no mostrada) están sombreados.
Los guiones indican vacíos introducidos para optimizar la
alineación. Existen 11 diferencias de nucleótidos predichas que
están presentes en la población de ARNm, lo cual se indica por medio
de asteriscos por encima y por debajo de la secuencia. Las otras
diferencias son probablemente productos PCR o posibles errores de
secuenciación.
Para determinar si el gen que codifican para la
SBE aislada codifica a una proteína activa, esto es, una que tenga
actividad como enzima de ramificación, se llevó a tubo una prueba de
complementación en la cepa KV832 de E. coli. Esta cepa es
incapaz de elaborar glicógeno bacterial ya que el gen que codifica
para la enzima de ramificación del glicógeno ha sido suprimida (Keil
y colaboradores, 1987 Mol. Gen. Genet. 207,
294-301). Cuando se cultivan células de tipo natural
en presencia de glucosa, ellas sintetizan glicógeno (un polímero de
glucosa altamente ramificado) que se colorea de color marrón con
yodo, mientras que las células KV832 elaboran únicamente un polímero
de glucosa de cadena lineal que se colorea de color verde azulado
con yodo. Para determinar si el gen clonado que codifica para la
SBE podría restablecer la habilidad de las células KV832 para
elaborar un polímero ramificado, se construyó y utilizó el clon
pSJ90 (Seq ID No. 19) de la siguiente forma. La construcción es un
fragmento sustancialmente de longitud completa, derivado de la PCR
(elaborada utilizando a los iniciadores PBE 2B y PBE 2X, que se
detalla más abajo), que fue cortado con Bgl II y Xho
I y clonado dentro de los sitios BamH I/Sal I del
vector de expresión pQE32. (Qiagen) etiquetado con His. Este clon,
pSJ86, fue secuenciado y se encontró que tiene una mutación en el
marco de lectura de dos bases en la mitad 5' del gen. Este marco de
lectura fue removido por digestión con Nsi I y con
SnaB I y reemplazado con el fragmento correspondiente de un
clon PCR generado con Taq para producir el plásmido pSJ90
(secuencia mostrada en la Figura 12; los primeros 10 aminoácidos se
derivan del vector de expresión). El polipéptido codificado por
pSJ90 sería predicho por corresponder a los aminoácidos
46-882 de la secuencia completa de codificación de
la SBE. La construcción pSJ90 fue transformada dentro del las
células KV832 deficientes en la enzima de ramificación y se
cultivaron los transformantes sobre medio PYG sólido
(KH_{2}PO_{4} al 0,85%, K_{2}HPO_{4} al 1,1%, extracto de
levadura al 0,6%) que contenía glucosa al 1,0%. Para analizar la
complementación, se raspó un bucle de células y se lo resuspendió
en 150 \mul de agua, a la cual se le añadieron 15 \mul de
solución de Lugol (2 g de KI y 1 g de I_{2} por 300 ml de agua).
Se encontró que las células KV832 transformadas con el fragmento de
la SBE de patata se colorearon ahora de un color
amarillo-marrón con yodo mientras que las células
de control que contenían únicamente al vector pQE32 continuaron
coloreándose de color verde azulado.
Se recogieron colonias sencillas de KV832, que
contenían uno de les plásmidos pQE32, pAGCR1 o pSJ90, en 50 ml de
medio 2xYT que contenía carbencilina, kanamicina y estreptomicina e
según corresponda (100, 50 y 25 mg/L, respectivamente) en un frasco
de 250 ml y se las cultivó durante 5 horas, con agitación, a 37°C.
Se añadió luego IPTG hasta una concentración final de 1 mM para
inducir expresión y se incubaron adicionalmente los frascos durante
la noche a 25°C. Se cosecharon las células por medio de
centrifugación y se las resuspendió en amortiguador de fosfato de
sodio 50 mM (pH 8,0), que contenía NaCl 300 mM, 1 mg/ml de lisozima
y PMSF 1 mM y se dejó sobre hielo durante 1 hora. Se sonicaron
luego los lisados celulares (3 pulsos de 10 segundos con una
potencia de 40% utilizando una microsonda) y se aclaró por medio de
centrifugación a 12.000 g durante 10 minutos a 4°C. Se concentraron
los lisados aclarados aproximadamente 10 veces en una unidad de
filtración Centricon^{TM} 30. Se analizaron duplicados de las
muestras de 10 \mul del extracto resultante por la actividad de
la SBE por el método de estimulación de la fcsforilación, como se
describe en la Solicitud Internacional de Patente No.
PCT/GB95/00634. En resumen, la mezcla de reacción del ensayo
estándar (0,2 ml) fue de amortiguador de ácido
2-(N-morfolino) etanosulfónico (MES) 200 mM pH 6,5,
que contenía 100nCi de
glucosa-1-fosfato con ^{14}C 50
mM, 0,05 mg de fosforilasa A de conejo, y lisado de E. coli.
Se incubó la mezcla de reacción durante 60 minutos a 30°C y se
terminó la reacción y se precipitó el polímero glucano por medio de
,a adición de 1 ml de metanol al 75% (v/v), hidróxido de potasio al
1% (p/v) y luego 0,1 ml de glicógeno (10 mg/ml). Los resultados se
presentan a continuación:
La actividad de la SBE clase A de patata está
7-8 veces por encima desniveles base. Se concluyó
por lo tanto que el gen que codifica para la SBE clase A de patata
fue capaz de complementar la mutación de la BE en el ensayo de
estimulación de la fosforilación y que el gen clonado en realidad
codifica para una proteína con actividad de enzima de
ramificación.
Se utilizaron los siguientes oligonucleótidos
sintéticos (Seq ID Nos. 1-11 respectivamente):
Un fragmento de Sac I - Xho I de
1200 pb, que codifica aproximadamente la mitad de -COOH de la SBE
clase A de patata (aislado del clon rescatado 3.2.1 de \lambdaZap)
fue clonado dentro de los sitios Sac I - Sal I del
vector pSJ29 de transformación de una planta para crear al plásmido
pSJ64, que se ilustra esquemáticamente en la Figura 11. En la
figura, la línea negra representa la secuencia de ADN. La línea
discontinua representa la columna vertebral del plásmido bacteriano
(que contiene el origen de replicación y el marcador de selección
bacteriana), que no se muestra completamente. Los triángulos
rellenos sobre la línea denotan los bordes del T-ADN
(RB = borde derecho, LB = borde izquierdo). Los sitios de
restricción relevante se observan por encima y por debajo de la
línea, con las distancias aproximadas (en kilobases) entre los
sitios (marcadas por medio de un asterisco) dadas por los números
debajo de la línea. Las flechas más delgadas indican señales de
poliadenilación (pAnos = nopalina sintasa, pAg7 = gen 7 de
Agrobacterium), las flechas con espesor intermedio denotan regiones
que codifican proteína (SBE II = SBE clase A de patata. HYG = gen de
resistencia a la higromicina) y las flechas más gruesas representan
regiones promotoras (P-2x35 =
promotor doble 35S de CaMV, Pnos = promotor de nopalina sintasa). Por lo tanto, pSJ64 contenía al fragmento del gen que codifica para la SBE clase A en una orientación antisentido entre el promotor 2X 35S de CaMV y la señal de poliadenilación de la nopalina sintasa.
promotor doble 35S de CaMV, Pnos = promotor de nopalina sintasa). Por lo tanto, pSJ64 contenía al fragmento del gen que codifica para la SBE clase A en una orientación antisentido entre el promotor 2X 35S de CaMV y la señal de poliadenilación de la nopalina sintasa.
Para información, pSJ29 es un derivado del
vector binario pGPTV-HYG (Becker y colaboradores,
1992 Plant Molecular Biology 20, 1195-1197)
modificado de la siguiente manera: un fragmento aproximadamente de
750 pb (Sac I, T4 ADN polimerasa roma - Sal I) de pJIT60
(Guerineau y colaboradores, 1992 Plant Mol. Biol. 18,
815-818) que contenía al promotor duplicado 35S del
virus del mosaico de la coliflor (CaMV) (cepa
Cabb-JI, equivalente a las nucleótidos 7040 a 7376
duplicados secuencia arriba de 7040 a 7433, Frank y colaboradores,
1980 Cell 21, 285-294) fue donado dentro de los
sitios Hind III (polimerasa Klenow reparada) - Sal I
de pGPTV-HYG para crear pSJ29.
La transformación se llevó a cabo sobre dos
tipos de explantes de plantas de patata; o bien minitubérculos no
transformados de tipo natural (con el propósito de suministrar
transformantes sencillos que contienen a la construcción
antisentido clase A sola) o minitubérculos de tres líneas celulares
del tejido (que dieron origen a las plantas #12, #15, #17 y #18
indicadas era Tabla 1) que ya habían sido exitosamente
transformadas con la construcción antisentido clase B (SBE I) que
contenía al promotor 35S en tándem (para obtener plantas doblemente
transformadas, que contienen secuencias antisentido tanto para las
enzimas clase A cómo clase B).
Los detalles del método de transformación del
Agrobacterium, y del desarrollo de las plantas transformadas, se
encuentran en la Solicitud Internacional de Patente No. WC)
95/26407, excepto porque el medio utilizado contenía 3% de sacarosa
(no 1%) hasta la transferencia final y porque la incubación inicial
con Agrobacterium (cepa 3850) se llevó a cabo la oscuridad Los
transformantes que contenían la secuencia antisentido clase A se
seleccionaron por medio del desarrollo en medio que contenía 15
mg/L de higromicina (la construcción antisentido clase A se
comprende al gen HYG, esto es, higromicina fosfotransferasa).
La transformación fue confirmada en todos los
casos por medio de la producción de un fragmento de ADN del gen
antisentido después de PCR en presencia de iniciadores apropiados y
de un extracto crudo de ADN genómico de cada vástago
regenerado.
El almidón de las plantas fue extraído de la
siguiente manera: se homogenizaron tubérculos de patata en agua
durante 2 minutos de un mezclador Waring operando a alta velocidad.
Se lavó y filtró el homogenizado (inicialmente a través de un
filtro de 2 mm, luego a través de un filtró de 1 mm) utilizando
aproximadamente 4 litros de agua cada 100 gramos de tubérculos (6
extracciones). Se extrajeron finalmente los gránulos lavados de
almidón con acetona y se los secó al aire.
El almidón extraído de plantas de patata
transformadas individualmente (clase A/SBE II y clase B/SBE I
antisentido), o a partir de plantas de control no transformadas, fue
parcialmente caracterizado. Los resultados se observan en la Tabla
1. La tabla muestra la cantidad de actividad de la SBE
(unidades/gramo de tejido) en tubérculos de cada planta
transformada. La temperatura endotérmica pico (°C) de almidón
extraído de varias plantas se determinó por medio de DSC, y la
temperatura de inicio (°C) de la adhesión fue determinada por
referencia a una viscoamilografía ("RVA"), como se describe en
WO 95/26407. El perfil de la viscoamilografía fue la siguiente:
etapa 1 50°C durante 2 minutos; etapa 2 - incremento en la
temperatura desde 50°C hasta 95°C a una velocidad de 1,5°C por
minuto; etapa 3 - mantener a 95°C durante 15 minutos; etapa 4 -
enfriar desde 95°C hasta 50°C a una velocidad de 1,5°C por minuto;
y finalmente, etapa 5 - mantener a 50°C durante 15 minutos. La
Tabla 1 muestra las viscosidades de pico, de adhesión y de retroceso
en unidades numéricas de agitación (SNUs), que es una medida de la
cantidad de torque requerido para agitar las suspensiones. La
viscosidad de pico se puede definir para los propósitos presentes
como la viscosidad máxima alcanzada durante la fase de
calentamiento (etapa 2) o la fase de mantenimiento (etapa 3) de la
viscoamilografía. La viscosidad de retroceso se puede definir corro
la viscosidad de la suspensión de almidón al final de la etapa 5 de
la viscoamilografía.
Se llevó a cabo también una determinación del
contenido aparente de amilosa (% p/p), utilizando el método del
ensayo iodométrico de Morrison & Laignelet (1983 J. Cereal Sci.
1, 9-20). Los resultados (porcentaje aparente de
amilosa) se muestran en la Tabla 1. Las plantas de control
transformadas y no transformadas dieron lugar a almidones con
contenidos aparentes de amilosa en el rango de 29 \pm 3%.
Generalmente se obtuvieron valores similares
para el contenido de amilosa del almidón extraído de la mayoría de
las plantas individualmente transformadas que contenían la secuencia
antisentido clase A (SBE II). Sin embargo, algunas plantas (#152,
249) dieron lugar a un almidón que tenía un contenido aparente de
amilosa del 37-38%, notablemente superior a aquel
del valor de control. El almidón extraído de estas plantas tenía
temperaturas de inicio de adhesión marcadamente elevadas, y el
almidón de la planta 152 también exhibió una temperatura endoténnica
de pico elevada (el almidón de la planta 249 no fue analizado por
medio de DSC).
\newpage
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{ \cr}
\newpage
Debe observarse que, aún si otros transformantes
sencillos no proveyeran almidón con una proporción alterada de
amilosa/amilopectina, el almidón de tales plantas puede tener aún
diferentes propiedades con relación al almidón de plantas
convencionales (por ejemplo, diferente peso molecular promedio o
diferentes patrones de ramificación de la amilopectina), que pueden
ser útiles.
Las plantas transformantes dobles, que contienen
secuencias antisentido tanto para enzimas clase A cómo clase B,
tenían actividad de la SBE muy reducida (unidades/gm) comparadas con
las plantas no transformadas o con los transformantes sencillos
clase A antisentido al paréntesis (como se observa en la Tabla 1).
Además, ciertas de las plantas transformantes dobles que contenían
almidón tienen propiedades alteradas muy significativas. Por
ejemplo, el almidón extraído de las plantas # 201, 202, 208, 208a,
236 y 236a tenían proporciones de amilosa/amilopectina drásticamente
alteradas, hasta el grado de que la amilosa era de constituyente
principal del almidón de estas plantas. Las temperaturas de inicio
de la adhesión del almidón a partir de esas plantas tuvieron también
el incremento más grande (aproximadamente a
25-30°C). El almidón de plantas tales como la #150,
161, 212, 220 y 230a representaron un rango de intermedios, en los
que tal almidón mostró un incremento más modesto tanto en el
contenido de amilosa como en la temperatura de inicio de la adición.
Los resultados tenderían a sugerir que existe una correlación
general entre el % en contenido de amilosa y la temperatura de
inicio de la adhesión, que está de acuerdo con el comportamiento
conocido de los almidones de otras fuentes, notablemente del
maíz.
El marcado incremento en el contenido de amilosa
obtenido por medio de la inhibición de la SBE clase A sola,
comparado con la inhibición de la SBE clase B sola (ver
PCT/GB95/00634) puede sugerir que sería conveniente transformar
plantas primero con una construcción para suprimir la expresión de
la SBE clase A (probablemente, en la práctica, una construcción
antisentido), seleccionar aquellas plantas que dan lugar a un
almidón con las propiedades más alteradas, y luego transformar
nuevamente con una construcción para suprimir la expresión de la SBE
clase A (nuevamente, en la práctica, probablemente una construcción
antisentido), para maximizar el grado de modificación del
almidón.
Además de las temperaturas de inicio de la
adhesión, otras características del perfil de la viscoamilografía,
por ejemplo, para almidones de las plantas # 149, 150, 152, 161,
201, 236 y 236a mostraron diferencias significativas con los
almidones de las plantas de control, como se ilustra en la Figura
13. Con relación a la Figura 13, se observan varias trazas de
viscoamilografía. La leyenda es la siguiente: casilla sombreada -
control de almidón de patata normal (29,8% de contenido de amilosa);
círculo sombreado - almidón de la planta 149 (35,6% de amilosa);
triángulo sombreado, apuntando hacia arriba – planta 152 (37,5%);
triángulo sombreado, apuntando hacia abajo - planta 161 (40,9%);
diamante sombreado - planta 150 (53,1%); casilla no sombreada -
planta 236a (56,7%); círculo no sombreado - planta (60,4%);
triángulo no sombreado, apuntando hacia arriba – planta 201 (66,4%);
triángulo no sombreado, apuntando hacia abajo – almidón Hylon V,
del maíz (44,9% de amilosa). La línea delgada denota el perfil de
calentamiento.
Con un contenido creciente de amilosa, las
viscosidades pico durante el procesamiento a 95°C disminuyen, y la
gota en la viscosidad del pico hasta el final del período de
sostenimiento a 95°C generalmente también disminuye (en realidad,
para algunas de las muestras le almidón existe un incremento en la
viscosidad durante este período). Ambos resultados son indicativos
de una fragmentación de gránulo reducida, y por lo tanto de una
mayor estabilidad del gránulo durante la adhesión. Esta propiedad
no había estado antes disponible en el almidón de patata sin una
extensa modificación física o química previa. Para aplicaciones
donde es deseable una viscosidad máxima después del procesamiento a
95°C (esto es, correspondiente a la viscosidad después de 47 minutos
en la prueba del viscoamilógrafo), se seleccionaría el almidón de la
planta # 152 va que los almidones con contenidos de amilosa más
bajos (Controles, #149) y más altos (#161, #150) tienen viscosidades
más bajas después de este régimen de gelatinización y adhesión
(Figura 13 y Tabla 1). Se cree que la viscosidad en esta etapa se
determina por medio de una combinación del grado de hinchamiento del
granulo y la resistencia de los gránulos hinchados a la
fragmentación mecánica. Para cualquier comportamiento de viscosidad
deseado, alguien entrenado en el arte seleccionaría un almidón de
patata entre un rango que contenga diferentes contenidos amilosa
producidos de acuerdo con la invención llevado a cabo análisis
estándar de viscosidad adecuados.
Por el enfriamiento de las pastas desde 95°C
hasta 50°C, los almidones de patata de la mayoría de las plantas
transformadas de acuerdo con invención mostraron un incremento en la
viscosidad con el viscoamilógrafo como se esperaba por la
reasociación parcial de la amilosa. Todos los almidones de las
plantas #149, 152 y 161 mostraron viscosidades a 50
significativamente superiores a aquellas para los almidones de las
plantas de control (Figura 13 y Tabla 1). Esto contrasta con el
efecto de contenidos elevados de amilosa en almidones de plantas de
maíz (Figura 2) que muestran viscosidades muy bajas en los ensayos
con el viscoamilógrafo. De particular interés es el hecho de que,
para contenidos similares de amilosa, el almidón de la planta de
patata 150 (53% de amilosa) muestra una viscosidad marcadamente
superior comparado con el almidón Hylon 5 (44,9% de amilosa) como
se ilustra la Figura 13. Esto demuestra que se pueden obtener
propiedades útiles que requieren elevados niveles de amilosa (35% o
superior) por medio del procesamiento de almidones de plantas de
patata por debajo de 100°C, mientras que se requiere un
procesamiento con mayor intensidad de energía con el propósito de
generar propiedades útiles similares a partir de almidones con
mayor contenido de amilosa derivados de plantas de maíz.
La viscosidad final en la prueba con el
viscoamilógrafo (viscosidad de retroceso después de 92 minutos) es
mayor para el almidón de la planta # 161 (40,9% de amilosa) entre
aquéllos analizados (Figura 13 y Tabla 1). La disminución de las
viscosidades finales se obtiene para los almidones de la planta #
152 (37,5% amilosa), # 149 (35,6% de amilosa) y # 150 (53,1% de
amilosa). La viscosidad de retroceso se presenta cuando las
moléculas de amilosa, exudadas a partir del gránulo de almidón
durante la adhesión, comienzan a reasociarse por fuera del gránulo y
forman una sustancia viscosa tipo gel. Se cree que los valores de
viscosidad de retroceso de los almidones de plantas de patata
transgénicas representan un balance entre el contenido inherente de
amilosa de los almidones y la habilidad de la fracción de amilosa
para ser exudada del granulo durante la adhesión y por lo tanto
estar disponible para el proceso de reasociación lo cual resulta en
un incremento en la viscosidad. Para los almidones con bajo
contenido de amilosa, el incremento en el contenido de amilosa
tiende a hacer más disponible a la amilosa para la reasociación,
incrementando así la viscosidad de retroceso. Sin embargo, por
encima de un valor de umbral, se piensa que un mayor contenido de
amilosa inhibe el hinchamiento del gránulo, evitando así la
exudación de amilosa del gránulo de almidón y reduciendo la
cantidad de amilosa disponible para la reasociación. Esto está
soportado por resultados RVA obtenidos para los almidones de patata
de muy alto contenido amilosa observados en los perfiles del
viscoamilógrafo en la Figura 13. Para cualquier comportamiento de
viscosidad deseada después del retroceso o la retrogradación a
partir de cualquier temperatura deseada durante cualquier período de
tiempo deseado, alguien capacitado en el arte seleccionaría un
almidón de patata entre un rango que contiene diferentes contenidos
amilosa producidos de acuerdo con la invención llevando a cabo
análisis estándar de viscosidad.
Experimentos adicionales con almidón de las
plantas # 201 y 208 mostraron que éstas tenían un contenido
aparente de amilosa por encima del 62% (ver Tabla 1). Los estudios
de viscoamilografía mostraron que el almidón de estas plantas tenía
propiedades radicalmente alteradas y se comportó en forma similar a
almidón hylon 5 de las plantas de maíz (Figura 13). Bajo las
condiciones empleadas con el viscoamilógrafo, este almidón exhibió
una hinchazón del gránulo extremadamente limitada (casi que
indetectable). Por lo tanto, por ejemplo, a diferencia del almidón
de las plantas de control, el almidón de las plantas 201, 208 y
208a no mostró un pico de viscosidad de adhesión claramente
definido durante la fase de calentamiento. El análisis microscópico
confirmó que la estructura de los gránulos de almidón experimentó
únicamente un hinchamiento menor durante el proceso experimental de
calentamiento. Esta propiedad puede ser particularmente útil en
ciertas aplicaciones, que será clara para aquellos capacitados en
el arte.
Se ha encontrado hasta ahora que algunas plantas
cultivadas nuevamente incrementan aún más el contenido aparente de
amilosa del almidón extraído de ellas. Tales incrementos pueden ser
debidos a:
- i)
- que el cultivo y desarrollo de la primera generación de plantas transformadas puede haber sido afectado en alguna medida por las hormonas exógenas de crecimiento presentes en el sistema de cultivo del tejido, cuyas hormonas exógenas no estaban presentes durante el cultivo de la segunda generación de plantas; y
- ii)
- que las generaciones siguientes fueron cultivadas bajo condiciones de campo, que pueden permitir el logro de una madurez mayor que las cultivadas bajo condiciones de laboratorio, siendo generalmente sostenido que el contenido amilosa del almidón de patata se incrementa con la madurez del tubérculo de la patata. Por lo tanto, debería ser posible obtener plantas de patata que den lugar a tubérculos con almidón que tenga un contenido de amilosa por encima del nivel del 66% logrado hasta ahora, simplemente analizando un gran número de plantas transformadas y/o cultivando nuevamente las plantas transgénicas mediante una o más generaciones bajo condiciones de campo.
La Tabla 1 muestra que otra característica del
almidón que es afectada por la presencia de secuencias antisentido
de la SBE es el contenido de fósforo. El almidón de las plantas de
control no transformadas tenían un contenido de fósforo
aproximadamente de 60-70 mg/100 gramos de peso seco
(como se determinó de acuerdo a los Métodos Oficiales de Análisis de
la AOAC, 15^{ava} edición, Método 948.09 "Fósforo en
Harina"). Se encontró que la introducción en la planta de una
secuencia B antisentido de la SBE causa un incremento modesto
(aproximadamente dos veces) en el contenido de fósforo, que está de
acuerdo con los hallazgos previos reportados en encuentros
científicos. En forma similar, una secuencia A antisentido de la
SBE sola, únicamente causa un pequeño aumento en el contenido de
fósforo con relación a los controles no transformados. Sin embargo,
el uso de una secuencia antisentido tanto A como B de la SBE en
combinación resulta en un incremento hasta de cuatro veces en el
contenido de fósforo, lo cual es mucho mayor que cualquier contenido
de fósforo en la planta previamente demostrado para el almidón de
patata.
Esto es útil porque, para ciertas aplicaciones,
el almidón debe ser fosforilado in vitro por medio de una
modificación química. La habilidad para obtener un almidón de patata
que, en la medida en que es extraído por la planta, ya tenga un
alto contenido de fósforo que reducirá la cantidad de fosforilación
requerida in vitro, adecuada para modificar al almidón. Por
lo tanto, en otro aspecto la invención provee un almidón de patata
que, en la medida en que es extraído de la planta, tenga un
contenido de fósforo por encima de 200 mg/100 gramos de peso seco de
almidón. Típicamente, el almidón tendrá un contenido de fósforo en
el rango entre 200-240 mg/100 gramos de peso seco de
almidón.
\vskip1.000000\baselineskip
Este listado de referencias citado por el
solicitante es únicamente para conveniencia del lector. No forma
parte del documento europeo de la patente. Aunque se ha tenido gran
cuidado en la recopilación, no se pueden excluir los errores o las
omisiones y la OEP rechaza toda responsabilidad en este sentido.
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- \bullet US 5281276 A [0032] [0032]
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\bulletMORRISON; LAIGNELET.
J. Cereal Sci, 1983, vol. 1, 9-20
[0064]
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: National Starch and Chemical Investment Holding Corporation
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 501 Silverside Road. Suite 27
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Wilmington
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Delaware
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Estados Unidos de América
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 19809
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Mejoras en o Relacionadas con una Composición de Almidón de una Planta
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 20
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA QUE PUEDE LEERSE EN EL COMPUTADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- COMPUTADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Versión #1.30 (EPO)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 57 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENTRELAZAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAAGGATCCGT CGACATCGAT AATACGACTC ACTATAGGGA TTTTTTTTTT TTTTTTT
\hfill57
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENTRELAZAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAAGGATCCGT CGACATC
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENTRELAZAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGACATCGATA ATACGAC
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENTRELAZAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCATCCAACCA CCATCTCGCA
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENTRELAZAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTGAGAGAAG ATACCTAAGT
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENTRELAZAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATGTTCAGTC CATCTAAAGT
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENTRELAZAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGAACAACAA TTCCTAGCTC
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENTRELAZAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGGCCTTGA ACTCAGCAAT
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENTRELAZAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGTCCCAGCA TTCGACATAA
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENTRELAZAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTTGGATCCT TGAACTCAGC AATTTG
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENTRELAZAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTAACTCGAGC AACGCGATCA CAAGTTCGT
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 3003 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENTRELAZAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2975 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENTRELAZAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 3033 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENTRELAZAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- UBICACIÓN: 145..2790
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 882 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2576 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENTRELAZAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2529 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENTRELAZAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 3231 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENTRELAZAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2578 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENTRELAZAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENTRELAZAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAATTTYATGG GNAAYGARTT YGG
\hfill23
Claims (56)
1. Almidón extraído de una planta de patata y
que tiene un contenido de amilosa de al menos 35% de acuerdo a lo
juzgado por el método de análisis iodométrico de Morrison &
Laignelet (1983 J. Cereal Science 1, 9-20).
2. Almidón de acuerdo a la reivindicación 1, que
tiene un contenido de amilosa de al menos 37%, de acuerdo a lo
juzgado por el método definido en la reivindicación 1.
3. Almidón de acuerdo a la reivindicación 1, que
tiene un contenido de amilosa de al menos 40%, de acuerdo a lo
juzgado por el método definido en la reivindicación 1.
4. Almidón de acuerdo a la reivindicación 1, que
tiene un contenido de amilosa de al menos 50%, de acuerdo a lo
juzgado por el método definido en la reivindicación 1.
5. Almidón de acuerdo a la reivindicación 1, que
tiene un contenido de amilosa de al menos 66%, de acuerdo a lo
juzgado por el método definido en la reivindicación 1.
6. Almidón de acuerdo a cualquiera de la
reivindicaciones 1-5, que tiene un contenido de
amilosa de 35-66%, de acuerdo a lo juzgado por el
método definido en la reivindicación 1.
7. Almidón de acuerdo a cualquiera de las
reivindicaciones precedentes que una vez extraído de una planta de
patata por medio de una molienda en húmedo a temperatura ambiente
tiene una temperatura de inicio de desarrollo de la viscosidad en
el rango de 70-95°C, de acuerdo a lo juzgado por
una viscoamilografía de una suspensión acuosa al 10% p/p de la
misma, llevada a cabo a presión atmosférica utilizando el Newport
Scientific Rapid Visco Analyser 3C con un perfil de calentamiento
mantenido a 50°C durante 2 minutos, calentando desde 50 hasta 95°C
con una velocidad de 1,5°C por minuto, manteniendo a 95°C durante 15
minutos, enfriando desde 95 hasta 50°C a una velocidad de 1,5°C por
minuto, y luego manteniendo a 50°C durante 15 minutos.
8. Almidón de acuerdo a cualquiera de las
reivindicaciones 1-6 que una vez extraído de una
planta de patata por medio de una molienda en húmedo a temperatura
ambiente tiene una viscosidad pico en el rango de
500-12 unidades del número de agitación (SNUs), de
acuerdo a lo juzgado por la viscoamilografía llevada a cabo de
acuerdo al protocolo definido en la reivindicación 7.
9. Almidón de acuerdo a cualquiera de las
reivindicaciones 1-6 que una vez extraído de una
planta de patata por medio de una molienda en húmedo a temperatura
ambiente tiene una viscosidad de adhesión en el rango de
214-434 SNUs, de acuerdo a lo juzgado por la
viscoamilografía llevada a cabo de acuerdo al protocolo definido en
la reivindicación 7.
10. Almidón de acuerdo a cualquiera de las
reivindicaciones 1-6 que una vez extraído de una
planta de patata por medio de una molienda en húmedo a temperatura
ambiente tiene una viscosidad de retroceso en el rango de
450-618 SNUs, de acuerdo a lo juzgado por la
viscoamilografía llevada a cabo de acuerdo al protocolo definido en
la reivindicación 7.
11. Almidón de acuerdo a cualquiera de las
reivindicaciones 1-6 que una vez extraído de una
planta de patata por medio de una molienda en húmedo a temperatura
ambiente tiene una viscosidad de retroceso en el rango de
14-192 SNUs, de acuerdo a lo juzgado por la
viscoamilografía llevada a cabo de acuerdo al protocolo definido en
la reivindicación 7.
12. Almidón de acuerdo a cualquiera de las
reivindicaciones 1-6 que una vez extraído de una
planta de patata por medio de una molienda en húmedo a temperatura
ambiente tiene una viscosidad pico en el rango de
200-500 SNUs y una viscosidad de retroceso en el
rango de 275-618 SNUs de acuerdo a lo juzgado por
la viscoamilografía llevada a cabo de acuerdo al protocolo definido
en la reivindicación 7.
13. Almidón de acuerdo a cualquiera de las
reivindicaciones 1-6 que una vez extraído de una
planta de patata por medio de una molienda en húmedo a temperaturE.
ambiente tiene una viscosidad que no disminuye entre el inicio de
la fase de calentamiento (etapa 2) y el inicio de la fase final de
mantenimiento (etapa 5) y tiene una viscosidad de retroceso de 303
SNUs o menor de acuerdo a lo juzgado por la viscoamilografía de
acuerdo al protocolo definido en la reivindicación 7.
14. Almidón de acuerdo a cualquiera de las
reivindicaciones 1-6 que una vez extraído de una
planta de patata por medio de una molienda en húmedo a temperatura
ambiente no muestra un incremento significativo en viscosidad de
acuerdo a lo juzgado por la viscoamilografía llevada a cabo de
acuerdo al protocolo definido en la reivindicación 7.
15. Almidón de acuerdo a cualquiera de las
reivindicaciones 1-6 que una vez extraído de una
planta de patata por medio de una molienda en húmedo a temperatura
ambiente, está de acuerdo con la reivindicación 7 y de acuerdo con
cualquiera que las reivindicaciones 8 a 14.
16. Almidón de acuerdo a cualquiera de las
reivindicaciones precedentes el cual, una vez extraído de una
planta de patata, tiene un contenido de fósforo por encima de 200
mg/100 gramos de peso seco de almidón.
17. El uso de almidón de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones 1-1,5 en la preparación o
el procesamiento de productos alimenticios.
18. El uso de almidón de acuerdo a la
reivindicación 17, en donde el almidón se utiliza para proveer una
película, barrera, recubrimiento o como un agente de
gelificación.
19. El uso de almidón de acuerdo con la
reivindicación 17, para preparar composiciones de almidón
resistentes.
20. El uso de almidón de acuerdo con cualquiera
de la reivindicaciones 1-16 en la preparación o el
procesamiento de aditivos para corrugados, productos biodegradables.
empaques, fibras de vidrio y textiles.
21. Una molécula aislada de ácido nucleico que
codifica a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos
de los residuos 49 a 882 de la secuencia mostrada en la Figura 5, o
el complemento de la misma.
22. Una molécula de ácido nucleico de acuerdo
con la reivindicación 21, que comprende sustancialmente la
secuencia de nucleótidos 289 a 2790 de la secuencia mostrada en la
Figura 5, o el complemento de la misma.
23. Una molécula de ácido nucleico de acuerdo a
la reivindicación 22, que comprende además la secuencia de
nucleótidos 145 a 288 de la secuencia mostrada en la Figura 5, o el
complemento de la misma.
24. Una molécula de ácido nucleico de acuerdo a
la reivindicación 21, que comprende la secuencia de nucleótidos 228
a 2855 de la secuencia marcada como psbe2con.seq en la Figura 8, o
el complemento de la misma.
25. Una molécula de ácido nucleico de acuerdo a
la reivindicación 21, que comprende la secuencia de nucleótidos 57
a 2564 de la secuencia marcada como psbe2con.seq en la Figura 12, o
el complemento de la misma.
26. Una molécula de ácido clínico de acuerdo a
cualquiera de las reivindicaciones 21 a 25, que comprende un codón
de inicio ATG en el marco, y que opcionalmente incluye una región 5'
y/o 3' no traducida.
27. Una molécula de ácido nucleico de acuerdo a
la reivindicación 21, que comprende la secuencia de nucleótidos 45
a 3200 de la secuencia marcada como psbe2con.seq en la Figura 8, o
el complemento de la misma.
28. Una construcción de ácido nucleico que
comprende una molécula de acuerdo a cualquiera de las
reivindicaciones 21 a 27.
29. Un vector que comprende una construcción de
ácido nucleico de acuerdo a la reivindicaciones 28.
30. Una célula huésped aislada que comprende un
vector de acuerdo con la reivindicación 29.
31. Un polipéptido de la SBE clase A obtenible a
partir de plantas de patata y codificado por una secuencia de ácido
nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21 a
29.
32. Un polipéptido de acuerdo a la
reivindicación 31, que comprende además la secuencia de aminoácidos
1 a 48 de la secuencia mostrada en la Figura 5.
33. Un polipéptido de acuerdo con la
reivindicación 31 o la 32 en aislamiento sustancial de otros
constituyentes derivados de la planta.
34. Un método para alterar las características
de una planta, que comprende la introducción dentro de la planta de
una molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 21 a 29, operativamente enlazada a un promotor
activo adecuado en la planta, para afectar la expresión de un gen
presente en la planta, cuya gen codifica a una enzima de
ramificación del almidón Clase A.
35. Un método de acuerdo a la reivindicación 34,
en donde la secuencia de nucleótidos está operativamente enlazada
en la orientación antisentido a un promotor activo adecuado en la
planta.
36. Un método de acuerdo a la reivindicación 34,
en donde la secuencia introducida comprende uno o más de lo
siguiente operativamente enlazado en la orientación sentido a un
promotor activo en la planta, para causar una supresión sentido de
una enzima naturalmente expresada en la planta: una región 5' no
traducida, una región 3' no traducida, o una región de codificación
de la enzima de ramificación del almidón SBE clase A de la
patata.
37. Un método de acuerdo a cualquiera de las
reivindicaciones 34, 35 ó 36, que comprende además la introducción
dentro de la planta de una o más secuencias adicionales.
\newpage
38. Un método de acuerdo a la reivindicación 37,
en donde una o más de las secuencias adicionales está
operativamente enlazadas en la orientación antisentido a un promotor
activo adecuado en la planta.
39. Un método de acuerdo a la reivindicación 37
ó 38, en donde la secuencia adicional comprende una porción de una
secuencia de nucleótidos para la SBE clase B.
40. Un método de acuerdo a cualquiera de las
reivindicaciones 34 a 39, efectivo en la alteración de la
composición de almidón de una planta.
41. Una planta o célula de una planta, o la
progenie de dicha planta, o una parte de dicha planta, que
comprende un vector de acuerdo con la reivindicación 29.
42. Una planta de acuerdo a la reivindicación
41, seleccionada entre una de las siguientes: patata, guisante,
tomate, maíz, trigo, arroz, cebada, patata dulce, y casabe.
43. Un tubérculo u otro órgano de almacenamiento
de una planta de acuerdo a la reivindicación 41 ó 42.
44. El uso de un tubérculo o de otro órgano de
almacenamiento de acuerdo con la reivindicación 43, en la
preparación y/o el procesamiento de un producto alimenticio.
45. Una planta de acuerdo a la reivindicación 41
ó 42, que contiene almidón el cual, una vez extraído de la planta
por medio de molienda en húmedo a temperaturz ambiente, tiene una
elevada temperatura de inicio del desarrollo de viscosidad de
acuerdo a lo juzgado por medio de la viscoamilografía llevada a
cabo de acuerdo con el protocolo definido en la reivindicación 7,
comparado con el almidón extraído de una planta inalterada, o bien
genéticamente idéntica.
46. Una planta de acuerdo a la reivindicación
45, en donde la temperatura de inicio de desarrollo de la
viscosidad se eleva en una cantidad en el rango de 10 a 25°C.
47. Una planta de acuerdo a la reivindicación 41
ó 42, que contiene almidón el cual, una vez extraído de la planta
por medio de molienda en húmedo a temperatura ambiente, tiene una
menor viscosidad de pico de acuerdo a lo juzgado por medio de la
viscoamilografía llevada a cabo de acuerdo con el protocolo
definido en la reivindicación 7, comparada con la del almidón
extraído de una planta inalterada, o bien genéticamente idéntica
48. Una planta de acuerdo a la reivindicación
47, en donde la viscosidad pico disminuye en una cantidad en el
rango de 240 a 700 SNUs.
49. Una planta de acuerdo a la reivindicación 41
ó 42, que contiene almidón el cual, una vez extraído de la planta
por medio de molienda en húmedo a temperatura ambiente, tiene una
mayor viscosidad de adhesión de acuerdo a lo juzgado por medio de la
viscoamilografía llevada a cabo de acuerdo con el protocolo
definido en la reivindicación 7, comparada con la del almidón
extraído de una planta inalterada, o bien genéticamente
idéntica.
50. Una planta de acuerdo a la reivindicación
49, en donde la viscos: dad de adhesión se incrementa en una
cantidad en el rango de 37 a 260 SNUs.
51. Una planta de acuerdo a la reivindicación 41
ó 42, que contiene almidón el cual, una vez extraído de la planta
por medio de molienda en húmedo a temperatura ambiente, tiene una
mayor viscosidad de retroceso de acuerdo a lo juzgado por medio de
la viscoamilografía llevada a cabo de acuerdo con el protocolo
definido en la reivindicación 7, comparada con la del almidón
extraído de una planta inalterada, o bien genéticamente
idéntica.
52. Una planta de acuerdo a la reivindicación
51, en donde la viscosidad de retroceso se incrementa en una
cantidad en el rango de 224 a 313 SNUs.
53. Una planta de acuerdo a la reivindicación 41
ó 42, que contiene almidón el cual, una vez extraído de la planta
por medio de molienda en húmedo a temperatura ambiente, tiene una
menor viscosidad de retroceso de acuerdo a lo juzgado por medio de
la viscoamilografía llevada a cabo de acuerdo con el protocolo
definido en la reivindicación 7, comparada con la del almidón
extraído de una planta inalterada, o bien genéticamente
idéntica.
54. Una planta de acuerdo a la reivindicación 41
ó 42, que contiene almidón el cual, una vez extraído de la planta
por medio de molienda en húmedo a temperatura ambiente, tiene un
elevado contenido aparente de amilosa de acuerdo a lo juzgado por
medio del ensayo iodométrico de acuerdo con el método de Morrison
& Laignelet, comparado con el almidón extraído de una planta
inalterada, o bien genéticamente idéntica.
55. Una planta de acuerdo a la reivindicación 41
ó 42, que contiene almidón el cual, una vez extraído de la planta,
tiene un contenido de fósforo por encima de 200 mg/100 gramos de
peso seco de almidón.
56. Un método de modificación del almidón in
vitro, que comprende el tratamiento del almidón bajo
condiciones adecuadas con una cantidad efectiva de un polipéptido de
acuerdo con cualquiera de la reivindicaciones 31 a 33.
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