DE3782996T2

DE3782996T2 - Zellmembranproteine, zubereitungen, die sie enthalten und verfahren zu ihrer herstellung.

Info

Publication number: DE3782996T2
Application number: DE8787113856T
Authority: DE
Inventors: Irun Robert Cohen; Meir Shinitzky
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Priority date: 1986-09-23
Filing date: 1987-09-22
Publication date: 1993-06-09
Anticipated expiration: 2007-09-23
Also published as: DE3782996D1; EP0261648B1; CA1320907C; EP0261648A2; IL83990A0; JPS63190829A; EP0261648A3

Description

In dieser Anmeldung wird auf mehrere Literaturstellen durch arabische Zahlen in Klammern hingewiesen. Vollständige Zitate dieser Literaturstellen finden sich am Ende der Beschreibung unmittelbar vor den Ansprüchen.
Die Erfindung betrifft neue Präparate und Arzneimittel zur Behandlung und Prävention von Autoimmunerkrankungen, die auf immunogenen, aus Membranen bestimmter Zellen und Zellinien von autoimmunen Lymphozyten erhaltenen Materialien oder auf aktivierten Zellen basieren, die mit einer neuen Druck-Behandlung, einem chemischen Vernetzungsmittel oder einem Zellskelett-aufbrechenden Mittel behandelt worden sind.
Die Präparate zur Prävention von Autoimmunerkrankungen umschließen Vakzine, die Membranproteine, welche aus spezifischen, bestimmte T-Zellrezeptoren enthaltenden autoimmunen T-Zellinien erhalten worden sind, oder Druck-behandelte, aktivierte T-Zellen umfassen. Die Erfindung stellt ferner Verfahren zur Herstellung solcher aktiver Zellmembran-Materialien und zur Behandlung aktivierter Zellen bereit, ferner werden pharmazeutische Zusammensetzungen bereitgestellt, die entweder die Zellmembran-Materialien oder die aktivierten Zellen als ihre Wirkstoffe enthalten.
Die krankheitsverursachenden Mittel von Autoimmunerkrankungen sind endogene Lymphozyten, die normale Bestandteile des Individuums angreifen. Vorliegend befaßte man sich damit, spezifische, autoimmune T-Lymphozyten als permanente Zellinien zu kultivieren, die mehrere experimentelle Autoimmunerkrankungen (1-9) hervorrufen. Die so erhaltenen, vergleichsweise reinen Kulturen von autoimmunen Zellen haben die Untersuchung der Pathogenese erleichtert, den Trägerzustand einer Autoimmunität aufgedeckt und Mittel zur Vakzinierung gegen und Behandlung von Autoimmunität (5-9) bereitgestellt.
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Präparate zur Verwendung in der Prävention und Behandlung von Autoimmunerkrankungen, wobei die Präparate als ihren Wirkstoff bestimmte Membran-Materialien von spezifischen autoimmunen T-Lymphozyten oder solche Druck-behandelten, aktivierten T-Lympozytenzellen haben. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zum Erhalt solcher Materialien aus solchen Lymphozyten, die Druck-Behandlung solcher Lymphozyten und ein Verfahren zur Herstellung sie enthaltender Vakzine und pharmazeutischer Präparate. Andere und weitere Merkmale der Erfindung werden nachstehend erläutert.
Autoimmunerkrankungen weisen das gemeinsame Merkmal auf, daß sie durch den Angriff des Immunsystems auf eigene Gewebe eines Individuums verursacht werden. Am Ausgangspunkt aller Autoimmunerkrankungen stehen die autoimmunen Lymphozyten, die spezifisch die einzelnen Zielantigene des Individuums erkennen. Unter Autoimmunerkrankungen können rheumatische Arthritis, Multiple Sklerose, einige Formen von Diabetes Mellitus, Thyroiditis und Myasthenia gravis verstanden werden. Bis jetzt existierte noch keine spezifische Therapieform gegen diese Erkrankungen.
Es wurde als möglich gefunden, T-Lymphozyten als permanente Zellinien zu kultivieren, die für die Verursachung von Autoimmunerkrankungen in Labortieren verantwortlich sind. Unter solchen Erkrankungen können Encephalomyelitis, Arthritis und Thyroiditis verstanden werden. Solche Zellen zeigten sich als wirksame Mittel zur Vakzinierung gegen solche spezifischen Autoimmunerkrankungen: Solche Lymphozyten wurden abgeschwächt und so injiziert, daß sie die Autoimmunerkrankungen nicht mehr verursachten. Es wurde gefunden, daß solche Vakzinierungen wirksam waren, solche Tiere gegen solche Erkrankungen immun oder weniger sensitiv (die Erkrankung war viel weniger stark) zu machen. Ferner wurde gezeigt, daß wenn solche Tiere mit solchen Zellen inokuliert wurden, dies zu einer ganz wirksamen Behandlung der Erkrankung beitrug.
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden pharmazeutische Präparate bereitgestellt, die als Wirkstoff Membran-Material aus spezifischen, bestimmte T-Zellrezeptoren enthaltenden autoimmunen T-Zellen aufweisen. Die Erfindung stellt auch ein neues Verfahren zur Herstellung und Isolierung eines solchen Membran-Materials bereit, bei dem solche T-Lymphozyten einem hohen hydrostatischen Druck ausgesetzt werden und der Druck allmählich entspannt wird, wodurch Membran-Material wirksam entfernt wird, das einen hohen Grad biologischer Aktivität beibehält. Eine Alternative dazu ist die Druck-Behandlung solcher T-Zellen, indem sie einem hydrostatischen Druck ausgesetzt werden und dieser allmählich entspannt wird.
Typische Bedingungen für das Entfernen des aktiven Materials sind Drücke der Größenordnung von 50,7 bis 152 MPa (500 bis 1500 Atmosphären), wobei das Aufbauen des Druckes allmählich innerhalb von 5 Minuten, das Beibehalten eines solchen Druckes im oberen Bereich für etwa 10 bis 45 Minuten und das allmähliche Entspannen des Druckes innerhalb von 5 bis 15 Minuten erfolgen.
Eine Druck-Behandlung aktivierter T-Zellen wird erreicht, indem solche Zellen innerhalb von etwa 5 Minuten einem Druckaufbau von etwa 500 auf etwa 1300 Atmosphären ausgesetzt werden, der Druck etwa 15 Minuten beibehalten und allmählich innerhalb von etwa 5 Minuten entspannt wird.
Ein Entfernen tritt praktisch nicht auf. Entferntes Material wie auch Druck-behandelte, aktivierte Zellen können als Wirkstoffe in den erfindungsgemäßen Vakzinen verwendet werden: Die Zellen behalten ihre volle Lebensfähigkeit bei.
Die so erhaltenen Materialien umfassen etwa 10&sup7; bis etwa 10&sup8; aktivierte Zellen oder das Material von Zellen gleicher Zahl. Zur Vakzinierung des Menschen wird eine Menge in der Größenordnung von 0,01 mg bis 3 mg solcher Materialien (entferntes Protein oder Druck-behandelte aktivierte T-Zellen) verwendet, wobei die Vakzinierung drei bis viermal innerhalb eines Intervals von etwa zwei Wochen zwischen den Anwendungen erfolgt.
Solche Immunisierungen sind für die Prävention und Behandlung bestimmter Autoimmunerkrankungen wirkungsvoll.
Die Druck-Behandlung umfaßt die Suspendierung von Lymphozyten in einem geeigneten Puffer, das Einführen der Suspension in ein Druckgefäß ohne jegliches gasförmiges Medium und die Anwendung eines Druckes, z. B. mit einer French-Presse, wie vorstehend ausgeführt.
Die erhaltene Zellsuspension wird einer Zentrifugation bei etwa 1500 rpm unterworfen und der Überstand etwa eine Stunde einer Ultrazentrifugation bei etwa 100 000 g unterzogen, wodurch die Membranfragmente präzipitiert werden. Werden Druck-behandelte, aktivierte T-Zellen hergestellt, werden diese durch Zentrifugation gesammelt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können gereinigte Membranproteine aus zur Prävention oder Behandlung einer spezifischen Autoimmunerkrankung geeigneten T-Lymphozytenzellen hergestellt werden, indem solche Zellen einer Behandlung unterworfen werden, die zur Ausbildung stabiler Aggregate von Zellmembran-Glycoproteinen führt. Es wird angenommen, daß solche Aggregate T-Zellrezeptoren, wahrscheinlich in Verbindung mit ein oder mehreren nicht-identifizierten Molekülen, umfassen, die nach Aktivierung der T-Zellen durch Behandlung mit einem Mitogen oder einem Antigen auftreten.
Anstelle die T-Zellen einer Druck-Behandlung zu unterziehen, können sie auch einer Behandlung mit einem geeigneten chemischen Vernetzungsmittel, wie Formaldehyd, Glutaraldehyd oder einem anderen üblichen Quervernetzungsmittel (vgl. Fig. 3,4 und 5) unterworfen werden. Eine solche Behandlung ist auch von Wert, wenn sie vor oder nach der Druck-Behandlung eingesetzt wird.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können solche T-Zellen einer Behandlung zum Aufbrechen des Zellskelettes der T-Lymphozyten unterworfen werden. Übliche Zellskelett-aufbrechende Mittel, wie Cytochalasin (0,5 ug/ml) oder Colchicin (10 uM), können verwendet werden.
Werden chemische Vernetzungsmittel des vorstehend genannten Typs verwendet, ermöglicht eine solche Behandlung die Verwendung isolierter Zellmembranen, die nach Aufbrechen der Zellen von einem Abbau abgehalten werden. Während Druckbehandelte Zellen etwas an ihrer Vakzinierungs-Wirksamkeit nach Lyse der Zellen verlieren, verlieren solche einer chemischen Vernetzung ausgesetzte Zellen eine solche Wirksamkeit nicht.
Gemäß Vorstehendem kann eine Vielzahl von Behandlungen von T-Lymphozytenzellen oder eine Kombinatin solcher Behandlungen verwendet werden, um wirksame Mittel zur Prävention und Behandlung bestimmter Erkrankungen zu erhalten.
Die Vernetzung von Membranproteinen wird vorteilhaft durch Behandlung mit einem Mittel, wie Formaldehyd oder Glutaraldehyd (0,3 bis 1% für einen Zeitraum von etwa 15 Minuten) bewirkt.
Das Aufbrechen des Zellskeletts kann durch Behandlung mit einem Mittel, wie einer Kombination aus Cytochalasin (0,5 ug/ml) und Colchicin (10 uM) bewirkt werden.
Nach Vernetzung können die fixierten Zellmembranen erhalten werden, indem die Zellen in einer geeigneten hypotonischen Lösung suspendiert, homogenisiert und unter Verwendung eines diskontinuierlichen Sucrosegradienten isoliert werden, dem eine Dialyse der abgetrennten Membranen gegen eine Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) folgt.
Die folgenden Experimente erläutern einige der Ergebnisse, die durch Behandlung von T-Lymphozytenzellen nach den vorstehend beschriebenen Verfahren erhalten wurden. Die Einzelheiten der Experimente sind wie folgt:
Fig. 1: Behandlung von fortschreitender Arthritis durch Zellen einer Zellinie
Aktive Adjuvans-Arthritis wurde in 20 Lewis-Ratten durch Inokulierung von CFA induziert. Fünf Tage nach dem Einsetzen klinischer Arthritis (Pfeil, Tag 16) wurde eine Gruppe von 10 Ratten durch eine einzelne Inokulierung von aktivierten Zellen einer Anti-Tb- Linie (geschlossene Kreise) behandelt. Eine zweite Gruppe von 10 Ratten wurde mit einer unbedeutenden Kontroll-Zellinine (offene Kreise) behandelt. Der Arthrits-Durchschnittswert wurde, wie in (5) beschrieben, bestimmt.
Fig. 2: Linderung von EAE durch Verabreichung einer Membranfraktion
Ratten wurden zweimal im Abstand einer Woche mit Membranfraktionen von Zellen der Zellinie Zla (0,5 ug, erhalten durch Druck-Verfahren) inokuliert und zwei Wochen später mit einer encephalogenen Dosis von EAE angeregt. Der klinische Wert der Testratten wird durch die offenen Kreise und der Kontrollratten durch die geschlossenen Kreise angezeigt. Klinischer Wert: 1 - leicht, 2 - mäßig, 3
- stark.
Fig. 3: Inhibierung von Adjuvans-Arthritis durch T-Lymphozyten-Vakzine
Adjuvans-Arthritis wurde in Gruppen von 10 Lewis-Ratten induziert, in dem sie intradermal an der Schwanzbasis mit Mycobacterium tuberculosis (MT) H37RA (1 g) in Öl immunisiert wurden. Die Schwere der Erkrankung wurde auf einer Skala von 0 bis 100%, hinsichtlich Schwellung, Rötung und Funktionsverlust der Pfoten eingestuft. Die Gruppen waren wie folgt:
C - Kontrolle, keine Vakzinierung
A - Vakzinierung vor Arthritis-Induktion durch 3 wöchentliche, subcutane Injektionen von 20·10&sup6; Zellen des Klons A2b, die durch dreitägige Inkubation mit dem T-Zell-Mitogen Concanavalin A (1,5 ug/ml) aktiviert wurden.
N - Vakzinierung mit A2b-Zellen, die nicht aktiviert, jedoch mit Formaldehyd (0,3% für 15 Minuten) behandelt wurden.
F - Vakzinierung mit aktivierten A2b-Zellen, die mit Formaldehyd behandelt wurden.
P - Vakzinierung mit aktivierten A2b-Zellen, die mit hydrostatischem Druck (1250 bar, 15 Minuten) behandelt wurden.
X - Vakzinierung mit aktivierten A2b-Zellen, die zunächst mit Druck und dann mit Formaldehyd behandelt wurden.
Fig. 4: Inhibierung von Adjuvans-Arthritis durch T-Lymphozyten-Vakzine
Das Experiment wurde, wie in der Beschreibung von Fig. 3 beschrieben, durchgeführt und die Gruppen haben die gleichen Markierungen, außer daß F hier für eine Behandlung der A2b-Zellen mit Formaldehyd (0,3%) nach Behandlung mit Druck (1500 bar) und G für eine Behandlung der A2b-Zellen mit Glutaraldehyd (0,3%) nach Behandlung mit Druck stehen.
Fig. 5: Inhibierung von Adjuvans-Arthritis durch eine T-Lymphozyten-Vakzine, hergestellt mit Zellskelettaufbrechenden Mitteln
Das Experiment wurde, wie in der Beschreibung von Fig. 3 beschrieben, durchgeführt. Y bedeutete A2b-Zellen, die mit Colchicin (10 umolar) plus Cytochalasin (0,5 ug/ml) 15 Minuten vor Vakzinierung behandelt wurden.
Die vorliegende Erfindung betrifft eine gegebenenfalls Druck-behandelte, aktivierte T-Lymphozytenzelle, die sich zur Prävention oder Behandlung einer spezifischen Autoimmunerkrankung eignet, wobei die Zelle zusätzlich mit einem chemischen Vernetzungsmittel oder einem Zellskelett-aufbrechenden Mittel oder beiden behandelt worden ist. Die erfindungsgemäßen T-Lymphozytenzellen können aus einer etablierten Zellinie stammen oder aus dem Kreislauf- oder lymphatischen System eines Objekts, z. B. einer Maus, einer Ratte oder eines Menschen entnommen werden. Zusätzlich können die T-Lymphozytenzellen direkt für einen Patienten entnommen werden, der wegen einer spezifischen Autoimmunerkrankung behandelt werden soll. In dieser Anmeldung bedeutet "aktivierte T-Lymphozytenzelle" eine T-Lymphozytenzelle, die einem spezifischen Antigen oder Mitogen ausgesetzt worden ist, das eine Immunreaktion durch die T-Lymphozytenzelle induzieren kann. Geeignete Mitogene sind auf dem Fachgebiet bekannt und umfassen Concanavalin A, Phytohämagglutinin und Kermesbeeren-Mitogen. Die erfindungsgemäßen Druck-behandelten und chemisch-vernetzten oder aufgebrochenen aktivierten T-Lymphozyten können sich zur Behandlung von Multiple Sklerose, Thyroiditis, Diabetes Typ I, ankylosierende Spondilitis, rheumatische Arthritis oder Myasthenia gravis eignen.
Geeignete chemische Vernetzungsmittel sind auf dem Fachgebiet bekannt und umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Formaldehyd und Glutaraldehyd. In einer Ausführungsform der Erfindung werden Druck-behandelte, aktivierte T-Lymphozytenzellen mit dem chemischen Vernetzungsmittel nach Behandlung mit hydrostatischem Druck behandelt. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden die Druck-behandelten, aktivierten T-Lymphozytenzellen mit dem chemischen Vernetzungsmittel vor der Behandlung mit hydrostatischem Druck behandelt.
In der vorliegenden Anmeldung ist mit einem aufbrechenden Mittel ein solches gemeint, das das Zellskelett zur Auftrennung in Fragmente veranlaßt und es umfaßt die chemischen Stoffe Cytochalasin und Colchicin. Andere aufbrechende Mittel sind ebenfalls auf dem Fachgebiet bekannt und können verwendet werden. Diese aufbrechenden Mittel können einzeln oder in Verbindung miteinander verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen, mit einem aufbrechenden Mittel behandelten, aktivierten T-Lymphozyten können zusätzlich mit einem chemischen Vernetzungsmittel oder mit hydrostatischem Druck behandelt werden.
Ferner wird ein Verfahren zur Herstellung von Druckbehandelten, aktivierten T-Lymphozyten bereitgestellt, die sich zur Prävention oder Behandlung einer spezifischen Autoimmunerkrankung eignen. Dieses Verfahren umfaßt zunächst die Suspendierung von aktivierten, für die Autoimmunerkrankung spezifischen T-Lymphozytenzellen in einem Puffer. Die suspendierten Zellen werden dann einem geeigneten hydrostatischen Druck für einen angemessenen Zeitraum ausgesetzt. Danach wird der Druck auf die suspendierten Zellen mit geeigneter Rate derart entspannt, daß Druck-behandelte, aktivierte T-Lymphozytenzellen ohne wesentlichen Verlust von Membranproteinen der Zellen erhalten werden. In einer Ausführungsform der Erfindung beträgt der geeignete Druck 50,7 bis 152 MPa (500 bis 1500 Atmosphären). In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden die suspendierten Zellen, bevor sie einem geeigneten hydrostatischen Druck ausgesetzt werden, mit einem chemischen Vernetzungsmittel behandelt. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden die suspendierten Zellen mit einem chemischen Vernetzungsmittel behandelt, nachdem der Druck entspannt worden ist.
Ebenso wird ein Verfahren zur Herstellung von mit einem chemischen Vernetzungsmittel behandelten, aktivierten T-Lymphozyten bereitgestellt, die sich zur Prävention oder Behandlung einer spezifischen Autoimmunerkrankung eignen. Dieses Verfahren umfaßt die Suspendierung von aktivierten, für die Autoimmunerkrankung spezifischen T-Lymphozytenzellen in einem Puffer und die Behandlung der suspendierten Zellen mit einem chemischen Vernetzungsmittel.
Die vorliegenden Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Herstellung von Druck-behandelten, aktivierten T-Lymphozyten-Zellmembran-Fragmenten bereit, die sich zur Prävention oder Behandlung einer spezifischen Autoimmunerkrankung eignen. Dieses Verfahren umfaßt zunächst die Suspendierung von aktivierten, für die Autoimmunerkrankung spezifischen T-Lymphozytenzellen in einem Puffer. Die suspendierten Zellen werden mit einem aufbrechenden Mittel behandelt, so daß aktivierte T-Lymphozytenzellen erhalten werden. Die aktivierten T-Lymphozytenzellen werden dann einem geeigneten hydrostatischen Druck für einen passenden Zeitraum ausgesetzt. Danach wird der Druck auf die aktivierten T-Lymphozyten-Zellmembran-Fragmente mit einer geeigneten Rate derart entspannt, daß Druck-behandelte, aktivierte T-Lymphozyten-Zellmembran-Fragmente ohne wesentlichen Verlust von Membranproteinen erhalten werden. In einer Ausführungsform der Erfindung beträgt der geeignete Druck 500 bis etwa 1300 Atmosphären. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden die aktivierten T-Lymphozyten-Zellmembran-Fragmente mit einem chemischen Vernetzungsmittel nach Behandlung mit dem aufbrechenden Mittel behandelt.
Des weiteren wird ein Verfahren zur Herstellung von Druck-behandelten, aktivierten T-Lymphozyten-Zellmembran- Fragmenten bereitgestellt, die sich zur Prävention oder Behandlung einer spezifischen Autoimmunerkrankung eignen. Dieses Verfahren umfaßt zunächst die Suspendierung der aktivierten, für die Autoimmunerkrankung spezifischen T-Lymphozytenzellen in einem Puffer. Die suspendierten Zellen werden einem geeigneten hydrostatischen Druck für einen angemessenen Zeitraum ausgesetzt. Danach wird der Druck auf die suspendierten Zellen mit einer geeigneten Rate derart entspannt, daß Druck-behandelte, aktivierte T-Lymphozytenzellen ohne wesentlichen Verlust von Membranproteinen erhalten werden. Wenn der Druck entspannt worden ist, werden die Druck-behandelten, aktivierten T-Lymphozytenzellen mit einem aufbrechenden Mittel derart behandelt, daß Druck-behandelte, aktivierte T-Lymphozytenzellen erhalten werden. In einer Ausführungsform der ,Erfindung beträgt der geeignete Druck 50,7 bis 152 MPa (500 bis 1500 Atmosphären). In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können die erhaltenen Druck-behandelten, aktivierten T-Lymphozytenzellen mit einem chemischen Vernetzungsmittel behandelt werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von aktivierten T-Lymphozyten-Zellmembran- Fragmenten, die sich zur Prävention oder Behandlung einer spezifischen Autoimmunerkrankung eignen. Das Verfahren umfaßt die Suspendierung von aktivierten, für die Autoimmunerkrankung spezifischen T-Lymphozytenzellen in einem Puffer und die Behandlung der suspendierten Zellen mit einem aufbrechenden Mittel derart, daß aktivierte T-Lymphozytenzellen erhalten werden. Zusätzlich können die erhaltenen aktivierten T-Lymphozytenzellen mit einem chemischen Vernetzungsmittel behandelt werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine Zusammensetzung zur Prävention oder Behandlung einer spezifischen Autoimmunerkrankung. Diese Zusammensetzung umfaßt erfindungsgemäße Druck-behandelte, aktivierte T-Lymphozytenzellen und einen pharmazeutisch verträglichen Träger. Pharmazeutisch verträgliche Träger sind auf dem Fachgebiet bekannt und umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, 0,01-0,1M, vorzugsweise 0,05M, Phosphatpuffer, oder 0,8% Kochsalzlösung. Eine weitere Zusammensetzung zur Prävention oder Behandlung einer spezifischen Autoimmunerkrankung wird ebenfalls bereitgestellt. Diese Zusammensetzung umfaßt erfindungsgemäße, mit einem chemischen Vernetzungsmittel behandelte, aktivierte T-Lymphozytenzellen und einen pharmazeutisch verträglichen Träger. Eine weitere Zusammensetzung zur Prävention oder Behandlung einer spezifischen Autoimmunerkrankung wird erfindungsgemäß bereitgestellt. Diese Zusammensetzung umfaßt erfindungsgemäße, mit einem aufbrechenden Mittel-behandelte, aktivierte T-Lymphozyten-Zellmembran-Fragmente und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Geeignete Verabreichungswege der erfindungsgemäßen Präparate umfassen orale, intranasale oder transdermale Verabreichung, wie auch intramuskuläre, intravenöse, intradermale, subcutane und intraperitonale Injektionen.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Sammlung gereinigter Membranproteine von aktivierten T-Lymphozytenzellen bereit, die sich zur Prävention oder Behandlung einer spezifischen Autoimmunerkrankung eignen. Dieses Verfahren umfaßt zunächst die Suspendierung von aktivierten, für die Autoimmunerkrankung spezifischen T-Lymphozytenzellen in einem Puffer. Die suspendierten Zellen werden einem geeigneten hydrostatischen Druck für einen angemessenen Zeitraum derart ausgesetzt, daß entfernte Membranproteine erhalten werden. Danach wird der Druck auf die suspendierten Zellen mit einer geeigneten Rate entspannt. Die entspannte Suspension wird zur Entfernung von Zellen zentrifugiert und es wird ein die Membranproteine enthaltender Überstand erhalten. Dieser Überstand kann ultrazentrifugiert werden, wodurch die gereinigten Membranproteine erhalten werden. In einer Ausführungsform der Erfindung werden die suspendierten Zellen, bevor sie dem geeigneten hydrostatischen Druck ausgesetzt werden, mit einem chemischen Vernetzungsmittel behandelt. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden die suspendierten Zellen nach Entspannung des Druckes mit einem chemischen Vernetzungsmittel behandelt. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden die suspendierten Zellen, bevor sie einem geeigneten hydrostatischen Druck ausgesetzt werden, mit einem aufbrechenden Mittel behandelt. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können die entspannten Zellen mit einem aufbrechenden Mittel behandelt werden. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung beträgt der geeignete hydrostatische Druck 50,7 bis 152 MPa (500 bis 1500 Atmosphären). In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden vor der Ultrazentrifugation des Überstandes die entfernten Membranproteine mit einem chemischen Vernetzungsmittel behandelt.
Die verschiedenen, erfindungsgemäß bereitgestellten Zellen, Behandlungen und Proteine werden durch Hinweis auf die folgenden Experimente und Beispiele besser verstanden, wobei diese zu Erläuterungszwecken bereitgestellt und in keiner Weise als Beschränkung des Schutzbereiches verstanden werden können.

Materialien und Verfahren

Ratten:

Inzucht-Lewis-Ratten wurden von "Animal Breeding Center of The Weizmann Institute of Science" erhalten. Ratten wurden mit einem Alter von 2 bis 3 Monaten verwendet und in jedem Experiment nach Alter und Geschlecht ausgewählt.

Antigene:

Hitze-abgetötetes M. tuberculosis H37Ra wurde von Difco Laboratories (Detroit, MI) erhalten. Gereinigtes Protein-Derivat (PPD) von Mycobakterium wurde von Staten Serum Institute (Kopenhagen, Dänemark) und Concanavalin A (Con A) von Bio-Yeda (Rehovot, Israel) erhalten. Gereinigtes Ratten-Collagen - Typ II wurde freundlicherweise von Dr. E.J. Miller von "University of Alabama Medical Center, Birmingham" zur Verfügung gestellt. Ratten-Collagen - Typ I wurde aus Ratten-Schwanzsehnen hergestellt und von Dr. D. Duskin von "Department of Biophysics of the Weizmann Institute" (16) zur Verfügung gestellt.

Kulturmedium:

In allen Zellkulturen wurde "Dulbecco's modified Eagle's medium" (Grand island Biological Co., (GIBCO), Grand Island, New York) verwendet. Die zu Proliferationstests zur Aktivierung und Klonierung (Proliferationsmedium) verwendeten Medien wurden mit 1 mM Glutamin (Bio-Lab, Jerusalem, Israel), 2-Mercaptoethanol (5·10³M), Gentamycin (40 ug/ml) und 1% frischem autologen Rattenserum ergänzt. Das zur Kultivierung der vermehrten Zellinien und Klone in permanenter Kultur (Vermehrungsmedium) verwendete Medium war das Proliferationsmedium, dem 15% (vol/vol) des Überstandes von ConA-aktivierten Lymphozyten als Quelle des T-Zellwachstumsfaktors (3), 10% Pferdeserum, (GIBCO), 1 mM Natriumpyruvat und nicht-essentielle Aminosäuren (Bio-Lab) zugesetzt wurden.

Einführung von aktiver Adjuvans-Arthritis (AA)

Zur Induzierung von aktiver AA wurden Ratten intradermal an der Schwanzbasis mit 0,1 ml Freund's vollständigem Adjuvans (CFA) inokuliert, das 10 mg/ml in Freund's unvollständigem Adjuvans (Difco Laboratories) enthielt. Das in (17) beschriebene System wurde zur Bestimmung der Schwere der Arthritis verwendet. Jede Pfote wurde von 0 bis 4 hinsichtlich Rötung, Schwellung und Mißbildung des Gelenks eingestuft. Der höchste, erreichbare Wert betrug 16. Die klinische Diagnose von AA wurde durch histologische Untersuchung der Gelenke ausgewählter Ratten wie in (18) bestätigt.

Kultivierung und Klonierung der Zellinie A2

Die zu MT reaktive Zellinie A2 wurde aus mit CFA immunisierten Ratten isoliert. Am Tag 9 wurden die ableitenden Lymphknoten entfernt und eine zu MT reaktive Zellinine wurde erhalten und wie in (19) beschrieben kultiviert. Die limitierende Verdünnungstechnik wurde angewandt, wodurch A2 kloniert wurde. Die Zellen der Zellinie wurden in vitro aktiviert, indem sie mit MT in Gegenwart akzessorischer Zellen, wie nachstehend beschrieben, drei Tage inkubiert wurden. Am dritten Tag wurden die Lymphoblasten für einen weiteren Zeitraum von sieben Tagen in ein Vermehrungsmedium überführt. Am zehnten Tag wurden die Zellen gesammelt, gewaschen, dreimal gezählt und stark gemischt. Die Zellen wurden mit 0,1 Zellen/Loch in Gegenwart bestrahlter (1,500 rad) Thymuszellen (2·10&sup7;/ml) und MT (10 ug/ml) in 96 Loch-Mikrotiterplatten ausgesät, in denen pro Loch 100 ul Proliferationsmedium vorlagen. Die Löcher wurden vom sechsten bis zum vierzehnten Tag nach Klonierung auf Zellwachstum untersucht. Die Platierungseffizienz betrug 60%. Klonierte Zellen wurden in Vermehrungsmedium in 200 ul-Löchern und dann in 2-, 6- und schließlich 10 ml Platten mit einer Konzentration von 2-4·10&sup5; Zellen/ml vermehrt. Kulturen wurden alle 3-4 Tage überführt. Alle 2-4 Wochen wurden die Zellen der Zellinien einmal reaktiviert, indem sie mit MT und akzessorischen Zellen drei Tage lang (vgl. nachstehend) inkubiert und dann wieder in das Vermehrungsmedium überführt wurden. Die klonierte Subzellinie A2b wurde auf diese Weise sechs Wochen vermehrt, bevor ihre Proliferationsantwort auf Antigene oder ihre Fähigkeit AA zu verursachen oder Resistenz zu induzieren untersucht wurde.

Aktivierung von Zellen einer Zellinie

(2·10&sup5;/ml) Zellen der Zellinie A2 oder Subzellinie A2b wurden durch dreitägige Inkubation mit 10 ug/ml MT oder 2,5 ug/ml ConA in Gegenwart von syngenen, bestrahlten, (1,500 rad) Thymuszellen (15·10&sup6;/ml) als akzessorische Zellen in dem Proliferationsmedium aktiviert. Nach drei Tagen wurden die Lymphoblasten gesammelt, zweimal in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und entweder in ein Vermehrungsmedium überführt oder für in vivo bzw. für in vitro Untersuchungen verwendet. Durch diese Zeit waren die meisten der bestrahlten Thymuszellen abgestorben und hatten sich aufgelöst.

Zell-Modifizierungen

A. Hydrostatischer Druck

Zur Druck-Anwendung auf kleine Volumina (2 ml) wurde die Zellsuspension in ein Plastikröhrchen mit Deckel gegeben und mit Probenpuffer überschichtet. Nach Verschließen wurde eine kurze 22G Nadel durch den Deckel durchgestoßen und fungierte als Luftloch zum Ausgleich des Druckes. Luftblasen wurden vermieden. Das Röhrchen wurde in den Hohlraum einer 45 ml Druckbombe (French Press Cell, Aminco) gegeben. Für größere Probenvolumina wurden die Zellsuspensionen direkt in den Hohlraum der Druckbombe gegeben.
Hydrostatischer Druck wurde allmählich mit einer Rate von 250 bar min&supmin;¹ angewandt, bis zu zwei Stunden bei dem gewünschten Wert gehalten und danach langsam entspannt. Die Zellen wurden gesammelt und zweimal in PBS gewaschen.

B. Vernetzung von Membranproteinen

Zellen wurden durch Formaldehyd oder Glutaraldehyd (0,3-1%) 15 Minuten fixiert. 106108 Zellen wurden in 2,5 ml PBS suspendiert. Das gleiche Volumen einer zweifach-konzentrierten Lösung eines Vernetzungsmittels in PBS wurde den Zellsuspensionen bei Raumtemperatur zugegeben, danach wurden die Zellen sechsmal in PBS gewaschen.

C. Aufbrechen des Zellskeletts

Das Verfahren wurde, wie in "Cross-linking of membrane proteins" beschrieben, durchgeführt, jedoch wurde eine Kombination von Cytochalasin (0,5 ug/ml) und Colchicin (10 uM) anstelle des Vernetzungsmittels verwendet.

D. Membran-Präparat

Fixierte Zellmembranen wurden erhalten, indem Zellen 15 Minuten bei 4ºC in 5 ml Volumen einer PBS-hypotonischen Lösung (1/3 physiologische Osmolarität + PMSF (10-5 M) + Acid (0,02%)) suspendiert und bei 4ºC in einem Polytron-Homogenisator (2,5 min, bei Intervallen von 30 sec, Geschwindigkeit: 6,5 Einheiten) homogenisiert wurden. Die Membranen wurden unter Verwendung eines diskontinuierlichen Sucrose-Gradienten (41% Sucrose, 96,000 g, 2 h, Rotor SW28, 4ºC) isoliert. Abgetrennte Membranen wurden gegen PBS (2h, 4ºC) dialysiert und in einer Bradford-Analyse bestimmt. Die bei diesem Verfahren erhaltene Proteinausbeute betrug 1,5-2 mg pro 3·10&sup8; Zellen.

Experimentelle Modelle:

Spezielle in vitro Zellinien von autoimmunen T-Zellen wurden entwickelt (1-9). Tabelle 1 faßt drei experimentelle Autoimmunerkrankungen zusammen, die mit diesen Zellinien von T-Lymphozyten verbunden sind. Experimentelle, autoimmune Encephalomyelitis (EAE) kann aktiv in genetisch verträglichen Stämmen von Ratten induziert werden, indem diese mit dem Basisprotein von Myelin (BP) (10) immunisiert werden. EAE tritt normalerweise als akute Erkrankung auf, dies sich durch Paralyse und Zellinfiltration in der weißen Hirnsubstanz des Zentralen Nervensystems auszeichnet. Unbehandelte Ratten erholen sich üblicherweise spontan von akuter EAE nach zwei oder drei Tagen und sind dann resistent gegenüber weiteren Versuchen, aktive EAE (2) zu induzieren. Chronische oder rezidivierende EAE kann unter bestimmten Bedingungen auch induziert werden und eine solche Erkrankung ähnelt in vielen Punkten der Multiple Sklerose beim Menschen.
Experimentelle autoimmune Thyroiditis (EAT) kann in H-2 genetisch verträglichen Mäusen induziert werden, indem diese mit Thyroglobulin (TG) in einem Adjuvans (11) immunisiert werden. EAT drückt sich als chronische Entzündung der Schilddrüse aus. Mäusestämme, die gegen EAT-Schädigungen resistent sind, können hohe Titer von TG-Autoantikörpern produzieren. EAT scheint ein Modell von autoimmuner Thyroiditis (Hashimoto's Thyroiditis) zu sein, die beim Menschen nicht ungewöhnlich ist.
Adjuvans-Arthritis (AA) unterscheidet sich von EAE und EAT darin, daß sie in Ratten induziert wird, die nicht mit einem definierten Selbst-Antigen sondern mit Mycobacterium tuberculosis-Organismen (TB) in Freund's vollständigem Adjuvans (CFA) (12) immunisiert werden. Etwa zwei Wochen nach Inokulierung entwickeln genetisch verträglich Ratten eine subakute Polyarthritis mit Merkmalen, die an einige jener erinnern, die in rheumatischer Arthritis beim Menschen gesehen werden. Es wurde vermutet, daß Collagen - Typ II das Ziel-Selbst-Antigen in AA sein könnte, da Arthritis durch Immunisierung mit diesem Antigen (13) induziert werden kann. Ein kürzlich erbrachter Nachweis drückt -jedoch aus, daß AA und Collagen II-Arthritis unterschiedliche Krankheitsbilder haben können (14, 15).
Tabelle I erläutert auch, daß ähnliche autoimmune Schädigungen durch Inokulierung mit antigen-spezifischen Zellen einer Zellinie induziert werden können. Die Einzelheiten des Aufbaus und der Kultivierung der Zellen einer Zellinie sowie das Hervorrufen der Erkrankungen sind veröffentlicht (1-5). Der Ausgang des Verfahrens sind die Immunisierung von Tieren mit dem Antigen nach Wahl und die Selektion auf spezifisch reaktive Zellen durch Kultivierung mit dem Selektionsantigen zusammen mit bestrahlten, syngenen akzessorischen Zellen. Die Antigen-präsentierenden akzessorischen Zellen müssen syngen sein, zumindest teilweise im Bereich des "major histocompatibility complex" (MHC), um die proliferative Antwort der Zellinien anzuregen (3,4). Die selektierten Zellinien werden dann mit konditioniertem Medium in Abwesenheit eines Antigens oder akzessorischer Zellen kultiviert. Stabile, zur Verursachung von Autoimmunkrankheiten fähige Zellinien haben sich alle für allgemeine T-Zellmarker (Thy 1 in Mäusen oder W3/13) und für die Marker eines verzögerten Typs von Hypersensitivität/Helferzellen (Lyt-1 oder W3/25) als positiv erwiesen, wenige oder gar keine Zelle haben sich jedoch für den Lyt-2- oder OX8-Marker von cytotoxischen Suppressorzellen als positiv erwiesen. Keine der Zellinien war für IG-Marker positiv. Zur Krankheitsverursachung muß die T-Lymphozyten-Zellinie durch Inkubation mit einem spezifischen Antigen oder T-Zellmitogen vor Inokulierung von Empfängertieren inaktiviert werden. Eine einzelne Inokulierung von so wenigen, wie 10&sup4;-10&sup5; anti-BP oder anti-Tg-Zellen kann in relativ kurzer Zeit zu den klinischen und pathologischen Symptomen von markierter EAE und EAT führen. Eine AA-Ausbildung benötigt die Verwendung größerer Zahlen von Zellen einer Zellinie (10&sup7;) und eine relativ starke Bestrahlung der Empfängerratten (750 rad). Die Empfänger müssen mit den Zellen der Zellinie im Bereich des MHC für die auszubildende Krankheit syngen sein. Die charakteristischen Autoimmun-Schädigungen werden durch eine immunologisch-spezifische Akkumulation der Zellen der Zellinie in dem Zielorgan begleitet. Es gibt keine Anzeichen dafür, daß Autoantikörper in einer Krankheit, die durch die T-Lymphozyten-Zellinien hervorgerufen wird, eine Rolle spielen.
Vorliegend ist es auch gelungen, Encephalomyelitis- oder Arthritis-klonierte Zellen zu produzieren; die anti-BP-Klone waren etwas weniger virulent als ihre Ausgangszellinien, während ein isolierter anti-TB-Klon viel virulenter als seine Ausgangszellinie war.

Vakzinierung gegen eine Autoimmunerkrankung

Die Verwendung von Zellinien als spezifische Vaccine zur Induzierung einer Resistenz gegen eine Autoimmunerkrankung ist in Tabelle II zusammengefaßt. Zellen einer Anti-BP-Zellinie, die bestrahlt oder mit Mitomycin C behandelt worden waren, konnten nicht länger EAE produzieren. Eine einzelne intravenöse Inokulierung mit solchen abgeschwächten Zellen der Zellinie führt jedoch zu einer durch Immunisierung mit BP/CFA aktiv-induzierten Resistenz in etwa 65% der Ratten. In früheren Experimenten waren die Ratten noch für EAE empfänglich, die durch passiven Transfer von Zellen einer anti-BP-Zellinie hervorgerufen wurde, was vermuten ließ, daß der Resistenzmechanismus weniger wirksam gegen vorgebildete Effekte oder Zellen sein könnte, als gegen differenzierende Zellen (7). Von den Anmeldern wurde jedoch kürzlich beobachtet, daß es möglich ist, eine an einen positiven Transfer von Zellinien gebundene EAE wie auch eine aktive EAE unter Verwendung von Druck-behandelten Zellen (20) zu verhindern. Im Gegenteil wurde gefunden, daß eine einzelne intravenöse Inokulierung mit abgeschwächten Zellen einer anti-TG-Zellinie eine aktive durch TG/CFA induzierte EAT nicht vollständig inhibiert, jedoch eine durch Inokulierung mit aktivierten Zellen einer anti-TG-Zellinie verursachte EAT verhindert. Somit ist eine Resistenz gegen eine Autoimmunerkrankung im Prinzip nicht auf die frühen Phasen der Differenzierung beschränkt, sondern kann auch die Entwicklungsphase einer Erkrankung umfassen. Vergleiche Tabelle V für Ergebnisse von Vakzinierungs-Experimenten, die mit Druck-, Vernetzungsmittel- oder aufbrechendem Mittel-behandelten T-Lymphozyten durchgeführt wurden. Vergleiche ferner die Fig. 3-5 für Ergebnisse von Vakzinierungs-Experimenten, die T-Lymphozyten umfassen, welche durch verschiedene erfindungsgemäße Verfahren modifiziert worden sind.

Therapie mit Membranproteinen

Zellen einer autoimmunen Zellinie erwiesen sich als wirksame Mittel zur Prävention und Behandlung von experimenteller Autoimmunität. Dieser Zugang kann für die Handhabung von klinischen Autoimmunerkrankungen, Krankheiten für die es keine spezielle Therapieart gibt, hilfreich sein. Obwohl die klinische Betonung eher auf der Behandlung als auf der Prävention liegen muß, ist es in der Praxis möglich, daß diese Trennung nicht kritisch ist. Autoimmunerkrankungen von ernstlicher Bedeutung sind oft progressiv oder rezidivierend und eine Prävention der Differenzierung neuer Wogen von autoimmunen Lymphozyten kann selbst eine wirksame Therapie bilden.
Fig. 1 erläutert die Linderung von AA durch eine einzelne Inokulierung mit Zellen einer Zellinie. In diesem Experiment wurden Ratten, die an aktiv-induzierter AA litten, mit Zellen einer spezifischen anti-TB-Zellinie oder mit Zellen einer Kontrollinie behandelt. Die mit den Zellen der spezifischen Zellinie behandelten Ratten hatten eine weniger starke Erkrankung und ein beschleunigtes Nachlassen der Krankheitserscheinung.
Eine weitere Überlegung ist die Identifizierung und Verfügbarkeit von Selbst-Antigenen, gegen die die autoimmunen Lymphozytenzellinien ausgewählt werden sollten. Oftmals sind die Selbst-Antigene unbekannt oder liegen nur in sehr begrenzter Menge vor. Dennoch läßt das AA-Model vermuten, daß es möglich sein sollte, relevante Zellinien aufzubauen, indem Gemische von schwach definierten, sogar von fremden Quellen stammenden Antigene verwendet werden. Warum oder wie spezifisch-virulente autoimmune Zellen unter solchen Bedingungen hervortreten sollten, ist ein Rätsel, jedoch eine Tatsache. Allerdings ist es nicht notwendig, Zellinien oder Klone von T-Lymphozyten aufzubauen, um wirksame Vakzine zu erhalten. Lymphknotenzellen, die direkt von Ratten oder Mäusen mit AA, EAE oder EAT entnommen worden sind, können mit einem spezifischen Antigen oder einem T-Lymphozyten-Mitogen aktiviert und mit Druck, Vernetzungsmittel oder aufbrechendem Mittel behandelt werden und die zur Erzielung der Ergebnisse verwendeten Zellen sind in den Tabelle 4, 5 und 6 beschrieben.
Für eine Therapie kann es vorteilhaft sein, subzelluläres Material von Zellen einer Zellinie oder Zellen verstärkter Antigenizität zu verwenden und es wurde gefunden, daß Membranproteine wirksam verwendet werden können. Membranproteine von Zellen einer Zellinie wurden nach einem neuen Verfahren gewonnen, das früher zur Isolierung von Blutgruppen-Antigenen aus humanen Erythrozyten angewandt wurde. Das Verfahren basiert auf der Überlegung, daß die Gleichgewichtsposition von Membranproteinen gegen die wäßrige Domäne nach Verfestigung der Membran-Lipid- Doppelschicht versetzt wird, und bei starken Lipid- Viskositäten die Proteine entfernt werden. Im Prinzip hat jedes integrierte Membranprotein einen definierten Lipid-Viskositäts-Grenzwert, an dem es von der Membran entfernt wird.
Die wirksamste Weise einer Hyper-Verfestigung von Membranen ist die Anwendung eines hydrostatischen Druckes von 50,7 bis 152 MPa (500 bis 1500 atm), der durch eine Vorbehandlung mit Cholesterin verstärkt werden kann. Zellen überleben in der Regel eine solche Behandlung und das freigesetzte Material kann nach der Größe durch Zentrifugation fraktioniert werden. Material, das im Überstand nach einstündiger Zentrifugation bei 100000 G verbleibt, kann als isolierte Proteine oder kleine Aggregate davon betrachtet werden. Das Präzipitat dieser Zentrifugation besteht aus Membranfragmenten und großen Proteinaggregaten. Die löslichen Membranproteine behalten in der Regel ihre Aktivität im Gegensatz zu Membranproteinen, die durch die übliche Verwendung von Detergentien isoliert worden sind.
Die Fähigkeit zur Immunisierung gegen Autoimmunerkrankungen fand sich in den folgenden Fraktionen, nämlich in: (a) unter Druck stehenden, aktivierten Zellen (vermutlich gebunden an eine laterale Umschichtung und vertikale Versetzung der spezifischen Antigenrezeptoren), (b) den entfernten, löslichen Proteinen und (c) den Membranfragmenten.
Tabelle III zeigt, daß durch das Druck-Verfahren isolierte Membranfraktionen immunologisch-spezifisch in der Inhibierung der Reaktion von Zellen einer autoimmunen Zellinie mit ihrem speziellen Antigen waren. Beispielsweise inhibierte die aus der Zla anti-BP Zellinie erhaltene Membranfraktion die Reaktion von intakten Zellen der Zla Zellinien mit BP, dagegen inhibierte sie nicht die Reaktion von Zellen der Arthritis-produzierenden A2 Zellinie mit ihrem Antigen. Umgekehrt inhibierte die aus Zellen der Arthritis-produzierenden Zellinie A2 erhaltene Membranfraktion die Reaktion von intakten Zellen der Zellinie A2, nicht jedoch die Reaktion von Zellen der Zellinie Zla. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, daß die Membranen biologisch-aktive Rezeptoren enthalten, die für Selbst-Antigen spezifisch sind.
Fig. 2 zeigt die Ergebnisse eines Experiments, in dem Ratten zwei Dosen von jeweils 0,05 ug einer Membranfraktion aus Zellen der Zellinie Zla in wöchentlichen Intervallen verabreicht wurden und zwei Wochen später aktives EAE in den Ratten induziert wurde. Es wird deutlich, daß die mit der Membranfraktion behandelten Ratten nur an einer schwache Paralyse im Vergleich zu den Kontrollratten litten. Somit konnte der Verlauf der Erkrankung deutlich durch Verwendung spezifischer Membranfraktionen gelindert werden. Tabelle IV zeigt die Ergebnisse einer Vakzinierung von Ratten mit Druck-aktivierten Zellen einer anti-BP Zellinie. Es wird deutlich, daß die mit Zellen einer Kontrollinie behandelten Ratten für EAE empfänglich waren, während Ratten, die mit Druck-behandelten, spezifischen Zellen einer anti-BP Zellinie behandelt worden waren, vollständig resistent gegen EAE waren. Sie waren ebenfalls gegen aktive EAE resistent, die durch intakte Zellen einer anti-BP Zellinie (Daten nicht gezeigt) verursacht wurde. Vergleiche auch Tabelle VI hinsichtlich der Ergebnisse von Druck-behandelten, mit einem Vernetzungsmittel behandelten Membranpräparate, die als Vakzine gegen AA verwendet wurden.
Beispiele von Autoimmunerkrankungen, die mit einem Membranprotein von Zellen einer autoimmunen Zellinie behandelt werden können: Humane Autoimmunerkrankungen Antigen, verwendet zur Aktivierung von T-Lymphozyten Multiple Sklerose a) Myelin-Basisprotein b) Rohextrakt aus zentralem Nervensystem Thyroiditis a) Thyroglobulin b) Rohextrakt aus der Schilddrüse Diabetes (Typ I) a) Extrakt aus Inselzellen Ankylosierende Spondylitis (spezifische Typen) a) Bestimmte Klebsiella-Bakterien b) Rohextrakt aus Gelenken Rheumatische Arthritis a) Rohextrakt aus Gelenken

Beispiel 1

Vakzine-Herstellung

Zellen einer Zellinie von gegen das Myelin-Basisprotein gerichteten T-Lymphozyten wurde verwendet (Zla-Zellinie). Diese Zellen induzieren eine experimentelle, autoimmune Encephalitis (EAE) in Ratten. 6·10&sup8; Zellen, die in 2,5 ml einer Phosphat-gepufferten Kochsalzlösung mit einem pH von 7.2 (PBS) suspendiert waren, wurden in eine sterile Druckkammer gegeben. Der Deckel wurde direkt auf die Oberfläche der Lösung gegeben, wodurch jegliche Luftblasen vermieden wurden. Durch eine "French Press" (15 Minuten) wurde allmählich ein Druck von 1000·0,1013 MPa (1000 atm) ausgeübt und bei diesem Wert 45 Minuten gehalten. Der Druck wurde dann langsam (15 Minuten) auf atmosphärischen Druck entspannt. Die Zellen wurden in ein Teströhrchen überführt, bei 1500 rpm abzentrifugiert und das Präzipitat wurde abgetrennt. Die durch Trypanblau-Ausschluß getestete Zell-Lebensfähigkeit betrug über 90%. Der Überstand wurde dann 1 h bei 100000 g ultrazentrifugiert. Der Überstand (etwa 699 ug Protein in 2 ml PBS) wurde gesammelt und in den nachstehend beschriebenen, funktionellen in vivo und in vitro Experimenten verwendet.
In dem in vitro Experiment wurden Zellen der Zellinie Zla zur Proliferation durch Zugabe ihres spezifischen Antigens (0,2 ug/ml Myelin-Basisprotein) induziert.
Die Zellproliferation wurde durch Counts pro Minute an eingebautem, radioaktiven Thymidin ausgedrückt. Die Zugabe von 30 ug/ml der freigesetzten Proteine (vgl. nachstehend) führte zu einer Reduzierung der Zellproliferation um 40-60%. Wurden 30 ug/ml von Proteinen, die aus Zellen einer anderen T-Zellinie (einschließlich Arthritis) entfernt worden waren, verwendet, wurde keine Wirkung auf die Zellproliferation festgestellt. Typische Ergebnisse eines solchen Experiments sind in Tabelle 111 gezeigt, und weisen darauf hin, daß das von dem Zelloberflächendruck entfernte Material einen spezifischen Rezeptor für das induzierende Antigen umfaßt. Dieses Material kann zur Immunisierung gegen den Rezeptor verwendet werden, wodurch eine teilweise oder vollständige Eliminierung der Autoimmunerkrankung erreicht wird. Ein solches Experiment wird nachstehend beschrieben.
Ratten wurden zunächst zweimal in wöchentlichem Intervall durch Inokulierung von 0,5 ug löslicher, durch Druck aus Zellen der Zellinie Zla freigesetzter Proteine vorimmunisiert. Zwei Wochen später wurden die Ratten mit BP-Antigen in einem Adjuvans angeregt. Nach 14 Tagen bildeten alle Ratten in der Kontrollgruppe eine starke EAE aus, während die vorbehandelten Ratten nur eine schwache Form von EAE zeigten. Typische Profile nach Anregung mit einer encephalogenen Dosis von BP sind in Fig. 2 gezeigt. Wiederum zeigte eine Vorbehandlung der Ratten mit Proteinen, die durch Druck aus einer nicht-verwandten Zellinie (Arthritis) entfernt worden waren, keine Wirkung auf die Entwicklung von EAE. Tabelle 1 Experimentelle Autoimmunerkrankungen, aktiv-induziert oder durch Zellen einer autoimmunen T-Lymphozyten-Zellinie erzeugt Aktiv-induzierte Erkrankung Erkrankung, die durch Zellen einer Zellinie erzeugt wurde Erkrankung Art Zielorgan Selbst-Antigen Immunisierung Latenz (Tage) Verlauf Antigen zur Zellinien-Selektion Zell-Inokulum Empfänger Ratte weiße Hirnsubstanz des ZNS Aktu Intakt Maus Schilddrüse Chronisch Gelenke Subakut Bestrahlt * Abkürzungen in den Tabellen: AA, Adjuvans-Arthritis; BP, Myelin-Basisprotein; CFA, Freunds vollständiges Adjuvans; ZNS, Zentrales Nervensystem, EAE experimetelle, autoimmunge Encephalomyelitis; EAT, experimentelle, autoimmune Thyroiditis; IFA, Freunds unvollständiges Adjuvans; Tb, Mycobacterium tuberculosis-Organismen; Tg, Thyroglobulin Tabelle II Vakzinierung gegen Autoimmunerkrankungen unter Verwendung spezifischer Zellen einer autoimmunen Zellinie Erkrankung Vakzine Zellinie Behandlung Resistenz gegen die Erkrankung induzierte Aktivität durch Zellinie erzeugt Resistenzgrad Bestrahlung ja nein vollständige Autoantikörper-Entwicklung keine vollständig
Ratten oder Mäuse, die intravenös mit Zellen einer aktivierten Zellinie (anti-BP, 5·10&sup6;, anti-Tg 5·10&sup6;, anti-Tb 2·10&sup7;) inokuliert wurden, einige davon waren bestrahlt worden (1,500 rad). Kontrolltiere (Daten nicht gezeigt) wurden mit Zellen einer gegen irrelevante Antigene gerichteten Zellinie inokuliert. Zwei bis vier Wochen später wurden die Tiere zur Induzierung aktiver Autoimmunerkrankungen angeregt. Tabelle III Membranfraktionen inhibieren proliferative Reaktionen von Zellen einer spezifischen Linie Zellulärer Ursprung der Membranfraktion Profliferations-Reaktion auf spezifisches Antigen % Inhibition der Zellinie
Membranfraktionen von den Zellinien A2 (Arthritis) und Zla (Encephalomyelitis) wurden unter Verwendung des Druck-Verfahrens (1,000 atm) erhalten und 50 ug/ml von intakten Zellen der Zellinien wurden in die Profliferations-Reaktionen auf das spezifische Antigen eingesetzt. Die prozentuale Inhibition wurde berechnet, indem die Reaktion in Gegenwart der aus Zellen der spezifischen Zellinie erhaltenen Membranfraktion mit der Reaktion in Gegenwart der Membranfraktion aus Zellen einer anderen Zellinie verglichen wurde.
Experimente, die mit Druck-behandelten, aktivierten Zellen ausgeführt wurden, ergaben praktisch identische Ergebnisse. Tabelle IV Vakzinierung gegen EAE unter Verwendung von Druck-behandelten aktivierten Zellen einer Anti-BP Zellinie Behandlung von Ratten mit Druck-behandelten, aktivierten Zellen einer Zellinie EAE, induziert durch aktive Immunisierung mit BP/CFA Auftreten Schwere des klinischen Auftretens Kontrolle mäßig bis stark Anti-BP keine bis sehr schwach
Lewis-Ratten wurden intraperitoneal mit Anti-BP oder Zellen einer Kontrollinie (5·10&sup6;) viermal wöchentlich inokuliert, die aktiviert und mit hydrostatischem Druck (1150 atm für 15 Minuten) behandelt und eine Woche später mit BP/CFA zur Induzierung aktiver EAE angeregt worden waren. Tabelle V Vakzinierung gegen experimentelle autoimmune Thyroiditis unter Verwendung von T-Lymphozyten-Vakzinen T-Lymphozyten-Vakzine Behandlung von T-Lymphozyten %-Auftreten von Thyroiditis keine Anit-Tg Druck Colchicin + Cytochalasin Formaldehyd
Gruppen von 10 Mäusen des Stammes C3H/eBxC57BL/6J)F1 wurden zur Entwicklung von experimenteller, autoimmuner Thyroiditis mittels einer intravenösen Inokulation von 2·10&sup6; T-Lymphozyten einer Anti-Thyroglobulin (Anti-Tg) Zellinie induziert. Vor Induktion der Erkrankung wurden einige Mäuse mit drei wöchentlichen subkutanen Injektionen von 10·10&sup6; T-Zellen einer aktivierten Anti-Tg Zellinie behandelt, die mit Druck, Colchicin+Cytochalasin oder Formaldehyd, wie in der Legende von Fig. 3 beschrieben, behandelt worden war. Die Schwere von Thyroiditis wurde durch histologische Untersuchung der Schilddrüse eine Woche später eingestuft. Tabelle VI Vakzinierung gegen AA unter Verwendung von isolierten Membran-Präparaten von unter Druck gesetzten und vernetzten T-Lymphozyten Vakzinierung mit Membranen des Klons A2b Induktion von AA durch MT Druck Formaldehyd Auftreten von AA Mittlere AA-Werte am Tag 20 kein Ja
Gruppen von 10 Lewis-Ratten wurden (bzw. nicht) viermal subkutan in wöchentlichen Abständen mit 1,2 mg von A2b-isolierten Membranpräparaten vakziniert. Eine Woche später wurden die Ratten mit MT (1 mg in Öl) zur Induktion von AA angeregt. Der klinische Wert am Tag 20 der behandelten Ratten wird in eine Skala von 0 bis 100%, wie in der Legende von Fig. 3 beschrieben, eingestuft.
Isolierte Membranen wurden wie folgt hergestellt: 3·10&sup8; aktivierte A2b T-Zellen wurden mit hydrostatischem Druck (1500 bar für 15 Minuten) behandelt und die Hälfte der Zellen wurde ebenfalls mit dem Vernetzungsmittel Formaldehyd (0,3%, 15 Minuten) behandelt und sechsmal in PBS gewaschen. Membranen wurden erhalten, indem die Zellen in einer hypotonischen Lösung von NaCl (1/3 physiologische Osmolarität + PMSF (10&supmin;&sup5;M) + Azid (0,02%)) lysiert wurden. Die Zellen wurden in einem Polytron-Homogenisator (6,5 Min, 2,5 Einheiten für 30 Sekunden bei 4ºC) homogenisiert und die Membranen mit einem 41% Sucrosegradienten (96000 g, 2 h, Rotor SW28, bei 4ºC) isoliert. Die Membranen wurden gegen PBS (2h, 4ºC) dialysiert und die Proteine durch eine Bradford-Analyse bestimmt: Die Ausbeute des Membranproteins betrug 1,5-2 mg.

Beispiel 2

Prävention von autoimmunem Diabetes mellitus unter Verwendung von behandelten Lymphozyten aus diabetischen Mäusen

C57BL/KS Mäuse entwickeln einen autoimmunen Diabetes, nachdem ihnen 5 tägliche Dosen (50 mg/kg jeweils) des Toxins Streptozotocin (STZ) (21) verabreicht wurden. Bei dieser Dosis induziert STZ Diabetes, indem ein schwacher Schaden den pankreatischen Beta-Zellen zugeführt wird, die normalerweise Insulin produzieren. Die T-Lymphozyten der STZ ausgesetzten Mäuse erkennen und greifen als Folge davon bestimmte nicht-definierte Beta-Zell-Antigene an, was zu autoimmuner Zerstörung des klinischen Diabetes der Beta-Zellen der Tiere führt.
Experimente wurden durchgeführt, indem Milz-T-Lymphozyten der STZ-ausgesetzten Mäuse zur Vakzinierung gegen Diabetes verwendet wurden. Die Milz-Lymphozyten wurden zwei Tage mit dem T-Zellmitogen Concanavalin A inkubiert, wodurch die autoimmunen, in der Milz vorliegenden und für den Angriff auf die Beta-Zellen verantwortlichen T-Zellen aktiviert wurden. Diese aktivierten Lymphozyten wurden dann durch 15-minütige Inkubation mit dem chemischen Vernetzungsmittel Glutaraldehyd bei einer Konzentration von 0,3% in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung behandelt. Die Glutaraldehyd-behandelten T-Zellen wurden sechsmal in frischer Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung gewaschen und Gruppen von 20 C57BL/KS Mäusen wurden subkutan mit 2·10&sup7; aktivierten, Glutaraldehyd-behandelten T-Zellen inokuliert. Zwei Woche später wurden die Mäuse einem fünftägigen STZ-Verlauf zur Induzierung von Diabetes ausgesetzt. Die Ergebnisse sind in Tabelle VII dargestellt. Tabelle VII Prävention von autoimmunem Diabetes durch Vakzinierung unter Verwendung von Glutaraldehyd-behandelten T-Zellen T-Zellen-Vakzinierung a Auftreten von Diabetes b keine Ja a Gruppen von 20 C57BL/KS Mäusen wurden (bzw. nicht) mit einer einzelnen Injektion von 2·10&sup7; Glutaraldehyd (0,3%)-behandelten, aktivierten T-Zellen vakziniert, die aus der Milz von STZ-ausgesetzten, diabetischen Mäusen erhalten worden waren. b Die Mäuse wurden durch einen STZ-Verlauf (50 mg/kg, täglich für fünf Tage) angeregt und auf das Auftreten von Diabetes durch Messungen von Glycosuria, Hyperglykämie (500 mg) und einem histologischen Anzeichen von Insulitis untersucht.
Die relative Resistenz der vakzinierten Mäuse gegen autoimmunen Diabetes weist auf folgendes hin, nämlich auf: (a) die Wirksamkeit von Glutaraldehyd-behandelten T-Zell-Vakzinen, (b) die Prävention von Diabetes und (c) die Fähigkeit zu Vakzinieren ohne Rückgriff auf gereinigte Zellinien und definierte Antigene unter Verwendung von Mitogen-aktivierten Milz-Zellen, die direkt aus diabetischen Mäusen erhalten wurden.
Entsprechend können ähnliche Populationen von T-Zellen aus dem Blut von diabetischen oder anderen Patienten erhalten und zur Herstellung von T-Zell-Vakzinen verwendet werden.

Beispiel 3

T-Zell-Vakzine, behandelt mit hydrostatischem Druck, und Glutaraldehyd

Gruppen von 20 Lewis-Ratten wurden in wöchentlichen Intervallen durch drei subkutane Injektionen von 10&sup7; aktivierten T-Zell-Vakzine vakziniert. T-Zell-Vakzine waren entweder ein Anti-Bp- oder ein Anti-MT-Klon, die mit hydrostatischem Druck (1250 bar, 15 Minuten) gefolgt von Glutaraldehyd (0,3%, 15 Minuten) behandelt worden waren. Eine Woche nach der letzten Vakzinierung wurden die Ratten mit BP (Myelin-Basisprotein, 25 ug) in einem Adjuvans zur Induzierung von EAE (experimentelle, autoimmune Encephalomyelitis) oder mit MT (Mycobacterium tuberculosis, Img) in Öl zur Induzierung von AA (Adjuvans-Arthritis) angeregt.
Die Daten in der nachstehenden Tabelle VIII zeigen, daß Klone der aktivierten T-Zellen durch eine Kombination von Druck und Vernetzungsmitteln behandelt und als spezifische Vakzine verwendet werden können. Tabelle VIII Spezifische Vakzinierung von aktivierten, mit hydrostatischem Druck- und Glutaraldehydbehandelten T-Zellen T-Zellen-Vakzine Induzierte Erkrankung Auftreten Schwere Keine letal schwer Anti-BP schwach schwer Anti-MT letal
Die Ergebnisse weisen auf folgendes hin, nämlich auf (a) die Wirksamkeit einer Kombination von hydrostatischem Druck und einem chemischen Vernetzungsmittel zur Herstellung von T-Zell-Vakzinen, (b) die immunologische Spezifität der Vakzine (jede Vakzine induzierte eine Resistenz gegen die Erkrankung, mit der sie immunologisch verbunden war), und (c) den Umstand hin, daß die T-Zell-Vakzinierung zu einer Inhibierung der T-Zell-Reaktion auf das Antigen führt.
In einem weiteren Experiment wurden (bzw. nicht) Lewis-Ratten mit Zellen des Anti-MT-Klons vakziniert, die entweder durch eine gamma-Bestrahlung oder eine Kombination von hydrostatischem Druck und einem chemischen Vernetzungsmittel behandelt worden waren. Gruppen von 10 Lewis-Ratten wurden speziell nicht vakziniert oder durch 3 wöchentliche Inokulationen von 10&sup7; Zellen des A2b (Anti-MT)-Klons vakziniert, die entweder bestrahlt (1500 rad) oder mit hydrostatischem Druck (1250 bar für 15 Minuten) gefolgt von Glutaraldehyd (0,3% für 15 Minuten) behandelt worden waren. Die Ratten wurden dann eine Woche später mit MT (1 mg) in Öl in den Hinterfußpfoten immunisiert. Die ableitenden Lymphknoten wurden neun Tage später entfernt und ihre Proliferations-Reaktionen auf MT in vitro durch den Einbau von ³H-Thymidin in die DNA bestimmt. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle IX gezeigt. Tabelle IX T-Zell-Vakzinierung führt zur Suppression der T-Zell- Reaktivität auf das Antigen Vakzinierung Anti-MT-Klon Behandlung des Klons Reaktion auf MT keiner keine Bestrahlung Druck, Glutaraldehyd
Die Ergebnisse weisen auf die Wirksamkeit der T-Zell- Vakzinierung mit durch eine Kombination von Druck und Glutaraldehyd-behandelten Zellen in der Suppression der T-Zell-Reaktivität auf ein Antigen hin.

Beispiel 4

Therapeutische Vakzinierung von etablierter Adjuvans- Arthritis unter Verwendung von behandelten aus arthritischen Tieren erhaltenen Zellen

Der klinische Einsatz einer T-Zell-Vakzinierung gegen eine humane Autoimmunerkrankung kann verwendet werden: (1) zur Behandlung von Individuen, die bereits an einer speziellen Autoimmunerkrankung leiden, eher als zur Prävention einer zukünftigen Erkrankung, (2) als Vakzine von autoimmunen T-Zellen, die von dem kranken Individuum eher als von einem gesunden Individuum erhalten werden, und (3) zur Herstellung von Vakzinen von aus dem Individuum direkt entfernten Zellpopulationen eher als zur Herstellung von Vakzinen aus permanenten Zellinien oder Klonen.
Die folgenden Experimente zeigen die Erfüllung dieser Angaben in dem Modell der Adjuvans-Arthritis.
Adjuvans-Arthritis wurde in einer Gruppe von 30 Lewis-Ratten induziert, indem jede Ratte mit 1 mg Mycobakterium tuberculosis-Organismus (H37Ra) in Öl immunisiert wurde. Am Tag 15, als alle Ratten an offener Arthritis litten, wurden drei Gruppen von jeweils 10 Ratten, bzw. nicht subkutan mit Lymphknotenzellen (50·10&sup6;) vakziniert, die aus einer anderen Gruppe von Ratten erhalten worden waren, welche auch an einer schweren Adjuvans-Arthritis litten. Die Spender-Lymphknotenzellen wurden durch Inkubation mit dem T-Zellmitogen Concanavalin A (1,5 ug/ml für 48h) aktiviert. Einige der Spenderzellen wurden durch Bestrahlung (2500 rad) alleine behandelt und andere der Spenderzellen wurden mit dem chemischen Vernetzungsmittel Glutaraldehyd (0,3%) für 15 Minuten behandelt und dann stark in einer Kochsalzlösung gewaschen. Eine Kontrollgruppe von 10 Ratten blieb unbehandelt.
Am Tag 17 erhielten die Gruppen von Ratten eine Booster-Vakzinierung mit 50·10&sup6; Spenderzellen, die wie vorstehend, bestrahlt oder mit Glutaraldehyd behandelt worden waren. Am Tag 24 wiesen alle Ratten, die mit Glutaraldehyd-behandelten Spenderzellen vakziniert worden waren, eine vollständige, anhaltende Remission auf, während die unbehandelten Kontrollratten und die mit bestrahlten Spenderzellen behandelten Ratten weiterhin an fortschreitender Adjuvans-Arthritis litten. Die nachstehende Tabelle X faßt die Ergebnisse zusammen. Tabelle X Therapeutische Vakzinierung gegen Adjuvans-Arthritis Spender-Lymphknotenzellen von arthritischen Ratten Behandlung der Lymphknotenzell-Vakzine Adjuvans-Arthritis am Tag 25 und danach Auftreten Schwere keine stark Bestrahlung mäßig stark Glutaraldehyd
Diese Ergebnisse weisen darauf hin, daß (1) Vakzine direkt aus kranken Individuen hergestellt werden können, (2) eine Glutaraldehyd (chemisches Vernetzungsmittel)-Behandlung von Zellen diese zu einer wirksamen Vakzine werden läßt, während die Bestrahlung nicht dazu führt, und (3) eine Behandlung einer etablierten Erkrankung erreichbar ist.

Beispiel 5

T-Zell-Vakzinierung gegen eine Hypersensitivität (DTH) vom verzögerten Typ auf ein Haut-sensibilisierendes Antigen

Zusätzlich zu Autoimmunerkrankungen verursachen T-Lymphozyten Hypersensitivitäts (DTH)-Reaktionen vom verzögerten Typ gegen fremde Chemikalien, wie Oxazolon (DX) oder Dinitrofluorbenzol (DNFB). Zur Demonstration der allgemeinen Verwendbarkeit durch Nachweise ihrer inhibitorischen Wirkung auf DTH wurden Gruppen von 10 BALB/c Mäusen für OX oder DNFB sensibilisiert, indem die Haut der Mäuse mit der einzelnen Chemikalie in einem geeigneten Träger bestrichen wurde. Eine DTH-Allergie gegen die Chemikalie wurde fünf Tage später getestet, indem die Chemikalie auf die Ohren der Mäuse aufgetragen und die Zunahme der Ohrdicke 24h später gemessen wurde. Mäuse wurden durch subkutane Injektion von 20·10&sup7; Lymphknotenzellen aus Spendermäusen vakziniert, die fünf Tage eher für die Chemikalie sensibilisiert worden waren. Die Spender- Lymphknotenzellen wurden durch eine 48-stündige Inkubation mit Concanavalin A aktiviert und dann entweder durch eine Bestrahlung (2500 rad) oder durch Glutaraldehyd (0,3%) für 15 Minuten behandelt, bevor sie als Vakzine verwendet wurden. Typische Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle XI gezeigt. Tabelle XI Vakzinierung von Mäusen gegen DTH durch OX Vakzine Sensibilisierung der Spender-Mäuse Behandlung der Spender-Lymphknoten-Zell-Vakzine DTH in der Test-Maus Sensibilisierungs-Antigen % Inhibition von DTH keine Bestrahlung Glutaraldehyd
Die Daten in Tabelle XI zeigen, daß Lymphknotenzellen von Spendermäusen, die für OX sensibilisiert worden waren, zur Vakzinierung von Testmäusen gegen DTH-Reaktivität durch OX verwendet werden können, nicht jedoch zur Vakzinierung gegen eine DTH-Reaktivität durch DNFB, mit der Maßgabe, daß die Spendervakzine aus Glutaraldehyd-behandelten Zellen zusammengesetzt ist. Bestrahlte Spender-Zellen eignen sich nicht zur Vakzinierung.
Diese Ergebnisse weisen darauf hin, daß
(1) Chemisch-vernetzte, aktivierte Lymphknotenzellen gegen eine DTH-Reaktivität in immunologisch-spezifischer Weise vakzinieren,
(2) Bestrahlte Spender-Zellen nicht vakzinieren,
(3) Eine Vakzinierung mit Zellen wirksam gegen fremde Antigene wie auch gegen Selbst-Antigene und Autoimmunität ist,
(4) Spender-Zellen nicht mit dem spezifischen Antigen aktiviert werden brauchen, um als Vakzine zu dienen, jedoch mit einem Mitogen, wie Concanavalin A, aktiviert werden können, und
(5) Lymphknotenzellen wie auch T-Zellinien und -Klone wirksam verwendet werden können.

Literaturliste

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9. Holoshitz, J., Frenkel. A., Sen-Nun, A. und Cohen, I.R. (1983). J. Immunol. 131:2810-2813.
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Claims

1. Druckbehandelte, aktivierte T-Lymphozytenzelle mit der Eignung zur Verhinderung oder Behandlung einer speziellen Autoimmunerkrankung, die mittels eines hydrostatischen Drucks in der Größenordnung von 50,7-152 MPa (500 bis 1500 atm) eine ausreichende Zeit lang druckbehandelt wurde, um eine vermehrte Antigenizität der T-Lymphozytenzellen ohne nennenswerten Verlust an Membranproteinen von den Zellen herbeizuführen, und die eine zusätzliche - Behandlung mit einem chemischen Vernetzungsmittel erfahren hat.

2. Druckbehandelte, aktivierte T-Lymphozytenzelle nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der speziellen Autoimmunerkrankung um multiple Sklerose, Thyroiditis, Diabetes Typ I, ankylosierende Spondylitis, rheumatische Arthritis oder Myasthenia gravis handelt.

3. Druckbehandelte, aktivierte T-Lymphozytenzelle nach Anspruch 1, die nach der Druckbehandlung mit dem chemischen Vernetzungsmittel behandelt wurde.

4. Druckbehandelte, aktivierte T-Lymphozytenzelle nach Anspruch 1, die vor der Druckbehandlung mit dem chemischen Vernetzungsmittel behandelt wurde.

5. Druckbehandelte, aktivierte T-Lymphozytenzelle mit der Eignung zur Verhinderung oder Behandlung einer speziellen Autoimmunerkrankung, die mittels eines hydrostatischen Drucks in der Größenordnung von 50,7-152 MPa (500 bis 1500 atm) eine ausreichende Zeit lang druckbehandelt wurde, um eine vermehrte Antigenizität der T-Lymphozytenzellen ohne nennenswerten Verlust an Membranproteinen von den Zellen herbeizuführen, und die einer zusätzlichen Behandlung mit einem Mittel zum Aufbrechen des Zellskeletts unterworfen wurde.

6. Druckbehandelte, aktivierte T-Lymphozytenzelle nach Anspruch 5, die nach der Druckbehandlung einer Behandlung mit dem Mittel zum Aufbrechen des Zellskeletts unterworfen wurde.

7. Druckbehandelte, aktivierte T-Lymphozytenzelle nach Anspruch 5, die vor der Druckbehandlung mit ,dem Mittel zum Aufbrechen des Zellskeletts behandelt wurde.

8. Mit einem chemischen Vernetzungsmittel behandelte, aktivierte T-Lymphozytenzelle mit der Eignung zur Verhinderung oder Behandlung einer speziellen Autoimmunerkrankung.

9. Mit einem chemischen Vernetzungsmittel behandelte, aktivierte T-Lymphozytenzelle nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der speziellen Autoimmunerkrankung um multiple Sklerose, Thyroiditis, Diabetes Typ I, ankylosierende Spondylitis, rheumatische Arthritis oder Myasthenia gravis handelt.

10. Mit einem Mittel zum Aufbrechen behandelte, aktivierte T-Lymphozytenzelle mit der Eignung zur Verhinderung oder Behandlung einer speziellen Autoimmunerkrankung.

11. Mit einem Mittel zum Aufbrechen behandelte, aktivierte T-Lymphozytenzelle nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der speziellen Autoimmunerkrankung um multiple Sklerose, Thyroiditis, Diabetes Typ I, ankylosierende Spondylitis, rheumatische Arthritis oder Myasthenia gravis handelt.

12. Mit einem Mittel zum Aufbrechen behandelte aktivierte T-Lymphozytenzelle nach Anspruch 10, die eine zusätzliche Behandlung mit einem chemischen Vernetzungsmittel erfahren hat.

13. Verfahren zur Herstellung druckbehandelter, aktivierter T-Lymphozyten mit der Eignung zur Verhinderung oder Behandlung einer speziellen Autoimmunerkrankung nach Anspruch 1, durch:

a) Suspendieren für die Autoimmunerkrankung spezifischer, aktivierter T-Lymphozytenzellen in einem Puffer;

b) Einwirkenlassen eines chemischen Vernetzungsmittels auf die suspendierten Zellen;

c) ausreichend langes Einwirkenlassen eines geeigneten hydrostatischen Drucks in der Größenordnung von 50,7 bis 152 MPa (500 bis 1500 atm) auf die behandelten Zellen zur Herbeiführung einer vermehrten Antigenizität der T-Lymphozytenzellen ohne merklichen Verlust an Membranproteinen von den Zellen und

d) Entspannen des auf die suspendierten Zellen einwirkenden Drucks mit geeigneter Geschwindigkeit zur Gewinnung druckbehandelter, aktivierter T-Lymphozytenzellen ohne merklichen Verlust an Membranproteinen von den Zellen.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß Zellen zusätzlich mit einem Mittel zum Aufbrechen behandelt werden.

15. Verfahren zur Herstellung druckbehandelter, aktivierter T-Lymphozyten mit der Eignung zur Verhinderung oder Behandlung einer speziellen Autoimmunerkrankung nach Anspruch 1, durch:

b) ausreichend langes Einwirkenlassen eines geeigneten hydrostatischen Drucks in der Größenordnung von 50,7 bis 152 MPa (500 bis 1500 atm) auf die suspendierten Zellen zur Herbeiführung einer vermehrten Antigenizität der T-Lymphozytenzellen ohne merklichen Verlust an Membranproteinen von den Zellen,

c) Entspannen des auf die suspendierten Zellen einwirkenden Drucks mit geeigneter Geschwindigkeit zur Gewinnung druckbehandelter, aktivierter T-Lymphozytenzellen ohne merklichen Verlust an Membranproteinen von den Zellen und

d) Einwirkenlassen eines chemischen Vernetzungsmittels auf die druckbehandelten Zellen.

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen eine zusätzliche Behandlung mit einem Mittel zum Aufbrechen erfahren.

17. Verfahren zur Herstellung druckbehandelter, aktivierter T-Lymphozyten mit der Eignung zur Verhinderung oder Behandlung einer speziellen Autoimmunerkrankung nach Anspruch 5, durch:

b) Einwirkenlassen eines Mittels zum Aufbrechen des Zellskeletts auf die suspendierten Zellen;

18. Verfahren zur Herstellung druckbehandelter, aktivierter T-Lymphozyten mit der Eignung zur Verhinderung oder Behandlung einer speziellen Autoimmunerkrankung nach Anspruch 5, durch:

d) Einwirkenlassen eines Mittels zum Aufbrechen des Zellskeletts auf die druckbehandelten Zellen.

19. Verfahren zur Herstellung von mit einem chemischen Vernetzungsmittel behandelten, aktivierten T-Lymphozyten mit der Eignung zur Verhinderung oder Behandlung einer speziellen Autoimmunerkrankung durch:

a) Suspendieren für die Autoimmunerkrankung spezifischer, aktivierter T-Lymphozytenzellen in einem Puffer und

b) Behandeln der suspendierten Zellen mit einem chemischen Vernetzungsmittel.

20. Verfahren zur Herstellung von mit einem Mittel zum Aufbrechen behandelten, aktivierten T-Lymphozytenzellen mit der Eignung zur Verhinderung oder Behandlung einer speziellen Autoimmunerkrankung durch:

b) Behandeln der suspendierten Zellen mit einem Mittel zum Aufbrechen zur Herstellung aktivierter T-Lymphozytenzellen mit aufgespaltenen Zellskeletten.

21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß im Anschluß an Stufe b) die aktivierten T-Lymphozytenzellen mit aufgespaltenen Zellskeletten mit einem chemischen Vernetzungsmittel behandelt werden.

22. Mittel zur Verhinderung oder Behandlung einer speziellen Autoimmunerkrankung, umfassend druckbehandelte, mit einem Vernetzungsmittel behandelte, aktivierte T-Lymphozytenzellen nach Anspruch 1 und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.

23. Mittel zur Verhinderung oder Behandlung einer speziellen Autoimmunerkrankung, umfassend mit einem chemischen Vernetzungsmittel behandelte, aktivierte T-Lymphozytenzellen nach Anspruch 8 und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.

24. Mittel zur Verhinderung oder Behandlung einer speziellen Autoimmunerkrankung, umfassend mit einem Mittel zum Aufbrechen behandelte, aktivierte T-Lymphozytenzellenmembranfragmente nach Anspruch 10 und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.

25. Verfahren zur Gewinnung gereinigter Membranproteine aus aktivierten T-Lymphozytenzellen mit der Eignung zur Verhinderung oder Behandlung einer speziellen Autoimmunerkrankung, durch:

c) ausreichend langes Einwirkenlassen eines geeigneten hydrostatischen Drucks in der Größenordnung von 50,7 bis 152 MPa (500 bis 1500 atm) auf die behandelten Zellen zur Herbeiführung einer vermehrten Antigenizität der T-Lymphozytenzellen ohne merklichen Verlust an Membranproteinen von den Zellen;

d) Entspannen des auf die suspendierten Zellen einwirkenden Drucks mit bestimmter Geschwindigkeit;

e) Zentrifugieren der entspannten Suspension zur Entfernung von Zellfragmenten und zur Herstellung eines Überstands mit den Membranproteinen und

f) Behandeln des Oberstands mittels einer Ultrazentrifuge zur Gewinnung der gereinigten Membranproteine.

26. Verfahren zur Gewinnung gereinigter Membranproteine aus aktivierten T-Lymphozytenzellen mit der Eignung zur Verhinderung oder Behandlung einer speziellen Autoimmunerkrankung,durch:

b) ausreichend langes Einwirkenlassen eines geeigneten hydrostatischen Drucks in der Größenordnung von 50,7 bis 152 MPa (500 bis 1500 atm) auf die suspendierten Zellen zur Herbeiführung einer vermehrten Antigenizität der T-Lymphozytenzellen ohne merklichen Verlust an Membranproteinen von den Zellen;

c) Entspannen des auf die suspendierten Zellen einwirkenden Drucks mit bestimmter Geschwindigkeit;

d) Einwirkenlassen eines chemischen Vernetzungsmittels auf die druckbehandelten Zellen;

f) Behandeln des Überstands mittels einer Ultrazentrifuge zur Gewinnung der gereinigten Membranproteine.

27. Verfahren zur Gewinnung gereinigter Membranproteine aus aktivierten T-Lymphozytenzellen mit der Eignung zur Verhinderung oder Behandlung einer speziellen Autoimmunerkrankung,durch:

28. Verfahren zur Gewinnung gereinigter Membranproteine aus aktivierten T-Lymphozytenzellen mit der Eignung zur Verhinderung oder Behandlung einer speziellen Autoimmunerkrankung, durch:

d) Einwirkenlassen eines Mittels zum Aufbrechen des Zellskeletts auf die druckbehandelten Zellen;

29. Verfahren zur Gewinnung gereinigter Membranproteine aus aktivierten T-Lymphozytenzellen mit der Eignung zur Verhinderung oder Behandlung einer speziellen Autoimmunerkrankung,durch:

b) Behandeln des Überstands mittels einer Ultrazentrifuge zur Gewinnung der gereinigten Membranproteine;

c) ausreichend langes Einwirkenlassen eines geeigneten hydrostatischen Drucks in der Größenordnung von 50,7 bis 152 MPa (500 bis 1500 atm) auf die suspendierten Zellen zur Herbeiführung einer vermehrten Antigenizität der T-Lymphozytenzellen ohne merklichen Verlust an Membranproteinen aus den Zellen;

f) Einwirkenlassen eines chemischen Vernetzungsmittels auf die "abgestoßenen" Membranproteine.

30. Präparat zur Verhinderung oder Behandlung einer Autoimmunerkrankung, umfassend T-Lymphozytenzellen mit entwickelter Spezifität für das für die Autoimmunerkrankung spezifische Antigen, die entweder durch Inkubieren in Gegenwart des für die Autoimmunerkrankung spezifischen Antigens oder durch Inkubieren mit einem Mitogen mit der Fähigkeit zur Induktion einer Immunantwort durch die T-Lymphozytenzellen aktiviert und dann eine ausreichende Zeit lang mittels eines hydrostatischen Drucks in der Größenordnung von 50,7 bis 152 MPa (50 bis 1500 atm) druckbehandelt wurden, um eine vermehrte Antigenizität der T-Lymphozytenzellen ohne merklichen Verlust an Membranproteinen aus den Zellen herbeizuführen, wobei die spezifischen aktivierten Zellen mit Hilfe eines chemischen Vernetzungsmittels entweder vor oder nach der Druckbehandlung vernetzt wurden.

31. Präparat zur Verhinderung oder Behandlung einer Autoimmunerkrankung, umfassend T-Lymphozytenzellen mit entwickelter Spezifität für das für die Autoimmunerkrankung spezifische Antigen, die entweder durch Inkubieren in Gegenwart des für die Autoimmunerkrankung spezifischen Antigens oder durch Inkubieren mit einem Mitogen mit der Fähigkeit zur Induktion einer Immunantwort durch die T-Lymphozytenzellen aktiviert und dann eine ausreichende Zeit lang mittels eines hydrostatischen Drucks in der Größenordnung von 50,7 bis 152 MPa (50 bis 1500 atm) druckbehandelt wurden, um eine vermehrte Antigenizität der T-Lymphozytenzellen ohne merklichen Verlust an Membranproteinen aus den Zellen herbeizuführen, wobei das Zellskelett der spezifischen aktivierten Zellen mit Hilfe eines Mittels zum Aufbrechen des Zellskeletts entweder vor oder nach der Druckbehandlung aufgebrochen wurde.

32. Präparat zur Verhinderung oder Behandlung einer Autoimmunerkrankung, umfassend T-Lymphozytenzellen mit entwickelter Spezifität für das für die Autoimmunerkrankung spezifische Antigen, die entweder durch Inkubieren in Gegenwart des für die Autoimmunerkrankung spezifischen Antigens oder durch Inkubieren mit einem Mitogen mit der Fähigkeit zur Induktion einer Immunantwort durch die T-Lymphozytenzellen aktiviert und dann mit Hilfe eines chemischen Vernetzungsmittels vernetzt wurden.

33. Präparat zur Verhinderung oder Behandlung einer Autoimmunerkrankung, umfassend T-Lymphozytenzellen mit entwickelter Spezifität für das für die Autoimmunerkrankung spezifische Antigen, die entweder durch Inkubieren in Gegenwart des für die Autoimmunerkrankung spezifischen Antigens oder durch Inkubieren mit einem Mitogen mit der Fähigkeit zur Induktion einer Immunantwort durch die T-Lymphozytenzellen aktiviert und deren Zellskelette danach mit Hilfe eines Mittels zum Aufbrechen des Zellskeletts aufgebrochen wurden.