DE60012713T2

DE60012713T2 - Durch xanthurensäure modifizierte proteine

Info

Publication number: DE60012713T2
Application number: DE2000612713
Authority: DE
Inventors: Halina Malina
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1999-03-26
Filing date: 2000-03-23
Publication date: 2005-12-01
Anticipated expiration: 2020-03-24
Also published as: FR2791263B1; EP1165600B1; WO2000058344A1; EP1165600A1; FR2791263A1; DE60012713D1

Description

Das Ziel dieser Erfindung ist die Induktion einer Immunantwort gegen die Pathologien, welche durch Änderungen der Zellphysiologie durch die Xanthurensäure induziert werden. Diese Erfindung betrifft auch eine regulierte Induktionsweise zur Zellularpathologie in Anwesenheit der Xanthurensäure. Sie ist bedingt durch die Bildung von auf kovalente Art durch die Xanthurensäure, in vitro oder in einem Zellsystem modifizierten Proteinen, aber nicht auf die früher beschriebene nicht-kovalente Art (Kotake Y. et al., J. Biochem., 1975, 77, S. 685–687; Kobayaashi K. et al., Chem. Pharm. Bull., 1980, 28, S. 2960–2966).
Die Ausgangslage der Erfindung ist die Beobachtung der Tatsache, daß die Xanthurensäure zur kovalenten Proteinmodifikation in Zellen führt und eine Änderung der Zellphysiologie verursacht. Zuvor wurde publiziert, daß sich die Xanthurensäure mit dem Alter in den Linsen der Augen des Rindes (Malina et al., Graefe's Arch. Clin. Exp. Ophthalmol., 1995, 233, S. 38–44) und des Menschen anhäuft (Malina et al., Graefe's Arch. Clin. Exp. Ophthalmol., 1996, 234, S. 723–730). In ihrer Anwesenheit bilden die α, β, γ-Kristalline Aggregate (idem) und werden fluoreszent (Malina et al., Eur. J. Ophthalmol., 1996, S. 250–256). Die kovalenten Konjugate werden gebildet durch die Vorbereitung von oxydierten Produkten der Xanthurensäure, DOXA genannt, und deren Reaktion mit den Kristallinen des Auges (Malina et al., Graefe's Arch. Clin. Exp. Ophthalmol., 1996, 234, S. 723–730).
Vor kurzem haben die Versuche gezeigt, daß die Xanthurensäure, die sich in einer Zelle anhäuft, zu einer Änderung der Zellphysiologie führt. Diese Änderung ist auf eine Anhäufung schlecht gefalteter Proteine zurückzuführen. Die Xanthurensäure kann mit Proteinen kovalente Verbindungen bilden. In Anwesenheit der Xanthurensäure, die eine gelbe Farbe hat, werden die Proteine dadurch gelb. Diese Farbe bleibt nach der Elektrophorese der Proteine auf dem denaturierenden Gel bestehen. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Xanthurensäure sich mit den Proteinen auf kovalente Weise verbindet. Um die Gestaltung eines Proteins zu verändern, ist es ausreichend, eine Aminosäure zu ändern; in der wissenschaftlichen Literatur gibt es zahlreiche Beispiele. In Anwesenheit der Xanthurensäure, wie es die in dieser Beschreibung angeführten Beispiele zeigen, können eine oder mehrere Aminosäuren geändert werden. Aus diesem Grund verursacht die Anwesenheit der Xanthurensäure in einer Zelle eine Überexpression der "Glucose Regulated Proteins 94" bzw. GRP94 genannten Chaperonproteine. Es ist bekannt, dass die Überexpression dieser Proteine durch die Anhäufung schlecht gefalteter Proteine verursacht wird (Kozutsumi, Nature, 1988, 332, S. 462–464).
Die Xanthurensäure ändert Proteine zufällig, und diese Änderung betrifft auch die Chaperonproteine, wie beispielsweise GRP 94 und Kalretikulin. Da diese Chaperonproteine für die richtige Gestaltung der Proteine verantwortlich sind, beschleunigt ihre Änderung die Anhäufung der schlecht gefalteten Proteine und auch der unter ihnen schlecht gefalteten Immunglobine. Diese komplexen Änderungen der Proteine durch die Xanthurensäure lassen die Zellen mit einer veränderten Physiologie funktionieren. Die Akkumulation der durch Xanthurensäure modifizierten Proteine in verschiedenen Zellentypen (zum Beispiel die Astrozyten und die Epithelzellen der Linsen) verursacht zum Beispiel eine Überexpression der Proteasen, eine Degradierung des Kalretikulins, eine Modifizierung des nuklearen κβ-Faktors und eine Induktion des β-Amyloids (A4).
Diese Ergebnisse zeigen, daß die Bildung von modifizierten Proteinen durch Xanthurensäure zu einer Zellularpathologie führt, indem sie die Änderung zahlreicher Proteine induziert. Die beobachteten Änderungen sind abhängig davon, wie stark die Xanthurensäure die Proteine modifiziert hat. Diese Ergebnisse zeigen, daß es möglich ist, eine Zellularpathologie auf künstliche Art und Weise zu erzeugen, indem in den Zellen die Menge der durch die Xanthurensäure modifizierten Proteine erhöht wird. Dieser neue Mechanismus wird verursacht, indem die Proteine in einer Zelle durch die Xanthurensäure modifiziert werden. In einer Astrozyten-Zellenkultur verursacht eine Erhöhung der durch Xanthurensäure modifizierten Proteinmenge die Induktion von β-Amyloid (A4), welches von den monoklonalen Antikörpern von Dako (Dänemark), die für die Diagnose der Alzheimerkrankheit benutzt werden, erkannt wird. Der Grund dieser Induktion von β-Amyloiden ist eine Änderung der Gestaltung des Proteins Precursor Amyloid (PPA), wegen der Änderung durch die Xanthurensäure. Diese Änderung gibt das Signal für eine Induktion von Proteasen, welche das geänderte PPA degradieren und die Bildung von β-Amyloiden (A4) induzieren. Die Xanthurensäure ist eine Aminosäure auf dem Weg des Abbaus von Tryptophan, und ihre Anhäufung in verschiedenen Zellentypen kann zu verschiedenen Pathologien führen. Man kann voraussehen, daß das Tier, in welchem die Menge der durch die Xanthurensäure modifizierten Proteine erhöht wird, als Modell zur Untersuchung der Wirkung von Arzneimitteln dienen kann. Eine direkte Einführung der Xanthurensäure auf oralem Weg oder auf anderen Wegen kann als Modell für die Entstehung von Alzheimer, Prionenkrankheiten, Alterskatarakten, Arteriosklerosen, Rheumakrankheiten und für die Altersdegeneration der Netzhaut dienen.
Die Beobachtung der Tatsache, daß die Xanthurensäure eine Deregulierung der Zellphysiologie verursacht, erlaubt eine regulierte Induktion der Zellularpathologie. Durch die Xanthurensäure modifizierte Proteine, die einem Tier eingespritzt werden, leiten eine Immunantwort gegen die schlecht gefalteten Proteine ein. Wegen der Änderung des Immunsystems durch die Xanthurensäure und infolge einer Degeneration der Chaperonproteine, wie das GRP94, werden die pathologischen Zellen nicht eliminiert. Die Induktion der Immunantwort gegen die schlecht gefalteten Proteine kann die pathologische Wirkung verhindern, welche mit der Bildung dieser Proteine im Laufe des Alterns stattfindet.
Die Impfstoffe, welche auf durch die Xanthurensäure modifizierten Proteinen basieren, werden eine Präventivrolle gegen die Krankheiten haben, die durch so veränderte Proteine verursacht werden. Die durch die Xanthurensäure modifizierten Proteine können den Säugetieren verabreicht werden, indem man alle nicht giftigen Lösungsmittel benutzt, in denen sie löslich sind. Die Modifizierungsgrade des Proteins durch die Xanthurensäure und die Menge des zu verabreichenden Proteins hängt vom zu verändernden Protein und vom durch die Impfung verfolgten Ziel ab. Fragmente von Proteinen, Peptiden oder synthetischen Sequenzen können benutzt werden, um mit Xanthurensäure konjugierte Produkte zu bilden. Diese Verbindungen werden in ein Säugetier eingeführt, um eine Immunantwort zu induzieren.
Beispiel 1
Bildung von durch die Xanthurensäure modifizierten Proteinen in einer Epithelzellenkultur
Die Primärkultur der Rinderepithelzellen in einem Medium des Typs Minimal Essential Medium (MEM) ist mit Xanthurensäure behandelt worden. Die Xanthurensäure ist diesem Medium in einer Konzentration von 0, 1, 2, 4 mM hinzugefügt worden. Nach 24 Stunden Kultur sind die Zellen gewaschen worden, indem man einen PBS-Puffer benutzt hat (50 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, pH 7.1) und in einem Puffer lysiert worden, der 50 mM Tris-HCl (pH 8) 150 mM NaCl 100 μg/ml PMSF, 1% Triton X-100 enthalten hat. Extrakte sind auf eine Kolonne von Sephadex G-50 geladen und mit 0,005 M NaHCO₃ eluiert worden. Die Xanthurensäure ist in den Proteinextrakten durch die UV-Spektrometrie quantifiziert worden. Die Proteinkonzentration, nach einer Inkubation mit Xanthurensäure λ = 342 nm (E_λmax 6 500 nach Merck Index, Merck and Co., Ausgabe White House Station, New York, 1996), ist berechnet worden, indem man einen Absorptionsindex der bekannten Quantitäten von Rinder-Albumin benutzt hat, welches das molekulare Gewicht von 67,5 kD hat. Die Konzentration der Xanthurensäure hat jeweils 0, 1, 3, 9 Mol pro Mol Protein entsprochen. Die Analysen der Proteine nach einer Übertragung von SDS-PAGE-Gel auf eine Nylonmembran (Western Blot) mit verschiedenen Antikörpern haben gezeigt, daß in Anwesenheit der mit Xanthurensäure modifizierten Proteine die Menge des nuklearen κβ-Faktors, des β-Amyloids (A4) und des Calpain Lp82 verändert worden ist.
Beispiel 2
Bildung von durch Xanthurensäure modifizierten Proteinen in der Astrozytenkultur
Die Astrozytenkultur der Ratte im MEM ist mit der Xanthurensäure der Konzentrationen 0, 2, 4, 8 mM behandelt worden. Die Konzentration der Xanthurensäure (XA) in den Extrakten ist wie in Beispiel 1 berechnet worden und hat jeweils 0; 1 Mol XA pro 8 Mol Proteine; 3 Mol XA pro 2 Mol Proteine; 1 Mol XA pro 5 Mol Proteine entsprochen.
In Anwesenheit von durch Xanthurensäure modifizierten Proteinen hat der nukleare κβ-Faktor die molekularen Gewichte von 50 kD, 52 kD und 55 kD statt der normalen Größe 50 kD gehabt. Die β-Amyloid-Bildung (A4), die ohne Anwesenheit der Xanthurensäure nicht feststellbar war, wurde stark induziert. Diese Ergebnisse haben gezeigt, daß eine Erhöhung der Xanthurensäure in der Zelle eine Deregulierung der Zellphysiologie hervorruft. Diese Resultate zeigen, daß es möglich ist, eine Zellularpathologie künstlich zu erzeugen, indem man in einer Zelle die Menge der mit Xanthurensäure modifizierten Proteine erhöht. Der neue beschriebene Mechanismus wird durch die kovalente Modifizierung der Proteine durch Xanthurensäure verursacht.
Beispiel 3
Bildung von durch Xanthurensäure modifizierten Proteinen in einem Zellextrakt der Netzhaut
Die Xanthurensäure der Konzentrationen 0, 2, 4, 8 mM wurde während einer Woche mit den Proteinextrakten der Netzhaut inkubiert, und die Extrakte sind, wie in Beispiel 1 beschrieben, behandelt worden, und die Konzentrationen haben jeweils 0; 2 Mol XA pro 1 Mol Protein; 3 Mol XA pro 1 Mol Protein; 5 Mol XA pro Mol Protein entsprochen.
Beispiel 4
Bildung von durch Xanthurensäure modifizierten Proteinen in der Gewebekultur
Die Linsen von Schweineaugen sind während einer Woche in Xanthurensäure-Lösungen 0 und 2 mM inkubiert worden. Die Xanthurensäure ist in die Linsen diffundiert worden. Der Kortex der Linsen ist in einem Phosphatpuffer von 7.4 homogenisiert worden. Der unlösliche Teil der Proteine wurde durch das Zentrifugieren mit 10 000 g getrennt. Die Konzentration der Proteine ist mit einer Wellenlänge von 280 nm gemessen worden; die unlöslichen Teile der Proteine sind in 4 mM oder in 8 mM Harnstoff aufgelöst worden. Die Xanthurensäure war in allen Extrakten vorhanden, und die Unlöslichkeit der Proteine hat sich durch die Quantität der Xanthurensäure erhöht: Die Konzentrationen an Xanthurensäure in den Proteinen entsprachen 1 Mol XA pro 1 Mol Protein im löslichen Teil des Phosphatpuffers; 2 Mol XA in den in 4 mM Harnstoff löslichen Proteinen, und 3 Mol XA in den in 8 mM Harnstoff löslichen Proteinen.
Beispiel 5
Vorbereitung des Konjugates der Xanthurensäure mit Bakterienproteinen
Das Mycelium des Streptomyces incarnatus, ein myceliales grampositives Bakterium, wurde in Abwesenheit oder in Anwesenheit von 2 mM Xanthurensäure kultiviert. 100 ml jeder Kultur wurden in 0.05 M Phosphatpuffer, pH 7, suspendiert, welcher 0.1% β-Mercaptoäthanol enthielt. Die Suspension wurde in einem Gefäss mit Trockeneis-Methanol gefroren. Die gefrorenen Zellen sind in der Hinton-Presse mit einem Druck von 360 Atmosphären zerstört worden. Die Zytosolproteine sind von der Membranfraktion durch Zentrifugieren mit 100 000 g während einer Stunde getrennt worden. Der Lösung wurde 2,5% Streptomycin zugegeben, um die Nukleinsäuren zu präzipitieren, welche durch Zentrifugation mit 5000 g während 10 Minuten eliminiert worden sind. Die Konzentrationen der Xanthurensäure in den Proteinen sind, wie in Beispiel 1 beschrieben, gemessen worden. Die Konzentrationen der Xanthurensäure in den Proteinen entsprachen 0 und 0.5 Mol Xanthurensäure für ein Mol Protein.
Beispiel 6
Induktion einer Immunantwort gegen mit Xanthurensäure modifizierte Proteine
Das Kalretikulin ist durch die Xanthurensäure in einer Zelle modifiziert und zum Teil degradiert. 3 mg Kalretikulin in sterilem Phosphatpuffer von pH 7.4 wurden mit 4 mM Xanthurensäure während 72 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert.
Das modifizierte Kalretikulin ist Mäusen verabreicht worden. Sechs Mäuse (Gewicht zirka 100 g) sind durch subkutane Injektion von je 500 μg dieses Kalretikulins immunisiert worden. Eine andere Mausgruppe ist ohne Behandlung geblieben. Die Immunisierung ist dreimal im Intervall von zwei Wochen wiederholt worden. Nach drei Monaten wurde das Kalretikulin im Plasma der Tiere analysiert. Die Proteine des Mausplasmas sind durch Elektrophorese auf einem denaturierenden Gel analysiert worden (Laemmli, Nature, 1970, 227, S. 680–685). Proteine sind auf eine Membran transferiert worden. Die Detektierung des Kalretikulins ist mit einem Antikörper gegen Kalretikulin durchgeführt worden. Im Plasma der nicht behandelten Mäuse wies das degradierte Kalretikulin ein Molekulargewicht von 55 kD statt 63 kD auf. In den behandelten Mäusen enthielt das Plasma 60 Prozent weniger degradiertes Kalretikulin.
Diese Methode kann benutzt werden, um die pathologische Alterung der Zellen aufgrund einer Änderung der Gestaltung der Proteine, insbesondere der Chaperonproteine, zu verzögern.
Die Injektionen von durch Xanthurensäure modifizierten Proteinen können eine Präventivwirkung gegen mit der Alterung zusammenhängende Pathologien haben. Eine Immuntherapie, die monoklonale Antikörper verwendet, wäre möglich, um die Wirkung von schlecht gefalteten Proteinen zu verzögern. Zum Beispiel ein Antikörper gegen das durch Xanthurensäure modifiziere Protein Precursor Amyloid, von dem angenommen wird, daß es die Entwicklung der Alzheimerkrankheit verzögert.

Claims

Verbindung, dazu bestimmt, Immunreaktionen in einem lebenden Organismus zu verursachen, welche dadurch charakterisiert ist, daß diese Verbindung Produkt aus der Reaktion der Xanthurensäure mit einem Protein ist, in welchem sich die Xanthurensäure und das besagte Protein kovalent binden.
Verbindung gemäß Forderung 1, die dadurch charakterisiert ist, daß die Xanthurensäure kovalent mit einem Protein, einem Peptid oder einer Proteinsequenz verbunden ist.
Verbindung gemäß Forderung 1, die dadurch charakterisiert ist, daß dieses Protein ein menschliches Protein oder das Protein eines anderen Säugetieres ist.
Verbindung gemäß Forderung 1, die dadurch charakterisiert ist, daß dieses Protein ein Bakterienprotein ist.
Verbindung gemäß Forderung 1, die dadurch charakterisiert ist, daß die Reaktion der Xanthurensäure mit einem Protein, in welchem sich die Xanthurensäure und das besagte Protein kovalent binden, durch Inkubation der Zellkulturen in Anwesenheit von Xanthurensäure geschieht.
Verbindung gemäß Forderung 1, die dadurch charakterisiert ist, daß die Reaktion der Xanthurensäure mit einem Protein, in welcher die Xanthurensäure und das besagte Protein sich kovalent binden, durch Inkubation von Gewebe in Anwesenheit von Xanthurensäure geschieht.