DE69112573T2

DE69112573T2 - Immunstimulierendes arzneimittel, das polare glycopeptidolipide von mycobakterium-chelonae enthält.

Info

Publication number: DE69112573T2
Application number: DE69112573T
Authority: DE
Inventors: Tsehay Neway; Charles Pilet
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1990-06-06
Filing date: 1991-06-06
Publication date: 1996-04-25
Anticipated expiration: 2011-06-07
Also published as: JP2709979B2; AU655425B2; WO1991018617A1; EP0485577B1; CA2063721A1; EP0485577A1; DE69112573D1; AU8090591A; ES2080320T3; FR2662942A1; US5336666A; GR3018244T3; FR2662942B1; ATE127021T1; JPH05500817A; DK0485577T3; CA2063721C

Description

Die Erfindung betrifft ein neues Arzneimittel zur Immunstimulierung mit einem Gehalt an Glykopeptidlipiden (GPLp) aus Mycobacterium chelonei als Wirkstoff.
Es ist bekannt, daß die polaren Glykopeptidlipide (GPLp), die in der Zellwand von atypischen Mycobakterien vorhanden sind, eine große Artspezifität zeigen.
Die Glykopeptidlipide (GPL) stellen Verbindungen dar, die aus Fettsäuren, Peptiden und Zuckern gebildet werden.
Äußerst gründliche Studien an diesen GPL-Verbindungen wurden mit dem Ziel durchgeführt, Mycobakterien zu klassifizieren und zu identifizieren.
Die Autoren haben aufgezeigt, daß die proliferative Antwort von mit GPLp-Verbindungen aus M.avium [vgl. Brownback und Barrow, Infection and Immunity, 56, 1044-1050, (1988)] behandelten Mäusemilzzellen infolge von unspezifischen Mitogenen verringert wird. Die gleichen Autoren haben auch eine Verringerung der proliferativen Antwort von diesen Zellen im Gefolge von in vitro-Costimulationen mit diesen GPLp-Verbindungen und Mitogenen aufgezeigt.
Die immunstimulierenden Eigenschaften des lebenden M.chelonei auf immunkompetente Zellen wurden ebenfalls aufgezeigt [vgl. Biozzi et al., Rev. Franç. Etudes Clin. Biol., 5, Seiten 867-890, (1960); Pilet et Goret, J. Réticuloendoth. Soc., 3, Seiten 305-309, (1966); Neway et al., Comp. Immunol. Infect. Dis., 12, Seite 63-70, (1989)].
Nunmehr wurde jedoch entdeckt, daß die GLP-Verbindungen von M.chelonei im Gegensatz zu den GPLp-Verbindungen aus M.avium immunstimulierende Eigenschaften besitzen.
Es ist bekannt, daß die GPL-Verbindungen im Hinblick auf die Mehrzahl an atypischen Mycobakterien die folgende gemeinsame Struktur aufweisen:
Phe-aThr-Ala-Alaninol,
wobei die terminale Phe-aminogruppe durch eine langkettige Fettsäure acyliert, die Alaninolgruppe mit einem Zucker verknüpft und die allo-Threoningruppe (aThr) entweder mit einem Zucker verknüpft ist (apolare GPL-Verbindungen) oder an ein Oligosaccharid gebunden ist (polare GPL-Verbindungen). Diese Glykopeptidlipidstruktur ist die gleiche wie insbesondere bei allen Mycobakterien des M.A.I.S-Komplexes (Mycobacterium Avium-Intracellulare- Scrofulaceum) und bei den beiden Subspezies von M.chelonei [vgl. Brennan und Goren, J. Biol. Chem., 254, Seiten 4205-4211, (1979); Brennan, Rev. Infect. Dis., 3, Seiten 905-913, (1981); Brennan "The Mycobacteria: A Source Book", Teil A, Kubica and Wayne Edition, Marcel Dekker, New York und Basel, Seiten 467-489, (1984); sowie Tsang et al., Int. J. Syst. Bacteriol., 34, Seiten 35-44, (1984); Asselineau und Asselineau, "The Mycobacteria: A Source Book", Teil A, Kubica and Wayne Edition, Marcel Dekker, New York und Basel, Seiten 345-360, (1984)].
Die GPLp-Verbindungen aus M.chelonei wurden bereits durch Tsang et al. in dem bereits erwähnten Artikel beschrieben. Aufgrund der Tatsache, daß die Variationen von Verbindungen des GPLp-Typus aus atypischen Mycobakterien den Zuckeranteil (die glucosidische Bindung) betreffen, haben die gleichen Autoren diesen Molekülbereich der Zuckerreste bei M.chelonei untersucht und für das Oligosaccharid die folgende Struktur vorgeschlagen:
3,4-Di-O-methylrhamnose-(1 T?)-Rhamnose-(α-1T2)-6-Desoxytalose.
Die GPLp-Verbindungen werden zur Identifizierung und Differenzierung von M.chelonei des M.fortuitum-M.chelonei-Komplexes mittels der Dünnschichtchromatographie (Tsang et al., siehe die erwähnte Publikation) und mittels des ELISA-Verfahrens (Yanagihara et al., J. Clin. Microbiol., 21, Seiten 569-574, (1985)] verwendet.
Die GPLp-Verbindungen von M.chelonei entsprechen definitiv der Formel 1: Alaninol Zucker Oligosaccharid
worin
Phe Phenylalanin,
aThr allo-Threonin,
Ala das Alanin bedeuten und
der Zucker die 3,4-Di-O-methylramnose darstellt,
das Oligosaccharid die folgende Struktur aufweist:
3,4-Di-O-methylrhamnose-rhamnose-6-desoxytalose,
R-CO- den Acylrest einer Fettsäure darstellt, und
wobei die 3,4-Di-O-methylrhamnose jeweils mit dem allo-Threonin und
dem Alaninol über eine Glycosidbindung verknüpft sind, und
die C-terminale Alaningruppe mit dem Alaninol über eine Amidbindung verknüpft ist.
Die genaueste Struktur des Oligosaccharids ist die, welche von Tsang et al. gemäß obenstehender Erwähnung gegeben wird, worin jedoch die Stellung der Rhamnosebindung bezüglich der Dimethylrhamnose nicht bekannt ist.
Darüber hinaus sind die Zucker in dem Oligosaccharidanteil bei den natürlichen GPLp-Verbindungen acetyliert.
Die Natur der Fettsäuren (Kettenlänge, gegebenenfalls Vorhandensein einer oder mehrerer Doppelbindungen, einer Verzweigung oder eines β-Hydroxy- oder β-Methoxysubstituenten) ist bei den GPLp-Verbindungen aus M.chelonei wie auch bei den GPL-Verbindungen aus anderen Mycobakterien vom Kulturmedium, der Temperatur und der Züchtungsdauer abhängig, vgl. beispielsweise Ratledge "Lipids: Cell Composition, Fatty Acid Biosyntheses" in "The Biology of the Mycobacteria", Band 1, Ratledge and Standford Edition, Academic Press, London (1982), Seiten 53-93, sowie die bereits obenstehend zitierten Veröffentlichungen und Werke.
Die natürlichen GPLp-Verbindungen stellen in der Tat Mischungen aus Verbindungen gemäß der Formel 1 dar, worin die Fettsäure-Acylgruppe R-CO- variabel ist. Diese Fettsäuren weisen mindestens 16 Kohlenstoffatome, im allgemeinen jedoch weniger als 36 Kohlenstoffatome auf.
Die Erfindung betrifft eine immunstimulierende pharmazeutische Zusammensetzung mit einem Gehalt an mindestens einer GPLp-Verbindung aus M.chelonei oder eines Derivats als immunstimulierender Wirkstoff der GPLp- Verbindung aus M.chelonei.
Die in dem erfindungsgemäßen Arzneimittel enthaltenen GPLp-Verbindungen stellen insbesondere mindestens teilweise gereinigte Fraktionen aus der Extraktion von Glykopeptidlipiden aus der Zellwand von M.chelonei dar, die anhand bekannter Verfahren gewonnen werden, wobei sich die Erfindung nicht nur auf pharmazeutische Zusammensetzungen mit einem Gehalt an GPLp aus M.chelonei von lebenden oder abgetöteten M.chelonei-Organismen bzw. vollständige Zellwände oder Fragmente von Zellwänden aus diesen Mycobakterien als einzige Quelle erstreckt.
Die Fraktionen aus der Extraktion von GLP-Verbindungen, die zumindest teilweise gereinigt wurden, werden als Wirkstoffprinzip in den erfindungsgemäßen Arzneimitteln verwendet und stellen insbesondere Glykopeptidlipidextrakte aus der Zellwand von M.chelonei dar, welche beispielsweise in kaltem Methanol löslich sind (insbesondere im Methanol bei +4ºC).
Diese stellen insbesondere Glykopeptidlipidfraktionen dar, welche sich durch die Extraktion von Zellen oder Zellwänden aus M.chelonei mit Hilfe einer Mischung aus Chloroform : Methanol (2 : 1) bei einer Temperatur von 18 bis 50ºC gewinnen lassen, und welche darüber hinaus in der Kälte in Methanol löslich sind, wobei sie beispielsweise nach der Zugabe von kaltem Methanol (4ºC) in einer ausreichenden Menge löslich bleiben in bezug auf das Volumenverhältnis Methanol : Chloroform bei einem Anteil von mindestens oder gleich 5 : 1. Diese Fraktionen lassen sich auch durch die Extraktion gemäß obenstehender Beschreibung gewinnen und im Anschluß daran durch die Silikagelsäulenchromatographie reinigen.
Die Erfindung betrifft insbesondere eine immunstimulierende pharmazeutische Zusammensetzung mit einem Gehalt an mindestens einer Verbindung gemäß der Formel 1 als Wirkstoff oder eines aktiven Derivats davon.
Die in den erfindungsgemäßen Arzneimitteln vorhandenen GPLp-Verbindungen können nicht nur natürliche acetylierte GPLp-Verbindungen darstellen, sondern auch aktive Abkömmlinge von GPLp, insbesondere den entsprechenden desacetylierten Derivaten.
Die GPLp-Verbindungen oder Derivate davon bilden den Wirkstoff des erfindungsgemäßen Arzneimittels und lassen sich, ausgehend von M.chelonei- Stämmen, herstellen.
Die Stämme von M.chelonei sind insbesondere bei den folgenden öffentlichen Sammlungen erhältlich:
- NCTC-National Collection of Type Cultures (GB) Hinterlegungs-Nr. 946 (M.chelonei, Subspezies chelonei)
- ATCC-American Type Culture Collection (USA) Hinterlegungs-Nr. 19977 (M.chelonei, Subspezies abscessus)
- CIPT-Collection Institut Pasteur Tuberculose, Paris (FR) Hinterlegungs-Nr. 140420019 (M.chelonei, Subspezies chelonei)
- CIPT-Collection Institut Pasteur Tuberculose, Paris (FR) Hinterlegungs-Nr. 140420020 (M.chelonei, Subspezies abscessus)
M.chelonei läßt sich auch im Löwenstein-Jensen-Medium (Institut Pasteur, Paris) aufbewahren und in Sauton-Medium, das in Roux-Gefäße verbracht wurde, nachdem eine Verfestigung durch Zugabe von 1,5% Bactoagar (DIFCO) erfolgt war. Das M.chelonei läßt sich auch in Fermentatoren oder mit Hilfe von Geflügelkulturen oder auch in allen anderen ähnlichen Mitteln kultivieren.
Die Extraktion der GPLp-Verbindungen von M.chelonei ist bekannt, wie bereits obenstehend erwähnt. Sie besteht in der Extraktion der Gesamtlipidkomplexe des lebenden oder abgetöteten Bakteriums bzw. der Bakterienzellwand. Dies geschieht beispielsweise durch die Extraktion mit Hilfe von Chloroform/Methanol-Gemischen der Bakterien, einschließlich von lyophilisierten Bakterien.
Im Anschluß daran lassen sich mindestens teilweise die Glykolipide, Carotinoide und freien Lipide entfernen. Dies kann beispielsweise durch die Zugabe großer Mengen Methanol in der Kälte in einer Lösung aus den Gesamtlipidkomplexen in Chloroform geschehen. Sodann findet eine Ausfällung der Glykolipide, Carotinoide und freien Lipide statt. Die polaren und apolaren GPL-Verbindungen, Phospholipide und anderen freie Lipide verbleiben in Lösung.
In diesem Stadium ist es von Interesse, in bekannter Weise durch Behandlung mit nicht allzu starkem Alkali (Zugabe einer NaOH-Lösung in Methanol) mit einer Desacetylierung fortzufahren. Zu den bei dem obenstehenden Schritt entstandenen Lipidkomplexen wird in einer Lösung aus einem Chloroform/Methanol-Gemisch, insbesondere einer Chloroform/Methanol- Mischung von 2 : 1, beispielsweise ein Volumen hinzugefügt, das einer 0,2M- Lösung aus NaOH in Methanol entspricht. Diese Desacetylierung stellt ein spezielles Merkmal der GPL-Verbindungen aus Mycobakterien dar, welche dieser alkalischen Behandlung widerstehen, wogegen sich die anderen Lipide, die eliminiert werden sollen (Phospholipide, Carotinoide und andere unerwünschte Lipide) zersetzt werden. Die Desacetylierung erleichtert auch deren Abtrennung und Schlußreinigung durch die Säulenchromatographie und/oder Dünnschichtchromatographie. Nach der Alkalibehandlung wird mit einer Säure, beispielsweise konzentrierter Essigsäure, neutralisiert. In diesem Stadium ist es von Vorteil, die organische Phase mit einem Gemisch aus Chloroform : Methanol : Wasser im Verhältnis 4 : 2 : 1 oder einem ähnlichen Gemisch zu waschen. Die organische gewaschene Phase läßt sich im Anschluß daran einer Reinigung durch Säulenchromatographie entweder mittels des Verfahrens nach Tsang et al. gemäß der bereits zitierten Publikation oder durch das Verfahren nach Dimitrijevich et al., J. Chromatog., 377, Seiten 345-349, (1986), unterziehen.
Auf diese Weise wird eine teilweise gereinigte Fraktion mit einem Gehalt an GPLp-Verbindungen aus M.chelonei gewonnen.
Die Säulenchromatographie ermöglicht die Abtrennung von unerwünschten Lipiden, die bei der zerstörenden Alkalibehandlung frei werden, sowie der apolaren Glykopeptidlipide, der polaren Glykopeptidlipide und gegebenenfalls der Glykolipide mit einem Gehalt an Trehalose (welche dann vorhanden sind, wenn die Ausfällung mit kaltem Methanol nicht durchgeführt wurde).
Die apolaren Glykopeptidlipide aus M.chelonei stellen Fraktionen dar, die sich nahe an der Lösungsmittelgrenze befinden und die sich in gelbliches Rosa bis unter Zusatz von 5-Methylresorcinol in einem Dünnschichtchromatographietest verfärben. Diese sind nicht artspezifisch (vgl. beispielsweise Tsang et coll. in dem bereits zitierten Artikel).
Die artspezifischen polaren Glykopeptidlipide aus M.chelonei stellen verbreiterte Fraktionen an der Lösungsmittelgrenze dar, die sich bei M.chelonei, Subspezies chelonei, kastanienbraun bis goldgelb verfärben, und tieforange bei M.chelonei, Subspezies abscessus, und zwar beim 5-Methylresorcinoltest mittels der Dünnschichtchromatographie (vgl. beispielsweise Tsang et al. in dem obenstehend erwähnten Artikel).
Der Wirkstoff bei den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen kann auch mindestens eine Verbindung gemäß der Formel 1 darstellen, die vermittels Synthese oder Partialsynthese nach klassischen Peptid- und Saccharidsyntheseverfahren gewonnen wurden.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung wird nach üblichen galenischen Verfahren hergestellt.
Die GPLp-Verbindungen oder sie enthaltende Fraktionen aus der Extraktion können mit Hilfe der Ultraschallbehandlung während der Zeitdauer von 20 bis 50 Minuten bei einer Wellenlänge von 8 um in einer Konzentration von 1 bis 20 mg/ml GPLp unterzogen werden, wobei das Produkt zur Fertigstellung in einem geeigneten flüssigen Träger homogenisiert wird.
Der Wirkstoff (GPLp) ist in den erfindungsgemäßen Mitteln im allgemeinen in einem Verhältnis von 0,02 bis 8 Gew.-% in bezug auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung enthalten.
Die erfindungsgemäßen Mittel können insbesondere in Form einer Suspension in einem passenden pharmazeutischen flüssigen Träger vorliegen. Die Suspension kann auch ein in der Pharmazie einsetzbares Tensid, insbesondere ein nichtionisches Tensid, enthalten, wie z.B. polyoxyethyliertes Sorbitanmonooleat (beispielsweise das Tween 80). Die flüssigen Mittel können lyophilisiert werden, gegebenenfalls mit einem Hilfsstoff zur Lyophilisierung. Sie lassen sich in Form von Lyophilisaten konservieren und zum Zeitpunkt der Applikation rekonstituieren. Die flüssige zur Applikation fertige Zusammensetzung enthält im allgemeinen 0,2 bis 80 mg/ml GPLp (je nach der angewendeten Verabreichungsweise).
Die Suspension kann auch noch zusätzlich bis zu 0,2 Vol.-% Tensid enthalten. Die erfindungsgemäßen Mittel können im allgemeinen eine wirksame Menge an einem üblichen Konservierungsmittel, beispielsweise Merthiolat, enthalten.
Die erfindungsgemäßen Mittel werden insbesondere in Form von Trink- oder injizierbaren Suspensionen hergerichtet oder zur topischen Verabreichung oder auch in Form von Zusammensetzungen, die für die nasale oder Bindehautapplikation hergerichtet sind.
Die erfindungsgemäßen Mittel können auch in Form von Kapseln, Komprimaten, Pulvern, Zäpfchen, Zahnfleischpasten oder Cremes vorliegen.
Wie aus dem untenstehenden experimentellen Teil ersichtlich ist, stellen die GPLp-Verbindungen aus M.chelonei Stimulantien der Antwort für die unspezifische Abwehr des Organismus dar. Sie können auch in unspezifischer Weise eine spezifische Immunreaktion hervorrufen (Adjuvanseffekt).
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung ist auch als immunstimulierendes Arzneimittel bei Mensch und Tier einsetzbar. Es ist insbesondere auch als Adjuvans verwendbar, das den Impfstoffen die Immunität verleiht und läßt sich als Potenziermittel bei der antibiotischen Therapie verwenden.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann auch als Wachstumsfaktor und/oder anabolisches Mittel bei Tier und Mensch Verwendung finden.
Diese wird insbesondere auf parenteralem Wege (intraperitioneal, subkutan, intramuskulär, intravenös oder perkutan), auf peroralem Wege, auf nasalem Wege, über die Bindehaut, rektal oder perlingual verabreicht.
Sie läßt sich auch für die topische Verabreichung vermittels Zahnfleischpasten oder bukkal zerfallenden Tabletten, insbesondere bei der unspezifischen Immuntherapie von Erkrankungen der Mundhöhle (alveolodentale Pyorrhö, Zahnfleischentzündungen oder Parodontitiden usw.), verwenden.
Die übliche Dosierung kann beispielsweise zwischen 0,1 und 12, insbesondere von 0,5 bis 10 mg/kg Körpergewicht bei einmaliger oder mehrmaliger Verabreichung liegen. Beispielsweise beträgt die am häufigsten verwendete Dosierung 0,5 bis 3 mg/kg bei parenteralem Verabreichungswege, 4 bis 10 mg/kg bei peroraler Verabreichung und 2 bis 4 mg/kg bei nasaler Verabreichung.
Das erfindungsgemäße Arzneimittel wird in einer wirksamen Dosis insbesondere im Zusammenhang mit der immunstimulierenden Behandlung im Falle eines sekundären Immundefektes, als Adjuvansbehandlungsmittel im Falle von lokalen oder allgemeinen Infektionserkrankungen, als Adjuvansbehandlungsmittel bei der Therapie des erworbenen Immundefektsyndroms (AIDS), insbesondere in Kombination mit antiviralen Therapien, als Adjuvansbehandlungsmittel im Falle von Parasiten- und Krebserkrankungen sowie bei der regulierenden Behandlung von immundepressiven Effekten (insbesondere im Zusammenhang mit der Leukopenie) bei Antitumorbehandlungen verabreicht.
Das erfindungsgemäße Arzneimittel kann auch zum Zwecke der Prophylaxe in den verschiedenen oben geschilderten Fällen, insbesondere zur Verhütung von rezidivierenden Infektionen des Hals-Nasen-Ohren-Formenkreises und zur Verhütung von infektiösen Risiken bei chronischen Erkrankungen, wie auch als Adjuvans bei Impfstoffen verabreicht werden.
Es läßt sich auch zur Wachstumsstimulierung oder Gewichtszunahme bei Tier und Mensch verwenden.
Die GPLp-Verbindungen aus M.chelonei lassen sich insbesondere auch als Futtermittelzusatzstoffe bei Tieren zur Stimulierung des Wachstums und/oder zur Resistenzerhöhung gegenüber Infektionen einsetzen.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der beispielsweise obenstehend gekennzeichneten GPLp-Verbindungen aus M.chelonei als Wirkstoffe zur Herstellung eines unspezifischen immunstimulierenden Arzneimittels oder als Anabolika, als Adjuvantien bei der Herstellung von Impfstoffen oder auch als Zusatzstoffe zur Herstellung eines Futter- oder Lebensmittels.
Die Erfindung betrifft insbesondere die Verwendung von GPLp-Verbindungen aus M.chelonei als Wirkstoffe bei der Herstellung eines unspezifisch immunstimulierenden Arzneimittels, das insbesondere zum Ausgleich der immundepressiven Effekte infolge von Antitumorbehandlungen (beispielsweise vom chemisch-induzierten Leukopenien) dient.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung ohne jegliche Beschränkung.

BEISPIEL 1

REINIGUNG EINER GPLp-FRAKTION AUS M.CHELONEI

BAKTERIENKULTUR

Das Mycobacterium chelonei, Subspezies chelonei, wird bei 35ºC in den Medien kultiviert, die in der obenstehenden Erläuterung angegeben sind, und zwar solange, bis die stationäre Phase erreicht ist, wonach die Gewinnung und Waschung mittels Zentrifugation bei 5900 x g erfolgen. Die Zellen werden im Anschluß daran getrocknet oder lyophilisiert und unter der denkbar kürzesten Verzögerung extrahiert.

GESAMTEXTRAKT DER LIPIDEN STOFFE:

Die Extraktion der Gesamtlipide aus der Zellwand von M.chelonei wird nach einer Technik vorgenommen, welche der durch Brennan und Goren, Journal of Biological Chemistry, Band 254, Nr. 10, Seiten 4205-4211 (1979), beschriebenen Methode nahesteht.
Danach erfolgt die Extraktion durch ein Gemisch aus Chloroform : Methanol im Verhältnis 2 : 1, wobei sich auf 40 ml-Gemisch ein 1 g lyophilisierte Mycobakterien bei 50ºc während der Zeitdauer von 18 Stunden in einem Kolben befinden, der in ein beheiztes Wasserbad eingetaucht ist. Der Extrakt wird anschließend durch Filtrieren durch ein Whatman-Papier Nr. 3 gewonnen. Der Rückstand wird einer erneuten Extraktion in derselben Weise, jedoch nur noch während einer Zeitdauer von 4 Stunden, unterzogen. Die Extrakte werden miteinander vereinigt und die Lösungsmittel abgedampft. Der Trockenextrakt wird bei 4ºC bis zur nächsten Stufe aufbewahrt.

ELIMINIERUNG DER GLYKOLIPIDE, CAROTINOIDE UND FREIEN LIPIDE

Die Gesamtlipidkomplexe werden mit einer ausreichenden Menge Chloroform in Lösung gebracht und eine beträchtliche Menge an Methanol bei 4ºC hinzugesetzt. Sodann erfolgt eine Ausfällung. Die Methanolmenge sollte so bemessen sein, daß eine weitere Zugabe an Methanol keine Ausfällung mehr bewirkt. Der Niederschlag enthält die Glykolipide, Carotinoide sowie die freien Lipide. Die GPLp-Verbindungen, apolaren GPL-Verbindungen, Phospholipide und die übrigen freien Lipide verbleiben in Lösung.
Die Ausfällung wird durch Zentrifugieren entfernt, wonach die Lösungsmittel über dem Überstand evaporiert werden.

DESACETYLIERUNG UND WASCHEN:

Der in vorangehender Stufe erhaltene Evaporationsrückstand wird einer mäßigen Alkalibehandlung (Desacetylierung) unterworfen, wonach mittels eines Gemisches aus Chloroform/Methanol/Wasser das Waschen erfolgt.
Der in vorangehender Stufe gewonnene Rückstand wird in einem Gemisch aus Chloroform : Methanol im Verhältnis 2 : 1 aufgenommen und eine gleiche Menge einer Lösung aus 0,2M NaOH in Methanol hinzugefügt. Nach 30 Minuten bei 37ºC wird das Gemisch durch 12,5 ul/ml konzentrierter Essigsäure neutralisiert und im Anschluß daran gewaschen. Dazu wird das Mischungsverhältnis von Chloroform : Methanol : Wasser auf 4 : 2 : 1 eingestellt. Nach dem Rühren und Austreiben des gebildeten Gases wird die Mischung eine Stunde lang stehengelassen. Die wäßrige Phase wird entfernt, die organische Phase aufgefangen und im Anschluß daran evaporiert. Der Rückstand wird bei +4ºC aufbewahrt.

ABTRENNUNG UND REINIGUNG DER GPL-VERBINDUNGEN DURCH SILIKAGELSÄULENCHROMATOGRAPHIE

Es wird eine Glassäule mit 100 g Silikagel 60 (Korngrößenbereich 0,063 bis 0,200 mm) auf 1 g Lipidkomplex vorbereitet. Es wird nach der von Tsang et al. im der erwähnten Publikation beschriebenen Verfahrensweise gearbeitet, welche in der Trennung der Bestandteile mit einem gekreuzten Übergang des Prozentsatzes an Methanol in Chloroform besteht, wobei mit reinem Chloroform gestartet wird. Es kann in gleicher Weise auch nach dem Verfahren nach Dimitrijevich et coll. (siehe den angegebenen Artikel) gearbeitet werden, wobei die Autoren mit einem definierten Prozentsatz an Methanol (10%) in Chloroform arbeiten. Der Durchfluß beträgt dabei etwa 1,5 ml/min. Die Fraktionen werden vermittels der Dünnschichtchromatographie analysiert. Die Fraktionen der gleichen Mobilität werden miteinander vereinigt, gewogen und vorzugsweise bei 4ºC aufbewahrt.

DÜNNSCHICHTCHROMATOGRAPHIE (DSC)

Die Dünnschichtchromatographieplatten (Glasplatten von 20 x 20 cm und 1 mm Dicke von Merck) werden durch 30-minütiges Erhitzen auf 110ºC vor der Verwendung aktiviert.
Die vermittels der vorangehenden Stufe erhaltenen Fraktionen werden auf 10 mg/ml in einem Gemisch aus Chloroform : Methanol im Verhältnis von 2 : 1 eingestellt. Diese Zubereitungen werden dann in jeweils gleicher Entfernung voneinander (von mindestens 1 cm) im Abstand von 1 bis 2 cm vom unteren Plattenrand als Flecke aufgetragen. Das Auftragen erfolgt mit Hilfe von schmalen Pasteurpipetten, die an ihrem Ende verjüngt sind. Die Platten werden dann in einen Trog mit dem Laufmittel (Chloroform : Methanol : Wasser im Verhältnis von 60 : 12 : 1) verbracht. In dem Moment, wo das Laufmittel an der oberen Plattenkante in einer Entfernung von 1 bis 2 cm angelangt ist, wird der Vorgang unterbrochen. Die Platte wird unter einem Abzug getrocknet und das Reagenz zur Erkennung pulverisiert. Die Erkennung der GPLp-Verbindungen erfolgt durch Pulverisieren von 0,1% 5-Methylresorcinol in einer Lösung aus 40%iger Schwefelsäure in zweifach destilliertem Wasser. Nach 3- bis 10-minütigem Verbleiben in einem Ofen bei einer Temperatur von 110 bis 130ºC verfärben sich die für M.chelonei spezifischen GPLp- Verbindungen kastanienbraun bis goldgelb, wogegen die apolaren Glykopeptidlipide eine Gelblich-Rosa-Färbung annehmen. Diese Chromatographie ermöglicht die Kontrolle des Reinheitsgrades des abgetrennten Extraktes.
Zur Identifizierung und Kontrolle der Reinheit der GPLp-Verbindungen lassen sich die folgenden analytischen Verfahren anwenden:

SAURE HYDROLYSE MIT 1N HCl

Die saure Hydrolyse der für M.chelonei spezifischen GPL-Verbindungen in Anwesenheit von 1M HCl ermöglicht die Freisetzung der spezifischen Zucker ( Methylrhamnose, Rhamnose und Desoxytalose), welche sich durch die Papierchromatographie mittels Whatman Nr. 1 sowie durch die Gaschromatographie identifizieren lassen.

SAURE HYDROLYSE MIT 6N HCl

Die saure Hydrolyse mit 6N HCl des Rückstandes aus der vorangehenden Stufe ermöglicht die Freisetzung der spezifischen Aminosäuren aus GPL- Verbindungen von Mycobakterien, welche sich durch die Dünnschichtchromatographie identifizieren lassen. Im Fall von M.chelonei wie auch im Fall von atypischen Mycobakterien liegen die Aminosäuren in Form von Phenylalanin, Alanin, Alaninol und allo-Threonin vor.

ANALYSE DER GPLp-VERBINDUNGEN VERMITTELS INFRAROTSPEKTROSKOPIE

Bei der Analyse der desacetylierten GPLp-Verbindungen aus M.chelonei haben sich charakteristische Peaks von Peptidbindungen der Glykopeptidlipide herausgestellt, welche jenen analog sind, wie sie von Brennan und Goren (1979, gemäß der genannten Publikation) und von Brennan (1984, im zitierten Werk) beschrieben wurden.
In analoger Weise wurden gemäß obenstehender Beschreibung gereinigte GPLp-Verbindungen, ausgehend von M.chelonei, Subspezies abscessus, hergestellt.

BEISPIEL 2

HERSTELLUNG EINER INJIZIERBAREN SUSPENSION

Die gemäß Beispiel 1 erhaltenen GPLp-Verbindungen werden in Chloroform aufgenommen und zweimal unter Stickstoffatmosphäre in einer Ultraschallröhre evaporiert.
Der Rückstand wird in einer Flüssigkeit in die Form einer Suspension gebracht, welche sich für die Herstellung von Injektionslösungen eignet, beispielsweise physiologisches Serum (pyrogenfreie Lösung von 8,5% NaCl). Es ist auch der Zusatz eines Detergens möglich, das mit der parenteralen Verabreichung, beispielsweise Tween-80, in einem Verhältnis von 0,1 bis 0,2 Vol.-% verträglich ist. Die Zugabe des Detergens soll die Herstellung der Suspension erleichtern.
Die so erhaltene Suspension wird im Anschluß daran einer Ultraschallbehandlung während der Dauer von 20 bis 50 Minuten bei einer Wellenlänge von 8 um in einer Konzentration von 1 bis 20 mg GPLp/ml zur Homogenisierung des Produktes unterworfen.
Die Injektionssuspensionen lassen sich auch mit anderen annehmbaren Medien, wie z.B. PBS oder Analoga davon, herstellen.
Die Konzentration an GPLp-Verbindungen wird beispielsweise auf den Bereich zwischen 0,2 und 80 mg/ml je nach Applikationsweise eingestellt. Für längere Aufbewahrungszeiten läßt sich die Präparation auch lyophilisieren und anschließend in physiologischem Serum ohne nennenswertem Aktivitätsverlust rekonstituieren.

BEISPIEL 3

PHARMAKOLOGISCHE UNTERSUCHUNG DER GPLp-VERBINDUNGEN AUS M.CHELONEI

Diese Studie wurde mit den gemäß Beispiel 1 gewonnenen GPLp- Verbindungen durchgeführt.

1. Stimulationseffekt der lymphoblastischen Transformation

Dieser Effekt wird durch die Erhöhung der lymphoblastischen Transformation von Milzzellen und Thymozyten aus Mäusen, welche zuvor mit GPLp aus M.chelonei durch direkte Einwirkung auf die Zellen behandelt wurden, beurteilt. Dabei kam alternativ auch der indirekte Effekt auf die Erhöhung der proliferativen Antwort auf Mitogene in Betracht. Diese Effekte wurden durch die Untersuchung des Einbaus an mit Tritium markiertem Thymidin gemessen.
Diese Untersuchung wurde mit weiblichen Mäusen Balb/c durchgeführt.
Das Produkt wird in einer Dosis von 12 mg/kg peroral oder 2,5 mg/kg subkutan (s.c.) in jeweils 3 Verabreichungen mit 3 Tagen Abstand (s.c.) und 4 Verabreichungen mit jeweils 3 Tagen Abstand (peroral) jeweils Gruppen von 5 Tieren verabreicht. Die Vergleichsgruppen wurden mit Lösungsmittel behandelt.

Ergebnisse:

Das GPLp stimuliert die lymphoblastische Transformation der Mäusemilzzellen durch subkutane Behandlungen (p ≤ 0,001) und perorale Behandlungen (p ≤ 0,05).
Die Mitogenantwort der Mäusemilzzellen gestaltet sich nach der Erhöhung im Verlauf der subkutanen Stimulation wie folgt: (p ≤ 0,02) für das Concanavalin A (ConA; IBF-LKB); p ≤ 0,01 für Phytohämagglutinin (PHA; Difco); sowie p ≤ 0,001 für das Lipopolysaccharid B (LPS, Difco). Diese Erhöhung wird ebenfalls nach der peroralen Stimulation beobachtet (p ≤ 0,001 für das ConA, PHA und das LPS).
Die Mitogenanwort von Mäusethymozyten wird gleichfalls in äußerst signifikanter Weise erhöht (p ≤ 0,001 für das ConA und LPS).

2. Induktionskapazität von Monokinen auf peritoneale Makrophagen bei behandelnden Balb/c-Mäusen

Während des Kontaktes von Makrophagen mit einem Antigen oder Mitogen mit immunstimulierenden Effekten antworten diese mit einer Sekretion von Monokinen [Interleukin 1, Tumornekrosefaktor (TNF)]. Der Test auf Induktion der Monokine durch die peritonealen Makrophagen stellt daher ein Mittel zur Bewertung der immunstimulierenden Effekte der Produkte auf die Zellen dar.

Ergebnisse:

Anhand der Aktivierung durch LPS von peritonealen Makrophagen, welche durch die zuvor dem GPLp behandelten Mäusen freigesetzt wurden, konnte eine äußerst signifikante Induzierung einer Interleukin 1-Aktivität (IL- 1), die 107 Einheiten/ml äquivalent waren, auf die Transformation von C3H/hej-Mäusen (gegenüber LPS unsensiblen Mäusen) aufgezeigt werden.
Der verbleibende Teil dieser Makrophagen zeigte ebenfalls noch einen toxischen Effekt auf die Tumorlinie L929, welche gegenüber der TNF-Wirkung bei einer äquivalenten Menge von 20000 Einheiten/ml empfindlich ist.
Die intraperitoneale Stimulierung von Balb/c-Mäusen durch 3 Verabreichungen im Abstand von jeweils 3 Tagen in einer Dosierung von 2,5 mg/kg an GPLp zeigte eine signifikante Induzierung der TNF-Aktivität im Serum dieser Tiere anhand der Bewertung der Toxizität bei der Tumorlinie L929 in einer äquivalenten Menge von 34000 Einheiten/ml.

3. Induktionskapazität von Lymphokinen auf die Milzzellen von Balb/c-Mäusen

Während des Kontaktes von Milzzellen mit einem immunstimulierenden Antigen oder Mitogen in vivo oder in vitro antworten diese durch die Sekretion von Lymphokinen.
Das meistbekannte Lymphokin stellt das Interleukin-2 (IL-2) dar, das zum Überleben und der Multiplizierung einer cytotoxischen Lymphozyten-T- Linie (Mäusetymom), die eine IL-2-Abhängigkeit zeigt (CTLL-2), unentbehrlich ist.

Ergebnisse:

Die subkutane Stimulation mit dem GPLp von Balb/c-Mäusen mittels dreier Verabreichungen im Abstand von jeweils 3 Tagen bei einer Dosierung von 2,5 mg/kg hat eine signifikate Induktion der in den verbliebenen Milzzellen gemessenen IL-2-Aktivität nach 48 Stunden in einer äquivalenten Menge von 5,55 Einheiten/ml erwiesen.

4. Test der retardierten Hypersensibilität bei Mäusen

Die Reaktion der retardierten Hypersensibilität (HSR) wird durch ein topisch injiziertes Allergen (Fußballen/Pfote) nach einer ersten intravenösen Sensibilisierung ausgelöst. Durch die immunstimulierende unspezifische Behandlung reagiert das Tier mit den T-Lymphozyten und es wird eine Erhöhung der retardierten Hypersensibilität bei der zweiten lokalen Inkorporierung des Allergens beobachtet.
Bei diesem Test wird die Volumenvergrößerung der Pfoten nach der zweiten Injektion des Allergens analysiert. Bei dieser Untersuchung werden Schafserythozyten als Allergen benutzt. Die intravenöse Injektion der Schafserythozyten wurde 2 Tage nach der letzten Stimulierung der Mäuse auf intraperitonealem oder subkutanem Wege des untersuchten Produkts und 4 Tage vor der Prüfung auf retardierte Hypersensibilität durchgeführt. Die stimulierten Mäuse erhalten das untersuchte Produkt in einer Dosierung von 2,5 mg/kg an den Tagen J-8, J-5 und J-2 auf intraperitonealem oder subkutanem Wege. Die Vergleichsmäuse erhalten lediglich physiologisches Serum. Am Tag J+0 erhalten sämtliche Mäuse intravenös eine Einzeldosis von 10&sup6; Schafserythozyten. Am Tag J+4 erhalten die Mäuse intraplantar (in die Pfoten) 10&sup8; Schafserythozyten.

Ergebnisse:

Die intraperitoneale und subkutane Stimulierung der C57BL/6-Mäuse durch 3 Verabreichungen jeweils im Abstand von 3 Tagen auf Basis des Produktes rief eine Erhöhung der retardierten Hypersensibilität (p ≤ 0,001) im Hinblick auf die Vergleichsgruppe an Mäusen (mit Ausnahme der Ablesung nach der 72. Stunde) im Vergleich zu jener des BCG hervor.

5. Erhöhung der Antikörper-Antischafserythozytenantwort bei Mäusen

Die Erhöhung der Antikörperantwort ist von der Natur der Antigene und des Immunsystems abhängig. Während letztere durch ein immunstimulierendes Agens oder ein durch ein Antigen in Anwesenheit eines Adjuvans hervorgerufen wird, wird die Antikörperantwort erhöht. Bei den durchgeführten Untersuchungen wurde diese Eigenschaft des GPLp's durch die Antikörper/- Antischafserythozytenantwort bei C57BL/6-Mäusen, die zuvor durch das untersuchte Produkt stimuliert wurden, analysiert. Die behandelten Mäuse erhalten das untersuchte Produkt in einer Dosierung von 2,5 mg/kg an den Tagen J-8, J-5 und J-2 auf intraperitonealem oder subkutanem Wege. Die Vergleichsgruppe an Mäusen erhält lediglich das physiologische Serum.
Am Tag J+0 erhalten sämtliche Mäuse intravenös eine Einzeldosis von 10&sup6; Schafserythozyten. Die vom Tage J+0 bis J+43 entnommenen Seren werden auf die Hämolysefähigkeit der Schafserythozyten hin getestet.

Ergebnisse:

Die intraperitoneale und subkutane Stimulierung der C57BL/6-Mäuse durch das GPLp durch 3 Verabreichungen in einem Abstand von jeweils 3 Tagen hat eine äußerst signifikante Erhöhung der Antikörper/Antischafserythozytenantwort bei Entnahmen an den Tagen 7, 11 und 25 bezüglich der intraperitonealen Stimulierung und an den Tagen 7, 20 und 25 bezüglich der subkutanen Stimulierung gezeigt.

6. Untersuchungen zum globalen Schutz

a) Versuche zum Schutz gegen eine Infektion durch Klebsiella pneumoniae bei Mäusen:

Die intraperitoneale Injektion von speziell an Mäuse angepaßter Klebsiella pneumoniae verursacht eine tödliche Septikämie innerhalb 24 bis 48 Stunden.
Die Untersuchung besteht in der Bestimmung der Überlebenszeit der behandelten Mäuse im Vergleich zur unbehandelten Gruppe. Die behandelten Mäuse erhalten das untersuchte Produkt in einer Dosierung von 2,5 mg/kg an den Tagen J-8, J-5 und J-2 auf intraperitonealem Wege. Die Mäusevergleichsgruppe erhält lediglich physiologisches Serum. Am Tag J+0 erhalten sämtliche Mäues intraperitoneal eine geeignete Dosis an K.pneumoniae. Die Mortalität wird im Anschluß daran während 5 Tagen beobachtet.

Ergebnisse:

Die intraperitoneale Stimulierung mit dem GPLp bei 3 Verabreichungen in einem Abstand von jeweils drei Tagen in einer Dosierung von 2,5 mg/kg schützt die durch 50 x DL50 K.pneumoniae infizierten Mäuse in äußerst signifikanter Weise. Während der Untersuchungen haben die Tiere im übrigen keinerlei Krankheitszeichen aufgewiesen.

b) Schutzeffekte gegen die durch eine Injektion von L 1210-Zellen hervorgerufene Leukämie bei Mäusen

Die Untersuchung besteht darin, die Überlebenszeit von B6D2/F1- Mäusen nach einer Behandlung im Vergleich zu einer unbehandelten Gruppe zu bestimmen.
Die Leukämiezellen L 1210 wurden in einem geeigneten Medium vor den Untersuchungen kultiviert.
Die behandelten Mäuse erhalten das untersuchte Produkt in einer Dosierung von 2,5 mg/kg an den Tagen J-8, J-5 und J-2 auf intraperitonealem Wege. Die Vergleichsgruppe an Mäusen erhält lediglich physiologisches Serum. Am Tag J0 erhalten alle Mäuse auf intraperitonealem Wege eine Einzeldosis von 10&sup6; lebensfähigen L 1210-Zellen. Die Überlebenszeit wird bestimmt.

Ergebnisse:

Die intraperitoneale Stimulierung durch GPLp bei 3 Verabreichungen in einem Abstand von jeweils 3 Tagen bei einer Dosierung von 2,5 mg/kg verlängerte in äußerst signifikanter Weise die Überlebenszeit der B6D2/F1- Mäuse gegenüber den Leukämiezellen L 1210 (bei einer Verlängerung der Überlebensdauer von 33% im Vergleich zur unbehandelten Gruppe).

7. Bewertung des anabolisierenden Effektes bei Mäusen nach Verabreichung s.c.

Das Produkt wird subkutan in einer Dosierung von etwa 2,5 mg/kg bei 3 Verabreichungen in einem Abstand von jeweils 3 Tagen injiziert. Das Gewicht der Mäuse wird täglich während der Dauer von 10 Tagen registriert und die Gesamtgewichtszunahme bewertet.
Die behandelten Mäuse erhalten das GPLp in einer Dosierung von 2,5 mg/kg an den Tagen J-10, J-7 und J-4. Die Vergleichsgruppe der unbehandelten Mäuse erhält lediglich physiologisches Serum.

Ergebnisse:

Die subkutane Stimulierung durch GPLp bei 3 Verabreichungen in einem Abstand von jeweils 3 Tagen und in einer Dosierung von 2,5 mg/kg ergibt bei den Balb/c-Mäusen eine signifikante anabolisierende Aktivität (p ≤ 0,02).

8. Antileukopänie-Effekt von GPLp nach chemisch induzierten Leukopenien

Der Test besteht in einem ersten Schritt in der Induktion einer Abnahme von weißen Blutkörperchen durch Adriblastin (Doxorubicinchlorhydratlactose; cytostatischer Stoff aus der Gruppe der Anthracycline). In einem zweiten Schritt werden die Mäuse mit GPLp behandelt als positive Vergleichssubstanzen (GM-CSF-Mäuse-Genzym) verwendet, und zwar solange, bis die Blutzellen ihren Normalwert wieder erreicht haben.
Die Balb/c-Mäuse werden mit Adriblastin in einem Verhältnis von 5 mg/kg/Tag intravenös an den Tagen J+0 und J+1 mit einem Volumen von 50 ul behandelt. Diese Mäuse erhalten anschließend das GPLp, GM-CSF oder das physiologische Serum intraperitoneal mit einem Volumen von 0,15 ml. Die Behandlung wird an den Tagen J+2, J+5, J+8, J+11, J+14, J+17 und J+20 durchgeführt. Die Zählung der zirkulierenden Leukozyten wird bei jedem Tier an den Tagen J+0, J+2, J+5, J+8, J+11, J+14, J+17, J+20 und J+28 durchgeführt.

Ergebnisse:

Die intraperitoneale Stimulierung mit GPLp an den Balb/c-Mäusen rekonstituiert die durch die vorherige Behandlung erzeugte Leukopenie mittels Adriblastin in äußerst signifikanter Weise, die in etwa jener bei den GM-CSF- Mäusen vergleichbar ist.

9. Untersuchung der phagozytären Funktion: Aktivität des GPLp's auf die kolloidale Kohlenstoffclearance:

Dieser Test ermöglicht die Untersuchung der Kinetik der Blutreinigung von kolloidalem Kohlenstoff durch Phagozyten. Die behandelten Mäuse erhalten das untersuchte Produkt in einer Dosierung von 12 mg/kg an den Tagen J-8, J-5 und J-2 auf peroralem Wege. Die unbehandelte Vergleichsgruppe an Mäusen erhält lediglich physiologisches Serum. Am Tag J+0 erhalten sämtliche Mäuse intravenös eine Einzeldosis von Kolloidalkohle (schwarze Tusche von Pelikan) in einer 4%igen Gelatinesuspension in einer Dosierung von 16 mg/100 g Lebendgewicht. Die Blutentnahmen von jeweils 0,025 ml werden nach jeweils 0, 2, 4, 6, 8, 10 und 12 Minuten durchgeführt. Die Ablesung der Probeentnahmen erfolgt spektrofotometrisch bei einer Wellenlänge von 630. Sie ermöglicht die Messung der Kohlenstoffpartikel, die in der Blutsuspension verbleiben.

Ergebnisse:

Die perorale Stimulierung durch GPLp in einer Dosierung von 12 mg/kg an den Tagen J-8, J-5 und J-2 der CDI-Mäuse ruft eine signifikante Erhöhung der kolloidalen Kohlenstoffclearance hervor.

Claims

1. Arzneimittel, dadurch gekennzeichnet, daß es als Wirkstoff eine Fraktion aus der mindestens teilweise gereinigten Extraktion von polaren Glykopeptidlipid(GPL)-Verbindungen aus Mycobakterium chelonei (M.chelonei) oder eines Derivats davon als immunstimulierenden Wirkstoff sowie die entsprechenden polaren GPLp-Verbindungen aus M.chelonei enthält.

2. Zubereitung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die zumindest teilweise gereinigte Fraktion eine in Methanol bei 4ºC lösliche Fraktion darstellt.

3. Zubereitung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Fraktion eine durch die Extraktion von Zellen oder Zellwänden von M.chelonei mittels eines Gemisches aus Chloroform : Methanol im Verhältnis 2 : 1 bei einer Temperatur von 18 bis 50ºC erhältliche Fraktion darstellt, die darüber hinaus in Methanol bei 4ºC löslich ist.

4. Zubereitung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Fraktion durch die Extraktion mittels eines Gemisches aus Chloroform : Methanol im Verhältnis 2 : 1, anschließende Zugabe von auf 4ºC abgekühltem Methanol in einer für das Volumenverhältnis von Methanol : Chloroform von mindestens oder gleich 5 : 1 ausreichenden Menge und Auffangen der in Lösung verbliebenen Fraktion erhältlich ist.

5. Zubereitung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß darüber hinaus die in Lösung verbliebene Fraktion nach dem Abdampfen der Lösungsmittel in einem Gemisch aus Chloroform : Methanol im Verhältnis 2 : 1 aufgenommen und in bekannter Weise eine Desacetylierung durch Zugabe einer Lösung von 0,2M NaOH in Methanol durchgeführt und nach 30 Minuten bei 37ºC mittels Essigsäure neutralisiert wird, die Lösungsmittelverhältnisse durch den Erhalt eines Gemisches aus Chloroform : Methanol : Wasser von 4 : 2 : 1 eingestellt und nach dem Rühren das Gemisch eine Stunde lang stehengelassen wird, die organische Phase zurückgewonnen und der Evaporierung oder einer Reinigung in bekannter Weise durch Säulenchromatographie unterzogen wird.

6. Zubereitung nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Wirkstoff mindestens ein Glykopeptidlipid der Formel 1 enthält: Alaninol Zucker Oligosaccharid

worin

Phe Phenylalanin,

aThr allo-Threonin,

Ala das Alanin bedeuten und

der Zucker die 3,4-Di-O-Methylramnose darstellt,

das Oligosaccharid die folgende Struktur aufweist:

3,4-Di-O-methylrhamnose-rhamnose-6-desoxytalose,

R-CO- den Acylrest einer Fettsäure darstellt, und

wobei die 3,4-Di-O-methylrhamnose jeweils mit dem allo-Threonin und

Alaninol über eine Glycosidbindung verknüpft sind, und

die C-terminale Alaningruppe mit dem Alaninol über eine Amidbindung verknüpft ist.

7. Zubereitung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Rest R-CO- der Acylrest einer Fettsäure mit mindestens 16 Kohlenstoffatomen darstellt.

8. Zubereitung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Rest R-CO- einen Acylrest einer Fettsäure mit weniger als 36 Kohlenstoffatomen darstellt.

9. Zubereitung nach den Ansprüchen 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Fettsäure eine oder mehrere Doppelbindungen und/oder eine Verzweigung und/oder einen ß-Hydroxy- oder ß-Methoxysubstituenten aufweist.

10. Zubereitung nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Derivat einen desacetylierten Abkömmling darstellt.

11. Zubereitung nach einem der Ansprüche 6 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff mindestens eine Verbindung gemäß Formel 1 bildet, der durch Synthese oder Partialsynthese hergestellt worden ist.

12. Zubereitung nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie in Form von Kapseln, Komprimaten, Pulvern, Suppositorien, Zahnfleischpasten, Cremes oder in Form von Zubereitungen vorliegen, die für die nasale Verabreichung oder die Verabreichung über die Bindehaut gedacht sind.

13. Zubereitung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß sie in Form einer Suspension in einem flüssigen pharmazeutischen Träger oder in Form eines Lyophilisats vorliegt.

14. Zubereitung nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie zusätzlich noch eine wirksame Menge an einem Konservierungsmittel und/oder einem Tensid enthält.

15. Zubereitung nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie 0,02 bis 8 Gew.-% Wirkstoff in bezug auf das Gesamtgewicht der Zubereitung enthält.

16. Verwendung einer zumindest teilweise gereinigten Fraktion an GPLp aus M.chelonei gemäß Bedeutung nach einem der Ansprüche 1 bis 11 als Wirkstoff bei der Herstellung eines unspezifischen immunstimulierenden Arzneimittels oder eines Anabolikums, als Adjuvans bei der Herstellung einer Vakzine oder als Zusatzstoff bei der Herstellung eines Lebens(Futter)mittels.

17. Verwendung nach Anspruch 16 bei der Herstellung eines Arzneimittels, das zum Ausgleich (Korrektur) der immundepressiven Effekte von Antitumortherapeutika bestimmt ist.