DE69214258T2

DE69214258T2 - Antibiotikum AB-041 und Verfahren zur seiner Produktion

Info

Publication number: DE69214258T2
Application number: DE69214258T
Authority: DE
Inventors: Nunzio Andriollo; Giorgio Ettore Borgonovi; Giorgio Cassani; Giovanni Confalonieri; Gianfranco Guglielmetti; Giorgio Pirali; Alessandro Scacchi; Silvia Spera
Original assignee: MINI RICERCA SCIENT TECNOLOG; Ministero dell Universita e della Ricerca Scientifica e Tecnologica (MURST)
Current assignee: MINI RICERCA SCIENT TECNOLOG; Ministero dell Universita e della Ricerca Scientifica e Tecnologica (MURST)
Priority date: 1991-12-04
Filing date: 1992-11-28
Publication date: 1997-03-20
Anticipated expiration: 2012-11-29
Also published as: EP0545490A2; CA2084477A1; EP0545490B1; DE69214258D1; GR3021520T3; HUT65566A; DK0545490T3; JPH05294982A; EP0545490A3; ITMI913254A1; CZ357892A3; HU9203826D0; HU215553B; IT1259423B; AR247591A1; NZ245333A; ZA929354B; SK357892A3; CZ282323B6; SK279441B6

Description

Dieses Erfindung betrifft ein Antibiotikum, das willkürlich AB-041 genannt wurde
Die Erfindung betrifft weiter das Verfahren zu dessen Herstellung durch Fermentierung von Streptomyces sp. NCIMB 40428, und dessen Verwendung beim Schutz von Feldfrüchten vor Unkräutern, die dagegen empfindlich sind.
Die hohe herbizide Aktivität dieser Substanz macht sie für den landwirtschaftlichen Einsatz beim Schutz von Nutz-Feldfrüchten gegenüber Unkräutern nützlich.
Diese Aktivität tritt gegenüber einer Vielzahl von Unkräutern auf, wobei keine toxische Auswirkungen bei Nutzpflanzen auftraten.
Die EP-A-0 371 509 offenbart das Antibiotikum AB0Z1, das aus Streptomyces sp. NCIB 40068 erhalten wurde und das keine herbizide Aktivität aufweist.
Die vorliegende Erfindung liefert das Antibiotikum AB-041 mit herbizider Aktivität, das durch Fermentierung von Streptomyces sp. NCIMB erhalten wird.
Es muß bemerkt werden, daß die vorliegende Erfindung nicht auf die Verwendung von Streptomyces sp. NCIMB 40428 beschränkt ist, sondern daß sie weiter die Verwendung natürlicher oder künstlicher Mutanten oder Varianten des Mikroorganismusses umfaßt, mit der Maßgabe, daß sie das Antibiotikum AB-041 synthetisieren.
Das Antibiotikum weist die folgenden Eigenschaften auf:

Physikalische und chemische Eigenschaften des Antibiotikums AB-041

Das Antibiotikum AB-041 liegt in Form eine weißen oder weiß-ockerfarbigen Pulvers vor, das gekennzeichnet ist durch :
a) eine gute Löslichkeit in Wasser, in Dimethylsulfoxid und in Gemischen davon, jedoch im wesentlichen keine Löslichkeit in Ethylether und Hexan;
b) einen Gehalt an Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff, Sauerstoff, Schwefel;
c) ein Molekulargewicht von 463.1373, bestimmt durch FAB-HRMS-Spektren, die Peaks bei m/z = 464.1452 + 0 0006 (MH)&spplus; und m/z = 486.1270 ± (MNa)&spplus; unter den folgenden Betriebsbedingungen zeigen:
HRFAB-MS, Xe bei 9,5 kV, Glycerinmatrix.
Der Wert von [MH]&spplus; bei m/z 464 wurde durch die Spektren bestätigt, die durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie/Thermospray-Massenspektrometrie (HPLC/TSMS) mit einer mobilen Phase erhalten wurde, die aus einer 0,05 M Lösung von Ammoniumacetat und Methanol (50/50) besteht.
e) die empirische Formel: C&sub1;&sub6;H&sub2;&sub5;N&sub5;O&sub9;S
Ultraviolett(UV)absorptionsspektrum, in Wasser bei pH 4,5 aufgezeichnet, in Fig. 1 der anliegenden Zeichnungen gezeigt. Es zeigt ein Absorptionsmaximum bei 278 nm.
f) Infrarot(IR)absorptionsspektrum in KBr-Tabletten, in Fig.2 der anliegenden Zeichnungen gezeigt, mit den folgenden Maxima: 3395, 1663, 1594, 1449, 1403, 1338, 1307, 1285, 1246, 1225, 1159, 1102, 1074, 1037, 1017, 960, 942, 917, 888, 741 cm&supmin;¹.
g) ein ¹HNMR-Spektrum, das in Fig.3 der anliegenden Zeichnungen gezeigt ist. Das Spektrum wurde auf einem Bruker AM 300 NMR Spektrometer in D&sub2;O aufgezeichnet. 3000 Scans wurden durchgeführt mit einer Verzögerung von 2 Sek. zwischen jedem Scan.
Die chemischen Verschiebungen wurden indirekt auf TMS bezogen = 0,00 ppm (δTMS), wobei als interner Standard der Peak von deuteriertem Wasser bei 4,80 ppm genommen wurde. Die 3 übereinanderliegenden Signale bei 3,67 ppm wurden durch Vergleichen des Spektrums in D&sub2;O mit dem analogen Spektrum in Hexadeuterodimethylsulfoxid (DMSO-d6), bei dem die entsprechenden Signale verschiedene Verschiebungen, 3,48, 3,43 und 3,28 ppm zeigten (Fig.4), und durch zweidimensionale NMR-Experimente, aufgelöst.
δ(ppm): 8,26 (s, 1H); 4,55 (t, 1H); 4,43 (d, 1H); 4,26 (d, 1H); 4,04 (m, 1H); 3,67 (m, 3H); 3,36 (t, 1H); 3,26(t, 1H); 3,09 (m, 1H); 2,71 (dd, 1H); 2,19 (d, 1H); 1,26 (d, 3H).
h) ¹³C NMR-Spektrum, in Fig.5 gezeigt, in einem Bruker AM 300 Spektrometer in D&sub2;O aufgezeichnet. 10.000 Scans wurden mit einer Verzögerung von 20 Sek. zwischen jedem Scan (90º Puls) aufgezeichnet. Die chemischen Verschiebungen wurden indirekt auf TMS = 0,00 ppm (δTMS) bezogen. Die Vergrößerung von Fig.6 zeigt eine Überlagerung von 2 Signalen bei 43,6 ppm. Die Daten relativ zur Multiplizität der Signale wurden durch DEPT- Experimente bei 45º, 90º und 135º erhalten.
δ(ppm): 180,9 (s); 174,7 (s); 165,8 (s); 158,3 (s); 137,8 (d); 107,8 (s); 105,3 (s) sehr schwach; 73,1 (d); 70,0 (s); 66,8 (t); 62,0 (t); 51,1 (d); 47,3 (t); 43,6 (d); 43,6 (t); 42,0 (d); 18,5 (q).
i) Retentionszeit (Rt) von etwa 4,7 Min., bei Analyse in einer Reversphasen HPLC- Säule unter den folgenden Bedingungen:
Säule = Hibar LiChrospher 100 RP 18, geschützt (5 µm) 250 x 4 mm (Merck, Darmstadt; Deutschland);
Vorsäule = LiChroCART 4-4 , LiChrospher 100 RP 18 geschützt (5 µm) (Merck, Darmstadt; Deutschland);
Elutionsmittel = Methanol : Kaliumphosphat, einbasisch 20 mM in Wasser, mit Phosphorsäure (12,1: 87,9 Vol./Vol.) auf pH 3,5 eingestellt;
Stromungsgeschwindigkeit = 0,7 ml/min
Temperatur = 40ºC
UV-Detektor 276 nm
1) positive kolorimetrische Reaktion mit Ninhydrin in Aceton 0,2 % (Gew./Vol.); mit Pinacryptol in Wasser (0,7 % Gew./Vol.) gelb; negative kolorimetrische Reaktion mit Diazotierungsreagenz und Kuppeln mit α-Naphthol.
m) Rf = 0,35 Cellulose F Chromatographieplatte (Merck AG, Darmstadt, Deutschland) mit Acetonitril/Wasser 91 : 9 (Vol./Vol.) als Elutionsmittel.

Morphologie und Kultureigenschaften von Streptomyces sp. NCIMB 40428

Der Mikroorganismus wurde aus einer Erdprobe aus San Martino in Colle (Perugia) isoliert und mit der internen Kodierung SD 749 katalogisiert.
Eine Kultur dieses Mikroorganismusses wurde am 27. Juni 1991 gemäß dem Budapester Vertrag bei der National Collection of Industrial and Marine Bacteria Ltd., 23 St. Machar Drive, Aberdeen AB2 1RY, Schottland, UK, hinterlegt, bei der ihm die Hinterlegungsnummer NCIMB 40428 zugeteilt wurde. Die morphologischen Eigenschaften sind in Tabelle A gezeigt (die Kulturnamen sind jene, die bei dem internationalen Streptomyces-Programm verwendet werden). Tabelle A
Tabelle B zeigt einige Eigenschaften dieses Stamms Tabelle B
Tabelle C zeigt das Wachstum des Stamms auf einigen organischen Substanzen als einzige Kohlenstoffquelle Tabelle C
Tabelle D zeigt die Sensitivität des Stamms gegenüber bestimmten Antibiotika. Tabelle D
(1) Internationale Einheiten
+ zeigt positives Wachstum
- zeigt kein Wachstum
Wie andere Mikroorganismen unterliegt auch Streptomyces sp. NCIMB 40428 Variationen.
Beispielsweise können durch Behandlung mit verschiedenen bekannten Mutagenen, wie Röntgenstrahlen oder Ultraviolettstrahlen (UV), Hochfrequenzwellen und chemischen Substanzen, wie salpetriger Säure, halogenierten Alkylaminen, Nitrosoguanidin, Campher und dergleichen künstliche Varianten oder Mutanten erhalten werden.
Alle diese natürlichen oder künstlichen Varianten oder Mutanten, die die Streptomyces- Spezies betreffen, die das Antibiotikum AB-041 synthetisieren, werden als zu dem Streptomyces sp. NCIMB 40428 Stamm äquivalent angesehen und befinden sich im Bereich der vorliegenden Erfindung.

Herstellungsverfahren für das Antibiotikum AB-041

Das Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums AB-041 besteht aus Züchten von Streptomyces sp. NCIMB 40428 oder eines dazu äquivalenten Mutanten unter kontrollierten aeroben Fermentationsbedingungen in einem wäßrigen Medium und Abtrennen des Antibiotikums durch bekannte Mittel. Kulturnährstoffe oder Fermentationsnährlösungen, die gewöhnlich zur Herstellung von Antibiotika verwendet werden, können eingesetzt werden, wobei jedoch bestimmte Kulturmedien bevorzugt sind.
Die Kulturmedien müssen Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthalten, die von dem Mikroorganismus der Gattung Streptomyces assimiliert werden können und müssen weiter geringe Mengen an anorganischen Salzen enthalten.
Sie müssen zudem Spuren von solchen Metallen enthalten, die für das Wachstum und die Entwicklung von Mikroorganismen erforderlich sind, die bereits in den für das Bakterienwachstum verwendeten Kohlenstoff- oder Stickstoffquellen als Verunreinigungen enthalten sein können, oder nach Wunsch zu dem Kulturmedium zugesetzt werden können.
Im allgemeinen kann die verwendete Kohlenstoffquelle aus Kohlenhydraten bestehen, insbesondere aus Sacchariden, wie Glucose oder Fructose oder alternativ oder zusätzlich aus Stärken oder Industrieprodukten, die der Stärke chemisch ähneln, wie lösliche Dextrinstärke oder Polyalkohole, wie Glycerin.
Die Zusammensetzungen können einzeln oder in Kombination verwendet werden. Die Konzentration der Kohlenstoffquelle im Kulturmedium hängt im allgemeinen von dem Typ und der Menge anderer Inhaltsstoffe in dem Medium ab. Konzentrationen zwischen 0,5 und 5 Gew.- % sind jedoch im allgemeinen ausreichend.
Die verwendete Stickstoffquelle kann ein Proteinhydroylsat sein, wie Hefeextrakt, Caseinhydrolysat oder Mehl, wie Sojamehl oder für diesen Zweck vertriebene Industrieprodukte, wie Profilo, Maisquellwasser oder lösliche Destillationsprodukte.
Diese Produkte können einzeln oder in Kombination verwendet werden, wobei die Konzentrationen in dem Kulturmedium zwischen 0,2 und 6 Gew.-% variiert.
Die vorhandenen Spurenmetalle können beispielsweise Cobalt, Mangan, Eisen und dergleichen sein.
Die anorganischen Salze, die verwendet werden können, umfassen beispielsweise Natrium-, Kalium-, Magnesium-, Ammonium- und Calciumsalze als Phosphate, Sulphate, Chloride, Carbonate oder Nitrate.
Bei bestimmte Kulturmedien wurde gezeigt, daß sie die Produktion des Antibiotikums AB-041 durch Streptomyces sp. NCIMB 40428 stimulieren können, wie die folgenden wäßrigen Formulierungen, die in den nachfolgenden Hestellungsbeispielen verwendet werden.
Der Stamm Streptomyces sp. NCIMB 40428 kann bei Temperaturen zwischen 20º und 35ºC, vorzugsweise zwischen 25º und 30ºC gezüchtet werden.
Die pH-Bedingungen können von etwa 5 bis etwa 9 variieren.
Die sterile, in das Kulturmedium eingeblasene Luft wird im allgemeinen in einer Menge verwendet, so daß eine Sauerstoffkonzentration von 20% des Sättigungswertes oder mehr in dein Medium beibehalten wird, mit der Ausnahme von etwa 24 Stunden nach dem Animpfen, in denen die Sauerstoffkonzentration auf niedrigere Werte fallen kann.
Die Antibiotika-Produktion während der Fermentierung kann anhand biologischer Aktivitätstests an Nährstofflösungsproben verfolgt werden.
Die Fermentation wird solange durchgeführt, bis im wesentlichen eine biologische Aktivität erhalten wird. Eine Zeitspanne von 72-120 Stunden ist im allgemeinen ausreichend.

Abtrennung und Reinigung des Antibiotikums

Nach Züchten bei den wie vorstehend beschriebenen Fermentationsbedingungen kann das Antibiotikum AB-041 von der Kulturnährlösung abgetrennt und dann durch herkömmliche Trennmethoden gereinigt werden.
Diese Methoden beinhalten beispielsweise Ausfällen mit nicht-Lösungsmitteln, Ultrafiltration, reverse Osmose, Silikagelchromatographie, Cellulosechromatographie, Reversphasenchromatographie, Ionenaustauschharzchromatographie, Chromatographie an nicht-ionischen, makroporösen Harzen und dergleichen, Größenausschlußchromatographie (SEC) und Gelpermeationschomatographie (GPC).
Das während der Herstellung synthetisierte Antibiotikum wird hauptsächlich in der Fermentationsnährlösung gefunden.
Ein bevorzugtes Verfahren zur Gewinnung des Antibiotikums AB-041 ist die Abtrennung der Mycelmasse von der Kulturnährlösung durch Zentrifugation. Die so erhaltene Nährlösung wird durch einen 1 µm Filter filtriert und durch eine Spiralmembran mit einem nominalen Ausschluß von 20 KD ultrafiltriert. Das Permeat wird durch reverse Osmose mit einem nominalen Ausschluß von 500 KD durch eine Spiralmembran ultrafiltriert.
Das durch die reverse Osmose Zurückgehaltene wird über nicht-ionischem Harz behandelt, das bestimmte lipophile Verunreinigungen, nicht jedoch das Antibiotikum AB-041, zurückhält, und dann in eine Säule überführt, die ein Ionenaustauscherharz (wie AMBERLITE IRA 401, das zuvor in die Chloridform umgewandelt wurde) enthält, das dann mit Wasser gewaschen wird. Das Produkt wird anschließend mit wäßriger HCl-Lösung eluiert.
Die Fraktionen, die das Antibiotikum AB-041 enthalten, werden vereinigt mit 32 % iger, wäßriger Ammoniaklösung neutralisiert und bei vermindertem Druck konzentriert.
Die auf diese Art und Weise erhaltene Lösung wird auf Silikagel in C18-Reversphase aufgebracht und mit Wasser eluiert.
Die Fraktionen, die das Antibiotikum AB-041 enthalten, werden vereinigt, bei vermindertem Druck konzentriert und durch eine Größenausschluß-Chromatographiesäule, die als stationäre Phase beispielsweise FRAKTOGEL TSK HW40(F) enthält, durchgeleitet, und mit Wasser eluiert. Die Fraktionen, die das Antibiotikum AB-041 enthalten, werden vereinigt und bei vermindertem Druck konzentriert, was das reine Antibiotikum AB-041 ergibt.

Biologische Aktivität

Die herbizide Aktivität vor und nach einem Befall wurde anhand der in den Beispielen erläuterten Verfahren bestimmt.
Die Verbindung AB-041 weist bei einer Vielzahl von ein- und zweikeimblättrigen Unkräutern unterschiedlicher botanischer Gruppen nach Befall eine starke herbizide Aktivität auf (siehe Tabelle E).
Die herbizide Aktivität vor Befall ist jedoch auf bestimmte zweikeimblättrige Spezien beschränkt (siehe Tabelle E, S.15).
Die Verbindung AB-041 ist zudem gegenüber bestimmten Nutzpflanzen-Spezien, wie Weizen, Gerste, Mais und Baumwolle selektiv (siehe Tabelle F, Seite 16), wobei sie bei den gegenüber Unkräutern aktiven Dosen nur gering phytotoxisch wirkt.
Die erläuterten Eigenschaften zeigen, daß das erfindungsgemäße Antibiotikum phytotoxische Aktivität von landwirtschaftlichem Interesse zeigt und daher zweckmäßig als Herbizid eingesetzt werden kann.

Verwendung und Formulierung

In der Praxis wird die erfindungsgemäße Verbindung in der Landwirtschaft sowie in anderen Anwendungsbereichen in Form geeigneter Zusammensetzungen äußerst zweckmäßig eingesetzt.
Zusätzlich zu dem Wirkstoff enthalten diese Zusammensetzungen feste oder flüssige inerte Träger (organische Lösungsmittel, Gemüse- oder Mineralöle, Wasser und Gemische davon) und gegebenenfalls andere, in Formulierungen gewöhnlich verwendete Additive, wie oberflächenaktive Mittel, Diespergiermittel und Benetzungsmittel.
Das Produkt kann beispielsweise bezüglich seiner positiven Eigenschaften der Löslichkeit und Stabilität in Wasser als wasserlösliches Pulver oder als wäßrige Lösung formuliert werden, um die von der Verwendung organischer Lösungsmittel herrührende Beeinflussung der Umwelt auf ein Minimum zu beschränken.
Die Anwendungsverfahren werden im Hinblick auf die zu erreichenden Ziele und dem zu verwendenden Formulierungstyp ausgewählt.
Für bestimmte Anwendungen oder um den Bereich der Wirkung der Zusammensetzungen zu erweitern, können den vorstehend aufgeführten Zusammensetzungen andere aktive Inhaltsstoffe zugesetzt werden, wie andere Herbizide, Insektizide, Fungizide oder Düngemittel.
Die verwendeten Dosen varriieren in Abhängigkeit von bestimmten Faktoren, wie dem Typ und dem Ausmaß des Befalls, dem Typ der verwendeten Zusammensetzung und in Abhängigkeit von klimatischen und Umwelteinflüssen.
Für die praktische Verwendung in der Landwirtschaft ergeben Antibiotika-Dosen von zwischen 0,1 bis 2 kg/Ha befriedigende Ergebnisse.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung ohne sie zu begrenzen.

Beispiel 1

Untersuchung der herbiziden Aktivität nach Befall

Samen von zehn unterschiedlichen Unkräutern, die zu unterschiedlichen botanischen Gruppen gehören, wurden in Kunststoffgefäßen mit einem Durchmesser von 11 cm mit landwirtschaftlicher Erde ausgesät und für 7-15 Tage in einem Treibhaus bei geeigneten Bedingungen, je nach der Spezies, gezüchtet, bis sich, im Fall der zweikeimblättrigen Spezies, die Cotyledonblätter zeigten und bis sich, im Fall der einkeimblättrigen Spezies, das erste Blatt erstreckte und das zweite sichtbar war. Eine 1,0 g/l wäßrige Lösung von AB-041 (entspricht einer Dosis von 1,0 Kg/Ha) wird den untersuchten Pflanzen mit einer DeVilbiss-Sprühvorrichtung verabreicht. Die herbizide Auswirkung wird wöchentlich aufgezeichnet. Tabelle E zeigt die Aktivitätsergebnisse nach 4 Wochen , die als prozentuale Wachstumsinhibierung angegeben sind. Alle Pflanzen der untersuchten Varietäten zeigen Inhibierungsgrade von zwischen 60% und 100% (0% = gesunde Pflanze; 100% vollständig inhibierte Pflanze).

Beispiel 2

Samen von 10 Varietäten von Unkräutern, die zu unterschiedlichen botanischen Gruppen gehören, wurden in Kunstoffbehältern mit einem Durchmesser von 11 cm, die landwirtschaftliche Erde enthalten, ausgesät.
Eine 1g/l wäßrige AB-041 Lösung (entspricht einer Dosis von 1 kg/Ha) wird mittels einer DeVilbiss-Sprühvorrichtung auf die Oberfläche der in den Behältern enthaltenen Erde aufgebracht. Die herbizide Auswirkung wird wöchentlich aufgezeichnet.
Tabelle E zeigt die als prozentuale Wachstumsinhibierung angegebenen Aktivitätsergebnisse nach 4 Wochen (0% = gesunde Pflanze; 100% = vollständig inhibierte Pflanze). Tabelle E

Beispiel 3

Untersuchung der herbiziden Wirkung gegenüber Nutzpflanzen nach dem Hervortreten

Die Untersuchung wird bei 6 ein- und zweikeimblättrigen Nutzpflanzen wie in dem Abschnitt "Herbizide Aktivität nach Hervortreten" durchgeführt.
Die Tabelle F zeigt die als prozentuale Wachstumsinhibierung angegebenen Aktivitätsergebnisse nach 4 Wochen Tabelle E
Die Arten, die kein Anzeichen von Phytotoxizität zeigten, sind Baumwolle (Gossypium hirsutum) und Gerste (Hordeum vulgare). Weizen (Triticum aestivum), Mais (Zea Mays) und Soja (Glycine maxima) zeigen nur geringe Anzeichen von Phytotoxizität von zwischen 5 % und 15 %. Rübe (Beta vulgaris) und Erbse (Pisum sativum) sind die empfindlichsten Arten, die eine Wachstumsinhibierung von 55% bzw. 70% zeigen.

Beisipiel 4

Fermentation des Streptomyces sp. NCIMB 40428 Stamms.

Eine Gefäß mit 2 ml Streptomyces sp. NCIMB 40428 Mycel (aufbewahrt in 10 % Glycerin bei -20ºC) wird zum Animpfen von 150 ml des vorstehend aufgeführten Kulturmediums V verwendet, das dann in einem Rotationsschüttler (150 Upm) bei 28ºC für 72 Stunden inkubiert wird.
Die erhaltene Kultur wird dazu verwendet, einen Fermenter (Nominalvolumen 10 L), der 7 L Kulturmedium P und 1 g/L Nixolen als Entschäumungsmittel enthält, bei den folgenden Bedingungen anzuimpfen:
Temperatur 29ºC, Belüftung 300 L/Std., Rührgeschwindigkeit 320 Upm, Dauer der Fermentation etwa 96 Stunden.

Beispiel 5

Fermentation des Streptomyces sp. NCIMB 40428 Stamms

Ein Gefäß mit dem Streptomyces sp. Stamm NCIMB 40428 in lyophilisierter Form wird aseptisch geöffnet und mit sterilem, destilliertem Wasser rehydratisiert. Die Suspension wird zum Animpfen eines 500 ml Behälters verwendet, der 100 ml des zuvor beschriebenen Kulturmediums P enthält, das dann für 90 Stunden bei 28ºC in einem Rotationsschüttler (200 Upm) inkubiert wird. Am Ende dieser Zeitspanne wird die Kulturlösung zentrifugiert, um sie von dem Mycel abzutrennen und für biologische Untersuchungen zu verwenden.

Beispiel 6

Fermentation des Streptomyces sp. Stamms NCIMB 40428

Eine Reinkultur des im Kulturmedium S gezüchteten Streptomyces sp. NCIMB 40428 wird zum Animpfen von 3 Flaschen mit jeweils 20 ml Kulturmedium C verwendet, die dann bei 28ºC in einem Rotationsschüttler (280β Upm) für 72 Stunden inkubiert werden.
Die Kulturen werden zum Animpfen von 2,0 L Flaschen mit jeweils 500 ml Kulturmedium V1 verwendet, die dann erneut bei den vorstehend aufgeführten Bedingungen für 72 Stunden inkubiert werden.
Am Ende dieser Zeitspanne wird die Kultur dazu verwendet, 3 Fermenter (Nominalvolumen 40 L) mit 25 1 Kulturmedium P und 1,0 g/l Nixolen als Entschäumungsmittel bei den folgenden Bedingungen anzuimpfen:
Temperatur 29ºC, Belüftung 300 L/Stunde, Dauer der Fermentation 74 Stunden

Beispiel 7

Isolierung des Antibiotikums AB-041

90 Liter der auf die vorstehend aufgeführte Art und Weise erhaltenen Fermentationslösung werden zentrifugiert und die geklärte Kulturlösung wird durch einen 1 µm Filter filtriert.
Das Filtrat wird in einer Ultrafiltrations-/Reversosmose-Einheit (Hydro Air Research S.R.L., Zerbo di Opera, Italien) behandelt, die mit einer G-50 Sprialmembran mit einem nominalen Ausschluß von 20 Kd (Hydro Air Research) ausgestattet war.
Etwa 80 l werden durchtreten gelassen, worauf der zurückgehaltenen Lösung 10 L Wasser zugesetzt werden, und weitere 10 l werden durchtreten gelassen, die den vorstehend erhaltenen 80 l zugesetzt werden.
Der durch die Ultrazentrifugation erhaltene Rückstand wird verworfen.
Die 90 l des Ultrafiltrationspermeats werden in einer Reversosmose-Einheit (Hydro Air Research) behandelt, die mit einer DS-5 Reversosmose-Spiralmembran mit einem nominalen Ausschluß von 500 D (Hydro Air Research) ausgestattet war.
82 l werden durchtreten gelassen und das Konzentrat wird gesammelt, das Modul wird mit 2,5 l Wasser gewaschen und das Waschwasser wird dem Konzentrat aus der reversen Osmose zugesetzt, wobei 9,5 L einer Lösung erhalten werden, die das Antibiotikum AB-041 enthält.
Diese wird auf eine Säule aufgetragen (Innendurchmesser 90 mm x 300 mm Höhe), die 2,4 kg XAD-4 (Rohm & Haas Co., Philadelphia, Pennsylvania) enthält, wobei 8,0 L Eluat erhalten werden.
Das Harz wird mit 4,0 L Wasser gewaschen, wobei die ersten 1,5 L gesammelt werden und zu den vorstehenden 8 L Eluat zugesetzt werden.
Diese Lösung mit einem pH von etwa 7,1, die das Antibiotikum AB-041 enthält, wird in einer Menge von 20 ml/min auf eine Säule (Innendurchmesser 90 mm x 300 mm Höhe), die 1,5 kg Amberlite IRA 401, 20-50 Mesh in chlorierter Form enthält (Fluka Chemie AG, Buchs, Schweiz), gegeben und die Säule wird dann mit 6,0 L Wasser gewaschen und mit einer wäßrigen 0,5 N HCl-Lösung eluiert. Das Antibiotikum AB-041 wird mit 7 L nach 4 L Eluent eluiert.
Die saure, das Antibiotikum AB-041 enthaltende Lösung wird mit einer 32 %igen Ammoniaklösung neutralisiert, bei vermindertem Druck auf ein Volumen von etwa 1,0 L konzentriert und auf eine Säule (Innendurchmesser 90 mm x 300 mm Höhe) geladen, die 1,2 kg RSiL C18 HL Siliziumdioxid enthält (0,044-0,063 mm, Porösität 90 Å, Bio-Rad Laboratories S.r.l., Mailand, Italien) und in einer Menge von 35 ml/min mit Wasser eluiert. Das Antibiotikum AB-04 1 wird mit 3,2 L nach 7,5 L Eluent eluiert. Diese Menge wird bei vermindertem Druck in Trockene eingedampft, in 50 ml Wasser aufgenommen, auf eine Säue (Innendurchmesser 70 mm x 500 mm Höhe) aufgetragen, die mit FRAKTOGEL TSK HW 40(F) gefüllt war (Merck AG, Darmstadt, Deutschland) und mit Wasser in einer Menge von 5 ml/min eluiert, wobei 35 ml Fraktionen gesammelt wurden.
Das Antibiotikum AB-041 wird in 350 ml von Fraktion 21 bis Fraktion 30 gesammelt.
Die gesammelten Fraktionen werden bei vermindertem Druck eingedampft, wobei 300 mg des Antibiotikums AB-041 erhalten werden.

Beispiel 8

Formulierung: Herstellung eines wasserlöslichen Pulvers

a) Wirkstoff (AB-041) 70-90%
b) Calciumlignosulfonat 2-5 %
c) anionisches oder nicht-ionisches 5-10% oberflächenaktives Mittel (Natriumbenzolsulfonat, kondensiertes Naphthalin-Formaldehyd, polyethoxylierte Alkylphenole usw., entweder allein oder im Gemisch)
d) Silikon-Entschäumungsmittel 0,5-2% gegebenenfalls zuzüglich inerte lösliche Salze, wie Natriumsulfat, KCl usw.

Beispiel 9

Formulierung: Herstellung einer konzentrierten wäßrigen Lösung

a) Wirkstoff (AB-041) 5-15 %
b) Polyethoxyliertes Nonylphenol 1-5 %
c) Propylenglycol 5-10%
d) Polyethoxyliertes Alkylamin 2-5 %
e) Wasser auf 100 %

Claims

1. AB-04 1-Antibiotikum mit folgenden Eigenschaften:

a) gute Löslichkeit in Wasser, Dimethylsulfoxid und Gemischen derselben, bei jedoch praktischer Unlöslichkeit in Ethylether und Hexan,

b) gemäß Elementenanlyse Gehalt an Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel,

c) ein Molekulargewicht von 463 g/mol,

d) ein UV-Absorptionsspektrum mit einem Absorptionsmaximum bei 278 nm,

e) empirische Formel: C&sub1;&sub6;H&sub2;&sub5;N&sub5;O&sub9;S,

f) Infrarot-Absorptionsmaxima bei: 3395, 1663, 1594, 1449, 1403, 1338, 1307, 1285, 1246, 1225, 1159, 1102, 1074, 1037, 1017, 960, 942, 917, 888 und 741 cm&supmin;¹

g) ¹H-NMR-Spektrum mit folgenden Hauptpeaks im Vergleich zu TMS (ppm): 8.26 (s. 1H); 4.55 (t. 1H); 4.43 (d. 1H); 4.26 (d. 1H); 4.04 (m. 1H); 3.67 (m. 3H); 3.36 (t. 1H); 3.26 (t. 1H); 3.09 (m. 1H); 2.71 (dd. 1H); 2.19 (d. 1H); 1.26 (d. 3H);

h) ¹³C-NMR-Spektrum mit folgenden Hauptpeaks im Vergleich zu TMS (ppm): 180.9 (s); 174.7 (s); 165.8 (s); 158.3 (s); 137.8 (d); 107.8 (s); 105.3 (s) very weak; 73.1 (d); 70.0 (s); 66.8 (t); 62.0 (t); 51.1 (d); 47.3 (t); 43.6 (d); 43.6 (t); 42.0 (d); 18.5 (q);

i) eine Retentionszeit von etwa 4,7 Minuten auf der Säule einer Umkehrphasen-HPLC unter folgenden Bedingungen:

- Säule: Hibar LiChrosper 100 RP 18 (5 µm) geschützt, 250 x 4 mm (Merck, Darmstadt, Deutschland)

- Vorsäule: LiChroCART 4-4 , LiChrosper 100 RP 18 (5 µm) geschützt, 250 x 4 mm (Merck, Darmstadt, Deutschland)

- Elutionsmittel: Methanol : 20 mM monobasischem Kaliumphosphat in Wasser, eingestellt auf pH 3,5 mit Phosphorsäure (12,1: 87,9 Vol:Vol)

- Durchflußgeschwindigkeit: 0,7 ml/min

- Temperatur: 40 ºC

- UV-Detektion 276 nm

l) positive colorimetrische Reaktion mit Ninhydrin in Aceton (0,2 % Gew./Vol.) sowie mit Pinacryptol-Gelb in Wasser (0,07 % Gew./Vol.), negative colorimetrische Reaktion mit einem Diazotierungsmittel und Kupplung mit α-Naphthol und

m) ein Retentionsfaktor von 0,35 auf einer Cellulose F-Chromatographieplatte (Merck AG, Darmstadt, Deutschland) mit Acetonitril / Wasser 91 : 9 (Vol./Vol.) als Elutionsmittel.

2. Verfahren zur Herstellung eines AB-041-Antibiotikums gemäß Anspruch 1, umfassend die Kultivierung von Streptomyces sp. NCIMB 40428 oder einer Mutante davon und anschließend Gewinnung des Antibiotikums aus der Kulturbrühe.

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, bei dem die Kultivierung bei einer Temperatur zwischen 20 und 35 ºC erfolgt.

4. Verfahren gemäß Anspruch 3, bei dem die Kultivierung bei einer Temperatur zwischen 20 und 30 ºC erfolgt.

5. Verfahren gemäß Anspruch 2, bei dem die Kultivierung bei pH 5 bis 9 erfolgt.

6. Verfahren gemäß Anspruch 2, bei dem das Antibiotikum mittels Filtration, gefolgt von Chromatographie, aus der Kulturbrühe isoliert wird.

7. Verfahren gemäß Anspruch 6, bei dem das AB-041-Antibiotikum aufgereinigt wird mittels

- Ultrafiltration der Kulturbrühe durch eine Spiralmembran,

- Aufkonzentrieren des Permeats durch Umkehrosmose über eine Spiralmembran,

- aufeinanderfolgende Chromatographien auf einer ein nichtionisches Harz bzw. ein Ionenaustauscherharz enthaltenden Säule und

- Größenausschlußchromatographie isoliert wird.

8. Mikroorganismus Streptomyces sp. NCIMB 40428

9. Verwendung des in Anspruch 1 definierten AB-041-Antibiotikums als Herbizid.

10. Herbizidzusammensetzung, die als aktiven Bestandteil das Antibiotikum gemäß Anspruch 1 sowie einen festen oder flüssigen Träger enthält.

11. Verfahren zur Wachstumsverzögerung von Unkrautgräsern, bei dem man auf eine wachsende Nutzpflanze oder deren Replikationsformen eine Menge des Antibiotikums gemäß Anspruch 1 aufbringt, das zur Hemmung des Wachstums der Unkrautgräser, ohne die Nutzpflanze zu beschädigen, befähigt ist.