CZ282323B6

CZ282323B6 - Antibiotikum AB-041, způsob jeho přípravy a herbi cidníprostředek, který ho obsahuje

Info

Publication number: CZ282323B6
Application number: CS923578A
Authority: CZ
Inventors: Nunzio Andriollo; Alessandro Scacchi; Giorgio Ettore Borgonovi; Giorgio Cassani; Silvia Spera; Giorgio Pirali; Giovanni Confalonieri; Gianfranco Guglielmetti
Original assignee: Ministero Dell` Universita` E Della Ricerca Scientifica E Tecnologica
Priority date: 1991-12-04
Filing date: 1992-12-04
Publication date: 1997-06-11
Also published as: EP0545490A2; CA2084477A1; EP0545490B1; DE69214258D1; GR3021520T3; HUT65566A; DK0545490T3; JPH05294982A; EP0545490A3; ITMI913254A1; CZ357892A3; HU9203826D0; HU215553B; IT1259423B; AR247591A1; NZ245333A; ZA929354B; SK357892A3; SK279441B6; DE69214258T2

Abstract

Antibiotikum AB-041, získatelné řízenou aerobní kultivací Streptomyces sp. NCIMB 40428 ve vodném kultivačním prostředí vykazuje biologickou účinnost především herbicidní působení na plevelné rostliny.ŕ

Description

(57) Anotace:

Antibiotikum má ultrafialovou absorpci maximálně při 278 nm, infračervená absorpční maxima v rozmezí 3395 až 741 cm'¹. Je rozpustné ve vodě a dlmethylsulfoxídu, nerozpustné v eťhyletheru a hexanu, obsahuje uhlík, vodík, dusík, kyslík a síru, má molekulovou hmotnost 463, ^1HNMR spektrum v rozsahu 8,26 až 1.26, ¹³C NMR spektrum v rozsahu 181,3 až 18,5, retenční dobu 4,5 minut, pozitivní kolorimetrickou reakci s ninhydrinem a Rf = 0,35. Připravuje se kultivací Streptomyces sp. NCIMB 40428 nebo Jeho mutantu při teplotě 20 až 35 °C a pH 5 až 9. Herbicidní prostředek obsahuje Jako účinnou látku antibiotikum AB-041 ve spojení s nosičem.

Antibiotikum AB-041, způsob jeho přípravy, mikroorganismus Streptomyces sp. NCIMB 40428 a herbicidní prostředek, obsahující antibiotikum

Oblast techniky

Vynález se týká antibiotika AB-041, způsobu jeho přípravy, mikroorganismu Streptomyces sp. NCIMB 40428 a herbicidního prostředku, obsahujícího uvedené antibiotikum.

Vysoká herbicidní účinnost látek podle vynálezu je určuje pro zemědělské použití k ochraně kulturních rostlin před napadáním plevelnými rostlinami. Látky podle vynálezu jsou účinné proti nejrůznějším plevelům, přičemž nevykazují toxické působení na kulturní rostliny.

Dosavadní stav techniky

Škodlivost plevelných rostlin při pěstování kulturních rostlin je všeobecně známa. Známy jsou také skupiny nejrůznějších používaných herbicidních prostředků. Stále se však hledají nové cesty boje proti zaplevelení, přičemž se zvláště dbá toho, aby takové prostředky, které jsou na jedné straně užitečné, neměly vedlejší nepříznivé účinky. Výsledkem těchto výzkumů je řešení vynálezu.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu jsou antibiotika AB-041, připravitelná řízenou aerobní kultivaci Streptomyces sp. NCIMB 40428 nebo mutantního ekvivalentu ve vodném kultivačním prostředí, obsahujícím zdroj uhlíku, dusíku a anorganických solí a izolací antibiotika, které má následující charakteristiky:

- ultrafialovou absorpci maximálně při 278 nm,

- infračervená absorpční maxima (cm'¹): 3395, 1663, 1594, 1449, 1403, 1338, 1307, 1285, 1246. 1225, 1159, 1102, 1074, 1037, 1017, 960, 942,917, 888, 741.

Vynález se tedy týká směsi, známé jakožto antibiotikum AB-041, připravitelné fermentací Streptomyces sp. NCIMB, obsahující všechny složky s herbicidní účinnosti.

Připomíná se, že vynález není omezen na použití Streptomyces sp. NCIMB 40428, nýbrž může také zahrnovat použití přirozených a umělých mutant nebo variant uvedeného mikroorganismu, za předpokladu, že produkuje antibiotikum AB-041. Toto antibiotikum podle vynálezu je charakterizováno za pomoci přiložených výkresů:

na obr. 1 je ultrafialové absorpční spektrum, zaznamenané ve vodě při hodnotě pH 4,5, na obr. 2 je infračervené absorpční spektrum v případě KBr pastilky, na obr. 3 je ^1HNMR spektrum, zaznamenané v deuterované vodě, na obr. 4 je ^1HNMR spektrum, zaznamenané v hexadeuterodimethylsulfoxidu, na obr. 5 je ¹³C NMR spektrum, zaznamenané v deuterované vodě, na obr. 6 je překrytí dvou signálů při 43,6 ppm.

Antibiotikum podle vynálezu má následující vlastnosti:

- 1 CZ 282323 B6

Fyzikální a chemické vlastnosti antibiotika AB-041:

Antibiotikum AB-041 má formu bílého nebo bílookrového prášku, který má tyto charakteristiky:

a) Dobrou rozpustnost ve vodě, v dimethylsulfoxidu a ve směsi dimethylsulfoxidu a vody, je však prakticky nerozpustný v ethyletheru a v hexanu.

b) Obsahuje uhlík, vodík, dusík, kyslík a síru.

c) Molekulová hmotnost je 463,1373, stanoveno FAB-HRMS spektrem, které vykazuje píky při m/z 464,1452 ± 0,0006 (MH)⁺ a m/z 486, 1270 ± 0,0007 (MNa)⁺ za následujících pracovních podmínek: HRFAB-MS, Xe při 9,5 kV, glycerolová matrice.

Hodnota (MH)’ při m/z 464 je potvrzena spektrem, získaným hmotovou spektrometrií ve vysoce výkonné kapalinové chromatografii/termosprej (HPLC/TSMS) s mobilní fází, sestávající z 0,05M roztoku octanu amonného a methanolu (50/50).

e) Empirický vzorec: C16H25N5O9S, ultrafialové (UV) absorpční spektrum, zaznamenané ve vodě při hodnotě pH 4,5, je na obr. 1. Vykazuje absorpční maximum při 278 nm.

f) Infračervené (IR) absorpční spektrum v případě KBr pastilek je na obr. 2 a vykazuje následující maxima: 3395, 1663, 1594, 1449, 1403, 1338, 1307, 1285, 1246, 1225, 1159, 1102, 1074, 1037, 1117. 960, 942,917,888, 741. cm’¹.

g) ^1HNMR spektrum je na obr. 3.

Spektrum, zaznamenané v D₂O na Brukerově AM 300 NMR spektrometru. Bylo provedeno 3000 sejmutí s intervaly 2 sekund mezi každým sejmutím.

Chemické posuny jsou v nepřímém vztahu k TMS = 0,00 ppm, (δ TMS) za interního předpokladu píku v deuterované vodě při 4,80 ppm. Tři překrývající se signály při 3,67 ppm se rozliší porovnáním spektra v D₂O s analogickým spektrem, zaznamenaným v hexadeuterodimethylsulfoxidu (DMSO-d6), ve kterém se odpovídající signály jeví jako oddělené při 3,48, 3,43 a 3,28 ppm (obr. 4) a dvourozměrnými NMR zkouškami.

δ (ppm): 8,26 (s, IH), 4,55 (t, IH), 4,43 (d, IH), 4,26 (d, IH), 4,04 (m, IH), 3,67 (m, 3H), 3,36 (t, IH), 3,26 (t, IH), 3,9 (m, IH), 2,71 (dd, IH), 2,19 (d, IH), 1,26 (d, 3H).

h) ¹³C NMR spektrum podle obr. 5 je zaznamenané v D₂O na Brukerově AM 300 spektrometru. Bylo provedeno 10000 sejmutí s intervaly 2 sekund mezi každým sejmutím (90 ⁰pulzy). Chemické posuny jsou v nepřímém vztahu k TMS = 0,00 ppm, (δ TMS). Zvětšení na obr. 6 ukazují překrytí dvou signálů při 43,6 ppm. Hodnoty, vztahující se na multiplicitu signálů, se získají DEPT pokusy při 45 °, 90 ⁰ a 135 °.

δ (ppm): 180,9 (s), 174,7 (s), 165,8 (s), 158,3 (s), 137,8 (d), 107,8 (s), 73,1 (d), 70,0 (s), 66,8 (t), 62,0 (t), 51,1 (d), 47,3 (t), 43,6 (d), 43,6 (t), 42,0 (d), 18,5 (q).

i) Retenční doba (Rt) přibližně 4,7 minut při analýze na reverzním fázovém HPLC sloupci za následujících podmínek:

sloupec = Hibar LiChrospher 100 RP 18 (5 pm) 250 x 4 mm (Měrek, Darmstadt, Německo),

-2CZ 282323 B6 předsloupec = LiChroCart 4-4, LiChrospher 100 RP 18 (5 pm) (Měrek Darmstadt, Německo), eluční činidlo = methanol monobázický fosforečnan draselný 20 mM ve vodě, nastaveno na hodnotu pH 3,5 kyselinou fosforečnou (12,1 : 87,9 objem/objem), rychlost toku = 0,7 ml/min, teplota = 40 °C,

UV detektor 276 nm.

l) Pozitivní kolorimetrická reakce s ninhydrinem v acetonu 0,2% (hmotnost/objem), s pinacryptolovou žlutí ve vodě (0,07% hmotnost/objem), negativní kolorimetrická reakce s diazotačním činidlem a kopulací s a-naftolem.

m) Rf = 0,35 na celulózové F chromatografické destičce (Měrek AG, Darmstadt, Německo) se systémem acetonitril/voda v poměru 91 : 9 (objem/objem), jakožto elučním činidlem.

Morfologie a kultivační vlastnosti Streptomyces sp. NCIMB 40428

Mikroorganismus se izoluje ze vzorku půdy, odebraného v San Martino v Colle (Perugia) a katalogizuje se pod vnitřním kódem SD749.

Kultura tohoto mikroorganismu je uložena od 27. června 1991 podle Budapešťské úmluvy v organizaci National Collection of Industrial and Marině Bacteria Ltd., 23. St. Machar Drive, Aberdeen AB2 IRY, Skotsko, Spojené království, s přiděleným číslem NCIMB 40428. Morfologické vlastnosti jsou uvedeny v tabulce A (název kultury odpovídá názvu podle Intemational Streptomyces Program).

Tabulka A

Kod ISP	Kultivační prostředí	Popis
Ml	tryptonová kvasničná půda	oddělený růst, vytváření melaninového pigmentu
M2	sladový extrakt	nadměrný růst, nízké kolonie,
	agar	bílé lehké mycelium, mírný melaninový pigment
M3	agar ovesné mouky	nadměrný růst, vysoké kolonie, šedé hygroskopické lehké mycelium
M4	agar škrobový	nadměrný růst, nízké kolonie, bílé lehké mycelium
M5	glycerol	nízký růst, nízké kolonie
	asparaginový agar	lehké mycelium chybí
M6	pepton železo	oddělený růst, nízké kolonie
	agar	šedé lehké mycelium
M7	tyrosinový agar	nízký růst, nízké kolonie, lehké mycelium chybí
-	živný agar	nadměrný růst, nízké kolonie, čiré
-	Emersonův agar	nadměrný růst, vysoké radiální kolonie, nadměrné bílé lehké mycelium
-	V8 rajčatová šťáva	nadměrný růst, nízké kolonie,
	agar	nadměrné šedé lehké mycelium
-	dextrózový brambor	nadměrný růst, nízké kolonie, bílé lehké mycelium, mírný melaninový pigment

u

V tabulce B jsou některé charakteristiky kmene

Tabulka B

Charakteristika

Odezva

odolnost k NaCl (7%)	negativní
odolnost k fenolu (0,1%)	pozitivní
růst při 45 °C	negativní
růst při 4 °C	negativní
lipolýza	pozitivní
DNA-ase	negativní
produkce sirovodíku	negativní
Antibiotické působení na:
B. subtilis NCIMB 3610	negativní
M. luteus NCIMB 196	negativní
C. albicans CBS 562	negativní
S. cerevisiae CBS 1171	slabá
S. murinus ISP 5091	negativní
A. niger LIV 131	negativní

V tabulce C je růst kmene na některých organických látkách jakožto jediném zdroji uhlíku.

Tabulka C

Sloučenina	Růst
N-acetyl-D-glukosamin	+ + +
adonitol	+ + +
L-arabinóza	+ + +
cellobióza	+ + +
galaktóza	+ + +
glycerol	+ + +
glukóza	+ + +
inositol	+
laktóza	+ +
2-keto-D-glukonát	+ + +
maltóza	+ +
melezitóza	+ +
methyl-D-glukosid	+ +
rafmóza	+ +
sacharóza	+ + +
sorbitol	+ + +
threalóza	+ +
xylitol	+ + +
xylóza	+ + +

-4I!

V tabulce D jsou uvedeny citlivosti kmene k určitým antibiotikům.

Tabulka D

5 Antibiotikum	Dávka (mikrogramy)	Citlivost
nalidixová kyselina	30	-
ampicillin	10	+ +
bacitracin	10(0	+ + +
cefaloridin	30	+ + +
chloramfenikol	30	+
chlortetracyklin	30	+ + +
eiythromycin	15	+ +
fopsfomycin	50	+ +
gentamycin	10	+ + +
kanamycin	30	+ + +
lincomycin	2	-
neomycin	30	+ + +
novobiocin	30	+ + +
oleandomycin	15	+
oxytetracyklin	30	+ + +
penicillin	10(1)	+
polymyxin B	300(1)	+ +
rifamycin	30	+ +
rifampicin	30	+ +
streptomycin	10	+ + +
tetracyklin	30	+ + +
tobramycin	10	+ + +
vankomycin	30	+ + +

(1) mezinárodní jednotky + indikace pozitivního růstu,

- indikace skutečnosti, že k růstu nedochází,

Jako v případě jiných mikroorganismů může Streptomyces sp. NCIMB 40428 podléhat změnám. Například se mohou získat umělé varianty nebo mutanty ošetřením různými známými mutageny, jako jsou například rentgenový paprsky nebo ultrafialové paprsky (UV), vysokofrekvenční vlny a chemické látky, jako jsou například kyselina dusitá, halogenované alkylaminy, nitrosoguanidin 15 a kafr.

Všechny takové přírodní nebo umělé varianty nebo mutageny patří do druhu Streptomyces, které produkují antibiotikum AB-041, a považují se za rovnocenné kmeni Streptomyces sp. NCIMB 40428 a spadají do rozsahu vynálezu.

Způsob přípravy antibiotika AB-041

Způsob přípravy antibiotika AB-041 je založen na kultivaci kmene Streptomyces sp. NCIMB 40428 nebo mutantu jemu rovnocenného za řízených aerobních fermentačních podmínek ve 25 vodném živném prostředí a na oddělení antibiotika o sobě známými způsoby. Může se použít kultivačních živin nebo fermentačních půd, běžně používaných pro produkci antibiotik, určitá kultivační prostředí jsou však výhodná.

Taková kultivační prostředí musí obsahovat zdroj uhlíku a dusíku, které se mohou asimilovat mikroorganismy rodu Streptomyces a musí obsahovat nízkou koncentraci anorganických solí. Musí také obsahovat stopy kovů, nutných pro růst a vývoj mikroorganismu, které však mohou být již obsaženy jakožto nečistoty ve zdrojích uhlíku nebo bílkovinového dusíku, dodávaných pro bakteriální růst, nebo se popřípadě mohou do kultivačního prostředí přidávat.

Obecně může používaný zdroj uhlíku sestávat z uhlohydrátů a zvláště ze sacharidů, jako je glukóza nebo fruktóza, nebo alternativně nebo přídavně ze škrobů nebo průmyslově vyráběných chemikálií, podobných škrobům, jako je rozpustný dextrinový škrob nebo jako jsou polyalkoholy, například glycerol. Takovéto látky se mohou používat jednotlivě nebo ve vzájemných směsích. Koncentrace zdroje uhlíku v kultivačním prostředí závisí obecně na typu a množství ostatních složek v živném prostředí, obecně by však měla být dostatečná koncentrace hmotnostně 0,5 až 5 %.

Jakožto zdroje dusíku se obecně může používat bílkovinových hydrolyzátů, jako je kvasnicový extrakt, kaseinový hydrolyzát nebo mouka, například sojová mouka, nebo jako jsou průmyslové produkty, prodávané pro tento účel, například profílo (moučka z bavlníkových semen), kukuřičná půda nebo lihovarské nerozpustné produkty. Těchto sloučenin se může používat v kultivačním prostředí jednotlivě nebo ve vzájemných směsích v koncentraci hmotnostně 0,2 až 6 %.

Obsaženými stopami kovů mohou být například kobalt, mangan a železo.

Může se používat anorganických solí, například sodných, draselných, hořečnatých, amoniových a vápenatých, jako jsou fosforečnany, sírany, chloridy, uhličitany a dusičnany.

Určitá kultivační prostředí vykazují obzvláštní kapacitu ke stimulaci produkce antibiotika AB041 z kmene Streptomyces sp. NCIMB 4042B, jako například následující vodné prostředky, kterých se používá podle následujících příkladů.

Kultivační prostředí P (složky)	Koncentrace (g/i)
profilo glycerol uhličitan vápenatý	10 15 3
Kultivační prostředí V (složky)	Koncentrace (g/i)
masový extrakt kukuřičný extrakt dextróza pepton chlorid sodný	4 1 10 4 2,5
Kultivační prostředí VI (složky)	Koncentrace (g/D
masový extrakt pepton	3 5

-6CZ 282323 B6

Kultivační prostředí S (složky) glukóza masový nebo jatemí pepton masový extrakt chlorid sodný agar

Koncentrace (g/D

12,5

Kmen Streptomyces sp. NCIMB 40428 se může nechávat růst při teplotě 20 až 35 °C a s výhodou při teplotě 25 až 30 °C. Hodnota pH je přibližně 5 až přibližně 9. Do kultivačního prostředí se dmýchá sterilní vzduch obecně v takovém množství, aby se udržovala koncentrace kyslíku 20 % nebo vyšší, vztaženo na hodnotu nasycenosti v prostředí s výjimkou přibližně 24 hodin po naočkování, kdy se koncentrace kyslíku nechává klesnout na nižší hodnotu. Produkce antibiotika v průběhu fermentace se může sledovat podle výsledků biologické účinnosti vzorků půdy. Fermentace se provádí až do dosažení podstatnější biologické činnosti. Obecně je dostatečná doba 72 až 120 hodin.

Oddělení a čištění antibiotika

Po kultivaci za shora uvedených fermentačních podmínek se antibiotikum AB-041 může oddělit z kultivační půdy a pak čistit osobě známými způsoby. Tyto způsoby zahrnují například vysrážení nerozpouštědly, ultrafiltraci, reverzní osmózu, chromatografií na silikagelu, chromatografií na celulóze, reverzní fázovou chromatografií, ionexovou chromatografii, chromatografií na neiontové makroporézní pryskyřici, rozměry vylučující chromatografii (size exclusion chromatography) (SEC) a gelovou permeační chromatografii (GPC). Antibiotikum, produkované při fermentaci, je hlavně ve fermentační půdě.

Výhodným způsobem získání antibiotika AB-041 je oddělení hmoty mycelia od kultivační půdy odstředěním. Takto získaná půda se zfiltruje 1 pm filtrem a ultrafiltruje se spirální membránou s 20 kD nominální exkluzí. Permeát se zkoncentruje spirálovou membránou reverzní osmózou s 500 D nominální exkluzí. Zbytek, zachycený reverzní osmózou, se zpracuje neiontovou pryskyřicí, která zadrží určité lipofilní nečistoty, avšak nezadrží antibiotikum AB-041, a pak se vede do sloupce, obsahujícího ionexovou pryskyřici (například Amberlit IRA 401, předem převedenou na chloridovou formu), pryskyřice se pak promyje vodou a produkt se eluuje vodným roztokem kyseliny chlorovodíkové. Frakce, obsahující antibiotikum AB-041, se spojí, neutralizují se 32% vodným amoniakálním roztokem a zkoncentrují se ve vakuu.

Roztok, získaný tímto způsobem, se vede na oxid křemičitý Cl8 reverzní fázi a eluuje se vodou. Frakce, obsahující antibiotikum AB-041, se spojí, zkoncentrují se ve vakuu a vedou se sloupcem chromatografie SEC, obsahujícím například Fraktogel TSK HW40(F), jakožto stacionární fázi a eluuje se vodou, frakce, obsahující antibiotikum AB-041, se spojí a zkoncentrují se za vakua, čímž se získá čisté antibiotikum AB-041.

Biologická účinnost

Herbicidní účinnost se stanovuje před vzejitím a po vzejití způsobem, popsaným v příkladech praktického provedení.

Sloučenina AB-041 má významné herbicidní působení po vzejití na nejrůznější jednoděložní a dvouděložní plevelné trávy a rostliny různých biologických skupin (tabulka E). Herbicidní působení před vzejitím je však omezeno jen na určité druhy dvouděložních rostlin (tabulka E).

-7U

Sloučenina AB-041 vykazuje také selektivitu - se zřetelem na určité druhy užitečných rostlin, jako je pšenice, ječmen, kukuřice a bavlník (tabulka F), přičemž je nepatrně fytotoxická v dávkách, účinných proti plevelným rostlinám.

Zjištěné výsledky dokládají, že antibiotikum podle vynálezu vykazuje fýtotoxickou účinnost, zajímavou pro zemědělství, a může se proto používat jakožto herbicidní prostředek.

Použití a herbicidní prostředek

Pro praktické použití v zemědělství a v jiných oborech se sloučenina podle vynálezu nejvýhodněji používá ve formě vhodného prostředku. Kromě účinné látky takové prostředky obsahují ještě pevné nebo kapalné inertní nosiče (organická rozpouštědla, rostlinné nebo minerální oleje, vodu nebo směsi uvedených látek) a další přísady, běžně používané v takových prostředcích, jako jsou povrchově aktivní látky, disperganty a smáčedla.

Například se pro své pozitivní vlastnosti se zřetelem na rozpustnost a stálost ve vodě může produkt podle vynálezu formulovat jakožto ve vodě rozpustný prášek nebo vodný roztok k minimalizaci nepříznivého působení na životní prostředí, pocházejícího od použití organických rozpouštědel.

Způsoby aplikace se volí se zřetelem jak na žádaný účinek, tak na typ používaného prostředku. Pro zvláštní účely nebo k rozšíření oboru působení se mohou do prostředku přidávat ještě jiné účinné látky, jako jsou například jiné herbicidy, fungicidy nebo hnojivá.

Používané dávky se liší v závislosti na různých faktorech, jako je typ a stupeň plevelného zamoření, typ použitého prostředku, klimatické poměry a faktory okolí. Pro praktické použití v zemědělství poskytuje dávka antibiotika 0,1 až 2 kg/ha uspokojivé výsledky.

Následující příklady praktického provedení vynález blíže objasňují, nijak jej však neomezují.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Zkouška herbicidního působení po vzejití

Semena deseti druhů plevelných jednoletých rostlin, patřících do různých botanických skupin, se vysejí do nádob z plastů o průměru 11 cm, obsahujících zemědělskou půdu, a nechají se růst za vhodných podmínek ve skleníku po dobu 7 až 15 dní v závislosti na druhu až do rozvinutí děložních lístků v případě dvouděložných rostlin, a do rozvinutí prvního lístku a do zviditelnění druhého lístku v případě jednoděložných rostlin. Zkoušená rostlina se ošetří vodným roztokem AB-041 o koncentraci 1,0 g/1 (což odpovídá dávce 1,0 kg/ha) za použití rozprašovače De Vilbiss. Herbicidní působení se týdně zaznamenává. V tabulce E jsou uvedeny výsledky za 4 týdny, vyjádřené jakožto procento inhibice růstu. Všechny rostliny při zkoušce vykazují inhibici růstu 60 až 100 % (0 % - zdravá rostlina, 100 % - dokonale zničená rostlina).

-8CZ 282323 B6

Příklad 2

Zkouška herbicidního působení před vzejitím

Semena deseti druhů plevelných jednoletých rostlin, patřících do různých botanických skupin, se vysejí do nádob z plastů o průměru 11 cm, obsahujících zemědělskou půdu. Povrch půdy v nádobách se ošetří vodným roztokem AB-041 o koncentraci 100 g/1 (což odpovídá dávce l,0kg/ha) za použití rozprašovače De Vilbiss. Herbicidní působení se týdně zaznamenává. V tabulce E jsou uvedeny výsledky za 4 týdny, vyjádřené jakožto procento inhibice růstu. Všechny rostliny při zkoušce vykazují inhibici růstu 60 až 100 % (0 % - zdravá rostlina, 100 % dokonale zničená rostlina).

Tabulka E

AB-041 1 kg/ha

Procento inhibice růstu

Plevelná rostlina	Po vzejití	Před vzejitím
Convolvolus arvensis (svlačec)	75	70
Convolvolus sepium (svlačec)	100	90
Ipomea leptofílla (povíjnice)	85	35
Geranium dissectum (kakost)	95	0
Stellaria media (ptačinec)	100	100
Abutilon theophrasti (abutilon)	100	10
Solanum nigrům (lilek)	95	20
Veronica sp. (rozrazil)	100	20
Setraria glauca (bér)	60	10
Digitaria sanguinalis (rosička)	75	10

Příklad 3

Zkouška herbicidní účinnosti po vzejití se zřetelem na kulturní rostliny

Zkouška se provádí shora popsaným způsobem pro zkoušku po vzejití v případě šesti kulturních jednoděložných a dvouděložných rostlin. V tabulce F jsou výsledky zkoušek účinnosti po čtyřech týdnech, vyjádřeny v procentech inhibice růstu.

Tabulka F

AB-041 1 kg/ha

Procento inhibice růstu

Kulturní rostlina

Triticum aestivum (pšenice)	5
Herdeum vulgare (ječmen)	0
Zea mays (kukuřice)	15
Glycine maxima (sója)	15
Beta vulgaris (řepa cukrovka)	55
Pisum sativum (hrách)	70
Gossypium hirsutum (bavlník)	0

-9U

Rostliny, u který ch se nejeví žádná fytotoxicita, jsou bavlník (Gossypium hirsutum) a ječmen (Hordeum vulgare). Pšenice (Triticum aestivum), kukuřice (Zea mays) a sója (Glycine maxima) vykazují malé známky fýtotoxicity 5 až 15 %. Nejcitlivějšími druhy rostlin jsou řepa cukrovka (Beta vulgaris) a hrách (Pisum sativum přičemž vykazují inhibici růstu 55 a 70 %.

Příklad 4

Fermentace kmene Streptomyces sp. NCIMB 40428

Zkumavka, obsahující 2 ml mycelia Streptomyces sp. NCIMB 40428 (uchovávaného v 10 % glycerolu při teplotě -20 °C) se po užije k naočkování 150 ml shora uvedeného živného prostředí V, které se pak inkubuje v rotační třepavce (počet otáček 150/min) při teplotě 28 °C po dobu 77 hodin. Získané kultury se používá k naočkování fermentoru (nominální objem 10 litrů), obsahujícího 7 litrů kultivačního prostředí P plus 1,0 g/1 Nixolenu jakožto odpěňovacího činidla za následujících podmínek: teplota 29 °C, provzdušňování 300 1/h, míchání za počtu otáček 320/min, doba fermentace 96 hodin.

Příklad 5

Fermentace kmene Streptomyces sp. NCIMB 40428

Zkumavka, obsahující kmen mycelia Streptomyces sp. NCIMB 40428 v lyofilizované formě se asepticky otevře a hydratuje se sterilní destilovanou vodou. Suspenze se použije k naočkování baňky o obsahu 500 ml, obsahující 100 ml shora uvedeného kultivačního prostředí P, přičemž se pak provádí inkubace po dobu 90 hodin při teplotě 28 °C v rotační třepačce (za počtu otáček 200/min). Na konci této periody se kultivační půda odstředí k oddělení od mycelia a použije se pro biologické zkoušky.

Příklad 6

Fermentace kmene Streptomyces sp. NCIMB 40428

Čistá kultura Streptomyces sp. NCIMB 40428 se nechá růst na kultivačním prostředí S k naočkování tříhrdlých baněk, obsahujících vždy 20 ml kultivačního prostředí V, které se pak inkubuje při teplotě 28 °C v rotační třepačce (počet otáček 250/min) po dobu 72 hodin. Kultury se použije k naočkování baňky o obsahu 2 litry, obsahující vždy 500 ml kultivační půdy VI, která se opět inkubuje za shora uvedených podmínek po dobu 72 hodin. Na konci této periody se kultury použije k naočkování tří fermentorů (o nominálním objemu 40 litrů), obsahujících 25 1 kultivačního prostředí P plus 1,0 g/1 Nixolenu jakožto odpěňovacího prostředku, za následujících podmínek: teplota 29 °C, provzdušňování 300/h, doba fermentace 74 hodin.

Příklad 7

Izolace antibiotika AV-041 litrů fermentační půdy, získané shora uvedeným způsobem, se odstředí a vyčeřená půda se zfiltruje přes filtr 1 pm. Filtrát se zpracuje na jednotce pro ultrafiltraci a reverzní osmózu (Hydro Air research S.R.L., Zerbo di Opera, Itálie), vybavené G-50 spirálovou membránou s 20 kD nominální exkluzí (Hydro Air Research). Permeaci se podrobuje přibližně 80 litrů, načež se přidá

- 10CZ 282323 B6 litrů vody do získané kapaliny a dalších 10 litrů se podrobí permeaci a vnese se do 80 litrů dříve získaného permeátu. Zbylý materiál po ultrafiltraci se vyhodí.

litrů permeátu. získaného ultrafiltraci, se zpracuje na jednotce pro reverzní osmózu (Hydro Air Research), vybavené DS-5 reverzní osmózovou spirálovou membránou s 500D nominální exkluzí (Hydro Air Research).

Permeaci se podrobuje 82 litrů, koncentrát se shromáždí, modul se promyje 2,5 litry vody a promývací voda se přidá ke koncentrátu z reverzní osmózy, čímž se získá 9,5 litrů roztoku, obsahujícího antibiotikum AB-041. Produkt se zavádí na sloupec (vnitřní průměr 90 mm, výška 300 mm), obsahující 2,4 kg XAD-4 (Rohm & Haas Co., Philadelphia, Pennsylvania) ke shromáždění 8,0 litrů eluátu. Pryskyřice se promyje 4,0 litrů vody, shromažďuje se prvních 1,5 litrů, které se přidají do shora získaných 8,0 litrů eluátu. Tento roztok, jehož hodnota pH je přibližně 7,1 a který obsahuje antibiotikum AB-041, se zavádí rychlostí 20 ml/min na sloupec (vnitřní průměr 90 mm, výška 300 mm), obsahující 1,5 kg Amberlitu IRA 401, 20 až 50 mesh (Fluka Chemie AG, Buchs, Švýcarsko) v chloridové formě, načež se sloupec promyje 6,0 litry vody a eluuje se 0,5N vodným roztokem kyseliny chlorovodíkové. Antibiotikum AB-041 se eluuje 7 litry po 4 litrech elučního činidla.

Kyselý roztok, obsahující antibiotikum AB-041, se neutralizuje 32% vodným roztokem amoniaku, zkoncentruje se ve vakuu na objem přibližně 1,0 litrů a zavede se na sloupec (vnitřní průměr 90 mm, výška 500 mm), obsahující 1,2 kg RSiL C18 HL oxidu křemičitého (0,044 až 0,063 mm, porozita 9 nm, Bio-Rad laboratories S.R.L., Milán, Itálie) a eluuje se rychlostí 35 ml/min vodou.

Antibiotikum AB-041 se eluuje 3,2 litry po 7,5 litrech elučního činidla. Toto množství se odpaří suchu za vakua, vyjme se do 50 ml vody, zavede se na sloupec (vnitřní průměr 70 mm a 500 mm výška), vyplněný Fraktogelem TSK HW 40(f) (Měrek AG., Darmstadt, Německo) a eluuje se vodou rychlostí 5 ml/min, přičemž se shromažďují 35 ml frakce. Antibiotikum AB-041 se eluuje 350 ml z frakce 21 do frakce 30. Shromážděné frakce se odpaří ve vakuu, čímž se získá 300 mg antibiotika AB-041.

Příklad 8

Herbicidní prostředek: příprava ve vodě rozpustného prášku

a) účinná látka (AB-041) 70 až 90%

b) lignosulfonát vápenatý 2 až 5 %

c) aniontové nebo neiontové povrchově aktivní činidlo (například 5 až 10% benzensulfonát sodný, kondenzovaný naftalenformaldehyd, polyethoxylované alkylfenoly, vždy buď samotné nebo ve vzájemných směsích)

d) silikonový odpěňovač a popřípadě inertní rozpustné soli, jako je například 0,5 až 2% síran sodný nebo chlorid draselný.

- 11 U

Příklad 9

Herbicidní prostředek: příprava koncentrovaného vodného roztoku

a) účinná látka (AB-041)

b) polyethoxylovaný nonylfenol

c) propylenglykol

d) polyethoxylovaný alkylamin

e) voda do 100 % až 15 % až 5 % až 10% až 5%

Průmyslová využitelnost

Antibiotikum AB-041, získatelné řízenou aerobní kultivací Streptomyces sp. NCIMB 40428 ve vodném kultivačním prostředí, vykazuje biologickou účinnost, především herbicidní působení na plevelné rostliny.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Antibiotikum AB-041, mající

a) ultrafialovou absorpci maximálně při 278 nm,

b) infračervená absorpční maxima, cm'¹, 3395, 1663, 1594, 1449, 1403, 1338, 1307, 1285, 1246, 1225, 1159, 1102, 1074, 1037, 1017, 960, 942,917, 888, 741,

c) rozpustnost ve vodě, dimethylsulfoxidu a v jejich směsi, nerozpustnost v ethyletheru a hexanu,

d) obsah uhlíku, vodíku, dusíku, kyslíku a síry,

e) molekulovou hmotnost 463,

f) ^1HNMR spektrum s hlavními píky, TMS ppm, 8,26, s,lH, 4,55, t,lH, 4,43, d,lH, 4,26, d,lH,

g) ¹³C NMR spektrum s hlavními píky, TMS ppm, 181,3, s, 174,7, s, 165,8, s, 158,3, s, 137,8, d,

107,8, s, 105,3, s, velmi slabé 73,1, d, 70,0, s, 66,8, t, 62,0, t, 51,1, d, 47,3, t, 43,6, d, 43,6, t, 42,0, d, 18,5, q,

h) retenční dobu Rt 4,5 minut při analýze na reverzním fázovém HPLC sloupci za podmínek, že sloupec je Hibar LiChrospher 100 RP 18,5 pm, 250 x 4 mm, Měrek, Darmstadt, Německo, předsloupec je LiChroCart 4-4, LiChrospher 100 RP 18,5 pm, Měrek, Darmstadt, elučním činidlem je methanol: monobázický fosforečnan draselný 20 mM ve vodě, nastaveno na hodnotu pH 3,5 kyselinou fosforečnou, 12,1 : 87,9 objem/objem, rychlost toku 0,7 ml/min, teplota 40 °C, UV detektor 276 nm,

i) pozitivní kolorimetrickou reakci s ninhydrinem v acetonu 0,2% hmotn./objem, s pinakryptolovou žlutí ve vodě 0,07% hmotn./objem, negativní kolorimetrickou reakci s diazotačním činidlem a kopulaci s α-naftolem, a

j) Rf = 0,35 na celulozové F chromatografické destičce, Měrek, Darmstadt, se systémem acetonitril/voda v poměru 91:9 objem/objem jakožto elučním činidlem.

- 12CZ 282323 B6
2. Způsob přípravy antibiotika AB-041 podle nároku 1, vyznačující se tím, že se kultivuje Streptomyces sp. NCIMB 40428 nebo jeho mutant a z kultivační půdy se izoluje antibiotikum.
3. Způsob podle nároku 2, teplotě 20 až 35 °C.
4. Způsob podle nároku 3, teplotě 25 až 30 °C.
5. Způsob podle nároku 2, hodnotě pH 5 až 9.

vyznačující s e t í m vyznačující s e t í m vyznačující s e tím,

, že se kultivace provádí při , že se kultivace provádí pří že se fermentace provádí při
6. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že se antibiotikum izoluje z živné půdy filtrací, následovanou chromatografickými postupy.
7. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že se antibiotikum izoluje čisticími postupy, zahrnujícími ultrafiltraci živné půdy spirálovou membránou, koncentraci permeátu spirálovou membránou reverzní osmózou, postupné chromatografie sloupcem, obsahujícím neiontovou pryskyřici a ionexovou pryskyřici, a rozměry vylučující chromatografií.
8. Mikroorganismus Streptomyces sp. NCIMB 40428, produkující antibiotikum podle nároku 1.
9. Herbicidní prostředek, vyznačující se tím, že jako účinnou látku obsahuje antibiotikum AB-041 podle nároku 1 a tuhé a kapalné nosiče a popřípadě další přísady.