HU215553B

HU215553B - Eljárás AB-041 antibiotikum előállítására, és az azt tartalmazó herbicid készítmények

Info

Publication number: HU215553B
Application number: HU9203826A
Authority: HU
Inventors: Nunzió Andriollo; Giorgio Ettore Borgonovi; Giorgio Cassani; Giovanni Confalonieri; Gianfranco Guglielmetti; Giorgio Pirali; Alessandro Scacchi; Silvia Spera
Original assignee: Ministero Dell 'universita' E Della Ricerca Scientifica E Tecnologica
Priority date: 1991-12-04
Filing date: 1992-12-03
Publication date: 1999-01-28
Also published as: EP0545490A2; CA2084477A1; EP0545490B1; DE69214258D1; GR3021520T3; HUT65566A; DK0545490T3; JPH05294982A; EP0545490A3; ITMI913254A1; CZ357892A3; HU9203826D0; IT1259423B; AR247591A1; NZ245333A; ZA929354B; SK357892A3; CZ282323B6; SK279441B6; DE69214258T2

Abstract

Az AB–041 antibiőtikűmőt NCIMB 40428 Streptőmyces sp. vizestápközegben, aerőb fermentálásával állítják elő. Az AB–041antibiőtikűm biőlógiai aktivitást műtat és elsősőrban herbicid hatásúEzért az űgyancsak a találmány tárgyát képező herbicid készítményekhatóanyagaiként alkalmazhatók, 0,02–95,0 tömeg% mennyiségben. Atalálmány a győmnövények fejlődésének csökkentésére vőnatkőzó eljáásra is kiterjed, a találmány szerinti eljárással előállítőttvegyületek hatásős mennyiségének kijűttatása révén. ŕ

Description

A találmány az AB-041-nek elnevezett antibiotikus hatású anyagok előállítására, valamint az ezeket tartalmazó herbicid készítményekre vonatkozik.

A találmány szerinti eljárás során ezeket az anyagokat NCIMB 40428 Streptomyces mikroorganizmustörzs fermentációjával állítjuk elő, és a termés védelmére, az ezekre az anyagokra érzékeny ffiféle gyomokkal szemben alkalmazzuk őket.

Az említett anyagok által mutatott erős herbicid hatás alkalmassá teszi ezeket mezőgazdasági használatra, haszonnövények fertőző növényekkel szembeni védelmében.

Ez az aktivitás a fertőző növények széles köre ellen megmutatkozik, a haszonnövényekkel szembeni toxikus hatás megnyilvánulása nélkül.

A találmány szerinti megoldás olyan, NCIMB Streptomyces törzs fermentációjával nyert, AB-041 néven ismert antibiotikumelegyet biztosít, amelynek minden komponense herbicid hatású.

Megjegyezzük, hogy találmányunk nem korlátozódik az NCIMB 40428 Streptomyces mikroorganizmustörzs használatára, hanem magában foglalja az említett mikroorganizmus minden olyan természetes vagy mesterséges mutánsának vagy variánsának az alkalmazását, amely az AB-041 antibiotikumot képes termelni.

Az említett antibiotikum a következő tulajdonságokat mutatja:

Az AB—041 antibiotikum fizikai és kémiai tulajdonságai:

A fehér vagy okkerfehér színű, porformájú AB-041 antibiotikumot az alábbiak jellemzik:

a) jó oldhatóság vízben, dimetil-szulfoxidban és dimetil-szulfoxid/víz elegyben, de gyakorlatilag oldhatatlan etil-éterben és hexánban,

b) szén-, hidrogén-, nitrogén-, oxigén- és kénatomból áll,

c) molekulatömege 463,1373, amelyet FAB-HRMS-spektrummal határoztunk meg, az alábbi műveleti körülmények mellett m/z= 464,1452 ±0,0006 (MH)+ és m/z = 486,1270± 0,0007 (MNa)⁺ értékeknél mutatott csúcsot: HRFAB-MS, Xe 9,5 kV-on glicerin mátrix. Az m/z=464-nél található (MH)+ értéket igazoltuk 50:50 arányú ammónium-acetát/metanol 0,05 M-os oldatából álló, mozgó fázisú, nagynyomású folyadékkromatográfia/ gőzfázisú tömegspektrometria (HPLC/TSMS) alkalmazásával kapott spektrummal.

d) kísérleti úton meghatározott összegképlet: C16H25N5O9S

e) a 4,5-es pH-jú vízben felvett ultraibolya (UV) abszorpciós spektrumot a mellékelt rajzokon lévő 1. ábra mutatja. Abszorpciós maximuma 278 nm-nél van.

f) KBr-tablettában felvett infravörös (IR) abszorpciós spektrumot a mellékelt rajzokon található

2. ábra mutatja az alábbi helyeken lévő maximumokkal: 3395; 1663; 1594; 1449; 1403; 1338; 1307; 1285; 1246; 1225; 1159; 1102; 1074; 1037; 1017; 960; 942; 917; 88; 741 cm-'.

g) Az 'H-NMR-spektrumot a mellékelt rajzlapokon lévő 3. ábra mutatja.

A spektrumot Bruker AM 300 NMR-spektrométerrel vettük fel D₂O-ban. 3000 lefutást vettünk fel minden egyes lefutás közötti 2 másodperces késleltetéssel. A kémiai eltolódás közvetlenül TMS-re vonatkoztatva 0,00 ppm (δ TMS) volt, emellett a belső referenciaként felvett deuterált víz csúcsa 4,80 ppm-nél jelentkezett. A 3,67 ppm-nél lévő három egymásra illeszkedő D₂O-ban felvett spektrumot hexadeutero-dimetil-szulfoxidban (DMSO-d₆) felvett analóg spektrummal bontottuk fel, amelyben a megfelelő jelek 3,48, 3,43 és 3,28 ppmnél (4. ábra) jelentek meg, a 3,67 ppm-es jeleket kétdimenziós NMR-kísérletekkel felbontottuk.

δ (ppm): 8,26 (s, 1H); 4,55 (t, 1H); 4,43 (d, 1H); 4,26 (d, 1H); 4,04 (m, 1H); 3,67 (m, 3H); 3,36 (t, 1H); 3,26 (t, 1H); 3,09 (m, 1H); 2,71 (dd, 1H); 2,19 (d, 1H); 1,26 (d, 3H).

h) A Bruker AM 300 spektrométeren D₂O-ban felvett ¹³C-NMR-spektrumot az 5. ábra mutatja. 10000 lefutást vettünk fel minden egyes lefutás közötti 20 másodperces késleltetéssel. A kémiai eltolódás közvetlenül TMS-re vonatkoztatva 0,00 ppm (δ TMS). A 6. ábra nagyítása mutatja, hogy 43,6 ppm-nél két egymásra illeszkedő jel van. A jelek multiplicitására vonatkozó adatokat DEPT-kísérletekkel kaptuk, 45°-on, 90°-on és 135°-on.

δ (ppm): 180,9 (s); 174,7 (s); 165,8 (s); 158,3 (s); 137,8 (d); 107,8 (s); 73,1 (d); 70,0 (s); 66,8 (t); 62,0 (t); 51,1 (d); 47,3 (t); 43,6 (d); 43,6 (t); 42,0 (d); 18,5 (q).

i) A retenciós idő (Rt) 4,7 perc körül van, reverz fázisú HPLC-kolonnán a következő körülmények között meghatározva :

Kolonna : Hibar LiChrospher 100 RP 18 töltött (5 μιη) 250x4 mm (Merck, Darmstadt; Németország),

Prekolonna: LiChroCART 4-4, LiCrospher 100 RP 18 töltött (5 μιη) (Merck, Darmstadt; DE)

Eluens: 12,1:87,9 térfogatarányú metanol és monobázikus kálium-foszfát elegyének 20 mMos vizes oldata foszforsavval 3,5-ös pH-ra beállítva.

Áramlási sebesség: 0,7 ml/perc.

Hőmérséklet: 40 °C UV-detektor 276 nm

l) ninhidrinnel acetonos oldatban (0,2 tömeg/térfogat%) és pinakriptol sárgával vizes oldatban (0,07 tömeg/térfogat%) pozitív a kolorimetriás reakció; diazotáló reagenssel a kolorimetriás reakció és a kapcsolás α-naftollal negatív.

m) R_f=0,35 cellulóz F kromatográfiás tányéron (Merck AG, Darmstadt, DE), eluensként 91:9 térfogatarányú acetonitril-víz elegyet használva.

HU 215 553 Β

Az NCIMB 40428 Streptomyces törzs morfológiája és tenyésztési jellemzői

A mikroorganizmust San Martinóban (Colle, Perugia) vett földmintából izolálták és SD749 belső kóddal lajstromozták.

A mikroorganizmus tenyészetét a Budapesti Szerződés alapján 1991. június 27-én helyezték letétbe Skócia (GB) Nemzeti Gyűjteményében (National Collection of Industrial and Maríné Bacteria Ltd., 23 St. Machar Driove, Aberdeen ABI 1RY, Scotland), ahol az NCIMB 40428 kódszámot kapta. A morfológiai jellemzőket az A táblázat tartalmazza (a tenyészetek neveként a Nemzetközi Streptomyces Program (ISP) által használt neveket adtuk meg).

A táblázat

ISP kód	Tápközeg	Leírás
M,	trypton élesztő húsleves táptalaj	diszkrét növekedés csekély melanin, pigment
m₂	malátakivonat agar	erőteljes növekedés kis kolóniák, fehér légmicéliumok
M₃	zabpehely agar	erőteljes növekedés, nagy kolóniák, szürke higroszkópos légmicéliumok
M„	keményítő agar	erőteljes növekedés, kis kolóniák, fehér légmicéliumok
M_s	glicerin	csekély növekedés, kis kolóniák, légmicéliumok nélkül
M₆	vastartalmú pepton agar	diszkrét növekedés, kis kolóniák, szürke légmicéliumok
m₇	tyrozin agar
-	tápanyag agar	erőteljes növekedés, kis kolóniák, tiszta
-	Emerson agar	erőteljes növekedés, radiális kolóniák, bőséges fehér légmicélium
-	V8 paradicsomlé agar	erőteljes növekedés, kis kolóniák, bőséges szürke légmicélium
-	burgonyadextróz	erőteljes növekedés, kis kolóniák, fehér légmicélium, csekély melanin pigment

A B táblázat ennek a törzsnek néhány jellemzőjét mutatja be.

B táblázat

Jellemzők	Hatás
Érzékenység 7%-os NaCl-re	negatív
Érzékenység 0,1 %-os fenolra	pozitív
Növekedés 45 Celsius-fokon	negatív
Növekedés 4 Celsius-fokon	negatív
Lipolízis	pozitív
DNS-bontó enzim	negatív
Kén-hidrogén-fejlesztés	negatív
Antibiózissal szemben:
B. subtilis NCIMB 3610	negatív
M. lutens NCIMB 196	negatív
C. albicans CBS 562	negatív
S. cerevisiae CBS 1171	gyenge
S. murinus ISP 5091	negatív
A. nigerLIV 131	negatív

A C táblázat a törzs növekedését mutatja, néhány szénforrásként alkalmazott szerves anyagon.

C táblázat

Vegyület	Növekedés
N-Acetil-D-glukózamin	+ + +
Adonitol	+ + +
a-Arabinóz	+ + +
Cellobióz	+ + +
Galaktóz	+ + +
Glicerin	+ + +
Glukóz	+ + +
Inozitol	+
Laktóz	+ +
2-K.eto-D-glukonát	+ + +
Maltóz	+ +
Melezitóz	+ +
Metil-D-glukozid	+ +
Raffinóz	+ +
Szacharóz	+ + +
Szorbitol	+ + +
Trealóz	+ +
Xilitol	+ + +
Xilóz	+ + +

A D táblázat a törzs érzékenységét mutatja néhány antibiotikumra.

HU 215 553 Β

D táblázat

Antibiotikum	Dózis (mikrogramm)	Érzékenység
Nalidixsav	30	-
Ampicillin	10	+ +
Bacotracom	10(1)	+ + +
Cephaloridin	30	+ + +
Chloramphenicol	30	+
Chlortetracylin	30	+ + +
Erytromycin	15	+ +
Phosphomycin	50	+ +
Gentamycin	10	+ + +
Kanamycin	30	+ + +
Lincomycin	2	-
Neomycin	30	+ + +
Novobiocin	30	+ + +
Oleandomycin	15	+
Oxytetracyclin	30	+ + +
Penicillin	10(1)	+
Polymixin B	300(1)
Rifamycin	30	+ +
Rifampicin	30	+ +
Streptomycin	10	+ + +
Tetracyclin	30	+ + +
Tobramycin	10	+ + +
Vancomycin	30	+ + +

(1) nemzetközi egység + pozitív növekedést jelöl

- növekedés hiányát jelöli

Más mikroorganizmusok esetében az NCIMB 40428 Streptomyces törzs variánsává alakulhat át.

Mesterséges variánsok vagy mutánsok nyerhetők például többféle ismert mutagénnel való kezeléssel, így röntgen- vagy ultraibolya (UV) -sugárzással, nagyfrekvenciájú hullámokkal és kémiai anyagokkal, például salétromossawal, halogénezett alkil-aminokkal, nitrozoguanidinekkel, kámforral és hasonlókkal.

Mindazok a Streptomyces törzsekhez tartozó, a természetes és mesterséges variánsok és mutánsok, amelyek az AB-041 antibiotikumot termelik, az NCIMB 40428 Streptomyces törzzsel ekvivalensek és találmányunk tárgykörébe tartoznak.

Eljárás az AB- 041 antibiotikum előállítására

Az AB 041 antibiotikum előállítási eljárása az NCIMB 40428 Streptomyces törzsnek vagy ekvivalens mutánsának vizes táptalajon, ellenőrzött aerob fermentációs körülmények közötti tenyésztéséből és az antibiotikum ismert módszerekkel történő elválasztásából áll.

Táptalajként vagy fermentációs közegként mindazok használhatók, amelyeket antibiotikumok termelésére általában alkalmaznak, bizonyos tápközegek használata azonban előnyös.

Az említett tápközegnek tartalmaznia kell a Streptomyces mikroorganizmus törzs által asszimilálható szénés nitrogénforrást, valamint kis mennyiségben tartalmaznia kell szervetlen sókat is.

A tápközegnek tartalmaznia kell azoknak a fémeknek a nyomnyi mennyiségeit is, amelyek szükségesek a mikroorganizmus növekedéséhez és fejlődéséhez, s amelyek már szennyezésként is jelen lehetnek a bakteriális fejlődéshez biztosított szén- vagy protein-nitrogénforrásokban, vagy ha szükséges, akkor csak a tápközeghez adagolhatok. Általában a szénforrásként használt anyagok szénhidrátokból, elsősorban szacharidokból, így glükózból vagy fruktózból származhatnak, vagy alternatív módon származhatnak keményítőből vagy a keményítőkhöz hasonló ipari termékekből, így oldható dextrin keményítőből, vagy polialkoholokból, így glicerinből. Az előzőekben említett kompozíciók alkalmazhatók egyedül vagy kombinációban. A táptalajban a szénforrás koncentrációja általában függ a tápközeg további alkotórészeinek típusától és mennyiségétől, azonban rendszerint 0,5 és 5 tömegszázalék közötti koncentráció elegendő.

Nitrogénforrásként használt anyagok lehetnek a protein hidrolizátumok, így élesztőkivonat, kazein hidrolizátum vagy liszt, például szójaliszt, vagy erre a célra kereskedelmi forgalomból beszerezhető ipari termékek, például profilo, gabonapáclé, alkohol desztillációs maradéka.

Ezek a vegyületek alkalmazhatók egyedül vagy kombinációban, a tápközeg össztömegére számítva 0,2 és 6% közötti koncentrációban.

A jelenlévő nyomelemek lehetnek például a kobalt, mangán, vas és hasonlók.

Az alkalmazható szervetlen sók példáiként a nátrium-, kálium-, magnézium-, ammónium- és kalciumsókat említjük, anionjaik lehetnek például a foszfátok, szulfátok, kloridok, karbonátok vagy nitrátok.

Bizonyos táptalajokról kimutatták, hogy az NCIMB 40428 Streptomyces törzsből az AB-041 antibiotikum termelésének a serkentésére különleges képességük van, ilyenek például azok az alábbi vizes készítmények, amelyeket az előállítási példákban használtunk:

P tápközeg	koncentráció
(alkotórészek)	g/1
profilo (gyapotmag liszt)	10
glicerin	15
CaCo₃	3

V tápközeg	koncentráció
(alkotórészek)	g/1
húskivonat	4
élesztőkivonat	1
pepton	4
dextróz	10
NaCl	2,5

HU 215 553 Β

VI tápközeg	koncentráció
(alkotórészek)	g/i
húskivonat	3
pepton	5

S tápközeg	koncentráció
(alkotórészek)	g/i
Glükóz	1
hús- és máj pepton	10
húskivonat	5
NaCl	3
agar	12,5

Az NCIMB 40428 Streptomyces törzs 20 és 35 °C, előnyösen 25 és 30 °C közötti hőmérsékleten tenyészthető.

A pH-viszonyok körülbelül 5 és körülbelül 9 közötti értékek között változtathatók.

A tápközegbe való steril levegő befüvását általában olyan mennyiségben kell alkalmazni, hogy ezzel a tápközegben az oxigénkoncentrációt a telítési érték 20%án, vagy efölött tartsuk, figyelmen kívül hagyva az inokuláció utáni 24. órát, amikor az oxigénkoncentráció alacsonyabb értékre esik vissza.

A fermentáció alatti antibiotikum-termelés a tenyészeti minták biológiai aktivitási tesztjével követhető. A fermentációt addig kell folytatni, amíg lényeges biológiai aktivitást nem érünk el. Általában 72-100 óra elegendő.

Az antibiotikum elválasztása és tisztítása

Az előzőekben leírt fermentációs körülmények között lefolytatott tenyésztést követően az AB-041 antibiotikum a tápközegtől elválasztható, és ezután az elválasztási technika hagyományos módszereivel tisztítható. Ezek közé a módszerek közé tartoznak például az antibiotikumot nem oldó anyagokkal történő kicsapás, az ultraszűrés, reverz ozmózis, szilikagél kromatográfia, cellulóz kromatográfia, reverz fázisú kromatográfia, ioncserélő gyantás kromatográfia, nemionos makroporózus gyantákon történő kromatográfia, és hasonló, méretkihagyásos (SEC, „size exclusion erőm.”) és gél-kromatográfia (gél permeation erőm; GPC).

A fermentáció folyamán képződött antibiotikum főként a fermentációs tápközegben van.

Az AB-041 antibiotikum feltárásának egyik előnyös módja a micéliumtömeg centrifiigálással való elválasztása a tápközegtől. Az így kapott tápközeget átszűrjük egy 1 pm-es szűrőn, majd spirálmembránon keresztül szűrjük 20 kD nominális exklúzióval. A szűrletet spirálmembránon keresztül reverz ozmózissal koncentráljuk 500 D nominális exklúzióval.

A reverz ozmózissal megmaradt anyagot nemionos gyantával kezeljük, ami bizonyos lipofil szennyezéseket tart vissza, de nem tartja vissza az AB-041 antibiotikumot, ezután ioncserélő gyantát (előzőleg klorid formájúvá alakított AMBERLITEIRA 401-et például) tartalmazó oszlopba tápláljuk, a gyantát ezután vízzel mossuk és a terméket vizes sósavoldattal eluáljuk.

Az AB-041 antibiotikumot tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, 32%-os vizes ammóniaoldattal semlegesítjük és vákuumban bepároljuk.

Az ily módon kapott oldatot C 18 reverz fázisú oszlopon szilíciumra visszük és vízzel eluáljuk.

Az AB-041 antibiotikumot tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, vákuumban bepároljuk és stacioner fázisként például FRAKTOGEL TSK HW40(F)-et tartalmazó méretkizárásos kromatográfiás oszlopra tápláljuk, vízzel eluáljuk, az AB-041 antibiotikumot tartalmazó frakciókat ismét összegyűjtjük és vákuumban betöményítjük, így kapjuk a tiszta AB-041 antibiotikumot. Biológiai aktivitás

Az alábbi példákban leírt módszerekkel meghatároztuk mind a kikelés előtti, mind a kikelés utáni herbicid aktivitást.

Az AB-041 vegyületnek jelentékeny posztemergens herbicid aktivitása van különböző botanikai csoportokat fertőző egy- és kétszikű gyomok széles körébei szemben (ld. E táblázatot). A preemergens herbicid aktivitás azonban bizonyos kétszikű fajokra (ld. E táblázatot) korlátozódik.

Az AB-041 vegyület szelektivitást is mutat bizonyos hasznos növényfajtákkal szemben, így például búzával, árpával, kukoricával és gyapottal szemben (ld. az F táblázatot), ezekkel szemben kis fitotoxieitást mutat olyan dózisban alkalmazva, amely a fertőző gyomokkal szemben aktív.

A példákban kimutatott tulajdonságok azt mutatják, hogy a találmányunk szerinti antibiotikumnak mezőgazdasági szempontból fitotoxikus aktivitása van, ezért herbicidként hasznosan alkalmazhatók.

Alkalmazás és formálás

A gyakorlatban a találmány szerinti vegyület mezőgazdasági és más területeken is hasznosan alkalmazható megfelelő készítmények formájában.

A hatóanyagon kívül a készítmények szilárd vagy folyékony inért hordozóanyagokat (szerves oldószereket, növényi vagy ásványi olajokat, vizet és ezek keverékét), és adott esetben további, az ilyen készítményekben szokásosan alkalmazott adalékanyagokat, így felületaktív anyagokat, diszpergálószereket és nedvesítő anyagokat tartalmaznak. A vízben való oldhatóság és stabilitás szempontjából pozitív jellemzőik tekintetében a készítmény szokásos módon kialakítható például vízoldható por vagy vizes oldat formájában a szerves oldószerek használatából eredő környezeti hatások csökkentésére.

Az alkalmazási módszereket mind a kijuttatás, mind a formálás szempontját figyelembe véve választjuk ki.

Speciális alkalmazásokra vagy a készítmények hatásspektrumának kiterjesztésére az említett készítményekhez további hatóanyagokat, így további herbicideket, inszekticideket, fungicideket vagy műtrágyákat is adhatunk.

Az alkalmazott dózis különféle faktoroktól, így a fertőzöttség típusától és fokától, a használt készítmény típusától és a klimatikus és környezeti tényezőktől függően változtatható.

HU 215 553 Β

A mezőgazdaságban történő gyakorlati alkalmazásra a 0,1 és 2 kg/ha közötti antibiotikum-dózis elegendő eredményt ad.

A következő példákkal mutatjuk be a találmányunkat, annak korlátozása nélkül.

1. példa

Posztemergens herbicid hatás vizsgálata

Mezőgazdasági termőtalajt tartalmazó, 11 cm átmérőjű műanyag edényekbe különböző botanikai csoportokhoz tartozó évelő gyomnövények 10 fajtájának magvait vetettük, és hagytuk kifejlődni ezeket üvegházban megfelelő körülmények között, a fajtáktól függően 7-15 napon át addig, míg a kétszikű fajták esetében a sziklevelek kifejlődtek, illetve az egyszikű fajták esetében az első levél megnagyobbodott és a második láthatóvá vált.

AB-041 1,0 g/l-es vizes oldatát (1,0 kg/ha dózisnak felel meg) juttattuk ki a növényekre a vizsgálat során De Vilbiss porlasztóval. A herbicid hatást hetenként értékeltük.

Az E táblázat mutatja az aktivitási eredményeket 4 hét elteltével a növekedésgátlás százalékában kifejezve. A vizsgálat alatt az összes növényfajtánál 60 és 100% közötti gátlást észleltünk (0%: egészséges növény; 100%: teljesen elpusztult növény).

2. példa

Preemergens herbicid hatás vizsgálata

Mezőgazdasági termőtalajt tartalmazó, 11 cm átmérőjű műanyag edénybe különböző botanikai csoportokhoz tartozó évelő gyomnövények 10 fajtájának magvait vetettük. AB-0411,0 g/l-es vizes oldatát (1,0 kg/ha dózisnak felel meg) DE Vilbiss porlasztóval juttattuk az edényekben lévő föld felületére. A herbicid hatást hetenként értékeltük.

Az E táblázat mutatja az aktivitási eredményeket 4 hét elteltével a növekedés százalékában kifejezve (0%: egészséges növény; 100%: teljesen elpusztult növény).

E táblázat

AB-041 1 kg/ha dózisnál a növekedésgátlás %-a

Gyomnövény	posztemergens	preemergens
	%	%
Convolvolus arvensis	75	70
Convolvolus sepium	100	90
Ipomoea leptofilla	85	35
Geránium dissectum	95	0
Stellaria média	100	100
Abutilon theophrasti	100	10
Solanum nigrum	95	20
Veronica sp.	100	20
Setaria glanca	60	10
Digitaria sanguinalis	75	10

3. példa

Posztemergens herbicid hatás vizsgálata haszonnövényeken

A vizsgálatot az 1. példában leírt módon végeztük el hat hasznos, egy- és kétszikű növényen.

Az F táblázat mutatja az aktivitási eredményeket 4 hét elteltével, a növekedésgátlás %-ában kifejezve.

F táblázat

AB-041 1 kg/ha dózisnál a növekedésgátlás

Haszonnövény	%
Triticum aestivum	5
Hordeum vulgare	0
Zea mays	15
Glycine maxima	15
Béta vulgáris	55
Pisum sativum	70
Gossypium hirsutum	0

Nem jelentkezett fitotoxikus hatás gyapoton (Gossypium hirsutum) és árpán (Hordeum vulgare). Búza (Triticum aestivum), kukorica (Zea mays) és szójabab (Glicine maxima) esetében csekély, 5 és 15% közötti fitotoxicitást észleltünk. A legérzékenyebb fajoknak a répa (Béta vulgáris) és a borsó (Pisum sativum) bizonyultak, ezeknél 55 és 70% közötti fejlődésgátlást észleltünk.

4. példa

NCIMB 40428 Streptomyces sp. törzs fermentációja ml NCIMB 40428 Streptomyces sp. micéliumot (-20 °C-on 10% glicerinben tenyésztve) tartalmazó ampullát inokuláltunk az előzőekben említett V tápközegbe, amelyet aztán 28 °C-on 72 órán át inkubáltunk forgó-rázógépen (150 fordulat/perc).

A tenyészetet egy 10 1 névleges térfogatú olyan fermentorba inokuláltuk, amely 7 liter P tápközeget és habzásgátlóként 1,0 g/1 Nixolent tartalmazott. A fermentációt az alábbi körülmények között végeztük: 29 °C hőmérséklet, 300 liter/óra levegőztetés, 320 fordulat/perc-es rázatás, 96 óra fermentációs időtartam.

5. példa

NCIMB 40428 Streptomyces sp. törzs fermentációja

Liofilizált formájú NCIMB 40428 Streptomyces sp. törzset tartalmazó ampullát aszeptikusán nyitottunk és steril desztillált vízzel rehidratáltuk. A szuszpenziót használtuk inokulumként egy olyan 500 ml-es lombikba, amely az előzőekben leírt P tápközeg 100 ml-jét tartalmazta, ezt aztán 90 órán át 28 °C-on inkubáltuk egy forgó-rázó gépen (200 fordulat/perc).

Ezt követően a tenyészetet centrifugáltuk a micéliumoktól történő elválasztás, valamint biológiai vizsgálatokhoz való felhasználás céljából.

HU 215 553 Β

6. példa

NCIMB 40428 Streptomyces sp. törzs fermentációja

Az S tápközegben tenyésztett NCIMB 40428 Streptomyces sp. tiszta tenyészetét inokuláltuk három olyan lombikba, amelyek mindegyike 20 ml V tápközeget tartalmazott, ezeket aztán 28 °C-on 72 órán át inkubáltuk egy forgó-rázó gépben (250 fordulat/perc). A tenyészeteket ezután 10 db 2 1-es lombikba inokuláltuk, melyek mindegyike 500 ml Vl tápközeget tartalmazott, ezek mindegyikét az előbbiekben említett körülmények között inkubáltuk 72 órán át.

Ezt követően a tenyészetet három, egyenként 401 névleges térfogatú fermentorba inokuláltuk, amelyek mindegyike 25 1 P tápközeget és 1,0 g/1 Nixolen habzásgátlót tartalmazott az alábbi körülmények között. 29 °C hőmérséklet, 3001/óra levegőztetés, 74 óra fermentációs idő.

7. példa

Az AB—041 antibiotikum izolálása

Az előzőekben leírt módon kapott fermentum 90 1ét centrifugáltuk, és a derített fermentlevet 1 μιη-es szűrőn átszűrtük.

A szűrletet egy G-50 spirálmembránnal ellátott ultraszűrő/reverz ozmózis egységben (Hydro Air Research S. R. L., Zerbo di Opera, Olaszország) 20 kD nominális exklúzióval kezeltük.

Kb. 801-nyi mennyiséget átengedtünk, a megmaradt folyadékhoz ezután 10 1 vizet adtunk, és további 10 1-t engedtünk át a membránon, amelyet az előzőleg kapott 80 1-nyi folyadékhoz adtunk.

Az ultraszűrés után megmaradt anyagot eldobtuk.

Az ultraszűréssel kapott permeátum 90 1-ét egy DS-5 reverz ozmózis spirálmembránnal ellátott reverz ozmózis egységben (Hydro Air Research) 500 D nominális exklúzióval kezeltük.

1-t engedtünk át és a koncentrátumot fölfogtuk, a berendezést 2,5 1 vízzel mostuk, és a reverz ozmózis koncentrátumához adott mosóvízzel együtt 9,5 1 AB-041 antibiotikumot tartalmazó oldatot kaptunk.

Ezt az oldatot egy olyan oszlopra (belső átmérő 90 mm, magasság 300 mm) tápláltuk, amely 2,4 kg XAD-4 töltetet (Rohm et Haas Co., Philadelphia, Pennsylvania) tartalmazott, és 8 1 eluátumot gyűjtöttünk össze.

A gyantát 4,0 1 vízzel mostuk, az első 1,5 1-nyi mennyiséget ebből az előzőleg kapott 8 1-nyi eluátumhoz adtuk.

Ezt a 7,1 körüli pH-értékű és az AB-041 antibiotikumot tartalmazó oldatot 20 ml/perc térfogatáramban egy olyan oszlopra (belső átmérő 90 mm, magasság 300 mm) tápláltuk, amely 1,5 kg 20-50 mesh szemcseméretű, klorid formájú Amberlite IRA 401 ioncserélő gyantát (Fluka Chemie Ag, Buchs, Svájc) tartalmazott, ezt követően az oszlopot 6 1 vízzel mostuk és 0,5 N vizes sósavoldattal eluáltuk. Az AB-041 antibiotikumot 4 1 eluens adagolása után az első 7 1-nyi eluátum tartalmazta.

Az AB-041 antibiotikumot tartalmazó savas oldatot 32%-os vizes ammóniaoldattal semlegesítettük, vákuumban körülbelül 1 1-nyi térfogatra betöményítettük, és egy olyan oszlopra (belső átmérő 90, magasság

500 mm) vittük, amely 1,2 kg RSIL Cl8 HL szilikagélt (0,044-0,063 mm, porozitás 9Á; Bio-Rad Laboratories S.r.l., Milánó, Olaszország) tartalmazott és 35 ml/perc térfogatáramú vízzel eluáltuk.

Az AB-041 antibiotikumot 7,5 1 adagolása után az első 32 1-nyi eluátum tartalmazta. Ezt az eluátumot vákuumban szárazra pároltuk, felvettük 50 ml vízben és egy olyan oszlopra (belső átmérő 70, magasság 500 mm) tápláltuk, amely FRAKTOGEL TSK HW 40(F) (Merck, AG, Darmstadt, Németország) töltetet tartalmazott és 5 ml/perc térfogatáramú vízzel eluáltuk, 35 ml-es frakciókat gyűjtöttünk.

Az AB-041 antibiotikumot az összesen 350 ml-nyi, 21-30 frakciók tartalmazták.

Az összegyűjtött frakciókat vákuumban bepároltuk, így 300 mg AB-041 antibiotikumot kaptuk.

8. példa

Vizoldható porkészítmény formálása

A készítmény összetétele:

a) hatóanyag (AB-041) 70-90%

b) kalcium-ligninszulfonát 2-5%

c) anionos vagy nemionos felületaktív anyag (nátrium-benzolszulfonát, naftalin-formaldehid kondenzátum, polietoxilezett alkil-fenolok stb.

egyedül vagy keverékeikként) 5-10%

d) szilikonos habzásgátló 0,5-2% adott esetben még további inért oldható sók, így nátrium-szulfát, kálium-klorid stb.

9. példa

Koncentrált vizesoldat-készítmény formálása A készítmény összetétele:

a) hatóanyag (AB-041) 5-15%

b) polietoxilezett nonil-fenol 1-5%

c) propilénglikol 5-10%

d) polietoxilezett alkil-amin 2-5%

e) a 100%-hoz szükséges mennyiségben víz

Claims

1. Eljárás AB-041 antibiotikumok előállítására, melyek ultraibolya abszorpciós maximuma 278 nm, infravörös abszorpciós maximumai (cm¹) 3395; 1663; 1594; 1449; 1403; 1338; 1307; 1285; 1246; 1225; 1159; 1102; 1074; 1037; 1017; 960; 942; 917; 888; 741, azzal jellemezve, hogy NCIMB 40428 Streptomyces sp. törzset vagy mutánsát fermentáljuk, és az említett antibiotikumokat a fermentumból kinyeijük.

2. Eljárás az AB-041 antibiotikumok egyik komponense, az AB-041 antibiotikum előállítására, mely

a) vízben, dimetil-szulfoxidban és dimetil-szulfoxid-víz elegyekben jól oldódik, azonban etiléterben és hexánban gyakorlatilag oldhatatlan;

b) elemanalízis alapján szén-, hidrogén-, nitrogén-, oxigén-, kénatomot tartalmaz;

c) molekulatömege 463;

HU 215 553 Β

d) ultraibolya abszorpciós spektrumában 278 nmnél abszorpciós maximumot mutat;

e) infravörös abszorpciós maximumai: 3395; 1663; 1594; 1449; 1403; 1338; 1307; 1285; 1246; 1225; 1159; 1102; 1074; 1037; 1017; 960; 942; 917; 888; 741 cm³;

f) Ή-NMR-spektrum jelentősebb csúcsai:

TMS (ppm): 8,26 (s, 1H); 4,55 (t, 1H); 4,43 (d, 1H); 4,26 (d, 1H); 4,04 (m, 1H); 3,67 (m, 3H); 3,36 (t, 1H); 3,26 (t, 1H); 3,09 (m, 1H); 2,71 (dd, 1H); 2,19 (d, 1H); 1,26 (d, 3H);

g) ¹³C-NMR-spektrum legfontosabb csúcsai:

TMS (ppm): 181,3 (s); 174,7 (s); 165,8 (s);

158.3 (s); 137,8 (s); 107,8 (s); 105,3 (s) nagyon gyenge 73,1 (d); 66,8 (t); 62,0 (t); 51,1 (d);

47.3 (t); 43,6 (d); 42,0 (d); 18,5 (q);

h) reverz fázisú HPLC-kolonnában az alábbi körülmények között a retenciós idő körülbelül 4,5 perc:

Oszlop: Hibar LiChrospher 100 RP 18 (5 pm) 250x4 mm (Merck, Darmstadt; Németország);

Prekolonna: LiChroCART 4-4, LiChrospher 100 RP 18 (5 pm) (Mesch, Darmstadt; Németország)

Eluens: metanol . monobázikus kálium-foszfát, 20 mM-os vizes oldat pH=3,5, foszforossavval beállítva, (12,1: 87,9 v/v)

Áramlási sebesség: 0,7 ml/perc Hőmérséklet: 40 °C UV-detektor 276 nm

i) pozitív kolorimetriás reakciót mutat ninhidrinnel acetonban (0,2 tömeg/térfogat%) és pinakriptol sárgával vízben (0,07 tömeg/térfogat%); negatív kolorimetriás reakciót mutat diazotáló reagenssel és α-naftollal való kapcsolás esetén;

1) R_f=0,35 cellulóz F kromatografáló lemezen (Merck Ag. Darmstadt, Németország) eluensként acetonitril és víz 91:9 térfogatarányú elegyét használva, azzal jellemezve, hogy NCIMB 40428 Streptomyces sp. törzset vagy mutánsát fermentáljuk, és a tárgyi kör szerinti AB 041 antibiotikum-komponenst kinyeijük.

3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fermentálást 20-35 °C közötti hőmérsékleten végezzük.

4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fermentálást 25-30 °C közötti hőmérsékleten végezzük.

5. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fermentálást 5-9 közötti pH-értéken végezzük.

6. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az antibiotikumokat a fermentumból szűréssel és ezt követően kromatográfiás módszerekkel izoláljuk.

7. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az AB-041 antibiotikumokat az alábbi tisztítási módszerekkel izoláljuk:

- a fermentumot spirálmembránon ultraszűrjük,

- a permeátumot töményítjük spirálmembránon történő reverz ozmózissal,

- egymást követő kromatográfiás lépéseket végzünk nemionos gyantát és ioncserélő gyantát tartalmazó oszlopon, majd

- méretkihagyásos kromatográfiát végzünk.

8. Herbicid készítmények, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként egy, az 1. vagy 2. igénypont szerinti antibiotikumot tartalmaznak 0,01-95 tömeg% mennyiségben, szilárd és folyékony hordozóanyagokkal és adott esetben további adalékanyagokkal együtt.

9. Eljárás gyomnövények fejlődésének csökkentésére, azzal jellemezve, hogy az 1. és 2. igénypont szerinti vegyületeket alkalmazzuk 0,1-2,0 kg/ha mennyiségben a hasznos növényeken, vagy azok szaporítóanyagain a gyomnövények növekedésének gátlására a hasznos növények károsodása nélkül.