DE2218648C2 - Validamycin C, D, E und F und diese Verbindungen enthaltende Pflanzenschutzmittel - Google Patents
Validamycin C, D, E und F und diese Verbindungen enthaltende PflanzenschutzmittelInfo
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- DE2218648C2 DE2218648C2 DE19722218648 DE2218648A DE2218648C2 DE 2218648 C2 DE2218648 C2 DE 2218648C2 DE 19722218648 DE19722218648 DE 19722218648 DE 2218648 A DE2218648 A DE 2218648A DE 2218648 C2 DE2218648 C2 DE 2218648C2
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Description
OH
in der R fur eine O-a-D-Glucopyranosyl-3-hydroxymethyM^o-trihydroxy^-cyclohexenylgruppe
steht, und eine Zersetzungstemperatur von 142 bis 1600C,
und seine Salze.
2. Validamycin D der Formel
2. Validamycin D der Formel
4. Validamycin F der Formel
OH
in der R3 für eine O-«-D-Glucopyranosyl-3-hydroxymethyM.S.ö-trihydroxy^-cyclohexenylgruppe
steht, und eine Zersetzungstemperatur von 165 bis 173° C,
und seine Salze.
5. Pflanzenschutzmittel, enthaltend als Wirkstoff eine Verbindung nach Anspruch 1 —4, ein Salz dieser
Verbindungen oder ein Gemisch dieser Wirkstoffe.
6. Pflanzenschutzmittel nach Anspruch 5, enthaltend ein Gemisch von Validamycin E und Validamycin
F als Wirkstoff.
HOH2C
HO
(II)
HN — R1
in der R1 Tür eine O-a-D-Glucopyranosyl^^-trihydroxy-5-hydroxymethyl-cyclohexylgruppe
steht, und seine Salze.
3. Validamycin E der Formel
3. Validamycin E der Formel
HOH
HO
OH
OR3
in der R2 für eine O-cr-D-Glucopyranosyl-O/i-D-glucopyranosy!gruppe
steht, und seine Salze.
Die Erfindung betrifft neue Antibiotika, die als Validamycin C, D, E und F bezeichnet und durch
Kultivierung von Validamycine bildenden Stämmen der Gattung Streptomyces erhalten werden, und ihre
Säureadditionssalze.
Auf der Suche nach neuen antibiotisch aktiven Substanzen isolierte die Anmelderin eine große Zahl
von Mikroorganismen des Bodens und untersuchte ihre Metabolite. Die Forschungsarbeit führte zu den
Feststellungen, daß gewisse, vom Boden isolierte Mikroorganismen Validamycine C, D, E und F zu bilden
vermögen, daß diese Mikroorganismen zu der Gattung Streptomyces gehören, und daß diese Antibiotika durch
Kultivierung dieser Mikroorganismen in einer Weise, daß die Antibiotika im Nährmedium angehäuft werden,
erhalten werden können.
Der Erfindung liegen die vorstehenden Feststellungen zu Grunde. Die Erfindung betrifft somit die
Antibiotika Validamycin C, D, E und F, die erhalten werden, indem ein Validamycine bildender Stamm, der
zur Gattung Streptomyces gehört, so kultiviert wird, daß das Antibiotikum gebildet werden kann, die
Validamycine C, D, E und F im Fermentationsmedium angehäuft werden, und die auf diese Weise im
Fermentationsmedium angehäuften Antibiotika isoliert werden.
Ferner wurde überraschenderweise gefunden, daß die vorstehend genannten Antibiotika ausgezeichnete Mittel
zur Bekämpfung von Pflanzenkrankheiten, beispielsweise des Blattscheidenbrandes (sheath blight) von
Reispflanzen bei Anwendung in vivo sind, jedoch in vitro keine Wirkung gegen Bakterien und Pilze zeigen.
Weitere Untersuchungen mit diesen Antibiotika haben das besondere Merkmal zu Tage gebracht, daß sie diese
starke Wirkung bei der Bekämpfung der Pflanzenkrank-
heiten nur zeigen, wenn die Pflanze oder der Boden mit ihnen behandelt wird.
Ferner wurde gefunden, daß die Antibiotika gemäß der Erfindung sehr wirksam nicht nur gegen den
Blattscheidenbrand von Reispflanzen, sondern auch gegen andere Pflanzenkrankheiten sind, z. B. gegen die
Wurzelfäule der Reispflanzen und ±e Umfallkrankheit
und sklerotiale Trockenfäule bei Gemüse, blühenden Pflanzen und jungen Bäumen. Außerdem sind die
Antibiotika gemäß der Erfindung im wesentlichen harmlos gegenüber Mensch und Tier sowie Fischen, und
selbst bei Anwendung in hoher Konzentration beeinträchtigen sie nicht wesentlich die Keimung, das
Wachstum, den Ertrag und andere Merkmale von Nutzpflanzen.
Die Erfindung umfaßt demgemäß die obengenannten neuen Antibiotika sowie gegenüber Menschen, Tieren
und Fischen ungiftige, im wesentlichen keine Phytotoxizität aufweisende Pflanzenschutzmittel mit fungizider
Wirkung zur Bekämpfung von bakteriellen und pilzlichen Pflanzenkrankheiten.
Die Validamycine C, D, E und F (nachstehend der Einfachheit halber als »Antibiotika« bezeichnet) wrden
durch Kultivierung eines zur Gattung Streptomyces gehörenden Stammes, der diese Antibiotika zu bilden
vermag, erhalten. Beispielsweise können der Stamm, der von den Erfindern von Bodenproben aus Akashi,
Präfektur Hyogo, Japan, isoliert wurde und als Streptomyces hygroscopicus var. limoneus (IFO-12 703
und IFO-12 704) bezeichnet wurde, sowie seine verwandten Stämme mit besonderem Vorteil verwendet
werden. Diese Mikroorganismen werden in der DE-OS 19 54 110 der Anmelderin beschrieben.
Einige mikrobiologische Eigenschaften und Kultureigenschaften von Streptomyces hygroscopicus var.
limoneus sind nachstehend angegeben. Hierbei basieren die mit »Rdg.« gekennzeichneten Farbbezeichnungen
auf Ridgeway's »Color Standard and Color Nomenclature«.
!.Morphologische Eigenschaften
Das Luftmycel dieses Mikroorganismus zeigt einfache Verzweigung, und die sporentragenden Hyphen
bilden Spiralen. Das Conidium ist eiförmig oder rechteckig, hat eine Größe von 1,0 bis 1,3 μ χ 1,0 bis 1,5 μ
und eine glatte Oberfläche. Dieser Mikroorganismus hat keine Sklerotia, Sporen mit Geißeln und Sporangia.
2. Kultureigenschaften '"
Die folgenden Kultureigenschaften werden, falls nicht anders angegeben, bei Kultivierung bei 28°C beobachtet.
Wenn die Kultivierung bei anderen Temperaturen durchgeführt wurde, sind diese Temperaturen in -,-,
Klammern angegeben.
a) Czapek-Agar
Wachstum: farblos, faltig
Rückseite: w)
Raw Sienna (Rdg, III, 17-i) bis Sudan Brown
(Rdg., Ill, 15k).
Luftmycel:
Tilleul Buff (Rdf, XL, 17"'-f) bis Light Buff (Rdg, XV, 17'-f), teilweise Mouse Gray (Rdg., h5
LI, 15'"") längs dtir Peripherie der Kolonie.
Lösliches Pigment:
gelb mit schwach bräunlichem Ton.
b) GIucose-Czapek-Agar Wachstum:
farblos bis Sulphin Yellow (Rdg, IV, 21 -i), faltig
Rückseite: Raw Sienna Luftmycel:
Tilleul Buff bis Massicot Yellow (Rdg, XVI, 21'-f), teilweise Light Olive Gray (Rdg, LI,
23"'"-d) längs der Peripherie der Kolonie.
Lösliches Pigment:
gelb mit schwach-bräunlichem Ton.
c) Glycerin-Czapek-Agar Wachstum:
farblos bis Orange Citrine (Rdg, IV, 19-k), faltig
Rückseite: Raw Sienna Luftmycel:
Tilleul Buff bis Massicot Yellow, teilweise
hellolivgrau. Lösliches Pigment:
gelb mit schwach bräunlichem Ton.
d) Glucose-Asparagin-Agar Wachstum: farblos Rückseite:
Old Gold (Rdg., XVI, 19'-i) bis Antimony Yellow (Rdg, XV, 17'-b) bis Cinnamon Brown
(Rdg, XV, 15'-k) Luftmycel:
hellolivgrau bis mausgrau mit gelben Flecken
und schwarzen feuchten Flächen Lösliches Pigment: hellbraun.
e) Calciummaleatagar Wachstum:
Primuline Yellow (Rdg, XVI, 19')
Rückseite: Primuline Yellow Luftmycel:
zunächst spärlich, jedoch später Tilleul Buff bis
hellolivgrau Lösliches Pigment: blaßgelb.
f) Stärkeagar: kein Wachstum
g)
Modifiziertes Stärkeagar mit folgenden | 1% | 0,3% |
Bestandteilen: | Kaliummonohydrogenphosphat 0,3% | 0,1% |
Lösliche Stärke | Calciumcarbonat | 0,2% |
Magnesiumsulfat | 0,05% | |
Ammoniumsulfat | 2% | |
Natriumchlorid | ||
Agar |
h) Wachstum:
farblos bis Barium Yellos (Rdg, XVI, 23'-d)
Rückseite:
Deep Colonial Buff (Rdg, XXX, 21 "-b) bis Snuff Brown (Rdg, XXIX, 15"-k)
Luftmycel:
Cartridge Buff (Rdg, XXX, 19"-f) bis mausgrau mit schwarzen feuchten Stellen
Lösliches Pigment: hellbraun Hydrolysierung der Stärke wurde beobachtet.
Tyrosin-Agar Wachstum:
farblos bis Trontian Yellow (Rde, XVl. 23')
Rückseite:
Pale Ochraceous Buff (Rdg., XV, 15'-f) bis Light Ochraceous Buff (Rdg., XV, 15'-d)
Luftmycel: nicht vorhanden Lösliches Pigment: nicht vorhanden
Hefeextrakt-Agar
Wachstum: farblos, faltig Rückseite: cremefarben (Rdg., XVI, 19'-f)
Luftmycel: weiß
Lösliches Pigment: hellbraun
Nähragar(37°C)
Wachstum: farblos
Rückseite: farblos
Luftmycel: nicht vorhanden Lösliches Pigment: nicht vorhanden
Wachstum: farblos
Rückseite: farblos
Luftmycel: nicht vorhanden Lösliches Pigment: nicht vorhanden
Glucose-Nähragar (37° C) Wachstum: farblos, faltig Rückseite:
Cartridge Buff bis Pale Ochraceous Buff Luftmycel: nicht vorhanden
Lösliches Pigment: nicht vorhanden
Nährbrühe (37° C)
Wachstum:
Wachstum:
farbloses Oberflächenwachstum und farbloses
flockiges Wachstum am Boden Luftmycel: nicht vorhanden Lösliches Pigment: nicht vorhanden
m) Glucose-Nährbrühe(37°C) Wachstum:
Oberflächenwachstum Cartridge Buff und farbloses flockiges Wachstum am Boden
Luftmycel: nicht vorhanden Lösliches Pigment: nicht vorhanden
n) Kartoffel-Stichkultur
Wachstum:
Wachstum:
farblos bis Pale Ochraceous Buff Luftmycel :Tilleul Buff bis mausgrau
Der Stich färbt sich Sayal Brown (Rdg. XXIX, 15"-i)
o) Möhrenstichkultur
Wachstum: farblos
Luftmycel: weiß bis mausgrau Der Stich färbt sich Cinnamon Rufous (Rdg., XIV. 11 '-i) bis zimtbraun.
Wachstum: farblos
Luftmycel: weiß bis mausgrau Der Stich färbt sich Cinnamon Rufous (Rdg., XIV. 11 '-i) bis zimtbraun.
p) Ceiiuiose
Wachstum:
Wachstum:
Chartreuse Yellow (Rdg, XXXl, 25"-d) bis Reed Yellow (Rdg. XXX, 23"-b)
Luftmycel: mausgrau
Lösliches Pigment: blaßgelb.
Lösliches Pigment: blaßgelb.
q) Gelatine (25° C)
Wachstum: sehr schlecht Luftmycel: nicht vorhanden Lösliches Pigment: nicht vorhanden
Die Gelatine wird leicht verflüssigt.
Das gleiche ist bei Nährgelatine der Fall,
r) Ganzes Ei (37° C)
Wachstum: farblos
Luftmycel: nicht vorhanden
Lösliches Pigment: nicht vorhanden.
Luftmycel: nicht vorhanden
Lösliches Pigment: nicht vorhanden.
-, s) Lackmusmilch (370C)
Wachstum:
Wachstum:
Oberflächenwachstum, cremefarben bis Seashell
Pink (Rdg., XIV, 1 l'-f)
Luftmycel: nicht vorhanden
Luftmycel: nicht vorhanden
mi Das Medium wird schwach koaguliert, dann
peptonisiert, wobei es Army Brown (Rdg. XL, 13"'-i) und schwach sauer wird.
t) Löffler-Medium(37°C)
r, Wachstum:
r, Wachstum:
Naples Yellow (Rdg., XVI, 19'-d) zuerst und später Light Buff
Luftmycel: nicht vorhanden
Lösliches Pigment: nicht vorhanden
:ii Keine Verflüssigung.
Luftmycel: nicht vorhanden
Lösliches Pigment: nicht vorhanden
:ii Keine Verflüssigung.
u) Peptonglucose-Agar
Wachstum: Chartreuse Yellow
Rückseite: Honey Yellow (Rdg., XXX, 19")
Luftmycel: dünn, Cream Buff (Rdg., XXX, 19"-d)
Lösliches Pigment: gelb mit bräunlichem Ton
Rückseite: Honey Yellow (Rdg., XXX, 19")
Luftmycel: dünn, Cream Buff (Rdg., XXX, 19"-d)
Lösliches Pigment: gelb mit bräunlichem Ton
ν) Reines Agar
Wachstum:
j ι spärliches und farbloses Wachstum in die
Wachstum:
j ι spärliches und farbloses Wachstum in die
Substanz des Mediums
Rückseite: farblos bis mausgrau
Luftmycel:
Rückseite: farblos bis mausgrau
Luftmycel:
spärlich, Tilleul Buff bis mausgrau
j j Lösliches Pigment: nicht vorhanden
j j Lösliches Pigment: nicht vorhanden
3. Physiologische Eigenschaften
a) Temperatur und pH-Bereich
Kein Wachstum bei 100C und 500C auf Bennett-Agar
oder Glucoseasparaginagar unter aeroben Bedingungen. Wachstum findet bei 15 bis 45°C
statt, besseres Wachstum bei 37 bis 45°C. Kein Wachstum, wenn das Medium einen pH-Wert von 4
hat. Bei pH 5 bis 10 findet zwar ein Wachstum statt, jedoch liegt der optimale Bereich bei pH 6 bis 7.
b) Gelatine: leicht verflüssigt
c) Stärke:
hydrolysiert
Durchmesser der hydrolysierten Fläche/
Durchmesser der Kolonie = 33 mm/8 mm
d) Tyrosinasereaktion: negativ
e) Lackmusmilch:
peptonisiert- Koagulierung zweifelhaft
f) Nitratreduktion: negativ
g) Hydrolyse von Cellulose: negativ
h) Farbstoffbildung: negativ
h) Farbstoffbildung: negativ
i) Produkt: Antibiotika der Validamycingruppe
4. Verwertung von Kohlenstoffquellen
Die Verwertung von Kohlenstoffquellen, ermittelt nach der Methode von Pridham und Mitarbeitern
(Journal of Bacteriology 56, 107-114 [1948]) ist nachstehend in Tabelle 1 angegeben.
Verwertung von KohlensloH'qucllen durch Slrcptomyces
hygroscopicus var. limoncus
Erythrit | - |
Adonit | - |
Sorbit | + |
D-Xylosc | + + |
L-A rabi nose | + + |
L-Sorbosc | - |
D-Galaclose | -H- |
Glucose | -H- |
D-Fruclosc | + + |
L-Rhamnosc | + + |
Melibiosc | + + |
Maltose | I I |
Saccharose | -H- |
Lactose | + + |
Raffinosc | -H- |
Inosit | + + |
ΰ-Mannit | + + |
Dulcit | - |
Trehalose | + + |
Salicin | - |
Esculin | - |
Inulin | + + |
Dextran | + |
Mannose | + + |
Stärke | + + |
Glycerin | -H- |
Natriumacetat | + |
Natriumsuccinat | + |
Natriumeitrat | + |
Calcium^-ketogluconat | - |
+ + : gut verwertet. | |
+ : ziemlich gut verwertet. | |
-: nicht verwertet. |
Der gemäß der Erfindung verwendete Stamm zeigt somit monopodiale Verzweigung, wobei die Spitze
seines Luftmycels spiralförmig ist. Die Konidien haben eine glatte Oberfläche. Der Stamm hat ein gelbes bis
lederfarbenes Wachstum auf synthetischen Medien im allgemeinen und erzeugt auf proteinhaltigen Medien
kein braunes lösliches Pigment.
Die vorstehenden Kultureigenschaften wurden mit den Beschreibungen in »Bergey's Manual of Determinative
Bacteriology«, 7. Auflage (The Williams and Wilkins, 1957), in »The Actinomycetes« von S.A.
Waksman, Band 2 (The Williams and Wilkins, 1962), und in »Systematik der Streptomyceten« von Ralph Hütter
(hs. Karugas, 1967) verglichen. Es wurde festgestellt, daß
der Stamm den Stämmen Streptomyces ambofaciens. Streptomyces platensis und Streptomyces hygroscopicus
ähnlich ist
Trotz der großen Ähnlichkeit in der Farbe sowohl des vegetativen Mycels als auch des Luftmycels unterscheiden
sich jedoch Streptomyces ambofaciens und der erfindungsgemäß verwendete Stamm dadurch, daß der
erstere keine schwarzen feuchten Flecken im Luftmycel hat daß er Gelatine in mittlerem Grad verflüssigt und
ein gelbes flockiges Wachstum im verflüssigten Teil bildet und daß er andere Kohlenstoffquellen als der
erfindungsgemäß verwendete Stamm verwertet. Streptomyces platensis unterscheidet sich von dem erfindungsgemäß
verwendeten Stamm dadurch, daß er ein tief olivfarbenes vegetatives Mycel auf Czapek-Agar
bildet, wobei die Rückseite der Kolonie mit der Zeit dunkel olivfarben wird, daß er ein cremefarbenes bis
stumpf-gelbliches Wachstum auf Stärkeagar ergibt, wobei sein Luftmycel die Farbe von Weiß nach
■-> Mausgrau mit schwarzen Flecken verändert, und daß er andere Kohlenstoffquellen als der erfindungsgemäß
verwendete Stamm verwertet. Ein Vergleich der Beschreibungen von Streptomyces hygroscopicus mit
den Kultureigenschaften des gemäß der Erfindung
ίο verwendeten Stammes zeigt, daß der letztere sich von
Streptomyces hygroscopicus dadurch unterscheidet, daß sein Wachstum oder die Rückseite der Kolonie die
hellgelbe Farbe bis Lederfarbe auf Czapek-Agar (einschließlich Glucose-Czapek-Agar und Glycerin-
r> Czapek-Agar), GIucose-Asparagin-Agar, Calciummaleatagar
und anderen Medien zeigt und ein gelblich-weißes bis gelbes Luftmycel auf diesen Czapek-Agarmedien
bildet. Viele Kultureigenschaften dieses Stammes fallen jedoch mit den stabilen Eigenschaften von
Streptomyces hygroscopicus zusammen, die von Tresner und Backus (Applied Microbiology, Band 4, Seite
243, 1956) angegeben werden. Demgemäß wurde von der Anmelderin der erfindungsgemäß verwendete
Stamm als eine Abart von Streptomyces hygroscopicus identifiziert und als Streptomyces hygroscopicus var.
limoneus bezeichnet.
Die Gattung Streptomyces hat das allgemeine Merkmal, daß ihre mikrobiologischen Eigenschaften
äußerst mutativ sind, und Streptomyces hygroscopicus
jo var. limoneus ist keine Ausnahme von dieser Regel.
Beispielsweise lassen sich seine Kultureigenschaften und die Art der Verwertung von Kohlenstoffquellen
leicht ändern, und es können zahlreiche Mutanten vorhanden sein. Insbesondere lassen sich von diesem
jrj Stamm leicht Mutanten erhalten, die ein gelbes
Luftmycel haben. Diese Mutanten können jedoch ebenfalls für die Zwecke der Erfindung verwendet
werden, soweit sie die Fähigkeit haben, Antibiotika der Validamycingruppe zu bilden. Es spielt natürlich keine
Rolle, ob die Mutation spontan oder künstlich induziert wird. Für die Zwecke der Erfindung sind diese Mutanten
mit den vorstehend genannten Stämmen völlig gleichwertig.
In das für die Zwecke der Erfindung verwendete Nährmedium werden assimilierbare Kohlenstoffquellen,
verwertbare Stickstoffquellen, anorganische Salze u.dgl. einbezogen. Gegebenenfalls können Spurenelemente,
z. B. Spurennährstoffe, Wachstumsfaktoren, Vorstufen usw, dem Kulturmedium zugesetzt werden.
so Zu den Kohlenstoffquellen, die der die Antibiotika der
Validamycingruppe bildende Stamm assimiliert, gehören u.a. Kohlenwasserstoffe; Glucose, Saccharose,
Melasse, Stärke, Dextrin und Glycerin. Als Stickstoffquellen eignen sich beispielsweise organische Stickstoffverbindungen
wie Fleischextrakt, Sojabohnenmehl, Maisquellwasser, Pepton und Casein sowie anorganische
Stickstoffverbindungen wie Nitrate und Ammoniumverbindungen, die sämtlich vorteilhaft verwendet
werden können.
Die Kultivierung kann als Oberflächenkultur durchgeführt werden, jedoch ist es üblicher, die aerobe
Submerskultur anzuwenden. Bei der Submerskultur wird der pH-Wert des Mediums vorteilhaft in der Nähe
des Neutralpunktes gehalten. Das Wachstum findet bei
b5 Bebrütungstemperaturen von 20 bis 40° C statt jedoch
wird das Medium vorzugsweise im Bereich von etwa 23 bis 37° C gehalten. Die Anreicherung des gewünschten
Antibiotikums ist in 4 bis 7 Tagen beendet
Die Antibiotika hemmen nicht das Wachstum von Bakterien und Pilzen beim in-vitro-Test, sondern
verursachen nur bei Pellucularia sasakii und seinen eng verwandten Pilzen eine anomale Verzweigung (übermäßige
Verzweigung, oder verzweigte Hyphen nehmen eine doldenartige Form an) an den Spitzen der Hyphen.
Daher sollte die biologische Austestung der Antibiotika wie folgt vorgenommen werden:
Pellicularia sasakii wird als Testorganismus und reines Agar als Nährmedium für den Test verwendet. Der
Testorganismus wird mil einer K;iru>fl'el-(Saech;irose)
Agarpliiitc 2 bis 5 Tage kultiviert. Die erhaltene Kultur
wird verwendet, um in der Mitte einer 9-em-Pcirisehale
eine Platte von modifiziertem Pfeffer-Medium zu impfen. Dieses Medium wird dann 2 Tage bei 27 C
bebrütet. Nach dieser Zeit hat sich das Mycel über die gesamte Oberfläche der Platte ausgebreitet. Das
Wachstum bis am Umfang eines Kreises mit einem Radius von etwa 3 bis 3,5 cm von der Mitte wird mit
einem Bohrer herausgeschnitten und die hierbei erhaltene Agarscheibe als Impfmaterial verwendet.
Eine Verdünnungsreihe von Agarplatten, die unterschiedliche Konzentrationen der Antibiotika enthalten,
wird nach der üblichen Agarverdünnungsmethode hergestellt.
Eine Glasscheibe von 8 mm Durchmesser und etwa 0,2 mm Dicke wird in der Mitte jeder Agarplatte der
obengenannten Verdünnungsreihe gelegt, und die als Impfmaterial dienende Agarscheibe wird dann auf die
Glasscheibe gelegt. Nach Bebrütung für 40 Stunden bei 27° C wird der Versuch ausgewertet. Eine Betrachtung
mit dem bloßen Auge zeigt, daß bei Pellicularia sasakii die Spitze der Hypen des Testorganismus, der auf der als
Impfmaterial dienenden Agarscheibe wächst, eine anomale Verzweigung erfährt. Die Verdünnungseinheit
stellt den Wert der maximalen Verdünnung dar, die eine solche anomale Verzweigung hervorbringt. Eine wäßrige
Lösung, die 1000 y/ml der gereinigten Validamycine C, D, E und F und Validoxylamine A und B enthält, zeigt
100, 10, 80 000, 80 000, 100 bzw. 10 Verdünnungseinheiten/ml.
Das bei diesem Test verwendete modifizierte Pfeffer-Medium hat folgende Zusammensetzung:
Saccharose | 3% |
L-Asparagin | 0,2% |
Ammoniumnitrat | 0,3% |
Kaliumdihydrogenphosphat | 0,1% |
Magnesiumsulfat | 0,1% |
Eisen-Natrium-Chelat von | |
N-(2-Hydroxyäthy])-äthylendiamin- | |
triessigsäure | 0,001 |
Agar | i,2% |
Eingestellt auf pH 7 |
Vor dem Gebrauch werden die folgenden Vitamine in den genannten Mengen zugesetzt (Gewicht pro ml
Medium):
Thiamin | ly/ml |
Riboflavin | ly/ml |
Calciumpantothenat | ly/ml |
Niacin | ly/ml |
Biotin | 0,005 y/ml |
Folsäure | 0,5y/mI |
Pyridoxinhydrochlorid | 2 y/ml |
p-Aminobenzoesäure | 04 y/ml |
Cyancobalamin | 0,0002 y/ml |
Wenn Streptomyces hygroscopicus var. limoneus in der oben beschriebenen Weise kultiviert wird, werden
die Antibiotika gebildet und hauptsächlich in der Flüssigphase des Fermentationsmediums angehäuft. Zur
■-, Gewinnung dieser Antibiotika ist es daher zweckmäßig,
das Fermentalionsmedium zu filtrieren und dann die Antibiotika vom erhaltenen Filtrat abzutrennen. Wenn
der verwendete Mikroorganismus nur eines der Antibiotika zu bilden vermag, kann das gebildete
ίο Antibiotikum natürlich in üblicher Weise vom Fermentationsmedium
abgetrennt werden. Wenn jedoch der verwendete Mikroorganismus gleichzeitig zwei oder
mehrere der Mikroorganismen zu bilden vermag, werden diese gleichzeitig im Fermentationsmedium
ι -, angehäuft, so daß diese Antibiotika vom Fermentationsmedium als Gemisch oder einzeln abgetrennt werden
können.
Zur Isolierung der Antibiotika können übliche Methoden der Isolierung von Metaboliten von Mikroorganismen
von ihren Fermentationsmedien allein oder in Kombination angewendet werden. Beispiele solcher
Methoden sind die Filtration, Konzentrierung, lonenaustauschchromatographie
mit Ionenaustauschern, Adsorptionschromatographie an Aktivkohle, Kieselgel oder Aluminiumoxyd, Gelfiltration mit Sephadex®,
Bio-Gel®-P, Verwendung verschiedener Lösungsmittel zur Überführung des Gelösten in eine andere Flüssigphase,
Ausfällung, Entfernung von Verunreinigungen, Dialyse, Trocknung und UmkristaHisatior·.
u) Für die Abtrennung und Reinigung der Antibiotika
von Verunreinigungen werden beispielsweise seine Wasserlöslichkeit und basischen Eigenschaften ausgenutzt.
Während beispielsweise wasserlösliche Verunreinigungen von niedrigerem Molekulargewicht nicht
r, adsorbiert werden, können die Antibiotika an Aktivkohle
adsorbiert und mit einem angesäuerten wäßrigen Alkohol und/oder wäßrigem Aceton eluiert werden.
Die Antibiotika werden an Anionenaustauscherharzen stark adsorbiert, auch wenn sie sich in neutraler
oder schwach sauerer Lösung befinden, und mit einer gepufferten basischen Lösung oder einer wäßrigen
Salzlösung eluiert.
Zu den vorstehend genannten Salzen gehören nicht nur die Alkalisalze starker Säuren, z. B. Natriumchlorid
und Ammoniumchlorid, sondern auch die Alkalisalze von organischen Säuren, z. B. Natriumacetat und
Ammoniumacetat, sowie die Salze schwacher Säuren oder schwacher Basen, z. B. die Salze von Essigsäure
und Pyridin.
-,ο Die Antibiotika können auch an starken Anionenaustauscherharzen
schwach adsorbiert und mit Wasser eluiert werden.
Ais lonenaustauschharze (stark oder schwach), die für
den obengenannten Zweck verw endet werden können, eignen sich beispielsweise die Produkte der Handelsbezeichnung
Amberlite® IR-100, 112 und 120, Amberlite®
XE-69, Amberlite® IRC-50, Amberlite® XE-89, Amberlite® XE-64, Amberlite® IR-45 und IRA-900, Dowex®-
5OW χ 2, Dowex®-1 χ 2, Dowex®-1 χ 8, Duolite® CS-65.
Diese Harze können nach Verfahren hergestellt
werden, die in »Ion Exchange Resin« (Robert Kumin,
Verlag John Wiley, New York, Seiten 87-97) beschrieben werden.
Die Antibiotika werden durch Ionenaustauschchromatographie
unter Verwendung von Kationen- und Anionenaustauscherharzen abgetrennt Beispielsweise
werden die rohen Validamycine bei einer typischen Säulenchromatographie für präparative Zwecke an
Il
einer Säule des Harzes Dowex®-1 χ 2 (OH-Form, 0,074 bis 0,149 mm, 870 ml) Chromatographien. Die Säule
wird mit Wasser entwickelt, wobei die 6 Komponenten Validoxylamin A und B und Validamycin D, C, F und E in
dieser Reihenfolge bei der Elution von der Säule erhalten werden. Fraktionen, die reich an Validamycin
sind, und eine Fraktion, die hauptsächlich Validamycin D enthält, werden erneut an einer Kieselgelsäule (Elution
mit n-Propanol, Essigsäure und Wasser 4:1 : 1) und einer Säule von Dowex®-50W χ 2 (Elution mit Pyridin-Essigsäure-Puffer,
pH 6,0) Chromatographien. Die Validamycine E und F werden an der Säule des Harzes
Dowex®-1 χ 2 auf Grund ihrer hohen Affinität zum Harz länger zurückgehalten und zeigen einen ziemlich
diffusen Elutionsverlauf beim Ablauf durch Gefälle. Die vollständige Abtrennung der Validamycine E und F wird
an der Säule von Dowex®-1 χ 2 nicht erreicht. Die durch Chromatographie an Dowex®-1 χ 2 erhaltenen Fraktionen,
die reich an Validamycin E sind, und die hierbei erhaltenen Fraktionen, die reich an Validamycin F sind,
werden an einer Säule von Dowex®-50W χ 2 weiter Chromatographien (Elution mit Pyridin-Essigsäure-Puffer,
pH 6,0). Bei dieser Chromatographie enthalten die zu Beginn ablaufenden Fraktionen Validamycin F.
Anschließend wird Validamycin E eluiert.
Abschließend werden die chromatographisch homogenen Valid:imycine C. D, E und F durch erneute Chromatographie an Dowex®-lx2 (OH-Form, Entwicklung mit Wasser) erhalten. Validoxylamin A wird unmittelbar vor dem Validamycin D an einer Säule von Dowex®-1 χ 2 eluiert. Durch Kristallisation aus Wasser-Äthanol wird reines Validoxylamin A erhalten. Obwohl sich Validoxylamin B und Validamycin D bei der Chromatographie an Dowex®-! χ 2 fast überschneiden, lassen sich diese Komponenten an einer Säule von Dowex®-50W χ 2 leicht trennen (Elution mit Pyridin-Essigsäure-Puffer. pH 6,0).
Abschließend werden die chromatographisch homogenen Valid:imycine C. D, E und F durch erneute Chromatographie an Dowex®-lx2 (OH-Form, Entwicklung mit Wasser) erhalten. Validoxylamin A wird unmittelbar vor dem Validamycin D an einer Säule von Dowex®-1 χ 2 eluiert. Durch Kristallisation aus Wasser-Äthanol wird reines Validoxylamin A erhalten. Obwohl sich Validoxylamin B und Validamycin D bei der Chromatographie an Dowex®-! χ 2 fast überschneiden, lassen sich diese Komponenten an einer Säule von Dowex®-50W χ 2 leicht trennen (Elution mit Pyridin-Essigsäure-Puffer. pH 6,0).
Unter Anwendung der vorstehend beschriebenen Verfahren lassen sich die Validamycine C, D, E und F
und die Validoxylamine A und B erfolgreich aus einem Fermentationsmedium von Streptomyces hygroscopicus
var. limoneus isolieren.
Die Validamycine C, D, E und F fallen als weißes Pulver an und bilden durch Hydrolyse Validoxylamin
Α-Glucose und Validoxylamin D-Glucose. Diese Antibiotika umerscheiden sich jedoch in der Molekülstruktur,
d. h. in der Konfiguration der Glycosidbindungen in den D-Glucosekomponenten (λ- oder ^-Konfiguration)
und in den Stellungen und in der Zahl der D-Glucosemoleküle.
Die Validamycine C, D, E und F haben die folgenden physiklischen und chemischen Eigenschaften:
1. Strukturformel
a) Validamycin C
11
R-NH
\ OH H HOH2CXl
OH H A
H I H OH
OH H
, HOH2Cx
H V0 \/ OH
H V0 \/ OH
0-ί!'-D-Glucopyraπosyl-3-hydroxymethyl-4,5,6-trihy(^rnvy-2-cyc!ohexenylgruppe.
b) Validamycin D
OH
NH-R1
H OH
1: O-ff-D-GlucopyTanosyl-l^^trihydroxy-S-hydroxymethylcyclohexylgruppe.
13
14
c) Validamycin E HOCH,
d) Validamycin F
H
H
R3-NH
H HOH2C OH H
OH
OH
O —R2
R:: O-a-D-Glucopyranosyl-O-jS-D-glucopyranosyl- R3: O-a-D-GlucopyranosyW-hydroxymethyM^o-tri-
gmppe. hydro xy-2-cyclohexeny !gruppe.
2. Schmelzpunkte bzw. Zersetzungspunkte
Keines der Antibiotika Validamycin C, D, E und F hat einen scharfen Schmelzpunkt, jedoch werden sie bei den folgenden
Temperaturen allmählich zersetzt:
Validamycin C 142° bis 160° C
Validamycin D 125° bis 130° C
Validamycin E 263° bis 268° C
Validamycin F 165° bis 173° C
3) Die Elementaranalyse und die daraus berechneten optischen Molekularformen, die pKa'-Werte, die Neutralisations- genannt,
äquivalente (Molekulargewicht) und die Werte der
Drehung sind nachstehend in Tabelle
Physikalische und chemische Eigenschaften der Validamycine C bis F
Verbin | Berechnete | Mole | Elenientaranalysc. | 46,48 | 0/ | 46,08 | Optische | pKa' | Rf- | Zahl der |
dung | Molekular | kular | 7,22 | 6,99 | Drehung | Neulralisa- | Wcrt**) | D-GIucosc- | ||
formel | gewicht | 2,15 | 2,07 | [a] | tionsäqui- | (Kicsel- | einheiten | |||
46,97 | 46,60 | Z)(H2O) | valent in | gclG) | und Bin | |||||
7,23 | 7,24 | wäßriger | dungsart***) | |||||||
2,58 | berechnet | 2,72 | Lösung | |||||||
Valid | C2(,H45NO1SH2O | 677,7 | 46,22 | C | 46,08 | 6,0 ± 0,2 | 0,15 | 2 a- und | ||
amycin | (659,7)*) | 7,19 | H | 7,02 | (680 ±30) | ß-Bin | ||||
C | 1,94 | N | 2,07 | dungen | ||||||
D | C2nH35NO13H2O | 515,5 | gefunden | 46,00 | C | 46,08 | + 169,3° | 6,0 ± 0,2 | 0,24 | 1 »-Bin |
(497,5)*) | C | 6,90 | H | 7,02 | (520 ±30) | dung | ||||
H | 1,95 | N | 2,07 | |||||||
E | C,(,HJ5NOISH2O | 677,7 | N | C | + 148,2° | 6,1 ±0,2 | 0,15 | 2 a- und | ||
(659,7)*) | C | H | (660 ±30) | /(-Bin | ||||||
H | N | dungen | ||||||||
F | C211H4^NO1xH2O | 677,7 | N | C | + 130,7° | 6,1 ±0,2 | 0,15 | 2 a- und | ||
(659,7)*) | C | II | (680 + 30) | Ji-13 in | ||||||
H | N | dungen | ||||||||
N | ||||||||||
C | ||||||||||
H | ||||||||||
N |
*) Die Klammcr/uhlen bezeichnen das empirische Molekulargewicht, berechnet unter Ausschluß von H2O.
**) Dünnschichtchromalographte: limwicklcrlösungsmiuel: n-Propanol-l:ssigsäure-Wasscr = 4:1:1.
'"") Berechnet aus der Spin-spin-K upplungskonslanle und dem Wert der optischen Drehung.
15
4. UV-Absorptionsspektrum
Bei Messung in wäßriger Lösung zeigen die Validamycine C, D, E und F keine charakteristischen
Absorptionsmaxima im Ultraviolettbereich des Spektrums oberhalb von 210 πιμ mit Ausnahme von
Endabsorptionen.
5. Infrarotspektrum (F i g. 1 bis 4)
Die Absorptionsspektren der Validamycine C, D, E und F, gemessen als KBr-Preßling, sind in F i g. 1 bis 4
dargestellt Diese Abbildungen zeigen, daß die Absorptionsspektren sich sehr ähnlen. Diese Antibiotika haben
die folgenden Hauptabsorptionen:
(stark), 2910 (mi ttel),
(mittel), 1410(mittel),
(stark), 1025 (stark),
(mittel), 845 (mittel).
(mittel), 1410(mittel),
(stark), 1025 (stark),
(mittel), 845 (mittel).
6. Löslichkeit
Alle diese Antibiotika sind in Wasser leicht löslich und in Pyridin, Dimethylformamid und Dimethylsulfoxyd
löslich.
In Methanol ist Validamycin D löslich, aber Valdiamycin C, E und F sind schwerer löslich.
7. Farbreaktionen
Alle diese Antibiotika ergeben positive Reaktionen bei den Tests mit Perjodsäure-Benzidin-Reagens und
Greig-Leaback-Reagens (tert-Butylhypochloritreagens),
aber negative Reaktionen bei den Sakaguchi- und Elson-Morgan-Tests.
Alle Antibiotika gemäß der Erfindung zeigen ferner positive Reaktionen bei den Tests mit Anfhron,
Orcin-Schwefelsäure und Naphthoresorcin-Schwefelsäure.
8. Salze
Die Validamycine C, D, E und F sind schwach basisch und bilden Salze mit Säuren (z. B. Salzsäure und
Schwefelsäure). Als Beispiele sind die Schmelzpunkte bzw. Zersetzungspunkte und die Elementaranalysen des
Hydrochlorids der Validamycine C, D, E und F in der folgenden Tabelle 3 angegeben.
Tabelle 3 | Zersetzungspunkte | Elementaranalyse | H 6,32 Cl 5,24 |
Verbindung | 115°-132 C | C 44,56 N 1,53 |
H 6,96 Cl 6,74 |
Validamycin C HCI |
113°-128 C | C 44,61 N 2,72 |
H 6,54 Cl 5,41 |
Validamycin D HCl |
141°-157 C | C 44,72 N 1,72 |
H 6,59 Cl 5,32 |
Validamycin E HCl |
146°-164 C | C 44,S3 N 1,95 |
|
Validamycin F HCI |
|||
9. Akute Toxizität der Antibiotika
Die Toxizität der Antibiotika kann beispielsweise ermittelt werden, indem sie Mäusen intravenös verabreicht
werden und die LD50 oder die mittlere Letaldosis (48 Stunden) für Oryzias latipes gemessen wird. Die
Ergebnisse dieser Messungen sind nachstehend in Tabelle 5 genannt.
Tabelle 5
Akute Toxizität
Akute Toxizität
Versuchstiere
Antibiotikum
Testmethode
Toxizität
Mäuse
Oryzias latipes
Validamycin C Validamycin D Validamycin E Validamycin F Validoxylamin A
Validoxylamin B
Validamycin C Validamycin D Validamycin E Validamycin F Validoxylamin Λ
Validoxvlamin B
Intravenöse
Injektion
Injektion
Einsetzen in
wäßriger Lösung
wäßriger Lösung
LD5n > 2000 mg/kg
LD50 > 2000 mg/kg
LD50 > 2000 mg/kg
LD50 > 2000 mg/kg
LD50 > 2000 mg/kg
LD50 > 2000 mg/kg
LD50 > 2000 mg/kg
LD50 > 2000 mg/kg
LD50 > 2000 mg/kg
LD50 > 2000 mg/kg
LD50 > 2000 mg/kg
TLn, > 1000 ppm
TL11, > 1000 ppm
TL11, > 1000 ppm
TLn, > 1000 ppm
TLn, > 1000 ppm
TLn, > 1000 ppm
TL11, > 1000 ppm
TL11, > 1000 ppm
TLn, > 1000 ppm
TLn, > 1000 ppm
TLn, > 1000 ppm
Biologische Eigenschaften
Bei Verwendung einer wäßrigen Lösung der Antibiotika gemäß der Erfindung (1 mg/ml) als Vorratslösung
wird eine anomale Verzweigung der Hyphenspitze von Pellicularia sasakii bei dem folgenden höchsten
Verdünnungsfaktor hervorgebracht:
Validoxylamin A
Validoxylamin B
Validamycin C
Validamycin D
Validamycin E
Validamycin F
Validoxylamin B
Validamycin C
Validamycin D
Validamycin E
Validamycin F
100
10
100
10
70 000-80 000
70 000-80 000
Die erfindungsgemäß hergestellten Antibiotika können zur Bekämpfung von Pflanzenkrankheiten verwendet
wenden. Zu diesem Zweck werden sie in Form des Fermentationsmediums eines die Antibiotika der
Validamycingruppe bildenden Stammes der Gattung
Streptomyces, des Filtrats dieses Mediums, seines Konzentrats oder eines gereinigten Präparats verwendet.
Es ist auch möglich, diese Antibiotika in Form von freien Basen oder als Salze mit geeigneten organischen
oder anorganischen Säuren (z. B. Oxalsäure, Bernsteinsäure, Schwefelsäure und Salzsäure).
Diese Präparate können in beliebiger geeigneter Weise angewendet werden. In Abhängigkeit vom
Zweck der Anwendung, der Anwendungszeit, der Anwendungsmethode usw. kann das Präparat unmittelbar
als solches, nach Auflösen oder Dispergieren in einem geeigneten flüssigen Träger oder nach Vermischen
mit einem geeigneten festen Träger angewendet werden. Gegebenenfalls können die Substanzen gemäß
der Erfindung durch Zusatz eines Emulgators, Dispergiermittels, Suspendiermittels, Adsorptionsmittels, Penetrationsmittels,
Netzmittels, Verdickungsmittel, Stabilisators und/oder Hilfsstoffes in verschiedenen Präparatformen,
beispielsweise in Form von Lösungen in öl, Emulsionen, netzbaren Pulvern, wäßrigen Lösungen,
löslichen Pulvern, Stäubemitteln, Tabletten, Granulat und Aerosolen zur Anwendung kommen.
Die Konzentration des Wirkstoffes in den gebrauchsfertigen Fungiziden gemäß der Erfindung beträgt
gewöhnlich etwa 0,0001 bis 0,5 Gew.-°/o, vorzugsweise etwa 0,0003 bis 0,3 Gew.-% bei flüssigen Präparaten
(d. h. Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen) und etwa 0,01 bis 30 Gew.-%, vorzugsweise etwa 0,1 bis 20
Gew.-%, bei festen Präparaten. Nach Bedarf können jedoch auch Präparate mit höherer oder niedrigerer
Konzentration verwendet werden. Bei der Herstellung in Konzentratform kann der Wirkstoffgehalt der
Konzentrate etwa 0,5 bis 80 Gew.-% betragen.
Die Zusammensetzungen einiger Fungizidpräparate, die Validamycine C, D, E und F enthalten, werden
nachstehend genannt.
Präparat 1 - Netzbares Pulver | 1,0% |
Validamycin C | 0,1% |
Natriumligninsulfonat | 0,1% |
Polyoxyäthylennonylphenyläther | 0,1% |
Weißkohle | 98,7% |
Ton | |
Je nach Anwendungszweck und -methode wird das vorstehende Präparat auf 2 bis 400 ppm Antibiotikum
verdünnt. Das verdünnte Präparat wird mit Sprühvorrichtungen auf den Boden aufgebracht oder das oben
beschriebene Pulver wird unverdünnt zum Umhüllen des Samens verwendet.
Präparat 2 - Tabletten
Validamycin E 15,0%
Polyoxyäthylennonylphenyläther 2,0%
Lactose 83,0%
Vor der Anwendung wird dieses Präparat auf die für ίο das Präparat 1 genannte Konzentration verdünnt
Präparat 3 — Wäßrige Lösung
Validamycin D 40,0%
Methanol 5,0%
Aluminiumstearat 5,0%
Wasser 50,0%
Dieses Präparat wird mit Wasser auf 1000 bis 200 000 ppm verdünnt Das verdünnte Präparat wird
id beispielsweise vom Flugzeug aus versprüht.
Präparat 4 — Emulgierbares Konzentrat
Validamycin F | 10,0% |
Polyoxyäthylennonylphenyläther | 5,0% |
Methanol | 20,0% |
Methylnaphthalin | 40,0% |
Dimethylformamid | 25,0% |
Vor der Anwendung wird dieses Gemisch auf die für das Präparat 1 genannte Konzentration verdünnt.
Präparat 5 — Gemischtes Stäubemittel A
Validamycin E 4,0%
Validamycin F 1,0%
Aluminiumstearat 0,02%
Talkum 94,98%
Das vorstehende Präparat wird unmittelbar als solches zur Umhüllung des Samens in einer Menge von
1 bis 50 Gcw.-%, bezogen auf den Samen, verwendet.
Versuch 1
Bekämpfung des Blattscheidenbrandes von Reis Versuchspflanzen
Kinmaze-Reispflanzen werden in Topfen von 9 cm
Durchmesser (3 Sämlinge pro Topf) kultiviert. Die Sämlinge werden 80 Tage nach dem Einpflanzen
getestet, wobei jeweils 6 Töpfe pro Behandlung verwendet werden.
Impfmethode
Pathogene Pilze Pellicularia sasakii werden 48 Stunden bei 300C auf einer Platte aus Kartoffel-Infusionszucker-Agar
kultiviert. Eine Agarscheibe von 10 mm Durchmesser wird aus einer peripheren Kolonie
ausgeschnitten. Die Scheibe wird in den Innenraum der Blattscheide in der Nähe der Bodenoberfläche eingesetzt,
und zwar jeweils eine Scheibe pro Pflanze. Die Töpfe werden unter einer PVC-Abdeckung bei der
normalen Umgebungstemperatur von 32 bis 25°C und bei einer relativen Feuchtigkeit von 100 bis 70%
gehalten. Die Impfung wird beim prophylaktischen Test unmittelbar nach der Trocknung des aufgebrachten
Präparats an der Luft und beim Bekämpfungstest 3 Tage vor der Anwendung vorgenommen.
stole in einer Menge "on 30 ml/6 Töpfe gleichmäßig über die Blätter gesprüht
Anwendung des Präparats
jedes Testpräparat wird mit Wasser bis zu der in Tabelle 3 genannten Konzentration des Wirkstoffes
verdünnt Die wäßrige Lösung wird mit einer Spritzpi-Bestimmungsmet'node
10 Tage nach der Anwendung des Präparats wurde die Länge jedes Stengels von Bodenhöhe bis zur
Oberkante der Läsion direkt gemessen.
Wirkung bei der Bekämpfung des Blattscheidenbrandes (mittlere Länge der Läsionen/Stengel/cm)
Konzentration des
Wirkstoffs in ppm
Wirkstoffs in ppm
Prävemivwirkung"). % Heilwirkung"), %
3 10 30 100 300 1 3 10 30
100
Schädigung
der Pflanze
300 (300 ppm)
der Pflanze
300 (300 ppm)
Validamycin C | 46 | 34 | 4 | 1 | 0 | — | 68 | 22 | 12 | 10 | V |
Validamycin D | 28 | 5 | 1 | 0 | 0 | - | - | 99 | 20 | 11 | 8 |
Validamycin E | 3 | 2 | 0 | 0 | 0 | 41 | 14 | 12 | 11 | 5 | 3 |
Validamycin F | 21 | 2 | 0 | 0 | 0 | 27 | 13 | 13 | 12 | 12 | 2 |
Validamycin E + Fft) | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 9 | 5 | 3 | 2 | 1 | 1 |
Validoxylamin A | 28 | 4 | 1 | 0 | 0 | - | 83 | 28 | 14 | 10 | 7 |
Validoxylamin B | 49 | 47 | 32 | 16 | 8 | - | - | 93 | 75 | 51 | 10 |
MAFA')
76 51
0 0 89 30
10
") Prozentuale durchschnittliche Länge der Läsion/Slcngel (cm) pro unbehandelle Kontrollpflunzc (34,4 cm).
h) Gemisch von Validamycin E (80%) und F (20%).
') Methylarsonsäure-Ammonium-Komplexsalz.
') Methylarsonsäure-Ammonium-Komplexsalz.
Versuch 2
Bekämpfung der Wurzelfäule der Gurke
Versuchsmethode
Versuchsmethode
Rhyzoctonia soiani wird auf Gerstenmedium 5 Tage
bei 280C kultiviert. Eine Bodenprobe des Feldes wird in
9-cm-Töpfe gefüllt, die dann mit Wasserdampf sterilisiert werden. Das Häcksel-Impfmaterial wird gleichmäßig
in die Oberschicht jedes Topfes bis zu einer Tiefe von etwa 3 cm in einer Menge von 2 g/Topf
eingearbeitet. Die Töpfe werden 4 Tage bei 28°C in einer Impfkammer gehalten und dann in ein Gewächshaus
überführt.
Anwendung des Präparats
Das Präparat wird wie beim Versuch 1 in einer Menge von 30 ml/6 Töpfe/Gruppe auf die Bodenoberfläche
gesprüht.
Testpflanze
Gesunde Gurkensamen (Sorte Yonyo) werden unmittelbar nach der Behandlung in einer Menge von 10
Samen/Topf in die Töpfe eingesetzt. Die Töpfe werden dann in einem Gewächshaus bei 32 bis 28°C gehalten.
Bestimmungsmethode
14 Tage nach dem Säen werden die Ergebnisse als Läsionskoeffizienten ermittelt. Ferner wird der Grad
der Schädigung berechnet.
Läsionskoeffizienten (I)
gesund nur die Haarwurzeln sind leicht angegriffen
Luftteile in der Nähe der Bodenoberfläche und Wurzeln sind angegriffen
Anfangsphase des Abfaulens
beider Keimung angegriffen;
Wachstum gehemmt
0:
0,5:
1:
2: 3: Grad der Schädigung (%) =
x 100
Hierin ist η die Zahl der Proben, die jedem
Läsionskoeffizienten entspricht, und N die Gesamtzahl der Pflanzen.
Tabelle 7 Wirkung der Bekämpfung |
der Wurzelfäule | Grad der Schädigung, % |
Schädigung der Pflanze |
Präparat | Konzentration des Wirkstoffs, ppm |
100 100 84 0 |
I III |
Unbehandelte VergleichHproben Validamycin C |
5 20 80 |
||
Fortsetzung | 22 1 | von 100 ml/6 | 8 | 648 | 22 | Konzentration | 100 | Impfmethode | |
21 | Ι*Γ;ι|>;ιι';ιΙ | des Wirkstoffs | 93 | Pathogene Pilze Cladosporium fulvum werden aul einer Kartoffelinfusions-Saccharoseplatte 14 Tage bei |
|||||
(inn! der Schädigung | ppm | 0 | 20° C kultiviert. Eine Suspension der Konidien | ||||||
Validamycin D | kon/cnlralinn | ppm Schädigung. "■· der I'liiin/e | 10 | (5 xl OVmI) wird aus der Kultur hergestellt. Die | |||||
ilcs W Ii kslol'ls. | 0 | Pflanzen werden mit der Suspension 3 Tage vor der | |||||||
5 | 50 | 0 | Anwendung des Präparates in einer Menge von | ||||||
Validamycin E | 20 | 50 | 80 | 5 ml/Topf besprüht. Die Töpfe werden 24 Stunden in | |||||
80 | 0 | einer Impfkammer bei 25°C gehalten und dann in ein | |||||||
5 | 0 | Gewächshaus überführt. | |||||||
Validamycin F | 20 | 7 | Bewertung | ||||||
80 | 0 | 14 Tage nach der Infizierung wird das spezifische | |||||||
5 | 0 | Verhältnis der durchschnittlichen Läsionsfläche in den | |||||||
Validamycin (E + F) | 20 | 84 | Blättern gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 | ||||||
80 | 6 | genannt | |||||||
5(4+ 1) | 0 | ||||||||
Validoxylamin A | 20(16 + 4) | 100 | |||||||
80(64+ 16) | 100 | Spezifische Schädigung | |||||||
5 | 75 | Fläche der Läsion der Pflanze | |||||||
Validoxylamin B | 20 | 100 | |||||||
80 | 100 | 98 | |||||||
5 | 100 | ||||||||
Pentachlomitrobenzol | 20 | 18 | |||||||
80 | 25 | ||||||||
5 | |||||||||
Versuch 3 | 20 | ||||||||
80 | |||||||||
40 | |||||||||
Bekämpfung der Braunfleckigkeit der Tomate | |||||||||
Testpflanzen | |||||||||
4") | |||||||||
Tomatenpflanzen (Sorte Ponterosa) werden in Töpfe | |||||||||
von 12 cm Durchmesser gepflanzt (1 Pflanze/Topf). Die | |||||||||
Sämlinge werden 50 Tage nach dem Pflanzen | |||||||||
verwendet. Je 6 Töpfe bilden eine Gruppe. | 50 | ||||||||
Anwendung des Präparats | |||||||||
Wie bei Versuch 1 in einer Menge | Bekämpfung der Braunfleckigkeit der Tomate | ||||||||
Töpfe/Gruppe. | Präparat | ||||||||
Tabelle 8 | |||||||||
Unbehandelte | |||||||||
Vergleichspflanzen | |||||||||
Validamycin C | |||||||||
Validamycin D |
■ortsL't/uim
ΙΊ.ιρ.ιι.ιΐ
Validamycin 1£
Validamycin F
Validamycin (E +
Validoxylamin A
Validoxylamin B
Validamycin F
Validamycin (E +
Validoxylamin A
Validoxylamin B
22 | 1 | 8 | 648 | c/iIim. Ik | 24 | |
κ Ik· ik-i I .ι | Si ll.lllllMIH | |||||
Kuli/- | : 111 μ I η | HI | S|' | Mi.Il tU-l I'll. Ill/ | ||
ill.· s W | llkslo | IK | I I. | _ | ||
50 | 2 | - | ||||
50 | 3 | - | ||||
50 | 2 | - | ||||
50 | 6 | _ | ||||
50 | 36 | |||||
") Gemisch von Validamycin I: (80%) und I- (20%).
In den folgenden Beispielen werden die Herstellung der Antibiotika und die für die Analyse bei den
beschriebenen Versuchen verwendeten Flüssigkeitschromatographie-Apparaturen beschrieben. Für die
Trennung und Zuführung wird die Apparatur »JLC-BC2«, Hersteller Japan Electronics Co., Ltd., verwendet.
Für den Nachweis der aktiven Verbindungen mit negativer Reaktion beim Orcin-Schwefelsäuretest wird
das Differentialrefraktometer Modell R 403 (Water Associates, Inc.) verwendet. Die folgenden Bedingungen
wurden angewendet:
Analyse I
Analysensäule
Analysensäule
Säule von 70 cm Länge und 8 mm Innendurchmesser, gefüllt mit dem Harz »AG 1 χ 2« (37-74 μ, OH-Form,
BIO-RAD-Laboratory).
Elutionsmittel
Wasser, Durchflußmenge 0,37 ml/Minute.
Wasser, Durchflußmenge 0,37 ml/Minute.
Analyse II
Analysensäule
Analysensäule
Säule von 15 cm Länge und 8 mm Innendurchmesser,
gefüllt mit dem Harz »Jeol Resin LCR-3 (Japan Electronics, Ionenaustauscherharz in der Sulfatform).
Elutionsmittel
(I) 0,25-molarer Boratpuffer (pH 9,0), Durchflußmenge
0,49 ml/Minute; (II) 0,15-molarer Boratpuffer (pH 7,7), Durchflußmenge 0,49 ml/Minute. Zum Nachweis
der Verbindungen, die negative Orcin-Schwefelsäure-Tests ergeben, wurde beispielsweise das Differentialrefraktorr.eter
der Water Associates verwendet
Die gaschromatographischen Messungen wurden mit einem Gaschromatographen Modell 063 (Hitachi, Ltd.)
und einem Yanaco-Gaschromatographen Modell 5DH (Yanagimeto Co., Ltd.) durchgeführt.
Die Proben wurden wie folgt hergestellt: Eine trockene Probe (einige mg), die die Komponenten des
Validamycinkomplexes enthielt wurde in trockenem Pyridin (0,5 ml) gelöst. Als innerer Standard wurde
Melezitose (0,5 mg) der Lösung zugesetzt Dann wurden Trimethylchlorsilan (0,5 ml) Bis-(trimethylsilyl)-acetamid
(0,5 ml) zugegeben. Das Gemisch wurde 20 Minuten der Reaktion bei 70" C überlassen. Das
Reaktionsprodukt wurde in die öaschromatographiesäule
eingespritzt
Mit der Kolonne können gute Trennungen erzielt werden, wenn beispielsweise »Chromosol b"W AW
DMCS« (Johns-Manville Co.) oder »Chromosol b"G
AW DMCS« (Johns-Manville Co.) als stationäre Phase und beispielsweise »Silicone OV-I, OV-17« (1—5%)
(Ohio Valley Specialty Chemical Co.) als flüssige Phase in einer Glaskolonne (1 — 2 m) verwendet werden. Die
Temperatur der Kolonne wird bei 250 bis 300° C
gehalten.
Zu einer auf pH 7 eingestellten wäßrigen Lösung, die 3% Glucose, 2,2% rohes Sojabohnenmehl und 0,3%
jo Pepton enthält, werden 0,4% gefälltes Calciumcarbonat
gegeben. Je 500 ml der Lösung werden in 4 Kolben von 2 1 Fassungsvermögen gegeben. Nach der Sterilisation
wird jeder Kolben mit einer Impfnadelmenge von Streptomyces hygroscopicus var. limoneus aus seiner
Schrägkultur geimpft Die Kolben werden 2 Tage bei 28° C auf einer hin- und hergehenden Schüttelvorrichtung
bebrütet.
Getrennt hiervon werden in 200-1-Tank aus nichtrostendem
Stahl 1001 eines Mediums (pH 7,0) gegeben, das aus einer wäßrigen Lösung besteht, die 5% Glucose,
3,6% rohes Sojabohnenmehl, 0,5% Pepton und 0,6% gefälltes Calciumcarbonat enthält. Nach der Sterilisation
werden in den Tank 2 1 der oben beschriebenen Impfkultur gegeben, worauf 114 Stunden bebrütet wird.
Hierbei werden 68 1 eines Kulturfiltrats erhalten, das den Validamycinkomplex in einer Menge von 10 000
Verdünnungseinheiten/ml enthält
Eine auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise erhaltene Kultur (950 1) von Streptomyces hygroscopicus
var. limoneus (IFO-12 703) wird mit Oxalsäure auf einen pH-Wert von etwa 4,0 eingestellt und nach Zusatz
eines Filterhilfsmittels filtriert. Das erhaltene Filtrat (720 1) wird durch eine Säule von 120 1 des Ionenaustauscherharzes
Amberlite® 1R-120 (OH-Form) geleitet Diese Säule wird mit Wasser (2401) gespült Die
Waschflüssigkeit wird mit dem Ablauf vereinigt Die Flüssigkeit wird durch eine Säule geleitet die 1401 des
Ionenaustauscherharzes Amberlite® IR-45 (OH-Form)
enthält und dann auf eine Säule aufgegeben, die 60 1 des lonenaustauscherharzes Dowex® 5OW χ 2 (H-Form)
enthält Die letzte Säule wird mit Wasser gewaschen und mit wäßrigem O,5n-Ammoniak eluiert Die aktiven
i,5 Fraktionen werden vereinigt und unter vermindertem
Druck eingeengt
Das Konzentrat (40 1) wird an einer Säule (die 301 des
lonenaustauscherharzes Amberlite® IRA-900 (OH-
Form) enthält, Chromatographien, wobei Wasser als Elutionsmittel verwendet wird. Jede Fraktion wird
durch Dünnschichtchromatographie (Kieselgel G, Entwickler n-Propanol-Essigsäure-Wasser = 4 : 1 : 1), Gaschromatographie
und Flüssigkeitschromatographie analysiert. Die aktiven Verbindungen werden in der
folgenden Reihenfolge eluiert: Validoxylamin A und B, Validamycin D, C, F und E. Jede Fraktion wird zur
Konsistenz eines Sirups eingeengt, worauf Aceton zugesetzt wird. Hierbei werden insgesamt 1,1 kg des 1»
Validamycinkomplexes als rohes Pulver erhalten.
Die von dem Harz Amberlite® IRA-900 bei dem in Beispiel 2 beschriebenen Versuch eluierten einzelnen |-,
Fraktionen, die Validamycin C D. E und F und Validoxylamin A und B enthalten, werden unter
vermindertem Druck zur Konsistenz eines Sirups eingeengt, worauf Aceton zur Ausfällung der aktiven
Komponenten zugesetzt wird. Hierbei werden insge- 2» samt 1,1 kg des rohen Validamycinkomplexes als Pulver
erhalten. In 21 Wasser werden 400 g dieses rohen Pulvers gelöst. Die Lösung wird an einer 22 1 des Harzes
Dowex® 1x2 (OH-Form) enthaltenden Säule unter Verwendung von Wasser als Elutionsmittel chromatographiert.
Jede Fraktion wird durch Dünnschichtchromatographie und Gaschromatographie analysiert. Die
Validoxylamiiie A und B und Validamycin D rinden sich
in den Fraktionen von 25 bis 55 1, Validamycin A in den Fraktionen von 75 bis 115 1, die Validamycine B und C in jo
den Fraktionen von 135 bis 275 1 und die Validamycine E und F in den Fraktionen von 325 bis 7601. Jede Gruppe
von Fraktionen wird aufgefangen und unter vermindertem Druck eingeengt, worauf Aceton zugesetzt wird,
wodurch weiße Pulver ausgefällt werden. Hierbei werden 42,8 g eines weißen Pulvers, das überwiegend
aus Validamycin D besteht, 179,2 g eines weißen Pulvers, das überwiegend aus Validamycin A besteht,
42 g eines weißen Pulvers, das hauptsächlich aus den Validamycinen B und C besteht, und 5,6 g eines weißen <io
Pulvers, das hauptsächlich die Validmycine E und F enthält, erhalten.
Eine Menge von 10 g des auf die in Beispiel 3 beschriebene Weise erhaltenen rohen Produkts, das
verhältnismäßig reich an Validamycin D ist, wird an einer Säule von 700 ml des Harzes Dowex® 1 χ 2
(OH-Form, 74 bis 149 μ) Chromatographien. Das Eluat
wird mit einem Differentialrefraktometer untersucht Jede Fraktion wird durch Gaschromatographie identifiziert
und auf Reinheit geprüft. Hierbei wird festgestellt, daß Validoxylamin A in den Fraktionen von 0,8 bis 2,01
und Validoxylamin B und Validamycin D in den Fraktionen von 1,6 bis 2,01 enthalten sind. Das
Validoxylamin A enthaltende Eluat wird unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft, wobei 2,0 g
eines weißen Pulvers erhalten werden. Das Validamycin D und Validoxylamin B enthaltende Eluat wird unter
vermindertem Druck zur Trockene eingedampft, wobei 4,6 g eines weißen Pulvers erhalten werden.
Das Pulver wird in einem 0,1-molaren Pyridln-Acetat-Puffer (pH 6,0) gelöst Die Lösung wird auf eine Säule
von 700 ml des Harzes Dowex® 5OW χ 2 aufgegeben, wobei mit der vorstehend genannten Pufferlösung
gepuffert wird. Die Säule wird mit der gleichen Pufferlösung eluiert, wobei Validoxylamin B in den
Fraktionen von 1,5 bis 2$ 1 und Validamycin D in den
Fraktionen von 7,5 bis 8.5 I eluiert werden. Jede Fraktion wird unter vermindertem Druck eingeengt. Das
Konzentrat wird an einer Säule von 100 ml des Harzes Dowex® 1 χ 2 (OH-Form) unter Verwendung von
Wasser als Elutionsmittel gereinigt.
Das Eluat wird unter vermindertem Druck eingeengt. Zum Konzentrat wird Aceton gegeben, wobei 0,7 g
Validoxylamin B und 3,2 g Validamycin D jeweils als weißes Pulver ausgefällt werden.
Um Validamycin D in hoher Reinheit zu erhalten, wird das erhaltene rohe Produkt durch ChOtnatographie
an Kieselgel (Merck, 0,05 bis 0,20 mm; n-Propanol-Essigsäure-Wasser
= 4 : 1 : 1) und am Harz Dowex® 5OW χ 8 (Elutionsmittel 0,1 -molarer Pyridin-Acetat-Puffer,
pH 6,0) gereinigt. Abschließend wird das Produkt mit dem Harz Dowex® 1x2 (OH-Form) unter
Verwendung von Wasser als Elutionsmittel weiter gereinigt.
Durch Hydrolyse mit einer Säure ergibt das Validamycin D je 1 Mol Validoxylamin A und
D-Glucose.
Eine Menge von 15 g des gemäß Beispiel 3 erhaltenen rohen Produkts, das verhältnismäßig reich an Validamycin
B und C ist, wird an einer Säule (3,5 χ 95 cm) von
870 ml des Harzes Dowex® 1 χ 2 (OH-Form, 74 bis 149 μ) unter Verwendung von Wasser als Elutionsmittel
Chromatographien. Jede Fraktion wird durch Dünnschichtchromatographie (Kieselgel G; n-Propanol-Essigsäure-Wasser
= 4 :1 :1; Farbreagens Naphthoresorcin) oder Gaschromatographie analysiert. Validamycin
A (Ausbeute etwa 5,0 g) fällt in dem Eluat an, das etwa dem 5- bis 7fachen Volumen des Harzes entspricht.
Validamycin C (Ausbeute etwa 0,2 g) wird in dem Eluat erhalten, das etwa dem 10- bis 20fachen Harzvolumen
entspricht. Validamycin B (Ausbeute etwa 6,0 g) wird in dem Eluat erhalten, das etwa dem 12- bis 18fachen
Harzvolumen entspricht.
Da das rohe Pulver, das in der oben beschriebenen Weise erhalten worden ist, überwiegend aus Validamycin
C besteht, jedoch noch eine geringe Menge Validamycin B enthält, wird es wie folgt weiter
gereinigt:
1,0 g des Pulvers wird an einer Säule (1,3 cm χ 90 cm,
200 ml) Kieselgel (Merck, 0,05 bis 0,2 mm) unter Verwendung von n-Propanol-Essigsäure-Wasser
(4:1:1) als Entwickler Chromatographien. Von den erhaltenen Fraktionen werden diejenigen, bei denen die
Naphthoresorcin-Reaktion positiv ist, durch Dünnschichtchromatographie
bestätigt Die Fraktionen, die Validamycin C allein enthalten, werden aufgefangen und
zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird weiterhin am Harz Dowex® 5OW χ 2 (Pyridinform)
adsorbiert und mit ln-Pyridin-Acetat-Puff er (pH 6,5)
eluiert. Die Fraktionen, bei denen der Naphthoresorcin-
test positiv ist, werden aufgefangen und unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft, wobei
Validamycin C als weißes Pulver erhalten wird. Zur Ermittlung der physikalischen und chemischen Eigenschaften wird das Pulver mit einer Säule des Harzes
Dowex® 1x2 (OH-Form) weiter gereinigt
Durch Hydrolyse mit einer Säure ergibt Validamycin C1 Mol Validoxylamin und 2 Mol D-Glucose.
Das rohe Produkt (5,2 g), das aus den an Validamycin
E und F verhältnismäßig reichen, gemäß Beispiel 3
erhaltenen Fraktionen erhalten worden ist, wird an einer Säule (2,7 cm χ 43 cm) des Harzes Dowex® 1 χ 2
(OH-Form, 74 bis 149 μ) unter Verwendung von Wasser als Elutionsmittel chromatographiert. Das Eluat wird
mit einem Brechungsindex-Detektor fraktioniert. Jede Fraktion wird durch automatische Flüssigkeitschromatographie
und Gaschromatographie identifiziert und auf Reinheit untersucht.
Validamycin B wird mit destilliertem Wasser in dem Eluat, das etwa dem 20fachen Harzvolumen entspricht,
eluiert. Die Validamycine E und F werden im Eluat erhalten, das etwa dem 30fachen Harzvolumen entspricht.
Bei dieser Methode wird Validamycin F etwas vor dem Validamycin E eluiert. Die Bestimmung durch
automatische Flüssigkeitschromatographie ergibt, daß die ersten Fraktionen verhältnismäßig große Mengen
Validamycin F enthalten und die späteren Fraktionen reich an Validamycin E sind. Die Fraktionen, die
Validamycin E in einer Konzentration von 80% oder mehr enthalten, werden unter vermindertem Druck zur
Trockene eingedampft, wobei 1,3 g weißes Pulver erhalten werden.
Das erhaltene Pulver, das Validamycin E in einer Konzentration von 80% oder mehr enthält, wird durch
Chromatographie am Harz Dowex® 5OW χ 8 (Pyridinform, Elutionsmittel 0,1-molarer Pyridin-Acetat-Puffer,
pH 6,0) und dann am Harz Dowex® 1 χ 2 (OH-Form, Wasser als Elutionsmittel) gereinigt. Die Fraktionen, die
Validamycin E enthalten, werden aufgefangen und unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft.
Hierbei wird Validamycin als weißes Pulver erhalten. Falls erforderlich, wird die vorstehend beschriebene
Behandlung einmal wiederholt, wobei Validamycin E in reiner Form erhalten wird.
Durch Hydrolyse mit einer Säure ergibt Validamycin E 1 Mol Validoxylamin und 2 Mol D-Glucose.
In der gleichen Weise, wie für Validamycin E beschrieben, werden die an Validamycin F reichen
Fraktionen aufgefangen und gereinigt, wobei Validamycin F als weißes Pulver erhalten wird. Falls erforderlich,
wird die gleiche Behandlung einmal wiederholt, wobei Validamycin F in reiner Form erhalten wird.
Durch Hydrolyse mit einer Säure ergibt Validamycin F 1 Mol Validoxylamin A und 2 Mol D-Glucose.
Validamycin E und Validmaycin F haben zwar ähnliche physikalische und chemische Eigenschaften,
jedoch ergibt eine Untersuchung durch Flüssigkeitschromatographie einen wesentlichen Unterschied zwischen
den beiden Antibiotika. Beispielsweise zeigt Validamycin F eine Retentionszeit von 197 Minuten,
während die Retentionszeit bei Validamycin E 233 Minuten beträgt.
Unter den gleichen Bedingungen zeigt Validamycin C eine Retentionszeit von 146 Minuten.
Zu 150 mg Validamycin C, das gemäß Beispiel 5 erhalten worden ist, werden 1 ml Pyridin und 1 ml
-, Essigsäureanhydrid gegeben. Das Gemisch wird der Reaktion überlassen und auf dem Wasserbad durch
Erhitzen und Rühren gelöst. Das Reaktionsgemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen,
worauf Wasser zugesetzt wird. Die gebildete Fällung ίο wird mit Chloroform extrahiert und der Extrakt mit
Wasser gewaschen. Das Chloroform wird abdestilliert. Zum Rückstand wird Wasser gegeben, wobei 258 mg
Acetyl-validamycin C erhalten werden.
[a|?+98,9O (C= 1,0,CHCI3).
i) Elementaranalyse: gefunden 51,45% C, 5,73% H,
1,04% N.
Molekulargewicht: 1245 + 50 (Dampfdruckosmometrie, in Äthylacetat).
Das auf diese Weise erhaltene Acetat von Validamy- :o ein C (350 mg) wird in 3,5 ml Methanol gelöst. Zur
Lösung werden 20 ml Natriummethylat (Lösung von 0,5 g Natriumm°tall in 100 ml Methanol) gegeben. Das
Gemisch wird 5 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Nach dieser Zeit wird es auf eine Säule des
r> Harzes Dowex® 50W χ 8 (Η-Form) aufgegeben. Die Säule wird mit Wasser gewaschen und dann mit In-HCI
eluiert. Das Eluat wird an einer Säule des Harzes Dowex® 1x2 (OH-Form, Wasser als Elutionsmittel)
weiter Chromatographien. Die aktiven Fraktionen j» werden unter vermindertem Druck zur Trockene
eingedampft, wobei Validamycin C erhalten wird.
Zu 400 mg Validamycin D, das gemäß Beispiel 4 j-, erhalten worden ist, werden 2,5 ml Pyridin und 1 ml
Essigsäureanhydrid gegeben. Das Gemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die
Aufarbeitung auf die in Beispiel 7 beschriebene Weise ergibt 690 mg Acetyl-Validamycin D. Die Analyse
dieses Produkts ergibt folgende Werte:
[«] I3 + 145° (C= 1,0, CHCl3).
[«] I3 + 145° (C= 1,0, CHCl3).
Elementaranalyse: gefunden 52,86% C, 6,23% H, 1,44% N.
Molekulargewicht: 960±50 (ermittelt durch Dampfdruckosmometrie
in Äthylacetat).
Bei O0C werden 30 ml Methanol, das mit Ammoniak
gesättigt ist, dem Acetyl-Validamycin D (550 mg) zugesetzt Das Gemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur
stehengelassen. Das Reaktionsgemisch wird unter vermindertem Druck eingeengt. Zum Rückstand
wird Methanol gegeben. Diese Behandlung wird dreimal wiederholt Der endgültige Rückstand wird in
Wasser gelöst und mit einer Säule des Harzes Dowex® 1 χ 2 (OH-Form) gereinigt wobei 228 mg Validamycin
D erhalten werden.
Hierzu 4 Blatt Zeichnungen
Claims (1)
1. Validamycin C, gekennzeichnet durch die Formel
R-NH
OH
OH (I) ,5
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Legal Events
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8126 | Change of the secondary classification | ||
D2 | Grant after examination |