DE2218648C2 - Validamycin C, D, E und F und diese Verbindungen enthaltende Pflanzenschutzmittel - Google Patents

Description

OH

in der R fur eine O-a-D-Glucopyranosyl-3-hydroxymethyM^o-trihydroxy^-cyclohexenylgruppe steht, und eine Zersetzungstemperatur von 142 bis 160⁰C, und seine Salze.
2. Validamycin D der Formel

4. Validamycin F der Formel

OH

in der R³ für eine O-«-D-Glucopyranosyl-3-hydroxymethyM.S.ö-trihydroxy^-cyclohexenylgruppe steht, und eine Zersetzungstemperatur von 165 bis 173° C, und seine Salze.

5. Pflanzenschutzmittel, enthaltend als Wirkstoff eine Verbindung nach Anspruch 1 —4, ein Salz dieser Verbindungen oder ein Gemisch dieser Wirkstoffe.

6. Pflanzenschutzmittel nach Anspruch 5, enthaltend ein Gemisch von Validamycin E und Validamycin F als Wirkstoff.

HOH₂C

HO

(II)

HN — R¹

in der R¹ Tür eine O-a-D-Glucopyranosyl^^-trihydroxy-5-hydroxymethyl-cyclohexylgruppe steht, und seine Salze.
3. Validamycin E der Formel

HOH

HO

OH

OR³

in der R² für eine O-cr-D-Glucopyranosyl-O/i-D-glucopyranosy!gruppe steht, und seine Salze.

Die Erfindung betrifft neue Antibiotika, die als Validamycin C, D, E und F bezeichnet und durch Kultivierung von Validamycine bildenden Stämmen der Gattung Streptomyces erhalten werden, und ihre Säureadditionssalze.

Auf der Suche nach neuen antibiotisch aktiven Substanzen isolierte die Anmelderin eine große Zahl von Mikroorganismen des Bodens und untersuchte ihre Metabolite. Die Forschungsarbeit führte zu den Feststellungen, daß gewisse, vom Boden isolierte Mikroorganismen Validamycine C, D, E und F zu bilden vermögen, daß diese Mikroorganismen zu der Gattung Streptomyces gehören, und daß diese Antibiotika durch Kultivierung dieser Mikroorganismen in einer Weise, daß die Antibiotika im Nährmedium angehäuft werden, erhalten werden können.

Der Erfindung liegen die vorstehenden Feststellungen zu Grunde. Die Erfindung betrifft somit die Antibiotika Validamycin C, D, E und F, die erhalten werden, indem ein Validamycine bildender Stamm, der zur Gattung Streptomyces gehört, so kultiviert wird, daß das Antibiotikum gebildet werden kann, die Validamycine C, D, E und F im Fermentationsmedium angehäuft werden, und die auf diese Weise im Fermentationsmedium angehäuften Antibiotika isoliert werden.

Ferner wurde überraschenderweise gefunden, daß die vorstehend genannten Antibiotika ausgezeichnete Mittel zur Bekämpfung von Pflanzenkrankheiten, beispielsweise des Blattscheidenbrandes (sheath blight) von Reispflanzen bei Anwendung in vivo sind, jedoch in vitro keine Wirkung gegen Bakterien und Pilze zeigen. Weitere Untersuchungen mit diesen Antibiotika haben das besondere Merkmal zu Tage gebracht, daß sie diese starke Wirkung bei der Bekämpfung der Pflanzenkrank-

heiten nur zeigen, wenn die Pflanze oder der Boden mit ihnen behandelt wird.

Ferner wurde gefunden, daß die Antibiotika gemäß der Erfindung sehr wirksam nicht nur gegen den Blattscheidenbrand von Reispflanzen, sondern auch gegen andere Pflanzenkrankheiten sind, z. B. gegen die Wurzelfäule der Reispflanzen und ±e Umfallkrankheit und sklerotiale Trockenfäule bei Gemüse, blühenden Pflanzen und jungen Bäumen. Außerdem sind die Antibiotika gemäß der Erfindung im wesentlichen harmlos gegenüber Mensch und Tier sowie Fischen, und selbst bei Anwendung in hoher Konzentration beeinträchtigen sie nicht wesentlich die Keimung, das Wachstum, den Ertrag und andere Merkmale von Nutzpflanzen.

Die Erfindung umfaßt demgemäß die obengenannten neuen Antibiotika sowie gegenüber Menschen, Tieren und Fischen ungiftige, im wesentlichen keine Phytotoxizität aufweisende Pflanzenschutzmittel mit fungizider Wirkung zur Bekämpfung von bakteriellen und pilzlichen Pflanzenkrankheiten.

Die Validamycine C, D, E und F (nachstehend der Einfachheit halber als »Antibiotika« bezeichnet) wrden durch Kultivierung eines zur Gattung Streptomyces gehörenden Stammes, der diese Antibiotika zu bilden vermag, erhalten. Beispielsweise können der Stamm, der von den Erfindern von Bodenproben aus Akashi, Präfektur Hyogo, Japan, isoliert wurde und als Streptomyces hygroscopicus var. limoneus (IFO-12 703 und IFO-12 704) bezeichnet wurde, sowie seine verwandten Stämme mit besonderem Vorteil verwendet werden. Diese Mikroorganismen werden in der DE-OS 19 54 110 der Anmelderin beschrieben.

Einige mikrobiologische Eigenschaften und Kultureigenschaften von Streptomyces hygroscopicus var. limoneus sind nachstehend angegeben. Hierbei basieren die mit »Rdg.« gekennzeichneten Farbbezeichnungen auf Ridgeway's »Color Standard and Color Nomenclature«.

!.Morphologische Eigenschaften

Das Luftmycel dieses Mikroorganismus zeigt einfache Verzweigung, und die sporentragenden Hyphen bilden Spiralen. Das Conidium ist eiförmig oder rechteckig, hat eine Größe von 1,0 bis 1,3 μ χ 1,0 bis 1,5 μ und eine glatte Oberfläche. Dieser Mikroorganismus hat keine Sklerotia, Sporen mit Geißeln und Sporangia.

2. Kultureigenschaften '"

Die folgenden Kultureigenschaften werden, falls nicht anders angegeben, bei Kultivierung bei 28°C beobachtet. Wenn die Kultivierung bei anderen Temperaturen durchgeführt wurde, sind diese Temperaturen in -,-, Klammern angegeben.

a) Czapek-Agar

Wachstum: farblos, faltig

Rückseite: _w)

Raw Sienna (Rdg, III, 17-i) bis Sudan Brown (Rdg., Ill, 15k).

Luftmycel:

Tilleul Buff (Rdf, XL, 17"'-f) bis Light Buff (Rdg, XV, 17'-f), teilweise Mouse Gray (Rdg., _h5 LI, 15'"") längs dtir Peripherie der Kolonie.

Lösliches Pigment:

gelb mit schwach bräunlichem Ton.

b) GIucose-Czapek-Agar Wachstum:

farblos bis Sulphin Yellow (Rdg, IV, 21 -i), faltig

Rückseite: Raw Sienna Luftmycel:

Tilleul Buff bis Massicot Yellow (Rdg, XVI, 21'-f), teilweise Light Olive Gray (Rdg, LI, 23"'"-d) längs der Peripherie der Kolonie.

Lösliches Pigment:

gelb mit schwach-bräunlichem Ton.

c) Glycerin-Czapek-Agar Wachstum:

farblos bis Orange Citrine (Rdg, IV, 19-k), faltig

Rückseite: Raw Sienna Luftmycel:

Tilleul Buff bis Massicot Yellow, teilweise

hellolivgrau. Lösliches Pigment:

gelb mit schwach bräunlichem Ton.

d) Glucose-Asparagin-Agar Wachstum: farblos Rückseite:

Old Gold (Rdg., XVI, 19'-i) bis Antimony Yellow (Rdg, XV, 17'-b) bis Cinnamon Brown

(Rdg, XV, 15'-k) Luftmycel:

hellolivgrau bis mausgrau mit gelben Flecken

und schwarzen feuchten Flächen Lösliches Pigment: hellbraun.

e) Calciummaleatagar Wachstum:

Primuline Yellow (Rdg, XVI, 19') Rückseite: Primuline Yellow Luftmycel:

zunächst spärlich, jedoch später Tilleul Buff bis

hellolivgrau Lösliches Pigment: blaßgelb.

f) Stärkeagar: kein Wachstum

g)

Modifiziertes Stärkeagar mit folgenden	1%	0,3%
Bestandteilen:	Kaliummonohydrogenphosphat 0,3%	0,1%
Lösliche Stärke	Calciumcarbonat	0,2%
	Magnesiumsulfat	0,05%
Ammoniumsulfat	2%
Natriumchlorid
Agar

h) Wachstum:

farblos bis Barium Yellos (Rdg, XVI, 23'-d)

Rückseite:

Deep Colonial Buff (Rdg, XXX, 21 "-b) bis Snuff Brown (Rdg, XXIX, 15"-k)

Luftmycel:

Cartridge Buff (Rdg, XXX, 19"-f) bis mausgrau mit schwarzen feuchten Stellen

Lösliches Pigment: hellbraun Hydrolysierung der Stärke wurde beobachtet.

Tyrosin-Agar Wachstum:

farblos bis Trontian Yellow (Rde, XVl. 23')

Rückseite:

Pale Ochraceous Buff (Rdg., XV, 15'-f) bis Light Ochraceous Buff (Rdg., XV, 15'-d)

Luftmycel: nicht vorhanden Lösliches Pigment: nicht vorhanden

Hefeextrakt-Agar

Wachstum: farblos, faltig Rückseite: cremefarben (Rdg., XVI, 19'-f) Luftmycel: weiß

Lösliches Pigment: hellbraun

Nähragar(37°C)
Wachstum: farblos
Rückseite: farblos
Luftmycel: nicht vorhanden Lösliches Pigment: nicht vorhanden

Glucose-Nähragar (37° C) Wachstum: farblos, faltig Rückseite:

Cartridge Buff bis Pale Ochraceous Buff Luftmycel: nicht vorhanden Lösliches Pigment: nicht vorhanden

Nährbrühe (37° C)
Wachstum:

farbloses Oberflächenwachstum und farbloses

flockiges Wachstum am Boden Luftmycel: nicht vorhanden Lösliches Pigment: nicht vorhanden

m) Glucose-Nährbrühe(37°C) Wachstum:

Oberflächenwachstum Cartridge Buff und farbloses flockiges Wachstum am Boden

Luftmycel: nicht vorhanden Lösliches Pigment: nicht vorhanden

n) Kartoffel-Stichkultur
Wachstum:

farblos bis Pale Ochraceous Buff Luftmycel :Tilleul Buff bis mausgrau Der Stich färbt sich Sayal Brown (Rdg. XXIX, 15"-i)

o) Möhrenstichkultur
Wachstum: farblos
Luftmycel: weiß bis mausgrau Der Stich färbt sich Cinnamon Rufous (Rdg., XIV. 11 '-i) bis zimtbraun.

p) Ceiiuiose
Wachstum:

Chartreuse Yellow (Rdg, XXXl, 25"-d) bis Reed Yellow (Rdg. XXX, 23"-b) Luftmycel: mausgrau
Lösliches Pigment: blaßgelb.

q) Gelatine (25° C)

Wachstum: sehr schlecht Luftmycel: nicht vorhanden Lösliches Pigment: nicht vorhanden Die Gelatine wird leicht verflüssigt.

Das gleiche ist bei Nährgelatine der Fall, r) Ganzes Ei (37° C)

Wachstum: farblos
Luftmycel: nicht vorhanden
Lösliches Pigment: nicht vorhanden.

-, s) Lackmusmilch (37⁰C)
Wachstum:

Oberflächenwachstum, cremefarben bis Seashell Pink (Rdg., XIV, 1 l'-f)
Luftmycel: nicht vorhanden

mi Das Medium wird schwach koaguliert, dann

peptonisiert, wobei es Army Brown (Rdg. XL, 13"'-i) und schwach sauer wird.

t) Löffler-Medium(37°C)
r, Wachstum:

Naples Yellow (Rdg., XVI, 19'-d) zuerst und später Light Buff
Luftmycel: nicht vorhanden
Lösliches Pigment: nicht vorhanden
:ii Keine Verflüssigung.

u) Peptonglucose-Agar

Wachstum: Chartreuse Yellow
Rückseite: Honey Yellow (Rdg., XXX, 19")
Luftmycel: dünn, Cream Buff (Rdg., XXX, 19"-d)
Lösliches Pigment: gelb mit bräunlichem Ton

ν) Reines Agar
Wachstum:
j ι spärliches und farbloses Wachstum in die

Substanz des Mediums
Rückseite: farblos bis mausgrau
Luftmycel:

spärlich, Tilleul Buff bis mausgrau
j j Lösliches Pigment: nicht vorhanden

3. Physiologische Eigenschaften

a) Temperatur und pH-Bereich

Kein Wachstum bei 10⁰C und 50⁰C auf Bennett-Agar oder Glucoseasparaginagar unter aeroben Bedingungen. Wachstum findet bei 15 bis 45°C statt, besseres Wachstum bei 37 bis 45°C. Kein Wachstum, wenn das Medium einen pH-Wert von 4 hat. Bei pH 5 bis 10 findet zwar ein Wachstum statt, jedoch liegt der optimale Bereich bei pH 6 bis 7.

b) Gelatine: leicht verflüssigt

c) Stärke:

hydrolysiert

Durchmesser der hydrolysierten Fläche/

Durchmesser der Kolonie = 33 mm/8 mm

d) Tyrosinasereaktion: negativ

e) Lackmusmilch:

peptonisiert- Koagulierung zweifelhaft

f) Nitratreduktion: negativ

g) Hydrolyse von Cellulose: negativ
h) Farbstoffbildung: negativ

i) Produkt: Antibiotika der Validamycingruppe

4. Verwertung von Kohlenstoffquellen

Die Verwertung von Kohlenstoffquellen, ermittelt nach der Methode von Pridham und Mitarbeitern (Journal of Bacteriology 56, 107-114 [1948]) ist nachstehend in Tabelle 1 angegeben.

Tabelle 1

Verwertung von KohlensloH'qucllen durch Slrcptomyces hygroscopicus var. limoncus

Erythrit	-
Adonit	-
Sorbit	+
D-Xylosc	+ +
L-A rabi nose	+ +
L-Sorbosc	-
D-Galaclose	-H-
Glucose	-H-
D-Fruclosc	+ +
L-Rhamnosc	+ +
Melibiosc	+ +
Maltose	I I
Saccharose	-H-
Lactose	+ +
Raffinosc	-H-
Inosit	+ +
ΰ-Mannit	+ +
Dulcit	-
Trehalose	+ +
Salicin	-
Esculin	-
Inulin	+ +
Dextran	+
Mannose	+ +
Stärke	+ +
Glycerin	-H-
Natriumacetat	+
Natriumsuccinat	+
Natriumeitrat	+
Calcium^-ketogluconat	-
+ + : gut verwertet.
+ : ziemlich gut verwertet.
-: nicht verwertet.

Der gemäß der Erfindung verwendete Stamm zeigt somit monopodiale Verzweigung, wobei die Spitze seines Luftmycels spiralförmig ist. Die Konidien haben eine glatte Oberfläche. Der Stamm hat ein gelbes bis lederfarbenes Wachstum auf synthetischen Medien im allgemeinen und erzeugt auf proteinhaltigen Medien kein braunes lösliches Pigment.

Die vorstehenden Kultureigenschaften wurden mit den Beschreibungen in »Bergey's Manual of Determinative Bacteriology«, 7. Auflage (The Williams and Wilkins, 1957), in »The Actinomycetes« von S.A. Waksman, Band 2 (The Williams and Wilkins, 1962), und in »Systematik der Streptomyceten« von Ralph Hütter (hs. Karugas, 1967) verglichen. Es wurde festgestellt, daß der Stamm den Stämmen Streptomyces ambofaciens. Streptomyces platensis und Streptomyces hygroscopicus ähnlich ist

Trotz der großen Ähnlichkeit in der Farbe sowohl des vegetativen Mycels als auch des Luftmycels unterscheiden sich jedoch Streptomyces ambofaciens und der erfindungsgemäß verwendete Stamm dadurch, daß der erstere keine schwarzen feuchten Flecken im Luftmycel hat daß er Gelatine in mittlerem Grad verflüssigt und ein gelbes flockiges Wachstum im verflüssigten Teil bildet und daß er andere Kohlenstoffquellen als der erfindungsgemäß verwendete Stamm verwertet. Streptomyces platensis unterscheidet sich von dem erfindungsgemäß verwendeten Stamm dadurch, daß er ein tief olivfarbenes vegetatives Mycel auf Czapek-Agar bildet, wobei die Rückseite der Kolonie mit der Zeit dunkel olivfarben wird, daß er ein cremefarbenes bis stumpf-gelbliches Wachstum auf Stärkeagar ergibt, wobei sein Luftmycel die Farbe von Weiß nach ■-> Mausgrau mit schwarzen Flecken verändert, und daß er andere Kohlenstoffquellen als der erfindungsgemäß verwendete Stamm verwertet. Ein Vergleich der Beschreibungen von Streptomyces hygroscopicus mit den Kultureigenschaften des gemäß der Erfindung

ίο verwendeten Stammes zeigt, daß der letztere sich von Streptomyces hygroscopicus dadurch unterscheidet, daß sein Wachstum oder die Rückseite der Kolonie die hellgelbe Farbe bis Lederfarbe auf Czapek-Agar (einschließlich Glucose-Czapek-Agar und Glycerin-

r> Czapek-Agar), GIucose-Asparagin-Agar, Calciummaleatagar und anderen Medien zeigt und ein gelblich-weißes bis gelbes Luftmycel auf diesen Czapek-Agarmedien bildet. Viele Kultureigenschaften dieses Stammes fallen jedoch mit den stabilen Eigenschaften von Streptomyces hygroscopicus zusammen, die von Tresner und Backus (Applied Microbiology, Band 4, Seite 243, 1956) angegeben werden. Demgemäß wurde von der Anmelderin der erfindungsgemäß verwendete Stamm als eine Abart von Streptomyces hygroscopicus identifiziert und als Streptomyces hygroscopicus var. limoneus bezeichnet.

Die Gattung Streptomyces hat das allgemeine Merkmal, daß ihre mikrobiologischen Eigenschaften äußerst mutativ sind, und Streptomyces hygroscopicus

jo var. limoneus ist keine Ausnahme von dieser Regel. Beispielsweise lassen sich seine Kultureigenschaften und die Art der Verwertung von Kohlenstoffquellen leicht ändern, und es können zahlreiche Mutanten vorhanden sein. Insbesondere lassen sich von diesem

j^rj Stamm leicht Mutanten erhalten, die ein gelbes Luftmycel haben. Diese Mutanten können jedoch ebenfalls für die Zwecke der Erfindung verwendet werden, soweit sie die Fähigkeit haben, Antibiotika der Validamycingruppe zu bilden. Es spielt natürlich keine Rolle, ob die Mutation spontan oder künstlich induziert wird. Für die Zwecke der Erfindung sind diese Mutanten mit den vorstehend genannten Stämmen völlig gleichwertig.

In das für die Zwecke der Erfindung verwendete Nährmedium werden assimilierbare Kohlenstoffquellen, verwertbare Stickstoffquellen, anorganische Salze u.dgl. einbezogen. Gegebenenfalls können Spurenelemente, z. B. Spurennährstoffe, Wachstumsfaktoren, Vorstufen usw, dem Kulturmedium zugesetzt werden.

so Zu den Kohlenstoffquellen, die der die Antibiotika der Validamycingruppe bildende Stamm assimiliert, gehören u.a. Kohlenwasserstoffe; Glucose, Saccharose, Melasse, Stärke, Dextrin und Glycerin. Als Stickstoffquellen eignen sich beispielsweise organische Stickstoffverbindungen wie Fleischextrakt, Sojabohnenmehl, Maisquellwasser, Pepton und Casein sowie anorganische Stickstoffverbindungen wie Nitrate und Ammoniumverbindungen, die sämtlich vorteilhaft verwendet werden können.

Die Kultivierung kann als Oberflächenkultur durchgeführt werden, jedoch ist es üblicher, die aerobe Submerskultur anzuwenden. Bei der Submerskultur wird der pH-Wert des Mediums vorteilhaft in der Nähe des Neutralpunktes gehalten. Das Wachstum findet bei

_b5 Bebrütungstemperaturen von 20 bis 40° C statt jedoch wird das Medium vorzugsweise im Bereich von etwa 23 bis 37° C gehalten. Die Anreicherung des gewünschten Antibiotikums ist in 4 bis 7 Tagen beendet

Die Antibiotika hemmen nicht das Wachstum von Bakterien und Pilzen beim in-vitro-Test, sondern verursachen nur bei Pellucularia sasakii und seinen eng verwandten Pilzen eine anomale Verzweigung (übermäßige Verzweigung, oder verzweigte Hyphen nehmen eine doldenartige Form an) an den Spitzen der Hyphen. Daher sollte die biologische Austestung der Antibiotika wie folgt vorgenommen werden:

Pellicularia sasakii wird als Testorganismus und reines Agar als Nährmedium für den Test verwendet. Der Testorganismus wird mil einer K;iru>fl'el-(Saech;irose) Agarpliiitc 2 bis 5 Tage kultiviert. Die erhaltene Kultur wird verwendet, um in der Mitte einer 9-em-Pcirisehale eine Platte von modifiziertem Pfeffer-Medium zu impfen. Dieses Medium wird dann 2 Tage bei 27 C bebrütet. Nach dieser Zeit hat sich das Mycel über die gesamte Oberfläche der Platte ausgebreitet. Das Wachstum bis am Umfang eines Kreises mit einem Radius von etwa 3 bis 3,5 cm von der Mitte wird mit einem Bohrer herausgeschnitten und die hierbei erhaltene Agarscheibe als Impfmaterial verwendet.

Eine Verdünnungsreihe von Agarplatten, die unterschiedliche Konzentrationen der Antibiotika enthalten, wird nach der üblichen Agarverdünnungsmethode hergestellt.

Eine Glasscheibe von 8 mm Durchmesser und etwa 0,2 mm Dicke wird in der Mitte jeder Agarplatte der obengenannten Verdünnungsreihe gelegt, und die als Impfmaterial dienende Agarscheibe wird dann auf die Glasscheibe gelegt. Nach Bebrütung für 40 Stunden bei 27° C wird der Versuch ausgewertet. Eine Betrachtung mit dem bloßen Auge zeigt, daß bei Pellicularia sasakii die Spitze der Hypen des Testorganismus, der auf der als Impfmaterial dienenden Agarscheibe wächst, eine anomale Verzweigung erfährt. Die Verdünnungseinheit stellt den Wert der maximalen Verdünnung dar, die eine solche anomale Verzweigung hervorbringt. Eine wäßrige Lösung, die 1000 y/ml der gereinigten Validamycine C, D, E und F und Validoxylamine A und B enthält, zeigt 100, 10, 80 000, 80 000, 100 bzw. 10 Verdünnungseinheiten/ml.

Das bei diesem Test verwendete modifizierte Pfeffer-Medium hat folgende Zusammensetzung:

Saccharose	3%
L-Asparagin	0,2%
Ammoniumnitrat	0,3%
Kaliumdihydrogenphosphat	0,1%
Magnesiumsulfat	0,1%
Eisen-Natrium-Chelat von
N-(2-Hydroxyäthy])-äthylendiamin-
triessigsäure	0,001
Agar	i,2%
Eingestellt auf pH 7

Vor dem Gebrauch werden die folgenden Vitamine in den genannten Mengen zugesetzt (Gewicht pro ml Medium):

Thiamin	ly/ml
Riboflavin	ly/ml
Calciumpantothenat	ly/ml
Niacin	ly/ml
Biotin	0,005 y/ml
Folsäure	0,5y/mI
Pyridoxinhydrochlorid	2 y/ml
p-Aminobenzoesäure	04 y/ml
Cyancobalamin	0,0002 y/ml

Wenn Streptomyces hygroscopicus var. limoneus in der oben beschriebenen Weise kultiviert wird, werden die Antibiotika gebildet und hauptsächlich in der Flüssigphase des Fermentationsmediums angehäuft. Zur

■-, Gewinnung dieser Antibiotika ist es daher zweckmäßig, das Fermentalionsmedium zu filtrieren und dann die Antibiotika vom erhaltenen Filtrat abzutrennen. Wenn der verwendete Mikroorganismus nur eines der Antibiotika zu bilden vermag, kann das gebildete

ίο Antibiotikum natürlich in üblicher Weise vom Fermentationsmedium abgetrennt werden. Wenn jedoch der verwendete Mikroorganismus gleichzeitig zwei oder mehrere der Mikroorganismen zu bilden vermag, werden diese gleichzeitig im Fermentationsmedium

ι -, angehäuft, so daß diese Antibiotika vom Fermentationsmedium als Gemisch oder einzeln abgetrennt werden können.

Zur Isolierung der Antibiotika können übliche Methoden der Isolierung von Metaboliten von Mikroorganismen von ihren Fermentationsmedien allein oder in Kombination angewendet werden. Beispiele solcher Methoden sind die Filtration, Konzentrierung, lonenaustauschchromatographie mit Ionenaustauschern, Adsorptionschromatographie an Aktivkohle, Kieselgel oder Aluminiumoxyd, Gelfiltration mit Sephadex®, Bio-Gel®-P, Verwendung verschiedener Lösungsmittel zur Überführung des Gelösten in eine andere Flüssigphase, Ausfällung, Entfernung von Verunreinigungen, Dialyse, Trocknung und UmkristaHisatior·.

u) Für die Abtrennung und Reinigung der Antibiotika von Verunreinigungen werden beispielsweise seine Wasserlöslichkeit und basischen Eigenschaften ausgenutzt. Während beispielsweise wasserlösliche Verunreinigungen von niedrigerem Molekulargewicht nicht

r, adsorbiert werden, können die Antibiotika an Aktivkohle adsorbiert und mit einem angesäuerten wäßrigen Alkohol und/oder wäßrigem Aceton eluiert werden.

Die Antibiotika werden an Anionenaustauscherharzen stark adsorbiert, auch wenn sie sich in neutraler oder schwach sauerer Lösung befinden, und mit einer gepufferten basischen Lösung oder einer wäßrigen Salzlösung eluiert.

Zu den vorstehend genannten Salzen gehören nicht nur die Alkalisalze starker Säuren, z. B. Natriumchlorid und Ammoniumchlorid, sondern auch die Alkalisalze von organischen Säuren, z. B. Natriumacetat und Ammoniumacetat, sowie die Salze schwacher Säuren oder schwacher Basen, z. B. die Salze von Essigsäure und Pyridin.

-,ο Die Antibiotika können auch an starken Anionenaustauscherharzen schwach adsorbiert und mit Wasser eluiert werden.

Ais lonenaustauschharze (stark oder schwach), die für den obengenannten Zweck verw endet werden können, eignen sich beispielsweise die Produkte der Handelsbezeichnung Amberlite® IR-100, 112 und 120, Amberlite® XE-69, Amberlite® IRC-50, Amberlite® XE-89, Amberlite® XE-64, Amberlite® IR-45 und IRA-900, Dowex®- 5OW χ 2, Dowex®-1 χ 2, Dowex®-1 χ 8, Duolite® CS-65.

Diese Harze können nach Verfahren hergestellt

werden, die in »Ion Exchange Resin« (Robert Kumin, Verlag John Wiley, New York, Seiten 87-97) beschrieben werden.

Die Antibiotika werden durch Ionenaustauschchromatographie unter Verwendung von Kationen- und Anionenaustauscherharzen abgetrennt Beispielsweise werden die rohen Validamycine bei einer typischen Säulenchromatographie für präparative Zwecke an

Il

einer Säule des Harzes Dowex®-1 χ 2 (OH-Form, 0,074 bis 0,149 mm, 870 ml) Chromatographien. Die Säule wird mit Wasser entwickelt, wobei die 6 Komponenten Validoxylamin A und B und Validamycin D, C, F und E in dieser Reihenfolge bei der Elution von der Säule erhalten werden. Fraktionen, die reich an Validamycin sind, und eine Fraktion, die hauptsächlich Validamycin D enthält, werden erneut an einer Kieselgelsäule (Elution mit n-Propanol, Essigsäure und Wasser 4:1 : 1) und einer Säule von Dowex®-50W χ 2 (Elution mit Pyridin-Essigsäure-Puffer, pH 6,0) Chromatographien. Die Validamycine E und F werden an der Säule des Harzes Dowex®-1 χ 2 auf Grund ihrer hohen Affinität zum Harz länger zurückgehalten und zeigen einen ziemlich diffusen Elutionsverlauf beim Ablauf durch Gefälle. Die vollständige Abtrennung der Validamycine E und F wird an der Säule von Dowex®-1 χ 2 nicht erreicht. Die durch Chromatographie an Dowex®-1 χ 2 erhaltenen Fraktionen, die reich an Validamycin E sind, und die hierbei erhaltenen Fraktionen, die reich an Validamycin F sind, werden an einer Säule von Dowex®-50W χ 2 weiter Chromatographien (Elution mit Pyridin-Essigsäure-Puffer, pH 6,0). Bei dieser Chromatographie enthalten die zu Beginn ablaufenden Fraktionen Validamycin F. Anschließend wird Validamycin E eluiert.
Abschließend werden die chromatographisch homogenen Valid:imycine C. D, E und F durch erneute Chromatographie an Dowex®-lx2 (OH-Form, Entwicklung mit Wasser) erhalten. Validoxylamin A wird unmittelbar vor dem Validamycin D an einer Säule von Dowex®-1 χ 2 eluiert. Durch Kristallisation aus Wasser-Äthanol wird reines Validoxylamin A erhalten. Obwohl sich Validoxylamin B und Validamycin D bei der Chromatographie an Dowex®-! χ 2 fast überschneiden, lassen sich diese Komponenten an einer Säule von Dowex®-50W χ 2 leicht trennen (Elution mit Pyridin-Essigsäure-Puffer. pH 6,0).

Unter Anwendung der vorstehend beschriebenen Verfahren lassen sich die Validamycine C, D, E und F und die Validoxylamine A und B erfolgreich aus einem Fermentationsmedium von Streptomyces hygroscopicus var. limoneus isolieren.

Die Validamycine C, D, E und F fallen als weißes Pulver an und bilden durch Hydrolyse Validoxylamin Α-Glucose und Validoxylamin D-Glucose. Diese Antibiotika umerscheiden sich jedoch in der Molekülstruktur, d. h. in der Konfiguration der Glycosidbindungen in den D-Glucosekomponenten (λ- oder ^-Konfiguration) und in den Stellungen und in der Zahl der D-Glucosemoleküle.

Die Validamycine C, D, E und F haben die folgenden physiklischen und chemischen Eigenschaften:

1. Strukturformel

a) Validamycin C

11

R-NH

\ OH H HOH₂CXl

OH H A

H I H OH

OH H

, HOH₂C_x
H V₀ \/ OH

0-ί!'-D-Glucopyraπosyl-3-hydroxymethyl-4,5,6-trihy(^rnvy-2-cyc!ohexenylgruppe.

b) Validamycin D

OH

NH-R¹

H OH

¹: O-ff-D-GlucopyTanosyl-l^^trihydroxy-S-hydroxymethylcyclohexylgruppe.

13

14

c) Validamycin E HOCH,

d) Validamycin F
H

R³-NH

H HOH₂C OH H

OH

OH

O —R²

R^:: O-a-D-Glucopyranosyl-O-jS-D-glucopyranosyl- R³: O-a-D-GlucopyranosyW-hydroxymethyM^o-tri- gmppe. hydro xy-2-cyclohexeny !gruppe.

2. Schmelzpunkte bzw. Zersetzungspunkte

Keines der Antibiotika Validamycin C, D, E und F hat einen scharfen Schmelzpunkt, jedoch werden sie bei den folgenden Temperaturen allmählich zersetzt:

Validamycin C 142° bis 160° C

Validamycin D 125° bis 130° C

Validamycin E 263° bis 268° C

Validamycin F 165° bis 173° C

3) Die Elementaranalyse und die daraus berechneten optischen Molekularformen, die pKa'-Werte, die Neutralisations- genannt, äquivalente (Molekulargewicht) und die Werte der

Drehung sind nachstehend in Tabelle

Tabelle 2

Physikalische und chemische Eigenschaften der Validamycine C bis F

Verbin	Berechnete	Mole	Elenientaranalysc.	46,48	0/	46,08	Optische	pKa'	Rf-	Zahl der
dung	Molekular	kular		7,22		6,99	Drehung	Neulralisa-	Wcrt**)	D-GIucosc-
	formel	gewicht		2,15		2,07	[a]	tionsäqui-	(Kicsel-	einheiten
				46,97		46,60	Z)(H2O)	valent in	gclG)	und Bin
				7,23		7,24		wäßriger		dungsart***)
				2,58	berechnet	2,72		Lösung
Valid	C2(,H45NO1SH2O	677,7		46,22	C	46,08		6,0 ± 0,2	0,15	2 a- und
amycin		(659,7)*)		7,19	H	7,02		(680 ±30)		ß-Bin
C				1,94	N	2,07				dungen
D	C2nH35NO13H2O	515,5	gefunden	46,00	C	46,08	+ 169,3°	6,0 ± 0,2	0,24	1 »-Bin
		(497,5)*)	C	6,90	H	7,02		(520 ±30)		dung
			H	1,95	N	2,07
E	C,(,HJ5NOISH2O	677,7	N		C	+ 148,2°	6,1 ±0,2	0,15	2 a- und
		(659,7)*)	C		H		(660 ±30)		/(-Bin
			H		N				dungen
F	C211H4^NO1xH2O	677,7	N		C	+ 130,7°	6,1 ±0,2	0,15	2 a- und
		(659,7)*)	C	II		(680 + 30)		Ji-13 in
			H	N				dungen
N
C
H
N

*) Die Klammcr/uhlen bezeichnen das empirische Molekulargewicht, berechnet unter Ausschluß von H₂O. **) Dünnschichtchromalographte: limwicklcrlösungsmiuel: n-Propanol-l:ssigsäure-Wasscr = 4:1:1. '"") Berechnet aus der Spin-spin-K upplungskonslanle und dem Wert der optischen Drehung.

15

4. UV-Absorptionsspektrum

Bei Messung in wäßriger Lösung zeigen die Validamycine C, D, E und F keine charakteristischen Absorptionsmaxima im Ultraviolettbereich des Spektrums oberhalb von 210 πιμ mit Ausnahme von Endabsorptionen.

5. Infrarotspektrum (F i g. 1 bis 4)

Die Absorptionsspektren der Validamycine C, D, E und F, gemessen als KBr-Preßling, sind in F i g. 1 bis 4 dargestellt Diese Abbildungen zeigen, daß die Absorptionsspektren sich sehr ähnlen. Diese Antibiotika haben die folgenden Hauptabsorptionen:

(stark), 2910 (mi ttel),
(mittel), 1410(mittel),
(stark), 1025 (stark),
(mittel), 845 (mittel).

6. Löslichkeit

Alle diese Antibiotika sind in Wasser leicht löslich und in Pyridin, Dimethylformamid und Dimethylsulfoxyd löslich.

In Methanol ist Validamycin D löslich, aber Valdiamycin C, E und F sind schwerer löslich.

7. Farbreaktionen

Alle diese Antibiotika ergeben positive Reaktionen bei den Tests mit Perjodsäure-Benzidin-Reagens und Greig-Leaback-Reagens (tert-Butylhypochloritreagens), aber negative Reaktionen bei den Sakaguchi- und Elson-Morgan-Tests.

Alle Antibiotika gemäß der Erfindung zeigen ferner positive Reaktionen bei den Tests mit Anfhron, Orcin-Schwefelsäure und Naphthoresorcin-Schwefelsäure.

8. Salze

Die Validamycine C, D, E und F sind schwach basisch und bilden Salze mit Säuren (z. B. Salzsäure und Schwefelsäure). Als Beispiele sind die Schmelzpunkte bzw. Zersetzungspunkte und die Elementaranalysen des Hydrochlorids der Validamycine C, D, E und F in der folgenden Tabelle 3 angegeben.

Tabelle 3	Zersetzungspunkte	Elementaranalyse	H 6,32 Cl 5,24
Verbindung	115°-132 C	C 44,56 N 1,53	H 6,96 Cl 6,74
Validamycin C HCI	113°-128 C	C 44,61 N 2,72	H 6,54 Cl 5,41
Validamycin D HCl	141°-157 C	C 44,72 N 1,72	H 6,59 Cl 5,32
Validamycin E HCl	146°-164 C	C 44,S3 N 1,95
Validamycin F HCI

9. Akute Toxizität der Antibiotika

Die Toxizität der Antibiotika kann beispielsweise ermittelt werden, indem sie Mäusen intravenös verabreicht werden und die LD50 oder die mittlere Letaldosis (48 Stunden) für Oryzias latipes gemessen wird. Die Ergebnisse dieser Messungen sind nachstehend in Tabelle 5 genannt.

Tabelle 5
Akute Toxizität

Versuchstiere

Antibiotikum

Testmethode

Toxizität

Mäuse

Oryzias latipes

Validamycin C Validamycin D Validamycin E Validamycin F Validoxylamin A Validoxylamin B

Validamycin C Validamycin D Validamycin E Validamycin F Validoxylamin Λ Validoxvlamin B

Intravenöse
Injektion

Einsetzen in
wäßriger Lösung

LD_5n > 2000 mg/kg
LD₅₀ > 2000 mg/kg
LD₅₀ > 2000 mg/kg
LD₅₀ > 2000 mg/kg
LD₅₀ > 2000 mg/kg
LD₅₀ > 2000 mg/kg

TL_n, > 1000 ppm
TL₁₁, > 1000 ppm
TL₁₁, > 1000 ppm
TL_n, > 1000 ppm
TL_n, > 1000 ppm
TL_n, > 1000 ppm

Biologische Eigenschaften

Bei Verwendung einer wäßrigen Lösung der Antibiotika gemäß der Erfindung (1 mg/ml) als Vorratslösung wird eine anomale Verzweigung der Hyphenspitze von Pellicularia sasakii bei dem folgenden höchsten Verdünnungsfaktor hervorgebracht:

Validoxylamin A
Validoxylamin B
Validamycin C
Validamycin D
Validamycin E
Validamycin F

100

10

100

10

70 000-80 000

70 000-80 000

Die erfindungsgemäß hergestellten Antibiotika können zur Bekämpfung von Pflanzenkrankheiten verwendet wenden. Zu diesem Zweck werden sie in Form des Fermentationsmediums eines die Antibiotika der Validamycingruppe bildenden Stammes der Gattung Streptomyces, des Filtrats dieses Mediums, seines Konzentrats oder eines gereinigten Präparats verwendet. Es ist auch möglich, diese Antibiotika in Form von freien Basen oder als Salze mit geeigneten organischen oder anorganischen Säuren (z. B. Oxalsäure, Bernsteinsäure, Schwefelsäure und Salzsäure).

Diese Präparate können in beliebiger geeigneter Weise angewendet werden. In Abhängigkeit vom Zweck der Anwendung, der Anwendungszeit, der Anwendungsmethode usw. kann das Präparat unmittelbar als solches, nach Auflösen oder Dispergieren in einem geeigneten flüssigen Träger oder nach Vermischen mit einem geeigneten festen Träger angewendet werden. Gegebenenfalls können die Substanzen gemäß der Erfindung durch Zusatz eines Emulgators, Dispergiermittels, Suspendiermittels, Adsorptionsmittels, Penetrationsmittels, Netzmittels, Verdickungsmittel, Stabilisators und/oder Hilfsstoffes in verschiedenen Präparatformen, beispielsweise in Form von Lösungen in öl, Emulsionen, netzbaren Pulvern, wäßrigen Lösungen, löslichen Pulvern, Stäubemitteln, Tabletten, Granulat und Aerosolen zur Anwendung kommen.

Die Konzentration des Wirkstoffes in den gebrauchsfertigen Fungiziden gemäß der Erfindung beträgt gewöhnlich etwa 0,0001 bis 0,5 Gew.-°/o, vorzugsweise etwa 0,0003 bis 0,3 Gew.-% bei flüssigen Präparaten (d. h. Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen) und etwa 0,01 bis 30 Gew.-%, vorzugsweise etwa 0,1 bis 20 Gew.-%, bei festen Präparaten. Nach Bedarf können jedoch auch Präparate mit höherer oder niedrigerer Konzentration verwendet werden. Bei der Herstellung in Konzentratform kann der Wirkstoffgehalt der Konzentrate etwa 0,5 bis 80 Gew.-% betragen.

Die Zusammensetzungen einiger Fungizidpräparate, die Validamycine C, D, E und F enthalten, werden nachstehend genannt.

Präparat 1 - Netzbares Pulver	1,0%
Validamycin C	0,1%
Natriumligninsulfonat	0,1%
Polyoxyäthylennonylphenyläther	0,1%
Weißkohle	98,7%
Ton

Je nach Anwendungszweck und -methode wird das vorstehende Präparat auf 2 bis 400 ppm Antibiotikum verdünnt. Das verdünnte Präparat wird mit Sprühvorrichtungen auf den Boden aufgebracht oder das oben beschriebene Pulver wird unverdünnt zum Umhüllen des Samens verwendet.

Präparat 2 - Tabletten

Validamycin E 15,0%

Polyoxyäthylennonylphenyläther 2,0%

Lactose 83,0%

Vor der Anwendung wird dieses Präparat auf die für ίο das Präparat 1 genannte Konzentration verdünnt

Präparat 3 — Wäßrige Lösung

Validamycin D 40,0%

Methanol 5,0%

Aluminiumstearat 5,0%

Wasser 50,0%

Dieses Präparat wird mit Wasser auf 1000 bis 200 000 ppm verdünnt Das verdünnte Präparat wird id beispielsweise vom Flugzeug aus versprüht.

Präparat 4 — Emulgierbares Konzentrat

Validamycin F	10,0%
Polyoxyäthylennonylphenyläther	5,0%
Methanol	20,0%
Methylnaphthalin	40,0%
Dimethylformamid	25,0%

Vor der Anwendung wird dieses Gemisch auf die für das Präparat 1 genannte Konzentration verdünnt.

Präparat 5 — Gemischtes Stäubemittel A

Validamycin E 4,0%

Validamycin F 1,0%

Aluminiumstearat 0,02%

Talkum 94,98%

Das vorstehende Präparat wird unmittelbar als solches zur Umhüllung des Samens in einer Menge von 1 bis 50 Gcw.-%, bezogen auf den Samen, verwendet.

Versuch 1

Bekämpfung des Blattscheidenbrandes von Reis Versuchspflanzen

Kinmaze-Reispflanzen werden in Topfen von 9 cm Durchmesser (3 Sämlinge pro Topf) kultiviert. Die Sämlinge werden 80 Tage nach dem Einpflanzen getestet, wobei jeweils 6 Töpfe pro Behandlung verwendet werden.

Impfmethode

Pathogene Pilze Pellicularia sasakii werden 48 Stunden bei 30⁰C auf einer Platte aus Kartoffel-Infusionszucker-Agar kultiviert. Eine Agarscheibe von 10 mm Durchmesser wird aus einer peripheren Kolonie ausgeschnitten. Die Scheibe wird in den Innenraum der Blattscheide in der Nähe der Bodenoberfläche eingesetzt, und zwar jeweils eine Scheibe pro Pflanze. Die Töpfe werden unter einer PVC-Abdeckung bei der normalen Umgebungstemperatur von 32 bis 25°C und bei einer relativen Feuchtigkeit von 100 bis 70% gehalten. Die Impfung wird beim prophylaktischen Test unmittelbar nach der Trocknung des aufgebrachten

Präparats an der Luft und beim Bekämpfungstest 3 Tage vor der Anwendung vorgenommen.

stole in einer Menge "on 30 ml/6 Töpfe gleichmäßig über die Blätter gesprüht

Anwendung des Präparats

jedes Testpräparat wird mit Wasser bis zu der in Tabelle 3 genannten Konzentration des Wirkstoffes verdünnt Die wäßrige Lösung wird mit einer Spritzpi-Bestimmungsmet'node

10 Tage nach der Anwendung des Präparats wurde die Länge jedes Stengels von Bodenhöhe bis zur Oberkante der Läsion direkt gemessen.

Tabelle 6

Wirkung bei der Bekämpfung des Blattscheidenbrandes (mittlere Länge der Läsionen/Stengel/cm)

Konzentration des
Wirkstoffs in ppm

Prävemivwirkung"). % Heilwirkung"), %

3 10 30 100 300 1 3 10 30

100

Schädigung
der Pflanze
300 (300 ppm)

Validamycin C	46	34	4	1	0	—	68	22	12	10	V
Validamycin D	28	5	1	0	0	-	-	99	20	11	8
Validamycin E	3	2	0	0	0	41	14	12	11	5	3
Validamycin F	21	2	0	0	0	27	13	13	12	12	2
Validamycin E + Fft)	1	0	0	0	0	9	5	3	2	1	1
Validoxylamin A	28	4	1	0	0	-	83	28	14	10	7
Validoxylamin B	49	47	32	16	8	-	-	93	75	51	10

MAFA')

76 51

0 0 89 30

10

") Prozentuale durchschnittliche Länge der Läsion/Slcngel (cm) pro unbehandelle Kontrollpflunzc (34,4 cm). ^h) Gemisch von Validamycin E (80%) und F (20%).
') Methylarsonsäure-Ammonium-Komplexsalz.

Versuch 2

Bekämpfung der Wurzelfäule der Gurke
Versuchsmethode

Rhyzoctonia soiani wird auf Gerstenmedium 5 Tage bei 28⁰C kultiviert. Eine Bodenprobe des Feldes wird in 9-cm-Töpfe gefüllt, die dann mit Wasserdampf sterilisiert werden. Das Häcksel-Impfmaterial wird gleichmäßig in die Oberschicht jedes Topfes bis zu einer Tiefe von etwa 3 cm in einer Menge von 2 g/Topf eingearbeitet. Die Töpfe werden 4 Tage bei 28°C in einer Impfkammer gehalten und dann in ein Gewächshaus überführt.

Anwendung des Präparats

Das Präparat wird wie beim Versuch 1 in einer Menge von 30 ml/6 Töpfe/Gruppe auf die Bodenoberfläche gesprüht.

Testpflanze

Gesunde Gurkensamen (Sorte Yonyo) werden unmittelbar nach der Behandlung in einer Menge von 10 Samen/Topf in die Töpfe eingesetzt. Die Töpfe werden dann in einem Gewächshaus bei 32 bis 28°C gehalten.

Bestimmungsmethode

14 Tage nach dem Säen werden die Ergebnisse als Läsionskoeffizienten ermittelt. Ferner wird der Grad der Schädigung berechnet.

Läsionskoeffizienten (I)

gesund nur die Haarwurzeln sind leicht angegriffen

Luftteile in der Nähe der Bodenoberfläche und Wurzeln sind angegriffen

Anfangsphase des Abfaulens

beider Keimung angegriffen;

Wachstum gehemmt

0:

0,5:

1:

2: 3: Grad der Schädigung (%) =

x 100

Hierin ist η die Zahl der Proben, die jedem Läsionskoeffizienten entspricht, und N die Gesamtzahl der Pflanzen.

Tabelle 7 Wirkung der Bekämpfung	der Wurzelfäule	Grad der Schädigung, %	Schädigung der Pflanze
Präparat	Konzentration des Wirkstoffs, ppm	100 100 84 0	I III
Unbehandelte VergleichHproben Validamycin C	5 20 80

	Fortsetzung	22 1	von 100 ml/6	8	648	22	Konzentration	100	Impfmethode
21	Ι*Γ;ι|>;ιι';ιΙ					des Wirkstoffs	93	Pathogene Pilze Cladosporium fulvum werden aul einer Kartoffelinfusions-Saccharoseplatte 14 Tage bei
				(inn! der Schädigung	ppm	0	20° C kultiviert. Eine Suspension der Konidien
Validamycin D	kon/cnlralinn		ppm Schädigung. "■· der I'liiin/e		10	(5 xl OVmI) wird aus der Kultur hergestellt. Die
	ilcs W Ii kslol'ls.			0	Pflanzen werden mit der Suspension 3 Tage vor der
	5		50	0	Anwendung des Präparates in einer Menge von
Validamycin E	20		50	80	5 ml/Topf besprüht. Die Töpfe werden 24 Stunden in
	80			0	einer Impfkammer bei 25°C gehalten und dann in ein
	5			0	Gewächshaus überführt.
Validamycin F	20			7	Bewertung
	80			0	14 Tage nach der Infizierung wird das spezifische
	5			0	Verhältnis der durchschnittlichen Läsionsfläche in den
Validamycin (E + F)	20			84	Blättern gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8
	80			6	genannt
	5(4+ 1)		0
Validoxylamin A	20(16 + 4)		100
	80(64+ 16)		100	Spezifische Schädigung
	5		75	Fläche der Läsion der Pflanze
Validoxylamin B	20		100
	80		100	98
	5		100
Pentachlomitrobenzol	20		18
	80		25
	5
Versuch 3	20
80
	40
Bekämpfung der Braunfleckigkeit der Tomate
Testpflanzen
	4")
Tomatenpflanzen (Sorte Ponterosa) werden in Töpfe
von 12 cm Durchmesser gepflanzt (1 Pflanze/Topf). Die
Sämlinge werden 50 Tage nach dem Pflanzen
verwendet. Je 6 Töpfe bilden eine Gruppe.	50
Anwendung des Präparats
Wie bei Versuch 1 in einer Menge	Bekämpfung der Braunfleckigkeit der Tomate
Töpfe/Gruppe.	Präparat
Tabelle 8
	Unbehandelte
	Vergleichspflanzen
	Validamycin C
	Validamycin D

■ortsL't/uim

ΙΊ.ιρ.ιι.ιΐ

Validamycin 1£
Validamycin F
Validamycin (E +
Validoxylamin A
Validoxylamin B

	22	1	8	648	c/iIim. Ik	24
					κ Ik· ik-i I .ι	Si ll.lllllMIH
Kuli/-	: 111 μ I η	HI		S|'		Mi.Il tU-l I'll. Ill/
ill.· s W	llkslo	IK		I I.		_
50				2		-
50				3		-
50				2		-
50				6		_
50				36

") Gemisch von Validamycin I: (80%) und I- (20%).

In den folgenden Beispielen werden die Herstellung der Antibiotika und die für die Analyse bei den beschriebenen Versuchen verwendeten Flüssigkeitschromatographie-Apparaturen beschrieben. Für die Trennung und Zuführung wird die Apparatur »JLC-BC2«, Hersteller Japan Electronics Co., Ltd., verwendet. Für den Nachweis der aktiven Verbindungen mit negativer Reaktion beim Orcin-Schwefelsäuretest wird das Differentialrefraktometer Modell R 403 (Water Associates, Inc.) verwendet. Die folgenden Bedingungen wurden angewendet:

Analyse I
Analysensäule

Säule von 70 cm Länge und 8 mm Innendurchmesser, gefüllt mit dem Harz »AG 1 χ 2« (37-74 μ, OH-Form, BIO-RAD-Laboratory).

Elutionsmittel
Wasser, Durchflußmenge 0,37 ml/Minute.

Analyse II
Analysensäule

Säule von 15 cm Länge und 8 mm Innendurchmesser, gefüllt mit dem Harz »Jeol Resin LCR-3 (Japan Electronics, Ionenaustauscherharz in der Sulfatform).

Elutionsmittel

(I) 0,25-molarer Boratpuffer (pH 9,0), Durchflußmenge 0,49 ml/Minute; (II) 0,15-molarer Boratpuffer (pH 7,7), Durchflußmenge 0,49 ml/Minute. Zum Nachweis der Verbindungen, die negative Orcin-Schwefelsäure-Tests ergeben, wurde beispielsweise das Differentialrefraktorr.eter der Water Associates verwendet

Die gaschromatographischen Messungen wurden mit einem Gaschromatographen Modell 063 (Hitachi, Ltd.) und einem Yanaco-Gaschromatographen Modell 5DH (Yanagimeto Co., Ltd.) durchgeführt.

Die Proben wurden wie folgt hergestellt: Eine trockene Probe (einige mg), die die Komponenten des Validamycinkomplexes enthielt wurde in trockenem Pyridin (0,5 ml) gelöst. Als innerer Standard wurde Melezitose (0,5 mg) der Lösung zugesetzt Dann wurden Trimethylchlorsilan (0,5 ml) Bis-(trimethylsilyl)-acetamid (0,5 ml) zugegeben. Das Gemisch wurde 20 Minuten der Reaktion bei 70" C überlassen. Das Reaktionsprodukt wurde in die öaschromatographiesäule eingespritzt

Mit der Kolonne können gute Trennungen erzielt werden, wenn beispielsweise »Chromosol b"W AW DMCS« (Johns-Manville Co.) oder »Chromosol b"G

AW DMCS« (Johns-Manville Co.) als stationäre Phase und beispielsweise »Silicone OV-I, OV-17« (1—5%) (Ohio Valley Specialty Chemical Co.) als flüssige Phase in einer Glaskolonne (1 — 2 m) verwendet werden. Die Temperatur der Kolonne wird bei 250 bis 300° C

gehalten.

Beispiel 1

Zu einer auf pH 7 eingestellten wäßrigen Lösung, die 3% Glucose, 2,2% rohes Sojabohnenmehl und 0,3%

jo Pepton enthält, werden 0,4% gefälltes Calciumcarbonat gegeben. Je 500 ml der Lösung werden in 4 Kolben von 2 1 Fassungsvermögen gegeben. Nach der Sterilisation wird jeder Kolben mit einer Impfnadelmenge von Streptomyces hygroscopicus var. limoneus aus seiner Schrägkultur geimpft Die Kolben werden 2 Tage bei 28° C auf einer hin- und hergehenden Schüttelvorrichtung bebrütet.

Getrennt hiervon werden in 200-1-Tank aus nichtrostendem Stahl 1001 eines Mediums (pH 7,0) gegeben, das aus einer wäßrigen Lösung besteht, die 5% Glucose, 3,6% rohes Sojabohnenmehl, 0,5% Pepton und 0,6% gefälltes Calciumcarbonat enthält. Nach der Sterilisation werden in den Tank 2 1 der oben beschriebenen Impfkultur gegeben, worauf 114 Stunden bebrütet wird.

Hierbei werden 68 1 eines Kulturfiltrats erhalten, das den Validamycinkomplex in einer Menge von 10 000 Verdünnungseinheiten/ml enthält

Beispiel 2

Eine auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise erhaltene Kultur (950 1) von Streptomyces hygroscopicus var. limoneus (IFO-12 703) wird mit Oxalsäure auf einen pH-Wert von etwa 4,0 eingestellt und nach Zusatz eines Filterhilfsmittels filtriert. Das erhaltene Filtrat (720 1) wird durch eine Säule von 120 1 des Ionenaustauscherharzes Amberlite® 1R-120 (OH-Form) geleitet Diese Säule wird mit Wasser (2401) gespült Die Waschflüssigkeit wird mit dem Ablauf vereinigt Die Flüssigkeit wird durch eine Säule geleitet die 1401 des Ionenaustauscherharzes Amberlite® IR-45 (OH-Form) enthält und dann auf eine Säule aufgegeben, die 60 1 des lonenaustauscherharzes Dowex® 5OW χ 2 (H-Form) enthält Die letzte Säule wird mit Wasser gewaschen und mit wäßrigem O,5n-Ammoniak eluiert Die aktiven

i,5 Fraktionen werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingeengt

Das Konzentrat (40 1) wird an einer Säule (die 301 des lonenaustauscherharzes Amberlite® IRA-900 (OH-

Form) enthält, Chromatographien, wobei Wasser als Elutionsmittel verwendet wird. Jede Fraktion wird durch Dünnschichtchromatographie (Kieselgel G, Entwickler n-Propanol-Essigsäure-Wasser = 4 : 1 : 1), Gaschromatographie und Flüssigkeitschromatographie analysiert. Die aktiven Verbindungen werden in der folgenden Reihenfolge eluiert: Validoxylamin A und B, Validamycin D, C, F und E. Jede Fraktion wird zur Konsistenz eines Sirups eingeengt, worauf Aceton zugesetzt wird. Hierbei werden insgesamt 1,1 kg des 1» Validamycinkomplexes als rohes Pulver erhalten.

Beispiel 3

Die von dem Harz Amberlite® IRA-900 bei dem in Beispiel 2 beschriebenen Versuch eluierten einzelnen |-, Fraktionen, die Validamycin C D. E und F und Validoxylamin A und B enthalten, werden unter vermindertem Druck zur Konsistenz eines Sirups eingeengt, worauf Aceton zur Ausfällung der aktiven Komponenten zugesetzt wird. Hierbei werden insge- 2» samt 1,1 kg des rohen Validamycinkomplexes als Pulver erhalten. In 21 Wasser werden 400 g dieses rohen Pulvers gelöst. Die Lösung wird an einer 22 1 des Harzes Dowex® 1x2 (OH-Form) enthaltenden Säule unter Verwendung von Wasser als Elutionsmittel chromatographiert. Jede Fraktion wird durch Dünnschichtchromatographie und Gaschromatographie analysiert. Die Validoxylamiiie A und B und Validamycin D rinden sich in den Fraktionen von 25 bis 55 1, Validamycin A in den Fraktionen von 75 bis 115 1, die Validamycine B und C in jo den Fraktionen von 135 bis 275 1 und die Validamycine E und F in den Fraktionen von 325 bis 7601. Jede Gruppe von Fraktionen wird aufgefangen und unter vermindertem Druck eingeengt, worauf Aceton zugesetzt wird, wodurch weiße Pulver ausgefällt werden. Hierbei werden 42,8 g eines weißen Pulvers, das überwiegend aus Validamycin D besteht, 179,2 g eines weißen Pulvers, das überwiegend aus Validamycin A besteht, 42 g eines weißen Pulvers, das hauptsächlich aus den Validamycinen B und C besteht, und 5,6 g eines weißen <io Pulvers, das hauptsächlich die Validmycine E und F enthält, erhalten.

Beispiel 4

Eine Menge von 10 g des auf die in Beispiel 3 beschriebene Weise erhaltenen rohen Produkts, das verhältnismäßig reich an Validamycin D ist, wird an einer Säule von 700 ml des Harzes Dowex® 1 χ 2 (OH-Form, 74 bis 149 μ) Chromatographien. Das Eluat wird mit einem Differentialrefraktometer untersucht Jede Fraktion wird durch Gaschromatographie identifiziert und auf Reinheit geprüft. Hierbei wird festgestellt, daß Validoxylamin A in den Fraktionen von 0,8 bis 2,01 und Validoxylamin B und Validamycin D in den Fraktionen von 1,6 bis 2,01 enthalten sind. Das Validoxylamin A enthaltende Eluat wird unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft, wobei 2,0 g eines weißen Pulvers erhalten werden. Das Validamycin D und Validoxylamin B enthaltende Eluat wird unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft, wobei 4,6 g eines weißen Pulvers erhalten werden.

Das Pulver wird in einem 0,1-molaren Pyridln-Acetat-Puffer (pH 6,0) gelöst Die Lösung wird auf eine Säule von 700 ml des Harzes Dowex® 5OW χ 2 aufgegeben, wobei mit der vorstehend genannten Pufferlösung gepuffert wird. Die Säule wird mit der gleichen Pufferlösung eluiert, wobei Validoxylamin B in den Fraktionen von 1,5 bis 2$ 1 und Validamycin D in den Fraktionen von 7,5 bis 8.5 I eluiert werden. Jede Fraktion wird unter vermindertem Druck eingeengt. Das Konzentrat wird an einer Säule von 100 ml des Harzes Dowex® 1 χ 2 (OH-Form) unter Verwendung von Wasser als Elutionsmittel gereinigt.

Das Eluat wird unter vermindertem Druck eingeengt. Zum Konzentrat wird Aceton gegeben, wobei 0,7 g Validoxylamin B und 3,2 g Validamycin D jeweils als weißes Pulver ausgefällt werden.

Um Validamycin D in hoher Reinheit zu erhalten, wird das erhaltene rohe Produkt durch ChOtnatographie an Kieselgel (Merck, 0,05 bis 0,20 mm; n-Propanol-Essigsäure-Wasser = 4 : 1 : 1) und am Harz Dowex® 5OW χ 8 (Elutionsmittel 0,1 -molarer Pyridin-Acetat-Puffer, pH 6,0) gereinigt. Abschließend wird das Produkt mit dem Harz Dowex® 1x2 (OH-Form) unter Verwendung von Wasser als Elutionsmittel weiter gereinigt.

Durch Hydrolyse mit einer Säure ergibt das Validamycin D je 1 Mol Validoxylamin A und D-Glucose.

Beispiel 5

Eine Menge von 15 g des gemäß Beispiel 3 erhaltenen rohen Produkts, das verhältnismäßig reich an Validamycin B und C ist, wird an einer Säule (3,5 χ 95 cm) von 870 ml des Harzes Dowex® 1 χ 2 (OH-Form, 74 bis 149 μ) unter Verwendung von Wasser als Elutionsmittel Chromatographien. Jede Fraktion wird durch Dünnschichtchromatographie (Kieselgel G; n-Propanol-Essigsäure-Wasser = 4 :1 :1; Farbreagens Naphthoresorcin) oder Gaschromatographie analysiert. Validamycin A (Ausbeute etwa 5,0 g) fällt in dem Eluat an, das etwa dem 5- bis 7fachen Volumen des Harzes entspricht. Validamycin C (Ausbeute etwa 0,2 g) wird in dem Eluat erhalten, das etwa dem 10- bis 20fachen Harzvolumen entspricht. Validamycin B (Ausbeute etwa 6,0 g) wird in dem Eluat erhalten, das etwa dem 12- bis 18fachen Harzvolumen entspricht.

Da das rohe Pulver, das in der oben beschriebenen Weise erhalten worden ist, überwiegend aus Validamycin C besteht, jedoch noch eine geringe Menge Validamycin B enthält, wird es wie folgt weiter gereinigt:

1,0 g des Pulvers wird an einer Säule (1,3 cm χ 90 cm, 200 ml) Kieselgel (Merck, 0,05 bis 0,2 mm) unter Verwendung von n-Propanol-Essigsäure-Wasser (4:1:1) als Entwickler Chromatographien. Von den erhaltenen Fraktionen werden diejenigen, bei denen die Naphthoresorcin-Reaktion positiv ist, durch Dünnschichtchromatographie bestätigt Die Fraktionen, die Validamycin C allein enthalten, werden aufgefangen und zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird weiterhin am Harz Dowex® 5OW χ 2 (Pyridinform) adsorbiert und mit ln-Pyridin-Acetat-Puff er (pH 6,5) eluiert. Die Fraktionen, bei denen der Naphthoresorcin- test positiv ist, werden aufgefangen und unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft, wobei Validamycin C als weißes Pulver erhalten wird. Zur Ermittlung der physikalischen und chemischen Eigenschaften wird das Pulver mit einer Säule des Harzes Dowex® 1x2 (OH-Form) weiter gereinigt

Durch Hydrolyse mit einer Säure ergibt Validamycin C1 Mol Validoxylamin und 2 Mol D-Glucose.

Beispiel 6

Das rohe Produkt (5,2 g), das aus den an Validamycin E und F verhältnismäßig reichen, gemäß Beispiel 3

erhaltenen Fraktionen erhalten worden ist, wird an einer Säule (2,7 cm χ 43 cm) des Harzes Dowex® 1 χ 2 (OH-Form, 74 bis 149 μ) unter Verwendung von Wasser als Elutionsmittel chromatographiert. Das Eluat wird mit einem Brechungsindex-Detektor fraktioniert. Jede Fraktion wird durch automatische Flüssigkeitschromatographie und Gaschromatographie identifiziert und auf Reinheit untersucht.

Validamycin B wird mit destilliertem Wasser in dem Eluat, das etwa dem 20fachen Harzvolumen entspricht, eluiert. Die Validamycine E und F werden im Eluat erhalten, das etwa dem 30fachen Harzvolumen entspricht.

Bei dieser Methode wird Validamycin F etwas vor dem Validamycin E eluiert. Die Bestimmung durch automatische Flüssigkeitschromatographie ergibt, daß die ersten Fraktionen verhältnismäßig große Mengen Validamycin F enthalten und die späteren Fraktionen reich an Validamycin E sind. Die Fraktionen, die Validamycin E in einer Konzentration von 80% oder mehr enthalten, werden unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft, wobei 1,3 g weißes Pulver erhalten werden.

Das erhaltene Pulver, das Validamycin E in einer Konzentration von 80% oder mehr enthält, wird durch Chromatographie am Harz Dowex® 5OW χ 8 (Pyridinform, Elutionsmittel 0,1-molarer Pyridin-Acetat-Puffer, pH 6,0) und dann am Harz Dowex® 1 χ 2 (OH-Form, Wasser als Elutionsmittel) gereinigt. Die Fraktionen, die Validamycin E enthalten, werden aufgefangen und unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Hierbei wird Validamycin als weißes Pulver erhalten. Falls erforderlich, wird die vorstehend beschriebene Behandlung einmal wiederholt, wobei Validamycin E in reiner Form erhalten wird.

Durch Hydrolyse mit einer Säure ergibt Validamycin E 1 Mol Validoxylamin und 2 Mol D-Glucose.

In der gleichen Weise, wie für Validamycin E beschrieben, werden die an Validamycin F reichen Fraktionen aufgefangen und gereinigt, wobei Validamycin F als weißes Pulver erhalten wird. Falls erforderlich, wird die gleiche Behandlung einmal wiederholt, wobei Validamycin F in reiner Form erhalten wird.

Durch Hydrolyse mit einer Säure ergibt Validamycin F 1 Mol Validoxylamin A und 2 Mol D-Glucose.

Validamycin E und Validmaycin F haben zwar ähnliche physikalische und chemische Eigenschaften, jedoch ergibt eine Untersuchung durch Flüssigkeitschromatographie einen wesentlichen Unterschied zwischen den beiden Antibiotika. Beispielsweise zeigt Validamycin F eine Retentionszeit von 197 Minuten, während die Retentionszeit bei Validamycin E 233 Minuten beträgt.

Unter den gleichen Bedingungen zeigt Validamycin C eine Retentionszeit von 146 Minuten.

Beispiel 7

Zu 150 mg Validamycin C, das gemäß Beispiel 5 erhalten worden ist, werden 1 ml Pyridin und 1 ml -, Essigsäureanhydrid gegeben. Das Gemisch wird der Reaktion überlassen und auf dem Wasserbad durch Erhitzen und Rühren gelöst. Das Reaktionsgemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen, worauf Wasser zugesetzt wird. Die gebildete Fällung ίο wird mit Chloroform extrahiert und der Extrakt mit Wasser gewaschen. Das Chloroform wird abdestilliert. Zum Rückstand wird Wasser gegeben, wobei 258 mg Acetyl-validamycin C erhalten werden.

[a|?+98,9^O (C= 1,0,CHCI₃).

i) Elementaranalyse: gefunden 51,45% C, 5,73% H, 1,04% N.

Molekulargewicht: 1245 + 50 (Dampfdruckosmometrie, in Äthylacetat).

Das auf diese Weise erhaltene Acetat von Validamy- :o ein C (350 mg) wird in 3,5 ml Methanol gelöst. Zur Lösung werden 20 ml Natriummethylat (Lösung von 0,5 g Natriumm°tall in 100 ml Methanol) gegeben. Das Gemisch wird 5 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Nach dieser Zeit wird es auf eine Säule des r> Harzes Dowex® 50W χ 8 (Η-Form) aufgegeben. Die Säule wird mit Wasser gewaschen und dann mit In-HCI eluiert. Das Eluat wird an einer Säule des Harzes Dowex® 1x2 (OH-Form, Wasser als Elutionsmittel) weiter Chromatographien. Die aktiven Fraktionen j» werden unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft, wobei Validamycin C erhalten wird.

Beispiel 8

Zu 400 mg Validamycin D, das gemäß Beispiel 4 j-, erhalten worden ist, werden 2,5 ml Pyridin und 1 ml Essigsäureanhydrid gegeben. Das Gemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Aufarbeitung auf die in Beispiel 7 beschriebene Weise ergibt 690 mg Acetyl-Validamycin D. Die Analyse dieses Produkts ergibt folgende Werte:
[«] I³ + 145° (C= 1,0, CHCl₃).

Elementaranalyse: gefunden 52,86% C, 6,23% H, 1,44% N.

Molekulargewicht: 960±50 (ermittelt durch Dampfdruckosmometrie in Äthylacetat).

Bei O⁰C werden 30 ml Methanol, das mit Ammoniak gesättigt ist, dem Acetyl-Validamycin D (550 mg) zugesetzt Das Gemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Das Reaktionsgemisch wird unter vermindertem Druck eingeengt. Zum Rückstand wird Methanol gegeben. Diese Behandlung wird dreimal wiederholt Der endgültige Rückstand wird in Wasser gelöst und mit einer Säule des Harzes Dowex® 1 χ 2 (OH-Form) gereinigt wobei 228 mg Validamycin D erhalten werden.

Hierzu 4 Blatt Zeichnungen

Claims (1)

Patentansprüche:

1. Validamycin C, gekennzeichnet durch die Formel

R-NH

OH

OH (I) ,5