SK279441B6

SK279441B6 - Antibiotikum ab-041, spôsob jeho prípravy, mikroor

Info

Publication number: SK279441B6
Application number: SK3578-92A
Authority: SK
Inventors: Nunzio Andriollo; Alessandro Scacchi; Giorgio E. Borgonovi; Giorgio Cassani; Silvia Spera; Gianfranco Guglielmetti; Giorgio Pirali; Giovanni Confalonieri
Original assignee: Ministero Dell' Universita' E Della Ricerca Scient
Priority date: 1991-12-04
Filing date: 1992-12-04
Publication date: 1998-11-04
Also published as: EP0545490A2; CA2084477A1; EP0545490B1; DE69214258D1; GR3021520T3; HUT65566A; DK0545490T3; JPH05294982A; EP0545490A3; ITMI913254A1; CZ357892A3; HU9203826D0; HU215553B; IT1259423B; AR247591A1; NZ245333A; ZA929354B; SK357892A3; CZ282323B6; DE69214258T2

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka antibiotika AB-041, spôsobu jeho prípravy, mikroorganizmu Streptomyces sp. NCIMB 40428 a herbicídneho prostriedku obsahujúceho uvedené antibiotikum.

Vysoká herbicídna účinnosť látok podľa vynálezu ich určuje na použitie v poľnohospodárstve na ochranu kultúrnych rastlín pred napadnutím burinami. Látky podľa vynálezu sú účinné proti najrôznejším burinám, pričom nemajú toxické pôsobenie na kultúrne rastliny.

Doterajší stav techniky

Škodlivosť burín pri pestovaní kultúrnych rastlín je všeobecne známa. Známe sú tiež skupiny najrôznejších používaných herbicídnych prostriedkov. Stále sa však hľadajú nové cesty boja proti zaburineniu, pričom sa zvlášť dbá na to, aby takéto prostriedky, ktoré sú na jednej strane užitočné, nemali vedľajšie nepriaznivé účinky. Výsledkom týchto výskumov je riešenie uvedené v tomto vynáleze.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je antibiotikum AB-041, ktoré má nasledujúce charakteristiky:

a) ultrafialovú absorpciu maximálne pri 278 nm,

b) infračervené absorpčné maximá, cm¹, 3395, 1663, 1594, 1449, 1403, 1338, 1307, 1285, 1246, 1225, 1159, 1102, 1074, 1037, 1017, 960, 942, 917, 888, 741,

c) rozpustnosť vo vode, dimetylsulfoxide a v ich zmesi, nerozpustnosť v etyléteri a hexáne,

d) obsah uhlíka, vodíka, dusíka, kyslíka a síry,

e) molekulovú hmotnosť 463,

f) ^1HNMR spektrum s hlavnými píkmi, TMS ppm, 8,26, s, IH, 4,55, t, IH, 4,43, d, IH, 4,26, d, IH, 4,04, m, IH, 3,67, m, 3H, 3,36, t, IH, 3,26, t, IH, 3,09, m, IH, 2,71, dd, IH, 2,19, d, IH, 1,26, d, 3H,

g) ¹³C NMR spektrum s hlavnými píkmi, TMS ppm, 181,3, s, 174,7, s, 165,8, s, 158,3, s, 137,8, d, 107,8, s, 105,3, s, veľmi slabé 73,1, d, 70,0, s, 66,8, t, 62,0, t, 51,1, d, 47,3, t, 43,6, d, 43,6, t, 42,0, d, 18,5, q,

h) retenčný čas Rt 4,5 minút pri analýze na reverznom fázovom HPLC stĺpci, kde elučným činidlom je metanol: monobázický fosforečnan draselný 20 mM vo vode, nastavené na hodnotu pH 3,5 kyselinou fosforečnou, 12,1:87,9 objem/objem, rýchlosť toku 0,7 ml/min., teplota 40 °C, UF detektor 276 nm,

i) pozitívnu kolorimetrickú reakciu s ninhydrínom v acetóne 0,2 % hmotn./objem, s pinakryptolovou žltou vo vode 0,07 % hmotn./objem, negatívnou kolorimetrickou reakciou s diazotačným činidlom a kopuláciu s α-naftolom a

j) Rf = 0,35 na celulózovej F chromatografickej doštičke so systémom acetonitril/voda v pomere 91:9 objem/objem ako elučným činidlom.

Ďalšou podstatou vynálezu je spôsob prípravy antibiotika AB-041 tak, že sa aeróbne kultivuje Streptomyces sp. NCIMB 40428 alebo jeho mutant vo vodnom kultivačnom prostredí obsahujúcom zdroj uhlíka, dusíka a anorganických solí a z kultivačnej pôdy sa izoluje antibiotikum. Kultivácia sa uskutočňuje pri teplote 20 až 35 °C, výhodne pri teplote 25 až 30 °C a pri hodnote pH 5 až 9. Antibiotikum sa izoluje zo živnej pôdy filtráciou nasledovanou chromatografickými postupmi a izoluje sa čistiacimi postupmi zahrnujúcimi ultrafiltráciu živnej pôdy špirálovou membránou, koncentráciu permeátu špirálovou membránou reverznou osmózou, postupné chromatografie stĺpcom obsahujúcim neiónovú živicu a ionexovú živicu a rozmery vylučujúcu chromatografiu.

Ďalej sa vynález týka mikroorganizmu Streptomyces sp. MCIMB 40428 a herbicídneho prostriedku, ktorý ako účinnú látku obsahuje antibiotikum AB-041 spolu s tuhými alebo kvapalnými nosičmi a prípadne ďalšími prísadami.

Antibiotikum podľa vynálezu má formu bieleho alebo bielookrového prášku ajeho molekulová hmotnosť je 463, stanovená FAB-HRMS spektrom, ktoré má piky pri m/z 464,1452 ± 0,0007 (MNa)+ pri nasledujúcich pracovných podmienkach: HRFAB-MS, Xe pri 9,5 kV, glycerolová matrica.

Hodnota [MH]+ pri m/z 464 je potvrdené spektrom, získaným hmotnostnou spektrometriou vo vysoko výkonnej kvapalinovej chromatografii/termosprej (HPLC/TSMS) s mobilnou fázou pozostávajúcou z 0,05 M roztoku octanu amónneho a metanolu (50/50).

Empirický vzorec antibiotika je C₁₆H25N₅O<)S, ultrafialové (UF) absorpčné spektrum, zaznamenané vo vode pri hodnote pH 4,5, je na obr. L Má absorpčné maximum pri 278 nm. Infračervené (IR) absorpčné spektrum v prípade KBr pastiliek je znázornené na obr. 2, ^IHNMR spektrum na obr. 3.

Spektrum bolo zistené v D₂O na Brukerovom AM 300 NMR spektrometri. Bolo uskutočnených 3000 odberov s intervalmi 2 sekúnd medzi každým odberom.

Chemické posuny sú v nepriamom vzťahu k TMS = = 0,00 ppm, (δ TMS) za interného predpokladu piku v deuterovanej vode pri 4,80 ppm. Tri prekrývajúce sa signály pri 3,67 ppm sa rozlíšia porovnaním spektra v D₂O s analogickým spektrom, zaznamenaným v hexadeuterodimetylsulfoxide (DMSO-d6), v ktorom sa zodpovedajúce signály javia ako oddelené pri 3,48, 3,43 a 3,28 ppm (obr. 4) a dvojrozmernými NMR skúškami.

¹³C NMR spektrum (obr. 5) je zaznamenané v D₂O na Brukerovom AM 300 spektrometri. Bolo uskutočnených 10 000 odberov s intervalmi 2 sekúnd medzi každým odberom (90° pulzy). Chemické posuny sú v nepriamom vzťahu k TMS = 0,00 ppm, (δ TMS). Zväčšenie na obr. 6 ukazuje prekrytie dvoch signálov pri 43,6 ppm. Hodnoty', vzťahujúce sa na multiplicitu signálov, sa získajú DEPT pokusmi pri 45°, 90° a 135°.

Retenčný čas (Rt) je asi 4,5 minút pri analýze na reverznom fázovom HPLC stĺpci, elučným činidlom je metanol/monobázický fosforečnan draselný 20 mM vo vode, nastavené na hodnotu pH 3,5 kyselinou fosforečnou (12,1 : : 87,9 objem/objem), lýchlosť toku je 0,7 ml/min., teplota 40 °C a UF detektor 276 nm.

Morfológia a kultivačné vlastnosti Streptomyces sp. NCIMB 40428.

Mikroorganizmus sa izoluje zo vzorky pôdy odobratej v San Martino v Colle (Perugia) a katalogizuje sa pod vnútorným kódom SD749.

Kultúra tohto mikroorganizmu je uložená od 27. júna 1991 podľa Budapeštianskej zmluvy v organizácii National Collection of Industrial and Marine Bacteria Ltd., 23. St. Machar Drive, Aberdeen AB2 1RY, Škótsko, Spojené krá

SK 279441 Β6 ľovstvo, s prideleným číslom NCIMB 40428. Morfologické vlastnosti sú uvedené v tabuľke A (názov kultúry zodpovedá názvu podľa Intemational Streptomyces Program).

Tabuľka A

Kód ISP	Kultivačné prostredie	Opis
Ml	tryptonová kvasnicová pôda	oddelený rast, vytváranie melanínového pigmentu
M2	sladový extrakt agar	nadmerný rast, nízke kolónie, biele ľahké mycélium, mierny melanínový pigment
M3	agar ovsenej múky	nadmerný rast, vysoké kolónie, sivé hygroskopické ľahké mycélium
M4	agar škrobový	nadmerný rast, nízke kolónie, biele ľahké mycélium
M5	glycerol asparagínový agar	nízky rast, nízke kolónie, ľahké mycélium chýba
M6	peptón, železo agar	oddelený rast, nízke kolónie, sivé ľahké mycélium
M7	tyrozínový agar	nízky rast, nízke kolónie, ľahké mycélium chýba
-	živný agar	nadmerný rast, nízke kolónie, číre
-	Emersonov agar	nadmerný rast, vysoké radiálne kolónie, nadmerné biele ľahké mycélium
-	V8 paradajková šťava agar	nadmerný rast, nízke kolónie, nadmerné sivé ľahké mycélium
-	dextrózový zemiak	nadmerný rast, nízke kolónie, biele ľahké mycélium, mierny melanínový pigment

V tabuľke B sú uvedené niektoré charakteristiky kmeňa.

Tabuľka B

Charakteristika	odpoveď¹
odolnosť proti NaCl (7%)	negatívna
odolnosť proti fenolu (0,1%)	pozitívna
rast pri 45 °C	negatívna
rast pri 4 °C	negatívna
lipolýza	pozitívna
DNA-áza	negatívna
produkcia sírovodíka	negatívna
Antibiotické pôsobenie na: B. subtilis NCIMB 3610	negatívna
M. luteus NCIMB 196	negatívna
C. albicans CBS 562	negatívna
S. cerevisiae CBS 1171	slabá
S. musinus ISP 5091	negatívna
A. nigerLIV 131	negatívna

V tabuľke C je uvedený rast kmeňa na niektorých organických látkach ako jedinom zdroji uhlíka.

Tabuľka C

Zlúčenina	Rast
N-acetyl-D-glukózamín	+ + +
adonitol	+ + +
L-arabinóza	+ + +
celobióza	+ + +
galaktóza	+ + +
glycerol	+ + +
glukóza	+ + +
inozitol	+
laktóza	+ +
2-keto-D-glukonát	+ + +
maltóza	+ 4-
melezitóza	4-4-
metyl-D-glukozid	+ +
rafinóza	4-4-
sacharóza	+ + +
sorbitol	4-4-4-
trealóza	+ 4-
xylitol	+ + +
xylóza	+ + 4-

V tabuľke D sú uvedené citlivosti kmeňa k určitým antibiotikám.

Tabuľka D

Antibiotikum	Dávka (pg)	Citlivosť
nalidixová kyselina	30	-
ampicilín	10	4-4-
bacitracín	10(1)	4-4-4-
cefaloridín	30	4-4-4-
chloramfenikol	30	+
hlórtetracyklín	30	+ + +
erytromycín	15	+ +
fosfomycin	50	4- 4-
gentamycín	10	4-4-4-
kanamycín	30	4-4-4-
lincomycín	2	-
eomycín	30	4-4-4-
novobiocin	30	+ 4-4-
oleandomycín	15	+
oxytetracyklín	30	+ + +
penicilín	10(1)	+
polymyxín B	300(1)	+ +
rifamycín	30	+ +
rifampicín	30	+ +
streptomycín	10	+ + +
tetracyklín	30	+ + +
tobramycín	10	+ + +
vankomycín	30	+ + +

(1) medzinárodné jednotky + indikácia pozitívneho rastu

- indikácia skutočnosti, že k rastu nedochádza

Ako v prípade iných mikroorganizmov môže Streptomyces sp. NCIMB 40428 podliehať zmenám. Napríklad sa môžu získať umelé varianty alebo mutanty ošetrením rôznymi známymi mutagénmi, akými sú napríklad rôntgenové lúče alebo ultrafialové lúče, vysoko frekvenčné vlny a chemické látky, akými sú napríklad kyselina dusitá, halogénované alkylamíny, nitrózoguanidín a gáfor.

Všetky takéto prírodné alebo umelé varianty alebo mutagény patria do druhu Streptomyces, ktoré produkujú antibiotikum AB-041, sa považujú za rovnocenné kmeňu Streptomyces sp. NCIMB 40428 a spadajú do rozsahu vynálezu.

Spôsob prípravy antibiotika AB-041 je založený na kultivácii kmeňa Streptomyces sp. NCIMB 40428 alebo mutanta jemu rovnocenného za riadených aerobných fermentačných podmienok vo vodnom živnom prostredí a na oddelení antibiotika známymi spôsobmi. Môžu sa použiť kultivačné živiny alebo fermentačné pôdy bežne používané na produkciu antibiotík, určité kultivačné prostredia sú však výhodné.

Takéto kultivačné prostredie musí obsahovať zdroj uhlíka a dusíka, ktoré sa môžu asimilovať mikroorganizmami rodu Streptomyces a musia obsahovať nízku koncentráciu anorganických solí. Musia tiež obsahovať stopy kovov, nutných pre rast a vývoj mikroorganizmu, ktoré však môžu byť už obsiahnuté ako nečistoty v zdrojoch uhlíka alebo bielkovinového dusíka, dodávaných pre bakteriálny rast, alebo sa prípadne môžu do kultivačného prostredia pridávať.

Všeobecne môže používaný zdroj uhlíka pozostávať z uhľohydrátov a najmä zo sacharidov, akým je glukóza alebo fruktóza, alternatívne alebo prídavné zo škrobov alebo priemyselne vyrábaných chemikálií podobných škrobom, akým je rozpustný dextrínový škrob alebo akými sú polyalkoholy, napríklad glycerol. Takéto látky sa môžu používať jednotlivo alebo vo vzájomných zmesiach. Koncentrácia zdroja uhlíka v kultivačnom prostredí závisí všeobecne od typu a množstva ostatných zložiek v živnom prostredí, všeobecne by však mala byť dostatočná koncentrácia 0,5 až 5 % hmotn.

Ako zdroje dusíka sa všeobecne môžu používať bielkovinové hydrolyzáty, akým je kvasnicový extrakt, kazeínový hydrolyzát alebo múka, napríklad sójová múka, alebo priemyselné produkty predávané na tento účel, napríklad profilo (múčka z bavlníkových semien), kukuričná pôda alebo liehovarské nerozpustné produkt}'. Tieto zlúčeniny sa môžu používať v kultivačnom prostredí jednotlivo alebo vo vzájomných zmesiach v koncentrácii 0,2 až 6 % hmotn.

Prítomnými stopami kovov môže byť napríklad kobalt, mangán a železo.

Môžu sa používať aj anorganické soli napríklad sodné, draselné, horečnaté, amóniové a vápenaté, akými sú fosforečnany, sírany, chloridy, uhličitany a dusičnany.

Určité kultivačné prostredia majú zvláštnu kapacitu na stimuláciu produkcie antibiotika AB-041 z kmeňa Streptomyces sp. NCIMB 40428, ako napríklad nasledujúce vodné prostriedky, ktoré sú používané v príkladoch uskutočnenia vynálezu.

Kultivačné prostredie P	Koncentrácia
(zložky)	(g/i)
profilo	10
glycerol	15
uhličitan vápenatý	3
Kultivačné prostredie V
mäsový extrakt	4
kukuričný extrakt	1
dextróza	10
peptón	4
chlorid sodný	2,5
Kultivačné prostredie VI
mäsový extrakt	3
peptón	5

Kultivačné prostredie S

glukóza	1
mäsový alebo	10
pečeňový peptón
mäsový extrakt	5
chlorid sodný	3
agar	12,5

Kmeň Streptomyces sp. NCIMB 40428 sa môže nechať rásť pri teplote 20 až 35 °C, výhodne pri teplote 25 až 30 °C. Hodnota pH je približne 5 až 9. Do kultivačného prostredia sa vháňa sterilný vzduch všeobecne v takom množstve, aby sa koncentrácia kyslíka udržiavala na 20 % alebo viac, vztiahnuté na hodnotu nasýtenosti v prostredí s výnimkou približne 24 hodín po naočkovaní, kedy sa koncentrácia kyslíka znižuje na nižšiu hodnotu. Produkcia antibiotika v priebehu fermentácie sa môže sledovať podľa výsledkov biologickej účinnosti vzoriek pôdy. Fermentácia sa uskutočňuje až do dosiahnutia podstatnejšej biologickej účinnosti. Všeobecne je dostačujúci čas 72 až 120 hodín.

Oddelenie a čistenie antibiotika

Po kultivácii za uvedených fermentačných podmienok sa antibiotikum AB-041 môže oddeliť z kultivačnej pôdy a potom čistiť známymi spôsobmi. Tieto spôsoby zahrnujú napríklad vyzrážanie ale nie rozpúšťadlami, ultrafitráciou, reverznou osmózou, chromatografiou na silikagéli, chromatografiou na celulóze, reverznou fázovou chromatografiou, ionexovou chromatografiou, chromatografiou na neiónovej makropórovitej živici, rozmermi vylučujúcou chromatografiou a gélovou permeačnou chromatografiou. Antibiotikum, produkované pri fermentácii, je hlavne vo fermentačnej pôde.

Výhodným spôsobom získania antibiotika AB-041 je oddelenie hmoty mycélia od kultivačnej pôdy odstredením. Takto získaná pôda sa sfiltruje 1 pm filtrom a ultrafiltruje sa špirálnou membránou s 20 kD nominálnou exklúziou. Permeát sa skoncentruje špirálovou membránou reverznou osmózou s 500 D nominálnou exklúziou. Zvyšok zachytený reverznou osmózou sa spracuje neiónovou živicou, ktorá zadrží určité lipofilné nečistoty, ale nezadrží antibiotikum AB-041, a potom sa vedie do stĺpca obsahujúceho ionexovú živicu (napríklad Amberlit IRA 401, vopred prevedenú na chloridovú formu), živica sa potom premyje vodou a produkt sa eluuje vodným roztokom kyseliny chlorovodíkovej. Frakcie, obsahujúce antibiotikum AB-041 sa spoja, neutralizujú sa 32 %-ným vodným amomakálnym roztokom a skoncentrujú sa vo vákuu.

Roztok, získaný týmto spôsobom, sa vedie na oxid kremičitý C18 reverznou fázou a eluuje sa vodou. Frakcie, obsahujúce antibiotikum AB-041 sa spoja, skoncentrujú sa vo vákuu a vedú sa stĺpcom chromatografíe (obsahujúcim napríklad Fraktogel TSK HW40 (F)) ako stacionárna fáza a eluujú sa vodou. Frakcie, obsahujúce antibiotikum AB-041 sa spoja a skoncentrujú sa vo vákuu, čím sa získa čisté antibiotikum AB-041.

Biologická účinnosť

Herbicídna účinnosť sa stanovuje pred vzídením a po vzídení spôsobom opísaným v príkladoch praktického uskutočnenia.

Zlúčenina AB-041 má významné herbicídne pôsobenie po vzídení na najrôznejšie jednoklíčnolisté a dvojklíčnolisté burinové trávy a rastliny rôznych biologických skupín (tabuľka E). Herbicídne pôsobenie pred vzídením je však obmedzené len na určité druhy dvojklíčnolistých rastlín (tabuľka E). Zlúčenina AB-041 má tiež selektivitu so zrete ľom na určité druhy užitočných rastlín, akou je pšenica, jačmeň, kukurica a bavlnovník (tabuľka F), pričom je nepatrne fytotoxická v dávkach účinných proti burinám.

Zistené výsledky dokazujú, že antibiotikum podľa vynálezu má fytotoxickú účinnosť zaujímavú pre poľnohospodárstvo a môže sa preto používať ako herbicídny prostriedok.

Pre praktické použitie v poľnohospodárstve a v iných odboroch sa antibiotikum podľa vynálezu najvýhodnejšie používa vo forme vodného prostriedku. Okrem účinnej látky takéto prostriedky obsahujú ešte pevné alebo kvapalné inertné nosiče, ako napríklad organické rozpúšťadlá, rastlinné alebo minerálne oleje, vodu alebo zmesi uvedených látok, a ďalšie prísady, bežne používané v takýchto prostriedkoch, akými sú povrchovo aktívne látky, dispergačné činidlá a zmáčadlá.

Produkt podľa vynálezu napríklad pre svoje pozitívne vlastnosti so zreteľom na rozpustnosť a stálosť vo vode môže byť forme vo vode rozpustného prášku alebo vodného roztoku na minimalizáciu nepriaznivého pôsobenia na životné prostredie, pochádzajúceho z použitia organických rozpúšťadiel.

Aplikácia sa volí podľa požadovaného účinku a od typu používaného prostriedku. Na zvláštne účely alebo na rozšírenie oboru pôsobenia sa môžu do prostriedku pridávať ešte iné účinné látky, ako sú napríklad herbicídy, fongicídy alebo hnojivá.

Používané dávky sa líšia v závislosti od rôznych faktorov, ako je typ a stupeň zamorenia burinami, typ použitého prostriedku, klimatické pomery a faktory prostredia. Na praktické použitie v poľnohospodárstve dáva dávka antibiotika 0,1 až 2 kg/ha uspokojivé výsledky.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Je potrebné pripomenúť, že vynález nie je obmedzený len na Streptomyces sp. NC1MB 40428, ale môže tiež zahrnovať prirodzené alebo umelé mutanty alebo variant uvedeného mikroorganizmu za predpokladu, že produkuje antibiotikum AB-041. Toto antibiotikum je charakterizované pomocou nasledujúcich výkresov, na ktorých obr. 1 znázorňuje ultrafialové absorpčné spektrum zaznamenané vo vode pri hodnote pH 4,5, obr. 2 znázorňuje infračervené absorpčné spektrum v prípade KBr pastilky, obr. 3 znázorňuje ^,HNMR spektrum zaznamenané v deutériovej vode, obr. 4 znázorňuje ^1HNMR spektrum zaznamenané v hexadeuterodimetylsulfoxide, obr. 5 je ¹³C NMR spektrum zaznamenané v deutériovej vode a obr. 6 znázorňuje prekrytie dvoch signálov pri 43,6 ppm.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Nasledujúce príklady praktického uskutočnenia vynález bližšie objasňujú, nijako ho však neobmedzujú.

Príklad 1

Skúška herbicídneho pôsobenia po vzídení

Semená desiatich druhov jednoročných burín patriacich do rôznych botanických skupín sa vysejú do nádob z plastov s priemerom 11 cm, obsahujúcich poľnohospodársku pôdu. Nechajú sa rásť za vhodných podmienok v skleníku 7 až 15 dní v závislosti od druhu až do rozvinutia kličnych lístkov v prípade dvojklíčnolistých rastlín a do rozvinutia prvého lístka a zviditeľnenia druhého lístka v prípade jednoklíčnolistých rastlín. Skúšaná rastlina sa ošetrí vodným roztokom AB-041 s koncentráciou 1,0 g/1 (čo zodpovedá dávke 1,0 kg/ha) za použitia rozprašovača (typ De Vilbiss). Herbicidne pôsobenie sa týždenne zaznamenáva. V tabuľke E sú uvedené výsledky za 4 týždne vyjadrené ako percento inhibície rastu. Všetky rastliny pri skúške majú inhibiciu rastu 60 až 100 % (0 % - zdravá rastlina, 100 % - dokonale zničená rastlina).

Príklad 2

Skúška herbicídneho pôsobenia pred vzídením

Semená desiatich druhov jednoročných burín patriacich do rôznych botanických skupín sa vysejú do nádob z plastov s priemerom 11 cm, obsahujúcich poľnohospodársku pôdu. Povrch pôdy v nádobách sa ošetrí vodným roztokom AB-041 s koncentráciou 1,0 g/1 (čo zodpovedá dávke 1,0 kg/ha) za použitia rozprašovača (typ De Vilbiss). Herbicídne pôsobenie sa týždenne zaznamenáva. V tabuľke E sú uvedené výsledky za 4 týždne vyjadrené ako percento inhibície rastu. Všetky rastliny majú pri skúške inhibiciu rastu 60 až 100 % (0 % - zdravá rastlina, 100 % - dokonale zničená rastlina).

Tabuľka E

AB-041 1 kg/ha Druh buriny	Percento inhibície rastu
Pred vzídením	Po vzídení
Convolvolus arvensis	75	70
Convolvolus sepium	100	90
Ipomea leptofilla	85	35
Geranium dissectum	95	0
Stellaria média	100	100
Abutilon theophrasti	100	10
Solanum nigrum	95	20
Veronica sp.	100	20
Setraria glauca	60	10
Digitaria sanquinalis	75	10

Príklad 3

Skúška herbicídnej účinnosti po vzídení so zreteľom na kultúrne rastliny

Skúška sa uskutočňuje uvedeným postupom pre skúšku po vzídení v prípade šiestich kultúrnych jednoklíčnolistých

a dvojklíčnolistých rastlín. V tabuľke F sú výsledky skúšok účinnosti po štyroch týždňoch vyjadrené v percentách inhi-
bicie rastu.
Tabuľka F
AB-041 1 kg/ha	Percento inhibície
Kultúrna rastlina	rastu
Triticum sativum (pšenica)	5
Hordeum vulgare (jačmeň)	0
Zea mays (kukurica)	15
Glycine maxima (sója)	15
Beta vulgaris (repa)	55
Pisum sativum (hrach)	70
Gossypium hirsutum (bavlník)	0

Rastlinami, na ktorých sa nejaví žiadna fytotoxicita, sú bavlník (Gossypium hirsutum) a jačmeň (Hordeum vulgare). Pšenica (Triticum aestivum), kukurica (Zea mays) a sója (Glycine maxima) majú malé známky fytotoxicity 5 až 15 %. Najcitlivejšími druhmi rastlín sú repa cukrová (Beta vulgaris) a hrach (Pisum sativum), ktoré majú inhibiciu rastu 55 a 70 %.

SK 279441 Β6

Príklad 4

Fermentácia kmeňa Streptomyces sp. NCIMB 40428

Skúmavka, obsahujúca 2 ml mycélia Streptomyces sp. NCIMB 40428 (udržiavaného v 10 % glycerole pri teplote -20 °C) sa použije na naočkovanie 150 ml uvedeného živného prostredia V, ktoré sa potom inkubuje v rotačnej trepačke s počtom otáčok 150/min., pri teplote 28 °C 72 hodín. Získaná kultúra sa používa na naočkovanie fermentora (nominálny objem 10 litrov), obsahujúceho 7 litrov kultivačného prostredia P a 1,0 g/1 odpeftovacieho činidla (Nixolen) pri teplote 29 °C, prevzdušňovaní 300 1/hod., miešaní pri počte otáčok 320/min., čas fermentácie 96 hodín.

Príklad 5

Fermentácia kmeňa Streptomyces sp. NCIMB 40428

Skúmavka, obsahujúca kmeň mycélia Streptomyces sp. NCIMB 40428 v lyofilizovanej forme sa aseptický otvorí a hydratuje sa sterilnou destilovanou vodou. Suspenzia sa použije na naočkovanie 500 ml banky obsahujúcej 100 ml uvedeného kultivačného prostredia P. Inkubácia sa uskutočňuje počas 90 hodín pri teplote 28 °C v rotačnej trepačke pri počte otáčok 200/min. Na konci tohto času sa kultivačná pôda odstredí na oddelenie od mycélia a použije sa na biologické skúšky.

Príklad 6

Fermentácia kmeňa Streptomyces sp. NCIMB 40428

Čistá kultúra Streptomyces sp. MCIMB 40428 sa nechá rásť na kultivačnom prostredí S na naočkovanie trojhrdlových baniek, obsahujúcich vždy 20 ml kultivačného prostredia V, ktoré sa potom inkubuje pri teplote 28 “C v rotačnej trepačke s počtom otáčok 250/min., 72 hodín. Kultúra sa použije na naočkovanie 2 1 banky obsahujúcej vždy 500 ml kultivačnej pôdy VI, ktorá sa opäť inkubuje za uvedených podmienok 72 hodín. Po skončení tohto času sa kultúra použije na naočkovanie troch fermentorov s nominálnym objemom 40 litrov, obsahujúcich 25 1 kultivačného prostredia P a 1,0 g/1 odpeňovacieho prostriedku (Nixolen) pri teplote 29 °C, prevzdušňovaní 300 1/hod., čas fermentácie 74 hodín.

Príklad Ί Izolácia antibiotika AB-041 litrov fermentačnej pôdy získanej uvedeným spôsobom sa odstredí a vyčerená pôda sa sfiltruje cez 1 pm filter. Filtrát sa spracuje na jednotke pre ultrafiltráciu a reverznú osmózu (Hydro Air Research S.R.L., Zerbo di Opera, Taliansko) vybavenej G-50 špirálovou membránou s 20 kD nominálnou exklúziou. Fermentuje sa asi 80 litrov, potom sa pridá 10 litrov vody do získanej kvapaliny a ďalších 10 litrov sa podrobí permeácii a dá sa do 80 litrov skôr získaného permeátu. Zvyšný materiál po ultrafiltrácii sa vyhodí.

litrov permeátu získaného ultrafiltráciou sa spracuje na jednotke pre reverznú osmózu vybavenej DS-5 reverznou osmózovou špirálovou membránou s 500 D nominálnou exklúziou. Permeuje sa 82 litrov, koncentrát sa zhromaždí, modul sa premyje 2,5 litrami vody a premývacia voda sa pridá ku koncentrátu z reverznej osmózv, čím sa získa 9,5 litra roztoku obsahujúceho antibiotikum AB-041. Produkt sa zavádza na stĺpec (vnútorný priemer 90 mm, výška 300 mm) obsahujúci 2,4 kg XAD-4 na zhromaždenie 8,0 litrov eluátu. Živica sa premyje 4,0 litrami vody, zhromažďuje sa prvých 1,5 litrov, ktoré sa pridajú do zhora uvedených 8,0 litrov eluátu. Tento roztok, ktorého hodnota pH je asi 7,1 a ktorý obsahuje antibiotikum AB-041, sa zavádza rýchlosťou 20 ml/min. na stĺpec obsahujúci 1,5 kg Amberlitu IRA 401 v chloridovej forme, potom sa stĺpec premyje 6,0 litrami vody a eluuje sa 0,5 N vodným roztokom kyseliny chlorovodíkovej. Antibiotikum AB-041 sa eluuje 7 litrami po 4 litroch elučného činidla.

Kyslý roztok, obsahujúci antibiotikum AB-041, sa neutralizuje 32 % vodným roztokom amoniaku, skoncentruje sa vo vákuu na objem približne 1,0 liter a zavedie sa na stĺpec obsahujúci 1,2 kg oxidu kremičitého (0,044 až 0,063 mm, pórovitosť 9 nm, Bio. Rad Laboratories S. r. 1., Miláno, Taliansko) a eluuje sa vodou rýchlosťou 35 ml/min.

Antibiotikum AB-041 sa eluuje 3,2 litrami po 7,5 litroch elučného činidla. Toto množstvo sa odparí dosucha vo vákuu, odoberie sa do 50 ml vody, zavedie sa na stĺpec vyplnený Fraktogélom TSK a eluuje sa vodou rýchlosťou 5 ml/min., pričom sa zhromažďuje 35 ml frakcie. Antibiotikum AB041 sa eluuje 350 ml z frakcie 21 do frakcie 30. Zhromaždené frakcie sa odparia vo vákuu, čím sa získa 300 mg antibiotika AB-041.

Príklad 8

Herbicídny prostriedok; príprava vo vode rozpustného prášku

a) účinná látka (AB-041) 70 až 90 %

b) lignosulfonát vápenatý 2 až 5 %

c) aniónová alebo neiónová povrchovo ak- 5 až 10 % tívna látka (napríklad benzensulfonát sodný, kondenzovaný naftalénformaldehyd, polyetoxylované alkylfenoly, vždy buď samotné alebo vo vzájomných zmesiach)

d) silikónový odpeňovač 0,5 až 2 % a prípadne inertné rozpustné soli, akou je napríklad síran sodný alebo chlorid draselný.

Príklad 9

Herbicídny prostriedok; príprava koncentrovaného vodného roztoku

a) účinná látka (AB-041)

b) polyetoxylovaný nonylfenol

c) propylénglykol

d) polyetoxylovaný alkylamín

e) voda do 100%.

až 15% až 5 % až 10% až 5 %

Priemyselná využiteľnosť

Antibiotikum AB-041 získané riadenou aerobnou kultiváciou Streptomyces sp. NCIMB 40428 vo vodnom kultivačnom prostredí má biologickú účinnosť, predovšetkým herbicídne pôsobenie na buriny.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Antibiotikum AB-041, ktoré má

a) ultrafialovú absorpciu maximálne pri 278 nm,

b) infračervené absorpčné maximá, cm¹, 3395, 1663, 1594, 1449, 1403, 1338, 1307, 1285, 1246, 1225, 1159, 1102, 1074, 1037, 1017, 960, 942, 917, 888,741,

c) rozpustnosť vo vode, dimetylsulfoxide a v ich zmesi, nerozpustnosť v etyléteri a hexáne,

d) obsah uhlíka, vodíka, dusíka, kyslíka a síry,

e) molekulovú hmotnosť 463,

f) ’^hNMR spektrum s hlavnými píkmi, TMS ppm, 8,26, s, IH, 4,55, t, IH, 4,43, d, IH, 4,26, d, IH, 4,04, m, IH, 3,67, m, 3H, 3,36, t, IH, 3,26, t, IH, 3,09, m, ÍH, 2,71, dd, IH, 2,19, d, IH, 1,26, d, 3H,

g) ^l3C NMR spektrum s hlavnými píkmi, TMS ppm, 181,3, s, 174,7, s, 165,8, s, 158,3, s, 137,8, d, 107,8, s, 105,3, s, veľmi slabé 73,1, d, 70,0, s, 66,8, t, 62,0, t, 51,1, d, 47,3, t, 43,6, d, 43,6, t, 42,0, d, 18,5, q,

h) retenčný čas Rt 4,5 minút pri analýze na reverznom fázovom HPLC stĺpci, kde elučným činidlom je metanol: monobázický fosforečnan draselný 20 mM vo vode, nastavené na hodnotu pH 3,5 kyselinou fosforečnou, 12,1:87,9 objem/objem, rýchlosť toku 0,7 ml/min., teplota 40 °C, UF detektor 276 nm,

i) pozitívnu kolorimetrickú reakciu s ninhydrínom v acetóne 0,2 % hmotn./objem, s pinakryptolovou žltou vo vode 0,07 % hmotn./objem, negatívnou kolorimetrickou reakciou s diazotačným činidlom a kopoláciu s α-naflolom a

j) Rf = 0,35 na celulózovej F chromatografickej doštičke so systémom acetonitril/voda v pomere 91:9 objem/objem ako eluačným činidlom.
2. Spôsob prípravy antibiotika AB-041 podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa kultivuje Streptomyces sp. NCIMB 40428 alebo jeho mutant a z kultivačnej pôdy sa izoluje antibiotikum.
3. Spôsob podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že kultivácia sa uskutočňuje pri teplote 20 až 35 °C.
4. Spôsob podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že kultivácia sa uskutočňuje pri teplote 25 až 30 °C.
5. Spôsob podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že fermentácia sa uskutočňuje pri hodnote pH 5 až 9.
6. Spôsob podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že antibiotikum sa izoluje zo živnej pôdy filtráciou nasledovanou chromatografickými postupmi.
7. Spôsob podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že antibiotikum sa izoluje čistiacimi postupmi zahrnujúcimi ultrafiltráciu živnej pôdy špirálovou membránou, koncentráciu permeátu špirálovou membránou reverznou osmózou, postupné chromatografíe stĺpcom obsahujúcim neiónovú živicu a ionexovú živicu a rozmery vylučujúcu chromatografiu.
8. Mikroorganizmus Streptomyces sp. NCIMB 40428 produkujúci antibiotikum podľa nároku 1.
9. Herbicídny prostriedok, vyznačujúci sa tým, že ako účinnú látku obsahuje antibiotikum AB-041 podľa nároku 1 spolu s tuhými alebo kvapalnými nosičmi a prípadne ďalšími prísadami.