DE69029315T2 - Verfahren zur Herstellung von Oxazopyrrolochinolinen, die sie enthaltenden Produkte und deren Verwendung - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von Oxazopyrrolochinolinen, die sie enthaltenden Produkte und deren Verwendung

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Oxazopyrrolochinolinen und insbesondere ein Verfahren zur Herstellung von Oxazopyrrolochinolinen aus Pyrrolochinolinchinon, das unter Verwendung von Mikroorganismen erhalten wurde. Sie betrifft ferner neue Osazopyrrolochinoline und die Verwendung von Oxazopyrrolochinolinen.
  • Oxazopyrrolochinoline sind auch als 5-substituierte 2,8,10- Tricarboxy-1H-oxazo(5,4-h)-pyrrolo(2,3-f)chinoline (nachstehend genetisch "OPQs" genannt) bekannt und weisen die folgende chemische Strukturformel (I) auf:
  • in welcher R Wasserstoff oder eine niedere Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen ist, die durch einen oder mehrere Substituenten, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Hydroxyl-, Carboxyl-, Mercapto-, Amino-, Carbamoyl-, Phenyl-, Hydroxyphenyl-, Guanidino-, Imidazolyl- und Methylmercaptogruppen, substituiert sein kann.
  • OPQs sind Derivate von Pyrrolochinolinchinon (nachstehend "PQQ" genannt) und sind wichtige Verbindungen, die in der Zukunft als medizinische Substanzen entwickelt werden sollen. PQQ wurde als Coenzym für Methanoldehydrogenase von Methanol unter Einsatz von Mikroorganismen analysiert.
  • PQQ liegt nicht nur in Mikroorganismen vor, sondern auch in Pilzen (Eukaryoten), Hefen, und außerdem in Säugetieren und es hat eine wichtige Funktion als Coenzym. Ferner wurde festgestellt, daß PQQ verschiedene physiologische Aktivitäten aufweist, wie eine die Zellvermehrung fördernde Wirkung (japanische Patente Kokai Nr. 61-58584 und 63-233783), eine Wirkung zur Verhinderung des grauen Stars (japanische Patente Kokai Nr. 63-41421, 63-48215 und 64-29313), eine präventiv therapeutische Wirkung in bezug auf Lebererkrankungen (japanisches Patent Kokai Nr. 63-192717), eine die Wundheilung fördernde Wirkung (japanisches Patent Kokai Nr. 63- 152309), eine Wirkung als Antiallergikum (japanisches Patent Kokai Nr. 63-17493), eine Hemmwirkung in bezug auf reverse Transkriptase (japanische Patente Kokai Nr.63-156724 und 1-29313), und eine Glyoxalase 1-Hemmwirkung in Verbindung mit einer carbinostatischen Wirkung (japanische Patente Kokai Nr. 63-215628 und 1-29313).
  • Es wurde jedoch kürzlich festgestellt, daß PQQ toxisch auf die Nieren wirkt (Watanabe et al, "Hiroshima J.Med.Sci.", Bd.38, Nr.1, Seiten 49-51 (1989)), und die Entwicklung von sicheren PQQ-Derivaten, welche sowohl eine niedrige allgemeine Toxizität als auch eine niedrige Toxizität gegenüber den Nieren aufweist, ist erwünscht.
  • Die Erfinder haben Tests in bezug auf die Toxizität gegenüber den Nieren und Akuttoxizitätstests bei verschiedenen PQQ- Derivaten durchgeführt, und dabei festgestellt, daß Oxazopyrrolochinoline (OPQs) diese Toxizitäten erheblich reduzierten.
  • Es ist bekannt, daß OPQ (R=H in der obenstehenden Formel) erhalten werden kann, indem man PQQ mit Glycin reagieren läßt. (Collection of Abstract of Presentation in Japan Chemical Society 2III B34 (1989)). In diesem Verfahren wird jedoch PQQ hoher Reinheit, das frei von Verunreinigungen ist, eingesetzt. PQQ wird üblicherweise unter Verwendung von Mikroorganismen hergestellt und die erhaltene Kulturlösung enthält in großen Mengen verschiedene Fremdsubstanzen, z.B. Zellen, in Mikroorganismen vorkommende Substanzen, wie Proteine und Saccharide, Komponenten des Kulturmediums und Nebenprodukte. Es wird befürchtet, daß diese Fremdsubstanzen auf die Reaktion einen ungünstigen Einfluß haben könnten. Ferner reagiert das PQQ nach Beendigung der Herstellung von PQQ mittels Fermentierung schnell mit Protein und anderen Produkten und wird so verbraucht, und um diesen Verbrauch von PQQ zu verhindern, wird PQQ schnell abgetrennt und aus dem Kulturmedium gewonnen, und, falls notwendig, gereinigt und für die Herstellung von OPQ eingesetzt.
  • Die Abtrennung und das Gewinnen von PQQ aus dem Kulturmedium und die Reinigung desselben erfordern jedoch mühsam durchzuführende Arbeitsstufen. Da der Gehalt an PQQ im Kulturmedium sehr gering ist, sind weitere komplizierte Arbeitsstufen erforderlich, um PQQ wirksam abzutrennen und zu reinigen. Die Verwendung des so erhaltenen PQQ hoher Reinheit führt zu einem Engpaß in der industriellen Herstellung von OPQ.
  • Die Zeitschrift "European Journal of Biochemistry", Bd. 183, Nr.1, 1989, Seiten 41 bis 47 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von OPQ unter Verwendung von PQQ mit Aminosäuren in Gegenwart von NH&sub4;-Salzen. Die PQQ-Herstellung selbst ist dort nicht beschrieben. Die EP-A-206471 beschreibt ein Verfahren zum Erhalt von PQQ aus Bakterien, ohne auf das weitere Vorgehen einzugehen.
  • Im allgemeinen ist Aldosereduktase ein Enzym, welches in Gegenwart von NADPH Glukose zu Sorbit reduziert. Dieses Sorbit wird in Gegenwart von NAD mittels Sorbitdehydrogenase in Fruktose umgewandelt. Der Umwandlungsweg von Glukose über Sorbit zu Fruktose wird Polyolmetabolismus genannt.
  • Glukose ist eine wichtige Substanz als Energiequelle. Unter gewissen Bedingungen wird Glukose in Zellen eingeschlossen und anschließend wird der größte Teil davon durch die Wirkung von Hexokinase in Glukose-6-phosphorsäure überführt und mittels Glycolyse metabolisiert, und so wird nur ein geringer Prozentsatz der Glukose über die Polyolroute metabolisiert. Liegt jedoch aufgrund von Diabetes ein hoher Blutzuckergehalt vor, dann wird die Konzentration von Glukose in den Zellen des insulinunabhängigen Gewebes, wie den peripheren Nervensträngen, der Retina, dem Kristallkörper, der Hornhaut, dem Gefäßsystem, dem Nierenglomerulus und den roten Blutkörperchen erhöht, und der Glukosemetabolismus über die Polyolroute wird beschleunigt und es wird überschüssiges Sorbit gebildet. Dieses Sorbit weist eine hohe Polarität auf und diffundiert so weniger gut durch die Zellmembran. Daher geht man davon aus, daß hierdurch Diabetesbegleitkrankheiten entstehen, wie diabetesbedingte Nervenleiden, diabetesbedingte Netzhautentzündung, diabetesbedingter grauer Star, diabetesbedingte Hornhautentzündung und diabetesbedingte Nierenerkrankungen usw.
  • Daher sind die Prävention und das Heilen von Diabetesbegleitkrankheiten durch Hemmen der Aldosereduktase möglich. Verschiedene Aldosereduktase-Hemmsubstanzen wurden untersucht und entwickelt, aber keine davon läßt sich in der Praxis einsetzen.
  • Ferner wurde berichtet, daß Pyrrolochinolinchinon (PQQ) und Pyrrolochinolinchinonsalze (nachstehend genetisch "PQQs" genannt) kürzlich als neue Coenzyme von Oxidoreduktase als Hemmstoff für Aldosereduktase identifiziert wurden. (japanische Patente Kokai Nr. 63-41421 und 63-48215). Jedoch ist die Wirkung derselben immer noch unzureichend und ferner wurde festgestellt, wie bereits erwähnt, daß PQQ toxisch auf die Nieren wirkt.
  • Bis jetzt hat keiner der Wirkstoffe zur Heilung der erwähnten Diabetesbegleitkrankheiten durch Hemmen der Aldosereduktase praktische Anwendung gefunden.
  • Im allgemeinen ist das Immunsystem bei älteren Menschen schwächer, d.h. die Abwehr gegenüber Krankheitserregern, wie z.B. Bakterien, ist geringer, und sie sind gegenüber schwach pathogen wirkenden Mikroorganismen, wie Darmbazillen, infektanfällig. Insbesondere Patienten, die einen chirurgischen Eingriff hinter sich haben, infizieren sich oft mit diesen pathogenen Mikroorganismen und sterben an akuter Lungenentzündung. Das ist ein schwerwiegendes Problem bei der Pflege von alten Menschen nach einem chirurgischen Eingriff.
  • Das humorale und zelluläre Immunsystem spielen eine wichtige Rolle bei der Abwehr von Bakterieninfektionen, von Infektionen mit Hefen, Pilzen und Viren, und bei den Abwehrmechanismen des Körpers gegen Tumore.
  • Die Makrophagen spielen eine wichtige Rolle bei der Entfernung von Fremdsubstanzen und für die spezifische Immunität des Körpers. Die Entfernung pathogener Mikroorganismen und Tumorzellen wird durch die Immunantwort der T-Zellen der Lymphozyten und die Erzeugung von Antikörpern durch die B-Zellen der Lymphozyten bewirkt.
  • Selbstverständlich sind diese Immunsysteme auch an der Entfernung von aufgrund des Alterungsprozesses geschädigten Zellen beteiligt. Die Entwicklung von die Immunkräfte steigernden Wirkstoffen dient also nicht nur der Verhinderung von Infektionen oder Tumorwachstum, sondern ist auch im Zusammenhang mit dem Alterungsprozeß von Bedeutung.
  • Bis jetzt wurden keine Medikamente entwickelt, die diesbezüglich eine zufriedenstellende Wirkung aufweisen.
  • Die Leber ist ein wichtiges Organ, das den größten Teil des Stoffwechsels im Körper kontrolliert und für den Stoffwechsel von Sacchariden, Proteinen, Lipiden, Nukleinsäuren, Vitaminen und Hormonen, die Herstellung von Bilirubin, die Ausscheidung von Galle, die Entgiftung von körpereigenen und von außen zugeführten Substanzen mittels Oxidation, die Reduktion und Kombination und Ausscheidung derselben in die Galle, oder die Lösung derselben in Wasser, um die Ausscheidung über die Harnblase zu beschleunigen, verantwortlich ist. Diese Funktionen können aufgrund von toxischen Substanzen, Medikamenten, Alkohol, Strahlung und Viren gestört sein, so daß Krankheiten, wie Lebererkrankung aufgrund von Medikamenten, aufgrund von Alkohol, aufgrund von virusbedingter Hepatitis, oder Fettleber und Gelbsucht auftreten können. Werden diese Krankheiten verschleppt, können Leberzirrhose und Leberkrebs entstehen.
  • Es gibt bis jetzt keine Medikamente zur Heilung dieser Leberkrankheiten und momentan besteht die Behandlung lediglich aus Diät- und Ruhetherapie.
  • Andererseits wurde vor kurzem berichtet, daß man festgestellt hat, daß Pyrrolochinolinchinon und Pyrrolchinolinchinonsalze als neue Coenzyme von Oxidoreduktase zur Verhinderung von Lebererkrankungen dienen (japanisches Patent Kokai Nr. 63- 192717).
  • Es war also die Entwicklung von Medikamenten erwünscht, welche eine allgemein geringe Toxizität, eine geringe spezifische Toxizität in bezug auf die Nieren und eine Hemmwirkung in bezug auf Lebererkrankungen aufweisen.
  • Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur wirksamen und stabilen Produktion von OPQs oder Salzen davon zur Verfügung zu stellen.
  • Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, neue OPQs-Verbindungen zur Verfügung zu stellen.
  • Ferner ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung,einen Aldosereduktase-Hemmstoff, ein therapeutisches Mittel für Diabetesbegleitkrankheiten , ein Immunsteigerungsmittel und einen Hemmstoff in bezug auf Lebererkrankungen zur Verfügung zu stellen, welche eine allgemeine geringe Toxizität und eine geringe spezifische Toxizität gegenüber den Nieren aufweisen.
  • Das Ergebnis der van den Erf indern durchgeführten intensiven Forschungsarbeit in bezug auf die Herstellung von OPQs durch Züchten von Mikroorganismen ist, daß, wenn ein für die Herstellung von PQQ geeigneter Mikroorganismus in einem Medium mit Methanol als Kohlenstoffquelle zwecks Vermehrung von PQQ im Kulturmedium gezüchtet wird und wenn dann mindestens eine von verschiedenen Aminosäuren und Monomethylamin zum Kulturmedium zugegeben wird und wenn man PQQ mit diesen Verbindungen in Gegenwart von Sauerstoff reagieren läßt, das im Kulturmedium sich anreichernde PQQ wirksam in OPQs umgewandelt wird. Diese OPQs umfassen neue Verbindungen mit ausgezeichneten physiologischen Wirkungen, die für die verschiedensten Zwecke eingesetzt werden können.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren ist in Anspruch 1 definiert.
  • In der vorliegenden Erfindung können jegliche Mikroorganismen eingesetzt werden, welche die Fähigkeit besitzen, Methanol zu nutzen, und welche ferner die Fähigkeit haben, PQQ extrazellulär herzustellen.
  • Repräsentative Beispiele für Stämme dieser Mikroorganismen sind wie folgt:
    • 1.Gattung Methylobacillus:
  • Methylobacillus glycogenes
  • (Die Namen der Arten basieren auf dem International Journal of Systematic Bacteriology, Bd. 36, Seiten 502-511 (1986)).
    • 2.Gattung Methylophilus:
  • Methylophilus methylotrophus NCIB 10515 and ATCC 31226 (=NCIB 11809).
  • (Die Namen der Arten basieren auf dem International Journal of Systematic Bacteriology, Bd. 37, Seiten 446-448 (1987)).
    • 3.Gattung Methylobacterium:
  • Methylobacterium extorquens
  • Methylobacterium rhodinum ATCC 14821 (=JCM 2811=NCIB 9421);
  • Methylobacterium rhodesianum
  • Methylobacterium zatmanii
  • Methylobacterium organophilum ATCC 27886 (=JCM 2833);
  • Methylobacterium mesophilius ATCC 29983 (=JCM 2829=NCIB 11561);
  • Methylobacterium fujisawaensis NCIB 12417 and NCIB 11272;
  • Methylobacterium radiotolerans IAM 12099 (=ATCC 27329=JCM 2830=NCIB 10815), IAM 12098 (=JCM 2831), NCIB 9142 and NCIB 9143; und
  • Methylobacterium SP. ATCC 21438 (=JCM 2827), IAM 12623 (=JCM 2834), JCM 2832, NCIB 9141, NCIB 9145, NRRL B-3449, FERM P-4893, FERM P-4894, FERM P-4895, FERM P-4896, FERM P-4897 und FERM P-9466.
  • (Die Namen der Arten basieren auf dem International Journal of Systematic Bacteriology, Bd. 33, Seiten 875-877 (1983) und Bd.38, Seiten 124-127(1988)).
    • 4. Gattung Ancylobacter:
  • Ancylobacter aquaticus ATCC 25396 (=CCM 1786=DSM 101=NCIB 9271), ATCC 27068 (=DSM 334), ATCC 27069, ATCC 21373 (=DSM 1106), NCIB 10516 (=DSM 2457), DSM 2666 (=FERM P-4416), DSM 2667 (=FERM P- 4417), DSM 2668 (=FERM P-4418) and DSM 2669 (=FERM P- 4419); und
  • Ancylobacter sp. DSM 1107, DSM 1108, DSM 1277, DSM 2455 and DSM 2456.
  • (Die Namen der Arten basieren auf dem International Journal of Systematic Bacteriology, Bd. 36, Seiten 415-421 1986)).
    • 5.Gattung Hyphomicrobium:
  • Hyphomicrobium vulgare NCIB 9698, NCIB 9775, DSM 1564, NCIB 11052, NCIB 9696, DSM 1566, NCIB 9697, NCIB 9699, NCIB 10099, NCIB 10342 (=DSM 1565) und NCIB 11053; und
  • Hyphomicrobium methylovorum IFO 14180, NCIB 10517 and DSM 1869 (=NCIB 11706)
  • (Die Namen der Arten basieren auf dem Journal of Applied Microbiology, Bd.33, Seiten 521-542 (1987)).
    • 6.Gattung Xanthobacter:
  • Xanthobacter autotrophicus DSM 432, DSM 431, DSM 685, DSM 1393, DSM 1618, DSM 2009 and DSM 2267; und
  • Xanthobacter flavus DSM 338 (=NCIB 10071)
  • (Die Namen der Arten basieren auf dem International Journal of Systematic Bacteriology, Bd. 28, Seiten 573-581 (1981)).
    • 7.Gattung Acidomonus:
  • Acidomonus methanolica JCM 6891 (=IMET 10945) und JCM 3712 (=FERM P-2664)
  • (Die Namen der Arten basieren auf dem International Journal of Systematic Bacteriology, Bd. 39, Seiten 50-55 (1989)).
    • 8.Gattung Paracoccus:
  • Paracoccus denitrificans ATCC 17441 (=DSM 65=IAM 12479=NCIB 11627), ATCC 13543 (=CCM 982=NRRL B- 3784), ATCC 19367 (=DSM 413=IFO 13301=NCIB 8944= NRRL B-3785), CCM 1396 (=DSM 415=NCIB 9722) and IFO 12442; und
  • Paracoccus alcaliphilus JCM 7364 (=FERM P-9282), FERM P-9280 and FERM P-9281
  • (Die Namen der Arten basieren auf dem International Journal of Systematic Bacteriology, Bd. 39, Seiten 116-121 (1989)).
    • 9.Gattung Thiobacillus:
  • Thiobacillus novellus ATCC 8093 (=CCM 1077 =DSM 506=IFO 12443=NCIB 9113) und NCIB 10456.
  • (Die Namen der Arten basieren auf dem International Journal of Systematic Bacteriology, Bd. 30, Seiten 225-420 (1980)).
    • 10.Gattung Methylophaga:
  • Methylophaga marina ATCC 35842 (=NCMB 2244);
  • Methylophaga thalassica ATCC 33146 (=IAM 12458=NCMB 2163), NCMB 2162 (=FERM P-3622) and ATCC 33145; und Methylophaga sp. FERM P-3619, FERM P-3620, FERM P-3623 and FERM P-3624
  • (Die Namen der Arten basieren auf dem International Journal of Systematic Bacteriology, Bd. 37, Seiten 402-406 (1982 )).
    • 11.Gattung Mycobacterium:
  • Mycobacterium methanolica FERM P-8823, FERM P-8824, FERM P-8825, FERM P-8826, FERM P-8827, FERM P-9464, FERM P-9465 und FERM P-9497.
  • (Die mikrobiologischen Eigenschaften dieser Stämme, die zur Gattung Mycobacterium gehören, sind in den japanischen Patenten Kokai Nr. 63-28385, 64-51077 und 64-60371 erwähnt).
  • Diese Stämme sind sämtlich bekannt.
  • Es lassen sich auch aus diesem Stämmen erhaltene Mutanden einsetzen.
  • Es ist notwendig, daß Nährstoffmedien, die zum Züchten dieser PQQ produzierenden Mikroorganismen eingesetzt werden, Methanol als Hauptkohlenstoffquelle enthalten. Ferner werden geeignete Mengen an Stickstoff und anorganische Quellen als Mediumkomponenten eingesetzt.
  • Normalerweise werden z.B. Ammoniumsulfat, Harnstoff, Ammoniumnitrat und Ammoniumphosphat als Stickstoffquelle und Phosphate, Magnesiumsalze, Eisensalze als anorganische Salze und, falls notwendig, Salze von Spurenmetallen eingesetzt. Ferner, wenn der eingesetzte Stamm Auxotrophieerscheinungen zeigt, dann muß dem Medium Nährsubstanz zugegeben werden.
  • Da Mikroorganismen der Gattung Methylphaga NaCl zum Wachstum brauchen, ist es notwendig, dem Medium NaCl in einer Menge von ca. 2 bis 4 Gewichtsprozent zuzugeben oder Meerwasser als Wasser zum Herstellen des Mediums zu verwenden.
  • Die für das Wachstum und das Vermehren der entsprechenden Stämme geeignete Züchtungstemperatur liegt normalerweise im Bereich von 25 bis 45ºC.
  • Der zum Züchten, für das Wachstum und die Vermehrung der entsprechenden Stämme geeignete pH-Bereich beträgt ca 6 bis 8. Da jedoch der für das Wachstum der Mikroorganismen der Gattung Acidomonus benötigte pH-Wert 2,0-5,5 ist und der für das Wachstum des Stammes Paracoccus Alcaliphilus 7,0-10,0 beträgt, ist es bei Verwenden dieser Stämme notwendig, einen zwischen diesen Werten liegenden pH-Wert zu wählen.
  • Wenn ein Ammoniumsalz als Stickstoffquelle eingesetzt wird, dann nimmt der pH-Wert des Kulturmediums gleichzeitig mit der Zunahme des Zellwachstums ab und so ist es notwendig, den pH- Wert des Kulturmediums durch Zugabe von Ammoniak, Kaliumhydroxid, Natriumhydroxid o.ä. während des Züchtens zu regulieren. Ammoniak ist dabei besonders bevorzugt.
  • PQQ wird im Kulturmedium durch aerobes Züchten mittels Verfahren , wie z.B.dem Züchten unter Durchperlen von Luft, gebildet.
  • Zu diesem Kulturmedium wird mindestens eine α-Aminosäure oder Monomethylamin zugegeben, um diese Verbindung mit PQQ, das im Kulturmedium enthalten ist, in Gegenwart von Sauerstoff reagieren zu lassen, um so OPQs entsprechend der eingesetzten Aminosäure oder entsprechend dem eingesetzten Monomethylamin zu erhalten.
  • Die hier eingesetzten α-Aminosäuren werden durch die Strukturformel R-CH(NH&sub2;)-COOH dargestellt.
  • (Wobei R Wasserstoff oder eine niedere Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen darstellt, welche durch einen oder mehrere Substituenten substituiert sein kann, wobei diese Substituenten ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Hydroxyl-, Carboxyl-, Mercapto-, Amino-, Carbamoyl-, Phenyl-, Hydroxyphenyl-, Guanidino-, Imidazolyl- und Methylmercaptogruppen).
  • Typische Beispiele dafür sind Glycin, Threonin, Prolin, Tryptophan, Alanin, Valin, Leukin, Isoleukin, Methionin, Glutaminsäure, Phenylalanin, Tyrosin, Glutamin, Serin, Aspartinsäure, Lysin, Histidin, Arginin, Asparagin und Cystein.
  • Sie können in der D-Form, der L-Form oder Mischungen davon vorliegen.
  • Monomethylamin und Salze davon, wie z.B. das Hydrochlorid, können ebenfalls eingesetzt werden.
  • Diese Verbindungen werden dem Kulturmedium in einer Menge von mindestens 1 Mol, vorzugsweise nicht weniger als 5 Mol je Mol PQQ, das im Kulturmedium enthalten ist, zugegeben, wenn die Konzentration an PQQ im Kulturmedium 10 µg- 10 g/l, vorzugsweise 100 µg - 10 g/l erreicht hat. Je höher die Konzentration, umso besser, in der Praxis sollte sie jedoch mindestens 0,1 g/l betragen.
  • Normalerweise wird das Kulturmedium so eingesetzt , wie es gebildet worden ist, falls notwendig kann jedoch eine Kulturlösung eingesetzt werden, von welcher ein Teil des Wassers durch Aufkonzentrieren entfernt worden ist.
  • Der pH-Wert der Reaktionslösung variiert je nach Art der Amiv nosäure und je nach Art der gewünschten OPQs und kann daher nicht allgemein festgelegt werden, in der Praxis liegt er jedoch vorzugsweise zwischen 2 und 10. Die Einzelheiten sind im folgenden aufgeführt.
  • Die Reaktionstemperatur liegt in der Praxis vorzugsweise bei ca. 20 bis 100ºC, mehr bevorzugt beträgt sie ca. 25 bis 80ºC.
  • Die Reaktionszeit ist nicht wesentlich, üblicherweise beträgt sie jedoch nicht mehr als ca. 48 Stunden, vorzugsweise ca 1 Stunde bis 30 Stunden.
  • Die Konzentration an gelöstem Sauerstoff in der Reaktionslösung ist nicht wesentlich, beträgt jedoch vorzugsweise 0,5 bis 1 TpM oder mehr, um die Reaktion in kurzer Zeit abzuschließen. Zu diesem Zweck kann man sich der Methode des Rührens unter Luftzufuhr, Sauerstoffzufuhr, Zufuhr eines Sauerstoff enthaltenden Gasgemisches oder der Methode des Druckerhöhens im Reaktor bedienen.
  • PQQ kann durch Durchführen der Reaktion unter den genannten Bedingungen in POQs umgewandelt werden.
  • Der Zeitraum vor der Zugabe der Aminosäure oder des Monomethylamins zum Kulturmedium ist vorzugsweise so kurz wie möglich und beträgt üblicherweise bis zu 10 Stunden, vorzugsweise bis zu 2 Stunden nach Abschluß der Herstellung von PQQ mittels Fermentierung.
  • OPQ (Oxazopyrrolochinolin) (R=H in der Formel (I)) wird durch Zugabe mindestens einer der Verbindungen Glycin, Tryptophan, Prolin, Threonin, Tyrosin, Serin und Monomethylamin zur Kulturlösung erhalten und der pH-Wert für die Reaktion liegt insbesondere zwischen 6 -9.
  • Ferner wird die nachstehend als 1-Methylethyl OPQ (R=CH(CH&sub3;))&sub2; in Formel (I)) bezeichnete Verbindung (5-(1- Methylethyl)-2,8,10-tricarboxy 1H-oxazo(5,4-h)-pyrrolo(2,3- f)chinolin);(das vor "OPQ" genannte "1-Methylethyl" gibt den Substituenten in der 5-Position von OPQs an und das gleiche gilt für andere OPQs ) durch Zugabe von Valin erhalten, 1- Methylpropyl OPQ (R= CH(CH&sub3;)CH&sub2;CH&sub3;) wird durch Zugabe von Isoleucin erhalten, 2-Methylpropyl OPQ (R=CH&sub2;CH(CH&sub3;)&sub2;) wird durch Zugabe von Leukin erhalten, Methyl-OPQ (R=CH&sub3;) wird durch Zugabe von Alanin erhalten, 2-Carboxyethyl-OPQ (R=CH&sub2;CH&sub2;CO&sub2;H) wird durch Zugabe von Glutaminsäure erhalten, 2-Carbamoylethyl-OPQ (R=CH&sub2;CH&sub2;CONH&sub2;) wird durch Zugabe von Glutamin erhalten, 2-Methylthioethyl-OPQ (R=CH&sub2;CH&sub2;SCH&sub3;) wird durch Zugabe von Methionin erhalten, Benzyl-OPQ
  • wird durch Zugabe von Phenylalanin erhalten, Carboxymethyl-OPQ (R=CH&sub2;CO&sub2;H) wird durch Zugabe von Aspartinsäure erhalten, Carbamoylmethyl-OPQ (R=CH&sub2; NH&sub2;) wird durch Zugabe von Asparagin erhalten, 1-(4-Imidazolyl)methyl-OPQ
  • wird durch Zugabe von Histidin erhalten, 4-Aminobutyl-OPQ (R=(CH&sub2;)&sub4;NH&sub2;) wird durch Zugabe von Lysin erhalten, 3-Guanidinpropyl-OPQ (R=(CH&sub2;)&sub3;HN H&sub2;) wird durch Zugabe von Arginin erhalten, und Mercaptomethyl-OPQ (R=CH&sub2;SH) wird durch Zugabe von Cystin zu den PQQ enthaltenden Kulturmedien erhalten. In diesem Fall liegt der pH-Wert in dem Reaktionsmedium besonders bevorzugt zwischen 6 -9.
  • Ferner wird Hydroxymethyl-OPQ (R=CH&sub2;OH) durch Zugabe von Serin zum Kulturmedium und durch Einstellen des pH-Wertes in der Reaktion auf 2 bis 6, am meisten bevorzugt von 4 bis 6, erhalten. Ist der pH- Wert höher als 6, dann wird OPQ (R=H) erhalten.
  • 4-Hydroxybenzyl-OPQ
  • wird durch Zugabe von Tyrosin zur Kulturlösung und durch Einstellen des pH-Wertes für die Reaktionslösung auf 4-8, am meisten bevorzugt von 6- 8, erhalten. Ist der pH-Wert höher als 8, dann wird OPQ (R=H) erhalten.
  • Das Salz vgn OPQs kann durch Zugabe eines Alkali entsprechend dem gewünschten Salz von OPQs zu einer OPQs enthaltenden Kultur erhalten werden.
  • Aus der so erhaltenen Reaktionsmischung werden feste Substanzen, wie Zellen, durch übliche Fest-Flüssig-Trennverfahren, wie z.B. Filtrieren und Zentrifugieren abgetrennt, wobei ein flüssiger Überstand erhalten wird.
  • Im Fall der Herstellung von OPQs bei niedrigem pH-Wert von 3 bis 5, können die gebildeten OPQs als Niederschlag in der Reaktionsmischung vorliegen. Daher ist es notwendig, die gebildeten OPQs einmal durch Einstellen des pH-Wertes der Reaktionslösung bzw. der Reaktionsmischung von einem neutralen auf einen alkalischen Bereich zu lösen und dann den flüssigen Überstand zu erhalten. Die OPQs werden abgetrennt und aus dem resultierenden flüssigen Überstand gewonnen.
  • Es gibt verschiedene Methoden zum Gewinnen der OPQs aus dem so erhaltenen flüssigen Überstand. Sie umfassen z.B. ein Verfahren, bei welchem ein Harzträger, der dazu in der Lage ist, OPQs zu adsorbieren, eingesetzt wird, ein Extraktionsverfahren, ein Ausfällungsverfahren, ein Waschverfahren und ein Ultrafiltrationsverfahren. Diese Verfahren können einzeln oder in Kombination angewandt werden, um OPQs abzutrennen und zu reinigen.
  • Das Verfahren zum Abtrennen und Reinigen von OPQs wird noch näher erläutert.
  • Das Ausfällungsverfahren umfaßt das saure Ausfällverfahren, bei welchem OPQs ausgefällt werden, wobei die Reaktionsmischung durch anorganische Säuren, wie Salzsäure, Schwefelsäure und Salpetersäure, oder organische Säuren, wie Trichloressigsäure, Trifluoressigsäure und Trifluormethansulfonsäure, sauer gemacht wird; das Aussalzverfahren, bei welchem OPQs durch Zugabe von Alkalimetallsalzen zur Reaktionsmischung, wie Natriumchlorid und Kaliumchlorid, oder Erdalkalimetallsalze, wie Calciumchlorid und Magnesiumchlorid ausgefällt werden; und das Lösungsmittelausfällverfahren, bei welchem OPQs durch Mischen der Reaktionsmischung mit einem Lösungsmittel, wie Aceton, in welchem Hydroxymethyl-OPQs eine geringe Löslichkeit haben, ausgefällt werden.
  • Bei diesen Ausfällverfahren erhöht sich die Ausbeute an OPQs mit der Abnahme der Temperatur in der Lösung.
  • Die Reinheit des Pulvers von OPQs oder von Ausfällungen, welche OPQs enthalten, die durch die genannten Reinigungsverfahren erhalten worden sind, läßt sich durch Unterwerfen des Pulvers eines Waschvorgangs mit Lösungsmitteln, wie Aceton, Diethyläther und saures Wasser, welche OPQs kaum lösen, weiter verbessern.
  • Bei der Herstellung von OPQs mittels Fermentierung kann die Entfernung von Fremdsubstanzen, wie Polymeren, im Kulturmedium mittels des Ultrafiltrationsverfahrens durchgeführt werden.
  • Für das Ultrafiltrationsverfahren kann ein Verfahren eingesetzt werden, bei welchem Trägerstoffe in Form von Harzen, wie SEPHADEX G-10 (hergestellt durch Pharmacia Fine Chemicals Inc.) und die TOYOPAL HW -Reihe (hergestellt durch Toso Co.) Anwendung finden, oder ein Verfahren, bei welchem verschiedene Ultrafiltrationsmembrane und Ultrafiltrationshohlfasern eingesetzt werden.
  • Wasser, organische Lösungsmittel usw. werden als Extrakionsmittel in Extraktionsverfahren eingesetzt. Organische Lösungsmittel sind vorzugsweise solche, welche eine geringe Kompatibilität mit Wasser aufweisen. Geeignete Beispiele dafür sind aliphatische Alkohole mit 4 oder mehr Kohlenstoffatomen, wie n-Butanol.
  • Für das Verfahren, in welchem ein Harzträger eingesetzt wird, der OPQs adsorbieren kann, können jegliche Harzträger eingesetzt werden, die OPQs adsorbieren und desorbieren können.
  • Typische Beispiele für Harzträger umfassen Anionenaustauschharzträger, wie DEAE-SEPHADEX A-25 (hergestellt von der Firma Pharmacia Fine Chemicals Inc.), welches ein Polysaccharidträger ist, und DEAE-TOYOPAL 650 (hergestellt von Toso Co.) und AMBERLIST A-21 (hergestellt von Rohm & Haas Co.), welches hydrophile Polymerharze sind. Träger vom Typ Adsorption-Trennung umfassen die DIAION HP-Reihe (hergestellt von Mitsubishi Chemical Ind.,Ltd.) und die AMBERLITE XAD-Reihe (Rohm 6 Haas Co.), welches hydrophobe Polymerharze sind, Siliciumdioxid, Octadecylsiliciumdioxid und Aluminiumoxid. Typische hydrophobe Harzträger für die Chromatographie umfassen BUTYL- TOYOPAL 650 und PHENYL-TOYOPAL 650 (hergestellt von Toso Co.).
  • Die Identifizierung von OPQs kann mittels Verfahren, wie der Elementaranalyse, dem nuklearmagnetischen Resonanzspektrum, dem Infrarot-Absorptionsspektrum und mittels Massenspektrometrie durchgeführt werden.
  • Die Bestimmung der Menge an OPQs kann mittels Hochleistungs- Flüssigchromatographie durchgeführt werden.
  • Diese OPQs umfassen die folgenden Verbindungen: (1) Hydroxymethyl-OPQ
  • 5-Hydroxymethyl-2,8,10-tricarboxy-1H-oxazo(5,4-h)- pyrrolo(2,3-f)-chinolin. (2) 1-Methylethyl-OPQ
  • 5-(1-Methylethyl)-2,8,10-tricarboxy-1H-oxazo(5,4-h)- pyrrolo(2,3-f)chinolin. (3) 1-Methylpropyl-OPQ
  • 5-(1-Methylpropyl)-2,8,10-tricarboxy-1H-oxazo(5,4-h)-pyrrolo(2,3-f)chinolin. (4) 2-Methylpropyl-OPQ
  • 5-(2-Methylpropyl)-2,8,10-tricarboxy-1H-oxazo(5,4-h)pyrrolo(2,3-f)chinolin. (5) Methyl-OPQ
  • 5-Methyl-2,8,10-tricarboxy-1H-oxazo(5,4-h)pyrrolo-(2,3- f)chinolin.
    • (6) 2-Carboxylethyl-OPQ
  • 5-(2-Carboxyethyl)-2,8,10-tricarboxy-1H-oxazo(5,4-h)pyrrolo(2,3-f)chinolin. (7) 2-Carbamoylethyl-OPQ
  • 5-(2-Carbamoylethyl)-2,8,10-tricarboxy-1H-oxazo(5,4-h)pyrrolo(2,3-f)chinolin. (8) 2-Methylthioethyl-OPQ
  • 5-(2-Methylthioethyl)-2,8,10-tricarboxy-1H-oxazo-(5,4-h)pyrrolo(2,3-f)chinolin. (9) Benzyl-OPQ
  • 5-Benzyl-2,8,10-tricarboxy-1H-oxazo(5,4-h)-pyrrolo-(2,3- f)chinolin. (10) 4-Hydroxybenzyl-OPQ
  • 5-(4-Hydroxybenzyl)-2,8,10-tricarboxy-1H-oxazo(5,4-h)pyrrolo(2,3-f)chinolin.
  • Diese neuen Verbindungen können unter Verwendung von Mikroorganismen, wie oben erwähnt, und außerdem unter Verwendung von zuvor abgetrenntem und gereinigtem PQQ hergestellt werden. Das heißt, die gewünschten OPQs können dadurch erhalten werden, daß man PQQ oder Salze von PQQ mit der gleichen Aminosäure, entsprechend den gewünschten OPQs, oder mit Monomethylamin in Gegenwart von Sauerstoff reagieren läßt. Die Mengen an Aminosäure oder Monomethylamin und die Reaktionsbedingungen, wie Temperatur und pH-Wert, sind die gleichen wie beim Verfahren, in welchem Mikroorganismen eingesetzt werden. Salze dieser PQQ umfassen Alkalimetallsalze, Erdalkalimetallsalze, Ammoniumsalze und substituierte Ammoniumsalze.
  • Beispiele für substituierte Ammoniumsalze sind alkylsubstituierte Ammoniumsalze und Hydroxyalkyl-substituierte Ammoniumsalze.
  • Typische Beispiele für die Salze von OPQs sind Natriumsalze, Kaliumsalze, Magnesiumsalze, Calciumsalze, Ammoniumsalze, Trimethylammoniumsalze, Triethylammoniumsalze und Triethanolammoniumsalze.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die neuen Verwendungsmöglichkeiten von OPQs.
  • Diese umfassen Aldose-Reduktase-Hemmstoffe, Therapiemittel für Diabetesbegleitkrankheiten, Immunstärkungsmittel und Hemmstoffe in bezug auf Lebererkrankungen, welche die Verbindungen (OPQs), die durch die folgende Formel I dargestellt sind, oder Salze davon als Wirkstoff enthalten.
  • wobei R Wasserstoff oder eine niedere Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen darstellt, welche durch einen oder mehrere Substituenten, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Hydroxyl-, Carboxy-, Mercapto-, Amino-, Carbamoyl-, Phenyl-, Hydroxyphenyl-, Guanidino-, Imidazolyl- und Methylmercaptogruppen, substituiert sein kann.
  • OPQs und Salze davon, die in vorliegender Erfindung eingesetzt werden, können solche mit der oben dargestellten Formel (I) sein, in welcher R gleich R' der α-Aminosäure, dargestellt durch die Formel R'-CH&sub2;(NH&sub2;)-COOH, sein kann, aber vorzugsweise ist R gleich R' der natürlichen Aminosäure, mehr bevorzugt ist R gleich R' der α-Aminosäure, welche natürliches Protein aufbaut.
  • Typische Beispiele für OPQs sind OPQ, Hydroxymethyl-OPQ, 1- Methylethyl-OPQ, 1-Methylpropyl-OPQ, 2-Methylpropyl-OPQ, Methyl-OPQ, 2-Carboxyethyl-OPQ, 2-Carbamoylethyl-OPQ, 2- Methylthioethyl-OPQ, Benzyl-OPQ, 4-Hydroxybenzyl-OPQ, Carboxymethyl-OPQ , Carbamoylmethyl-OPQ, 4-Imidazolylmethyl-OPQ, 4-Aminobutyl-OPQ, 3-Guanidinopropyl-OPQ und Mercaptomethyl- OPQ.
  • Typische Beispiele für Salze von OPQs sind Natriumsalze, Kaliumsalze, Magnesiumsalze, Calciumsalze, Ammoniumsalze, Trimethylammoniumsalze, Triethylammoniumsalze und Triethanolammoniumsalze.
  • Für neue medizinische Einsatzzwecke können neben den genannten Verbindungen Ester, dargestellt durch die folgende Formel (11), eingesetzt werden.
  • wobei R Wasserstoff oder eine niedere Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen darstellt, welche durch einen oder mehrere Substituenten, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Hydroxyl-, Carboxy-, Mercapto-, Amino-, Carbamoyl-, Phenyl-, Hydroxyphenyl-, Guanidino-, Imidazolyl- und Methylmercaptogruppen, substituiert sein kann und R¹,R² und R³, welche gleich oder verschieden sein können, jeweils ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe, eine Alkenylgruppe oder eine Benzylgruppe darstellen.
  • Die in vorliegender Erfindung eingesetzten Ester können Monoester, Diester und Triester sein. Diese Ester von OPQs können leicht hergestellt werden, indem man OPQs oder Salze davon und Alkohole miteinander durch herkömmliche Verfahren reagieren läßt. Die Alkylgruppen umfassen z.B. die Methylgruppe, Ethylgruppe, und die Alkenylgruppen umfassen z.B. die Allylgruppe.
  • Alternativ dazu können die gewünschten Ester von OPQs erhalten werden, indem man PQQ oder ein PQQ-Salz mittels herkömmlicher Methoden mit Alkoholen reagieren läßt, wobei Ester von PQQs erhalten werden, und indem man anschließend die Ester von PQQs mit verschiedenen Aminosäuren oder Methylamin reagieren läßt.
  • Als Aldose-Reduktase-Hemmstoff, als Heilmittel für Diabetesbegleitkrankheiten, als Immunstärkungsmittel und als Hemmstoff in bezug auf Lebererkrankungen nach vorliegender Erfindung können OPQs oder Salze davon oder Ester davon entweder als parenterale oder nicht-parenterale Formulierung einschließlich eines pharmazeutisch verträglichen Trägers eingesetzt werden. Sie können in herkömmlichen Formulierungsformen, wie als Kapseln, Tabletten und Pulver verabreicht werden. Im Fall einer nicht-oralen Verabreichung werden sie in geeigneter flüssiger Formulierungsform eingesetzt, z.B. als Injektionen oder Flüssigkeiten. Auch die Verabreichung in Form von Zusammensetzungen mit Langzeitwirkung ist wirksam. Für die Formulierung der Wirkstoffe der vorliegenden Erfindung kann gegebenenfalls ein oberflächenaktives Mittel, ein Trägerstoff, ein Farbstoff, ein Konservierungsmittel oder ein Beschichtungshilfsmittel eingesetzt werden.
  • Ferner können sie in Kombination mit anderen Arzneimittel angewendet werden.
  • Die Dosierung variiert je nach Art der Krankheit, Krankheitsverlauf, Art der OPQs und Art der Verabreichung, normalerweise beträgt sie 1 bis 100 mg, vorzugsweise 5 bis 50 mg/kg (Körpergewicht) pro Tag. Die Wirkstoffe werden in der genannten Dosierung einmal oder über den Tag verteilt 2- oder 3-mal verabreicht.
  • Nach vorliegender Erfindung lassen sich OPQs einschließlich neuer Verbindungen und Salze davon wirksam und zuverlässig herstellen. Diese OPQs und Salze und Ester davon weisen sehr geringe Toxizitäten, wie z.B. akute oder chronische Toxizität und Toxizität gegenüber den Nieren, auf und lassen sich wirksam als Aldose-Reduktase-Hemmstoff, als Heilmittel für Diabetesbegleitkrankheiten und als Heilmittel für Lebererkrankungen einsetzen.
  • Ferner steht die Verwendung dieser OPQs und der Salze davon als andere Medikamente, wie Medikamente für Tiere und als landwirtschaftliche Wirkstoffe, wie Mittel zur Förderung der Pollenkeimung und Mittel zur Förderung der Pollenorganverlängerung (pollen tube elongation) in Aussicht.
  • Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung weisen immunstärkende Wirkung auf, d.h. die Aktivität von B- und T-Zellen und die Aktivität der Makrophagen wird verstärkt, und so dienen sie nicht nur der Verhinderung von verschiedenen Infektionen und Tumoren, sondern auch als Vorbeugungs- und Therapiemittel gegen altersbedingte Krankheiten.
  • (Test der PQQ undd OPQs auf akute Toxizität und Toxizität gegenüber Nieren)
    • (1) Test auf akute Toxizität:
  • (i) Männlichen SPF-ICR-Mäusen werden im Alter von 5 Wochen (von Charles River Co. zur Verfügung gestellt) PQQ.2Na und OPQs in Dosierungen von 20,40,160 und 200 mg/kg Körpergewicht der Maus intraperitoneal verabreicht und sie werden bei 25ºC 14 Tage lang aufgezogen. OPQ, 1-Methylpropyl-OPQ, 2- Methylthioethyl-OPQ und Benzyl-OPQ werden als OPQs eingesetzt. Eine Gruppe bestand aus 8 Mäusen. Das Ergebnis ist wie folgt bei Verabreichung von 20 mg/kg und 40 mg/kg PQQ.2Na überlebten die Mäuse, aber 5 Mäuse starben bei Verabreichung von 80mg und alle 8 Mäuse starben bei Verabreichung von 160 mg und 200mg.
  • LD&sub5;&sub0; von PQQ.2na betrug ca. 70mg/kg Maus.
  • Andrerseits starb keine Maus bei Verabreichung von OQPs.
  • (ii) Männlichen SPF-ICR-Mäusen wird im Alter von 5 Wochen (von Charles River Co. zur Verfügung gestellt)OPQ in Dosierungen von 0,1;0,2;0,4; 0,8 oder 1,2g/kg Körpergewicht der Maus intraperitoneal verabreicht und sie werden bei 25ºC 14 Tage lang aufgezogen. Eine Gruppe bestand aus 8 Mäusen. Alle Mäuse überlebten bei Verabreichung von 0,1-0,4 g, 2 Mäuse starbei bei Verabreichung von 0,89 und 6 Mäuse starben bei Verabreichung von 1,2g.
  • LD&sub5;&sub0; betrug ca. 1,0g/kg Maus.
  • (iii) Männlichen SPF-ICR-Mäusen wird im Alter von 5 Wochen (von Charles River Co. zur Verfügung gestellt)OPQ in einer Dosierung von 1,0 g,1,5 g, oder 2,0g/kg Körpergewicht der Maus oral verabreicht. Sie werden bei 25ºC 14 Tage lang aufgezogen. Eine Gruppe bestand aus 8 Mäusen.
  • Keine Maus starb.
  • Aus den Ergebnissen von (i) - (iii) geht hervor, daß OPQs eine wesentlich geringere Toxizität aufweisen als PQQ.
    • (2) Toxizität gegenüber den Nieren
  • (i) Die Toxizität gegenüber den Nieren, festgestellt durch Urinuntersuchung:
  • In gleicher Weise wie zur Feststellung der akuten Toxizität werden PQO.2Na und OPQs den Mäusen intraperitoneal verabreicht und die Mäuse werden aufgezogen. Der Urin wird jeden Tag entnommen und die Konzentration von Glukose im Urin wird unter Verwendung von Uristex II(hergestellt von Miles Sangkyo Co.) erhalten. Wie in Tabelle 1 dargestellt, wird im Urin von Mäusen, welchen PQQ.2Na verabreicht wurde, Zucker festgestellt, im Urin der Mäuse, welchen OPQs verabreicht wurden, wurde jedoch kein Zucker festgestellt.
  • Das heißt, daß PQQ eine Toxizität gegenüber den Nieren aufweist, OPQs jedoch nicht. Tabelle 1
  • - es wurde keine Glucose festgestellt
  • ± Glucose 0.10 g/dl
  • + Glucose 0.25 g/dl
  • 2+ Glucose 0.50 g/dl
  • 3+ Glucose 1.00 g/dl
  • 4+ Glucose 2.00 g/dl
  • (ii) Toxizität gegenüber Nieren, bestimmt durch Blutuntersuchung:
  • (a) in gleicher Weise wie zur Bestimmung der akuten Toxizität werden den Mäusen PQQ.2Na und OPQs intraperitoneal verabreicht und die Mäuse werden aufgezogen.
  • Nach Ablauf eines Tages nach der Verabreichung läßt man die Mäuse hungern (nur Wasser wird verabreicht) und nach Ablauf von 18 Stunden wird Blut entnommen und ein Serum daraus erhalten. Glukose, Harnstoff-Stickstoff und Kreatinin im Serum werden bestimmt unter Verwendung von FUJI Dry Chemslide (hergestellt von Fuji Photo Film Co.Ltd.) Die Ergebnisse werden anhand von Durchschnittswerten für 8 Mäuse bestimmt, wie in Tabelle 2 dargestellt.
  • Eine wesentliche Herabsetzung von Glukose und Harnstoff- Stickstoff und ein erheblicher Anstieg von Kreatinin werden bei Verabreichung von PQQ.2na beobachtet und so wird eine Toxizität gegenüber den Nieren festgestellt. Andererseits war im Fall der Verabreichung von OPQs der Gehalt an Glukose, Harnstoff-Stickstoff und Kreatinin fast gleich dem Fall, wo keine OPQs verabreicht wurden. Tabelle 2
  • (b) in gleicher Weise wie beim akuten Toxizitätstest werden 150 mg, 300 mg, 400 mg oder 600mg/kg den Mäusen intraperitoneal verabreicht und die Mäuse werden 1 Tag lang aufgezogen.
  • Anschließend läßt man die Mäuse hungern (nur Wasser wird verabreicht) und nach Ablauf von 18 Stunden wird Blut entnommen und Serum daraus erhalten. Der Gehalt an Glukose, Harnstoff- Stickstoff und Kreatinin im Serum wird unter Verwendung von FUJI Dry Chemslide erhalten. Die Ergebnisse sind anhand von Durchschnittswerten für 8 Mäuse dargestellt. Sie sind in Tabelle 3 aufgeführt.
  • Bei Verabreichung von OPQ in allen genannten Dosierungen waren der Gehalt an Glukose, Harnstoff-Stickstoff und Kreatinin nahezu gleich wie ohne Verabreichung von OPQ. Tabelle 3
  • Wie aus den Ergebnissen (a) und (b) ersichtlich ist, weist PQQ Toxizität gegenüber den Nieren auf, während OPQs keine Toxizität gegenüber den Nieren aufweisen.
  • Anhand der folgenden Beispiele, auf welche die Erfindung nicht beschränkt ist, wird die Erfindung näher erläutert.
    • Beispiel 1
  • In 1 Liter reinem Wasser werden 3 g (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 1,4 g KH&sub2;PO&sub4;, 2,1g Na&sub2; HPO&sub4;, 0,2g MgSO&sub4;.7H&sub2;O, 30 mg CaCl&sub2;.2H&sub2;O, 30 mg FeC&sub6;H&sub5;O&sub7;.XH&sub2;O, 5mg MNCl&sub2;.4H&sub2;O, 5 mg ZnSO&sub4;.7H&sub2;O, 0,5 mg CuSO&sub4;.5H&sub2;O, 4mg Thiaminhydrochlorid, 4mg Calciumpantothenat, 20µg Biotin, und 12 ml Methanol gelöst. 200ml dieser Lösung werden auf einen pH-Wert von 7,1 eingestellt, in einen konischen Kolben mit einer Kapazität von 1 Liter gegeben und bei 120ºC 20 Minuten lang sterilisiert. Diese Lösung wird als Kulturmedium eingesetzt.
  • 1 Vol% des Kulturmediums der bei 30ºC 2 Tage lang unter Verwendung des gleichen Mediums vorgezüchteten Bakterienstämme wird in dem genannten Medium inokuliert und einer Rotations- Schüttel-Kultur unterworfen, um 3 Tage nach Beginn der Züchtung ein Kulturmedium zu erhalten.
  • Das Kulturmedium wird in 2 gleiche Teile geteilt. Zu einem Teil werden 0,3 g/l Glycin zugegeben und der pH-Wert wird auf 8,5 eingestellt und dieses Kulturmedium wird bei 30ºC 24 Stunden lang einem Rotations-Schüttelvorgang unterworfen, wobei eine Reaktionsmischung erhalten wird, in welcher OPQ hergestellt worden ist. Zum anderen Teil werden 0,4 g/l L- Serin zugegeben und der pH- Wert wird auf 4,0 eingestellt und dieses Kulturmedium wird einem Rotations-Schüttelvorgang bei 30ºC während eines Zeitraums von 24 Stunden unterworfen, um eine Reaktion stattfinden zu lassen, um eine Reaktionsmischung zu erhalten, in welcher Hydroxymethyl-OPQ gebildet worden ist. Diese Reaktionsmischungen werden einer Zentrifugation unterworfen, wobei ein flüssiger Überstand erhalten wird und die Menge an darin enthaltenen OPQs wird gemessen.
  • Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 dargestellt.
  • Die Menge an OPQs in der Reaktionsmischung wird mittels Hochleistungs-Flüssigchromatographie (wie in den folgenden Beispielen) gemessen
  • Vorrichtung: Hochleistungs-Flüssigchromatograph, hergestellt von Shimadzu Seisakusho Ltd.
  • Säule: YMC ODS A-302
  • (4,6 mm x 150 mm)
  • Entwicklerlösung: 0,1M KH&sub2;PO&sub4;, 0,1M HClO&sub4;/CH&sub3;CN:H&sub2;O = 1:9 (pH 2,5)
  • Fließgeschwindigkeit: 1,5 ml/min
  • Detektor: SHIMADZU SPD-6AV
  • UV-VIS Detektor (420nm) Tabelle 4(1) Tabelle 4 (2) Tabelle 4 (3)
    • Beispiel 2
  • Acidomonus methanolica JCM 6891 wird 3 Tage lang gezüchtet und es wird ein Kulturmedium in gleicher Weise erhalten wie in Beispiel 1, mit der Abänderung, daß ein durch Lösen von 3g (NH&sub4;)&sub2; SO&sub4; ,4g KH&sub2;PO&sub4;, 0,2 g MgSO&sub4;.7H&sub2;O, 30 mg CaCl&sub2;.2H&sub2;O, 30 mg FeC&sub6;H&sub5;O&sub7;.XH&sub2;O, 5mg MnCl&sub2;.4H&sub2;O, 5mg ZnSO&sub4;.7H&sub2;O, 0,5mg CuSO&sub4;.5H&sub2;O, 4mg Calciumpantothenat in 1 Liter reinem Wasser, und Zusatz von 12 ml Methanol hergestelltes Medium eingesetzt wird und der pH-Wert auf 4,5 eingestellt wird.
  • Das Kulturmedium wird in zwei gleiche Teile geteilt. Zu einem Teil werden 0,3 g/l Monomethylaminhydrochlorid zugegeben und der pH-Wert wird auf 8,5 eingestellt und dieses Kulturmedium wird 24 Stunden lang bei 30ºC gerührt, wobei eine Reaktionsmischung erhalten wird, in welcher OPQ gebildet wird.
  • Zum anderen Teil werden 0,4 g/l L-Serin zugegeben und der pH- Wert wird auf 4,0 eingestellt und dieses Kulturmedium wird bei 30ºC 24 Stunden lang einem Rotations-Schüttelvorgang unterworfen, um eine Reaktion stattfinden zu lassen, um schließlich eine Reaktionsmischung zu erhalten, in welcher Hydroxymethyl-OPQ gebildet wird.
  • Jede dieser Reaktionsmischungen wird einer Zentrifugation unterworfen, um eine Überstandsflüssigkeit zu erhalten und der darin enthaltene Gehalt an OPQs wird gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 dargestellt.
    • Beispiel 3
  • Paracoccus alcalifilus JCM 7364 wird 3 Tage lang gezüchtet, um ein Kulturmedium in gleicher Weise wie in Beispiel 1 zu erhalten, mit der Abänderung, daß ein Medium eingesetzt wird, das durch Lösen von 3g (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 1,4g KH&sub2;PO&sub4;, 2,1g Na&sub2;HPO&sub4;, 0,2 g MgSO&sub4; 7H&sub2;O, 30 mg CaCl&sub2; 2H&sub2;O, 30 mg FeC&sub6;H&sub5;O&sub7; XH&sub2;O, 5 mg MnCl&sub2; 4H&sub2;O, 5 mg ZnSO&sub4; 7H&sub2;O, 0.5 mg CuSO&sub4; 5H&sub2;O, 20 µg Biotin, in 1 Liter reinem Wasser und Zusatz von 12 ml Methanol erhalten worden ist, wobei die Lösung bei 120ºC 20 Minuten lang sterilisiert wird und dann unter aseptischen Bedingungen 10 Gewichtsprozent wäßrige Na&sub2;CO&sub3;-Lösung zugegeben und der pH- Wert auf 9,0 eingestellt wird.
  • Das Kulturmedium wird in zwei gleiche Teile geteilt. Zu einem dieser Teile werden 0,4 g/l L-Serin zugegeben und der pH-Wert wird auf 8,5 eingestellt und dieses Kulturmedium wird bei 30ºC 24 Stunden lang gerührt, um eine Reaktionsmischung zu erhalten, in welcher OPQ gebildet wird. Zum anderen Teil werden 0,4 g/1 L-Serin zugegeben und der pH-Wert wird auf 4, eingestellt und dieses Kulturmedium wird bei 30ºC 24 Stunden lang gerührt, um eine Reaktionsmischung zu erhalten, in welcher Hydroxymethyl-OPQ gebildet wird.
  • Jede dieser Reaktionsmischungen wird einer Zentrifugation unterworfen, um eine Überstandsflüssigkeit zu erhalten und die darin enthaltene Menge an OPQs wird gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 enthalten.
    • Beispiel 4
  • Die zur Gattung Methylophagen gehörenden Bakterien werden 3 Tage lang gezüchtet, um ein Kulturmedium in gleicher Weise wie in Beispiel 1 zu erhalten, mit der Abänderung, daß ein Medium eingesetzt wird, das durch Lösen von 3.0 g (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 1.4 g KH&sub2;PO&sub4;, 2.1 g Na&sub2;HP&sub4;, 0.2 g MgSO&sub4; 7H&sub2;O, 30 mg CaCl&sub2; 2H&sub2;O, 30 mg FeC&sub6;H&sub5;O&sub7; XH&sub2;O, 5 mg MnCl&sub2; 4H&sub2;O, 5 mg ZnSO&sub4; 7H&sub2;O, 0.5 mg CuSO&sub4; 5H&sub2;O, und unter Zusatz von 12 ml Methanol in 1 l Meerwasser erhalten worden ist, und daß der pH-Wert auf 7,1 eingestellt wird.
  • Das Kulturmedium wird in zwei gleiche Teile geteilt. Zum einen Teil werden 0,5 g/l L-Threonin zugegeben und der pH- Wert wird auf 8,5 eingestellt und dieses Kulturmedium wird bei 30ºC 24 Stunden lang gerührt, um eine Reaktionsmischung zu erhalten, in welcher OPQ gebildet wird. Zum anderen Teil werden 0,4 g/l D-Serin zugegeben und der pH-Wert wird auf 4, eingestellt und diese Lösung wird bei 30ºC 24 Stunden lang gerührt, um eine Reaktionsmischung zu erhalten, in welcher Hydroxymethyl-OPQ gebildet wird.
  • Jede dieser Reaktionsmischungen wird einer Zentrifugation unterworfen, um eine Überstandsflüssigkeit zu erhalten, und die Menge an darin enthaltenen OPQs wird gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 dargestellt. Tabelle 5
    • Beispiel 5
  • In einem Liter reinem Wasser werden
  • 3.0 g (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 1.4 g KH&sub2;PO&sub4;, 2.1 g Na&sub2;HPO&sub4;, 0.2 g MgSO&sub4; 7H&sub2;O, 30 mg CaCl&sub2; 2H&sub2;O, 30 mg FeC&sub6;H&sub5;O&sub7; XH&sub2;O, 5 mg MnCl&sub2; 4H&sub2;O, 5 mg ZnSO&sub4; 7H&sub2;O, 0.5 mg CuSO&sub4; 5H&sub2;O,
  • gelöst und nach Zusatz von 8 ml Methanol wird die Lösung auf einen pH-Wert von 7,1 gebracht. 200ml dieser Lösung werden in einen 1 l fassenden konischen Kolben gegeben und bei 120ºC 20 Minuten lang sterilisiert. Dieses Medium wird als Kulturmedium eingesetzt.
  • Hyphomicrobium vurgare NCIB 9775 wird in diesem Medium inokuliert und bei 30ºC unter Verwendung einer Rotations-Schüttelvorrichtung bei 200 UpM einem Rotations-Schüttelvorgang unterworfen. Das resultierende Kulturmedium wird als Keimflüssigkeit eingesetzt.
  • 15 l des durch Lösen von 1.0 g
  • (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 1.0 g MgSO&sub4; 7H&sub2;O und 1.4 g KH&sub2;PO&sub4; in 1 Liter reinem Wasser erhaltenen Mediums werden in ein 301 fassendes Gefäß zum Züchten gegeben und sterilisiert.
  • In 10 ml reinem Wasser werden 75 mg FeSO&sub4; 7H&sub2;O, 150 mg ZnSO&sub4; 7H&sub2;O, 150 mg CaCl&sub2; 2H&sub2;O, 150 mg NaCl, 45 mg MnSO&sub4; 4-5H&sub2;O, 3 mg H&sub3;BO&sub3;, 1.5 mg CuSO&sub4; 5H&sub2;O, 1.5 mg CoCl&sub2; 2H&sub2;O, 1.5 mg KI und 1.5 mg (NH&sub4;)&sub6;Mo&sub7;O&sub2;&sub4; 4H&sub2;O. gelöst. Die resultierende Minerallösung wird sterilisiert.
  • Nach Absenken der Temperatur des 30-Liter-Zuchtgefäßes auf 30ºC, werden 10ml der genannten Minerallösung unter aseptischen Bedingungen zu dem Medium in dem Gefäß zugegeben und dazu wird außerdem Ammoniak unter aseptischen Bedingungen zugegeben, um den pH-Wert des Kulturmediums auf 6,8 einzustellen.
  • In dieses Zuchtgefäß werden unter aseptischen Bedingungen 150 ml Methanol und 200ml der genannten Keimflüssigkeit gegeben und das Züchten wird bei einer Belüftungsgeschwindigkeit von 10 Liter/Min. und bei 300 UpM bei 30ºC unter Zugabe von Ammoniakwasser durchgeführt, so daß der pH-Wert des Kulturmediums bei 6,8 gehalten wird.
  • Mit dem Wachstum der Mikroorganismen nimmt die Konzentration an Methanol im Kulturmedium ab. Anhand von Analysen mittels Gaschromatographie wird Methanol im Abgas festgestellt und es wird Methanol zugegeben, so daß die Konzentration an Methanol im Kulturmedium bei 0,1 -0,5 Gewichtsprozent gehalten wird.
  • Auf diese Weise findet das Züchten in 12 Zuchtgefäßen mit einer Kapazität von je 30 Liter während eines Zeitraums von 10 Tagen statt und zum Kulturmedium in den Zuchtgefäßen werden (1) 90 g Glycin, (2) 120g L-Serin, (3) 120g D-Serin, (4) 150 g L-Threonin, (5) 150 g D-Threonin, (6) 150 g L-Prolin , (7) 150 g D-Prolin, (8) 210g L-Tyrosin, (9) 210g D-Tyrosin, (10) 240g L-Tryptophan, (11) 240g D-Tryptophan und (12) 75g Monomethylaminhydrochlorid zugegeben und die Reaktion läßt man 24 Stunden lang stattfinden, wobei der pH-Wert der Reaktionslösung auf 8,5 eingestellt wird, um Reaktionsmischungen zu erhalten.
  • Der Gehalt an OPQ in den Reaktionsmischungen wird in Tabelle 6 dargestellt.
    • Beispiel 6
  • Das Züchten wird während eines Zeitraums von 10 Tagen unter Einsatz von 7 Zuchtgefäßen mit jeweils 30 l Kapazität in gleicher Weise, wie in Beispiel 5 durchgeführt, mit der Abänderung, daß Hyphomicrobium methylovorum DSM 1869 als Stamm eingesetzt wird und daß zu den Kulturmedien Glycin in Mengen von (1) 4,5 g, (2) 9,0g, (3) 15,0 g, (4) 45g, (5) 75g, (6) 150g und (7) 22g zugegeben wird und das Züchten weitere 5 Stunden lang durchgeführt wird, wobei der pH-Wert auf 8,0 eingestellt wird, um Reaktionsmischungen zu erhalten.
  • Die Gehalte an OPQ in den Reaktionsmischungen sind in Tabelle 7 dargestellt. Tabelle 6 Tabelle 7
    • Beispiel 7
  • In gleicher Weise wie in Beispiel 6 wird Hypomicrobium methylovorum DSM 1869 10 Tage lang in 8 Zuchtgefäßen von je 30 l Kapazität gezüchtet.
  • Anschließend wird der pH-Wert des Kulturmediums in jedem Zuchtgefäß auf (1) 3,0, (2) 4,0, (3) 5,0, (4) 6,0, (5) 7,0, (6) 8,0, (7) 9,0 oder (8) 10,0 eingestellt und 30 g Glycin werden zum Kulturmedium in jedem Zuchtgefäß zugegeben und dann läßt man die Reaktion weitere 3 Stunden lang ablaufen, um eine Reaktionsmischung zu erhalten.
  • Die Menge an mittels Zentrifugation jeder Reaktionsmischung im Zuchtgefäß erhaltenem OPQ und die Menge an mittels Zentrifugation der Reaktionsmischungen von (1) bis (5), deren pH- Wert auf 8,5 eingestellt wurde, erhaltenem OPQ ist in den Tabellen 8 angegeben. Tabelle 8
    • Beispiel 8
  • In gleicher Weise wie in Beispiel 6 wird Hyphomicrobium methylovorum DSM 1869 10 Tage lang in 8 Zuchtgefäßen von je 30 l Kapazität gezüchtet.
  • Anschließend wird der pH-Wert des Kulturmediums in jedem Zuchtgefäß auf (1) 2,0, (2) 3,0, (3) 4,0, (4) 5,0, (5) 6,0 (6) 7,0, (7) 8,0, (8) 9,0 oder (9) 10,0 eingestellt und 42 g L-Serin werden zum Kulturmedium in jedem Zuchtgefäß zugegeben und dann läßt man die Reaktion weitere 5 Stunden lang ablaufen, um eine Reaktionsmischung zu erhalten.
  • Die Menge an mittels Zentrifugation jeder Reaktionsmischung im Zuchtgefäß erhaltenem OPQ und Hydroxymethyl-OPQ und die Menge an mittels Zentrifugation der Reaktionsmischungen von (1) bis (5), deren pH-Wert auf 8,5 eingestellt wurde, erhaltenem OPQ und Hydroxymethyl-OPQ ist in den Tabellen 9 (1) und (2) angegeben. Tabelle 9 (1) Table 9 (2)
    • Beispiel 9
  • In gleicher Weise wie in Beispiel 6 wird Hyphomicrobium methylovorum DSM 1869 10 Tage lang in 4 Zuchtgefäßen von je 30 l Kapazität gezüchtet.
  • Dann wird die Temperatur jedes Kulturmediums in den Zuchtgefäßen auf (1) 20ºC, (2) 30ºC, (3) 40ºC, (4) 50ºC, oder (5) 70ºC eingestellt und 48 g L-Threonin werden zu jedem Kulturmedium zugegeben und man läßt die Reaktion weitere 5 Stunden ablaufen, wobei der pH-Wert des Kulturmediums auf 8,0 eingestellt wird, um Reaktionsmischungen zu erhalten.
  • Die Gehalte an OPQ in den Reaktionsmischungen sind in Tabelle 10 dargestellt. Tabelle 10
    • Beispiel 10
  • Methylobacillus glycogenes FERM P-2247 wird in gleicher Weise gezüchtet wie in Beispiel 6. 27 g Monomethylaminhydrochlorid werden am 4. Tag nach Zuchtbeginn zum Kulturmedium zugegeben und man läßt die Reaktion weitere 6 Stunden ablaufen, wobei der pH-Wert des Kulturmediums auf 8,0 eingestellt wird, um eine Reaktionsmischung zu erhalten.
  • Der Gehalt an OPQ in der Reaktionsmischung beträgt 220 mg/l.
    • Beispiel 11
  • Paracoccus denitrificans ATCC 19367 wird in gleicher Weise gezüchtet wie in Beispiel 6.
  • 42 g D-Serin werden zu dem Kulturmedium am 10.Tag nach Zuchtbeginn zugegeben und man läßt die Reaktion weitere 6 Stunden lang ablaufen, wobei der pH-Wert des Kulturmediums auf 8,0 eingestellt wird, um eine Reaktionsmischung zu erhalten.
  • Der Gehalt an in der Reaktionsmischung enthaltenem OPQ beträgt 140 mg/l.
    • Beispiel 12
  • Methylophaga thalassica ATCC 33146 wird in gleicher Weise gezüchtet wie in Beispiel 6, mit der Abänderung, daß als Kulturmedium Meerwasser eingesetzt wird. 48 g D-Threonin werden am 10.Tag nach Zuchtbeginn dem Kulturmedium zugegeben und man läßt die Reaktion weitere 6 Stunden ablaufen, wobei der pH- Wert des Kulturmediums auf 8,0 eingestellt wird, um eine Reaktionsmischung zu erhalten.
  • Der Gehalt an in der Reaktionsmischung enthaltenem OPQ beträgt 163 mg/l.
    • Beispiel 13
  • In 1 Liter reinem Wasser werden 3 g (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 1,4 g KH&sub2;PO&sub4;, 2.1 g Na&sub2;HPO&sub4;, 0.2 g MgSO&sub4; 7H&sub2;O, 30 mg CaCl&sub2; 2H&sub2;O, 30 mg FeC&sub6;H&sub5;O&sub7; H&sub2;O, 5 mg MnCl&sub2; 4H&sub2;O, 5 mg ZnSO&sub4; 7H&sub2;O, 0.5 mg CuSO&sub4;, 5H&sub2;O, und 12 ml Methanol gelöst und der pH-Wert der Lösung wird auf 7,1 eingestellt. 200 ml dieser Lösung werden in einen konischen Kolben mit einer Kapazität von 1 Liter gegeben und bei 120ºC 20 Minuten lang sterilisiert. Diese Lösung wird als Kulturmedium eingesetzt.
  • Hyphomicrobium vurgare NCIB 9775 wird in dieses Medium inokuliert und bei 30ºC unter Einsatz eines Rotations-Schüttelgerätes bei 220 UpM einer Rotations-Schüttel-Kultur unterworfen. Die resultierende Kulturlösung wird als Keimflüssigkeit verwendet.
  • 15 Liter eines durch Lösen von 1 g (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 1 g MgSO&sub4;.7H&sub2;O und 1,4 g KH&sub2;PO&sub4; in 1 l reinem Wasser hergestellten Mediums werden in ein Zuchtgefäß von 30 l Kapazität gegeben und sterilisiert.
  • In 10 ml reinem Wasser werden 75 mg FeSO&sub4;.7H&sub2;O, 150 mg ZnSO&sub4; 7H&sub2;O, 150 mg CaCl&sub2; 2H&sub2;O, 150 mg NaCl, 45 mg MnSO&sub4; 4-5H&sub2;O, 3 mg H&sub3;BO&sub3;, 1.5 mg CuSO&sub4; 5H&sub2;O, 1.5 mg CoCl&sub2; 2H&sub2;O, 1.5 mg KI und 1.5 mg (NH&sub4;)&sub6;Mo&sub7;O&sub2;&sub4; 4H&sub2;O. gelöst. Die resultierende Minerallösung wird sterilisiert.
  • Nach Absenken der Temperatur des Zuchtgefäßes auf 30ºC werden 10 ml der Minerallösung unter aseptischen Bedingungen dem Medium in dem Gefäß zugegeben und ferner wird Ammoniakwasser unter aseptischen Bedingungen zugegeben, um den pH-Wert der Kulturlösung auf 6,8 einzustellen.
  • In dieses Zuchtgefäß werden unter aseptischen Bedingungen 150 ml Methanol und 200 ml der genannten Keimflüssigkeit gegeben und außerdem wird Ammoniakwasser bei 30ºC unter Rühren bei einer Belüftung von 10 l/Min und bei 300 UpM zugegeben, um den pH-Wert des Kulturmediums bei 6,8 zu halten. Mit dem Wachstum der Mikroorganismen nimmt die Konzentration an Methanol im Kulturmedium ab. Dies wird durch Analysieren des Methanols im Abgas mittels Gaschromatographie festgestellt und Methanol wird in einer dieser Abnahme entsprechenden Menge zugeführt, um die Konzentration an Methanol in der Kulturlösung bei 0,1 bis 0,5 Gewichtsprozent zu halten.
  • Auf diese Weise wird das Züchten in 2 Zuchtgefäßen von je 30 l Kapazität 10 Tage lang durchgeführt und der pH-Wert des Kulturmediums im Zuchtgefäß wird auf 4,0 eingestellt und dann werden (1) 120 g L-Serin/15 l und (2) 120 g D-Serin/15 l zugegeben. Man läßt anschließend die Reaktion weitere 24 Stunden bei 30ºC unter Rühren bei Belüftung ablaufen und der pH-Wert des Kulturmediums wird auf 4,0 eingestellt, um Reaktionsmischungen zu erhalten. Nach dem Einstellen des pH-Wertes der Reaktionsmischung auf 7,0 wird die Reaktionsmischung einer Zentrifugation unterworfen, um eine Überstandsflüssigkeit zu erhalten.
  • Die Gehalte an in der Überstandsflüssigkeit enthaltenem Hydroxymethyl-OPQ sind in Tabelle 11 dargestellt. Tabelle 11
    • Beispiel 14
  • Das Züchten wird 10 Tage lang unter Einsatz eines Zuchtgefäßes von 30 Litern Kapazität in gleicher Weise durchgeführt wie in Beispiel 13, mit der Abänderung, daß Hyphomicrobium methylovorum DSM 1869 als Stamm eingesetzt wird, und dann wird der pH-Wert des Kulturmediums auf 4,0 eingestellt und 42 g L-Serin werden zugegeben und man läßt die Reaktion weiter ablaufen.
  • Nach Zugabe von L-Serin werden Proben der Reaktionsmischung zu verschiedenen Zeitpunkten entnommen, ihr pH-Wert wird auf 7 eingestellt, sie werden einer Zentrifugation unterworfen und der Gehalt an in der Reaktionsmischung enthaltenem Hydroxymethyl-OPQ wird gemessen.
  • Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 dargestellt. Tabelle 12
    • Beispiel 15
  • In gleicher Weise wie in Beispiel 13 wird Methylobacillus glycogenes FERM P-2247 4 Tage lang in Zuchtgefäßen von je 30 l Kapazität gezüchtet.
  • Anschließend-wird der pH-Wert des Kulturmediums im Zuchtgefäß auf 4,5 eingestellt, 42 g L-Serin werden zugegeben und man läßt die Reaktion weitere 6 Stunden ablaufen, um eine Reaktionsmischung zu erhalten. Nach Einstellen des pH-Wertes der Reaktionsmischung auf 7,0 wird die Reaktionsmischung einer Zentrifugation unterworfen, um eine Überstandsflüssigkeit zu erhalten. Die Menge an Hydroxymethyl-OPQ, die sich in der Überstandsflüssigkeit angesammelt hat, beträgt 200 mg in l Liter der Reaktionsmischung.
    • Beispiel 16
  • Paracoccus denitrificans ATCC 19367 wird 10 Tage lang in einem Zuchtgefäß von 30 Liter Kapazität in gleicher Weise wie in Beispiel 13 gezüchtet, mit der Abänderung, daß ein anderer Stamm eingesetzt wird.
  • Dann wird der pH-Wert des Kulturmediums im Zuchtgefäß auf 6, eingestellt, 429 D-Serin werden zugegeben, und man läßt die Reaktion weitere 6 Stunden ablaufen, um eine Reaktionsmischung zu erhalten. Die Menge an Hydroxymethyl-OPQ, die sich angesammelt hat, beträgt 110 mg in 1 Liter der Reaktionsmischung.
    • Beispiel 17
  • Methylophaga thalassica ATCC 33146 wird 10 Tage lang in einem Zuchtgefäß von 30 Liter Kapazität in gleicher Weise gezüchtet wie in Beispiel 13, mit der Abänderung, daß ein anderer Stamm eingesetzt wird und daß Meerwasser als Kulturmedium eingesetzt wird.
  • Anschließend wird der pH-Wert des Kulturmediums auf 4,0 eingestellt, 42 g DL-Serin werden zugegeben und man läßt die Reaktion weitere 6 Stunden bei 30ºC unter Rühren mit Belüftung ablaufen, um eine Reaktionsmischung zu erhalten. Nach dem Einstellen des pH-Wertes der Reaktionsmischung auf 7, wird die Reaktionsmischung einer Zentrifugation unterworfen, um eine Überstandsflüssigkeit zu erhalten. Die Menge an Hydroxymethyl-OPQ, die sich in der Überstandsflüssigkeit angesammelt hat, beträgt 142 mg in 1 Liter der Reaktionsmischung.
    • Beispiel 18
  • In gleicher Weise wie in Beispiel 14 wird Hyphomicrobium methylovorum DSM 1869 in Zuchtgefäßen von je 30 l Kapazität gezüchtet, um 15 l Kulturmedium zu erhalten. Je 200 ml dieses Kulturmediums werden in einen konischen Kolben von 1 Liter Kapazität gefüllt und je 0,6 g verschiedener Aminosäuren werden zugegeben. Der pH-Wert des Kulturmediums wird mit NaOH oder HCl auf 4,7 oder 9 eingestellt und man läßt die Reaktion bei 30ºC 24 Stunden lang unter Schütteln ablaufen, um Reaktionsmischungen zu erhalten.
  • Der pH-Wert der Reaktionsmischung wird in jedem Kolben auf 7,0 eingestellt und dann wird sie einer Zentrifugation unterworfen, um eine Überstandsflüssigkeit zu erhalten. Der Gehalt an OPQs in der Überstandsflüssigkeit ist in Tabelle 13 dargestellt. Tabelle 13
  • X-OPQ: OPQs entsprechend den entsprechenden Aminosäuren
    • Beispiel 19
  • Jeweils 200 ml des gleichen Kulturmediums wie des PQQ enthaltenden Kulturmediums von Beispiel 18 werden in 12 konische Kolben von je 1 l Kapazität gefüllt.
  • Es werden jeweils 0,6 g L-Threonin, L-Tyrosin, L-Serin oder L-Cystin in jeden Kolben gegeben und der pH-Wert des Kulturmediums wird mittels NaOH oder HCl auf 4,7 oder 9 eingestellt und man läßt die Reaktion bei 30ºC weitere 24 Stunden unter Schütteln ablaufen, um Reaktionsmischungen zu erhalten.
  • Der pH-Wert der Reaktionsmischung in jedem Kolben wird auf 7,0 eingestellt, und sie wird einer Zentrifugation unterworfen, um eine Überstandsflüssigkeit zu erhalten. Der Gehalt an OPQs in der Überstandsflüssigkeit ist in Tabelle 14 dargestellt.
  • OPQ liegt in jeder Reaktionsmischung zusätzlich zu den den eingesetzten Aminosäuren entsprechenden OPQs vor. Tabelle 14
  • X-OPQ: OPQs entsprechend den entsprechenden Aminosäuren
    • Beispiel 20
  • Die in gleicher Weise wie in Beispiel 9 erhaltene Reaktionsmischung wird bei 30ºC einer Zentrifugation bei 12,000 G während eines Zeitraums von 20 Minuten unterworfen, um eine Überstandsflüssigkeit zu erhalten.
  • 50 ml der Überstandsflüssigkeit werden jeweils mit HCl auf die pH-Werte 7,2; 6,5; 5,7; 5,0; 4,7; 4,2; 3,7; 3,1; 2,6; 2,1; 1,5 und 1,0 eingestellt und dann 4 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen, woraufhin sie zentrifugiert werden (12000 G, 20 Minuten). OPQ wird ausgefällt und gewonnen.
  • Nicht gewonnenes OPQ in der Überstandsflüssigkeit wird mittels Hochleistungs-Flüssigchromatographie festgestellt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 15 dargestellt. OPQ wird in Form einer Ausfällung erhalten, wenn der pH-Wert 4 oder weniger beträgt. Tabelle 15
    • Beispiel 21
  • 30,0 g L-Serin werden in 600 ml destilliertem Wasser gelöst und die Lösung wird mit 6N-Salzsäure auf einen pH-Wert von 3,0 gebracht, um eine L-Serinlösung zu erhalten. Zu dieser L- Serin-Lösung werden 604 mg PQQ zugegeben und man läßt die Reaktion bei 30ºC 20 Stunden lang unter heftigem mechanischem Rühren bei Belüftung ablaufen. Als Ergebnis beträgt die Konzentration von Hydroxymethyl-OPQ in der Reaktionsmischung ca. 890 mg/l.
  • Diese Reaktionsmischung wird mit 6N-Salzsäure auf einen pH- Wert von 2,0 eingestellt und es werden 129 CaCl&sub2;.2H&sub2;O zugegeben, und diese Flüssigkeit wird mit Eiswasser gekühlt, um Hydroxymethyl-OPQ auszufällen.
  • Diese Ausfällung wird mittels Zentrifugaltrennung gewonnen. Zu dieser Ausfällung werden 600ml Wasser zugegeben und der pH-Wert dieser Flüssigkeit wird mit 5N NaOH auf 7,8 eingestellt, um die Ausfällung zu lösen.
  • Zur resultierenden Lösung werden 100ml DEAE-SEPHADEX A-25 zugegeben, nämlich ein Anionenaustauschträger, und die Mischung wird gut gerührt, um Hydroxymethyl-OPQ an dem Träger zu adsorbieren, und dann läßt man sie stehen. Überstandsflüssigkeit wird entfernt und der Träger abgetrennt und gewonnen.
  • 100ml frisches DEAE-SEPHADEX A-25 werden in eine Säule von 50mm Durchmesser gefüllt und der gewonnene Träger wird anschließend eingefüllt.
  • Durch diese Säule werden 300ml destilliertes Wasser, 3400 ml 0,5M wäßrige Natriumchloridlösung und anschließend 2500ml 0,7 M wäßrige Natriumchloridlösung geleitet. Zu diesem Zeitpunkt liegt eine geringe Menge an nicht umgesetztem PQQ, das von Hydroxymethyl-OPQ mitgerissen worden war, in der Fraktion von 0,5 M wäßriger Natriumchloridlösung vor und Hydroxymethyl-OPQ liegt in der Fraktion von 0,7 M wäßriger Natriumchloridlösung vor.
  • Die Fraktion der 0,7 M wäßrigen Natriumchloridlösung wird mit 6N-Salzsäure auf einen pH-Wert von 2,0 eingestellt und dann auf 5ºC abgekühlt, um Hydroxymethyl-OPQ auszufällen.
  • Die resultierende Ausfällung wird mittels Zentrifugalabtrennung gewonnen und mit verdünnter Salzsäure und mit Diethyläther gewaschen und anschließend bei ca. 60ºC im Vakuum getrocknet, um 330 mg Hydroxymethyl-OPQ zu erhalten.
  • Das so erhaltene Hydroxymethyl-OPQ weist eine orange Farbe auf, zersetzt sich langsam bei 210-220ºC und weist keinen eindeutigen Schmelzpunkt auf. Dieses Hydroxymethyl-OPQ ist leicht in Wasser löslich und sehr leicht unter neutralen und alkalischen Bedingungen löslich, und ferner wird es in niederen Alkoholen gelöst, jedoch nicht in Aceton und Diethyläther.
  • Die Farbe der wäßrigen Lösung des Hydroxymethyl-OPQ ist unterschiedlich, je nach Konzentration von Hydroxymethyl-OPQ und pH-Wert der wäßrigen Lösung und die wäßrige Hydroxymethyl-OPQ-Lösung von ca. 10 mg/l ist hellgelb unter neutralen bis alkalischen Bedingungen und rötlich hellgelb unter sauren Bedingungen.
  • Der Wert der Elementaranalyse, das IR-Spektrum, das ¹H-NMR- Spektrum und das sichtbare UV-Spektrum des genannten Hydroxymethyl-OPQ sind nachstehend dargestellt.
  • (1) Wert der Elementaranalyse: C&sub1;&sub6;H&sub9;N&sub3;O&sub8; (MG 371.25)
  • Berechnet (%): C 51.76 H 2.44 N 11.32
  • Festgestellt (%): C 50.58 H 2.63 N 11.08
  • (2) IR-Spektrum (Vmax, cm&supmin;¹) (KBr) 2500br,s, 1680sh,w, 1575sh,s, 1510s, 1150vs, 1095sh,s, 700m, 650m
  • (3) ¹H-NMR-Spektrum (δ-Wert, ppm): (DMSO-d&sub6;, interner Standard: TMS) 4.98 (s,2H,C -OH), 7.27(D,1H, Pyrrolring C- ,J=1.98Hz). 8.07 (s,1H, Pyridinring C- ), 14.60(d,1H, Pyrrolring N- , J=0.44Hz)
  • (4) Sichtbares UV-Spektrum (λmax nm): (10 mM Kaliumphosphatpuffer pH 7.0) 254, 269sh, 416
    • Beispiel 22
  • Jeweils 40 ml wäßriger L-Serin-Lösung von 10 g/l, deren pH- Wert mittels Salzsäure oder Natriumhydroxid auf 1,5-9 eingestellt wurde, werden in einen konischen Kolben von je 100 ml Kapazität gefüllt und je 40 mg PQQ werden in den entsprechenden Kolben zugegeben.
  • Ein gasdurchlässiger Stöpsel wird auf jedem konischen Kolben angebracht und der Inhalt des Kolbens wird unter Einsatz eines Rotations-Schüttel-Geräts gerührt, um die Reaktion 1 Tag lang bei 30ºC ablaufen zu lassen.
  • Die Reaktionsmischung wird auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt und die Menge an gebildetem Hydroxymethyl-OPQ wird mittels Hochleistungschromatographie festgestellt.
  • Die Bedingungen für die Hochleistungschromatographie sind nachstehend angegeben.
  • Meßvorrichtung: Hergestellt von der Firma Shimadzu Seidakusho Ltd.
  • Pumpe LC-6A Detektor SPD-6AV Säulenthermostat CTO-6A5 (40ºC)
  • Säule. Hergestellt von YMC Co.
  • ODS A-302 4,6 mm Durchmesserx lsomm
  • Meßwellenlänge: 259 nm Fließgeschwindigkeit: 1,5 ml /min Zusammensetzung des Eluenten: 0,1 M KH&sub2;PO&sub4;, 0,1M HCIO&sub4; 10% wäßrige CH&sub3;CN-Lösung pH-Wert 2,5 (NaOH)
  • Die Ergebnisse sind in Tabelle 16 dargestellt Tabelle 16
    • Beispiel 23
  • 7,8 L-Valin werden in 200 ml destilliertem Wasser gelöst und die Lösung wird mittels 5N NaOH auf einen pH-Wert von 8,5 eingestellt. Dazu werden 801 mg PQQ-Dinatriumsalz gegeben und man läßt die Reaktion bei 30ºC 21 Stunden lang unter heftigem mechanischem Rühren bei Belüftung ablaufen. Diese Reaktionsmischung wird mit 6N-Salzsäure auf einen pH-Wert von 1,6 eingestellt und auf 5ºC abgekühlt, um 1-Methylethyl-OPQ auszufällen.
  • Diese Ausfällung wird mittels Zentrifugalabtrennung gewonnen und es werden 200ml Wasser zugegeben und diese Flüssigkeit wird mit 5 N NaOH auf einen pH-Wert von 8,7 eingestellt, um die Ausfällung zu lösen.
  • Zur resultierenden Lösung werden 50 ml DEAE-SEPHADEX A-25 zugegeben, nämlich ein Anionenaustauschträger, und die Mischung wird gut gerührt, um 1-Methylethyl-OPQ an dem Träger zu adsorbieren, und dann stehen gelassen. Überstandsflüssigkeit wird entfernt und der Träger wird abgetrennt und gewonnen.
  • 75 ml frisches DEAE-SEPHADEX A-25 werden in eine Säule von 50 mm Durchmesser gegeben und der gewonnene Träger wird darüber eingefüllt.
  • Durch diese Säule werden 300 ml destilliertes Wasser geleitet, um den Inhalt zu waschen, dann werden 3700 ml 0,4 M wäßrige Natriumchloridlösung und anschließend 4300 ml 0,6 M wäßrige Natriumchloridlösung durchgeleitet. Zu diesem Zeitpunkt liegt das in der Reaktionsmischung enthaltene 1-Methylethyl- OPQ hauptsächlich in der Fraktion von 0,6 M wäßriger Natriumchloridlösung vor.
  • Die Fraktionen von 0,4 M wäßriger Natriumchloridlösung und 0,6 M wäßriger Natriumchloridlösung, in welche 1-Methylethyl- OPQ eluiert worden ist, werden mittels 6 N Salzsäure auf einen pH-Wert von 1,7 eingestellt. Dann wird n-Butanol zugegeben und die Mischung wird stehen gelassen. Daraufhin wird die n-Butanolschicht, die 1-Methylethyl-OPQ enthält, abgetrennt und gewonnen. Ferner wird diese n-Butanolschicht mit 0,1 N Salzsäure vermischt und gewaschen und anschließend wird die n-Butanolschicht abgetrennt, gewonnen und bis zur Trockne aufkonzentriert. Dann wird Diethyläther zugegeben und die resultierende Ausfällung wird filtriert und gewonnen. Die Ausfällung wird bei ca. 70ºC im Vakuum getrocknet, um 460 mg w 1-Methylethyl-OPQ zu erhalten.
  • Das so erhaltene 1-Methylethyl-OPQ weist eine orange Farbe auf und zersetzt sich langsam bei 255-259ºC und weist keinen eindeutigen Schmelzpunkt auf. Dieses 1-Methylethyl-OPQ ist leicht in Wasser löslich und sehr leicht löslich unter neutralen und alkalischen Bedingungen, es ist ferner in niederen Alkoholen löslich, löst sich jedoch nicht in Aceton und Diethyläther.
  • Die Farbe der wäßrigen Lösung von 1-Methylethyl-OPQ ist unterschiedlich in Abhängigkeit von der Konzentration von 1- Methylethyl-OPQ und dem pH-Wert der wäßrigen Lösung und die wäßrige 1-Methylethyl-OPQ-Lösung von ca. 10 mg/l ist hellgelb bei einem pH-Wert von neutral bis alkalisch und rötlich hellgelb bei sauren Bedingungen.
  • Der Wert der Elementaranalyse, das IR-Spektrum, das ¹H-NMR- Spektrum und das sichtbare UV-Spektrum des resultierenden 1- Methylethyl-OPQ sind nachstehend dargestellt.
  • (1) Wert der Elementaranalyse: C&sub1;&sub8;H&sub1;&sub3;N&sub3;O&sub7; H&sub2;O (MG 401.33)
  • Berechnet (%): C 53.87 H 3.77 N 10.47
  • Festgestellt (%): C 53.61 H 3.96 N 10.22
  • (2) IR-Spektrum (vmax, cm&supmin;¹): (KBr) 2850br,s, 2530sh,s, 1575s, 1515sh,m, 1175vs, 1100sh,m, 1015sh,m, 815sh,w, 755m, 730m, 660sh,w
  • (3) ¹H-NMR-Spektrum ( δ-Wert, ppm):(DMSO-d&sub6;) Interner Standard:TMS)
  • 1.36(d,6H,CH-(C &sub3;), J=6.4Hz), 3.74(hep,1H,C -(CH&sub3;)&sub2;,J=6.7Hz), 7.29(d,1H, Pyrrolring c- ,J=1.8Hz), 8.00(s,1H, Pyridinring C- ), 13.01(brs,1H, Pyrrolring N- )
  • (4) Sichtbares UV-Spektrum (λmax, nm): (10 mM Kaliumphosphatpuffer pH 7,0) 255, 272sh, 418
    • Beispiel 24
  • 5,1 g L-Isoleukin werden in 200 ml destilliertem Wasser gelöst und die Lösung wird mit 5N NaOH auf einen pH-Wert von 8,5 eingestellt. Zu dieser L-Isoleukinlösung werden 805 mg PQQ-Dinatriumsalz zugegeben und man läßt die Reaktion bei 30ºC 21 Stunden lang unter heftigem Rühren bei Belüftung ablaufen. Diese Reaktionsmischung wird mit 6 N-Salzsäure auf einen pH-Wert von 1,8 eingestellt und auf 5ºC abgekühlt, um 1-Methylpropyl-OPQ auszufällen.
  • Diese Ausfällung wird mittels Zentrifugalabtrennung gewonnen und es werden 200ml Wasser zugegeben und diese Flüssigkeit wird mit 5 N NaOH auf einen pH-Wert von 8,2 eingestellt, um die Ausfällung zu lösen.
  • Zur resultierenden Lösung werden 50 ml DEAE-SEPHADEX A-25 zugegeben, nämlich ein Anionenaustauschträger, und die Mischung wird gut gerührt, um 1-Methylpropyl-OPQ an dem Träger zu adsorbieren, und dann stehen gelassen. Überstandsflüssigkeit wird entfernt und der Träger wird abgetrennt und gewonnen.
  • 75 ml frisches DEAE-SEPHADEX A-25 werden in eine Säule von 50 mm Durchmesser gegeben und der gewonnene Träger wird darüber eingefüllt.
  • Durch diese Säule werden 700 ml destilliertes Wasser geleitet, um dem Inhalt zu waschen, dann werden 3800 ml 0,5 M wäßrige Natriumchloridlösung und anschließend 1800 ml 0,8 M wäßrige Natriumchloridlösung durchgeleitet. Zu diesem Zeitpunkt liegt das in der Reaktionsmischung enthaltene 1-Methylpropyl- OPQ hauptsächlich in der Fraktion von 0,5 M wäßriger Natriumchloridlösung vor.
  • Die Fraktionen von 0,5 M wäßriger Natriumchloridlösung und 0,8 M wäßriger Natriumchloridlösung, in welche 1-Methylpropyl-OPQ eluiert worden ist, werden mittels 6 N Salzsäure auf einen pH-Wert von 1,9 eingestellt. Dann wird n-Butanol zugegeben und die Mischung wird stehen gelassen. Daraufhin wird die n-Butanolschicht, die 1-Methylpropyl-OPQ enthält, abgetrennt und gewonnen. Ferner wird diese n-Butanolschicht mit 0,1 N Salzsäure vermischt und gewaschen und anschließend wird die n-Butanolschicht abgetrennt, gewonnen und bis zur Trockne aufkcnzentriert. Dann wird Diethyläther zugegeben und die resultierende Ausfällung wird filtriert und gewonnen. Die Ausfällung wird bei ca. 70ºC im Vakuum getrocknet, um 410 mg 1-Methylpropyl-OPQ zu erhalten.
  • Das so erhaltene 1-Methylpropyl-OPQ weist eine orange Farbe auf und zersetzt sich langsam bei 250-254ºC und weist keinen eindeutigen Schmelzpunkt auf. Dieses 1-Methylpropyl-OPQ ist leicht in Wasser löslich und sehr leicht löslich unter neutralen und alkalischen Bedingungen, es ist ferner in niederen Alkoholen löslich, löst sich jedoch nicht in Aceton und Diethyläther.
  • Die Farbe der wäßrigen Lösung von 1-Methylpropyl-OPQ ist unterschiedlich in Abhängigkeit von der Konzentration von 1- Methylpropyl-OPQ und dem pH-Wert der wäßrigen Lösung und die wäßrige 1-Methylpropyl-OPQ-Lösung von ca. 10 mg/l ist hellgelb
  • bei einem pH-Wert von neutral bis alkalisch und rötlich hellgelb bei sauren Bedingungen.
  • Der Wert der Elementaranalyse, das IR-Spektrum, das ¹H-NMR- Spektrum und das sichtbare UV-Spektrum des vorstehenden 1- Methylpropyl-OPQ sind nachstehend dargestellt.
  • (1) Wert der Elementaranalyse: C&sub1;&sub9;H&sub1;&sub5;N&sub3;O&sub7; H&sub2;O
  • (MG 415.36)
  • Berechnet (%): C 54.94 H 4.13 N 10.12
  • Festgestellt (%): C 54.68 H 4.20 N 9.88
  • (2) IR-Spektrum (vmax cm&supmin;¹) (KBr) 2900 br,s, 2530sh,s, 1605s, 1520sh,m, 1180vs, 1145sh,m, 1100sh,m, 850w, 760m, 725sh,m, 670sh,w
  • (3) ¹H-NMR-Spektrum ( δ-Wert, ppm):(DMSO-d&sub6;)
  • Interner Standard: TMS)
  • 0,83(t,3H,CH(CH&sub3;)-CH&sub2;-C (J=7.3Hz), 1.38(d,3H,CH(C )-CH&sub2;-CH&sub3;, J=6.8Hz) 1.71(m, 2H,CH(CH&sub3;)-C -CH&sub3;), 3.54(hex,1H,C (CH&sub3;)-CH&sub2;-CH&sub3;,J=6.5Hz), 7.31(d,1H Pyrrolring C- ,J=2.4Hz), 7.98(s,1H, Pyridinring C- ), 13.07(brs,1H, Pyrrolring N- )
  • (4) Sichtbares UV-Spektrum (λmax.nm): (10 mM Kaliumphosphatpuffer pH 7,0) 256, 272sh, 418
    • Beispiel 25
  • 3,2 g L-Leukin werden in 200 ml destilliertem Wasser gelöst und die Lösung wird mit 5N NaOH auf einen pH-Wert von 8,5 eingestellt. Zu dieser L-Leukinlösung werden 802 mg PQQ-Dinatriumsalz zugegeben und man läßt die Reaktion bei 30ºC 21 Stunden lang unter heftigem Rühren bei Belüftung ablaufen. Diese Reaktionsmischung wird mit 6 N-Salzsäure auf einen pH- Wert von 1,7 eingestellt und auf 5ºC abgekühlt, um 2-Methylpropyl-OPQ auszufällen.
  • Diese Ausfällung wird mittels Zentrifugalabtrennung gewonnen und es werden 200ml Wasser zugegeben und diese Flüssigkeit wird mit 5 N NaOH auf einen pH-Wert von 8,3 eingestellt, um die Ausfällung zu lösen.
  • Zur resultierenden Lösung werden 50 ml DEAE-SEPHADEX A-25 zugegeben, nämlich ein Anionenaustauschträger, und die Mischung wird gut gerührt, um 2-Methylpropyl-OPQ an dem Träger zu adsorbieren, und dann stehen gelassen. Überstandsflüssigkeit wird entfernt und der Träger wird abgetrennt und gewonnen.
  • 50 ml frisches DEAE-SEPHADEX A-25 werden in eine Säule von 50 mm Durchmesser gegeben und der gewonnene Träger wird darüber eingefüllt.
  • Durch diese Säule werden 300 ml destilliertes Wasser geleitet, um den Inhalt zu waschen, dann werden 2000ml 0.5M wäßrige Natriumchloridlösung, 2000 ml 0,8 M wäßrige Natriumchloridlösung und anschließend 500 ml 2 M wäßrige Natriumchloridlösung durchgeleitet. Zu diesem Zeitpunkt liegt das in der Reaktionsmischung enthaltene 2-Methylpropyl-OPQ hauptsächlich in der Fraktion von 0,8 M wäßriger Natriumchloridlösung vor.
  • Die Fraktion der 0,8 M wäßrigen Natriumchloridlösung, in welche 2-Methylpropyl-OPQ eluiert worden ist, wird mittels 6 N Salzsäure auf einen pH-Wert von 1,8 eingestellt und 2-Methylpropyl-OPQ wird bei 5ºC ausgefällt. Die resultierende Ausfällung wird mittels Zentrifugalabtrennung gewonnen, mit 0,1 N Salzsäure gewaschen und dann bei ca. 70ºC im Vakuum getrocknet, um 430 mg 2-Methylpropyl-OPQ zu erhalten.
  • Das so erhaltene 2-Methylpropyl-OPQ weist eine orange Farbe auf und zersetzt sich langsam bei 248-252ºC und weist keinen eindeutigen Schmelzpunkt auf. Dieses 2-Methylpropyl-OPQ ist leicht in Wasser löslich und sehr leicht löslich unter neutralen und alkalischen Bedingungen, es ist ferner in niederen Alkoholen löslich, löst sich jedoch nicht in Aceton und Diethyläther.
  • Die Farbe der wäßrigen Lösung von 2-Methylpropyl-OPQ ist unterschiedlich in Abhängigkeit von der Konzentration von 2- Methylpropyl-OPQ und dem pH-Wert der wäßrigen Lösung und die wäßrige 2-Methylpropyl-OPQ-Lösung von ca. 10 mg/l ist hellgelb bei einem pH-Wert von neutral bis alkalisch und rötlich hellgelb bei sauren Bedingungen.
  • Der Wert der Elementaranalyse, das IR-Spektrum, das ¹H-NMR- Spektrum und das sichtbare UV-Spektrum des resultierenden 2- Methylpropyl-OPQ sind nachstehend dargestellt.
  • (1) Wert der Elementaranalyse: C&sub1;&sub9;H&sub1;&sub5;N&sub3;O&sub7; H&sub2;O (MG 415.36)
  • Berechnet (%): C 54.94 H 4.13 N 10.12
  • Festgestellt (%): C 54.70 H 4.27 N 9.85
  • (2) IR-Spektrum (vmax, cm&supmin;¹): (KBr) 2880br,s, 2520sh,s, 2330sh,m, 1585s, 1520sh,m, 1180vs, 760sh,m, 735m, 670sh,w.
  • (3) ¹H-NMR-Spektrum ( δ-Wert, ppm):(BMSO-d&sub6;)
  • Interner Standard: TMS)
  • 0.93 (d(6H,CH&sub2;-CH-(C )&sub2;, J=6.6Hz), 2.16 (m,1H,CH&sub2;-C -(CH&sub3;)&sub2;), 3.08 (d,2H(CH&sub2;-CH-(CH&sub3;)&sub2;,J=7.0Hz), 7.28(d,1H, Pyrrolring C- ,J=2.2Hz), 7.99 (s, 1H, Pyridinring C- ,), 12.60 (brs,1H, Pyrrolring N- ,)
  • (4) Sichtbares UV-Spektrum (λmax.nm): (10 mM Kaliumphosphatpuffer pH 7,0) 255, 272sh, 419
    • Beispiel 26
  • 4,3 g L-Alanin werden in 800 ml destilliertem Wasser gelöst und die Lösung wird mittels 1 N Salzsäure auf einen pH-Wert von 4,0 eingestellt.
  • Zu dieser L-Alanin-Lösung ewrden 800 mg PQQ zugegeben und man läßt die Reaktion bei 30ºC 30 Stunden lang unter heftigem mechanischem Rühren bei Belüftung ablaufen. Zu dieser Reaktionsmischung werden 23,4g Natriumchlorid zugegeben und die Mischung wird mittels 6 N Salzsäure auf einen pH-Wert von 1,6 eingestellt und auf 5ºC abgekühlt, um Methyl-OPQ auszufällen.
  • Diese Ausfällung wird mittels Zentrifugalabtrennung gewonnen und es werden 250ml destilliertes Wasser zugegeben und diese Flüssigkeit wird mit 5 N NaOH auf einen pH-Wert von 7,4 eingestellt, um die Ausfällung zu lösen.
  • Zur resultierenden Lösung werden 50 ml DEAE-SEPHADEX A-25 zugegeben, nämlich ein Anionenaustauschträger, und die Mischung wird gut gerührt, um Methyl-OPQ an dem Träger zu adsorbieren, und dann stehen gelassen. Überstandsflüssigkeit wird entfernt und der Träger wird abgetrennt und gewonnen.
  • 75 ml frisches DEAE-SEPHADEX A-25 werden in eine Säule von 50 mm Durchmesser gegeben und der gewonnene Träger wird darüber eingefüllt.
  • Durch diese Säule werden 400 ml destilliertes Wasser geleitet, um den Inhalt zu waschen, dann werden 6900 ml 0,5 M wäßrige Natriumchloridlösung durchgeleitet. Zu diesem Zeitpunkt liegt das in der Reaktionsmischung enthaltene Methyl-OPQ in der Fraktion von 0,5M wäßriger Natriumchloridlösung vor.
  • Die Fraktion, in welche Methyl-OPQ eluiert worden ist, wird mittels 6 N Salzsäure auf einen pH-Wert von 1,0 eingestellt und Methyl-OPQ wird bei 5ºC ausgefällt. Die resultierende Ausfällung wird mittels Zentrifugalabtrennung gewonnen, mit 0,1 N Salzsäure gewaschen und dann bei ca. 70ºC im Vakuum getrocknet, um 273 mg Methyl-OPQ zu erhalten.
  • Das so erhaltene Methyl-OPQ weist eine orange Farbe auf und zersetzt sich langsam bei 262-268ºC und weist keinen eindeutigen Schmelzpunkt auf. Dieses Methyl-OPQ ist leicht in Wasser löslich und sehr leicht löslich unter neutralen und alkalischen Bedingungen, es ist ferner in niederen Alkoholen löslich, löst sich jedoch nicht in Aceton und Diethyläther.
  • Die Farbe der wäßrigen Lösung von Methyl-OPQ ist unterschiedlich in Abhängigkeit von der Konzentration von Methyl-OPQ und dem pH-Wert der wäßrigen Lösung und die wäßrige Methyl-OPQ- Lösung von 10 mg/l ist hellgelb bei einem pH-Wert von neutral bis alkalisch und rötlich hellgelb bei sauren Bedingungen.
  • Der Wert der Elementaranalyse, das IR-Spektrum, das ¹H-NMR- Spektrum und das sichtbare UV-Spektrum des resultierenden Methyl-OPQ sind nachstehend dargestellt.
  • (1) Wert der Elementaranalyse: C&sub1;&sub6;H&sub9;N&sub3;O&sub7; H&sub2;O (MG 373.28)
  • Berechnet (%): C 51.48 H 2.97 N 11.26
  • Festgestellt (%):C 51.20 H 3.24 N 11.03
  • (2) IR-Spektrum (vmax, cm&supmin;¹): (KBr)
  • 2725br,s, 2480br,s, 1590s, 1515s, 1170vs, 1095sh,s, 965m, 750m, 710m.
  • (3) ¹H-NMR-Spektrum ( δ-Wert, ppm):(DMSO-d6, Interner Standard TMS) 273(s,3H,C ) 7.18(d,1H, Pyrrolring C- ), 7.92(s,1H, Pyridinring C- ), 12.82(brs,1H, Pyrrolring N- )
  • (4) Sichtbares UV-Spektrum (λmax.nm): (10 mM Kaliumphosphatpuffer pH 7,0) 255, 272, 418
    • Beispiel 27
  • 6,4 g L-Glutaminsäure werden in 800ml destilliertem Wasser gelöst und die Lösung wird mittels 5 N NaOH auf einen pH-Wert von 4,0 eingestellt.
  • Zu dieser L-Glutaininsäurelösung werden 800 mg PQQ zugegeben und man läßt die Reaktion bei 30ºC 26 Stunden lang unter heftigem mechanischem Rühren bei Belüftung ablaufen. Diese Reaktionsinischung wird mittels 6N Salzsäure auf einen pH-Wert von 1,0 eingestellt und mit n-Butanol vermischt und die Mischung wird stehen gelassen, um eine n-Butanolschicht abzutrennen und zu gewinnen, welche 2-Carboxyethyl-OPQ enthält. Ferner wird zu dieser n-Butanolschicht 0,1 N NaOH zugegeben und damit vermischt. Man läßt die Mischung stehen, um eine wäßrige Schicht abzutrennen und zu erhalten, welche 2-Carboxyethyl-OPQ enthält. Diese Flüssigkeit wird mittels 6N Salzsäure auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt und destilliertes Wasser wird zugegeben, um eine Menge von 450 ml zu erreichen.
  • Zur resultierenden Lösung werden 50 ml DEAE-SEPHADEX A-25 zugegeben, nämlich ein Anionenaustauschträger, und die Mischung wird gut gerührt, um 2-Carboxyethyl-OPQ an dem Träger zu adsorbieren, und dann stehen gelassen. Überstandsflüssigkeit wird entfernt und der Träger wird abgetrennt und gewonnen.
  • 75 ml frisches DEAE-SEPHADEX A-25 werden in eine Säule von 50 mm Durchmesser gegeben und der gewonnene Träger wird darüber eingefüllt.
  • Durch diese Säule werden 400 ml destilliertes Wasser geleitet, um den Inhalt zu waschen, dann werden 3400 ml 0,4 M wäßrige Natriumchloridlösung und anschließend 3800ml 0,6M wäßrige Natriuinchloridlösung durchgeleitet. Zu diesem Zeitpunkt liegt das in der Reaktionsmischung enthaltene 2-Carboxyethyl- OPQ in der Fraktion von 0,6M wäßriger Natriumchloridlösung vor.
  • Diese Fraktion, in welche 2-Carboxyethyl-OPQ eluiert worden ist, wird mittels 6 N Salzsäure auf einen pH-Wert von 0,9 eingestellt und 2-Carboxyethyl-OPQ wird bei 5ºC ausgefällt. Die resultierende Ausfällung wird mittels Zentrifugalabtrennung gewonnen, mit 0,1 N Salzsäure gewaschen und dann bei ca. 70ºC im Vakuum getrocknet, um 358 mg 2-Carboxyethyl-OPQ zu erhalten.
  • Das so erhaltene 2-Carboxyethyl-OPQ weist eine orange Farbe auf und zersetzt sich langsam bei 266-271ºC und weist keinen eindeutigen Schinelzpunkt auf. Dieses Methyl-OPQ ist leicht in Wasser löslich und sehr leicht löslich unter neutralen und alkalischen Bedingungen, es ist ferner in niederen Alkoholen löslich, löst sich jedoch nicht in Aceton und Diethyläther.
  • Die Farbe der wäßrigen Lösung von 2-Carboxyethyl-OPQ ist unterschiedlich in Abhängigkeit von der Konzentration von 2- Carboxyethyl-OPQ und dem pH-Wert der wäßrigen Lösung und die wäßrige 2-Carboxyethyl-OPQ-Lösung von ca. 10 mg/l ist hellgelb bei einem pH-Wert von neutral bis alkalisch und rötlich hellgelb bei sauren Bedingungen.
  • Der Wert der Elementaranalyse, das IR-Spektrum, das ¹H-NMR- Spektrum und das sichtbare UV-Spektrum des resultierenden 2- Carboxyethyl-OPQ sind nachstehend dargestellt.
  • (1) Wert der Elementaranalyse: C&sub1;&sub8;H&sub1;&sub1;N&sub3;O&sub9; H&sub2;O (MG 431.31)
  • Berechnet (%): C 50.12 H 3.04 N 9.74
  • Festgestellt (%): C 49.85 H 3.33 N 9.62
  • (2) IR-Spektrum (vmax, cm&supmin;¹): (KBr) 2840br,s, 2500m, 2340sh,m, 1570s, 1515s, 1175vs, 1100sh,m, 755w, 730w.
  • (3) ¹H-NMR-Spektrum ( δ-Wert, ppm):(DMSO-d&sub6;, Interner Standard: TMS) 2.85(t,2H,CH2-C -CO&sub2;H,J=6.2Hz), 3.30(t,2H,C -CH&sub2;-CO&sub2;H,J=5.9Hz), 7.23(brs,1H, Pyrrolring C-H), 7.98(s,1H, Pyridinring C-H), 13.67(brs,1H, Pyrrolring N- )
  • (4) Sichtbares UV-Spektrum (λmax .nm): (10 mM Kaliumphosphatpuffer pH 7,0) 256, 275sh, 419
    • Beispiel 28
  • 6,4 g L-Glutamin werden in 800 ml destilliertem Wasser gelöst und die Lösung wird mittels 1N Salzsäure auf einen pH-Wert von 4,0 eingestellt.
  • Zu dieser L-Glutaminlösung werden 800 mg PQQ zugegeben und man läßt die Reaktion bei 30ºC 30 Stunden lang unter heftigem mechanischem Rühren bei Belüftung ablaufen. Zu dieser Reaktionsmischung werden 23,49 Natriumchlorid zugegeben, um es darin zu lösen, und dann wird sie mittels 6N Salzsäure auf einen pH-Wert von 2,0 eingestellt. Anschließend wird sie auf 5ºC abgekühlt, um 2-Carbamoylethyl-OPQ auszufällen.
  • Diese Ausfällung wird mittels Zentrifugalabtrennung gewonnen und zu dieser Ausfällung werden 250 ml destilliertes Wasser zugegeben und diese Flüssigkeit wird mittels 5N NaOH auf einen pH-Wert von 7,2 eingestellt, um die Ausfällung zu lösen.
  • Zur resultierenden Lösung werden 50 ml DEAE-SEPHADEX A-25 zugegeben, nämlich eine Anionenaustauschträger, und die Mischung wird gut gerührt, um 2-Carbamoylethyl-OPQ an dem Träger zu adsorbieren, und dann stehen gelassen. Überstandsflüssigkeit wird entfernt und der Träger wird abgetrennt und gewonnen.
  • 75 ml frisches DEAE-SEPHADEX A-25 werden in eine Säule von 50 mm Durchmesser gegeben und der gewonnene Träger wird darüber eingefüllt.
  • Durch diese Säule werden 400 ml destilliertes Wasser geleitet, um den Inhalt zu waschen, dann werden 5800 ml 0,4 M wäßrige Natriumchloridlösung und anschließend 1100 ml 0,6M wäßrige Natriumchloridlösung durchgeleitet. Zu diesem Zeitpunkt liegt beinahe das gesamte in der Reaktionsmischung enthaltene 2-Carbamoylethyl-OPQ in der Fraktion von 0,6M wäßriger Natriumchloridlösung vor.
  • Die Fraktionen von 0,4M wäßriger Natriumchloridlösung und von 0,6 M wäßriger Natriumchloridlösung, in welche 2-Carbamoylethyl-OPQ eluiert worden ist, werden mittels 6 N Salzsäure auf einen pH-Wert von 1,8 eingestellt und 2-Carbamoylethyl- OPQ wird bei 5ºC ausgefällt. Die resultierende Ausfällung wird mittels Zentrifugalabtrennung gewonnen, mit 0,1 N Salzsäure gewaschen und dann bei ca. 70ºC im Vakuum getrocknet, um 373 mg 2-Carbamoylethyl-OPQ zu erhalten.
  • Das so erhaltene 2-Carbamoylethyl-OPQ weist eine orange Farbe auf und zersetzt sich langsam bei 286-290ºC und weist keinen eindeutigen Schmelzpunkt auf Dieses 2-Carbamoylethyl-OPQ ist leicht in Wasser löslich und sehr leicht löslich unter neutralen und alkalischen Bedingungen, es ist ferner in niederen Alkoholen löslich, löst sich jedoch nicht in Aceton und Diethyläther.
  • Die Farbe der wäßrigen Lösung von 2-Carbamoylethyl-OPQ ist unterschiedlich in Abhängigkeit von der Konzentration von 2- Carbamoylethyl-OPQ und dem pH-Wert der wäßrigen Lösung und die wäßrige 2-Carbamoylethyl-OPQ-Lösung von ca. 10 mg/l ist hellgelb bei einem pH-Wert von neutral bis alkalisch und rötlich hellgelb bei sauren Bedingungen.
  • Der Wert der Elementaranalyse, das IR-Spektrum, das ¹H-NMR- Spektrum und das sichtbare UV-Spektrum des resultierenden 2- Carbamoylethyl-OPQ sind nachstehend dargestellt.
  • (1) Wert der Elementaranalyse: C&sub1;&sub8;H&sub1;&sub2;N&sub4;O&sub8; H&sub2;O (MG 430.33)
  • Berechnet (%): C 50.24 H 3.28 N 13.02
  • Festgestellt (%): C 50.01 H 3.50 N 12.87
  • (2) IR-Spektrum (vmax, cm&supmin;¹): (KBr) 2735br,m, 2500br,m 2300sh.m, 1555br,s, 1390s, 1180vs, 1100sh,s 990m, 765m, 560w
  • (3) ¹H-NMR-Spektrum ( δ-Wert, ppm):(DMSO-d&sub6;, Interner Standard: TMS) 2.76(t,2H,CH&sub2;-C -CO-NH&sub2;,J=6.7Hz), 3.31(t,2H,C -CH&sub2;-CO-NH&sub2;,J=6.9Hz) 6.79( brs,1H,CH&sub2;-CH&sub2;CO-N &sub2;), 7.25(d,1H, Pyrrolring C- ,J=2.0Hz), 7.38(brs,1H,CH&sub2;-CH&sub2;-CO-N &sub2;), 7.97(s,1H, Pyridinring C- ), 12.91(brs,1H, Pyrrolring N- )
  • (4) Sichtbares UV-Spektrum (λmax.nm): (10 mM Kaliumphosphatpuffer pH 7,0) 255, 272sh, 418
    • Beispiel 29
  • 7,2 g L-Methionin werden in 400 ml destilliertem Wasser gelöst und die Lösung wird mittels 6N Salzsäure auf einen pH- Wert von 4,0 eingestellt.
  • Zu dieser L-Methioninlösung werden 800mg PQQ zugegeben und man läßt die Reaktion bei 30ºC 26 Stunden lang unter heftigem mechanischem Rühren bei Belüftung ablaufen. Diese Reaktionsmischung wird mittels 6N Salzsäure auf einen pH-Wert von 1,5 eingestellt und auf 5ºC abgekühlt, um 2-Methylthioethyl-OPQ auszufällen.
  • Diese Ausfällung wird mittels Zentrifugalabtrennung gewonnen und zu dieser Ausfällung werden 250 ml destilliertes Wasser zugegeben und diese Flüssigkeit wird mittels 5N NaOH auf einen pH-Wert von 8,1 eingestellt, um die Ausfällung zu lösen.
  • Zur resultierenden Lösung werden 50 ml DEAE-SEPHADEX A-25 zugegeben, nämlich ein Anionenaustauschträger, und die Mischung wird gut gerührt, um 2-Methylthioethyl-OPQ an dem Träger zu adsorbieren, und dann stehen gelassen. Überstandsflüssigkeit wird entfernt und der Träger wird abgetrennt und gewonnen.
  • 75 ml frisches DEAE-SEPHADEX A-25 werden in eine Säule von 50 mm Durchmesser gegeben und der gewonnene Träger wird darüber eingefüllt.
  • Durch diese Säule werden 200 ml destilliertes Wasser geleitet, um den Inhalt zu waschen, dann werden 4800 ml 0,4 M wäßrige Natriumchloridlösung und anschließend 3000ml 0,5M wäßrige Natriumchloridlösung und 2000 ml 0,6M wäßrige Natriumchloridlösung durchgeleitet.
  • Zu diesem Zeitpunkt liegt der größe Teil des in der Reaktionsmischung enthaltenen 2-Methylthioethyl-OPQ in der Fraktion von 0,5 M wäßriger Natriumchloridlösung vor.
  • Die Fraktionen von 0,5M wäßriger Natriumchloridlösung und von 0,6 M wäßriger Natriumchloridlösung, in welche 2-Methylthioethyl-OPQ eluiert worden ist, werden mittels 6 N Salzsäure auf einen pH-Wert von 1,8 eingestellt und 2-Methylthioethyl- OPQ wird bei 5ºC ausgefällt. Die Ausfällung wird mittels Zentrifugalabtrennung gewonnen, mit 0,1 N Salzsäure gewaschen und dann bei ca. 70ºC im Vakuum getrocknet, um 470 mg 2- Methylthioethyl-OPQ zu erhalten.
  • Das so erhaltene 2-Methylthioethyl-OPQ weist eine orange Farbe auf und zersetzt sich langsam bei 250-258ºC und weist keinen eindeutigen Schmelzpunkt auf. Dieses 2-Methylthioethyl-OPQ ist leicht in Wasser löslich und sehr leicht löslich unter neutralen und alkalischen Bedingungen, es ist ferner in niederen Alkoholen löslich, löst sich jedoch nicht in Aceton und Diethyläther.
  • Die Farbe der wäßrigen Lösung von 2-Methylthioethyl-OPQ ist unterschiedlich in Abhängigkeit von der Konzentration von 2- Methylthioethyl-OPQ und dem pH-Wert der wäßrigen Lösung und die wäßrige 2-Methylthioethyl-OPQ-Lösung von ca. 10 mg/l ist hellgelb bei einem pH-Wert von neutral bis alkalisch und rötlich hellgelb bei sauren Bedingungen.
  • Der Wert der Elementaranalyse, das IR-Spektrum, das ¹H-NMR- Spektrum und das sichtbare UV-Spektrum des resultierenden 2- Methylthioethyl-OPQ sind nachstehend dargestellt.
  • (1) Wert der Elementaranalyse: C&sub1;&sub8;H&sub1;&sub3;N&sub3;O&sub7;S H&sub2;O (MG 433.39)
  • Berechnet(%): C 49.88 H 3.49 N 9.70
  • Festgestellt (%): C 49.63 H 3.77 N 9.49
  • (2) IR-Spektrum (vmax, cm&supmin;¹): (KBr) 2775br,s 2500br,m 1575s, 1510sh,s, 1175 970w, 850w, 750m, 720m
  • (3) ¹H-NMR-Spektrum ( δ-Wert, ppm):(DMSO-d&sub6;, Interner Standard: TMS) 2.13(s,3H,CH&sub2;-CH&sub2;-S-C ), 2.98(t(2H,CH&sub2;-C -S-CH&sub3;,J=7.7Hz), 3.45(t,2H,C -CH&sub2;-S-CH&sub3;,J=7.9Hz), 7.23(d,1H, Pyrrolring C- ,J=2.0Hz), 7.99(s,1H, Pyridinring C- ), 13.14(brs,1H, Pyrrolring N- ,)
  • (4) Sichtbares UV-Spektrum (λmax.nm): (10 mM Kaliumphosphatpuffer pH 7,0) 256, 273sh, 418
    • Beispiel 30
  • 8,09 L-Phenylalanin werden in 400 ml destilliertem Wasser gelöst und die Lösung wird mittels 6N Salzsäure auf einen pH- Wert von 4,0 eingestellt.
  • Zu dieser L-Phenylalaninlösung werden 800mg PQQ zugegeben und man läßt die Reaktion bei 30ºC 26 Stunden lang unter heftigem mechanischem Rühren bei Belüftung ablaufen. Diese Reaktionsmischung wird mittels 6N Salzsäure auf einen pH-Wert von 1,4 eingestellt und auf 5ºC abgekühlt, um Benzyl-OPQ auszufällen.
  • Diese Ausfällung wird mittels Zentrifugalabtrennung gewonnen und zu dieser Ausfällung werden 250 ml destilliertes Wasser zugegeben und diese Flüssigkeit wird mittels 5N NaOH auf einen pH-Wert von 8,1 eingestellt, um die Ausfällung zu lösen.
  • Zur resultierenden Lösung werden 50 ml DEAE-SEPHADEX A-25 zugegeben, nämlich ein Anionenaustauschträger, und die Mischung wird gut gerührt, um Benzyl-OPQ an dem Träger zu adsorbieren, und dann stehen gelassen. Überstandsflüssigkeit wird entfernt und der Träger wird abgetrennt und gewonnen.
  • 75 ml frisches DEAE-SEPHADEX A-25 werden in eine Säule von 50 mm Durchmesser gegeben und der gewonnene Träger wird darüber eingefüllt.
  • Durch diese Säule werden 200 ml destilliertes Wasser geleitet, um den Inhalt zu waschen, dann werden 5000 ml 0,4 M wäßrige Natriumchloridlösung und anschließend 5000ml 0,5M wäßrige Natriumchloridlösung und 5000 ml 0,6M wäßrige Natriumchloridlösung durchgeleitet. Zu diesem Zeitpunkt liegt das in der Reaktionsmischung enthaltene Benzyl-OPQ hauptsächlich in der Fraktion von 0,5 M wäßriger Natriumchloridlösung vor.
  • Die Fraktionen von 0,5M wäßriger Natriumchloridlösung und von 0,6 M wäßriger Natriumchloridlösung, in welche Benzyl-OPQ eluiert worden ist, werden mittels 6 N Salzsäure auf einen pH-Wert von 1,2 eingestellt und Benzyl-OPQ wird bei 5ºC ausgefällt. Die Ausfällung wird mittels Zentrifugalabtrennung gewonnen, mit 0,1 N Salzsäure gewaschen und dann bei ca. 70ºC im Vakuum getrocknet, um 724 mg Benzyl-OPQ zu erhalten.
  • Das so erhaltene Benzyl-OPQ weist eine orange Farbe auf und zersetzt sich langsam bei 244-250ºC und weist keinen eindeutigen Schmelzpunkt auf. Dieses Benzyl-OPQ ist leicht in Wasser löslich und sehr leicht löslich unter neutralen und alkalischen Bedingungen, es ist ferner in niederen Alkoholen löslich, löst sich jedoch nicht in Aceton und Diethyläther.
  • Die Farbe der wäßrigen Lösung von Benzyl-OPQ ist unterschiedlich in Abhängigkeit von der Konzentration von Benzyl-OPQ und dem pH-Wert der wäßrigen Lösung und die wäßrige Benzyl-OPQ- Lösung von ca. 10 mg/l ist hellgelb bei einem pH-Wert von neutral bis alkalisch und rötlich hellgelb bei sauren Bedingungen.
  • Der Wert der Elementaranalyse, das IR-Spektrum, das ¹H-NMR- Spektrum und das sichtbare UV-Spektrum des resultierenden Benzyl-OPQ sind nachstehend dargestellt.
  • (1) Wert der Elementaranalyse. C&sub2;&sub2;H&sub1;&sub3;N&sub3;O&sub7; H&sub2;O (MG 449.37)
  • Berechnet (%): C 58.80 H 3.36 N 9.35
  • Festgestellt (%): C 58.52 H 3.61 N 9.14
  • (2) IR-Spektrum (vmax, cm&supmin;¹): (KBr) 2710br,s, 2490br,s 1575br,s, 1490sh,s 1170vs, 980w, 710m, 690m, 660sh,w
  • (3) ¹H-NMR-Spektrum ( δ-Wert, ppm):(DMSO-d&sub6;, Interner Standard: TMS) 4.67(s,2H,C -C&sub6;H&sub5;), 7.02-7.90(m,6H, Pyrrolring C- ,CH&sub2;-C&sub6; ), 7.96(s, 1H, Pyridinring C- ), 12.95(brs, Pyrrolring N- ,)
  • (4) Sichtbares UV-Spektrum (λmax .nm): (10 mM Kaliumphosphatpuffer pH 7,0) 256, 273sh,419
    • Beispiel 31
  • 4,4g L-Tyrosin werden in 400 ml destilliertem Wasser gelöst und die Lösung wird mittels 1N Salzsäure auf einen pH-Wert von 4,0 eingestellt.
  • Zu dieser L-Tyrosinlösung werden 800 mg PQQ zugegeben und man läßt die Reaktion beil 60ºC 24 Stunden lang unter heftigem mechanischem Rühren bei Belüftung ablaufen. Diese Reaktionsmischung wird auf 5ºC abgekühlt und ausgefälltes L-Tyrosin wird abfiltriert. Das Filtrat wird mittels 6N Salzsäure auf einen pH-Wert von 1,0 eingestellt und auf 5ºC abgekühlt, um 4-Hydroxybenzyl-OPQ auszufällen.
  • Diese Ausfällung wird mittels Zentrifugalabtrennung gewonnen und zu dieser Ausfällung werden 150 ml destilliertes Wasser zugegeben und diese Flüssigkeit wird mittels 5N NaOH auf einen pH-Wert von 7,3 eingestellt, um die Ausfällung zu lösen.
  • Zur resultierenden Lösung werden 50 ml DEAE-SEPHADEX A-25 zugegeben, nämlich ein Anionenaustauschträger, und die Mischung wird gut gerührt, um 4-Hyroxybenzyl-OPQ an dem Träger zu adsorbieren, und dann stehen gelassen. Überstandsflüssigkeit wird entfernt und der Träger wird abgetrennt und gewonnen.
  • 75 ml frisches DEAE-SEPHADEX A-25 werden in eine Säule von 50 mm Durchmesser gegeben und der gewonnene Träger wird darüber eingefüllt.
  • Durch diese Säule werden 500 ml destilliertes Wasser geleitet, um dem Inhalt zu waschen, dann werden 3700 ml 0,4 M wäßrige Natriuinchloridlösung und anschließend 6000ml 0,6 M wäßrige Natriumchloridlösung durchgeleitet. Zu diesem Zeitpunkt liegt das an dem Trägermaterial adsorbierte 4-Hydroxybenzyl- OPQ in der Fraktion von 0,6 M wäßriger Natriumchloridlösung vor.
  • Diese Fraktion, in welche 4-Hdyroxybenzyl-OPQ eluiert worden ist, wird mittels 6 N Salzsäure auf einen pH-Wert von 1, eingestellt und 4-Hydroxybenzyl-OPQ wird bei 5ºC ausgefällt. Die Ausfällung wird mittels Zentrifugalabtrennung gewonnen, in Methanol gelöst und die Lösung wird bis zur Trockne aufkonzentriert. Dann wird Diethyläther zugegeben und die resultierende Ausfällung wird abfiltriert. Die Ausfällung wird bei ca 70ºC im Vakuum getrocknet, um 357 mg 4-Hydroxybenzyl-OPQ zu erhalten.
  • Das so erhaltene 4-Hydroxybenzyl-OPQ weist eine rötlich braune Farbe auf und zersetzt sich langsam bei 263-268ºC und weist keinen eindeutigen Schmelzpunkt auf. Dieses 4-Hydroxybenzyl-OPQ ist leicht in Wasser löslich und sehr leicht löslich unter neutralen und alkalischen Bedingungen, es ist ferner in niederen Alkoholen löslich, löst sich jedoch nicht in Aceton und Diethyläther.
  • Die Farbe der wäßrigen Lösung von 4-Hydroxybenzyl-OPQ ist unterschiedlich in Abhängigkeit von der Konzentration von 4- Hydroxybenzyl-OPQ und dem pH-Wert der wäßrigen Lösung und die wäßrige 4-Hydroxybenzyl-OPQ-Lösung von ca. 10 mg/l ist hellgelb bei einem pH-Wert von neutral bis alkalisch und rötlich hellgelb bei sauren Bedingungen.
  • Der Wert der Elementaranalyse, das IR-Spektrum, das ¹H-NMR- Spektrum und das sichtbare UV-Spektrum des resultierenden 4- Hydroxybenzyl-OPQ sind nachstehend dargestellt.
  • (1) Wert der Elementaranalyse: C&sub2;&sub2;H&sub1;&sub3;N&sub3;O&sub8; H&sub2;O (MG 465.37)
  • Berechnet (%): C 56.78 H 3.25 N 9.03
  • Festgestellt (%): C 56.51 H 3.52 N 8.87
  • (2) IR-Spektrum (vmax, cm&supmin;¹): (KBr) 2810s, 2520s,sh, 1590s, 1500s, 1415m, 1180vs, 990w,sh 820w,sh, 760m, 730m, 670w,sh
  • (3) ¹H-NMR-Spektrum ( δ-Wert, ppm):(DMSO-d&sub6;, Interner Standard: TMS) 4.54(s,2H,C -C&sub6;H&sub4;OH), 6.64(d,2H,J=8.6Hz,CH&sub2; C- ), 6.81(d,2H,J=8.1HZ, OH C- ), 7.31(d,1H, Pyrrolring C- ,3=2.0Hz), 7.94(s,1H, Pyridinring C- ), 13.01(brs,1H, Pyrrolring N- )
  • (4) Sichtbares UV-Spektrum (λmax.nm): (10 mM Kaliumphosphatpuffer pH 7,0) 256, 270sh, 420
    • Beispiel 32
  • Nierenmark von einer Hundeniere wird mit 10 mM Phosphorsäurepuffer (pH 7,0), enthaltend 2 mM Dithiothreitol in einer dem 4-fachen Volumen des Nierenmarks entsprechenden Menge, homogenisiert und einer Zentrifugation unterworfen. Die Überstandsflüssigkeit wird mittels Affinitätschromatographie, Gelfiltration und chromatographischer Focussierung (chromatofocusing) gereinigt, um elektrophoretisch homogene Aldosereduktase zu erhalten.
  • 0,05 ml 3 mM NADPH, 0,1 ml DL-Glycerinaldehyd und 0,04 ml destilliertes Wasser werden zu 0,8 ml 0,1 M Phosporsäurepuffer (pH 6,2) zugegeben und bei 25ºC 3 Minuten stehen gelassen. Daraufhin werden 0,01 ml der Aldosereduktaselösung zugegeben, um die Reaktion zu starten, und die Abnahme der Extinktion bei 340 nm wird bei 25ºC von Zeit zu Zeit gemessen. Die Menge des Enzyms, welches 1 µMol NADPH in 1 Minute verbraucht, wird als 1 Einheit definiert.
  • Die Enzymaktivität wird unter den gleichen Bedingungen gemessen, wie vorstehend für Aldosereduktaseaktivität angegeben, mit der Abänderung, daß 0,04 ml wäßrige Lösung einer Hemmsubstanz in verschiedenen Konzentrationen anstelle von 0,04 ml destilliertem Wasser zugegeben werden, und das Ausmaß der Hemmwirkung wird aus dem Vergleich der Enzymaktivität mit der in Abwesenheit der Hemmsubstanz erhaltenen Enzymaktivität berechnet.
  • (1) OPQ, (2) Methyl OPQ, (3) 1.Methylpropyl OPQ, (4) 2-Methylpropyl OPQ, (5) 2 Carbamoylethyl OPQ, (6) Hydroxymethyl OPQ, (7) 2-Methylthioethyl OPQ, (8) 2-Carboxyethyl OPQ, (9) 4-Hydroxybenzyl OPQ, (10) 1-Methylethyl OPQ, und (11) Benzyl OPQ werden als Hemmsubstanzen eingesetzt und (12) PQQ wird als Kontrollsubstanz verwendet.
  • Das Ausmaß der Hemmwirkung dieser Substanzen für Aldosereduktase ist in Tabelle 17 dargestellt.
  • Wie aus Tabelle 17 ersichtlich ist, weisen OPQs eine höhere Hemmwirkung für Aldosereduktase auf als PQQ. Tabelle 17 Hemmwirkung von OPQs und PQQ in bezug auf Aldosereduktase der Nieren
    • Beispiel 33
  • Die Linse eines Kaninchens wird mit 10 mM Phosphorsäurepuffer (pH 7,0), enthaltend 2 mM Dithiothreitol in einer dem 2fachen Volumen der Linse entsprechenden Menge, homogenisiert und einer Zentrifugation unterworfen. Die Überstandsflüssigkeit wird mittels Affinitätschromatographie, Gelfiltration und chromatischer Fokussierung gereinigt, um elektrophoretisch homogene Aldosereduktase zu erhalten. Unter Verwendung von (1)OPQ, (2) 1-Methylpropyl-OPQ, (3) 2-Methylpropyl-OPQ, (4) Hydroxymethyl-OPQ, und (5) 1-Methylethyl-OPQ als Hemmsubstanzen wird die Hemmwirkung dieser Substanzen für Aldosereduktase der Kaninchenlinse in gleicher Weise untersucht, wie in Beispiel 32. Die Hemmwirkung dieser Substanzen für Aldosereduktase ist in Tabelle 18 dargestellt.
  • Wie aus Tabelle 18 ersichtlich ist, weisen die OPQs eine höhere Hemmwirkung für Aldosereduktase auf als PQQ. Tabelle 18 Hemmwirkung von OPQs in bezug auf Aldosereduktase der Linse
    • Beispiel 34
  • Vierundachzig männliche Sprague-Davley -Ratten (geliefert von Japan Charles Liver Co.), 4 Wochen alt mit einem Körpergewicht von 70 bis 80g werden eingesetzt und die folgenden Versuche werden durchgeführt. Eine Gruppe besteht aus 6 Ratten.
  • Die Gruppen umfassen eine normale Gruppe, eine 50% -Galactose-Verabreichungsgruppe, eine PQQ-Verabreichungsgruppe,und eine OPQ-Verabreichungsgruppe Im Handel erhältliches Futter (hergestellt von Japan Clea Co.) wird den Ratten der normalen Gruppen verabreicht, und die Ratten der 50% -Galactose-Verabreichungsgruppe, der PQQ-Verabreichungsgruppe und der OPQ- Verabreichungsgruppe läßt man pulverartiges Futter aufnehmen, das eine Mischung des genannten im Handel erhältlichen Pulverfutters und D-Galactose als Futterzusatz im gleichen Gewichtsverhältnis enthält.
  • Den Ratten der PQQ- und OPQ-Verabreichungsgruppen wird PQq.2Na oder OPQ in einer Dosis von 2 mg, 5mg, 10 mg und 20 mg je kg Körpergewicht der Ratte einmal am Tag gleichzeitig mit Beginn der Galactosefütterung und bis zum Ende des Fütterns verabreicht.
  • Am sechsten Tag und am neunten Tag nach Versuchsbeginn wird der Augapfel mittels eines stereoskopischen Mikroskops untersucht und die Beurteilung in bezug auf grauen Star wird nach folgenden Kriterien durchgeführt.
  • AO: keine Trübung (normal)
  • A1: leichte weibliche Trübung im Oberflächenbereich
  • A2: leichte kräftig weiße Trübung im Oberflächenbereich
  • A3: beträchtliche weiße Trübung im Oberflächenbereich
  • A4: beträchtliche weiße Trübung im Oberflächenbereich und geringfügige weiße Trübung im Zentrum.
  • A5: beträchtliche weiße Trübung im Oberflächenbereich und im Zentrum.
  • Die Ergebnisse sind in Tabelle 19 dargestellt.
  • Das Fortschreiten des grauen Stars konnte durch die intraperitoneale Verabreichung von PQQ verhindert werden, jedoch im Fall der Verabreichung von PQQ.2na in einer Dosis von 10 mg und 20 mg/kg Ratte, wurde eine Reduktion des Körpergewichts festgestellt, und im Fall der Verabreichung von PQQ.2na in einer Dosis von 20 mg/kg Ratte starben einige Ratten.
  • Andererseits wurde jedoch das Fortschreiten des grauen Stars durch die Verabreichung von OPQ wirksamer verhindert, als dies durch die Verabreichung von PQQ möglich war und außerdem starben bei Verabreichung von OPQ keine Ratten, was bei Verabreichung von PQQ nicht der Fall war. Tabelle 19 Hemmwirkung in bezug auf grauen Star von peritoneal verabreichtem PQQ, OPQ
  • * reduziertes Körpergewicht im Durchschnitt (66g) das durchschnittliche Körpergewicht der Ratten der Normalgruppe betrug ca.115 g
  • ** Körpergewicht nicht erhöht ( Durschnitt: 77g)
  • Das Körpergewicht der Ratten der Normalgruppe betrug ca.141 g
    • Beispiel 35
  • Sechsunddreißig männliche Sprague-Davley -Ratten (geliefert von Japan Charles Liver Co.), 4 Wochen alt mit einem Körpergewicht von 70 bis 80g werden eingesetzt und die folgenden Versuche werden durchgeführt. Eine Gruppe besteht aus 6 Ratten.
  • Die Gruppen umfassen eine normale Gruppe, eine 50%-Galactose- Verabreichungsgruppe, eine PQQ-Verabreichungsgruppe, und eine OPQ-Verabreichungsgruppe. Im Handel erhältliches Futter (hergestellt von Japan Clea Co.) wird den Ratten der normalen Gruppe verabreicht, und die Ratten der 50% -Galactose-Verabreichungsgruppe, der PQQ-Verabreichungsgruppe und der OPQ- Verabreichungsgruppe läßt man pulverartiges Futter aufnehmen, das eine Mischung des genannten im Handel erhältlichen Pulverfutters und von D-Galactose als Futterzusatz im gleichen Gewichtsverhältnis enthält.
  • Den Ratten der PQQ- und OPQ-Verabreichungsgruppen wird PQQ.2na oder OPQ in einer Dosis von 10 mg und 20 mg je kg Körpergewicht der Ratte einmal am Tag gleichzeitig mit Beginn der Galactosefütterung und bis zum Ende des Fütterns verabreicht.
  • Am sechsten und am neunten Tag nach Versuchsbeginn wird der Augapfel mittels eines stereoskopischen Mikroskops untersucht und die Beurteilung in bezug auf grauen Star wird nach den gleichen Kriterien wie in Beispiel 34 durchgeführt.
  • Die Ergebnisse sind in Tabelle 20 dargestellt. Das Fortschreiten des grauen Stars konnte durch die orale Verabreichung von PQQ kaum verhindert werden, jedoch im Fall der oralen Verabreichung von OPQ wurde dieses deutlich verhindert. Tabelle 20 Hemmwirkung in bezug auf grauen Star von oral verabreichtem PQQ, OPQ
    • Beispiel 36
  • Test bezüglich der Makrophagen-Chemotaxis (1):
  • 32 C3H/He-Mäuse (männlich, 7 Wochen alt, durchschnittliches Körpergewicht 20g, geliefert von Japan Charles River Co.) werden in 4 Gruppen (A-D) von je 8 Mäusen aufgeteilt.
  • Eine Lösung von OPQ in physiologischer Salzlösung mit einem pH-Wert von 7,0 wird jeder Maus 7 mal intraperitoneal verabreicht, nämlich am 1.Tag, am 2.Tag, am 3.Tag, am 4.Tag, am 5.Tag, am 6.Tag und am 7.Tag. Die Dosierung je Verabreichung je Maus ist wie folgt 0,2ml der Lösung, welche 0,2 mg/ml OPQ enthält, für Gruppe B; 0,2ml der Lösung, welche 0,5 mg/ml OPQ enthält, für Gruppe C; 0,2ml der Lösung, welche 0,1 mg/ml OPQ enthält, für Gruppe D und 0,2 ml der physiologischen Salzlösung für Gruppe A.
  • Am 8. Tag nach Beginn des Versuchs werden die Mäuse mit Äther anästesiert und aus der Halsschlagader wird Blut abgenommen, 5 ml kalter Hank's Lösung werden intraperitoneal injiziert und Exudatzellen für den Bauchraum werden gesammelt. Die Exudatzellen für den Bauchraum der entsprechenden Gruppen werden gesammelt, 3 mal mit kalter Hank's Lösung gewaschen und in RPMI-Medium entsprechend 5x10&sup5; Zellen/ml suspendiert und dann wird die Makrophagenchemotaxis gemessen. Mit 50% Zymosan behandeltes Serum wird als Faktor für die Chemotaxis eingesetzt und die Untersuchung findet bei jeder Probe an 3 Punkten statt. Die Anzahl der mittels Chemotaxis untersuchten Makrophagen wird mittels eines Mikroskops gemessen und für jeden einzelnen Punkt werden 13 visuelle Bereiche untersucht; die Ergebnisse sind in Tabelle 21 dargestellt. Der Wert in der Tabelle ist eine Gesamtzahl der mittels Chemotaxis untersuchten Makrophagen an 3 Punkten jeder Probe.
  • Die Herstellung der Hank's Lösung und des RMPI-Mediums ist nachtehend erläutert.
    • Hank's Lösung
  • Hank's Lösung (Nissui Seiyaku Co.) 475 ml
  • 2% Lactalbumin 25 ml
  • 7,5% NaHCO&sub3; 1,25 ml
  • Die entsprechenden Flüssigkeiten werden bei 121ºC 15 Minuten lang sterilisiert und vor Verwendung unter aseptischen Bedingungen vermischt.
    • RPMI-Medium
  • RPMI (Gibco Diagnostics Laboratories (USA)) 261 ml
  • Serum eines Rinderfötus (Flow Laboratories (USA)) 30 ml
  • 5x10&supmin;³M 2-Mercaptoethanollösung 3 ml
  • Mischung aus Streptomycin (100 µg/ml) und Penicillin G(100 Einheiten/ml) 3 ml
  • 200 mM L-Glutaminlösung 3 ml
  • Die genannten Bestandteile werden mit Ausnahme des Serums eines Rinderfötus filtriert und vor Verwendung unter aseptischen Bedingungen vermischt. Tabelle 21
    • Beispiel 37
  • Test bezüglich der Makrophagen-Chemotaxis (2):
  • Der Test bezüglich der Makrophagen-Chemotaxis wird in gleicher Weise durchgeführt wie in Beispiel 36, mit der Abänderung, daß Hydroxymethyl-OPQ jeder Maus 3 mal intraperitoneal verabreicht wird, nämlich am ersten, zweiten und dritten Tag, und zwar in folgender Dosierung je Verabreichung je Maus: 0,2 ml Hydroxymethyl-OPQ-Lösung, enthaltend 0,5 mg/ml Hydroxymethyl-OPQ für Gruppe B; 0,2 ml der Lösung, enthaltend 1,0 mg/ml Hydroxymethyl-OPQ für Gruppe C und 0,2 ml der Lösung, enthaltend 1,5 mg/ml Hydroxymethyl-OPQ für Gruppe D, und die Exudatzellen für die Bauchhöhle werden am vierten Tag nach Beginn des Versuchs gesammelt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 22 dargestellt. Tabelle 22
    • Beispiel 38
  • Test in bezug auf die T-Zellen-Aufbrech(blast)--Transformationsreaktion
  • (1):
  • In gleicher Weise wie in Beispiel 36 wird OPQ an C3H/He-Mäuse verabreicht und die Mäuse werden aufgezogen. Die Dosierung des OPQ je Verabreichung je Maus beträgt 0,2 ml OPQ-Lösung, enthaltend 0,5 mg/ml OPQ für Gruppe B und 0,2 ml der Lösung, enthaltend 1,0 mg/ml OPQ für Gruppe C und 0,2 ml physiologische Salzlösung werden in Gruppe A verabreicht.
  • Am achten Tag nach Beginn des Versuchs wird die Maus mit Äther anästhesiert, Blut wird aus der Halsschlagader entnommen, und die Milz wird unter aseptischen Bedingungen entnommen.
  • Milzzellen der entsprechenden Gruppen werden aufgebrochen und diese Zellen läßt man auf tris-NH&sub4;Cl hämolytischer , auf 37ºC erwärmter Lösung schwimmen und 5 Minuten bei 37ºC stehen, um Erythrozyten zu hämolysieren. woraufhin zweimal mit kalter Hank's Lösung gewaschen wird. Die Zellen werden in RPMI-Medium entsprechend 4x10&sup6; Zellen/ml suspendiert und die Suspension wird auf eine Mikroplatte mit flachem Boden und mit 96 Vertiefungen gegeben.Das Züchten findet in Luft, welche 5 % CO&sub2; enthält, bei 37ºC unter Einsatz von Concanavalin A(Typ IV Sigina C 2010) in einer Menge von 0,5 µg/ml oder 2µg/ml als Mitogen statt. 63 Stunden nach Beginn des Züchtens wird ³H- Thymidin in einer Menge von 2,5 µci/ml zugegeben und das Züchten wird weitere 9 Stunden lang fortgesetzt. Anschließend werden die Zellen auf einem Glasfaserfilter gesammelt und das ³H auf diesem Filter wird mittels eines Flüssig-Scintillationszählers gemessen.
  • Zur Kontrolle werden die gleichen 4 Kulturen bei gleichen Bedingungen ohne Zugabe von Concanavalin A hergestellt.
  • Die Ergebnisse sind in Tabelle 23 dargestellt.
  • Die Werte in der Tabelle sind Durchschnittswerte der eingesetzten Menge (cpm) an ³H in der Kultur und vier gleichen Bedingungen.
  • Die hämolytische tris-NH&sub4;Cl-Lösung wird in folgender Weise hergestellt.
  • Hämolytische Tris-NH&sub4;Cl-Lösung:
  • 0,16 M NH&sub4;Cl 90 ml
  • 0,17 M tris (eingestellt auf pH 7,65 mittels HCl) 10 ml
  • Die obigen beiden Flüssigkeiten werden vermischt und die Mischung wird auf einen pH-Wert von 7,2 eingestellt und bei 121ºC 15 Minuten lang sterilisiert. Tabelle 23
    • Beispiel 39
  • Test in bezug auf die T-Zellen-Aufbrech-Transformationsreaktion (2):
  • Milzzellen werden in gleicher Weise erhalten wie in Beispiel 38, mit der Abänderung, daß OPQ den 5 C3H/He-Mäusen (männlich, 7 Wochen alt, durchschnittliches Körpergewicht 20g, geliefert von Japan Charles Liver Co.) nicht verabreicht wird.
  • Dann werden die Zellen in RPMI-Medium entsprechend 4x10&sup6; Zellen /ml suspendiert und die Suspension wird auf eine Mikroplatte mit flachem Boden und 96 Vertiefungen gegeben. Das Züchten findet in Luft, welche 5 % CO&sub2; enthält, bei 37ºC unter Einsatz von Concanavalin A als Mitogen unter Zugabe von 0,5 oder 2,0 µg/ml OPQ statt. 63 Stunden nach Beginn des Züchtens wird ³H-Thymidin in einer Menge von 2,5 uci/ml zugegeben und das Züchten wird weitere 9 Stunden lang fortgesetzt. Anschließend werden die Zellen auf einem Glasfaserfilter gesammelt und das ³H auf diesem Filter wird mittels eines Flüssig-Scintillationszählers gemessen.
  • Zur Kontrolle werden die gleichen 4 Kulturen bei gleichen Bedingungen ohne Zugabe von Concanavalin A oder OPQ hergestellt.
  • Die Ergebnisse sind in Tabelle 24 dargestellt .
  • Die Werte in der Tabelle sind Durchschnittswerte der eingesetzten Menge (cpm) an ³H in der Kultur bei den gleichen vier Bedingungen. Es wird kein Effekt einer Wirkungsbeschleunigung durch OPQ festgestellt, wenn Concanavalin A nicht zugegeben wird, jedoch wird dieser Effekt einer Wirkungsbeschleunigung durch OPQ erzielt, wenn Concanavalin A zugegeben wird. Tabelle 24
    • Beispiel 40
  • Test in bezug auf B-Zellen-Aufbrech-Transformationsreaktion:
  • Milzzellen von C3H/He-Mäusen, welchen OQP verabreicht wurde, werden in gleicher Weise erhalten, wie in Beispiel 38.
  • Ferner wird die aufgenommene Menge an ³H-Thymidin in gleicher Weise untersucht wie in Beispiel 38, mit der Abänderung, daß 25µl/ml oder 50 µg/ml Lipopolysaccharid (LPS WE E.coli 0111, Difco) anstelle von Concanavalin A als Mitogen eingesetzt werden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 25 dargestellt. Die Werte in der Tabelle sind Durchschnittswerte der aufgenommenen Menge (cpm) an ³H in der Kultur unter vier gleichen Bedingungen. Tabelle 25
  • In den Beispielen 36-40 wird die Makrophagen-Aktivität gemäß der Chemotaxis peritonealer Makrophagen (Literatur 1) und die Aktivität der T-Zellen und der B-Zellen gemäß der Aufbrech- Transformationsreaktion unter Einsatz von Concanavalin A und Lipopolysaccharid (LPS) als Mitogen (Literatur 2) untersucht.
  • Literatur 1: "Function of Macrophage and Method of Measurement of Function", Seiten 61-65 , 1985),herausgegeben von Educational Committee of Japan Bacteriological Society, veröffentlicht von Saikon Shuppan Co.)
  • Literatur 2: "New Method of Searching of Function of Lymphocytes", Seiten 350-355 (1987), herausgegeben von Junichi Yada und Michio Fujiwara, veröffentlicht von Chugai Igaku Co.
    • Beispiel 41
  • Pharmakologische Aktivität (1) von OPQs bei durch Kohlenstofftetrachlorid (CCl&sub4;) hervorgerufenen Leberkrankheiten:
  • 25 SD-Ratten (männlich, 7 Wochen alt, Körpergewicht: ca. 220g; geliefert von Japan Charles River Co.) werden in 5 Gruppen (A-E) aufgeteilt, die aus je 5 Ratten bestehen.
  • Alle Ratten läßt man 16 Stunden lang hungern und dann werden 1,1 ml Lösungen, enthaltend 0,4 mg/ml, 1,0 mg/ml und 2, mg/ml OPQ, intraperitoneal an die Ratten der Gruppen C,D und E verabreicht, und ferner wird nach 40 Minuten OPQ in der gleichen Dosis wie oben erwähnt intraperitoneal verabreicht. In diesen Fällen wird OPQ als Lösung in physiologischer Salzlösung eingesetzt. Den Ratten der Gruppe B werden 1,1 ml physiologischer Salzlösung anstelle der OPQ-Lösung intraperitoneal verabreicht.
  • Ferner werden nach 20 Minuten 2,2ml einer 10%-igen Kohlenstofftetrachloridlösung (in Olivenöl) den Ratten der Gruppen B-E in den Magen verabreicht.Den Ratten der Gruppe A wurde weder OPQ noch Kohlenstofftetrachlorid verabreicht.
  • 24 Stunden nach dem Verabreichen von Kohlenstofftetrachlorid wird Blut aus der Bauchschlagader entnommen und mittels Zentrifugaltrennung wird Serum erhalten.
  • GPT, GOT und die Menge des gesamten vorhandenen Bilirubin werden mittels eines klinischen Untersuchungsreagens (Warenzeichen: FUJI Dry Chemslide, hergestellt von Fuji Photo Film Co.Ltd.) gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 26 als Durchschnittswerte für 5 Ratten angegeben.
  • GPT, GOT und die Menge des gesamten vorhandenen Bilirubins, welche mit Verabreichung von Kohlenstofftetrachlorid ansteigen, sinken bei Verabreichung von OPQ erheblich ab, und man kann daraus schließen, daß OPQ eine Hemmwirkung in bezug auf Leberkrankheiten aufweist. Tabelle 26
    • Beispiel 42
  • Pharmakologische Aktivität (2) von OPQs bei durch Kohlenstofftetrachlorid (CCl&sub4;) hervorgerufene Leberkrankheiten:
  • Die Pharmakologische Aktivität von OPQs in bezug auf durch Kohlenstofftetrachlorid hervorgerufene Lebererkrankungen wird in gleicher Weise untersucht wie in Beispiel 41, mit der Abänderung, daß 1-Methylpropyl-OPQ, 2-Methylthioethyl-OPQ und Benzyl-OPQ je 2-mal in einer Dosis von 5 mg/kg Körpergewicht der Ratte anstelle von OPQ verabreicht werden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 27 dargestellt.
  • GPT, GOT und die Menge des gesamten vorhandenen Bilirubins, welche bei Verabreichung von Kohlenstofftetrachlorid ansteigen, sinken bei Verabreichung von 1-Methylpropyl-OPQ, 2- Methylthioethyl-OPQ oder Benzyl-OPQ stark ab. Daraus läßt sich schließen, daß OPQs eine Hemmwirkung in bezug auf Lebererkrankungen aufweisen. Tabelle 27
    • Beispiel 43
  • Pharmakologische Wirkung von OPQ auf durch D-Galactosamin hervorgerufene Lebererkrankungen:
  • 30 SD-Ratten (männlich, 7 Wochen alt, Körpergewicht: ca.240 g; geliefert von Japan Charles River Co.) werden in 6 Gruppen (A-F) aufgeteilt, die aus je 5 Ratten bestehen. Man läßt alle Ratten 18 Stunden lang hungern, dann werden 1,2 ml Lösungen, enthaltend 0,4 mg/ml, 1,0 mg/ml, 2,0 mg/ml und 3,0 mg/ml OPQ, den Ratten der Gruppen C, D,E und F intraperitoneal verabreicht und ferner wird nach 40 Minuten OPQ in der genannten Dosis den Ratten intraperitoneal verabreicht. In diesen Fällen wird das OPQ in physiologischer Salzlösung gelöst und den Ratten verabreicht. Den Ratten der Gruppe B werden anstelle der OPQ-Lösung 1,2 ml physiologischer Salzlösung intraperitoneal verabreicht.
  • Anschließend werden nach 20 Minuten 1,2 ml einer Lösung, enthaltend 0,2 mg/ml D-Galactosamin, den Ratten der Gruppen B-F subkutan injiziert. Weder OPQ noch D-Galactosamin werden den Ratten der Gruppe A verabreicht.
  • 23 Stunden nach Verabreichung von D-Galactosamin wird Blut aus der Bauchschlagader entnommen und Serum wird mittels Zentrifugalabtrennung erhalten.
  • GPT, GOT und die gesamte vorhandene Menge an Bilirubin werden mittels klinischer Untersuchungsreagentien (Warenzeichen: FUJI DRYCHEMSLIDE, hergestellt von Fuji Photo Film Co.Ltd.) gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 28 als Durchschnittswerte für 5 Ratten angegeben.
  • GPT, GOT und die gesamte vorhandene Menge an Bilirubin, welche bei Verabreichung von D-Galactosamin ansteigen, sinken bei Verabreichung von OPQ stark ab, woraus man ableiten kann, daß OPQ eine Hemmwirkung in bezug auf Lebererkrankungen aufweist.

Claims (8)

1. Eine Verbindung, dargestellt durch die folgende Formel und ein Salz derselben:
2. Eine Verbindung, dargestellt durch die folgende Formel und ein Salz derselben:
3. Ein Aldose-Reduktase-Hemmstoff, der als Wirkstoff eine Verbindung, dargestellt durch die folgende Formel (I), oder ein Salz oder einen Ester derselben enthält,
in welcher R Wasserstoff oder eine niedere Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen darstellt, welche durch einen oder mehrere Substituenten substituie'rt sein kann, wobei diese Substituenten aus der Gruppe, bestehend aus Hydroxyl-, Carboxy-, Mercapto-, Amino-, Carbamoyl-, Phenyl-, Hydroxyphenyl-, Guanidino-, Imidazolyl- und Methylmercaptogruppen, ausgewählt sind.
4. Ein Aldose-Reduktase-Hemmstoff nach Anspruch 3, in welchem der Ester der Verbindung der Formel (I) eine Verbindung, dargestellt durch die folgende Formel (II), ist: in welcher R wie in Anspruch 3 definiert ist und R¹, R² und R³, welche gleich oder verschieden sein können, jeweils ein Wasserstoffatom, eine Methylgruppe, eine Ethylgruppe, eine Allylgruppe oder eine Benzylgruppe darstellen.
5. Ein Heilmittel gegen Diabetesbegleitkrankheiten, welches als Wirkstoff eine Verbindung, dargestellt durch die folgende Formel (I), oder ein Salz oder einen Ester derselben enthält:
in welcher R wie in Anspruch 3 definiert ist.
6. Ein Heilmittel gegen Diabetesbegleitkrankheiten nach Anspruch 5, in welchem der Ester der Verbindung der Formel (I) eine Verbindung, dargestellt durch die folgende Formel (II) ist:
in welcher R wie in Anspruch 3 definiert ist und R¹, R² und R³, welche gleich oder verschieden sein können, jeweils ein Wasserstoffatom, eine Methyl- , Ethyl- , Allyl- oder Benzylgruppe darstellen.
7. Ein Mittel zur Steigerung der Immunkräfte, welches als Wirkstoff eine Verbindung, dargestellt dürch die folgende Formel (I) oder ein Salz davon enthält
in welcher R wie in Anspruch 3 definiert ist.
8. Ein Mittel zur Verhinderung einer Lebererkrankung, welches als Wirkstoff eine Verbindung, dargestellt durch die folgende Formel (I) oder ein Salz davon enthält:
in welcher R wie in Anspruch 3 definiert ist.
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