CH634599A5 - Verfahren zur herstellung von neuen antibiotika der thienamycin-reihe. - Google Patents

Description

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PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Herstellung von neuen antibiotischen Verbindungen der Strukturformel ch3-ch{oh)

-ch=ch-nh-2-

ch.

(I)

in Form eines Gemischs der beiden isomeren Antibiotika der der Thienamycinfamilie. Die neuen antibiotischen Verbin-

890A2 und 890As, oder von deren pharmazeutisch annehmba- düngen, die hier als 890A2 und 890As bezeichnet werden, kön-ren Salzen, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Stamm is nen als Antibiotika in verdünnten Formen, als rohe Konzen-von Streptomyces flavogriseus in einem wässrigen, assimilier- träte und in reinen Formen vorliegen.

bare Quellen von Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe

Salze enthaltenden Nährmedium unter aeroben Bedingungen zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von neuen und wertzüchtet und das genannte Gemisch gewinnt oder vor der vollen Antibiotika zu schaffen, die bei der Hemmung des Gewinnung versalzt. 20 Wachstums verschiedener gram-negativer und gram-positiver

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, Mikroorganismen sehr aktiv sind. Erfindungsgemäss erfolgt dass der gezüchtete Organismus Streptomyces flavogriseus dies durch Fermentation eines Nährmediums mit Species von NRRL 8139 oder NRRL 8140 ist. Streptomyces, wie im Patentanspruch 1 definiert.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeich- Die neuen erfindungsgemässen antibiotischen Verbindun-net, dass man die Züchtung unter submersen Bedingungen aus- 25 gen werden durch Züchten bei kontrollierten Bedingungen von führt. neuen Stämmen von Streptomyces flavogriseus hergestellt.

4. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, Aufgrund ausgedehnter taxonomischer Untersuchungen dadurch gekennzeichnet, dass man das erhaltene Gemisch in wurden die Mikrorganismenstämme, die bei der vorliegenden seine Komponenten spaltet und eine Verbindung 890A2 und Erfindung verwendet wurden, als Stämme identifiziert, die zu eine Verbindung 890As bzw. Salze dieser Verbindungen erhält. 30 den Species Streptomyces flavogriseus gehören und als MA-

4434 und MA-4600 in der Kultursammlung von Merck & Co., Inc. Rahway, N.j., bezeichnet. Eine Kultur von jedem Stamm wurde am 7. Nov. 1975 permanent ohne Beschränkungen hinsichtlich der Freigabe bei der Kultursammlung des Northern 35 Regional Laboratories, Northern Utilization Research and Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren Development Division, Agricultural Research Service, U.S. zur Herstellung von neuen Antibiotika MSD 890A2 und MSD Department of Agriculture, Peoria, III., hinterlegt und sind 890A5 und von deren pharmazeutisch annehmbaren Salzen (die öffentlich unter den Bezeichnungen NRRL 8139 bzw. 8140 im folgenden als Antibiotika 890A2 und 890A5 bezeichnet wer- zugänglich.

den), die gegenüber gram-positiven und gram-negativen Bakte- 40 Streptomyces flavogriseus NRRL 8139 und NRRL 8140 rien aktiv sind. Die Antibiotika werden durch Züchten von ergeben je die beiden Antibiotika 890A2 und 890As, die im

Streptomyces-Species auf geeigneten Fermentationsmedien wesentlichen reiner Form aus der Fermentationsbrühe isolierhergestellt. bar sind.

Die Feststellung der überraschenden antibiotischen Eigen- Die morphologischen und kulturellen Eigenschaften von Schäften von Penicillin hat ein grosses Interesse auf diesem 45 Streptomyces flavogriseus NRRL 8139 sind in der folgenden Gebiet stimuliert. Dadurch wurden viele andere wertvolle anti- Tabelle aufgeführt.

biotische Substanzen, wie andere Penicilline, Cephalosporine,

Streptomycin, Bacitracin, T etracycline, Chloramphenicol, Ary- Morphologie thromycine u.ä., gefunden. Die antibakterielle Aktivität jedes Die Sporenträger sind verzweigt, gerade bis gekrümmte dieser Antibiotika umfasst im allgemeinen nicht bestimmte kli- 50 Sporenketten, Büschelbildung. Die Ketten sind mehr als 10 nisch wichtige pathogene Bakterien. Beispielsweise sind einige Sporen lang. Die Sporen sind kugelförmig bis oval - 0,9 x 1,2 ji hauptsächlich gegenüber nur gram-positiven Bakterienarten (970 x ).

aktiv. Die durch die weitverbreitete Verwendung der vorhandenen Antibiotika bei der Behandlung von Bakterieninfektio- Kultureigenschaften nen auftretende Resistenz hat ein ernstes Resistenzproblem 55 Hafermehlagar Vegetatives Wachstum - umgekehrt -erzeugt. gelblich-dunkelgelb, pergamentartiges Wachstum; Luftmyze-

Die Nachteile der bekannten Antibiotika haben somit die lium - hellgrau gesäumt mit mittelgrau; lösliches Pigment -weitere Forschung nach der Suche anderer Antibiotika stimu- keins ;

liert, die gegenüber einem grossen Bereich von Pathogenen Czapek-Dox-Agar (Saccharose-Nitrat-Agar) Vegetatives wie auch gegenüber resistenten Stämmen besonderer Mikroor-60 Wachstum - umgekehrt - braun gesäumt mit dunkelbraun; ganismen aktiv sind. Luftmyzelium - mittelgrau, samtartig; lösliches Pigment -

Diese weitere Forschung hat zur Entwicklung der Familie geringes Braunwerden des Mediums ; der Thienamycin-Antibiotika geführt, zu der auch die erfin- Eialbuminagar Vegetatives Wachstum - umgekehrt -

dungsgemäss erhältlichen Verbindungen gehören. Anderer gelblich-dunkelgelb, braun gesäumt; Luftmyzelium - mittel-Mitglieder der Thienamycin-Familie der Antibiotika werden in 65 grau, vermischt mit gelblichgrau (2dc) und graubelb (2db); lösli-der DE-OS 25 52 638.9, in der DE-OS 26 52 677.2, in der DE-OS ches Pigment - hellgelblich-dunkelgelb;

26 52 681.8 und in der DE-OS 26 52 678.3 beschrieben. Glycerin-Asparagin-Agar Vegetatives Wachstum - umge-

Die neuen antibiotischen Verbindungen sind neue Mitglie- kehrt - gelblich-dunkelgelb, flach, sich ausbreitend; Luftmyze-

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lium - samtartig, hellgrau mit stark gelblicher Tönung bis grau (2dc); lösliches Pigment - keines;

Anorganische Salze-Stärke-Agar Vegetatives Wachstum

- umgekehrt - braun; Luftmyzelium - mittelgrau, samtartig; lösliches Pigment - hellgelblich-dunkelgelb;

Hefeextrakt-Dextrose + Salze-Agar Vegetatives Wachstum - umgekehrt - braungesäumt mit sehr dunklem Braun; Luftmyzelium - dunkelgrau, vermischt mit hellgrau, samtartig; lösliches Pigment - keins;

Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar Vegetatives Wachstum -umgekehrt - dunkelbraun; Luftmyzelium - dunkelgrau, samtartig; lösliches Pigment - keins;

Magermilchagar Vegetatives Wachstum - dunkelgelb; Luftmyzelium - spärlich, gräulich; lösliches Pigment - Hellbraunfärbung des Mediums; Hydrolyse des Caseins - gut;

Lackmusmilch Vegetatives Wachstum - mässiges Ringwachstum, stark dunkelgelb; Luftmyzelium - keins; Farbe -purpur; Koagulation und/oder Peptonisierung - vollständige Peptonisierung; Alkalischwerden, pH 8,2;

Magermilch Vegetatives Wachstum - mässiges Ringwachstum, dunkelgelb; Luftmyzelium - keins; lösliches Pigment

- dunkelgelb; Koagulation und/oder Peptonisierung - vollständige Peptonisierung; Alkalischwerden, pH 8,0;

Tyrosinagar Vegetatives Wachstum - umgekehrt - dunkelbraun; Luftmyzelium - dunkelgrau; lösliches Pigment - Hellbraunfärbung des Mediums; Zersetzung von Tyrosin - keine;

Pepton-Eisen-Hef eextrakt-Agar V egetatives W achstum -dunkelgelb; Luftmyzelium - spärlich, gräulich; lösliches Pigment - keins; Melanin - keins; H2S-Bildung - keine;

Nähragar Vegetatives Wachstum - umgekehrt - hellgräulich braungesäumt mit dunklerem Grau-Braun; Luftmyzelium -hellgrau mit dunkelgrau gesäumt; lösliches Pigment - keins;

Nährstärkeagar Vegetatives Wachstum - dunkelgelb, gesäumt mit Grau; Luftmyzelium - mittelgrau, gesäumt mit Dunkelgrau; lösliches Pigment - keins; Hydrolyse der Stärke -gut;

Nährgelatineagar Vegetatives Wachstum - farblos, gesäumt mit Dunkelgrau; Luftmyzelium - gräulich-weiss; lösliches Pigment - keins; Verflüssigung von Gelatine - gut;

Kartoffelpfropfen Vegetatives Wachstum - gutes Wachstum, stark gekräuselt; Luftmyzelium - grau bis gräulich-grau; lösliches Pigment - Hellbraunfärbung des Mediums;

Loefflers Blutserum Vegetatives Wachstum - cremefarben; Luftmyzelium - keins; lösliches Pigment - keins; Verflüssigung - keine;

Gelatinestiche bzw. -proben Vegetatives Wachstum -cremefarben; Luftmyzelium - keins; lösliches Pigment - keines; Verflüssigung von Gelatine - gut.

Alle die oben aufgeführten Ergebnisse werden nach dreiwöchiger Inkubation bei 28 °C erhalten, sofern nicht anders angegeben. Der pH-Wert der bei diesen Versuchen verwendeten Medien ist etwa neutral, nämlich pH 6,8 bis 7,2. Die Farbbezeichnungen, die in der Beschreibung verwendet werden, entsprechen den Definitionen von Color Harmony Manual, 4. Ed. (1958), Container Corporation of America, Chicago, Illinois.

Die Fähigkeit von Streptomyces flavogriseus NRRL 8139, verschiedene Kohlenhydrate zu verwenden oder zu assimilieren, wurde ebenfalls geprüft. Zu diesem Zweck wird der Mikroorganismus in einem synthetischen Grundmedium (Prid-ham und Gottlieb), das 1% Kohlenhydrate enthält, 3 Wochen bei 28 °C gezüchtet. Der pH-Wert der bei dieser Untersuchung verwendeten Medien ist ungefähr neutral (6,8 bis 7,2). In Tabelle I ist die Verwendung dieser Kohlenhydratquellen von Streptomyces flavogriseus NRRL 8139 aufgeführt. + bedeutet gutes Wachstum, ± bedeutet schlechtes Wachstum und -bedeutet kein Wachstum auf dem besonderen Kohlenhydrat.

Tabelle I

Glucose

+

Maltose

+

Arabinose

+

Mannit

+

Cellulose

-

Mannose

+

Fructose

+

Raffinose

-

Inosit

-

Rhamnose

+

Lactose

+

Saccharose

+

Xylose

+

Die Wachstumsmenge bei Temperaturänderungen und der Sauerstoffbedarf des Mikroorganismus ist wie folgt:

Temperaturbereich (Hefeextrakt-Dextrose + Salze Agar) 28 °C - gut

37 °C - gutes vegetatives Wachstum; keine Lufthyphen 1 50 °C - kein Wachstum; !

Sauerstoffbedarf (Stichkultur in Hefeextrakt-Dextrose + Salze Agar) aerob.

Die morphologischen und kulturellen Eigenschaften von Streptomyces flavogriseus NRRL 8140 werden in der folgen-20 den Tabelle aufgeführt.

Morphologie

Die Sporenträger sind verzweigt, gerade bis gekrümmte Sporenketten, die Büschel bilden. Die Ketten sind länger als 10 Sporen. Die Sporen sind kugelförmig bis oval - 0,9 x 1,2 jj. (970 x).

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Kultureigenschaften

Hafermehlagar Vegetatives Wachstum - umgekehrt -30 gelblichdunkelgelb, gesäumt mit Dunkelbraun; Luftmyzelium -hellgrau, gesäumt mit Mittelgrau; lösliches Pigment - keins;

Czapek-Dox-Agar (Saccharose-Nitrat-Agar) Vegetatives Wachstum - umgekehrt - braun, gesäumt mit Dunkelbraun; Luftmyzelium - mittelgrau, samtartig; lösliches Pigment -keins;

Eialbuminagar Vegetatives Wachstum - umgekehrt -gräulichdunkelgelb mit Teilen von stark Gelbdunkelgelb; Luftmyzelium - Teile von Mittelgrau, Gräulichweiss und Gelblichgrau (2dc); lösliches Pigment - sehr helles Dunkelgelb;

Glycerin-Asparaginagar Vegetatives Wachstum - gelblichdunkelgelb; Luftmyzelium - spärlich, gräulich; lösliches Pigment-keins;

Anorganische Salze-Stärkeagar Vegetatives Wachstum -umgekehrt - gräulichcreme; Luftmyzelium - mittelgrau, samtartig; lösliches Pigment - keins;

Hefeextrakt-Dextrose + Salze Agar Vegetatives Wachstum - umgekehrt - dunkelbraun; Luftmyzelium - dunkelgrau, gemischt mit einem hellen Grau, samtartig; lösliches Pigment -keines;

Hefeextrakt - Malzextrakt-Agar Vegetatives Wachstum - umgekehrt - dunkelbraun; Luftmyzelium - dunkelgrau, samtartig; lösliches Pigment - keins;

Pepton-Eisen-Hefeextrakt-Agar Vegetatives Wachstum -dunkelgelb; Luftmyzelium - keins; lösliches Pigment - keins; Melanin - keins; H2S-Bildung - keine;

Nähragar Vegetatives Wachstum - helles Dunkelgelb; Luftmyzelium - keins; lösliches Pigment - keins;

Nährstärkeagar Vegetatives Wachstum - cremefarben; Luftmyzelium - keins; lösliches Pigment - keins; Hydrolyse von 60 Stärke - gut;

Nährgelatineagar Vegetatives Wachstum - cremefarben; Luftmyzelium - keins; lösliches Pigment - keins; Verflüssigung von Gelatine - gut;

Gelatinestiche Vegetatives Wachstum - dunkelgelb; Luftmyzelium - keins; lösliches Pigment - keins; Verflüssigung von Gelatine - vollständig;

Magermilchagar Vegetatives Wachstum - dunkelgelb;

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Luftmyzelium - keins; lösliches Pigment - keins; Hydrolyse von Casein gut;

Lackmusmilch Vegetatives Wachstum - dunkelgelbes Ringwachstum; Luftmyzelium - keins; Farbe - bräunlich Purpur; Koagulation und/oder Peptonisierung - vollständige Peptonisierung, Alkalischwerden, pH 8,0;

Magermilch Vegetatives Wachstum - dunkelgelb, mässiges Ringwachstum; Luftmyzelium - keins; lösliches Pigment -hellbraun; Koagulation und/oder Peptonisierung - vollständige Peptonisierung, Alkalischwerden, pH 8,5;

Kartoffelpfropfen Vegetatives Wachstum - gut, dunkel-gelbfarben; Luftmyzelium - sehr spärlich, weisslich; lösliches Pigment - keins;

Loefflers Blutserum Vegetatives Wachstum - cremefarben; Luftmyzelium - keins; lösliches Pigment - keins; Verflüssigung - keine;

Tyrosinagar Vegetatives Wachstum - dunkelgelb; Luftmyzelium - keins; lösliches Pigment - Hellbraunfärbung des Mediums; Zersetzung von Tyrosin - sehr gering.

Alle obigen Bestimmungen bzw. Ablesungen erfolgten, sofern nicht anders angegeben, nach dreiwöchiger Inkubation bei 28 °C. Der pH-Wert der bei diesen Untersuchungen verwendeten Medien ist etwa neutral, nämlich pH 6,8 bis 7,2. Die bei der Beschreibung verwendeten Farbbezeichnungen stehen in Übereinstimmung mit den Definitionen von Color Harmony Manual, 4. Ed. ( 1958), Container Corporation of America, Chicago, Illinois.

Die Fähigkeit von Streptomyces flavogriseus NRRL 8140, verschiedene Kohlenhydrate zu verwenden oder zu assimilieren, wurde ebenfalls geprüft. Zu diesem Zweck wurde der Mikroorganismus auf einem synthetischen Grundmedium (Pridham und Gottlieb), das l°/o Kohlenhydrate enthält, 3 Wochen bei 28 °C gezüchtet. Der pH-Wert der bei diesem Versuch verwendeten Medien ist ungefähr neutral (6,8 bis 7,2). In Tabelle II ist die Verwendung dieser Kohlenhydratquellen von Streptomyces flavogriseus NRRL 8140 aufgeführt; + bedeutet gutes Wachstum; ± bedeutet schlechtes Wachstum; und -bedeutet kein Wachstum auf dem betreffenden Kohlenhydrat.

Tabelle II

Glucose

+

Maltose

+

Arabinose

+

Mannit

+

Cellulose

-

Mannose

+

Fructose

+

Raffinose

+

Inosit

±

Rhamnose

+

Lactose

+

Saccharose

+

Xylose

+

Die Menge des Wachstums mit der Temperaturänderung und der Sauerstoffbedarf des Mikroorganismus sind wie folgt: Temperaturbereich (Hefeextrakt-Dextrose + Salze Agar) 28 °C - gut

37 °C - mässiges vegetatives Wachstum; keine Lufthyphen 50 °C - kein Wchstum.

Sauerstoffbedarf (Stichkultur in Hefeextrakt-Dextrose + Salze Agar) aerob.

Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung der neuen Antibiotika ist nicht auf den Organismus Streptomyces flavogriseus oder auf Organismen, die die obigen Wachstumsund mikroskopischen Eigenschaften, die zur Erläuterung aufgeführt werden, vollständig erfüllen, beschränkt. Von der vorliegenden Erfindung sollen ebenfalls die Mutanten mitumfasst werden, die von den oben beschriebenen Organismen durch verschiedene Massnahmen, wie durch Röntgenbestrahlung, Ultraviolettbestrahlung, Sticl'stofflost, Phageneinwirkung und ähnliche Massnahmen, gebildet werden.

Die neuen Antibiotika, 890A2 und 890As, werden während der aeroben Fermentation bei kontrollierten Bedingungen geeigneter, wässriger Nährmedien, die mit Stämmen des Organismus Streptomyces flavogriseus inokuliert sind, gebildet. Für die Bildung von 890A2 und 890As sind wässrige Medien, wie sie für die Bildung anderer Antibiotika verwendet werden, geeignet. Solche Medien enthalten Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und von dem Mikroorganismus assimilierbare Salze.

Im allgemeinen können als Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff in den Nährmedium, entweder als Gemisch oder allein, Kohlenhydrate, wie Zucker, z.B. Dextrose, Glucose, Fructose, Maltose, Saccharose, Xylose, Mannit u.ä., und Stärken, wie Dextrin, oder Getreide, wie z.B. Hafer, Roggen, Maisstärke, Maismehl u.ä., verwendet werden. Die genaue Menge an in dem Medium verwendeter Kohlenhydratquelle oder -quellen hängt teilweise von den anderen Bestandteilen des Mediums ab; im allgemeinen wird die Menge an Kohlenhydraten zwischen etwa 1 und 6 Gew.-%, bezogen auf das Medium, variieren. Diese Kohlenstoffquellen können einzeln verwendet werden oder verschiedene solche Kohlenstoffquellen können in dem Medium vermischt werden. Im allgemeinen können viele pro-teinhaltige Materialien als Stickstoffquellen bei dem Fermentationsverfahren verwendet werden. Geeignete Stickstoffquellen umfassen z.B. Hefehydrolysate, primäre Hefe, Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Hydrolysate von Casein, Maiseinweichflüssigkeit bzw. Maiswasser, bei der Branntweinbrennerei anfallende lösliche Stoffe bzw. Schlempen oder Tomatenmark bzw. -paste u.ä. Stickstoffquellen, die entweder allein oder im Gemisch verwendet werden können, werden in Mengen im Bereich von etwa 0,2 bis 6 Gew.-%, bezogen auf das wässrige Medium, verwendet.

Unter den anorganischen Nährsalzen, die zu dem Kulturmedium zugegeben werden können, sind die üblichen Salze, die Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium-, Magnesium-, Phosphat-, Sulfat-, Chlorid-, Carbonat- und ähnliche Ionen ergeben. Weiterhin können Spurenmetalle, wie Kobalt, Mangan und Eisen, zugegeben werden.

Die in den Beispielen beschriebenen Medien sind nur Beispiele für eine grosse Vielzahl von Medien, die verwendet werden können.

Die Fermentation erfolgt zweckmässig bei Temperaturen im Bereich von 20 bis 37 °C. Für optimale Ergebnisse ist es bevorzugt, die Fermentation bei Temperaturen von 23 bis 28 °C durchzuführen. Der Anfangs-pH-Wert der Nährmedien, die zum Züchten von Stämmen von Streptomyces flavogriseus-Kulturen und zur Herstellung der Antibiotika 890A2 und 890A5 geeignet sind, kann von 6,0 bis 8,0 variieren.

Obgleich die neuen Antibiotika 890A2 und 890As sowohl als Oberflächen- als auch als submerse Kulturen hergestellt werden können, ist es bevorzugt, die Fermentation in submersem Zustand durchzuführen.

Die Fermentation des Antibiotikums in kleinem Massstab wird zweckdienlich ausgeführt, indem man ein geeignetes Nährmedium mit der das Antibiotikum ergebenden Kultur animpft und nach der Übertragung in ein Produktionsmedium die Fermentation bei konstanter Temperatur von etwa 28 °C auf einer Schüttelvorrichtung während mehrerer Tage ablaufen lässt.

Die Fermentation wird zweckmässig in einem sterilisierten Kolben des Nährmediums über eine oder mehrere Stufen der Keimentwicklung durchgeführt. Das Nährmedium für die Keimungsstufe kann irgendein geeignetes Gemisch von Kohlen-Stoff- und Stickstoffquellen sein. Der Impfkolben wird z.B. in einer Kammer mit konstanter Temperatur von etwa 28 °C einen Tag geschüttelt, bis das Wachstum zufriedenstellend ist, und ein Teil des entstehenden, gewachsenen Materials wird zum Inokulieren entweder eines Impfmediums der zweiten Stufe oder des Produktionsmediums verwendet. Impfkolben der Zwischenstufen werden bei ihrer Verwendung im wesentli-

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chen auf gleiche Weise entwickelt, d.h. ein Teil des Kolbeninhalts von der letzten Impfstufe wird zur Inokulierung des Produktionsmediums verwendet. Die inokulierten Kolben werden bei konstanter Temperatur mehrere Tage geschüttelt, und gegen Ende der Inkubationszeit wird der Kolbeninhalt zentrifu-giert oder filtriert.

Für das Arbeiten in grossem Massstab ist es bevorzugt, die Fermentation in geeigneten Tanks durchzuführen, die mit einer Rührvorrichtung und Einrichtungen zum Belüften des Fermentationsmediums ausgerüstet sind. Nach diesem Verfahren wird das Nährmedium in einem Tank hergestellt und durch Erhitzen bei Temperaturen bis zu etwa 120 °C sterilisiert. Nach dem Abkühlen wird das sterilisierte Medium mit dem zuvor gezüchteten Impfkeim der Züchtungskultur inokuliert, und die Fermentation kann während einer Zeit, wie z.B. 1 bis 6 Tage, unter Rühren und/oder Belüften des Nährmediums und Halten der Temperatur bei 24 bis 28 °C durchgeführt werden. Dieses Verfahren zur Herstellung der Antibiotika 890A2 und 890As ist besonders für die Herstellung von grossen Mengen der Antibiotika geeignet.

Physikalische und chemische Eigenschaften der Antibiotika 890A2 und 890As

Eigenschaften des Antibiotikums 890A2

Das Antibiotikum 890A2 ist eine saure Verbindung, die sich bei der Elektrophorese bei neutralem pH-Wert in Richtung auf den positiven Pol bewegt.

Das Natriumsalz des Antibiotikums 890A2 ist nach der Lyo-philisierung aus wässriger Lösung ein weisses Pulver und ist sehr gut in Wasser löslich.

Das Ultraviolettabsorptionsspektrum zeigt Maxima bei 308 und 228 nm und ein Minimum bei 262 nm. Der E%-Wert bei 308 nm des Natriumsalzes des Antibiotikums 890A2 in Wasser bei neutralem pH-Wert wird auf einen Wert geschätzt, der grösser ist als 490. Das Verhältnis der Absorptionswerte, A308/A260, beträgt 1,91 und A308/A228 beträgt 1,02 bei den besten erhaltenen Proben. Das Vorhandensein sehr geringer Verunreinigungen, die in diesen Proben verbleiben* legt den Schluss nahe,

dass diese Verhältnisse für eine Probe mit allerhöchster Reinheit etwas höher sind.

Mehr als 80% der Absorption bei 308 nm können durch Umsetzung mit Hydroxylamin eliminiert werden, und eine ähnliche Abnahme wird bei der Umsetzung mit Cystein beobachtet. Die Absorption bei 260 nm nimmt nach diesen Umsetzungen um etwa ein Viertel des Wertes der A308-Abnahme zu. Bei den Bedingungen, die in dem Teil beschrieben werden mit der Überschrift «Bioassay III» für die Bestimmung der HAEA308-Werte, scheint die Reaktionskinetik erster Ordnung zu sein mit einer Halbwertszeit bei Zimmertemperatur zwischen 0,5 und 1,5 Minuten.

In der folgenden Tabelle sind die 100 MHz-NMR-Signale für das 890A2-Natriumsalz in D2O, bezogen auf den Innenstandard, Natrium-2,2-dimethyl-2-silapentan-5-sulfonat, der im folgenden als DSS bezeichnet wird, angegeben. Die chemischen Verlagerungen sind in ppm und die Kupplungskonstanten in Hz aufgeführt; die offensichtlichen Mehrfachheiten sind angegeben.

1,33 (D, J=6, CHi-CH); 2,07 (S, CH3C=0); 3,15 (M, C-CH2-C); 3,69 (M, /CH-C=0); -4,3 ( >CHN und ^CH-OH), 6,09 und 7,12 Dubletts,J= 13,5, S-CH=CH-N).

Die antibiotische Potenz von 890A2, bestimmt in Vibrio per-colans ATCC 8461 gemäss dem Teil mit der Überschrift «Bioassay I», beträgt etwa 180 Einheiten/HAEA308-Einheit.

Eigenschaften des Antibiotikums 890As

Antibiotikum 890As ist eine saure Substanz, die sich bei der Elektrophorese bei neutralem pH-Wert in Richtung auf den positiven Pol bewegt.

■ 5 Nach dem Lyophilisieren aus wässriger Lösung ist das Natriumsalz ein weisses Pulver.

Das Ultraviolettabsorptionsspektrum zeigt Maxima bei 308,5 und 228 nm und ein Minimum bei 262 nm. Der E%-Wert bei 308,5 nm einer Lösung des Natriumsalzes des Antibioti-10 kums 890As in Wasser bei neutralem pH-Wert wird als 490 für eine reine Probe geschätzt. Das Verhältnis der Absorptionen A308/A260 beträgt 2,0 und das Verhältnis A308/A228 beträgt 1,03. Mehr als 90% der Absorption bei 308 nm können durch Umsetzung mit Hydroxylamin beseitigt werden, wobei man ein Pro-15 dukt mit erhöhter Absorption bei 260 nm erhält. Der Wert bzw. die Grösse der A26o-Erhöhung beträgt etwa ein Viertel der A308-Abnahme. Die Kinetik der A308-Abnahme bei den für die Bestimmung von HAEA308 beschriebenen Bedingungen scheint erster Ordnung zu sein mit einer Halbwertszeit bei Zimmer-20 temperatur zwischen 1 und 3 Minuten.

Das Zirkulardichroismusspektrum von 890As besitzt ein positives Maximum bei 304 nm mit einer spezifischen Elliptizität von 7189 Grad-ml/dm-g, einen Nullpunkt der Elliptizität bei 257,5 nm und ein negatives Minimum bei 220 nm mit einer spe-25 zifischen Elliptizität von -21 218 Grad-ml/dm-g. Bei der Berechnung dieser Werte wird die Konzentration an 890A5 aus der Adsorption bei 308 nm unter Verwendung eines E%-Werts von 490 bei dieser Wellenlänge geschätzt.

In der folgenden Tabelle sind die 100-MHz-NMR-Signale 3o für das 890As-Natriumsalz in D2O, bezogen auf den Innenstandard DSS, aufgeführt. Die chemischen Verlagerungen werden in ppm aufgeführt und die Kupplungskonstanzen in Hz; die offensichtlichen Mehrfachheiten werden ebenfalls aufgeführt.

1,29 (D, 1=6,2. CH3-CH); 2,05 (S, CH3C=0); 3,09 (entspre-35 chend D von D, C-CH2-C); 3,41 (D von D, J=5,0,3,0, ^CH-C=0); 4,16 (M, >CH-N und>CH-OH); 6,00 und 7,11 (Dubletts, J=13,8, S-CH=CH-N).

Die antibiotische Potenz von 890As, bestimmt an Vibrio percolans ATCC 8461, beträgt 12 Einheiten/HAEAsos-Einheit.

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Massenspektrumsanalyse von 890A2 und 890A5

Die Massenspektrumswerte für 890As werden an Trimethyl-silylderivaten, hergestellt aus Ammoniumsalzen des Antibiotikums mit bis-Trimethylsilyltrifluoracetamid in Dimethylform-45 amid, erhalten. Die Umwandlung des Natriumsalzes des Antibiotikums in die Ammoniumsalze wird unter Verwendung des Ammoniumsalzes eines sauren Ionenaustauschharzes durchgeführt.

Die Trimethyl-Silylierung von 890A2 und 890As ergibt drei 50 unterschiedliche Derivate: ein Di- und ein Tri-trimethylsilylderi-vat (Molekulargewicht 456 bzw. 528) und eine geringe Menge eines Tetra-trimethylsilylderivats eines hydrolysierten Produktes (Molekulargewicht 628), worin der ß-Lactamring geöffnet ist.

55 Die Werte der wichtigsten Massenspektrumsfragmente werden im folgenden aufgeführt:

Di-trimethylsilylderivat: 441,299,298 und 84; Tri-trimethylsilylderivat:513,371 und 156; Tetra-trimethylsilylderivat: (es wird nur ein Signal mit niedriger 60 Auflösung beobachtet) 618 und 603.

Es wird angenommen, dass die Antibiotika 890A2 und 890As Isomere mit folgender molekularer Struktur sind:

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6

ch3-ch(0h).

/

;-ch=ch-nh-§-

ch.

(I)

.N

Die Antibiotika 890A2 und 890A5 können weiterhin durch die folgenden antibiotischen Spektrumprofile charakterisiert werden.

Der Versuch zur Bestimmung des antibiotischen Spektrumsprofils des Antibiotikums 890A2 wird durchgeführt, indem man eine Papierscheibe mit einem Durchmesser von 0,63 cm mit einer Lösung des Antibiotikums 890A2 in 5%igem Methanol bei einer Konzentration von 5 ug/ml sättigt, die gesättigten Papierscheiben in der Luft trocknet und sie dann auf die Oberfläche von lOOx 15 mm Petrischalen gibt, die 5 ml angeimpften Nähragar plus 0,2% Hefeextrakt enthalten.

Der Versuch zur Bestimmung des antibiotischen Spektrumprofils des Antibiotikums 890As wird durchgeführt, indem man ein 0,015 ml Tröpfchen einer 33 jig/ml wässrigen Lösung des Antibiotikums auf die Oberfläche einer lOOx 15 mm Petrischale gibt, die 5 ml angeimpften Nähragar plus 0,2% Hefeextrakt enthält. Die Ergebnisse, ausgedrückt als Durchmesser in Millimeter der Hemmzone, sind in Tabelle III aufgeführt.

Die Spektren der Antibiotika 890A2 und 890As sind recht ähnlich, mit Ausnahme der Resistenz von 890As gegenüber der Inaktivierung durch Difco Penicillinase und durch Lacta-mase(n), gebildet von einem Cephalosporin C-resistenten Stamm von Vibrio percolans (MB-2566). Die Ergebnisse zeigen weiterhin, dass das Antibiotikum 890A2 wesentlich wirksamer ist als 890As.

Tabelle III

In vitro antibakterielles Spektrumprofil (ASP) der Antibiotika 890A2 und 890As

10

Organismus

Merck ATCC Hemmzone, 0, mm Nr. Nr. 890A=- 890As-5 |ig/ml 33 (ig/ml

Organismus

Merck ATCC Nr. Nr.

Hemmzone, 0, mm 890A2- 890As-5 |xg/ml 33 |xg/ml

Bacillus sp.

MB-633 -

40

18

Proteus vulgaris

MB-1012-

11

23

Pseudomonas

MB-979 -

0

0

aeruginosa

Serratia marcescens

990

23

29

Staphylococcus aureus

6538 P

34

34

Bacillus subtilis

6633

42

27

Sarcina lutea

9341

42

40

Staphylococcus aureus

MB-698 -

30

35

Streptococcus faecalis

MB-753 -

12

0

Alcaligenes faecalis

213

34

25

Brucella bronchiseptica

4617

29

22

Salmonella gallinarum

MB-1287 -

33

26

Vibrio percolans

8461

31

32

Xanthomonas

MB-815 -

29

20

vesicatoria

Proteus vulgaris

21100

30

27

Escherichia coli

MB-1418-

32

27

Pseudomas stutzeri

11607

19

14

Klebsiella pneumoniae

MB-1264-

31

27

Aerobacter aerogenes

MB-835 -

27

24

Erwinia atroseptica

4466

26

21

Pseudomonas

MB-2824 -

13

0

aeruginosa

Corynebacterium

9742

35

33

pseudodiph.

Escherichia coli 15 Streptococcus faecium Streptococcus agalactiae Vibrio percolans résistant gegenüber 20 Ceph. C Proteus vulgaris (Episom)a Proteus mirabilis Staphylococcus aureus 25 (resistent gegenüber Methicillin)

Vibrio percolans +2x 105 Einheiten/ml Penicillinase 30 Vibrio percolans + Aerobacter lactamase

9637 MB-2820 -MB-2875 -

MB-2566 -

MB-2112-

MB-3126-MB-2949 -

MB-1272 -

MB-1272 -

29 22 32

11

33

22 11

31

24 0 27

35

23

20 15

40

36

a Dieses Episom zeigt Resistenz gegenüber Tetracyclin, Chlor-35 amphenicol, Kanamycin und Streptomycin bei einer Konzentration von 20 jig/ml und gegenüber Neomycin bei einer Konzentration von 25 (ig/ml und Sulfa-Arzneimitteln.

Das Antibiotikum 890A2 zeigt In-vivo-Aktivität gegenüber 40 gram-negativen und gram-positiven Organismen und ist somit zur Kontrolle von Bakterieninfektionen bei Tieren und Menschen geeignet. Bei der Bestimmung der In-vivo-Aktivität wird das Antibiotikum 890A2 in 0,15 Mol NaCl, 0,01 Mol Natriumphosphat, pH 7,0, gelöst und mit Wasser verdünnt, wobei man 45 fünf vierfache Konzentrationen des Arzneimittels für die Prüfung erhält. Weibliche weisse Schweizer Mäuse, die durchschnittlich 21g wiegen, werden intraperitoneal mit den in einer Brühe suspendierten Testorganismen infiziert. Die Anzahl der injizierten Organismen wird nach Standardplatten-Zählverfah-50 ren bestimmt. Zum Zeitpunkt der Infizierung und erneut 6 Stunden später wird eine bestimmte Zahl der Mäuse intraperitoneal mit dem Antibiotikum behandelt. Fünf Mäuse werden jeweils für jede Konzentration des zu prüfenden Arzneimittels verwendet. Weitere zwei, nichtinfizierte Mäuse werden mit dem 55 Antibiotikum behandelt, um zu bestimmen, ob die injizierte Menge des Mittels toxisch ist. Bei jedem Versuch werden weiterhin Kontrollen von fünf Mäusen für jede der verschiedenen Verdünnungen der Infektionskulturen verwendet, damit man die Anzahl der Organismen berechnen kann, die für 50% der 60 infizierten, nichtbehandelten Mäuse letal ist (LD50). Diese Berechnung erfolgt unter Verwendung der Überlebenswerte am 7. Tag nach der Infektion. Zu diesem Zeitpunkt wird weiterhin die Menge an Arzneimittel berechnet, die 50% der infizierten Mäuse schützt (ED50).

65 Alle Tiere, die diesem Immunitätstest unterworfen und nicht mit dem Antibiotikum behandelt wurden, starben innerhalb von 48 Stunden nach der Infektion. Die Wirksamkeit des Antibiotikums 890A2 mit einer Potenz von 59 Einheiten/ml

gegenüber Salmonella schottmuellari MB-2837 wird im folgenden aufgeführt.

Einheiten/mla Art der Verabreichung EDsoX 2 Dosiseinheiten 59 ip 19

a 1 Einheit/ml wird bei dem Absatz mit der Überschrift «Bioassay I» definiert.

Die Antibiotika 890A2 und 890A5 sind für eine Vielzahl von gram-positiven und gram-negativen Bakterien wertvolle Antibiotika und können somit in der Human- und Veterinärmedizin Verwendung finden. Die beschriebenen Verbindungen können allein oder zusammen im Gemisch als antibakterielle Arzneimittel zur Behandlung von Infektionen verwendet werden, die durch gram-positive oder gram-negative Bakterien hervorgerufen werden, z.B. zur Behandlung von Staphylococcus aureus, Proteus mirabilis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae und Salmonella schottmuellari. Die beschriebenen antibakteriellen Verbindungen können weiterhin als Zusatzstoffe für Tierfutterstoffe, zur Konservierung von Nahrungsmitteln und als Desinfektionsmittel verwendet werden. Sie können z.B. in wässrigen Zubereitungen in Konzentrationen im Bereich von 0,1 bis 100 Teilen Antibiotikum/Million Teile Lösung oder bevorzugt in Konzentrationen im Bereich von 1 bis 10 Teilen Antibiotikum/ Million Teile Lösung für die Zerstörung und Hemmung des Wachstums von schädlichen Bakterien auf medizinischen und zahnmedizinischen Geräten und als Bakterizide bei industriellen Anwendungen, z.B. in Anstrichmitteln auf Wassergrundlage und in dem Weisswasser von Papiermühlen, zur Hemmung des Wachstums schädlicher Bakterien verwendet werden.

Die beschriebenen Antibiotika können in irgendeiner der vielen pharmazeutischen Zubereitungen als einziger aktiver Bestandteil oder zusammen mit entweder einem oder mehreren anderen Antibiotika oder mit einer oder mehreren pharmakologisch aktiven Substanzen verwendet werden. Als Beispiel für die erstere kann man ein Aminocyclit-Antibiotikum, wie Gentamicin, gleichzeitig mitverabreichen, so dass irgendwelche Chancen, dass resistente Organismen hervorkommen, minimal gehalten werden. Als Beispiel der letzteren können Diphenoxylate und Atropin in Dosiseinheitsformen, die für die Therapie der Gastroenteritis bestimmt sind, kombiniert werden. Die Antibiotika können in Kapselform oder als Tabletten, Pulver oder flüssige Lösungen oder als Suspensionen oder Elixiere verabreicht werden. Sie können oral, topisch, intravenös oder intramuskulär verabreicht werden. Weiterhin können die Antibiotika 890A2 und 890As miteinander kombiniert verwendet werden.

Tabletten und Kapseln für die orale Verabreichung können in Dosiseinheitsformen vorliegen, und sie können übliche Arzneimittelzusatzstoffe und -trägerstoffe, wie Bindemittel, z.B. Sirup, Acacia, Gelatine, Sorbit, Tragant oder Polyvinylpyrroli-don; Füllstoffe, z.B. Lactose, Zucker, Maisstärke, Calciumphos-phat, Sorbit oder Glycin; Schmiermittel, z.B. Magnesiumstea-rat, Talk, Polyäthylenglykol, Siliciumdioxid; Desintegrationsmittel, z.B. Kartoffelstärke, oder annehmbare Benetzungsmittel, wie Natriumlaurylsulfat, enthalten. Die Tabletten können nach an sich bekannten Verfahren überzogen werden. Orale, flüssige Zubereitungen können in Form wässriger oder öliger Suspensionen, Lösungen, Emulsionen, Sirupen, Elixieren usw. vorliegen, oder sie können als Trockenprodukt für die Rekon-stitution mit Wasser oder einem anderen geeigneten Träger vor der Verwendung vorliegen. Solche flüssigen Zubereitungen können übliche Zusatzstoffe, wie Suspensionsmittel, z.B. Sorbitsirup, Methylcellulose, Glucose/Zuckersirup, Gelatine, Hydro-xyäthylcellulose, Carboxymethylcellulose, Aluminiumstearat-gel oder hydrierte geniessbare Fette; Emulgiermittel, z.B. Leci-

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thin, Sorbitan-monooleat oder Acacia enthalten. Nichtwässrige Trägerstoffe umfassen geniessbare Öle, z.B. Mandelöl, fraktioniertes Cocosnussöl, ölige Ester, Propylenglykol oder Äthylalkohol; Konservierungsmittel, z.B. Methyl- oder Propyl-p-hydro-xybenzoate oder Sorbinsäure. Suppositorien werden übliche Suppositorien-Grundstoffe, z.B. Kakaobutter oder andere Gly-ceride, enthalten.

Zubereitungen für die Injektion können in Dosiseinheitsform in Ampullen oder in Behältern mit mehreren Dosen mit einem zugegebenen Konservierungsmittel vorhanden sein. Die Zubereitungen können in Form von Suspensionen, Lösungen, Emulsionen in öligen oder wässrigen Trägern vorliegen, und sie können weiterhin Hilfsstoffe für die Zubereitung, wie Suspensionsmittel, Stabilisatoren und/oder Dispersionsmittel, enthalten. Alternativ kann der aktive Bestandteil in Pulverform für die Rekonstitution mit einem geeigneten Träger, z.B. sterilem, pyrogenfreiem Wasser, vor der Verwendung vorliegen.

Die Zubereitungen können ebenfalls in für die Absorption durch die Schleimmembranen der Nase und des Rachens oder der Bronchialgewebe geeigneter Form vorliegen, und zweckdienlich liegen sie als Pulver, flüssige Sprays oder Inhalationsmittel, Lutschbonbons, Einpinselungsmittel für den Hals usw. vor. Für die Medikation der Augen oder Ohren können die Zubereitungen als einzelne Kapseln, in flüssiger oder semifester Form, vorliegen oder sie können als Tropfen usw. verwendet werden. Zubereitungen für die topische Anwendung können in hydrophoben oder hydrophilen Grundstoffen als Salben, Cremes, Lotionen, Einpinselungsmittel, Pulver usw. vorliegen.

Zusätzlich zu dem Träger können die Zubereitungen andere Bestandteile enthalten, wie Stabilisatoren, Bindemittel, Antioxydantien, Konservierungsmittel, Schmiermittel, Suspensionsmittel, Viskositätsmittel oder Geschmacks- bzw. Aromamittel u.ä.

In der Veterinärmedizin, wie bei der Behandlung von Hühnern, Kühen, Schafen, Schweinen u.ä., können die Zubereitungen z.B. als intramammare Zubereitung, entweder als Depotformen oder als schnellwirkende Formen, zubereitet werden.

Die zu verabreichende Dosis hängt in starkem Ausmass von dem Zustand des zu behandelnden Subjekts, dem Gewicht des Wirts und der Art der Infektion, dem Weg und der Häufigkeit der Verabreichung ab. Die parenterale Verabreichung ist im allgemeinen bei generalisierten Infektionen bevorzugt, und die orale Verabreichung ist bei intestinalen Infektionen bevorzugt.

Bei der Behandlung von Bakterieninfektionen bei Lebewesen können die beschriebenen Verbindungen oral oder parenteral nach den für die antibiotische Verabreichung üblichen Verfahren in einer Menge von 2 bis 600 mg/kg/Tag und bevorzugt von 5 bis 100 mg/kg/Tag in einer bevorzugt geteilten Dosis, z.B. 3 bis 4 Mal am Tag, verabreicht werden. Sie können in Dosiseinheiten verabreicht werden, die z.B. 100,330,400 oder 1000 mg aktiven Bestandteil zusammen mit physiologisch annehmbaren Trägern oder Verdünnungsmitteln enthalten. Die Dosiseinheiten liegen z.B. in Form flüssiger Zubereitungen, wie Lösungen oder Suspensionen, oder als Feststoffe in Tabletten oder Kapseln vor. Die optimale Dosis wird bei einem gegebenen Fall von der Art und Stärke der zu behandelnden Infektion abhängen. Kleinere Dosen werden im allgemeinen bei Kindern verwendet, und alle Einstellungen können leicht durch den Fachmann erfolgen.

Das erfindungsgemässe Verfahren umfasst auch die Herstellung der nichttoxischen, pharmazeutisch annehmbaren Salze von 890A2 und 890As, z.B. die pharmakologisch annehmbaren Salze, die mit anorganischen und organischen Basen gebildet werden, die z.B. umfassen: die Metallsalze, die sich von Alkalimetall- oder Erdalkalimethyllhydroxiden, -carbonaten oder -bicarbonaten ableiten, wie solche, die sich von Natrium, Kalium, Ammonium und Calcium ableiten, und Salze, die sich

7

- 5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

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8

von primären, sekundären oder tertiären Aminen ableiten, wie Die an 890A2 reichen Fraktionen und die an 890As reichen Monoalkylamine, Dialkylamine, Trialkylamine, niedrig-Alkanol- Fraktionen werden vereinigt. Diese vereinigten Fraktionen amine, Di-niedrig-alkanolamine, niedrig-Alkylendiamine, werden weiter gereinigt.

N,N-DiaralkyI-niedrig-alkylendiamine, Aralkylamine, aminosub- Ein Verfahren zur Herstellung von weiter gereinigten Anti-stituierte niedrig-Alkanole, N,N-Di-niedrig-alkylamino-subst- 5 biotika 890Az und 890As ist die Verwendung der Gelfiltration niedrig-alkanole, Amino-, Polyamino- und Guanidino-subst.- mit Polyacrylamidgel mit einer Porengrösse, die Moleküle mit niedrig-Alkansäuren und Stickstoff enthaltende heterocycli- einem Molekulargewicht über 1800 ausschliesst, wie «Bio-Gel» sehe Amine. Beispiele von Salzen sind auch Salze, die sich von P-2 (hergestellt von Bio Rad, Richmond, California). Andere Natriumhydroxid, Ammoniumhydroxid, Natriumcarbonat, Gele, wie «Sephadex» G-10, können ebenfalls für die Entsal-Natriumbicarbonat, Kaliumcarbonat, Kaliumhydroxid, Calci- 10 zung verwendet werden.

umearbonat, Trimethylamin, Triäthylamin, Piperidin, N-Äthyl- Das bevorzugte Verfahren, gemäss dem die Antibiotika piperidin, Morpholin, Chinin, Lysin, Protamin, Arginin, Procain, 890A2 und 890As in hoher Reinheit aus einer Brühe gewonnen Äthanolamin, Morphin, Benzylamin, Äthylendiamin, N,N'- werden können, besteht in einem Zentrifugieren oder Filtrieren

Dibenzyläthylendiamin, Diäthanolamin, Piperazin, Dimethyl- der Brühe zur Entfernung der Feststoffe, einer Adsorption und aminoäthanol, 2-Amino-2-methyl-l-propanol, Theophyllin, >5 Elution des Filtrats aus einem Anionenaustauschharz, wie N-Methylglucamin und ähnlichen Verbindungen ableiten. «Dowex»-1 x2 im Chloridzyklus mit 3%iger NaCl in 50%igem

Die Salze der beschriebenen Verbindungen können nach an (VoL/Vol.) wässrigem Methanol, wodurch die Antibiotika sich bekannten Verfahren hergestellt werden. Beispielsweise sowohl konzentriert als auch teilweise gereinigt werden, einem können die Monosalze, wie das Mononatriumsalz, durch Durchgang über eine Säule mit geeignet hergestelltem XAD-2,

Behandlung von 1 Äquiv. Natriumhydroxid mit 1 Äquiv. des 2» das die Antibiotika zurückhält und dadurch das «Dowex»-l x 2-Produktes (I) in einem geeigneten Lösungsmittel hergestellt Eluat reinigt und entsalzt. Ausserdem wird das Antibiotikum werden. Man kann auch gemischte Salze mit zweiwertigen 890As stärker zurückgehalten als das Antibiotikum 890A2, und Kationen herstellen, indem man 1 Mol der zweiwertigen Base dadurch werden die beiden Antibiotika teilweise getrennt. Die mit 1 Mol des Produktes (I) plus 1 Äquiv. einer anderen Säure mit 890A2 und 890As angereicherten Fraktionen werden ver-vermischt. Alternativ kann man Salze durch Behandlung von 1 25 einigt und weiter gereinigt. Die Chromatographie an einem Äquiv. einer Base mit einem zweiwertigen Kation, wie Calci- «Dowex»-l x 2 minus 400 mesh-Harz (kleiner als 0,037 mm) umhydroxid, mit 1 Äquiv. des Produktes (I) herstellen. Die Salze unter Eluierung mit NaCl und/oder NH-tCl in 50%igem wässri-sind pharmakologisch annehmbare, nichttoxische Derivate, die gern Methanol ergibt ein Produkt, das von UV-absorbierenden als aktiver Bestandteil in geeigneten pharmazeutischen Ein- Verunreinigungen fast frei ist (das NH4CI wird verwendet, heitsdosisformen verwendet werden können. Sie können wei- 30 damit man in dem Eluierungsmittel eine gewisse Pufferkapazi-terhin mit anderen Arzneimitteln zur Herstellung von Zuberei- tat erhält). Die Entsalzung an «Bio-Gel» P-2 oder «Sephadex» tungen kombiniert werden, die ein breites Aktivitätsspektrum G-10 entfernt die Hauptmenge des bei der «Dowex»-!x2-Chro-besitzen. matographie eingeführten Salzes.

Die Fermentationsbrühen, die die Antibiotika 890A2 und Werden Brühen mit niedriger Potenz nach dem obigen Ver-

890A5, die nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellt 35 fahren behandelt, so kann das Endprodukt wesentliche Mengen wurden, enthalten, besitzen Aktivitäten im Bereich von etwa 2 (mehr als 50%) restlicher Verunreinigungen enthalten. Diese bis 170 Einheiten/ml, bestimmt nach dem Scheiben-Diffusions- Verunreinigungen können durch einen zusätzlichen Zyklus der assay unter Verwendung von Vibrio percolans (ATCC 8461). Chromatographie an «Dowex»-l x 2, minus 400 mesh (kleiner Die in diesen Fermentationsbrühen enthaltenen Antibiotika als 0,037 mm), unter Elution mit einer Natriumchlorid und 890A2 und 890As können nach einer Reihe von Verfahren iso- 40 50%iges Isopropanol enthaltenden Lösung entfernt werden. Es liert und gereinigt werden. Bei einem dieser Verfahren werden ist weiterhin bei der Isolierung der Antibiotika aus Brühen mit die Antibiotika 890A2 und 890As an stark basischem Anionen- niedriger Potenz empfehlenswert, eine zweite XAD-2-Chroma-austauschharz adsorbiert. Beispiele solcher stark basischen tographiestufe durchzuführen. Dies ermöglicht eine weitere Anionenaustauschharze sind solche mit einer Styrol-Divinyl- Reinigung, die Entfernung von restlichem Salz und eine teil-benzol-Matrix, z.B. quaternäres Ammoniumharz «Dowex» 1 x 2 45 weise Abspaltung der Antibiotika 890A2 von 890A5. Genauer, mit Polystyrolkern (hergestellt von Dow Chemical Co., Mid- wird das 890As später als das 890A2 eluiert, und die beiden kön-land, Michigan) beim Chloridzyklus. Andere Beisiele dieser nen durch ihre unterschiedlichen Bioaktivitätsverhältnisse Klasse von stark basischen Austauschharzen sind die folgen- gegenüber HAEA 308 unterschieden werden. Solche Fraktio-den: «Duolite» A-40, A-42, A-101, A-102 und A-l 14 (hergestellt nen, die ein Bioaktivitätsverhältnis an Vibrio percolans ATCC von Chemical Process Co., Redwood City, California); und 50 8461 zu HAEA308 von 180 Bioaktivitätseinheiten/HAEA3os-Ein-«Amberlite» IRA-400, IRA-401 und IRA-410. Alternativ kann heit zeigen, enthalten das Antibiotikum 890A2, und solche Frak-ein schwach basisches Anionenaustauschharz, wie «Amber- tionen, die ein Bioaktivitätsverhältnis an Vibrio percolans lite» IRA-68, verwendet werden («Amberlite»-Harze werden ATCC 8461 zu HAEA308 von 12 Bioaktivitätseinheiten/ von Rohm and Haas, Washington Square, Philadelphia 5, Penn- HAEAsos-Einheit zeigen, enthalten das Antibiotikum 890As. sylvania hergestellt). 55 Bei der Reinigung durch Säulenromatographie werden im

Das adsorbierte Antibiotikum wird leicht aus dem Anionen- allgemeinen für die weitere Reinigung nur solche Fraktionen austauschharz mit Salzlösungen in 50%igem (VoL/Vol.) wässri- des eluierten Volumens vereinigt, die das Antibiotikum in min-gem Methanol eluiert. Das so erhaltene Eluat kann gegebenen- destens 30%iger Reinheit wie die reinste Fraktion enthalten, falls nach anderen Reinigungsverfahren weiter gereinigt wer- Die Kriterien für die Reinheit sind die Verhältnisse der Bioakti-den. Das Eluat kann gereinigt werden, indem man es konzen- 60 vität/A22o, A308/A260 und HAEA308/A220, und bei dem Entsal-triert und durch eine mit Acrylesterpolymer gepackte Säule zungsverfahren die Leitfähigkeit. Bei j eder Chromatographie-mit Zwischenpolarität, wie XAD-7 oder 8, leitet oder indem stufe werden A220, A260, Asos und die Bioaktivität geeigneter man es durch eine Säule leitet, die mit einem Polystyrol, einem Fraktionen gemessen. Sofern möglich, wird HAEA308 ebenfalls nichtpolaren, hydrophoben, vernetzten Divinylbenzol-Polyme- gemessen, und beim Entsalzen werden die Leitfähigkeiten ren, wie XAD-1,2 und 4, bevorzugt XAD-2, gepackt ist. 65 gemessen. Die Kriterien für die Entscheidung, welche Fraktio-

(XAD-1,2,4,7 und 8 werden von Rohm and Haas, Philadelphia, nen für die nachfolgenden Verfahrensstufen vereinigt werden, Pennsylvania, hergestellt.) Bei diesem Verfahren werden die können, damit man eine höhere Ausbeute erhält, auf Kosten Antibiotika 890A2 und 890As teilweise gespalten bzw. getrennt, der Reinheit etwas eingestellt werden; umgekehrt kann man

I

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eine höhere Reinheit auf Kosten der Ausbeute erzielen.

Bei Versuchen im Labormassstab (weniger als 201 Probenvolumen) werden alle Chromatographiestufen, mit Ausnahme der XAD-2-Chromatographie, in einem Kühlraum bei 2 bis 5 °C durchgeführt. Die XAD-2-Chromatographie wird bei Zimmertemperatur, sofern nicht anders angegeben, durchgeführt. Der pH-Wert der antibiotischen Lösungen, die gelagert werden, wird durch sorgfältige Zugabe von verdünnten NaOH- oder HCl-Lösungen auf 7 bis 8 eingestellt. Die wässrigen Lösungen werden in einem Kühlschrank, oder bevorzugt in Eis-Wasser,

aufbewahrt. 50%ige Methanollösungen werden bei -20 °C aufbewahrt.

Bei den Reinigungsstufen vor der XAD-2-Chromatographie werden die Lösungen im allgemeinen auf 25 jiMol in EDTA 5 durch Zugabe von '/iooostel Volumen einer Lösung aus 0,1 Mol Na2 EDTA, die durch Zugabe von Natriumhydroxid auf einen pH-Wert von 7,0 neutralisiert wurde (0,1 Mol «neutrales EDTA»), eingestellt.

In den Fig. 1 und 2 ist ein Fliessschema des Reinigungsver-io fahrens bei der Herstellung der Antibiotika 890A2 und 890As dargestellt.

Figur 1

Schematische Darstellung des Reinigungsverfahrens für das Antibiotikum 890A2

890A2 und 890Ae enthaltende fermentierte Brühe

Abkühlen

Zentrifugieren EDTA-Zugabe

->

Zentrifugieren der Brühe

XAD-2 Eluat t

Alternativer Weg

Ui

Konzentrieren Adsorbieren an XAD

(1^Absorbieren anl,Dowex-1x2 (Cl") * (50-100 mesh) (2; Waschen mit 5% NaCl + 0,01M Tris-HCl +25^uM

il)

EDTA

Waschen mit Wasser

Eluieren mit 3% NaCl + 0,01M Tris-HCl, pH + 25yuM neutralem EDTA in 50 # Methanol v

2 CJowexM

(3) Eluieren mit h2o x 2

(50-100 mesh) 50 % MeOH Eluat

Konzentrieren Adsorbieren an XAD -2

Eluieren mit h2o

(1) Konzentration der Fraktionen,

Zweites XAD-2 Eluat

M

g)

(4)

(5)

die 890Ap enthalten Verdünnen mit MeOH Adsorbieren an "Dowex?-1x4 (Cl" (minus 400 mesh)

Waschen mit 0,07M NaCl* + 0,005M NH.C1 Eluieren mit 0,08M NaCl + 0,005M NHy.Cl + 0,0001 M NH, in 50 % Metnanol

890Ac enthaltende Fraktionen werden gesammelt und entsprechend Fig. 2 gereinigt

V

Fortsetzung Fig. 1

Konzentrieren Adsorbieren an

-~1Q— Eluieren mit 50 % Methanol + 0,02mM NHj:

'Dowex?-1 x 4 50 % MeOH Eluat

8)

Alternativer Weg

Verdünnen mit HpO Adsorbieren an _ Dowex-1 x 2 (Cl~)

(mimia. 40Q_niesh)

(3) Eluieren mit 0,07M NaCl + 0,005 M NH^Cl + 0,0001M NHZ in 50 %

&

Konzentrieren

Lyophilisieren

890A2><-

(1) Konzentrieren

(2) Lyophilisieren

"Dowex-1 x 2 (- 400 mesh) Eluat

üi

(3)

Konzentrieren Adsorbieren an 'Sephadex11 G-10 Eluieren mit 0,02mM NH, in 50 % Methanol

Bemerkungen zu Fig. 1 und 2:

50 mesh « 0,297 mm Öffnungen 100 mesh » 0,149 mm Öffnungen 400 mesh » 0,037 mm Öffnungen

Figur 2

Darstellung des Reinigungsverfahrens für das Antibiotikum 890A^

13

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Bestimmungsverfahren für die Antibiotika 890A2 und 890As I. Bioassay (Bioversuch)

Ein Agarplatten-Scheiben-Diffusionsverfahren wird entweder unter Verwendung von Vibrio percolans ATCC 8461 oder von Salmonella gallinarum MB-1287 als Testorganismen verwendet. Eine gereinigte Probe des Antibiotikums 890Ai wird als Standard verwendet. Das Antibiotikum 890Ai wird gemäss dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren hergestellt.

Vibrio percolans ATCC 8461 enthaltende Platten werden folgendermassen hergestellt.

Eine lyophilisierte Kultur von Vibrio percolans ATCC 8461 wird in 15 ml sterilisiertem Medium suspendiert, das 8 g/1 Difco-Nährbrühe und 2 g/1 Hefeextrakt in destilliertem Wasser enthält («Nährbrühe-Hefeextrakt», im folgenden als NBYE bezeichnet). Die Kultur wird über Nacht auf einer Rotations-schüttelvorrichtung bei 28 °C inkubiert. Diese Kultur wird dann zum Inokulieren der Oberflächen von Schrägkulturen, die 1,5% Agar in NBYE enthalten, verwendet. Die inokulierten Schrägkulturen werden über Nacht bei 28 °C inkubiert und dann in einem Kühlschrank gelagert.

Die gekühlten Schrägkulturen, die aus einer einzigen, lyophilisierten Kultur hergestellt werden, werden bis zu 4 Wochen von ihrer Herstellung folgendermassen verwendet: Eine Schleife des Inokulums aus der Schrägkultur wird in 50 ml NBYE, das in einem 250-ml-Erlenmeyerkolben enthalten ist, dispergiert. Die Kultur wird über Nacht auf einer Rotations-schüttelvorrichtung bei 28 °C inkubiert. Sie wird dann auf eine Diche, die eine 50%ige Durchlässigkeit bei 660 nm ergibt, verdünnt. Ein 33,2 ml Teil der verdünnten Kultur wird zu 11 NBYE, das 15 g Agar enthält, zugegeben und bei 46 °C gehalten. Das inokulierte, Agar enthaltende Medium wird in lOOx 15 mm Kunststoff-Petrischalen gegossen, jeweils 5 ml/Schale, anschliessend wird abgekühlt und vor der Verwendung lagert man bei 2 bis 4 °C bis zu 5 Tagen.

Salmonella gallinarum MB-1287 enthaltende Platten werden folgendermassen hergestellt.

Ein verschlossenes Rohr, das Salmonella gallinarum MB-1287-Zellen in Magermilch enthält, das unter Vakuum gefroren, lyophilisiert und verschlossen wurde, wird geöffnet und zum Inokulieren von 15 ml Gehirn-Herz-Infusionsbrühe verwendet. Die Zellen können ohne Schütteln bei 37 °C über Nacht wachsen und diese Kultur wird dann zum Inokulieren von Schrägkulturen von 0,8% BBL-Nährbrühe + 0,2% «Difco»-Hefeextrakt + 1,5% Agar verwendet. Nach dem Wachsen über Nacht bei 37 °C wird eine Schlinge der Kultur von der Schrägkultur in einen Kolben übertragen, der 50 ml 0,8%ige Nährbrühe + 0,2% Hefeextrakt enthält. Der Kolben wird über Nacht geschüttelt und 20 ml dieser Kultur werden zum Inokulieren in 11 eines Gemisches aus 0,8% Nährbrühe + 0,2% Hefeextrakt + 1,5% Agar verwendet, das zuvor sterilisiert und auf 48 °C abgekühlt wurde. Der inokulierte NBYE-Agar wird sofort in lOOx 15 mm Kunststoff-Petrischalen gegeben, 5 ml/Schale, und die Platten werden dann bei 2 bis 4 °C bis zur Verwendung aufbewahrt.

Filterpapierscheiben mit einem Durchmesser von 1,27 cm werden in die zu prüfende Lösung eingetaucht und dann auf das Agar gelegt. Alternativ können die Scheiben durch Auftragen mit der Pipette von Vio ml Lösung auf eine trockene Scheibe beladen werden, und dann können die Scheiben auf den Agar gesetzt werden. Der Durchmesser der Hemmzone wird nach der geeigneten Inkubation (9 bis 18 h bei 37 °C für Salmonella gallinarum MB-1287 oder 12 bis 24 h bei 25 °C für Vibrio percolans ATCC 8461) bestimmt. Gegebenenfalls werden Verdünnungen der zu prüfenden Lösungen in 0,05 Mol Kaliumphosphatpuffer, pH 7,4 («Kaliumphosphatpuffer», der im folgenden als KPB bezeichnet wird) oder in entionisiertem Wasser hergestellt.

Die Berechnungen der Potenz (Wirksamkeit) erfolgt folgendermassen: Die Steigung wird bestimmt, indem man die

Durchmesser der Zone einer Lösung des Antibiotikums 890A2 oder 890A5 bestimmt und dann die vierfache Verdünnung (in KPB) dieser Lösung. Zwei Scheiben von jeder Konzentration werden auf einer einzelnen Platte geprüft, und dann wird die 5 durchschnittliche Zonengrösse bei jeder Konzentration bestimmt. Die Steigung entspricht der Hälfte des Unterschieds der durchschnittlichen Zonengrössen. Die Wirksamkeiten werden dann nach der Formel berechnet:

io Potenz (Einheiten/ml) = ^ Ds]log2

Steigung

(Potenz des Standards) x Verdünnung x 10

wobei D der durchschnittliche Durchmesser der Zonen bedeu-15 tet, die von der unbekannten Verbindung gebildet werden, Ds der durchschnittliche Durchmesser der Standardzonen bedeutet, und «Verdünnung» den Wert bedeutet, auf den die unbekannte Probe vor dem Versuch verdünnt wurde. Wird kein Standard verwendet, wird angenommen, dass Ds 25 mm beträgt 20 und die (Potenz des Standards) wird als 1 Einheit/ml angenommen, bestimmt an Vibrio percolans ATCC 8461. Reines 890Ai wird so definiert, dass es eine Potenz von 250 Einheiten/hydro-xylaustauschbarer Absorptionseinheit bei 300 nm besitzt, wenn es als Standard verwendet wird.

25 Für Untersuchungen an Salmonella gallinarum MB-1287-Platten wird die Steigung auf gleiche Weise wie bei Vibrio percolans ATCC-8461-Platten bestimmt. Wenn kein Standard verwendet wird, werden nur relative Wirksamkeiten berechnet. Wird keine Steigung gemessen, wird ein Wert von 2,3 mm 3o angenommen. Die Potenzberechnungen erfolgen wie bei dem Vibrio percolans ATCC- 8461-Versuch. Wird kein 890Ai-Stan-dard verwendet, kann zur Verifizierung, damit die Empfindlichkeit des Organismus im normalen Bereich liegt, eine Kontrolle mit Penicillin G mit 250 n.g/ml verwendet werden.

35

II. Assayverfahren bzw. Untersuchungsverfahren für die Bestimmung der «890-Assay-Einheiten»

Ein übliches Agarplatten-Scheiben-Diffusionsverfahren wird unter Verwendung von Vibrio percolans ATCC 8461 als 40 Testorganismus verwendet. Cephaloridin wird als Standard verwendet. Vibrio percolans ATCC 8461 enthaltende Platten werden folgendermassen hergestellt. Eine Kultur von Vibrio percolans ATCC 8461 wird in einer Nährbrühe-Hefeextrakt über Nacht auf einer Rotationsschüttelvorrichtung bei 28 °C 45 inkubiert und dann auf eine Dichte von 60% Durchlässigkeit bei 660 nm verdünnt. Ein 33,2-ml-Teil dieser verdünnten Kultur wird zu 11 eines Mediums zugegeben, das aus einem Nähragar + 0,2% Hefeextrakt besteht und bei 46 °C gehalten wird. Das inokulierte, Agar enthaltende Medium wird in lOOx 15 mm so Kunststoff-Petrischalen, 10 ml/Schale, gegossen, abgekühlt und bei 2 bis 4 °C bis zu 5 Tagen vor der Verwendung gehalten.

Die Konzentration an Cephaloridin, die 1 Einheit/ml von 890A äquivalent ist, wird durch Assay auf Platten, die wie oben beschrieben hergestellt wurden, jedoch 5 ml inokuliertes 55 Medium/Platte enthalten, folgendermassen bestimmt. Vier Konzentrationen von Cephaloridin stellen den Standard dar -3,12,6,25,12,5 und 25 [i-g/ml mit 12,5 (xg/ml als Vergleichslösung. Die Durchmesser der Zonen auf einer 5-ml-Platte für den Standard sind die folgenden.

60

65

Konzentration (|ig/ml)

Zonendurchmesser (mm)

3,12

16,8

6,25

22,3

12,5

25,0

25

29,6

634599

14

Eine Einheit wird als die Menge Antibiotikum/ml definiert, FeSCKN6H2O 0,0351

die eine 25-mm-Hemmzone auf einer 5-ml-Platte, wie bei Teil I MgCh -òHiO 5,32

oben beschrieben, ergibt. Bei diesem Assay wird eine Konzen- CaCh • 2H2O 0,728

tration von 12,5 ug/ml Cephalodirin ls äquivalent zu 1 Einheit destilliertes Wasser 1000 ml

890A/ml angesehen. Da die Krümmung der Linie für Cephalori- s pH 7,4 (vor der Sterilisation)

din 4,0 beträgt, erfolgen die Berechnungen für die Potenz der Agar 25,0 g

Probe unter Verwendung einer Krümmung von 4,0.

Die inokulierten Schrägkulturen werden 1 Woche bei 27 bis III. Hydroxylamin-Reaktion 28 °C inkubiert und dann bei 4 bis 6 °C, bis sie 10 Tage später

Beide Antibiotika 890A2 und 890As reagieren mit Hydroxyl-10 verwendet werden. Der halbe Teil des Oberflächenwachstums amin und ergeben eine Substanz mit stark verminderter einer dieser Schrägkulturen wird zur Inokulierung von 250 ml

Absorption bei 308 nm. Dies kann als Grundlage für die quanti- Erlenmeyerkolben mit Ablenkeinrichtungen verwendet, die 50 tative Bestimmung der Antibiotika 890A2 und 890As verwendet ml Medium B der folgenden Zusammensetzung enthalten, werden.

Die zu prüfende Lösung wird auf 0,05 Mol in Kaliumphos- is Medium B phat, pH 7,4, durch Zugabe von V20 Volumen einer Lösung ein- Hefeautolysat (*«Ardamine») 10,0 g gestellt, die 0,8 Mol K2HPO4 und 0,2 Mol KH2PO4 enthält. V100 Glucose 10,0 g

Volumen von 1 Mol Hydroxylamin-hydrochlorid wird dann Phosphatpuffer1 2,0 ml zugegeben, und die Absorption bei 308 nm wird in Intervallen MgSCU • 7H2O 50,0 mg von Vz bis 2 min bestimmt. Die Reaktion wird bei Zimmertem- 20 destilliertes Wasser 1000 ml peratur durchgeführt. Es wird eine Kinetik erster Ordnung pH: unter Verwendung von HCl oder NaOH auf 6,5 eingestellt angenommen, und die Halbwertszeit wird aus der Absorptions- * «Ardamine»: Yeast Products Corporation abnahme während der ersten 10 min geschätzt. Aus dieser 1 Phosphatpufferlösung

Halbwertszeit wird die Zeit, über die hinaus keine weitere KH2PO4 91,0 g

Absorptionsabnahme mehr beobachtet werden sollte, 25 NaîHP04 95,0 g bestimmt und die Beobachtungen werden über diese Zeit hin- destilliertes Wasser 1000 ml weggeführt. Beobachtet man keine weitere Abnahme über diese Zeit hinaus, so wird die gesamte Absorptionsabnahme Drei Impfkolben werden inokuliert, so dass man ausrei-

(korrigiert für den Verdünnungseffekt und für die Absorption chend Inokulum für die zwölf 2-1-Produktionskolben, die bei die-des Hydroxylamins) als «durch Hydroxylamin beseitigbare 30 sem Ansatz fermentiert werden, erhält. Die Impfkolben werden Absorption bei 308 nm (HAEA308)» genommen. Wird eine 1 Tag bei 28 °C auf einer 220 U/min Schüttelvorrichtung (5,08

Absorptionsabnahme über diese Zeit hinaus beobachtet, so cm = 2" -Schwingungsamplitude) geschüttelt. Die Kolben wer-wird die Rate der Hintergrundabsorptionsabnahme berechnet, den von der Schüttelvorrichtung entfernt und 1 Tag bei 4 °C und die beobachtete Abnahme zu diesem Zeitpunkt wird durch gelagert. Der Inhalt dieser Impfkolben wird zur Inokulierung die Hintergrundabnahme korrigiert, unter der Annahme, dass 35 von zwölf 21 Erlenmeyer-Produktionskolben ohne Ablenkein-die Hintergrundabnahme mit der Zeit linear ist. Der korrigierte richtung (7 ml Inokulum/Kolben), die 250 ml des Produktions-Wert wird dann als HAEA308 aufgezeichnet. médiums C der folgenden Zusammensetzung enthalten, ver-

Die Zahl der NAEA3os-Einheiten ist gleich der HAEA308, wendet.

multipliziert mit dem Volumen in ml.

In den folgenden Beispielen werden die Verfahren zur erfin- 40 Medium C dungsgemässen Herstellung der Produkte erläutert. Tomatenpaste bzw. -mark 20,0 g primäre Hefe 10,0g

Beispiel 1 Dextrin («Amidex») 20,0 g

Herstellung eines die Antibiotika 890A2 und 890As enthalten- entionisiertes Wasser 1000 ml den Gemisches «

Ein Rohr mit einer lyophilisierten Kultur von Streptomyces pH: unter Verwendung von NaOH auf 7,3 eingestellt, flavogriseus MA-4434 wird aseptisch geöffnet, und der Inhalt wird in einem Rohr suspendiert, das 0,8 ml sterile Lösung aus Nach der Inokulierung werden die Produktionskolben bei

Davis-Salzen der folgenden Zusammensetzung enthält. 24 °C unter Bewegung auf einer 220 U/min Schüttelvorrichtung so (5,08 cm Schwingungsamplitude) während 4 Tagen und 5 Stun-Da vis-Salze den verwendet. Am Ende dieser Zeit wird der Inhalt der Kol-

Natriumcitrat 0,5 g ben gesammelt und auf die Aktivität unter Verwendung von

K2HPO4 7,0 g Standard Salmonella gallinarum MG-1287- und Vibrio perco-

KH2PO4 3,0 g lans ATCC-8461-Versuchsplatten geprüft, wobei 1,27 cm Ver-

(NH4)2S04 1,0 g 55 suchsscheiben verwendet weden, die in die zentrifugierten Brü-

MgS04-7H2O 0,1 g henproben eingetaucht werden. Die Ergebnisse sind in der fol-

destilliertes Wasser 1000 ml genden T abelle zusammengefasst.

Diese Suspension wird zum Inokulieren von vier Schrägkul- Sammelversuch turen aus sterilem Medium A der folgenden Zusammensetzung so Alter zum Zeitpunkt des Sammeins (h) 101

verwendet. pH 7,1

Salmonella gallinarum (mm Zone) 31

Medium A g Vibrio percolans (mm Zone) 43

Dextrose 10,0

Pepton 5,0 65 Die Fermentationsbrühe wird zentrifugiert. Man erhält 2,21

Hefeextrakt 3,0 klares Zentrifugat mit einem pH-Wert von 6,8. Dazu gibt man

NaCl ' 12,705 22 mg (Äthylendinitrilo)-tetraessigsäure und stellt den pH-Wert

KCl 0,72 auf 7,2 ein. Das Zentrifugat mit eingestelltem pH-Wert wird an

15

634599

150 ml «Dowex» 1X2 Harz in dem Cl~-Zyklus bei 15 ml/min adsorbiert, wobei der verbrauchte Strom als eine Fraktion gesammelt wird. Das Adsorbat wird mit 150 ml entionisiertem Wasser, das 10 ug/ml (Äthylendinitrilo)-tetraessigsäure enthält, und dann mit 5% NaCl, das 10 |ig/ml (Äthylendinitrilo)-tetraes- 5 sigsäure enthält, gewaschen. Es werden 5x75 ml Fraktionen gesammelt.

Auf die 5%ige NaCl-Eluierungslösung folgt ein Verdrän-gungswaschen mit 60 ml entionisiertem Wasser, und dann werden die Antibiotika 890A2 und 890As mit 90%igem (VoL/Vol.) io Methanol; 3%igem Ammoniumchlorid (Gew./Vol.); 10% Wasser (Vol/Vol.), das 10 ug/ml (Äthylendinitrilo)-tetraessigsäure enthält, eluiert, wobei man 5 x 75 ml Fraktionen sammelt. Die Fraktionen werden gegenüber Vibrio percolans ATCC 8461 geprüft, und die erhaltenen Ergebnisse werden im folgenden als 15 Prozent der Ausgangsbioaktivität angegeben.

pH: unter Verwendung von HCl oder NaOH auf 6,5 eingestellt.

*«Ardamine»: Yeast Products Corporation

1 Phosphatpufferlösung

KH2PO4

NazHP04

destilliertes Wasser

91,0 g 95,0 g 1000 ml

Fraktion

Beschickung verbraucht

Wasserverdrängungswaschen MeOH/NH4Cl-Eluatfraktionen 1 bis 3

Wiedergewinnung, %

100 20

0

1

24

Die Impfkolben werden 1 Tag bei 27 bis 28 °C auf einer 220 U/min Schüttelvorrichtung (5,08 cm Schwingungsamplitude) geschüttelt. Die Kolben und ihr Inhalt werden 1 Tag bei 4 °C stationär gelagert.

Vierundvierzig 2-1-Erlenmeyer-Produktionskolben, die je 200 ml Medium C enthalten, werden mit 8 ml/Kolben des Wachstums von den Impfkolben inokuliert. Das Medium C besitzt die folgende Zusammensetzung.

Medium C

Tomatenpaste bzw. -mark primäre Hefe Dextrin («Amidex») CoCl2-6H20 destilliertes Wasser

20,0 g 10,0 g 20,0 g 5,0 mg 1000 ml

Beispiel 2 25

Schüttelkolbenherstellung des Antibiotikums 890A2

Ein Rohr mit lyophilisierter Kultur von Streptomyces flavogriseus MA-4434 wird aseptisch geöffnet und der Inhalt wird in einem Rohr suspendiert, das 0,8 ml sterile Davis-Salze der folgenden Zusammensetzung enthält. 30

Davis-Salze

Natriumeitrat

K2HPO4

KH2PO4

(NBO2SO4

MgSÛ4-7H20

destilliertes Wasser

0,5 g 7,0 g 3,0 g 1,0 g 0,1g 1000 ml pH: unter Verwendung von NaOH auf 7,2 bis 7,4 eingestellt.

Nach der Inokulierung werden die Produktionskolben bei 24 °C inkubiert. Dabei rührt man auf einer 212 U/min Schüttelvorrichtung (5,08 cm Schwingungsamplitude) 4 Tage und 5 Stunden. Der Inhalt der Kolben wird gesammelt und seine Aktivität wird unter Verwendung von Standard Salmonella gallinarum MB-1287- und Vibrio percolans ATCC-8461-Versuchsplatten und 1,27 cm (Vi in.) Assayscheiben, die in die zentrifugierten Brühenproben eingetaucht wurden, bestimmt. Die Proben werden, sofern erforderlich, mit 0,02 Mol Phosphatpuffer, pH 7,0, verdünnt. Die Ergebnisse sind im folgenden tabellarisch aufgeführt.

Diese Suspension wird zur Inokulierung von vier Schrägkulturen aus sterilem Medium A der folgenden Zusammensetzung verwendet.

40

Medium A Glycerin primäre Hefe Fischmehl destilliertes Wasser Agar

20,0 g 5,0 g 15,0 g 1000 ml 20,0 g pH: unter Verwendung von NaOH auf 7,2 eingestellt.

Die inokulierten Schrägkulturen werden eine Woche lang bei 27 bis 28 °C inkubiert und dann bei 4 bis 6 °C bis zu ihrer Verwendung (nicht länger als 21 Tage) gelagert.

VS-Teil des Wachstums von einer Schrägkultur wird zur Inokulierung eines 250-ml-Erlenmeyerkolbens mit Ablenkeinrichtungen verwendet. Insgesamt werden vier Schrägkulturen zur Inokulierung von zwölf Kolben verwendet. Jeder Kolben enthält 50 ml Medium B der folgenden Zusammensetzung.

50

Medium B

Hefeautolysat (*«Ardamine»)

Glucose

Phosphatpuffer1

MgS04-7H20

destilliertes Wasser

10,0 g 10,0 g 2,0 ml 50,0 mg 1000 ml

60

65

Zeitpunkt der Gewinnung des Ertrags, h 101

pH-Wert 7,2

Salmonella gallinarum (mm Zone) 35 Vibrio percolans V10 Verdünnung (mm Zone) 25

890 Assayeinheit 121

Die Gesamtmengte von 7,01 der gesamten Brühe, die man bei dieser Fermentation erhält, wird auf 3 °C gekühlt und in 200-ml-Teilen bei 9000 U/min während jeweils 15 min zentrifugiert. Zu den vereinigten überstehenden Lösungen gibt man 1,7 ml 0,1 Mol neutralem EDTA und dann wird die Charge bei 3 °C gehalten.

Die obige Fermentation wird bei im wesentlichen identischen Bedingungen wiederholt, mit der Ausnahme, dass die vierundvierzig 2-1-Erlenmeyer-Produktionskolben mit 7 ml/Kolben mit gewachsenem Material aus den Impfkolben inokuliert wurden. Der pH-Wert und die Versuchsergebnisse sind im folgenden aufgeführt.

Zeitpunkt der Gewinnung des Ertrags, h 101 pH-Wert 7,3

Salmonella gallinarum (mm Zone) 38

Vibrio percolans '/io Verdünnung (mm Zone) 27 890 Assayeinheiten 92,8

Die Gesamtmenge von 7,41 der gesamten Brühe, die man bei dieser Fermentation erhält, wird auf 3 °C gekühlt und in 200-ml-Teilen bei 9000 U/min während jeweils 15 min zentrifugiert. Zu den vereinigten überstehenden Lösungen gibt man 1,8 ml 0,1 Mol neutralem EDTA.

634599

16

10

15

Die überstehenden Lösungen aus den zentrifugierten Brühen, die man bei den beiden obigen Fermentationen dieses Beispiels erhält, werden vereinigt und ergeben ein Gesamtvolumen von 131 mit einer Potenz von 80 Einheiten/ml, bestimmt durch Assay an Vibrio percolans ATCC 8461.

Die vereinigten überstehenden Lösungen werden durch eine Säule aus «Dowex»-l x2 (Cl~), 0,297 bis 0,149 mm mit Schichtdimensionen von 4,7x40 cm und einer Strömungsrate von 60 ml/min geleitet. Die Säule wird mit 11 entionisiertem Wasser gewaschen und mit 51 einer 5%igen (Gew.-Vol.) NaCl-Lösung, die 0,01 Mol tris-HCl-Puffer, pH 7,0, und 25 |i,Mol neutrales EDTA enthält, in einer Strömungsrate von 50 ml/min eluiert.

Die Säule wird mit 500 ml entionisiertem Wasser gewaschen und die Antibiotika 890A2 und 890As werden mit 21 3%igem NaCl + 0,01 Mol tris-HCl, pH 7,0, + 25 uMol neutralem EDTA in 50°/oigem Methanol in einer Strömungsrate von 40 ml/min eluiert. Fraktionen von 220 ml werden gesammelt.

Die antibiotische Aktivität, bestimmt durch Versuche an Salmonella gallinarum MG-1287, erscheint in den Fraktionen 4 20 bis 8 mit einem Maximum in der Fraktion 5. Die Fraktionen 4 bis 8 enthalten 9% der in der Brühe vorhandenen anfänglichen Aktivität.

Die Fraktionen 4 bis 7 werden vereinigt, auf 150 ml an einem Rotationsverdampfer bei vermindertem Druck konzen- 25 triert und durch Zugabe von 200 ml entionisiertem Wasser auf 350 ml verdünnt. Die Probe wird auf eine Säule (5x25 cm) von XAD-2 gegeben, das zuvor mit jeweils 3160%igem (Vol/Vol.) Aceton, entionisiertem Wasser und 5%igem (Gew./Vol.) NaCl gewaschen wurde. Die Säule wird mit 500 ml entionisiertem 30 Wasser bei 20 ml/min und anschliessend mit 500 ml 60%igem (Vol/Vol.) wässrigem Aceton eluiert. Es werden Fraktionen von jeweils 160 ml gesammelt. Die antibiotische Aktivität, bestimmt durch Versuche an Salmonella gallinarum MB-1287, erscheint in den Fraktionen 1 bis 5 mit einem Maximum in den 35 Fraktionen 3 und 4.

Die Fraktionen 4, die erste, Aceton enthaltende Fraktion,

wird auf 10 ml bei vermindertem Druck konzentriert und mit 90 ml entionisiertem Wasser verdünnt. Diese Probe wird auf eine Säule (5 x 25 cm) von XAD-2 gegeben, das zuvor mit je 31 40 60%igem (Vol./Vol.) Aceton, entionisiertem Wasser und 5%igem (Gew./Vol.) NaCl gewaschen wurde. Die Säule wird mit entionisiertem Wasser in einer Strömungsrate von 20 ml/min eluiert. Es werden Fraktionen von 140 bis 190 ml gesammelt. Die antibiotische Aktivität, bestimmt an Versuchen mit 45 Salmonella gallinarum MG-1287, erscheint in den Fraktionen 2 bis 7 mit einem Maximum in der Fraktion 4. Die Fraktionen 3,4 und 5 werden vereinigt und zu der Fraktion 3 aus der XAD-Säule, die im vorhergehenden Absatz beschrieben wurde, zugegeben. Die vereinigten Fraktionen enthalten 26 400 Bioassay- 50 einheiten, bestimmt durch Versuche an Vibrio percolans ATCC 8461 ; dies entspricht 2,5% der Ausgangsaktivität.

Die vereinigten XAD-2-Fraktionen 3 aus der ersten XAD-Säule, und die Fraktionen 3,4 und 5 aus der zweiten XAD-Säule werden bei vermindertem Druck auf 25 ml konzentriert und 55 dann werden 25 ml entionisiertes Wasser und 50 ml Methanol zugegeben. Die methanolische Lösung wird an einer Säule (2,15x26,4 cm) von «Dowex»-l x4 (Cl~), minus 400 mesh (0,037 mm Öffnungen), adsorbiert, das mit 50%igem wässrigem Methanol (Vol./Vol.) ins Gleichgewicht gebracht wurde. Die Säule 60 wird mit 1,44 ml von 0,07 Mol NaCl + 0,005 Mol NH4CI + 0,0001 Mol NH3 in 50%igem Methanol in einer Strömungsrate von 2 ml/min eluiert. Die Fraktionen von 12,1 ml werden gesammelt. Die Elution wird mit 21 von 0,08 Mol NaCl + 0,005 Mol NH4CI + 0,0001 Mol NH3 in 50%igem Methanol weitergeführt, 65 wobei man Fraktionen von je 11,7 ml isoliert.

In den Fraktionen 138 bis 162 tritt in der UV-Absorption bei 300 nm ein Peak auf, mit einem Maximum bei den Fraktionen

149 bis 150. Die Absorption bei 305 nm kann durch Umsetzung mit L-Cystein bei neutralem pH-Wert bis zu 77% ausgelöscht werden. Die Fraktionen 145 bis 155, die das Antibiotikum 890A2 enthalten, werden gesammelt und auf 2,4 ml konzentriert, die insgesamt 70,5 A3oo-Einheiten enthalten.

Die konzentrierte Probe wird auf eine Säule (2,2 x 70 cm) aus «Bio-Gel» P-2,0,074 bis 0,037 mm Öffnungen, das mit 11 entionisiertem Wasser gewaschen wurde, aufgebracht. Die Probe kann bis zur Schichthöhe ablaufen, und der Rückstand wird durch zweimaliges Spülen mit je 1 ml entionisiertem Wasser gewaschen. Die Säule wird mit entionisiertem Wasser in einer Rate von 1 ml/min eluiert. Die Fraktionen von 2 bis 3,5 ml werden gesammelt.

Der Hauptabsorptionspeak tritt bei den Fraktionen 64 bis 72 bei 308 nm auf, die unmittelbar dem Natriumchlorid vorhergehen und von diesem nicht vollständig abgetrennt sind. Die Fraktionen 66 und 67 werden vereinigt. Sie enthalten 27 Absorptionseinheiten des Antibiotikums 890A2 bei 308 nm und 29 bis 43 mg NaCl (geschätzt durch Leitfähigkeitsmessungen). Diese vereinigten Fraktionen werden bei vermindertem Druck auf 1,5 ml konzentriert und lyophilisiert; man erhält 43,7 mg Feststoffe.

Beispiel 3

Herstellung der Antibiotika 890A2 und 890As

Ein Rohr aus lyophilisierter Kultur von Streptomyces flavogriseus MA4434 wird aseptisch geöffnet und der Inhalt wird in einem'Rohr suspendiert, das 0,8 ml sterile Davis-Salze der folgenden Zusammensetzung enthält.

Davis-salze

Natriumeitrat

K2HPO4

KH2PO4

(NH4)2S04

MgSo4.7H20

destilliertes Wasser

0,5 g 7,0 g 3,0 g 1,0 g 0,1g 1000 ml

Diese Suspension wird zur Inokulierung von vier Schrägkulturen des Mediums A der folgenden Zusammensetzung verwendet.

Medium A Glycerin primäre Hefe Fischmehl destilliertes Wasser Agar

20,0 g 5,0 g 15,0 g 1000 ml 20,0 g pH: unter Verwendung von NaOH auf 7,2 eingestellt.

Die inokulierten Schrägkulturen werden 1 Woche bei 27 bis 28 °C inkubiert und dann bei 4 bis 6 °C bis zu ihrer Verwendung gelagert (nicht länger als 21 Tage).

10 ml Medium B der folgenden Zusammensetzung

Medium B

Hefeautolysat («*Ardamine»)

Glucose

Phosphatpuffer1

MgS04-7H20

destilliertes Wasser

10,0g 10,0 g 2,0 ml 50,0 mg 1000 ml pH: unter Verwendung von HCl oder NaOH auf 6,5 eingestellt *«Ardamine»: Yeast Products Corporation 1 Phosphatpufferlösung

KH2PO4 91,0 g

Na2HP04 95,0 g destilliertes Wasser 1000 ml

17

634599

werden aseptisch zu einer dieser Schrägkulturen gegeben, die Sporen und Luftmyzelia werden in die Suspension abgekratzt und 3,3 ml dieser Suspension werden zur Inokulierung von 2-1-Erlenmeyerkolben mit Ablenkeinrichtungen, der 500 ml Medium B enthält, verwendet. Dieser Impfkolben wird bei 28 °C auf einer 160 U/min Schüttelvorrichtung (5,08 cm Schwingungsamplitude) 36 h geschüttelt. Zu diesem Zeitpunkt ist das Wachstum zufriedenstellend.

Der Bewuchs (bzw. das gewachsene Material) aus diesem Impfkolben wird zur Inokulierung von einem 1891 rostfreien Stahlimpf tank, der 1601 Medium B enthält, verwendet. Dieser Tank wird 24 h bei 28 °C gehalten, wobei eine Rührrate von 150 U/min und eine Luftströmung von 84,91/min verwendet werden. Ein Entschäumungsmittel, Polyglykol 2000 (Dow Chemical Corp.), wird je nach Bedarf verwendet, aber nicht in einer grösseren Menge als 0,1%. Die pH-Bestimmungen werden wie folgt durchgeführt:

10

Alter, h pH-Wert

0

6,3

12 6,35

20

431 des in diesem Impftank gewachsenen Materials werden zur Inokulierung von einem 7561 rostfreien Stahl-Fermentationsbehälter, der 4671 Medium C enthält, verwendet. Das Medium C besitzt die folgende Zusammensetzung.

Medium C

Tomatenpaste bzw. -mark primäre Hefe Dextrin («Amidex») C0CI2.6H2O destilliertes Wasser

20,0 g 10,0g 20,0 g 5,0 mg 1000 ml pH: unter Verwendung von NaOH auf 7,2 bis 7,4 eingestellt.

Dieser Tank wird unter Verwendung einer Rührrate von 146 U/min und einer Luftströmung von 2551/min 92 h bei 25 °C in Gang gehalten. Zusätzliches Entschäumungsmittel, Polyglykol 2000, wird je nach Bedarf zugegeben, wobei jedoch nicht mehr als 0,1% zugefügt wird. Die antibakteriellen Assays werden mit Salmonella gallinarum MB-1287, Vibrio percolans ATCC 8461 durchgeführt; man erhält die folgenden Ergebnisse.

Alter, h 0

12

24

36

48

60

72

84

92

pH 6,6

6,7

6,65

6,3

6,0

6,4

6,15

6,5

6,5

MB-1287 mm -

S

_

19

26

28

32

ATCC 8461mm-

-

S

-

21

24

26

30

(1-10)

890A-

NA

NA

6,8

13,5

24,9

24,3

Einheiten/ml

25

30

35

40

45

50

55

Die 890A-Einheiten/ml werden bestimmt, wie in dem Teil mit der Überschrift «II. Untersuchungsverfahren für die Bestimmung von <890 Assayeinheiten»> angegeben wird.

4731 (125 gal.) Brühe werden auf 5 °C gekühlt und durch bzw. mit einer Titan-P-9-Zentrifuge zentrifugiert. 22,7 kg 60 «Celite» werden zu 3791 der überstehenden Flüssigkeit gegeben, und die Suspension wird durch eine Shriver 45,7 cm Filterpresse filtriert. Das 3441 Filtrate werden an einer Säule adsorbiert, die 26,51 «Dowex»-l x 2 (Cl-), 0,297 bis 0,149 mm Öffnungen enthält, und die Säule wird mit 37,91 entionisiertem Wasser 65 und anschliessend mit 11415% NaCl + 0,01 Mol tris-HCl-Puffer, pH 7,0, + 25 |iMol neutrales EDTA in entionisiertem Wasser gewaschen. Nach einem weiteren Waschen mit 18,91 entionisiertem Wasser werden die Antibiotika 890A2 und 890As mit 94,613% NaCl + 0,01 Mol tris-HCl-Puffer, pH 7,0 + 25 jiMol neutrales EDTA in 50%igem (V0I./V0I.) wässrigem Methanol eluiert. 18,91 Fraktionen werden gesammelt.

Die antibiotische Aktivität, die durch Versuche gegenüber Salmonella gallinarum MB-1287 bestimmt wird, erscheint in den Fraktionen 1 bis 5 mit einem Maximum in der Fraktion 3. Die Fraktionen 2 und 3, die 10,9% der Aktivität der angewendeten Brühe enthalten, werden vereinigt und auf 7,571 bei vermindertem Druck konzentriert. Die konzentrierte Probe wird mit 30,31 entionisiertem Wasser verdünnt und erneut auf 7,571 bei vermindertem Druck zur Entfernung von restlichem Methanol konzentriert.

7,571 Konzentrat werden auf eine Säule aufgebracht, die 37,91 XAD-2 enthält, das zuvor mit 189160%igem wässrigem Aceton und anschliessend mit 1891 entionisiertem Wasser und 18915%igem NaCl gewaschen wurde. Die Säule wird mit 1421 entionisiertem Wasser eluiert. Es werden drei Fraktionen mit 9,461 und anschliessend 6 Fraktionen mit 18,91 gesammelt. Die Aktivität, die durch Versuche an Salmonella gallinarum MB-1287-Platten bestimmt wird, tritt in den Fraktionen 1 bis 6 auf mit einem Potenzpeak bei der Fraktion 2. Die Fraktionen 2 bis 5, die 64% der Aktivität, die auf die XAD-Säule aufgebracht wurde, oder 520 000 Einheiten enthalten, werden vereinigt.

Die Fraktionen 2 bis 5 werden durch Verdampfen bei vermindertem Druck auf 120 ml konzentriert. Der pH-Wert wird auf 6,5 eingestellt und das Konzentrat wird auf eine Säule (7 x 50 cm) von XAD-2, die mit 8160%igem wässrigem Aceton und anschliessend mit 41 entionisiertem Wasser und 815%igem NaCl in entionisiertem Wasser gewaschen wurde, aufgebracht. Die Probe kann bis zur Schichthöhe ablaufen, und dann wird die Säule dreimal mit 20 ml Teilen entionisiertem Wasser gespült, wobei man jedesmal bis zur Schichthöhe ablaufen lässt. Das Antibiotikum wird mit 61 entionisiertem Wasser in einer Strömungsrate von 40 ml/min eluiert. Acht Fraktionen von 200 ml und anschliessend elf Fraktionen von 400 ml werden gesammelt. Die antibiotische Aktivität, bestimmt durch Versuche an Salmonella gallinarum MB-1287-Platten, tritt in den Fraktionen 3 bis 18 auf, wobei ein Aktivitätspeak in der Fraktion 8 beobachtet wird.

Die Fraktionen 8 bis 12 mit den höchsten Verhältnissen der Bioaktivität/A22o und mit 225 000 Bioaktivitätseinheiten, bestimmt durch Versuche gegenüber Salmonella gallinarum MB-1287, werden für die weitere Verarbeitung vereinigt.

Die vereinigten Fraktionen werden bei vermindertem Druck auf 50 ml konzentriert und 50 ml Methanol werden zugegeben. Die Probe wird auf eine Säule von «Dowex»-l x4 (Cl~), minus 400 mesh (0,037 mm Öffnungen), Schichtdimensionen 2,2x40 cm, das zuvor mit 50%igem Methanol gewaschen wurde, aufgebracht. Die Säule wird mit 21 von 0,07 Mol NaCl + 0,005 Mol NH4CI + 0,0001 Mol NH3 in 50%igem wässrigem Methanol mit einer Strömungsrate von 2 ml/min eluiert. Fraktionen von 12 ml werden gesammelt.

Man beobachtet in dem Abstrom zwei ungleiche Bioaktivi-tätspeaks, bestimmt durch Versuche gegenüber Salmonella gallinarum MB-1287, die den zwei Peaks des Materials mit einem Absorptionsmaximum bei 308 nm entsprechen. Der grösste Teil der Absorption bei 308 nm in beiden Peaks ist durch Umsetzung mit Hydroxylamin auslöschbar.

Der erste Peak, der 890A2 enthält, tritt in den Fraktionen 98 bis 136 auf, und der zweite Peak, der 890As enthält, tritt in den Fraktionen 136 bis 158 auf. Die Fraktionen 112 bis 130 werden vereinigt; man erhält eine 890A2-«Dowex»-Charge, und die Fraktionen 138 bis 148 werden vereinigt; man erhält eine 89OA5- «Dowex»-Charge. Das 890A2 wird weiter durch Entsalzen an «Sephadex» G-10 gereinigt.

Die Fraktionen 112 bis 130, die 890A2 enthalten, werden bei vermindertem Druck auf 5,5 ml konzentriert, und das Konzen-

634599

18

trat wird auf eine Säule (2,15x 70 cm) aus «Sephadex» G-10 aufgebracht und mit entionisiertem Wasser in einer Strömungsrate von 1 ml/min eluiert. Es werden jeweils Fraktionen von 2,85 ml gesammelt. Die Bioaktivität, die durch Versuche gegenüber Salmonella gallinarum MB-1287 bestimmt wurde, s tritt in den Fraktionen 60 bis 98 auf. Die Fraktionen 78 bis 90 zeigen die höchsten A3os/A26o-Verhältnisse und diese werden für die Lyophilisierung vereinigt. Der pH-Wert der vereinigten Fraktionen beträgt 4,1 und durch Zugabe von 8 jxl 1 molarem Ammoniak wird er auf 7,8 eingestellt. Das vereinigte Material io enthält 52 A3os-Einheiten mit einem A3os/A26o-Verhältnis von 0,76, was einen wesentlichen Abbau des Antibiotikums während dieses Verfahrens anzeigt.

Die gesammelten Fraktionen 78 bis 90 werden bei vermindertem Druck auf 1,69 ml konzentriert. Zwei 0,1 ml Proben wer- is den entfernt und getrennt in kleinen, kegelförmigen Reaktionsglasampullen lyophilisiert. Der Rest wird in einer 14-ml-Gla-sampulle mit Schraubverschluss lyophilisiert; man erhält 1,29 mg Feststoffe, die 890A2 enthalten.

kratzt werden und die Suspension dann zur Inokulierung von drei 2-1-Erlenmeyerkolben mit Ablenkeinrichtungen, die 500 ml Medium B enthalten, zugegeben wird, und zwar in einer Menge von 3,3 ml/Kolben. Diese Impfkolben werden bei 28 °C auf einer 160 U/min Schüttelvorrichtung (5,08 cm Schwingungsamplitude) 36 h geschüttelt, wobei zu diesem Zeitpunkt das Wachstum zufriedenstellend ist.

500 ml des gewachsenen Materials aus diesen Impfkolben werden zur Inokulierung eines 1891 rostfreien Stahlimpftanks, der 1601 Medium B enthält, verwendet. Dieser Tank wird bei 28 °C unter Verwendung einer Rührrate von 150U/min und einer Luftströmung von 84,931/min während 24 h betrieben. Entschäumungsmittel, Polyglykol 2000 (Dow Chemical Corp.), wird je nach Bedarf, aber nicht in einer Menge über 0,1%, verwendet. Die pH-Bestimmungen werden wie folgt durchgeführt.

Alter, h pH-Wert

0

6,1

24 5,6

Beispiel 4

Herstellung von 890As

Ein Rohr aus lyophilisierter Kultur von Streptomyces flavogriseus MA4434 wird aseptisch geöffnet und der Inhalt wird in einem Rohr suspendiert, das 0,8 ml sterile Davis-Salze der folgenden Zusammensetzung enthält.

431 des in diesem Impftank gewachsenen Materials werden zur Inokulierung eines 7561 rostfreien Stahlfermentationsge-fässes, das 4601 Medium C enthält, verwendet, wobei das Medium C die folgende Zusammensetzung besitzt.

Davis-Salze

Natriumeitrat

K2HPO4

KH2PO4

(NH4)2SC>4

MgS04-7H20

destilliertes Wasser

0,5 g 7,0 g 3,0 g 1,0 g 0,1g 1000 ml

25 Medium C Tomatenpaste bzw. -mark primäre Hefe Dextrin («Amidex») C0CI2 • 6H2O 30 destilliertes Wasser

20,0 g 10,0 g 20,0 g 5,0 mg 1000 ml

Diese Suspension wird zur Inokulierung von vier Schrägkulturen aus Medium A der folgenden Zusammensetzung verwendet.

Medium A Glycerin primäre Hefe Fischmehl destilliertes Wasser Agar

20,0 g 5,0 g 15,0 g 1000 ml 20,0 g pH: unter Verwendung von NaOH auf 7,2 bis 7,4 eingestellt.

Das Medium war zuvor 60 min bei 120 °C sterilisiert wor-35 den. Dieser Tank wird bei 25 °C unter Verwendung einer Rührrate von 160 U/min und einer Luftströmung von 2831/min 144 h betrieben. Zusätzliches Entschäumungsmittel, Polyglykol 2000, wird je nach Bedarf zugegeben, jedoch nicht in einer Menge über 0,1%. Die antibakteriellen Versuche werden an Salmonella 40 gallinarum MB-1287 und Vibrio percolans ATCC 8461 durchgeführt, und die Werte sind die folgenden.

pH: unter Verwendung von NaOH auf 7,2 eingestellt.

Die inokulierten Schrägkulturen werden 1 Woche bei 27 bis. 28 °C inkubiert und dann bei 4 bis 6 °C bis zu ihrer Verwendung 50 gelagert (nicht länger als 21 Tage).

10 ml Medium B der folgenden Zusammensetzung

Alter, h 0

24

48

72

96

120

144

pH-Wert 6,2

6,2

6,3

7,0

7,3

7,7

8,2

MB-1287 mm

T

26,5

28,0

33,5

32,5

31,5

MB-1272 mm

O

21,5

26,5

35,0

31,5

33,0

(1-10 Verdünn.)

890A-Einheiten/ml-

NA

6,4

16,5

16,7

22,5

19,5

Medium B

Hefeautolysat (*«Ardamine»)

Glucose

Phosphatpuffer1

MgS04-7H20

destilliertes Wasser

10,0 g 10,0 g 2,0 ml 50,0 mg 1000 ml

55

pH: unter Verwendung von HCl oder NaOH auf 6,5 eingestellt eo *«Ardamine»: Yeast Products Corporation 1 Phosphatpufferlösung

KH2PO4 91,0 g

Na2HP04 95,0 g destilliertes Wasser 1000 ml 65

werden aseptisch zu einer dieser Schrägkulturen gegeben,

wobei die Sporen und Luftmyzelia in die Suspension abge-

Die 890A-Einheiten/ml werden bestimmt, wie in dem Teil mit der Überschrift «II. Versuchsverfahren für die Bestimmung von <890-Assayeinheiten»> beschrieben.

3791 Brühe werden auf 5 °C gekühlt und mit bzw. durch eine Titan-P-9-Zentrifuge zentrifugiert. 18,1 kg «Celite» werden zu 2891 der überstehenden Flüssigkeit gegeben und die Suspension wird durch eine Shriver 45,7 cm Filterpresse filtriert. 2271 des Filtrats werden an einer Säule adsorbiert, die 26,51 «Dowex»-l x2 (Cl~), 16 bis 100 mesh (entsprechend 1,19 bis 0,149 mm Öffnungen), enthält, und die Säule wird mit 37,91 entionisiertem Wasser und dann mit 11415%igem NaCl + 0,01 Mol tris-HCl-Puffer, pH 7,0 + 25 jxMol neutralem EDTA gewaschen. Nach weiterem Waschen mit 18,91 entionisiertem Wasser werden die Antibiotika 890A2 und 890As mit 13213%igem NaCl + 0,01 Mol tris-HCl, pH 7,0 + 25 jiMol neutralem EDTA in 50%igem Methanol eluiert. Es werden jeweils Fraktionen von 18,91 gesammelt.

Die Bioaktivität, bestimmt durch Versuche gegenüber Sai-

19

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monella gallinarum MB-1287, tritt in den Fraktionen 1 bis 7 auf Das Konzentrat wird weiter gereinigt, indem mafl es auf mit einem Maximum bei der Fraktion 3. eine Säule (3,4 x 46 cm) aus «Dowex»-50 x 2 (Na+), 200 bis 400

Die Fraktionen 3 bis 7, die 18% der aufgebrachten Aktivität mesh (0,074 bis 0,037 mm Öffnungen), aufbringt, das zuvor mit enthalten, werden bei vermindertem Druck auf 9,461 konzen- 410,2 mM NaOH und dann mit 800 ml entionisiertem Wasser triert und das Konzentrat wird auf eine Säule aufgebracht, die 5 gewaschen wurde. Das Antibiotikum wird mit entionisiertem 37,91 XAD-2 enthält, das zuvor mit 1891 von jeweils 60%igem Wasser in einer Strömungsrate von 4,1 ml/min eluiert. Fraktio-(V0I./Vol.) wässrigem Aceton, entionisiertem Wasser und nen von 8,2 ml werden gesammelt.

5%igem NaCl in entionisiertem Wasser gewaschen wurde. Die Das Antibiotikum tritt in den Fraktionen 22 bis 27 mit Antibiotika 890A2 und 890A5 werden mit 1321 von 25 ^Mol einem Maximum bei der Fraktion 23 auf. Die Fraktionen 23 bis neutralem EDTA in entionisiertem Wasser eluiert. Zuerst wird 10 25 werden vereinigt, die 152 Asos-Einheiten mit einem Verhälteine Fraktion von 18,91 und anschliessend werden vier Fraktio- nis A308/A260 von 2,00 enthalten. Leitfähigkeitsmessungen zei-nen von 9,461 und vier Fraktionen von 18,91 gesammelt. Die gen, dass 70 uMol NaCl in den gesammelten Fraktionen vor-Bioaktivität, die durch Versuche gegenüber Salmonella gallina- handen sind.

rum MB-1287 bestimmt wird, tritt in den Fraktionen 3 bis 9 auf Ein 4 ml Teil der gesammelten «Dowex»-50-Fraktionen 23 mit einem Maximum bei der Fraktion 4. 15 bis 25 wird in die Ammoniumform durch Durchleiten durch

Die Fraktionen 3 bis 6, die 18% der Aktivität der gefilterten eine Säule (0,7 x 12 cm) aus «Dowex»-50x2 (NH4+), 200 bis 400 Brühe enthalten, werden vereinigt und bei vermindertem mesh (0,074 bis 0,037 cm Öffnungen), überführt, wobei das Harz

Druck auf 122 ml konzentriert. Das Konzentrat wird durch zuvor mit 100 ml 0,1 mM NHs und anschliessend mit 10 ml Zugabe von 5 ml 1 molarer HCl auf einen pH-Wert von 6,45 ein- entionisiertem Wasser gewaschen wurde. Die Probe wird mit gestellt. Das Konzentrat wird auf eine Säule (7,9 x 60 cm) aus 20 entionisiertem Wasser eluiert; es werden Fraktionen von 1 bis XAD-2, das zuvor mit je 16160%igem wässrigem Aceton, entio- 2 ml gesammelt. Alle Fraktionen mit einem Asos-Wert über 1 nisiertem Wasser und 5%igem NaCl in entionisiertem Wasser werden vereinigt; man erhält insgesamt 6 ml mit Asos = 30. gewaschen wurde, gegeben. Die Antibiotika 890A2 und 890As Diese Probe wird bei vermindertem Druck auf 0,725 ml konzenwerden mit 81 entionisiertem Wasser in einer Strömungsrate triert, und zwei 50 (il aliquote Teile werden getrennt in zwei von 50 ml/min eluiert. Fraktionen von 200 bis 1000 ml werden 25 konische 0,5 ml Reaktionsampullen pipettiert und lyophilisiert, gesammelt. Die Trimethyl-Silylierung des Antibiotikums 890As ergibt

Die Bioaktivität, bestimmt durch Versuche gegenüber Sai- drei unterschiedliche Derivate: ein Di- und ein Tri-methylsi-monella gallinarum MB-1287, tritt in den Fraktionen 5 bis 20 lylderivat (Molekulargewichte 456 bzw. 528) und eine geringe auf, was 1900 bis 7700 ml eluiertem Volumen entspricht. Die Menge eines Tetra-trimethylsilylderivats eines hydrolysierten A220- und HAEA304-Werte werden ebenfalls bei den Fraktionen 30 Produktes (Molekulargewicht 618), worin der ß-Lactamring 9 bis 20 bestimmt. Die Fraktionen 9 bis 12 besitzen 261 bis 286 geöffnet ist.

Biopotenzeinheiten/HAEA304-Einheit, die Fraktionen 16 bis 20 Die Werte für die wichtigsten Massenfragmente im Spek-

haben 23 bis 28 Einheiten/HAEA304-Einheit und die Fraktionen trum werden im folgenden aufgeführt.

13 bis 16 besitzen Zwischenwerte, was eine wesentliche Tren- Di-trimethylsilylderivat: 441,299,298 und 84;

nung der Antibiotika 890A2 und 890As auf dieser Säule anzeigt. 35 Tri-trimethylsilylderivat: 513,371 und 156;

Die Fraktionen 15 bis 19, die hauptsächlich 890As enthalten, Tetra-trimethylsilylderivat (es wird nur ein Signal mit werden für die weitere Reinigung vereinigt. niedriger Auflösung beobachtet): 618 und 603.

Die vereinigten Fraktionen 15 bis 19 werden bei verminder- Ein 18,6 ml Teil der gesammelten «Dowex»-50-Fraktionen tem Druck auf 250 ml konzentriert. Zu dem Konzentrat gibt 23 bis 25 wird bei vermindertem Druck auf 3 ml konzentriert, man 250 ml Methanol und die Probe wird in einer Strömungs- 4o Ein 1,96 ml aliquoter Teil wird gefroren und in einer 14 ml Glasrate von 2 ml/min auf eine Säule (3,4x50 cm) aus «Dowex»-l x4 ampulle lyophilisiert; man erhält 2,73 mg Feststoffe, die ein (Cl~), minus 400 mesh (0,037 mm Öffnungen), gegeben, das Gemisch aus Antibiotikum 890As und Natriumchlorid enthal-

zuvor mit 50%igem Methanol gewaschen wurde. Die Säule ten. Da die Leitfähigkeit der Fraktionen 23 bis 25 anzeigen, dass wird mit 810,1 M NaCl + 0,005 M NH4CI + 0,0001 M NH3 in 45% Feststoffe aus Natriumchlorid bestehen, kann ein E%-Wert 50%igem Methanol in einer Strömungsrate von 2 ml/min 45 von 490 bei 308 nm für eine salzfreie Probe von 890As aus dem eluiert. Fraktionen von 10 ml werden gesammelt. beobachteten E%-Wert von 272 berechnet werden. Die restli-

Das Antibiotikum 890As wird in den Fraktionen 505 bis 605 chen 1,0 ml von den 3,0 ml Konzentrat werden getrennt für die mit einem Peak in der Fraktion 550 eluiert. Die Fraktionen 520 NMR-Analyse lyophilisiert.

bis 580 werden gesammelt und ein 300 ml Teil des gesammelten in der folgenden Tabelle sind die 100-MHz-NMR-Signale Materials werden entnommen und bei vermindertem Druck 50 für das 890A5-Natriumsalz in D2O, bezogen auf den Innenstan-auf 4 ml konzentriert. Zu dem Konzentrat gibt man 6 ml Metha- dard DSS, angegeben. Die chemischen Verschiebungen sind in noi und 4 ml konzentriert. Zu dem Konzentrat gibt man 6 ml ppm aufgeführt und die Kupplungskonstanten in Hz. Die offen-Methanol und 25 jxl 1 M NaOH; man erhält einen End-pH Wert sichtlichen Mehrfachheiten sind angegeben, von 7,3. 1,29 (D, J=6,2, CHs-CH); 2,05 (S, CH3C=0); 3,09 (entspre-

Das Konzentrat mit eingestelltem pH-Wert wird auf eine 55 chend D eines D, C-CH2-C); 3,41 (D eines D, J=5,0,3,0 Säule (2,2X70 cm) aus «Sephadex» G-10 gegeben, das zuvor mit ^CH-C=0);4,16 (M, ^CH-N und ^CH-OH); 6,00 und 7,11 0,02 mMol NH3 in 50%igem Methanol äquilibriert wurde. Die (Dubletts, J = 13,8, S-CH=CH-N).

Säule wird mit 0,02 mMol NH3 in 50%igem Methanol in einer Strömungsrate von 1 ml/min eluiert. Beispiel 5

Das 890As erscheint in den Fraktionen 38 bis 88 mit einem 60 Schüttelkolbenproduktion des Antibiotikums 890Ai Maximum bei den Fraktionen 39 und 40. Die Fraktionen 40 bis Ein Rohr aus lyophilisierter Kultur von Streptomyces flavo-

68 werden vereinigt und mit 1 M NaOH wird der pH-Wert auf griseus MA-4600 wird aseptisch geöffnet und der Inhalt wird in 6,3 bis 6,8 eingestellt Die vereinigten Fraktionen 40 bis 68 wer- einem Rohr suspendiert, das 1,5 ml steriles Medium A der fol-den bei vermindertem Druck auf 4 ml konzentriert. 80 |xl 1 M genden Zusammensetzung enthält.

NaOH werden während der Konzentration so zugegeben, dass 65 der pH-Wert zwischen 7,0 und 7,3 bleibt. Zu dem letzten 4 ml Medium A

Konzentrat gibt man 20 p.11 M NaOH, wodurch der pH-Wert Hefeextrakt 10,0 g auf 7,4 eingestellt wird. • Glucose 10,0 g

634599

20

MgS04-7H20

0,05 g

Phosphatpuffer1

2 ml destilliertes Wasser

1000 ml

1 Phosphatpufferlösung

KH2P04

91,0 g

Na2HP04

95,0 g destilliertes Wasser

1000 ml

Diese Suspension wird zur Inokulation eines 250-ml-Erlen-meyer-Impfkolbens mit Dreifachablenkeinrichtungen verwendet, der 54 ml Impfmedium B der folgenden Zusammensetzung enthält.

Medium B

Autolysierte Hefe (Ardamine*)

Glucose

MgS04-7H20

Phosphatpuffer1

destilliertes Wasser

10,0 g 10,0 g 0,05 g 2 ml 1000 ml pH: unter Verwendung von NaOH auf 6,5 eingestellt *«Ardamine» : Yeast Products Corporation 1 Phosphatpufferlösung

KH2PO4 91,0 g

Na2HP04 95,0 g destilliertes Wasser 1000 ml

Die Impfkolben werden mit Baumwolle verschlossen und 30 h bei 28± 1 °C auf einer 220 U/min Gyro-Rotationsschüttel-vorrichtung (5,08 cm Schwingungsamplitude) geschüttelt.

Fünfzig 250-ml-Erlenmeyer-Produktionskolben ohne Ablenkeinrichtungen, die je 40 ml Produktionsmedium C enthalten, werden mit 1 ml/Kolben Brühe aus dem Impfkolben inokuliert. Die Produktionskolben werden mit Baumwolle verschlossen.

Medium C

Tomatenpaste bzw. -mark primäre Hefe Dextrin («Amidex») CoCl2'6H20 destilliertes Wasser

20,0 g 10,0 g 20,0 g 5,0 mg 1000 ml pH: unter Verwendung von NaOH auf 7,2 bis 7,4 eingestellt.

Nach der Inokulation werden die Produktionskolben bei 28 ± 1 °C unter Schütteln auf einer 220 U/min Gyro-Rotations-schüttelvorrichtung (5,08 cm Schwingungsamplitude) 3 Tage inkubiert. Die Aktivität des Materials in den Kolben wird gegenüber Standard Vibrio percolans ATCC-8461-Assayplat-ten unter Verwendung von 1,27 cm Versuchsscheiben, die in die zentrifugierten Fermentationsbrühenprobe eingetaucht sind, geprüft. Die Proben werden mit 0,05 M Phosphatpuffer, pH 7,4, verdünnt. Die Ergebnisse sind im folgenden aufgeführt.

Zeitpunkt bei der Sammlung des Ertrags, h 72 pH 6,4

Vibrio percolans ('/:oo Verdünnung) Assay 23 mm

890 Assay, Einheiten/ml 103

Die 890A-Einheiten/ml werden bestimmt, wie in dem Teil mit der Überschrift «II. Untersuchungsverfahren für die Bestimmung von <890-Assay-Einheiten>» beschrieben.

Die gesamte Brühe wird in 200 ml Teilen in Polycarbonat-flaschen bei 9000 U/min während 15 min zentrifugiert; man erhält 1600 ml vereinigte überstehende Lösung mit einer Wirksamkeit von 104 Einheiten/ml. Dazu gibt man 0,5 ml 0,1 M neutrales EDTA.

Die zentrifugierte Brühe wird an «Dowex»-l x 2 (Cl-), 50 bis 100 mesh (0,297 bis 0,149 mm Öffnungen) Säule, Schichtdimensionen 3,8x22 cm, in einer Strömungsrate von 6 bis 20 ml/min adsorbiert. Die Säule wird mit 100 ml entionisiertem Wasser 5 gespült und mit 11 entionisiertem Wasser, das 50 g Natriumchlorid, 0,02 Mol tris-HCl-Puffer, pH 7,0, und 25 |i.Mol neutrales EDTA, in einer Strömunsrate von 6 ml/min eluiert. Es werden Fraktionen von 10 ml gesammelt.

Das Antibiotikum 890Ai tritt in den Fraktionen 13 bis 81 auf •o mit einem Maximum bei den Fraktionen 25 bis 33, was durch die erste Anwendung des Salzeluats hervorgerufen wird. Die Fraktionen 24 bis 41 mit den höchsten Biopotenz/A22o-Verhält-nissen werden für die weitere Verarbeitung vereinigt. Die vereinigten Fraktionen besitzen insgesamt 29 000 Einheiten oder 15 17% der angewendeten Bioaktivität.

Das «Dowex»-Eluat wird auf 10 ml konzentriert, d.er pH-Wert wird mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure auf 6,5 eingestellt und das Konzentrat wird auf eine Säule aus XAD-2, Schichtdimensionen 3,3x36 cm, gegeben, wobei das Harz 20 zuvor mit je 2160%igem wässrigem Aceton, entionisiertem Wasser und 5% (Gew./Vol.) Natriumchlorid in entionisiertem Wasser gewaschen wurde. Die Probe wird mit entionisiertem Wasser in einer Strömungsrate von 6 ml/min eluiert. Die Fraktionen von 40 bis 260 ml werden gesammelt. 25 Die antibiotische Aktivität tritt in den Fraktionen 6 bis 14 auf, was 220 bis 2560 ml des eluierten Volumens entspricht. Der Peak tritt bei den Fraktionen 9 und 10 auf und erstreckt sich von 370 bis 590 ml des eluierten Volumens. Die Fraktionen 9 bis 12, die 370 bis 1060 ml des eluierten Volumens entsprechen, 30 besitzen die höchsten HAEA3oo/A22o-Verhältnisse und werden für die weitere Verarbeitung vereinigt. Diese Fraktionen enthalten 36600 Einheiten; dies entspricht 126% der offensichtlich angewendeten Aktivität. ■' .

Die vereinigten Fraktionen 9 bis 12 werden auf 100 ml kon-35 zentriert, und das Konzentrat wird auf eine Säule aus _ _r-«Dowex»-l x4 (Cl"), minus 400 mesh (0,037 mm Öffnungen), Schichtdimensionen 2,2x41 cm, in einer Strömungsrate von 2 ml/min gegeben. Die Säule wird mit 50 ml entionisiertem Wasser gespült und mit 310,07 M NaCl + 0,005 M NH4C1 + 0,0001 40 M NH3 in entionisiertem Wasser in einer Rate von 2 ml/min eluiert. Die Fraktionen von 10,8 ml werden gesammelt, beginnend mit der ersten Anwendung des Eluierungsmittels.

Der Hauptpeak des Antibiotikums 890Ai tritt in den Fraktionen 181 bis 217 auf mit einem Maximum bei der Fraktion 45198. Die Fraktionen 186 bis 210, die insgesamt 114 Adsorptionseinheiten bei 300 nm enthalten, werden vereinigt.

Die vereinigten Fraktionen werden auf 4,0 ml konzentriert, und der pH-Wert wird durch Zugabe von 16 jxl IM NaOH auf 7,3 eingestellt. Das Konzentrat wird auf eine Säule aus «Bio-50 Gel» P-2,200 bis 400 mesh (0,074 bis 0,037 mm Öffnungen), Schichtdimensionen 2,15x70 cm, gegeben, mit 3x 1 ml Waschlösungen aus entionisiertem Wasser gewaschen und mit entionisiertem Wasser von 0,96 ml/min eluiert. Die Fraktionen von 3,85 ml werden gesammelt 55 Der Hauptpeak des Antibiotikums 890Ai tritt in den Fraktionen 24 bis 44 auf mit einem Maximum bei den Fraktionen 33 und 34. Die Fraktionen 27 bis 38 mit den höchsten A3O0/A24S-Verhältnissen werden für die Lyophilisierung vereinigt. Diese vereinigten Fraktionen besitzen insgesamt 72 A30o-Einheiten. 60 Zur Durchführung der Lyophilisierung werden die vereinigten Fraktionen auf 3,0 ml konzentriert, und der pH-Wert des Konzentrats wird durch Zugabe von 10 |il 0,1 M NaOH auf 7,5 eingestellt Die Probe wird in zwei Teile von je 1,50 ml geteilt, und die Teile werden getrennt schnell gefroren und aus 14 ml 65 Glasampullen mit Schraubverschluss lyophilisiert. Jede Probe enthält 1,73 mg 890Ai; dies entspricht 35,8 A3oo-Einheiten.

G