DE68918004T2 - Verfahren zur Analyse von Zellbestandteilen in einer Flüssigkeit. - Google Patents

Verfahren zur Analyse von Zellbestandteilen in einer Flüssigkeit.

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Description

    Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Multiparameteranalyse von zellulären Bestandteilen in einer Körperflüssigkeit, und insbesondere betrifft die Erfindung die Unterscheidung und quantitative Bestimmung von zellulären Bestandteilen in Blut oder abgesaugten Knochenmarksproben durch Analyse von fünf Parametern mittels Durchflußcytometrie.
    • Hintergrund der Erfindung
  • Zwei der wichtigsten Maße für den hämatologischen Status eines Individuums sind die Vollblutzahl und das Leukocytendifferential. Vollblutzahlen und Leukocytendifferentiale beinhalten die Unterscheidung und anschließende Zählung verschiedener zellulärer Bestandteile von Blut. Die verschiedenen Bestandteile von Blut, die in einer Probe vorhanden sein können, umfassen rote Blutzellen (RBC), Blutplättchen und Zellen mit Kern. In der letztgenannten Kategorie gibt es eine Anzahl verschiedener Typen von Leukocyten, die Lymphocyten (sowohl als B- als auch T-Zellen, natürliche Killerzellen ("NK"-Zellen) und verschiedene Untergruppen davon), Monocyten und Granulocyten (unter Einschluß von Neutrophilen, Eosinophilen und Basophilen in allen Reifungsstadien) umfassen. Aufgrund des weiten Bereichs möglicher Zelltypen und des Bereichs verschiedener Reifungsstadien für jeden Zelltyp beinhaltet die Bestimmung von Vollblutzahlen und Leukocytendifferentialen oftmals schwierige und komplexe Verfahren bei einem gesunden Menschen, sie ist jedoch schwieriger und komplexer bei einem anomalen Individuum. Diese Komplexität ist noch ausgeprägter, wenn die Analyse von Knochenmarksproben versucht wird.
  • Traditionell sind Vollblutzahlen (d.h. die Anzahl der Zellen pro Standardeinheit des Volumens) und Leukocytendifferentiale (d.h. die Anzahl der Zellen eines gegebenen Typs pro Standardeinheit des Volumens) manuell durch Zählen eines kleinen Volumens an Zellen unter Verwendung eines Lichtmikroskops und anschließendes Multiplizieren der festgestellten Anzahl mit einem Faktor, um dem Volumen Rechnung zu tragen, bestimmt worden. Sowohl aufgrund der vermessenen Probengröße als auch des Grads der Fertigkeit, der erforderlich ist, um verschiedene Zelltypen zu unterscheiden, kann durch dieses Verfahren ein hoher und oftmals nicht akzeptabler Grad an Variabilität eingeführt werden.
  • In neuerer Zeit sind Vorrichtungen angegeben worden, um Vollblutzahlen oder Leukocytendifferentiale zu erhalten, ohne auf eine manuelle mikroskopische Untersuchung zurückzugreifen. Derzeit verfügbare Vorrichtungen weisen Zellen entweder elektronisch durch eine Öffnungsimpedanz (z.B. Coulter Counter , beschrieben in Coulter, Proc. Nat. Electronics Conf., Bd. 12 (1956), 5. 1034) oder optisch durch Lichtstreuung und Absorption (z.B. Technicon H-6000 , beschrieben in Breakell et al., Blood Cells, Bd. 11 (1985), 5. 257) nach. Bei diesen Vorrichtungen muß die Fraktion mit roten Blutzellen von den Leukocyten getrennt werden, und jede Messung wird unabhängig von der anderen durchgeführt. Dies muß geschehen, da RBC bei einem normalen Patienten die Leukocyten um mindestens 1000:1 übertreffen. Bei einem anomalen Patienten (z.B. einem Leukopeniepatienten) kann dieses Verhältnis wesentlich höher sein.
  • Es gibt auch weitere Einrichtungen, um Leukocytendifferentiale zu erhalten. Durchflußcytometer, die allgemein in den US-Patenten 4 661 913 4 284 412 und 3 826 364 und in einem Artikel von Herzenberg et al., Sci. Am., Bd. 234 (l976), S. 108, beschrieben werden, werden verwendet, um verschiedene Populationen an Leukocyten in einer heterogenen Probe durch Nachweis mehrerer unabhängiger Parameter für einzelne Zellen, die durch den Nachweisbereich treten, zu identifizieren. Typischerweise umfassen diese Parameter die Lichtstreuung in Vorwärtsrichtung (FLS; sie ist ein Maß für die relative Teilchengröße), die orthogonale Lichtstreuung (OLS; sie ist ein Maß für die relative Granularität) und die Fluoreszenz. Fluoreszenz kann für Zellen gemessen werden, die einen Nucleinsäurefarbstoff enthalten, oder sie kann für Zellen gemessen werden, die Oberflächenmarker tragen, die mit monoklonalen Antikörpern (MAb), die direkt oder indirekt an Fluorochrome konjugiert sind, markiert sind, wie es z.B. im US- Patent 4 520 110 beschrieben ist. Getrennte Kanäle innerhalb des Durchflußcytometers führen jede der verschiedenen Zellmessungen durch und zeichnen sie auf. Durch Kombination und Vergleich dieser Parameter können die verschiedenen Leukocytenkomponenten unterschieden werden. US-Patent 4 727 020 stellt ein Beispiel bereit, wie ein Durchflußcytometer bei diesem Verfahren verwendet werden kann, um Leukocytendifferentiale von Blut zu erhalten. Dieser Ansatz ist jedoch auf Leukocytendifferentiale und nur diejenigen, die von Blut erhalten werden, beschränkt.
  • Die Charakterisierung von Leukocyten durch Durchflußcytometriesysteme ist in einem Übersichtsartikel über Durchflußcytometrie von Steinkamp in Review in Scientific Instruments, Bd. 55 (1984), S. 1375, enthalten.
  • Zusammengenommen steht derzeit keine einzelne, standardisierte und genaue Vorrichtung oder Methode zur Verfügung, die es erlaubt, eine einzige Probe von Blut oder Knochenmark zu analysieren, so daß alle verschiedenen Zelltypen, die in Blut und Knochenmark vorhanden sind, unterschieden und anschließend gezählt werden.
    • Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung umfaBt ein Verfahren zur gleichzeitigen Multiparameteranalyse von Zellen in einer Körperflüssigkeit, wobei die Flüssigkeit Spinalflüssigkeit, peritoneale Flüssigkeit oder Gehirnflüssigkeit, Urin oder Vollblut umfaßt und außerdem Gewebezellsuspensionen umfassen kann, wobei das Gewebe abgesaugtes Knochenmark, Lymphknoten, Milz- oder Leberzellen, wie von einer Biopsie, umfaßt, und wobei die Parameter mindestens zwei Maße für die Lichtstreuung und mindestens drei Maße für die Fluoreszenzemission oder Fluoreszenzaktivität von jeder untersuchten Zelle umfassen. Das Verfahren umfaßt die Stufen der Entnahme einer Probe einer Flüssigkeit, die von einem Individuum stammt, das Mischen der Flüssigkeitsprobe mit mindestens zwei Farbstoffen und mit mindestens einem markierten Zelloberflächenmarker, wobei die Farbstoffe unabhängig verschiedene Merkmale der Zellen in der Probe feststellen und wobei der Marker ein Antigen erkennt, das in verschiedener Weise auf Zellen verschiedener Abstammung exprimiert wird, um eine markierte Lösung zu bilden. Jeder der Farbstoffe und die Markierung sind fluoreszierend und weisen eine maximale spektrale Emission auf, die von den anderen unterscheidbar ist. Die markierte Lösung wird anschließend durch ein Nachweisinstrument geleitet, worin jede Zelle in der Lösung im wesentlichen eine nach der anderen untersucht wird, und Messungen der Fluoreszenzintensität und der Lichtstreuung werden für jede untersuchte Zelle durchgeführt. Die Maße (oder-Parameter), die für jede Zelle festgestellt wurden, können in einem Datenspeicher- und Analysesystem gespeichert und rekombiniert und in Echtzeit oder zu einer späteren Zeit analysiert werden. Durch Analyse dieser verschiedenen Parameter können die Typen und Abstammungen der Zellen, die Blut- und Knochenmarksproben ausmachen, unterschieden und identifiziert werden.
  • Genauer gesagt umfaßt das bevorzugte Verfahren die Stufen der Entnahme einer Körperflüssigkeitsprobe, die von einem Individuum stammt, das Mischen der Flüssigkeitsprobe mit Nucleinsäurefarbstoffen, wie einem RNA- Farbstoff und einem DNA-Farbstoff, und mit einem markierten monoklonalen Antikörper (MAb), der ein Zelloberflächenantigen erkennt, das in unterschiedlicher Weise bei Zellen verschiedener Abstammung exprimiert wird, um eine markierte Lösung zu bilden; des Durchleitens der markierten Lösung durch ein Durchflußcytometer; der Messung von Fluoreszenzintensität, OLS und FLS; und des Speicherns der für eine Analyse aufgezeichneten Daten. Jeder der Bestandteile Nucleinsäurefarbstoffe und Immunmarkierung ist fluoreszierend, ist bei der gleichen Wellenlänge anregbar und weist eine maximale spektrale Emission auf, die von der der anderen Komponenten unterscheidbar ist.
  • Ein Reagenzsatz, der die Nucleinsäurefarbstoffe und die markierten Zelloberflächenmarker, die sich für die vorliegende Erfindung eignen, enthält, gehört ebenfalls zum Schutzumfang der vorliegenden Erfindung.
    • Kurze Beschreibung der Zeichnung
  • Alle sechs Figuren stellen logarithmische Punktgraphiken dar, die etwa 22 000 Zellen aus einer Flüssigkeitsprobe enthalten, die mit den Nucleinsäurefarbstoffen LDS-751 und Thiazol-Orange und mit einem CD45 MAb, wie HLe-1(PE), markiert wurde. Markierte Zellen wurden mit einem FACScan .Durchflußcytometer analysiert, das mit einem einzelnen Argonlaser, der auf 488 nm eingestellt war, versehen war (Becton Dickinson Immunocytometry Systems (oder BDIS)), analysiert, und Messungen von OLS und FLS und der Fluoreszenzintensität wurden für jede Zelle durchgeführt. Die Datensammlung der fünf digitalisierten und in einem Listenformat gespeicherten Parameter wurde unter Verwendung eines Consort 30-Computers (BDIS) durchgeführt. Datenanalysen und Ausdrucke wurden unter Verwendung der Paint-A-Gate -Software (BDIS) durchgeführt.
  • Fig. 1 umfaßt mehrere Punktgraphiken von Zellen aus einer Probe von normalem peripherem Blut, die durch verschiedene Kombinationen der fünf Parameter analysiert wurde;
  • Fig. 2 umfaßt mehrere Punktgraphiken nur der Zellen mit Kern der in Fig. 1 analysierten und auf LDS-751 und Thiazol-Orange-Fluoreszenz (Fig. 1b) eingestellten ("gated on") Blutprobe;
  • Fig. 3 umfaßt mehrere Punktgraphiken von Zellen aus einer abgesaugten Probe von normalem Knochenmark, die durch verschiedene Kombinationen der fünf Parameter wie in Fig. 1 analysiert wurden;
  • Fig. 4 umfaßt mehrere Punktgraphiken nur der Zellen mit Kern der in Fig. 3 analysierten und auf LDS-751 und Thiazol-Orange-Fluoreszenz eingestellten Knochenmarksprobe.
  • Fig. 5 umfaßt mehrere Punktgraphiken von peripheren Blutzellen aus einem Patienten mit Thrombocytopenie B-CLL, die durch verschiedene Kombinationen der fünf Parameter wie in Fig. 1 analysiert wurden;
  • Fig. 6 umfaßt mehrere Punktgraphiken nur der Zellen mit Kern aus der in Fig. 5 analysierten und auf LDS-751 und Thiazol-Orange-Fluoreszenz wie in Fig. 4 analysierten Blutprobe.
    • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung umfaßt ein Verfahren zur gleichzeitigen Multiparameteranalyse von Zellen in einer Körperflüssigkeit, wobei die Flüssigkeit Spinalflüssigkeit, peritoneale Flüssigkeit oder Gehirnflüssigkeit, Urin oder Vollblut umfaßt und zusätzlich Gewebezellsuspensionen umfassen kann, wobei die Zellsuspensionen aus Proben von abgesaugtem Knochenmark, Leber, Milz oder Lymphknoten, wie in Form einer Biopsie, hergestellt werden, und wobei die Parameter mindestens zwei Maße für das Licht, das in mehr als einer Richtung von jeder untersuchten Zelle gestreut wird, und mindestens drei Maße für die Fluoreszenzaktivität von jeder untersuchten Zelle umfassen. Das Verfahren umfaßt die Stufen der Entnahme einer Probe von Körperflüssigkeit von einem Individuum, des Mischens der Flüssigkeitsprobe mit mindestens zwei Farbstoffen und mit mindestens einem markierten Zelloberflächenmarker, wobei jeder der Farbstoffe unabhängig verschiedene Merkmale der Zellen in der Probe feststellt, und wobei der Marker ein Antigen erkennt, das in unterschiedlicher Weise bei Zellen verschiedener Abstammung exprimiert wird, um eine markierte Lösung zu bilden. Jede der Komponenten Farbstoffe und Markierung ist fluoreszierend und weist eine maximale spektrale Emission auf, die von den anderen Komponenten unterscheidbar ist. Die markierte Lösung wird anschließend durch ein Nachweisinstrument geleitet, wobei die einzelnen Zellen in der Lösung im wesentlichen nacheinander untersucht werden und Messungen der Fluoreszenzintensität und der Lichtstreuung für jede untersuchte Zelle durchgeführt werden. Die Messungen (oder Parameter), die für jede Zelle durchgeführt werden, können in einer Datenspeicherungseinrichtung gespeichert und in Echtzeit oder zu einer späteren Zeit rekombiniert und erneut analysiert werden.
  • Die vorliegende Erfindung erlaubt die Unterscheidung und Identifizierung von Zellen in einer Flüssigkeitsprobe durch Analyse von mindestens 5 Parametern. Wünschenswerterweise umfaßt das erfindungsgemäße Verfahren folgende Stufen: 1) Entnahme einer Zellen enthaltenden Flüssigkeitsprobe, die von einem Individuum stammt, wobei die Flüssigkeitsprobe vorzugsweise entweder Vollblut oder abgesaugtes Knochenmark umfaßt; 2) Zugabe von zwei fluoreszierenden Nucleinsäurefarbstoffen zu der Probe, um in unterschiedlicher Weise DNA und RNA in den einzelnen Zellen zu markieren, wobei jeder Farbstoff eine maximale spektrale Fluoreszenzemission aufweist, die von dem anderen Farbstoff verschieden ist; 3) Zugabe eines fluoreszierend markierten Zelloberflächenmarkers zu der Probe, wobei der Marker ein Antigen erkennt, das in unterschiedlicher Weise auf Zellen in der Flüssigkeit exprimiert wird, und wobei die fluoreszierende Immunmarkierung eine maximale spektrale Emission aufweist, die von der der fluoreszierenden Farbstoffe verschieden ist; und 4) Analyse der Zellen in der Probe in einem Automaten, der imstande ist, sowohl die Fluoreszenz der einzelnen Zellen bei oder nahe der maximalen spektralen Emission als auch die OLS- und FLS-Werte der einzelnen Zellen festzustellen und aufzuzeichnen.
  • Gemäß der bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Nachweisinstrument um ein Durchflußcytometer, wie FACScan (BDIS). Vorzugsweise ist das Durchflußcytometer mit einem einzigen Laser zur Anregung der fluoreszierend markierten Zellen, wie einem Argonionenlaser, ausgerüstet, der auf 488 nm oder einen Wert nahe 488 nm eingestellt ist. Die fluoreszierenden Nucleinsäurefarbstoffe und die fluoreszierende Markierung müssen daher bei 488 nm anregbar sein. Vorzugsweise wird 2-(2-[4- (Dimethylamino)-phenyl]-ethenyl-1-ethylchinoliniumiodid (LDS -751 (Exciton)) als DNA-Farbstoff und 1-Methyl-4-([3-methyl-2(3H)-benzothiazolyliden]-methyl)-chinolinium-4-methylbenzolsulfonat (Thiazol-Orange (BDIS)) als RNA-Farbstoff verwendet. LDS-751 weist eine maximale spektrale Emission bei 670 nm auf, und Thiazol-Orange weist eine maximale spektrale Emission bei 530 nm auf. Weitere fluoreszierende Nucleinsäurefarbstoffe, die für die Durchführung der vorliegenden Erfindung geeignet sein können, umfassen die Farbstoffe, die im US-Patent 4 544 546 beschrieben sind.
  • Der Fachmann erkennt, daß die fluoreszierenden Farbstoffe und/oder die fluoreszierende Markierung bei verschiedenen Wellenlängen angeregt werden können, wenn das Durchflußcytometer mit mehr als einem Laser ausgestattet ist. Gemäß einer derartigen Ausführungsform besteht die einzige Anforderung darin, daß die maximalen spektralen Emissionen der Farbstoffe und der fluoreszierenden Immunmarkierung sich alle voneinander unterscheiden. Durchflußcytometer, die mit Helium/Neon- und Argonionenlasern ausgestattet und auf 633 nm bzw. 488 nm eingestellt sind, umfassen FACStar Plus (BDIS).
  • Ebenfalls gemäß einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Zelloberflächenmarker um einen monoklonalen Antikörper, der selektiv an ein Zelloberflächenantigen bindet, das in unterschiedlicher Weise auf der Oberfläche von Zellen des blutbildenden Systems exprimiert wird. Wünschenswerterweise wird das Antigen in unterschiedlichen Mengen von verschiedenen Typen und Reifungsstadien von Zellen mit Kern exprimiert. Ein derartiges Antigen ist CD45. Dieses Antigen weist ein Molekulargewicht von ungefähr 180 bis 220 kD auf und wird in verschiedenen Graden auf allen Lymphocyten, Monocyten und Granulocyten exprimiert, fehlt jedoch bei reifen Blutplättchen oder RBC. Monoklonale Antikörper, die spezifisch mit dem CD45-Antigen reagieren (d.h. CD45 MAb), umfassen HLe-1 (auch als Antileukocyt bezeichnet; BDIS) und LCA (Dako Corp.). Vorzugsweise wird HLe-1 verwendet.
  • Der CD45 MAb wird direkt an eine fluoreszierende Markierung, wie ein Fluorochrom, angeheftet. Bei diesem direkten Verfahren wird der MAb direkt mit einer fluoreszierenden Markierung gemäß dem Fachmann bekannten Verfahren konjugiert. US-Patent 4 520 110 stellt ein Verfahren zur Konjugation einer fluoreszierenden Markierung mit einem MAb bereit.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den Fluorochrom um ein Phycobiliprotein, wie Phycoerythrin (PE), das bei 488 nm angeregt werden kann und ein Emissionsmaxium bei 575 nm aufweist. Die Kombination von HLe-1 und PE wird im allgemeinen als HLe-1(PE) bezeichnet.
  • Weitere Fluorochrome können erfindungsgemäß ebenfalls verwendet werden. Die einzigen Anforderungen bestehen darin, daß die Fluorochrome bei 488 nm angeregt werden können, wenn ein Argonlaser verwendet wird, oder bei einer anderen Wellenlänge, wenn eine doppelte Laserquelle verwendet wird (z.B. 633 nm für einen He/Ne-Laser), und daß das Fluorochrom eine maximale spektrale Emission aufweist, die nicht mit der der Nucleinsäurefarbstoffe überlappt.
  • Ferner ist es günstig, wenn das Durchflußcytometer mit einer Einrichtung zur Aufzeichnung und Analyse der für jede einzelne Zelle gesammelten Daten gekoppelt ist. Einrichtungen zur Aufzeichnung und Analyse der Daten können einen Personalcomputer, der mit einer geeigneten Software ausgestattet ist, umfassen. Die Software sollte imstande sein, mindestens 5 Parameter für jede Zelle zu analysieren, zwischen Populationen von gleichen Zellen in einem fünf-dimensionalen Raum zu unterscheiden oder solche Populationen zu identifizieren und mindestens zwei der Parameter in zwei Dimensionen graphisch darzustellen. Darüber hinaus sollte die Software imstande sein, eine Einstellung auf einen oder mehrere Parameter vorzunehmen und die Kombination der anderen Parameter in zwei Dimensionen darzustellen.
  • Gemäß einer bevorzugte Ausführungsform wird die Paint-A-Gate -Software (BDIS) in Verbindung mit einem Consort 30-Datenspeicherungs- und - analysesystem (BDIS) verwendet. Die Software wird vollständig im US-Patent 4 855 653 der gleichen Anmelderin beschrieben.
  • Zusätzlich zu dem hier beschriebenen Verfahren umfaßt die vorliegende Erfindung auch einen Reagenzsatz für die Multiparameteranalyse von Zellen in einer Körperflüssigkeit. Der Reagenzsatz umfaßt einen ersten Behälter, der mindestens zwei Nucleinsäurefarbstoffe enthält, um DNA und RNA in jeder Zelle zu markieren, wobei die Farbstoffe maximale spektrale Emissionen aufweisen, die von denen der anderen unterscheidbar sind, und einen zweiten Behälter, der einen fluoreszierend markierten Zelloberflächenmarker enthält, wobei der Zelloberflächenmarker spezifisch mit einem Zelloberflächenantigen reagiert, das in unterschiedlicher Weise auf unterschiedlichen Zellen, die die Probe ausmachen, exprimiert wird. Wünschenswerterweise handelt es sich bei den Farbstoffen um Nucleinsäurefarbstoffe, die in unterschiedlicher Weise DNA und RNA markieren. Gemäß der bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den Nucleinsäurefarbstoffen um LDS-751 und Thiazol-Orange, und bei dem fluoreszierend markierten Zelloberflächenmarker handelt es sich um HLe-1(PE). Der Fachmann erkennt, daß andere der hier beschriebenen Kombinationen von Nucleinsäurefarbstoff und/oder Zelloberflächenmarker im Reagenzsatz enthalten sein können. In entsprechender Weise erkennt der Fachmann, daß die Nucleinsäurefarbstoffe und/oder Zelloberflächenmarker getrennt in den Behältern enthalten sein können.
    • Beispiele
  • Peripheres Blut von normalen Freiwilligen wurde durch Venenpunktion in Vacutainer -Röhrchen mit einem Gehalt an EDTA(k&sub3;) als Antikoagulanz (Becton Dickinson) gesammelt. Blut wurde auch von einem Patienten mit chronischer lymphocytischer B-Zellen-Leukämie (B-CLL), der gemäß RAI als Stadium IV eingestuft wurde, gesammelt. Blutzellzahlen, die mit einem automatischen Blutzellenanalysator (H1, Technicon) bestimmt wurden, waren: RBC: 3,3 x 10&sup9;/ml; Leukocyten: 8l,9 x 10&sup6;/ml; und Blutplättchen 35 x 10&sup6;/ml, korrigiert nach manuellem Zählen auf 20 x 10&sup6;/ml. Abgesaugte Knochenmarksproben wurden von normalen Freiwilligen erhalten. Die abgesaugten Proben wurden in Vacutainer -Röhrchen überführt und 1:1 mit RPMI 1640 (GIBCO) verdünnt.
  • Für jeden Test wurden 10 ul einer Blut- oder Knochenmarksprobe verwendet. Die Proben wurden 30 Minuten mit 10 ul einer LDS-751-Lösung (0,1 mg in 5 ml PBS), 10 ul einer Thiazol-Orange-Lösung (0,1 mg in 1 ml PBS) und 10 ul HLe-1(PE) inkubiert. Die Probe wurde mit 1 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) vor der Messung verdünnt.
  • Eine spektrale Kompensation wurde herangezogen, um die PE-Emission die den LDS-751-Kanal erreichte (5 % Subtraktion), die LDS-751-Emission, die den PE-Kanal erreichte (11 % Subtraktion), die PE-Emission, die den Thiazol-Orange-Kanal erreichte (23 % Subtraktion), und die Thiazol-Orange-Emission, die den PE-Kanal erreichte (0,4 % Subtraktion), zu korrigieren. Zwischen den Thiazol-Orange- und LDS-751-Kanälen war keine Kompensation erforderlich.
  • Durchflußcytometrische Messungen wurden mit einem FACScanF-Durch. flußcytometer durchgeführt, das mit einem einzigen Argonionenlaser ausgestattet war. Die Datensammlung für die fünf digitalisierten und in einem Listenformat gespeicherten Parameter wurde mit FACScan -Forschungssoftware unter Verwendung eines Consort 30 -Computers durchgeführt. Für jede Probe wurden 22 000 Zellen analysiert.
  • Zur Unterscheidung zwischen den Zellen mit Kern wurde die Datensammlung durchgeführt, während auf die Fluoreszenzintensität von LDS- 751 und Thiazol-Orange eingestellt wurde. Die Datenanalyse wurde unter Verwendung des Paint-A-Gate -Softwareprogramms durchgeführt, das eine Visualisierung von Multiparameterdaten erlaubt.
  • Der Fachmann erkennt, daß die Analyse einer Probe in zwei getrennten Verfahren durchgeführt werden kann. Zuerst wird eine geteilte Probe der Körperflüssigkeit entnommen, ein Teil oder mehrere Teile werden wie vorstehend verdünnt und ein Teil wird nicht verdünnt oder in geringerem Maße verdünnt. Anschließend wird das vorstehend beschriebene Verfahren unter Verwendung von einem Teil der Probe durchgeführt, um RBC, Blutplättchen und Reticulocyten zu identifizieren und zu unterscheiden, während auf die Zellen mit Kern eingestellt wird, diese aber nicht gezählt werden. Das Verfahren wird auch durchgeführt, um die Zellen mit Kern zu identifizieren und zu unterscheiden, während auf die Zellen ohne Kern eingestellt wird, diese aber nicht gezählt werden. Das Aufteilen der Probe und die Untersuchung der Zellen mit Kern in einem weniger verdünnten Format ermöglicht es, daß die vergleichsweise selteneren Zellen mit Kern in der Probe auf raschere Weise gezählt werden.
  • Das Sortieren der Zellen wurde mit einer Vorrichtung FACS 440 durchgeführt, die angepaßt wurde, um zwei Lichtstreusignale und drei Fluoreszenzsignale unter Verwendung eines einzigen Argonionenlasers, der auf 488 nm eingestellt war, nachzuweisen. Die Zellen wurden in RPMI 1640 mit einem Gehalt an 10 % fötalem Kälberserum (FCS) sortiert. Die sortierten Zellen wurden 5 Minuten bei 200 g zentrifugiert und in 100 ul RPMI mit einem Gehalt an 10 % FCS resuspendiert. Präparate für die mikroskopische Untersuchung wurden unter Verwendung einer Shandon-Cytocentrifuge (Southern Product Ltd., England) hergestellt. Die Objektträger wurden mit "Wright Stain" angefärbt und mit einem Lichtmikroskop untersucht. Zur Identifizierung von Reticulocyten wurden 100 ul 1 % neuer Methylenblau-Lösung zu den resuspendierten sortierten Zellen gegeben. Die Zellen wurden auf einen Objektträger übertragen, abgedeckt und mit einem Lichtmikroskop untersucht.
  • Die Analyse der Dateien mit den fünf Parametern im Listenformat wurde mit einem Computerprogramm durchgeführt, bei dem Farben herangezogen wurden, um Cluster von Punkten in mehreren Dimensionen zu identifizieren. Verschiedene Kombinationen der fünf Parameter wurden zeitgleich dargestellt. Clustern von Zellen, die durch eine Kombination von Parametern identifiziert wurden, wurde eine Farbe gegeben, die dann gleichzeitig in den anderen Projektionen der Daten erschien. Die identifizierten Zellcluster sind in den beigefügten Schwarz-Weiß-Figuren auf der Grundlage der Farbe in den Originalen markiert.
  • Man erhält einen weiten Bereich von Lichtstreusignalen von nichtlysierten Blutproben als Folge des Vorhandenseins von kleinen Blutplättchen (1 bis 4 um), Erythrocyten (6 bis 8 um) und größeren Leukocyten (6 bis 20 um). Um den gesamten Bereich der Lichtstreusignale zu bewerten, wurden die Lichtstreusignale in Vorwärtsrichtung und die orthogonalen Lichtstreusignale unter Verwendung von logarithmischen Vier-Zehnerpotenzen-Verstärkern gesammelt. Unter diesen Bedingungen wurden zwei hauptsächliche Populationen von Zellen in Vollblut identifiziert (vgl. Fig. 1a). Eine weitere Unterscheidung zwischen den Zellpopulationen erforderte zusätzliche Parameter.
  • Thiazol-Orange weist eine höhere Affinität zu RNA oder eine Bevorzugung von RNA im Vergleich mit DNA auf und unterliegt einer Fluoreszenzverstärkung bei der Bindung. Die maximale Emission des gebundenen Farbstoffs tritt bei 530 nm auf. Im Gegensatz dazu weist LDS-751 eine höhere Affinität zu DNA oder eine Bevorzugung von DNA im Vergleich mit RNA auf.
  • Dieser Farbstoff unterliegt ebenfalls einer Fluoreszenzverstärkung bei der Bindung, die maximale Emission tritt jedoch bei 670 nm auf. Obwohl erkannt wird, daß Blutplättchen keinen Kern aufweisen, färbt LDS-751 selektiv derartige Zellen. Es ist daher zu erwarten, daß von LDS-751 verschiedene Farbstoffe ebenfalls selektiv an Blutplättchen und andere Zellen mit Kern binden, wodurch Blutplättchen sich von RBC ohne Kern unterscheiden.
  • Thiazol-Orange und LDS-751 in Kombination führen zu einer deutlichen Trennung zwischen Erythrocyten, denen sowohl RNA als auch DNA fehlt, und Leukocyten mit Kern, die beide Nucleinsäuren aufweisen. In Fig. 1b sind die Erythrocyten und die Leukocyten (in der rechten oberen Ecke) hinsichtlich ihrer Fluoreszenzsignale durch fast drei Größenordnungen getrennt. Es wurde keine signifikante Störung zwischen diesen Farbstoffen für Zellen mit Kern beobachtet.
  • Obwohl Thiazol-Orange und LDS-751 zur Unterscheidung zwischen Erythrocyten, Reticulocyten und Blutplättchen verwendet werden können, gab es eine Wechselwirkung zwischen diesen Farbstoffen, die sowohl bei Blutplättchen als auch bei Reticulocyten beobachtet wurde. Für Blutplättchen beeinflußte die Reihenfolge, in der diese Farbstoffe zugegeben wurden, die Fluoreszenzintensität. Die Zugabe von LDS-751 vor oder zusammen mit Thiazol-Orange hemmte das Anfärben der Blutplättchen mit Thiazol-Orange. Die Blutplättchen wurden mit Thiazol-Orange nur angefärbt, wenn der Farbstoff allein zugegeben wurde oder wenn er vor der Zugabe von LDS-751 zugegeben wurde. Unter den Reticulocyten war die Fluoreszenzintensität mit Thiazol-Orange etwas geringer als bei Vorhandensein von LDS-751. Durch gleichzeitiges Inkubieren der Proben mit Thiazol-Orange und LDS-751 wurde die maximale Trennung zwischen Blutplättchen und Reticulocyten erzielt, während eine gute Trennung dieser Populationen im Hinblick auf die Erythrocyten erhalten blieb.
  • Die Trennung der Emissionsspektren zwischen Thiazol-Orange und LDS- 751 erlaubte es, die Bindung eines MAb, der mit PE konjugiert war, gleichzeitig zu bewerten. CD45 wurde ausgewählt, da gezeigt worden war, daß das Antigen, das durch diesen Antikörper erkannt wird, in verschiedenen Dichten auf Zellen verschiedener Abstammung auftrat. Die Kombination der Immunfluoreszenzintensität mit der Lichtstreuung in Vorwärtsrichtung und der orthogonalen Lichtstreuung erlaubte eine gründliche Differentialanalyse der Zellen mit Kern, wie es in den nachstehenden Abschnitten beschrieben wird.
    • I. Differentialanalyse von normalen Blutzellen
  • Peripheres Blut wurde mit LDS-751, Thiazol-Orange und HLe-1(PE) inkubiert. Das Blutpräparat wurde im Verhältnis 1:100 mit PBS vor der Messung verdünnt.
  • Im Hinblick auf die Komplexität der Daten wird die Identifizierung der verschiedenen Blutzellpopulationen getrennt beschrieben. Die Identität der Zellsubpopulationen, auf die Bezug genommen wird, wurde durch mikroskopische Untersuchung der sortierten Zellen bestätigt. Die Reinheit der sortierten Zellfraktionen war größer als 90 %, wobei es sich bei der Mehrzahl der kontaminierenden Zellen um Erythrocyten handelte. Die hohe Häufigkeit der Erythrocyten erlaubte es ihnen, zusammen mit der eingestellten Zellpopulation als Folge der Einstellung des Schwellenwerts während des Sortierens der Leukocytenpopulationen abgelenkt zu werden.
  • Die vorherrschende Zellpopulation im Blut besteht aus reifen Erythrocyten (RBC). RBC wurden durch ihre vergleichsweise großen Lichts treusignale in Vorwärtsrichtung und ihre vergleichsweise großen orthogonalen Lichtstreusignale, das Fehlen der Fluoreszenz mit LDS-751 und Thiazol-Orange (Fig. 1b) und das Fehlen einer anti-CD45-Bindung (Fig. 1c, d) identifiziert.
  • Die Reticulocyten ("Ret") wurden von den reifen Erythrocyten hauptsächlich durch ihre Reaktivität gegenüber Thiazol-Orange unterschieden (Fig. 1b). Die Reticulocyten weisen eine geringfügig verstärkte Fluoreszenzintensität mit LDS-751 im Vergleich zu Erythrocyten auf. Weder RBC noch Reticulocyten exprimieren Oberflächenantigene, die von CD45 erkannt werden (Fig. 1c, d). Die Reticulocyten konnten von den Leukocyten und den RBC nicht auf der Grundlage ihrer Lichtstreucharakteristiken unterschieden werden (Fig. 1a).
  • Rote Blutzellen mit Kern, die normalerweise nicht in peripherem Blut gefunden werden, werden später als Teil der Analyse von Knochenmark erörtert.
  • Blutplättchen ("P") wurden durch ihre vergleichsweise geringe Lichtstreuung in Vorwärtsrichtung und ihre vergleichsweise geringe orthogonale Lichtstreuung (Fig. 1a) sowie ihre Anfärbung mit LDS-751 (Fig. 1b) charakterisiert. Die Blutplättchen waren klar von den RBC, den Reticulocyten und den Leukocyten ("L") (Fig. 1b) unter Verwendung dieser drei Parameter getrennt. Wie die Erythroidzellen exprimieren auch die Blutplättchen nicht die Antigene, die von CD45 (Fig. 1c, d) erkannt werden. Unter Verwendung der Multiparameteranalyse können "normale" Blutplättchen als Teilchen mit vergleichsweise geringen Lichtstreusignalen, mit einer größeren Fluoreszenzintensität mit LDS-751 als RBC, ohne Reaktivität gegenüber Thiazol-Orange und mit fehlender CD45-Bindung charakterisiert werden.
  • Leukocyten werden durch eine vergleichsweise große Lichtstreuung in Vorwärtsrichtung und eine vergleichsweise große orthogonale Lichtstreuung charakterisiert (Fig. 1a). Obwohl ihre Lichtstreucharakteristiken ähnlich waren, waren Leukocyten klar von Erythroidzellen durch ihre großen Fluoreszenzsignale, die sowohl mit LDS-751 als mit Thiazol-Orange erzeugt wurden, getrennt (Fig. 1b). Diese Auflösung stellt ein genaues Mittel zur Zählung weißer Blutzellen in Gegenwart der überwiegenden Anzahl an RBC dar. Eine weitere Unterscheidung der Leukocyten von Blutplättchen, RBC und Reticulocyten wurde durch ihre Reaktivität gegenüber CD45 erreicht (Fig. 1c, d).
  • Um die Zellen mit Kern ausführlicher zu analysieren, wurde ein Gate auf Thiazol-Orange und LDS-751 eingestellt, wie es in Fig. 1b gezeigt ist. Ein Leukocytendifferential wurde durch Korrelation der Lichtstreueigenschaften der Zellen mit Kern mit der Fluoreszenzintensität von CD45 erhalten (vgl. Fig. 2a). Lymphocyten ("Lym") wurden durch die klarste Expression des CD45-Antigens und die niedrigsten orthogonalen Lichtstreusignale charakterisiert. Monocyten ("M") wurden identifiziert, da sie geringfügig weniger CD45 als Lymphocyten binden, jedoch ein größeres Lichtstreusignal in Vorwärtsrichtung und ein größeres orthogonales Lichtstreusignal zeigten. Neutrophile Granulocyten ("N") exprimierten schwach das CD45-Antigen und wiesen große Lichtstreusignale auf. Eosinophile Granulocyten ("Eo") banden die gleiche Menge an CD45 wie Monocyten, sie konnten jedoch von diesen Zellen durch das größere orthogonale Lichtstreusignal und das niedrigere Lichtstreusignal in Vorwärtsrichtung unterschieden werden.
    • II. Differentialanalyse von normalen Knochenmarkszellen
  • Die fünfdimensionale Analyse, die für Blut herangezogen wurde, wurde auch auf die quantitative Charakterisierung von Knochenmark angewandt. Abgesaugtes Knochenmark wurde mit LDS-751, Thiazol-Orange und HLe- 1(PE), die auch für peripheres Blut verwendet worden waren, inkubiert. Die Datensammlung wurde mit den gleichen Einstellungen des Instruments, die für die Analyse von peripherem Blut verwendet worden waren, durchgeführt. Ein typischer Versuch (unter Verwendung der gleichen Anzeigevorrichtung, wie sie bei der Analyse von peripherem Blut verwendet worden war) ist in Fig. 3 gezeigt. RBC, Reticulocyten, Blutplättchen und Zellen mit Kern nahmen ähnliche Orte im fünfdimensionalen Raum wie ihre Gegenstücke aus peripherem Blut ein (vgl. Fig. 1 und 3).
  • Es gab interessante Unterschiede zwischen den Blutpopulationen und den Knochenmarkspopulationen. Bei der Analyse der Blutplättchen wurde der Lichtstreubereich, der für diese zellulären Teilchen typisch ist, in Fig. 3 gekennzeichnet, wie es auch bei der Analyse der Blutprobe (Fig. 1) geschah. Im Gegensatz zu peripherem Blut wurde der größte Teil dieser Ereignisse aus Knochenmark nicht mit LDS-751 angefärbt. Daher wurden diese Ereignisse nicht als normale Blutplättchen identifiziert. Das Zellsortieren dieser Population zeigte hauptsächlich Bruchstücke unter Einschluß von Knochenmarks-Spicula und zellulären Teilchen, die nicht identifiziert wurden.
  • Knochenmarkszellen mit Kern wurden durch ihre großen Fluoreszenzsignale sowohl mit LDS-751 als auch mit Thiazol-Orange identifiziert (Fig. 3b). Ein Gate wurde auf die LDS-751- und die Thiazol-Orange-Intensität eingestellt, wie es in Fig. 3b gezeigt ist, um mehr Ereignisse von Zellen mit Kern zu sammeln. Die Lichtstreueigenschaften und ihre Korrelation mit den Immunfluoreszenzsignalen mit CD45 für diese Zellen mit Kern sind in Fig. 4 gezeigt.
  • Für drei verschiedene abgesaugte Knochenmarksproben wurden differentielle morphologische Zählungen der Zellen mit Kern, die gemäß der orthogonalen Lichtstreuung und der CD45-Expression sortiert wurden, durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle I als mittlerer Prozentsatz der Zellen mit Kern, die in drei Versuchen gefunden wurden, angegeben. Tabelle I Differentielle morphologische Zählung von normalen menschlichen Knochenmarkszellen mit Kern, sortiert gemäß der orthogonalen Lichtstreuung und der CD45-Expression &spplus;. lymphocytische monocytische granulocytische erythroide undifferenzierte Hämoblasten dunkelblau rot grün violett hellblau
  • Die Farben beziehen sich auf die Bereiche, die in Fig. 4b gezeigt sind. Die Daten sind als Prozentsatz der Zellen mit Kern angegeben.
  • + n=3, * Hämoblasten
  • Die lichtmikroskopische Untersuchung der sortierten Populationen bestätigte die Klassifizierung der Abstammung dieser Zellen, es waren jedoch nicht alle Zellen im dunklen Bereich reif. Innerhalb der Population der Neutrophilen wurden außer reifen Neutrophilen auch Hämoblasten und Metamyelocyten gefunden. Ungefähr 5 % der Lymphocyten waren Lymphoblasten und 20 % der Monocyten waren unreife Monomyeloidzellen.
  • Im Gegensatz zu peripherem Blut wurden zwei Populationen von Knochenmarkszellen mit niedrigen orthogonalen Lichtstreusignalen und schwach exprimiertem CD45-Antigen identifiziert. Die lichtmikroskopische Untersuchung der Population ("Nuc E") der Zellen, die die niedrigsten Spiegel an CD45-Antigen exprimierten, zeigte, daß die Population ausschließlich aus Normoblasten und Erythroblasten (Tabelle I) bestand. Die Population ("P"), die geringfügig höhere Mengen an CD45-Antigen exprimierte, enthielt die meisten unreifen Zellen unter Einschluß von Monomyeloid- und Lymphoid-Vorläufern und wenigen Erythroblasten (Tabelle I).
    • III. Differentielle Blutzellanalyse eines Thrombocytopenie-Patienten mit chronischer B-Lymphocyten-Leukämie
  • Die Brauchbarkeit dieser Technik wird bei der Analyse von Blut von einem B-CLL-Patienten gezeigt. Ein B-CLL-Patient im RAI-Stadium IV wurde ausgewählt, da anomale Zahlen üblicherweise für Blutzellen aller Abstammungen gefunden werden. Der 10- bis 100-fache Anstieg der Zahl der Lymphocyten macht die Unterscheidung dieser Zellen von restlichen normalen Leukocyten und Reticulocyten schwieriger. Ferner macht die geringe Zahl der Blutplättchen bei diesen Patienten die Zählung der Blutplättchen weniger zuverlässig.
  • Das Blut von dem B-CLL-Patienten wurde mit LDS-751, Thiazol-Orange und HLe-1(PE) inkubiert, wie es für normales Blut durchgeführt worden war. Die Daten wurden in der gleichen Weise dargestellt, die für das normale periphere Blut (Fig. 1) und das Knochenmark (Fig. 3) gewählt worden war.
  • Die Häufigkeit der Zellen, die in dem Lichtstreubereich auftraten, der für Blutplättchen typisch ist (Fig. 5a), war niedrig im Vergleich mit normalem peripherem Blut (vgl. Fig. 1a, b mit Fig. 5a, b). Nur einige der in Fig. 5a durch Lichtstreuung als Blutplättchen identifizierten Punkte zeigen die Fluoreszenzintensität mit LDS-751, die für Blutplättchen typisch ist (Fig. 5b) und können als normale Blutplättchen angesehen werden. Die Unterscheidung der Blutplättchen von Reticulocyten ist immer noch hervorragend (Fig. 5b).
  • Als Konsequenz des starken Anstiegs der Häufigkeit der Zellen mit Kern ist die Trennung der Leukocyten und Reticulocyten, die mit LDS-751 und Thiazol-Orange erzielt wird, weniger klar. Die Leukocyten können jedoch klar von den Reticulocyten auf der Grundlage ihrer Expression des CD45-Antigens getrennt werden (Fig. 5c, d).
  • Die Lichtstreueigenschaften und die Expression an CD45-Antigen von Zellen mit Kern (eingestellt in Fig. 5b) ist in Fig. 6a, b gezeigt. Der größte Teil der Zellen exprimiert schwach das CD45-Antigen und zeigt niedrige Lichtstreusignale in Vorwärtsrichtung und niedrige orthogonale Lichtstreusignale, die charakteristisch für unreife Lymphocyten sind. Nur wenige Leukocyten wurden als normale Lymphocyten, Granulocyten und Monocyten nachgewiesen, obwohl die Trennung als Folge der überwiegenden Anzahl der unreifen Lymphoidzellen nicht klar war. Es ist auf die wenigen Zellen, die das CD45-Antigen nicht exprimierten und die ein niedriges orthogonales Lichtstreusignal aufwiesen, hinzuweisen (vgl. Fig. 6b). Diese Zellen wurden als Erythroidzellen mit Kern identifiziert, was konsistent mit dem großen Anstieg der Reticulocyten bei diesem Patienten ist.
    • IV. Vollblut als Verunreinigung von Knochenmark
  • Bei der Entnahme von abgesaugtem Knochenmark kann oftmals Blut in die abgesaugte Probe als Verunreinigung eingeführt werden. Würde man also die Probe ohne Korrektur der Verunreinigungen durch Blut analysieren, so könnten die Leukocytendifferentiale fehlerhaft sein.
  • Durch Untersuchung einer Blutprobe, wie es im vorstehenden Beispiel I beschrieben ist, können die Prozentsätze der weißen Blutzelltypen im Blut berechnet werden. Wenn die Knochenmarksprobe untersucht wird, wie es im Beispiel II beschrieben ist, dann können die erwarteten Prozentsätze der weißen Blutzellen der Blutprobe von denen der Knochenmarksprobe abgezogen werden, wobei man eine genauere Ablesung erhält, die frei von Verunreinigungen durch Blut ist (wobei man in der Tat annimmt, daß alle Verunreinigungen aus dem Blut stammen).
  • So machen z.B. Lymphocyten, Granulocyten und Monocyten 1,0, 1,0 bzw. 0,2 % der gesamten Zellen in einer Blutprobe aus, wobei es sich bei dem Rest von 97,8 % der Zellen im wesentlichen um RBC handelt. Es befinden sich also ungefähr ein Lymphocyt und ein Granulocyt und 0,2 Monocyten pro 100 RBC in der Blutprobe. Die absoluten Zahlen dieser gleichen Zellen in einer Knochenmarksprobe sind 800, 490 bzw. 165 in einer 20 000 Zellen umfassenden Probe, wobei es sich bei dem Rest der Zellen (d.h. 18 545) im wesentlichen um RBC handelt. Nur als Beispiel ist zu erwarten, daß die Zahlen der Lymphocyten, Granulocyten und Monocyten, die die Knochenmarksprobe verunreinigen, 185 Lymphocyten (d.h. 1 % von 18 545), 185 Granulocyten (d.h. 1 % von 18 545) und 37 Monocyten (d.h. 0,2 % von 18 545) betragen. Die korrigierten Zahlen sind daher 615 Lymphocyten, 306 Granulocyten und 128 Monocyten. Gemäß diesem Verfahren können genauere Zahlen erhalten werden.
  • Alle Veröffentlichungen und Patentanmeldungen, die in der vorliegenden Anmeldung erwähnt wurden, zeigen den Grad der Fertigkeiten von Fachleuten auf dem Gebiet, zu dem die Erfindung gehört.

Claims (17)

1. Verfahren zur Multiparameteranalyse von Zellen in einer Körperflüssigkeit, wobei das Verfahren folgende Stufen umfaßt:
1) Entnahme einer Flüssigkeitsprobe, die von einem Individuum stammt;
2) Zugabe von zwei fluoreszierenden Nucleinsäure-Farbstoffen zu der Probe, die in unterschiedlicher Weise die DNA und die RNA in jeder Zelle markieren, wobei jeder Farbstoff eine maximale spektrale Fluoreszenzemission aufweist, die sich von der des anderen Farbstoffs unterscheidet;
3) Zugabe eines fluoreszierend markierten Zelloberflächenmarkers zu der Probe, wobei der Marker ein Antigen erkennt, das in unterschiedlicher Weise auf den Zellen in der Flüssigkeitsprobe exprimiert wird und wobei die fluoreszierende Markierung eine maximale spektrale Emission aufweist, die sich von der der fluoreszierenden Farbstoffe unterscheidet; und
4) Analyse der Zellen in der Probe mit einer Vorrichtung, die zum Nachweis und zur Aufzeichnung der Fluoreszenz von jeder Zelle in der Probe mit drei Kanälen und der Lichtstreuung von jeder Zelle in der Probe mit zwei Kanälen imstande ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Körperflüssigkeit eine peritoneale Flüssigkeit, Spinalflüssigkeit oder Gehirnflüssigkeit, Urin, Vollblut oder eine Zellsuspension von Knochenmark, Lymphknoten, Leber oder Milz umfaßt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei es sich bei der Körperflüssigkeit um Vollblut handelt.
4. Verfahren nach Anspruch 2, wobei es sich bei der Körperflüssigkeit um Knochenmark handelt.
5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei einem der Nucleinsäurefarbstoffe um LDS-751 (2-{2-[4-(Dimethylamino)-phenyl]-ethenyl}-1-ethylchinoliniumiodid) handelt.
6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei einem der Nucleinsäurefarbstoffe um Thiazol-Orange (1-Methyl-4-{[3- methyl-2(3H)-benzothiazolyliden]-methyl}-chinolinium-4-methylbenzolsulfonat) handelt.
7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem Zelloberflächenmarker um einen mit einem Fluorochrom konjugierten MAb handelt.
8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei es sich bei dem MAb um CD45 MAb handelt.
9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei es sich bei dem CD45 MAb um HLe-1 handelt.
10. Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem Fluorochrom um Phycoerythrin handelt.
11. Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei der Vorrichtung um ein Durchflußcytometer handelt.
12. Verfahren zur Fünfparameteranalyse von Zellen in einer Blutprobe, wobei das Verfahren folgende Stufen umfaßt:
1) Entnahme einer Blutprobe, die von einem Menschen stammt;
2) Zugabe von LDS-751 (2-{2-[4-(Dimethylamino)-phenyl]- ethenyl}-1-ethylchinoliniumiodid) und Thiazol-Orange (1- Methyl-4-{[3-methyl-2(3H)-benzothiazolyliden]-methyl}-chinolinium-4-methylbenzolsulfonat) zu der Probe;
3) Zugabe von Phycoerythrin-markiertem HLe-1 zu der Prcbe;
4) Durchleiten der Probe durch ein Durchflußcytometer mit einer einzigen, auf 488 nm eingestellten Laserquelle, das imstande ist, Messungen der orthogonalen Lichtstreuung und der Vorwärtslichtstreuung sowie der Fluoreszenzemission von LDS-751 (2-{2-[4-(Dimethylamino)-phenyl]-ethenyl}-1-ethylchinoliniumiodid), Thiazol-Orange (1-Methyl-4-{3-methyl- 2(3H)-benzothiazclyliden]-methyl}-chinolinium-4-methylbenzolsulfonat) und Phycoerythrin für jede Zelle in der Probe auf zuzeichnen und zu speichern.
13. Verfahren zur Fünfparameteranalyse von Zellen in einer Knochenmarksprobe, wobei das Verfahren folgende Stufen umfaßt:
1) Entnahme einer Knochenmarksprobe, die von einem Menschen stammt;
2) Zugabe von LDS-751 (2-(2-[4-(Dimethylamino)-phenyl]- ethenyl}-1-ethylchinoliniumiodid) und Thiazol-Orange (1- Methyl-4-{[3-methyl-2(3H)-benzothiazolyliden]-methyl}-chinolinium-4-methylbenzolsulfonat) zu der Probe;
3) Zugabe von Phycoerythrin-markiertem HLe-1 zu der Probe;
4) Durchleiten der Probe durch ein Durchflußcytometer mit einer einzigen, auf 488 nm eingestellten Laserquelle, das imstande ist, Messungen der orthogonalen Lichtstreuung und der Vorwärtslichtstreuung sowie der Fluoreszenzemission von LDS-751 (2-{2-[4-(Dimethylamino)-phenyl]-ethenyl}-1-ethylchinoliniumiodid), Thiazol-Orange (1-Methyl-4-{[3-methyl- 2(3H)-benzothiazolyliden]-methyl}-chinolinium-4-methylbenzolsulfonat) und Phycoerythrin für jede Zelle in der Probe aufzuzeichnen und zu speichern.
14. Reagenzsatz für die Multiparameteranalyse von Zellen in einer Körperflüssigkeit, wobei der Reagenzsatz einen ersten Behälter, der mindestens zwei Nucleinsäurefarbstoffe enthält, um die DNA und die RNA in jeder Zelle unterschiedlich zu markieren, wobei jeder Farbstoff eine maximale spektrale Fluoreszenzemission aufweist, die sich von der des anderen Farbstoffs unterscheidet, und einen zweiten Behälter umfaßt, der mindestens einen fluoreszierend markierten Zelloberflächenmarker enthält, wobei der Marker ein Antigen erkennt, das in unterschiedlicher Weise auf Zellen in der Flüssigkeitsprobe exprimiert wird, und wobei die fluoreszierende Markierung eine maximale spektrale Emission aufweist, die sich von der der fluoreszierenden Farbstoffe unterscheidet, zur Verwendung bei einem Verfahren zur Multiparameteranalyse von Zellen in einer Körperflüssigkeit, wobei das Verfahren folgende Stufen umfaßt:
1) Entnahme einer Flüssigkeitsprobe, die von einem Individuum stammt;
2) Zugabe von zwei fluoreszierenden Nucleinsäure-Farbstoffen zu der Probe, um in unterschiedlicher Weise die DNA und die RNA in jeder Zelle zu markieren, wobei jeder Farbstoff eine maximale spektrale Fluoreszenzemission aufweist, die sich von der des anderen Farbstoffs unterscheidet;
3) Zugabe eines fluoreszierend markierten Zelloberflächenmarkers zu der Probe, wobei der Marker ein Antigen erkennt, das in unterschiedlicher Weise auf den Zellen in der Flüssigkeitsprobe exprimiert wird, und wobei die fluoreszierende Markierung eine maximale spektrale Emission aufweist, die sich von der der fluoreszierenden Farbstoffe unterscheidet; und
4) Analyse der Zellen in der Probe mit einer Vorrichtung, die zum Nachweis und zur Aufzeichnung der Fluoreszenz von jeder Zelle in der Probe mit drei Kanälen und der Lichtstreuung von jeder Zelle in der Probe mit zwei Kanälen imstande ist.
15. Reagenzsatz nach Anspruch 14, wobei die Nucleinsäurefarbstoffe LDS-751 (2-{2-[4-(Dimethylamino)-phenyl]- ethenyl}-1-ethylchinoliniumiodid) und Thiazol-Orange (1-Methyl-4-{[3-methyl-2(3H)-benzothiazolyliden]-methyl}chinolinium-4-methylbenzolsulfonat) umfassen.
16. Reagenzsatz nach Anspruch 14, wobei der fluoreszierend markierte Zelloberflächenmarker Phycoerythrin-markiertes HLe-1 umfaßt.
17. Verfahren zum Korrigieren einer Multiparameteranalyse einer Knochenmarksprobe, um einen erhöhten Spiegel an weißen Blutzellen aufgrund einer Blutkontamination der Knochenmarksprobe zu berichtigen, wobei das Verfahren folgende Stufen umfaßt:
1) Durchführung der Stufen des Verfahrens nach Anspruch 1 für Vollblut;
2) Bestimmung des Prozentsatzes der verschiedenen weißen Blutzellkomponenten im Blut;
3) Durchführung der Stufen des Verfahrens nach Anspruch 8;
4) Bestimmung der absoluten Anzahl der verschiedenen weißen Blutzellkomponenten im Knochenmark; und
5) Multiplikation jedes in Stufe (2) erhaltenen Prozentsatzes mit der Gesamtanzahl der Zellen in der Knochenmarksprobe und Subtraktion dieser Anzahl von dem entsprechenden absoluten Wert, der in Stufe (4) erhalten wurde.
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